BRPI0502399B1 - Compostos análogos a peptídeos analgésicos derivados de veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, seus usos, composições, métodos de preparação e de puruficação - Google Patents
Compostos análogos a peptídeos analgésicos derivados de veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, seus usos, composições, métodos de preparação e de puruficação Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0502399B1 BRPI0502399B1 BRPI0502399-8A BRPI0502399A BRPI0502399B1 BR PI0502399 B1 BRPI0502399 B1 BR PI0502399B1 BR PI0502399 A BRPI0502399 A BR PI0502399A BR PI0502399 B1 BRPI0502399 B1 BR PI0502399B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- seq
- pain
- peptide
- analgesic
- saline
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
"compostos análogos a peptídeos analgésicos derivados de veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, seus usos, composições, métodos de preparação e de purificação". a presente invenção compreende compostos análogos a peptídeos com seqüências de aminoácidos seq id no: 1, seq id no: 2, seq id no: 3 ou seq id no: 4, incluindo peptídeos analgésicos derivados de serpentes da espécie crotalus durissus terrificus; seus usos no tratamento, diagnóstico e prevenção de processos dolorosos ou mediados por receptores opióides, suas composições e seus métodos de preparação e de purificação, bem como seus usos na identificação de compostos analgésicos.
Description
(54) Título: COMPOSTOS ANÁLOGOS A PEPTÍDEOS ANALGÉSICOS DERIVADOS DE VENENO DE SERPENTES CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS, SEUS USOS, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS DE PREPARAÇÃO E DE PURUFICAÇÃO (73) Titular: FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP, Pessoa Jurídica de Dir.Privado. CGC/CPF: 43828151000145. Endereço: Rua Pio XI , n° 1500, Alto da Lapa, São Paulo, SP, BRASIL(BR), 05468-901; BIOSINTÉTICA FARMACÊUTICA LTDA.. CGC/CPF: 53162095000106. Endereço: Av. das Nações Unidas, 22.428, Jurubatuba, São Paulo, SP, BRASIL(BR), 04795-916; YARA CURY, Biomédico(a). CGC/CPF: 03562051859. Endereço: Rua Antonio Júlio dos Santos, 73 - apto 51, São Paulo, São Paulo, SP, BRASIL(BR), 05661-020 (72) Inventor: YARA CURY; GISELE PICOLO; KATSUHIRO KONNO; RENATA GIORGI; PATRÍCIA BRIGATTE; VANESSA PACCIARI GUTIERREZ; ANTÔNIO CARLOS MARTINS DE CAMARGO
Código de Controle: E137529F9A97E4FA 1334D38FF8EFACF8
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/05/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 02/05/2018
Assinado digitalmente por:
Júlio César Castelo Branco Reis Moreira
Diretor de Patente
1/48 “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM OU MAIS COMPOSTOS TETRADECAPEPTÍDEOS”
Campo da invenção:
A presente invenção refere-se a compostos que induzem analgesia ou atuam sobre receptores opióides em mamíferos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a compostos análogos a peptídeos com ação analgésica derivados de serpentes Crotalus durissus terrificus, seus usos, composições farmacêuticas e métodos de preparação e de purificação.
Fundamentação da invenção:
Segundo dados da Sociedade Brasileira para o Estudo da Dor (SBED, 2004 http://www.dor.org.br/dor_impactos.asp), a dor afeta pelo menos 30% dos indivíduos durante algum momento da sua vida e, em 1 O a 40% destes indivíduqs, tem duração superior a um dia. A dor constitui a causa principal de sofrimento, incapacitação para o trabalho e ocasiona graves conseqüências psicossociais e econômicas. Muitos dias de trabalho podem ser perdidos por aproximadamente 40% dos indivíduos. Não existem dados estatísticos oficiais sobre a dor no Brasil, mas a sua ocorrência tem aumentado substancialmente nos últimos anos. Ainda, a incidência da dor crônica no mundo oscila entre 7 e 40% da população e, como conseqüência da mesma, cerca de 50 a 60% dos que sofrem dela ficam parcial ou totalmente incapacitados, de maneira transitória ou permanente, comprometendo de modo significativo a qualidade de vida.
A propriedade terapêutica de venenos de serpentes, observada em humanos e experimentalmente, remonta ao início do século XX (Brazil, V. Biol. Med. São Paulo, 1: 7-21, 1934, Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398-408, 1950; Klobusitzky D. Anais do Instituto
Pinheiros, 1 :3-23, 1938) e a literatura apresenta revisões importantes sobre o uso destes venenos como agentes terapêuticos. Estas revisões mostram, por exemplo, a utilização do veneno de Crotalus adamanteus no tratamento da epilepsia e a utilização dos venenos de Agkistrodon piscivorus, Vipera ruselli e Notechis scutatus como agentes hemostáticos (Klobusitzky, D. Anais do Instituto Pinheiros, 1 :3-23, 1938).
Petição 870170087810, de 13/11/2017, pág. 18/25
2/48
4
4
4
4
Os relatos sobre a propriedade analgésica de venenos de serpentes, observada em humanos, remontam ao início da década de 30 (Monaelesser & Taguet, 1933, apud on Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398-408, 1950). Em relação ao efeito analgésico do veneno de serpentes Crotalus durissus terrificus (VCdt), denominada popularmente como cascavel, os primeiros estudos foram realizados pelo Dr. Vital Brazil. Nestes estudos, o Dr. Vital Brazil preparava soluções altamente diluídas do veneno crotálico, denominadas soluto crotálico, que eram distribuídas a vários médicos no Brasil e no exterior e utilizadas no tratamento de algias, em sua maioria, de origem neoplásica. Os resultados deste estudo demonstraram ser o veneno da cascavel altamente eficaz no tratamento de diferentes algias (Brazil, V. Biol. Med. São Paulo, 1: 7-21, 1934, Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398-408,1950).
Ainda em relação à utilização de produtos à base de venenos de serpentes no tratamento de condições dolorosas, merece destaque o desenvolvimento de um produto denominado anaveneno, produzido no Instituto Butantan, através do processamento de venenos de serpentes com formol. A aplicação destes produtos era indicada para o tratamento de algias de diferentes origens, principalmente aquelas em que analgésicos usuais não tinham mais efeito. Nesta época, este produto já demonstrava efeito analgésico marcante, uma vez que seu uso levava à supressão do uso da morfina, e também já demonstrava efeito analgésico prolongado, uma vez que a indicação de sua administração era com intervalos entre 1 e 3 dias.
Apesar dos resultados observados pelo Dr. Vital Brazil, mostrando o efeito analgésico do veneno de serpentes Crotalus durissus terrificus, durante o tratamento de diversas algias, o princípio ativo, presente no veneno bruto, responsável pelo efeito analgésico, não era conhecido.
Estudos para a determinação dos mecanismos da ação analgésica deste veneno, utilizando-se modelos experimentais de avaliação da sensibilidade dolorosa, foram iniciados a partir de 1990.
Estes estudos evidenciaram que o VCdt, administrado em camundongos, induz antinocicepção de longa duração, quando avaliado no método da placa quente, sugerindo que este veneno é capaz de acarretar analgesia por ação no Sistema Nervoso Central (Giorgi R. et al., Toxicon, 31: 1257-65, 1993; Picolo G. et al, Toxicon 36:223227, 1998). Estudos farmacológicos evidenciaram a participação de receptores opióides
3/48
• · · • · ·· (Giorgi R. et al., Toxicon, 31: 1257-65, 1993), do tipo kappa (Brigatte P. et al. Toxicon 39:1399-1410, 2001), na antinocicepção observada no modelo da placa quente. O tratamento prolongado com o veneno induz tolerância ao efeito antinociceptivo na placa quente, mas não dependência física. Esta tolerância é mediada por mecanismos farmacodinâmicos, não sendo observada tolerância cruzada com a morfina (Brigatte P, et al. Toxicon 39:1399-1410, 2001). Por outro lado, em decorrência do efeito antinociceptivo prolongado do veneno (5 dias após a administração de uma única dose), não há o desenvolvimento do fenômeno de tolerância se o veneno for administrado a cada 5 dias, por até 65 dias após o início do tratamento (Brigatte P. et al. Toxicon 39:1399-1410,2001).
Adicionalmente ao efeito observado no modelo da placa quente, foi demonstrada ação analgésica para o veneno bruto, em dois modelos experimentais de dor inflamatória: o modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (Giorgi
R. et al., Toxicon, 31: 1257-65,1993) e na hiperalgesia induzida por carragenina (Picolo G. et al., Eur J Pharmacol 391:55-62, 2000). No modelo da carragenina, foi evidenciado que este efeito é também de longa duração, persistindo por até 5 dias após a administração de uma única dose do veneno. Este efeito envolve a participação de receptores opióides periféricos do tipo delta (Picolo G. et al., Eur J Pharmacol 391:5562, 2000).
Por outro lado, em modelo de hiperalgesia induzida por prostaglandina, a ação antinociceptiva do veneno crotálico é mediada por receptores opióides do tipo kappa e delta (Picolo G. et al. Eur J Pharmacol 469:57-64, 2003). Em ambos os modelos de hiperalgesia (carragenina e prostaglandina), a antinocicepção induzida pelo VCdt envolve, ainda, a estimulação da via L-arginina/Óxido Nítrico (NO)/GMPc, da proteinoquinase dependente de GMPc e ativação de canais de potássio dependentes de ATP (Picolo G. et al. Eur J Pharmacol 469:57-64, 2003, Picolo e Cury, Life Science 75:559-73,2004).
É importante ressaltar que o veneno é capaz de acarretar, ainda, antinocicepção em modelos de dor persistente, como no modelo de dor neuropática induzida pela constrição crônica do nervo ciático de ratos (Gutierrez, V. P., Chacur, M., Sampaio,
S. C., Picolo, G., Cury, Y. Memórias do Instituto Butantan vol. 60, p. 50, 2003) e em modelo de dor de câncer resultante da injeção intraplantar de células do carcinoma de
• · ·
4/48
Walker 256, em ratos (Brigatte, P., Sampaio S.C., Gutierrez, V., Curi, R. RangelSantos, A.C., Guerra, J.L., Cury Y., XXXVI Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, Programa e Resumos, p. 195, 2004). O efeito do veneno, no modelo de dor neuropática, é também de longa duração, sendo detectado por até 3 dias após a administração de uma única dose do veneno. Da mesma maneira que nos modelos de hiperalgesia induzida por carragenina ou prostaglandina, receptores opióides do tipo kappa e delta, a via L-arginina/NO/GMPc e a ativação de canais de potássio dependentes de ATP são os responsáveis pelo efeito do veneno, neste modelo (Gutierrez, V. P., Chacur, M., Sampaio, S.C., Picolo, G., Cury, Y. Memórias do Instituto Butantan vol. 60, p. 50, 2003).
O veneno de serpentes é constituído por uma mistura complexa de proteínas e peptídeos biologicamente ativos. Vários princípios ativos com diferentes indicações terapêuticas já foram isolados a partir destes venenos. Como exemplos, temos a patente US5182260 (Maraganore, J.H., 1993), onde isolou-se um polipeptídeo inibidor da ativação plaquetária a partir da serpente norte americana Water Moccasin, ou a patente US5763403 (Lyan, E.C.Y., 1998), onde obteve-se uma proteína anticoagulante de lupus a partir do veneno de serpentes Agkistrodon halys brevicaudus, ou ainda a patente US6489451 (Li, B.X., 2002), onde uma enzima antitrombótica foi purificada a partir do veneno de serpentes Agkistrodon acutus. Em relação à obtenção de produtos utilizados no tratamento da dor, a patente americana US6555109 (Shulov, A., 2003) descreve a obtenção de uma fração não-tóxica, isolada do veneno de serpentes Vipera xanthina palestinae, e seus derivados, com utilização em diversos tipos de dor, inclusive dor crônica. Ainda, a patente americana US6613745 (Gopalakrishnakone, P., 2003) apresenta peptídeos com sequências de aminoácidos derivadas ou baseadas na seqüência de aminoácidos de um fator analgésico presente no veneno da Cobra-Rei (Ophiophagus hannah).
É encontrado também no estado da técnica a atividade analgésica da crotamina, uma toxina do veneno da serpente da espécie Crotalus durissus terrificus. Esse estudo verificou que há uma relação dose-resposta analgésica, quando a crotamina purificada é aplicada na forma s.c. e i.p. em camundongos, e que esse efeito analgésico foi inibido pela naloxona, sugerindo assim um mecanismo através dos receptores opióides (Mancin C. A. et al.,Toxin 36:12,1927-1937,1998).
5/48 • · · ·
* · «« • · · • · · · • ·
O ópio e seus derivados são potentes analgésicos, que também possuem outros efeitos farmacológicos. Os opióides endógenos e exógenos estão entre os analgésicos mais utilizados no controle da dor, particularmente a dor crônica ou intratável, como por exemplo, as dores que ocorrem no câncer, dor neuropática e durante processos inflamatórios crônicos. Por meio de ação em receptores específicos, estes fármacos induzem analgesia em seres humanos e em animais, por alteração na resposta do organismo a estímulos nocivos químicos, mecânicos ou térmicos (Yaksh, T.L. Acta Anaesth. Scand.41:94-lll, 1997).
Pelo menos três famílias distintas de peptídeos opióides endógenos foram identificadas: as encefalinas, as endorfínas e as dinorfinas. Cada família é derivada de um polipeptídeo precursor distinto e possui distribuição anatômica característica. Estes precursores são designados como proencefalina, proopiomelanocortina e prodinorfina todos eles caracterizados por possuírem a seqüência de aminoácidos Tyr-Gly-Gly-PheMet/Leu, (onde Tyr, Gly, Phe, Met e Leu correspondem aos aminoácidos tirosina, glicina, fenilalanina, metionina e leucina, respectívamente), localizada na porção Nterminal dos peptídeos opióides dessa classe (Przewlocki R. e Przewlocka B. Eur. J. Pharmacol, 429:79-91, 2001, Reisine T. e Pasternak, G. Irr. The Pharmacolcogical Basis of Therapeutics, Hardman J.G. e Limbird L.E. eds, 9a ed, New York, McGraw-Hill, pp. 521-555,1996).
Os opióides, pela ação em terminações nervosas aferentes, levam à inibição da adenilato ciclase, com diminuição da produção de AMPc (Schultz, J.E.J. e Gross, G.J. Pharmacol. Ther., 89:123-137, 2001), impedindo a abertura dos canais para cálcio, com consequente bloqueio da liberação de neurotransmissores (Junien, J.L. e Wettstein, J.G. Life Science, 51:2009-18, 1992: Zaki, P.A. et al. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.,
36:379-401,1996; Yaksh, T.L. Acta Anaesth. Scand. 41:94-111, 1997).
Ainda, os opióides levam à facilitação da abertura dos canais para potássio, com consequente hiperpolarização da membrana celular, através da ativação da via Larginina-óxido nítrico-GMPc (Ferreira, S.H. et al. Eur. J. Pharmacol., 1217: 225-7, 1991; Ferreira, S.H. et al. Br. J. Pharmacol., 114: 303-8, 1995; Nozaki-Taguchi, N. e
Yamamoto, T. Anesth. Anal., 87: 388-93, 1998; Amarante, L.H e Duarte, I.D. Eur J
Pharmacol., 454:19-23, 2002). O efeito antinociceptivo de agonistas opióides sobre canais para K+ envolve tanto canais para K+ sensíveis a ATP, como canais para K+
6/48 * * · · • · · · · • φ · • · · · • φφ ♦ φ • φ • · φ · φ φ φ
dependentes de voltagem (Welch, S. e Dunlow, L.D. J. Pharmacol. Exp. Ther., 267:390399, 1993; Rodrigues, A.R A. e Duarte I.D.G. Br, J.Pharmacol, 129:110-114, 2000; Schultz, J.E.J. e Gross, G.J. Pharmacol. Ther., 89:123-137,2001).
Adicionalmente, vários estudos têm mostrado que analgésicos opióides, incluindo agonistas κ opióides afetam a atividade de proteinoquinase ativada por mitógeno (MAPK) (Li, J.G., et al, J. Biol. Chem., 274:12087-12094, 1999; Eitan, S. et al, J. Neuroscience, 23:8360-8369, 2003; Lesscher, H.M.B. et al, Neuroscience, 116:139-144, 2003).
Concomitante à existência de múltiplos peptídeos que apresentam atividade opióide, descobriu-se farmacologicamente a existência de múltiplos receptores opióides. Assim, considera-se que os analgésico opióides exercem seus efeitos por interação com receptores específicos, constituintes de pelo menos 3 principais classes: μ (mu), κ (kappà) e Ô (delta) (Yaksh, T. L. Eur. J. Anaesthesiol. 1:201-243, 1984), distribuídos no sistema nervoso central e em tecidos periféricos, com distintas atividades farmacológicas, distribuição anatômica e função (Junien, J.L. e Wettstein, J.G. Life Science, 51:2009-2018, 1992; Yaksh, T.L. Acta Anaesth. Scand. 41:94-111, 1997).
As ações centrais e periféricas dos opióides são um importante componente de sua utilização terapêutica. Os receptores mu são responsáveis pela maioria dos efeitos analgésicos dos opióides e por alguns dos seus efeitos colaterais, como depressão respiratória e cardiovascular, euforia, dependência, sedação e alteração de vários efeitos neuroendócrinos [Brownstein, M.J. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 90:5391-5393,1993].
Esses efeitos secundários decorrem, principalmente, da ação desses agonistas no sistema nervoso central, e contribuem para a limitação da utilização destes analgésicos no controle da dor. Os receptores delta são, provavelmente, mais importantes na periferia, entretanto acarretam também analgesia central. Estes receptores, além de mediar a analgesia, medeiam a motilidade gastrointestinal e várias funções hormonais. Já os receptores kappa induzem analgesia sem causar os efeitos colaterais característicos de receptores μ, como constipação, prurido, depressão respiratória, dependência física e/ou vício. Porém, os receptores kappa mantêm alguns efeitos mediados centralmente, como sedação e disforia, mas não dependência física (Vanvoigtlander et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 224: 7-12,1983; Wood, P.L. e Iyengar,
S. In: The opiate receptors. Pastemak, G.W. ed. Humana press, Clifton, N.Y., 1988).
• · · • ··
7/48 • · · · * · • · · · · · • » * * · ······»
··
Esses receptores são os responsáveis pelo balanço na ingestão de água, de comida, motilidade intestinal, controle de temperatura e várias funções endócrinas (Leander, J. Pharmacol. Exp. Ther., 227: 35-41, 1983; Leander et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 234, 463-469, 1985; Morley et al., Peptides 4, 797-800, 1983; Manzanares et al.,
Neuroendocrinology 52, 200-205, 1990; Iyengar et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 238, 429-436, 1986).
Os analgésicos opióides mais utilizados clinicamente como morfina e codeína, agem como agonistas de receptores opióides mu. Estes opióides causam efeitos secundários indesejáveis bem conhecidos, como por exemplo, o desenvolvimento de dependência física. Compostos chamados de agonista de receptores kappa ou de receptores delta agem como analgésicos por ação em receptores opióides do tipo kappa ou delta, respectivamente. A vantagem destes agonistas sobre os agonistas clássicos de receptores mu, como a morfina, decorre de sua habilidade em causar analgesia sem induzir os efeitos comportamentais secundários indesejáveis descritos para morfina.
Sabe-se que o grau de complementaridade entre as características estruturais do receptor opióide e do ligante é responsável pela seletividade e pela especificidade do receptor. Contudo, trabalhos indicam que interações específicas dos peptídeos opióides com vários compartimentos da membrana podem contribuir para a habilidade destes opióides em interagir seletivamente com receptores específicos (Janecka A. et al. Mini Rev Med
Chem. 2:565-572, 2002; Naito A. e Nishimura K. Curr Top Med Chem. 4:135-145, 2004; Singh VK. et al. Neuroimmunomodulation. 4:285-297, 1997). A presente invenção refere-se a um nova série de peptídeos não homólogos às encefalinas, endorfinas ou dinorfinas, ou aos peptídeos sintéticos com atividade opióide preferencial em receptores opióides kappa.
É conhecido no estado da técnica que quanto maior a especificidade e seletividade de um opióide por um tipo ou subtipo de receptor, menor a chance de aparecimento de efeitos colaterais ao se utilizar o material com finalidade terapêutica. Aqueles agonistas que têm afinidade por receptores kappa e/ou delta, têm demonstrado potente atividade analgésica, não apresentando, porém, efeitos colaterais sérios que representam problemas clínicos, como dependência física, supressão da respiração e inibição do movimento da musculatura lisa, efeitos que são observados para morfina e derivados agonistas de receptores mu (Nagase, H.; Kawai, K.; Kawamura, K.;
• · 4
8/48 • · • 4 44 ♦ ·
Hayakawa, J.; Endoh, T.; patente US6323212, 2001). Ainda o acesso ao sistema nervoso central tem muita associação com efeitos colaterais tais como a dependência física e depressão respiratória. Os opióides convencionais como a morfina, naloxona, levorfanol, encefalinas, endorfínas e dinorfínas e análogos são geralmente hidrófobos e portanto, capazes de permear as membranas tais como a barreira hemato-encefálica, se acumular facilmente nos tecidos adiposos e em órgãos dos pacientes. Essa permeabilidade tem sido associada também aos efeitos colaterais no sistema nervoso central, como a euforia e adição. Ainda mais esses peptídeos devem ser administrados em altas doses o que causa reações tóxicas associadas com a longa exposição aos opióides (patente US5602100; Brown, W.L., 1997). Foram achadas no estado da técnica algumas patentes sugerindo o uso de combinação de vários antagonistas e agonistas, formulados ou não, como agentes anti-nociceptivos e anti-inflamatórios. Estes trabalhos sugerem a possibilidade de utilização de composições farmacêuticas com atuação concomitante em diferentes vias nociceptivas e/ou mecanismos inflamatórios, levando a uma interferência no desencadeamento de ambos os processos (nociceptivo e inflamatório), por exemplo, em processos cirúrgicos como procedimentos orais e/ou dentais. Esses agentes podem ser: um antagonista de receptor 5HT-2, um antagonista de receptor 5HT-3, um antagonista da histamina, um agonista de serotonina, um inibidor de ciclooxigenase, um antagonista de receptor neurocinina 1, um antagonista de receptor neurocinina 2, um antagonista de purinoreceptores, um antagonista de canal de cálcio, um antagonista de receptor BI de bradicinina, um antagonista de receptor B2 de bradicinina e um agonista do receptor mu opióide. Ainda, é descrito nestas patentes o uso de combinações para o tratamento da destruição de cartilagem (patente US6420432; Demopulos, G., 2002; US2003096807 Al; Demopulos, G., 2003).
Muitos trabalhos foram encontrados no estado da técnica que revisam os efeitos da farmacologia molecular e a manipulação genética dos peptídeos opióides, receptores opióides, agonistas e antagonistas dos receptores opióides. Esses estudos cobrem os efeitos bioquímicos e moleculares dos opióides, os estudos de localização neuroquímica dos opióides endógenos e seus receptores relacionados ao comportamento, e ainda, a relação dos mesmos com a analgesia e dor, stress, tolerância e dependência, aprendizado e memória, álcool e abuso de drogas, atividade sexual e hormonal, gravidez e desenvolvimento endócrino, atividade mental geral e locomoção, desordens
9/48 • · ·
• · » · · • * » « « ♦ ·» ·» * ♦ · · neurológicas, funções gastrintestinal, renal e hepáticas e respostas cardiovasculares (Bodnar, R and Hadjimarkou, Peptides, 24,1241-1302, 2003).
Na patente US5866346 (Yu. L., 1999), Lei Yu descreve o método de uso das dinorfínas como ligantes para o receptor XOR1. Dessa forma compostos que, assim como as dinorfínas, são ligantes agonistas preferenciais de receptores kappa, poderiam ser ligantes para os receptores XOR1.
Embora tenham sido identificados diversos estudos sobre o uso de compostos derivados do veneno de serpentes e sobre o uso de peptídeos que atuam sobre receptores opióides, tais estudos, no entanto, não elucidaram a natureza do princípio ativo analgésico presente no veneno de serpente da espécie Crotalus durissus terrificus, nem sua eficácia, quando administrado na forma purificada, mesmo por via oral. Tais estudos também não elucidaram a eficácia de compostos análogos a tal princípio ativo, nem sua ação específica sobre receptores opióides.
Descrição da Invenção:
A presente invenção baseia-se na descoberta e caracterização do componente ativo analgésico presente no veneno de Crotalus durissus terrificus, bem como da confirmação da manutenção do efeito analgésico de tal componente quando administrado na forma purificada, mesmo por via oral. A presente invenção também baseia-se no evidenciamento da eficácia analgésica de compostos análogos ao componente ativo presente no veneno de Crotalus durissus terrificus, bem como do evidenciamento da ação de tais compostos sobre receptores opióides.
Em um primeiro aspecto principal independente, a presente invenção compreende novos compostos análogos ao componente analgésico presente no veneno de Crotalus durissus terrificus, tendo propriedades farmacológicas que mimetizam compostos com a estrutura:
Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys (SEQ ID NO: 1) onde
Xaa é sempre piroglutamato,
10/48 • · 1 • · · · · • · · · • · ·· ·
··· • · · • * ·· • « ♦ ·· ·· • · · · • «· · ·
RI = Phe ou Trp ou Tyr ou Leu ou Thr,
R2 = Pro ou Arg,
R3 = Glx ou Asx ou Gly,
R4 - Asn ou Gin ou Leu,
R5 = Glx ou Asx,
R6 = Glx ou Lys, seus sais, solvatos ou compostos análogos, com a ressalva de que quando o composto é um tetradecapeptídeo em que Rl=Phe, R2=Pro, R3=Glu, R4-Asn, R5=Glu e R6=Gln, os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estão ligados por uma ponte dissulfeto intramolecular (SEQ ID NO: 2).
Mais especificamente, a presente invenção provê compostos conforme a SEQ ID NO: 1, caracterizados por os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estarem ligados por uma ponte dissulfeto intramolecular (SEQ ID NO: 4); especialmente compostos análogos ao tetradecapeptídeo com a sequência de aminoácidos Xaa-Phe-Ser-Pro-GluAsn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys, em que Xaa é piroglutamato e os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estão ligados por uma ponte dissulfeto intramolecular (SEQ ID NO: 2); como por exemplo tetradecapeptídeos que apresentam a seqüência de peptídeos SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO 4.
Conforme a presente invenção, a expressão “compostos análogos” aplica-se a compostos que possuem estrutura química com porções que conferem, ainda que parcialmente, propriedades farmacológicas de peptídeos com as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 em relação à sua ação analgésica ou de sua interação direta ou indireta, agonista ou antagonista, com receptores opióides.
Em um aspecto complementar a presente invenção também compreende compostos que mimetizam propriedades farmacológicas de peptídeos que contém a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO 4 caracterizados por apresentarem adição, deleção ou alteração peptídico-mimética, para modulação de suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas, incluindo a substituição de um ou mais L-aminoácidos por D-aminoácidos ou aminoácidos não convencionais ou ainda por apresentar hidroxilação do resíduo de prolina na posição 4 ou γ-carboxilação dos
11/48
| • · | • a · | • | • · · | • | • | • · · · | • |
| * · | • | • · | • * | • · | • | • · · | • · |
| • · | • | * · | • | • · | • | * · · | • * |
| * | « · | • · | • * | • | • · · | • | |
| • · * | • | • | * | • · * | • * · | • · |
resíduos de glutamato nas posições 5 ou 10. Exemplos de D-aminoácidos e aminoácidos não convencionais estão descritos (sem todavia se limitar), por exemplo, na publicação US6613745 (National University of Singapore, 2003) ou na publicação “A Textbook of Drug Design and Development”, 2nd Edition, Harwood Academic Publishers, Singapore.
Em um outro aspecto complementar, a presente invenção compreende compostos análogos a peptídeos que apresentam as sequências SEQ ID NO: 1, SEQID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, caracterizados por serem purificados.
Conforme a presente invenção o termo “purificado” corresponde a compostos substancialmente isentos de componentes celulares contaminantes, outros constituintes do veneno, meios de cultura ou outros materiais tais como reagentes utilizados na síntese química dos “compostos”. Preferencialmente, os “compostos purificados” estão em uma quantidade superior a 50% da massa seca da mistura; mais preferencialmente, em uma quantidade superior a 90% da massa seca da mistura, especialmente superior a 95%.
Em um segundo aspecto principal independente, a presente invenção compreende composições farmacêuticas caracterizadas por conterem um ou mais carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis e um ou mais compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais, solvatos ou compostos análogos; preferencialmente purificados.
Exemplos de composições farmacêuticas compreendidas pela presente invenção são, por exemplo: soluções, suspensões, pastas, géis cápsulas, comprimidos, drágeas, pós, grânulos, liófilos, sistemas de liberação controlada, micropartículas, micro ou nanoesferas, lispossomas e formulações associadas a revestimento orgânico, etc. Possíveis vias de administração para as composições farmacêuticas compreendidas pela presente invenção são: oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, tópica, pulmonar, intranasal, bucal, retal, sublingual, intraperitonial intradérmica, intratecal, etc., em formas para liberação imediata, retardada, prolongada ou cronogramada. Exemplos de formas farmacêuticas, carreadores, diluentes e vias de administração compreendidos pela presente invenção estão descritos (sem todavia se limitar), por exemplo, no livro Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA.
12/48
| • * | • · « | • | • · · | • · | • · · | • * |
| • · | • | • · | • · | * · · | * | • ♦ * · |
| ♦ · | • | • · | • | • · · | • | • · ♦ · |
| • | • * | • · | • · * | • * | • · | |
| • · · | • | • | • · · · | • | • · · * |
Em um aspecto complementar, a presente invenção compreende ainda composições farmacêuticas caracterizadas por conterem um ou mais ingredientes ativos em combinação com compostos análogos a peptídeos que apresentam as sequências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, numa mesma unidade de dosagem ou na forma de kits.
Em um aspecto específico, quando as composições são líquidas, semi-sólidas, ou em formas secas para reconstituição, estas contêm um diluente à base de água. Em outro aspecto específico, as composições podem ser para uso oral, apresentando vantagem sobre composições injetáveis, no que diz respeito à facilidade de administração e aceitabilidade pelos pacientes.
Em um terceiro aspecto principal independente, a presente invenção compreende o uso de um ou mais compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais, solvatos ou compostos análogos, preferencialmente purificados, na preparação de composições farmacêuticas analgésicas ou úteis no tratamento, diagnóstico ou prevenção de condições moduladas por receptores opióides.
Em um aspecto específico, a presente invenção compreende o uso de um ou mais compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais, solvatos ou compostos análogos, preferencialmente purificados, no preparo de composições com propriedades agonistas ou antagonistas, diretas ou indiretas, de receptores opióides; especialmente receptores opióides do tipo kappa.
Em um outro aspecto específico, a presente invenção compreende o uso de um ou mais compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais, solvatos ou compostos análogos, preferencialmente purificados, como agentes analgésicos; especialmente em composições farmacêuticas para uso oral e/ou composições analgésicas com longa duração, com ação remanescente até 5 dias após a administração.
Em outro aspecto específico, a presente invenção compreende o uso de um ou mais compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4, seus sais, solvatos ou compostos análogos, preferencialmente purificados, para a preparação de composições úteis no tratamento, diagnóstico ou
13/48 • «·· · ·»· · · «·· · · • · · · · · · · · · ···· • **· ···* · · · «· • ·♦····· · · · * • ·· · · · *·· · ·« ·· prevenção de dor aguda ou crônica, incluindo dores oncológicas, dores neuropáticas como neuralgia do trigêmeo, distrofia simpática, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, pós-acidente vascular cerebral, neuropatia diabética, dores associadas a neoplasias, fibromialgia, dor dentária, dismenorréia, cólica renal, menstruai ou biliar, dores articulares, artrites incluindo artrite reumatóide ou artrites degenerativas, hipertensão intra-ocular, dor pós-artroscopia, dor pós-laparoscopia ginecológica, dor produzida por nefrolitotomia percutânea, dor pós-prostectomia retropúbica radical, dor pós-toracotomia, dor pós-tonsilectomia em pacientes pediátricos, dor pós-histerectomia, dor pós-operação cesariana ou queimaduras, dependência de cocaína ou de opióides, proliferação celular, carcinoma pulmonar de células pequenas, depressão e psicose, inflamação, condições associadas por aumento de angiogênese, feridas, doenças isquêmicas coronarianas, doença de Parkinson e discinesias, encefalopatia hepática, doenças cognitivas, doença de Alzheimer, prurido decorrente de colestase hepática ou hiperinsulinemia em mulheres com ovário policístico.
Em um quarto aspecto principal independente, a presente invenção compreende métodos de tratamento, diagnóstico e prevenção de condições dolorosas ou mediadas por receptores opióides com o uso de um ou mais compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais, solvatos ou compostos análogos; preferencialmente purificados.
Em um aspecto específico, a presente invenção compreende métodos de tratamento, diagnóstico e prevenção de condições moduladas por receptores opióides, com o uso de um ou mais compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, com propriedades agonistas ou antagonistas, diretas ou indiretas, sobre receptores opióides; particularmente receptores opióides do tipo kappa.
Em outro aspecto específico, a presente invenção compreende métodos de tratamento, diagnóstico ou prevenção de condições dolorosas caracterizados com o uso de um ou mais compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, por via oral e/ou em composições analgésicas com longa duração, com ação remanescente até 5 dias após a administração.
Em outro aspecto específico, a presente invenção compreende métodos de tratamento, diagnóstico ou prevenção, com o uso de um ou mais compostos contendo as
14/48
sequências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, de condições tais como dor aguda ou crônica, incluindo dores oncológicas, dores neuropãticas como neuralgia do trigêmeo, distrofia simpática, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, pós-acidente vascular cerebral, neuropatia diabética, dores associadas a neoplasias, fibromialgia, dor dentária, dismenorréia, cólica renal, menstruai ou biliar, dores articulares, artrites incluindo artrite reumatóide ou artrites degenerativas, hipertensão intra-ocular, dor pós-artroscopia, dor pós-laparoscopia ginecológica, dor produzida por nefrolitotomia percutânea, dor pós-prostectomia retropúbica radical, dor pós-toracotomia, dor pós-tonsilectomia em pacientes pediátricos, dor pós-histerectomia, dor pós-operação cesariana ou queimaduras, dependência de cocaína ou de opióides, proliferação celular, carcinoma pulmonar de células pequenas, depressão e psicose, inflamação, condições associadas por aumento de angiogênese, feridas, doenças isquêmicas coronarianas, doença de Parkinson e discinesias, encefalopatia hepática, doenças cognitivas, doença de Alzheimer, prurido decorrente de colestase hepática ou hiperinsulinemia em mulheres com ovário policístico.
Em um quinto aspecto principal independente, a presente invenção compreende processos de produção e purificação de compostos análogos a peptídeos contendo as sequências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais, solvatos ou compostos análogos.
Em um aspecto específico a presente invenção compreende processos de produção de compostos contendo a sequência SEQ ID NO 4, seus sais e compostos análogos, contendo ponte dissulfeto intramolecular entre os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14, caracterizados por envolverem etapa de oxidação das sulfidrilas das posições 7 e 14, com um agente enzimático ou por oxidação com agentes oxidantes (tais como iodina, ar, oxigênio ou ferricianeto de potássio) ou ainda caracterizados por envolverem uma etapa de purificação de um composto contendo em sua estrutura a sequência de aminoácidos:
Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys (SEQ ID NO: 5) onde
15/48
| • · • 4 | • 4 4 | ♦ | 4 · 4 | • ♦ | ♦ 4 4 | |
| • 4 | • | 4 4 | • 4 | • | • 4 | • 4 4 4 4 |
| * · | • | • 4 | • | 4 | ♦ 4 | 4 4 4 4 4 |
| • | • 4 | ♦ 4 | ♦ | 4 · | 4 4 4 4 | |
| ♦ 4 4 | ♦ | • | • 4 4 4 | 4 4 4 4 4 |
R5 = Glx ou Asx, R6 = Glx ou Lys
e onde os resíduos de cisteína estão ligados por uma ponte dissulfeto intramolecular.
Em outro aspecto específico a presente invenção compreende processos de produção de compostos contendo as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO; 3, SEQ ID NO: 4, seus sais, solvatos ou compostos análogos, purificados, através da purificação de misturas de compostos de origem sintética, semi-sintética ou biológica; como por exemplo: o veneno bruto de Crotalus durissus terrificus ou ainda culturas celulares, de microorganismos recombinantes, ou seus respectivos lisados; utilizando-se processos de precipitação seletiva e/ou separação por cromatografia.
No caso da precipitação seletiva, o uso de soluções de ácido trifluoroacético em misturas de acetonitrila e água, especialmente em concentração de cerca de 0,1% de ácido trifluoroacético em misturas de acetonitrila e água numa proporção de aproximadamente 1:2 é particularmente útil.
Para a separação por cromatografia, o uso de colunas de HPLC com fase reversa e o emprego de fase móvel com gradiente de concentração, e o uso soluções de ácido trifluoroacético em acetonitrila e água como fase móvel é particularmente útil.
Exemplos de processos de síntese e purificação de compostos análogos aos peptídeos com sequência SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 compreendem, por exemplo (sem todavia se limitar), aqueles descritos na publicação “Amino Acid and Peptide Synthesis”, 2nd Edition, Oxford University Press, Bath, Great Britain; Principies of Biochemistry, 3rd Edition, Worth Publishers, USA.
Em um sexto aspecto principal independente, a presente invenção compreende métodos de identificação de compostos que mimetizam a atividade analgésica de um peptídeo que tem a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 3.
Em um sexto aspecto específico, a presente invenção compreende métodos de identificação de compostos que mimetizam a atividade analgésica de um peptídeo que tem a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 caracterizados por compreenderem as etapas de:
• ··« · ··· · · ··· · ·
16/48 • · · · · · ·· « · ·*·· « · · · ···* *··«· • ······· * · · · *·· · · * · · · « ·· ··
a) conduzir análise biológica de um peptídeo com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, para determinação da atividade analgésica,
b) conduzir a análise biológica de um composto a ser testado, para determinar sua atividade analgésica e
c) comparar os resultados obtidos a partir da análise biológica da SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 com os resultados obtidos a θ partir da análise biológica do composto a ser testado.
ou
a) colocar um peptídeo com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ
ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, marcado, em contato com uma amostra,
b) adicionar um composto teste à amostra em contato com um peptídeo com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4, marcado, e
O
c) medir a ligação do peptídeo com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, marcado, com a amostra.
Exemplos de métodos de identificação de compostos que mimetizam a atividade analgésica de peptídeos estão descritos (sem todavia se limitar), por exemplo, na publicação US5877026 (Lampe R.A., 1999).
A presente invenção é complementarmente ilustrada pelos seguintes exemplos 30 experimentais, não limitantes:
17/48
Μ·
9
EXEMPLO 1. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DO ENPAK-k A PARTIR DO VENENO DE Crotalus durissus terrificus.
mg veneno bruto liofilizado, de serpentes Crotalus durissus terrificus (fornecido pelo Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan) foram diluídos em 1,5 ml de uma solução 1:2 de acetonitrila/água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA). O sobrenadante foi fracionado por uma coluna Sep-Pak Cig (2 g, 12 cc, Millipore) e eluído em diferentes concentrações de acetonitrila/água (contendo 0,1% de TF A), Este procedimento foi repetido 60 vezes, e o “pool” obtido das frações de cada concentração de acetonitrila/água foi liofilizado.
A fração obtida na eluição de 20% de acetonitrila/água (contendo 0,1% de ácido trifluoroacético - TF A) foi dissolvida em água e submetida a uma coluna de HPLC de fase reversa (Shimadzu Co. Ltd.), usando uma coluna CAPCELL PAK Cjg, 6 mm x 150 mm (Shiseido Co. Ltd.) em gradiente linear de 15% a 35% de acetonitrila/água (contendo 0,1 % de TF A), com fluxo de 1 ml/min por 25 minutos à temperatura ambiente. A fração obtida no tempo de retenção de 10,7 minutos foi coletada com monitoramento espectrofotométrico por UV, no comprimento de onda de 215 nm.
A fração obtida foi novamente submetida ao HPLC, utilizando uma coluna CAPCELL PAK Cis, 6 mm x 150 mm em isocrático de 15% de acetonitrila/água (contendo 0,1 % de TF A), com fluxo de 1 ml/min à temperatura ambiente, e a fração obtida no tempo de retenção de 14 minutos foi coletada com monitoramento espectrofotométrico por UV, no comprimento de onda de 215 nm. A fração resultante demonstrou alto grau de pureza em espectrometria de massa MALDI-TOF usando Ettan MALDI-Tof/Pro (Amersham Biosciences), com pico iônico molecular [(M+H)+, monoisotópico] em m/z 1534,6. Esta fração foi liofilizada e denominada de ENPAK-k na presente invenção.
EXEMPLO 2. DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DO ENPAK-k.
A seqüência de aminoácidos do peptídeo resultante foi determinada por espectrometria de massa, uma vez que não foi obtida seqüência por degradação de Edman, devido ao bloqueio do N-terminal.
18/48
| 4 4 | 4 4 4 | • · ·· » « | 4 4 4 4 | 4 |
| 4 4 | 4 | • · · · · · | 4 4 4 | 4 4 |
| 4 | ······· | 4 4 4 | 4 | |
| 4 4 4 | • · · · * · | 4 4 4 | 4 * |
Inicialmente a ponte dissulfeto foi reduzida e alquilada. Uma alíquota do ENPAK-k puro resultante foi dissolvida em 10 μΐ de água. A esta solução foi adicionado 10 μΐ de 5 mM de ditiotreitol em 25 mM de tampão de bicarbonato de amônia, e a solução foi mantida a 60 °C por 30 min. Após resfriar à temperatura ambiente, 10 μΐ de uma solução 55 mM de iodoacetamida em 25 mM de tampão de bicarbonato de amônia foi adicionado e então mantido em temperatura ambiente por 30 minutos. O MALDI-TOF MS deste produto mostrou pico iônico molecular [(M+H)+, monoisotópico] em m/z 1650,7, demonstrando que existe uma ponte dissulfeto no peptídeo natural.
A seqüência do peptídeo reduzido-alquilado foi analisado por ESI tandem espectrometria de massa usando Q-Tof Ultima™ (Micromass). A tandem espectrometria de massa de dupla carga iônica [(M+2H)2+, monoisotópica] em m/z 825,90 proporcionou séries de íons b e y, gerando uma seqüência de 14 resíduos de aminoácidos hipotética representada por: pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys/Gln-Gly15 Glu-Ser-Lys/Gln-Pro-Cys, considerando os dados obtidos com a espectrometria de massa, onde pGlu mostra resíduo de piroglutamato, e Lys/Gln implica que é possível tanto Lys ou Gin nesta posição. Os 2 resíduos de Cys estão ligados um ao outro por uma ponte dissulfeto.
Assim, existiríam 4 possíveis seqüências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 que corresponderíam ao ENPAK-k. As seguintes seqüências foram obtidas:
pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 2) pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 3) pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 6) 30 pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys~Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 7)
19/48 • · * ·«·· · « · · · · · · ·· « · · *·· * · · · · · • · ······· · » · · • ·♦· * · · ·«· · ·· ··
Onde os resíduos de cisteína estão ligados por uma ponte díssulfeto intramolecular e os aminoácidos são representados pelo código de três letras correspondendo, respectivamente a:
pGlu = piroglutamato Phe = fenilalanina Ser = serina Pro = prolina Glu = ácido glutâmico Asn = asparagina Cys = cisteina Gin = glutamina Lys = lisina Gly = glicina
Essas sequências de aminoácidos, quando comparadas a sequências de proteínas conhecidas, depositadas no banco de dados da Swiss Prot, mostraram que o peptídeo SEQ ID NO: 2 tem identidade com a seqüência de aminoácidos da porção C-terminal da crotapotina, sub-unidade ácida, não tóxica da crotoxina do veneno de serpente da espécie Crotalus durissus terrificus (Faure G, Guillaume JL, Camoin L, Saliou B, Bon C. Biochemistry, 1991,13,8074-8083); exceto pelo fato de os resíduos de cisteína na porção C-terminal da crotapotina não apresentam ponte dissulfeto intramolecular como o peptídeo SEQ ID NO: 2:
Porção C-terminal da crotapotina, sub-unidade ácida, não tóxica da crotoxina do veneno de serpente da espécie Crotalus durissus terrificus'.
pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 8)
EXEMPLO 3. SÍNTESE DOS PEPTÍDEOS SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, COMO EXEMPLO NÃO LIMITANTE.
• ·** · ·«· * < ·»« · *
20/48 * · » « ·· · · « · · · « « • ··· · · « · « · · ·« • ······» · « · * ·♦· » « · ««« · «· ··
Os peptídeos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 foram obtidos através de síntese peptídica manual em fase sólida, através da estratégia Fmoc, utilizando-se como suporte sólido a resina H-Cys(Trt)-2-ClTrt .
Cada um dos peptídeos sintetizados foi então clivado da resina pela adição de ácido acético/trifluoroetanol/diclorometano (1:1:8) em temperatura ambiente, por 1 hora, seguido pela desproteção por uma solução de TFA/tioanisol/l,2-etanoditiol (94:5:1), também em temperatura ambiente, por 2 horas. Após os tratamentos, éter foi adicionado à solução de TFA para precipitar os peptídeos. O precipitado foi lavado 3 vezes com éter para se obter os peptídeos brutos SH-livre. A ponte dissulfeto foi formada pelo tratamento com solução de metanol e iodina O,1M em temperatura ambiente, por 30 minutos, seguido pela adição de uma solução aquosa de ácido ascórbico 0,lM. Em seguida, os peptídeos brutos obtidos foram purificados por HLPC de fase reversa utilizando YMC-Pak ODS, 20 x 150 mm (Yamamura Kagaku Co. Ltd.) em gradiente linear de 15% a 35% de acetonitrila/água contendo 0,1% TFA com fluxo de 8 ml/min por 25 minutos, em temperatura ambiente. A comparação dos peptídeos sintéticos resultantes:
pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 2) pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 3) pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 6) pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 7) onde os resíduos de cisteína estão ligados por uma ponte dissulfeto intramolecular, com o peptídeo natural ENPAK-k, em HPLC e espectrometria de massa, demonstrou que o peptídeo SEQ ID NO: 2 é idêntico ao ENPAK-k natural. Complementarmente, o peptídeo SEQ ID NO: 2 demonstrou a mesma atividade analgésica que o ENPAK-k
21/48
| # * | 4 4 4 | * | 4 4 4 | * * | * 4 4 | 4 | 4 |
| * 4 | • | • 4 | • » | • · · | « | 4 í | 4 4 |
| • | • 4 | 4 | • · «. | 4 | • 4 | 4 4 | |
| • | • * | 4 4 | * * · | 4 4 | 4 | 4 | |
| 4 4· | 4 | 4 | e ·» · | 4 | • 4 | 4 4 |
natural. O peptídeo SEQ ID NO: 3 também demonstrou atividade analgésica, enquanto que os outros 2 peptídeos (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7) se mostraram inativos em condições semelhantes.
Com base em estudos de modelagem molecular das seqüências SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, outras seqüências importantes para a presente invenção foram evidenciadas:
Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys (SEQIDNO: 1) especialmente
Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys (SEQ ID NO: 4) onde:
Xaa é sempre piroglutamato,
RI - Phe ou Trp ou Tyr ou Leu ou Thr,
R2 = Pro ou Arg,
R3 = Glx ou Asx ou Gly,
R4 = Asn ou Gin ou Leu,
R5 = Glx ou Asx,
R6 = Glx ou Lys,
EXEMPLO 4. IDENTIFICAÇÃO DA FRAÇÃO ANALGÉSICA EM CADA ETAPA DE PURIFICAÇÃO: MODELO DE PRESSÃO DE PATA
Para os testes comportamentais, objetivando avaliação da sensibilidade dolorosa dos animais, foram utilizados Ratos Wistar machos, pesando entre 170-190 g, fornecidos pelo Biotério Central do Instituto Butantan. Os animais foram mantidos no laboratório, com ciclo claro/escuro de 12/12 horas e temperatura controlada a 22±1° C, com livre acesso à água e ração. O protocolo utilizado foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan (CEUAIB) sob o número 019/2000.
Para a avaliação da sensibilidade dolorosa dos animais foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos (Analgesy-Meter Ugo Basile®, Itália), realizado de acordo com
22/48
| 4 · | • fc * | « «6 | • * | • ·· | * | • | |
| • · | » | • · | • · · | • | • » | V · | |
| « · | * | • · | * | • 1 « | • | ♦ · | 4« |
| • | 4 t | 4 · | « · · | ♦ · | « | • | |
| * ·· | 4 | • | • · « · | • | * · | • 4 |
o método descrito por Randall & Selitto (Randall L.O. e Selitto J.J. Arch. Intem. Pharmacodyn. 111:209-219, 1957).
Neste teste, uma força em gramas (g), de magnitude crescente (16 g/s), é continuamente aplicada sobre o dorso de uma das patas posteriores do rato e interrompida quando o animal apresenta a reação de retirada do membro. Neste modelo, o limiar de dor é representado como a força (g) necessária para a indução da reação. Este teste foi aplicado antes do início dos tratamentos (medida inicial) e 3 horas após (medida final) a indução da hiperalgesia.
Para indução de hiperalgesia, uma solução estoque de prostaglandina E2 (PGE2) foi preparada, dissolvendo-se 500 pg de PGE2 em 1 ml de etanol. No momento do uso, essa solução estoque foi novamente diluída em salina estéril. A dose de prostaglandina utilizada foi de 100 ng em 100 μΐ de salina, administrada por via i.pl. A hiperalgesia foi avaliada 3 horas após a injeção do irritante.
A cada etapa da purificação, o material obtido no fracionamento foi diluído em um volume de 11 ml de salina. Cada animal recebeu 2 ml desta solução, administrada por via oral, imediatamente antes da indução da hiperalgesia. Animais injetados com salina, por via oral, foram utilizados como controles.
EXEMPLO 5. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA E DA DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO NATURAL ENPAK-k ISOLADO DO VENENO DE Crotalus durissus terrificus
O peptídeo natural, ENPAK-k, isolado a partir da purificação de 60 mg de veneno bruto, conforme o EXEMPLO 1, foi diluído em um volume de 33 ml de salina. Cada animal recebeu 2 ml desta solução, administrada por via oral (p.o.), imediatamente antes da indução da hiperalgesia. Animais que receberam salina, por via oral, foram utilizados como controles.
Para a avaliação da sensibilidade dolorosa foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos. O limiar de dor, representado pela força (em gramas) necessária para a retirada da pata, foi determinado antes (tempo 0) e 3, 72 e 120 horas (medidas finais) após o tratamento, p.o., com o peptídeo natural (ENPAK-k) ou salina (grupo controle). Prostaglandina (100 ng/pata), utilizada como agente hiperalgésico, foi injetada 3 horas
23/48 • ··· · ··· » · · · · · · • · · · ·· · · • · · · * e · • ··*··· • · · • · • · • * · ·· · · • · « · ·· • · • · • · ♦ · ·· antes de cada medida final. Os dados apresentados na Tabela 1 representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
TABELA 1: EFICÁCIA E DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO 5 PEPTÍDEO NATURAL (ENPAK-k) ISOLADO DO VENENO DE Crotalus durissus terriflcus.
| Tratamento | Oh MI (g) + epm | 3h MF (g) + epm | 72h MF (g) + epm | 120h MF (g) ± epm |
| Salina | 76+1,00 | 56+ 1,87* | 58 + 1,22* | 57 ±1,22* |
| Peptídeo Natural | 77 ± 2,00 | 118 + 2,55*# | 113 + 2,55*# | 112 ±3,39*# |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial 10 # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
MI = medida inicial; MF - medida final; g - peso em gramas
O presente exemplo mostra não só a eficácia, mas também a longa duração do efeito antinociceptivo do peptídeo natural ENPAK-k isolado do veneno de serpentes
Crotalus durissus terriflcus.
EXEMPLO 6. CURVAS DOSE-RESPOSTA DA ATIVIDADE ANALGÉSICA DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2 COMO EXEMPLO NÃO
LIMITANTE
O peptídeo sintético SEQ ID NO: 2, em diferentes doses, foi diluído em salina, e administrado por diferentes vias, imediatamente antes da indução da hiperalgesia. Animais que receberam salina pelas mesmas vias, foram utilizados como controles.
Para indução de hiperalgesia, prostaglandina E2, na dose de 100 ng/pata foi 25 administrada por via intraplantar (i.pl.) A hiperalgesia foi avaliada antes (medida inicial
- MI) e 3 horas após (medida final - MF) a injeção do irritante.
Para a avaliação da sensibilidade dolorosa, foi utilizado 0 teste de pressão da pata de ratos. O limiar de dor, representado pela força (em gramas) necessária para
24/48
induzir a retirada da pata, foi determinado antes (medida inicial) e 3 horas após (medida final) a injeção intraplantar de prostaglandina E2(100 ng/pata). O peptídeo sintético foi administrado, pelas seguintes vias e nas seguintes doses, imediatamente antes do agente lesivo.
A) Por via oral, em um volume de 2 ml, nas doses de 0,0016; 0,008; 0,04; 0,2; 1;
e 25 pg/kg, imediatamente antes da indução da hiperalgesia (tabela 2).
B) Por via intraplantar, em um volume de 50 pl, nas doses de 0,00000256;
0,0000128; 0,00032 e 0,0016 pg/pata, imediatamente antes da indução da hiperalgesia (tabela 3).
C) Por via intravenosa, em um volume de 200 pl, nas doses de 0,0000128,
0,000064, 0,00032, 0,0016 e 0,008 pg/kg, imediatamente antes da indução da hiperalgesia (tabela 4).
D) Um grupo adicional foi testado, utilizando-se morfina, para comparação do efeito antinociceptivo. A morfina foi administrada, por via oral, nas doses de 0,004; 0,2; 1 e 5 pg/kg (tabela 5).
Salina, administrada pelas respectivas vias, foi utilizada como controle de todos os experimentos.
Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medidas iniciais e finais ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais, e foram utilizados para definir a DE50, DEêo e DE 90.
Nas tabelas 2, 3, 4 e 5: MI = medida inicial; MF = medida final; g = peso em gramas; Dose do peptídeo em pg/kg, quando administrado pelas vias oral e intravenosa, ou em pg/pata, quando administrado pela via intraplantar; Os dados representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
f
P «FÍWFP
25iW>
TABELA 2: CURVA DOSE-RESPOSTA DA ATIVIDADE ANALGÉSICA DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, ADMINISTRADO POR VIA ORAL, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2.
| Tratamentos | MI (g) ± epm | MF (g) ± epm |
| Salina (p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 77+1,34 | 56 ± 1,30* |
| Peptídeo (0,0016, p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 78 ± 1,22 | 64 ±1,00* |
| Peptídeo (0,008, p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 79 ± 1,25 | 71 ±2,39# |
| Peptídeo (0,04, p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 77 ± 1,22 | 75 ±1,87# |
| Peptídeo (0,2, p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 77 ± 2,00 | 84 ± 1,87# |
| Peptídeo (1,0, p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 77 ± 2,00 | 108 ±2,00 *# |
| Peptídeo (5,0, p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 78 ± 2,00 | 130 ±1,58*# |
| Peptídeo (25,0, p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 79 ± 1,87 | 133 ±3,39*# |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
O presente exemplo evidencia o potente efeito analgésico do peptídeo sintético
SEQ ID NO: 2, administrado por via oral, no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2. Para determinação das doses-efetivas, os dados foram analisados através da determinação da porcentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia), comparando-se as medidas finais com as medidas iniciais, seguida da determinação da porcentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados com o peptídeo com o grupo controle, através do programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as dose-efetivas 50, 60 e 90 % do peptídeo, neste exemplo, foram 0,004146; 0,006348 e 0,02106 pg/kg, respectivamente. Cabe ressaltar que somente as doses de 0,0016; 0,008; 0,04 e 0,2 foram utilizadas para a determinação das doses efetivas.
TABELA 3: CURVA DOSE-RESPOSTA DA ATIVIDADE ANALGÉSICA DO
PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, ADMINISTRADO POR VIA
2614%
| • · | • · 9 | • | 9 «9 | • 9 | • ** 9 9 | |
| « 9 | • | • | • | • 9 | 9 9 V | • · · · · |
| ♦ · | • | ♦ | * | • | 9 9 9 | * · · · · |
| • | • | • | • | • 9 | ♦ 9 · | • · · · |
| • | • 9 9 | 9 | • | • 9 9 9 | • · · · · |
/
INTRAPLANTAR, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR oS
PROSTAGLANDINA E2. '
| Tratamentos | MI (g) ± epm | MF (g) ± epm |
| Salina (i.pl.) + PGE2 (i.pl.) | 75 ± 1,83 | 40 ±3,10* |
| Peptídeo (0,00000256) (i.pl.) + PGE2 (i.pl.) | 72+1,12 | 57 ± 5,34 * |
| Peptídeo (0,0000128) (i.pl.) + PGE2 (i.pl.) | 71 ±2,39 | 62 ±3,22# |
| Peptídeo (0,00032) (i.pl.) + PGE2 (i.pl.) | 67 ±2,35 | 60 ± 3,25 # |
| Peptídeo (0,0016) (i.pl.) + PGE2 (i.pl.) | 72 ±1,84 | 67 ± 1,12# |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
O presente exemplo evidencia o potente efeito analgésico do peptídeo sintético SEQ ID NO: 2, administrado por via intraplantar, no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2. Para determinação das doses-efetivas, os dados foram analisados através da determinação da porcentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia), comparando-se as medidas finais com as medidas iniciais, seguida da determinação da porcentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados com o peptídeo com o grupo controle, através do programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as dose-efetivas 50, 60 e 90 % do peptídeo, neste exemplo, foram 0,000002327; 0,000004904 e 0,0028758 pg/kg, respectivamente.
TABELA 4: CURVA DOSE-RESPOSTA DA ATIVIDADE ANALGÉSICA DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, ADMINISTRADO POR VIA
INTRAVENOSA, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2.
| Tratamentos | MI (g) ± epm | MF (g) ± epm |
| Salina+ PGE2 (i.pl.) | 72 ±1,83 | 44 ± 2,67 * |
·♦
27/48 • 4 4 4 4
4 4 4 «
4 4 4 4
4 4 4
| Peptídeo (0,0000128) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) | 70 ± 2,05 | 54 ±3,04* |
| Peptídeo (0,000064) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) | 68 ± 1,44 | 54 ± 2,39 |
| Peptídeo (0,00032) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) | 72+1,84 | 63 ±5,16# |
| Peptídeo (0,0016) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) | 74 + 0,92 | 67 ±2,35# |
| Peptídeo (0,008) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) | 69 ±2,26 | 73 ± 4,74 # |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
O presente exemplo evidencia o potente efeito analgésico do peptídeo sintético
SEQ ID NO: 2, administrado por via intravenosa, no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2. Para determinação das doses-efetivas, os dados foram analisados através da determinação da porcentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia), comparando-se as medidas finais com as medidas iniciais, seguida da determinação da porcentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados com o peptídeo com o grupo controle, através do programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as dose-efetivas 50, 60 e 90 % do peptídeo administrado por via i.v., neste modelo, foram 0,0000458; 0,0002144 e 0,002701 pg/kg, respectivamente.
TABELA 5: CURVA DOSE-RESPOSTA DA ATIVIDADE ANALGÉSICA DA MORFINA, ADMINISTRADA POR VIA ORAL, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2.
| Tratamentos | MI (g) ± epm | MF (g) ± epm |
| Salina (p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 77 ±2,55 | 59 ± 1,87* |
| Morfina (0,004) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 77 ±1,22 | 69 ±1,87# |
| Morfina (0,2) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 76 ±1,87 | 70 ±1,58# |
| Morfina (1) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 78 ±1,22 | 85 ± 1?58 # |
| Morfina (5) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 78 ±1,22 | 109 ±1,87 *# |
Dose da morfina = pg/kg
28/48
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
O presente exemplo evidencia o efeito analgésico da morfina, administrada por via oral, no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2. Para determinação das dosesefetivas, os dados foram analisados através da determinação da porcentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia), comparando-se as medidas finais com as medidas iniciais, seguida da determinação da porcentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados com a morfina com o grupo controle, através do programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as dose-efetivas 50, 60 e 90 % da morfina, via oral, neste modelo, foram 0,0551516; 0,100504 e 0,326728 pg/kg, respectivamente.
EXEMPLO 7. AVALIAÇÃO DA DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2
Demonstrado o efeito antinociceptivo do peptídeo no modelo de hiperalgesia induzida por prostaglandina E2, foi investigada a duração deste efeito. Para a avaliação da sensibilidade dolorosa, foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos. O limiar de dor, representado pela força (em gramas) necessária para a retirada da pata, foi determinado antes (medida inicial) e 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas após a administração, por via oral, do peptídeo sintético na dose de 1 pg/kg ou salina (controle). PGE2, na dose de 100 ng/pata, foi administrada nos diferentes grupos, sempre 3 horas antes da medida final (tabela 6).
TABELA 6: DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NA HIPERALGESIA INDUZIDA POR PGE2.
| Tempo após a administração do peptídeo (horas) | |||||||
| 0 | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 | 144 | |
| Tratamentos | MI(g) | MF (g) | MFjgL | MFfe) | MFfe) | MFfe) | MF(g) |
• 4 · / 48 • 4 4 4 4 • 4 4 · «4 • · 4 4 4 •*••44 • •44
| ± epm | ± epm | + epm | + epm | + epm | + epm | + epm | |
| Salina | 78 + 1,66 | 58 ± 1,66* | 62 + 1,66* | 58 + 3,33* | 56 ± 1,87* | 57 ± 2,55* | 57 + 1,22* |
| Peptídeo | 79 ± 1,00 | 126 + 3,32*# | 121 ± 1,87*# | 111 + 4,3*# | 117± 2,5*# | 130 ± 2,24*# | 59 + 2,39* |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
MI = medida inicial; MF = medida final; g = peso em gramas
Os resultados demonstraram que o peptídeo foi capaz de induzir antinocicepção por até 120 horas após uma única administração.
O
EXEMPLO 8. AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES
OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PGE2
Para a avaliação da sensibilidade dolorosa, foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos; o limiar de dor, representado pela força (em gramas) necessária para induzir a retirada da pata, foi determinado antes (medida inicial, MI) e 3 horas após (medida final, MF) a injeção intraplantar de prostaglandina E2(100 ng/pata). O peptídeo sintético (1 pg/kg) ou salina (grupo controle), foram administrados por via oral, imediatamente antes do agente lesivo (PGE2). ICI 174,864 - ICI (10 pg/pata), antagonista de receptores opióides delta, nor-Binaltorfimina - BNI (50 pg/pata), antagonista de receptores opióides kappa e CTOP (20 pg/pata), antagonista de receptores opióides mu foram administrados por via intraplantar (i.pl.) concomitante à injeção de PGE2 (tabela 7). Os dados representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
Ainda, os antagonistas de receptores kappa e delta foram também testados na antinocicepção induzida pelo peptídeo, na dose de 5 pg/kg (tabela 8). Os dados representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
TABELA 7: AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO (1 pg/kg) NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA
!LHIH5|JEF
| Tratamentos | MI (g) ± epm | MF (g) ± epm |
| Salina+ PGE2 | 78 ±1,44 | 56 ± 1,25* |
| Peptídeo + PGE2 | 77 ±1,22 | 111 ±3,32 *# |
| Peptídeo + PGE2 + ICI 174,864 | 78 ±1,22 | 114 ±1,00 *# |
| Peptídeo + PGE2 + nor-Binaltorfimina | 77 ±1,22 | 56+ 1,87* |
| Peptídeo + PGE2 + CTOP | 77 ±1,22 | 114 ± 1,87 *# |
| Salina + PGE2 + ICI 174,864 | 75 ± 2,04 | 57 ±3,22* |
| Salina + PGE2 + nor-Binaltorfimina | 72 ±1,44 | 56+ 1,25* |
| Salina+ PGE2+CTOP | 74±2,39 | 56 ±2,39* |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
MI = medida inicial; MF = medida final; g = peso em gramas
Esses dados indicam que no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2 os receptores opióides do tipo kappa estão envolvidos na atividade antinociceptiva do peptídeo sintético SEQ ID NO: 2 (1 pg/kg).
TABELA 8: AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO (5 pg/kg) NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA
| Tratamentos | MI (g) ± epm | MF (g) ± epm |
| Salina + PGE2 | 78 ±1,44 | 59 ± 2,39* |
| Peptídeo + PGE2 | 77 ±1,22 | 147 + 2,55 *# |
| Peptídeo + PGE2 + nor-BNI | 77 ±1,05 | 58 ± 2,47* |
| Peptídeo + PGE2 + ICI 174,864 | 77 ±1,05 | 145 ±2,89 *# |
| Salina + PGE2 + nor-BNI | 72 ±1,44 | 56 ± 1,25* |
• · · • · ·
31/48
| Salina + PGE2 + ICI 174,864 | 75 ± 2,04 | 57 ±3,22* |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
MI = medida inicial; MF = medida final; g = peso em gramas
Esses dados indicam que no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2 os receptores opióides do tipo kappa estão envolvidos na atividade antinociceptiva do peptídeo sintético SEQ ID NO: 2, mesmo quando utilizado em maior dose (5 pg/kg),
EXEMPLO 9. ATIVIDADE ANALGÉSICA DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR CARRAGENINA COMO EXEMPLO NÃO LIMITANTE
Ainda, utilizando-se o modelo de pressão de pata de ratos, foi avaliado o efeito antinociceptivo deste peptídeo na hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina. O teste foi aplicado antes do início dos tratamentos (medida inicial) e 3 horas após (medida final) a indução da hiperalgesia inflamatória por carragenina (200 pg/pata). O peptídeo sintético foi administrado, por via oral (2 ml), na dose de 1 pg/kg, imediatamente antes da indução da hiperalgesia (tabela 9). Salina, administrada por via oral, foi utilizada como controle. Os dados representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
TABELA 9: EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR CARRAGENINA
| Tratamentos | MI (g) ± epm | MF (g) ± epm |
| Salina + carragenina | 77 ± 2,00 | 57 ± 2,00* |
| Peptídeo + carragenina | 77 ± 2,00 | 116 ± 1,87 *# |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial
32/48
·«« ··» • · · · · • · · * · * · • · · · · · • · · · · · • ·« · · • · • · • · · • · * · * · · · • · · · *· ·« * · • · · · # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina)
MI = medida inicial; MF = medida final; g = peso em gramas
Os dados demonstram que o peptídeo sintético foi capaz de acarretar antinocicepção, também no modelo de hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina.
EXEMPLO 10. DETERMINAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NA ATIVIDADE ANALGÉSICA DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR CARRAGENINA
Da mesma maneira que no modelo da PGEo, foi investigada a participação de receptores opióides no efeito antinociceptivo do peptídeo SEQ ID NO: 2, neste modelo (tabela 10). Para tanto, os animais foram tratados com CTOP, antagonista específico de receptor μ (20 pg/pata), nor-BNI, antagonista específico de receptor κ (50 pg/pata) ou com ICI 174,864, antagonista específico de receptor δ (10 pg/pata), injetados concomitante à carragenina. O peptídeo foi administrado na dose de 1 pg/kg, por via oral, imediatamente antes da carragenina. Os dados representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
TABELA 10: AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO (1 pg/kg) NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR CARRAGENINA
| Tratamentos | MI (g) + epm | MF (g) ± epm |
| Salina + carragenina | 75 ± 2,04 | 57 + 1,44* |
| Peptídeo + carragenina | 77 + 1,22 | 129 + 1,87 *# |
| Peptídeo + carragenina + CTOP | 76 + 1,87 | 126 + 2,92 *# |
• ·
33/48
* · * · · • · ** « · ♦ · · · · ······ • · · · »· · · • · · · · • · · · « * • * · · «· * · · · ··· · · · *>«
| Peptídeo + carragenina + nor-BNI | 78 ±2,00 | 56 ±1,00* |
| Peptídeo + carragenina + ICI 174,864 | 77 ±1,22 | 128 ±2,00 *# |
| Salina + carragenina + CTOP | 73+1,25 | 49 ±1,25* |
| Salina + carragenina + nor-BNI | 72 ±1,12 | 52 + 2,79* |
| Salina + carragenina +10174,864 | 72 + 1,7 | 51 ±2,47* |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle.
MI = medida inicial; MF = medida final; g = peso em gramas
Da mesma maneira que no modelo da PGE2, apenas o antagonista de receptores opióides kappa foi capaz de reverter totalmente o efeito antinociceptivo do peptídeo, sem alterar a hiperalgesia induzida pela carragenina.
EXEMPLO 11. ATIVIDADE ANALGÉSICA DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NA HIPERALGESIA INDUZIDA PELA CONSTRIÇÃO CRÔNICA DO NERVO CIÁTICO, UM MODELO DE DOR PERSISTENTE.
Para a indução de dor neuropática, foi realizada cirurgia no nervo ciático, de acordo com o método descrito por Bennett, G.J and Xie, Y.K, (Pain, 33:87-107, 1988), Os animais foram anestesiados com halotano, O nervo ciático foi exposto na região mediana da coxa, afastando-se o músculo bíceps femoral. Próximo à trifurcação do nervo ciático,7mm de distância da trifurcação, foram realizadas 4 ligaduras (categute cromado 4-0) frouxas ao redor deste, distantes entre si em aproximadamente lmm. As ligaduras foram realizadas ao longo do nervo, até 4-5mm do ponto inicial. A incisão foi suturada em camadas, utilizando fio de sutura de seda número 4-0.
EXEMPLO 11 A. AVALIAÇÃO DA HIPERALGESIA
Para avaliação da hiperalgesia, foi utilizado 0 teste de pressão da pata de ratos (Analgesy-Meter Ugo Basile®, Itália), realizado de acordo com o método descrito por
Randall & Sellito (1957). O teste foi aplicado antes (medida basal-MB) e no 14° dia • · · • * ·
34/48
* · * · • · ♦ * · ♦ · ♦· ·» • · · · · ··« · ·· ·» após a cirurgia, para caracterizar o aparecimento da dor neuropática. No 14° dia póscirúrgico, o teste foi aplicado antes (medida inicial - MI) e 1, 3, 24, 48, 72 e 96 horas após a administração do peptídeo sintético, nas doses de 0,0016; 0,008; 0,04; 0,2; 1 e 5 pg/kg, por via oral, ou salina, como controle (tabela 11).
Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medidas iniciais e finais ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
TABELA 11: DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 SOBRE A HIPERALGESIA INDUZIDA POR CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO.
| Tratamentos | MB | MI | MF Ih | MF 3h | MF 24h | MF 48h | MF 72h | MF 96h |
| Salina | 73 + 1,44 | 33 ± 1,44* | 30 + 0,00* | 30 ± 0,00* | 30 ± 0,00* | 34 ± 1,25* | 33 + 1,44* | 33 + 1,44* |
| P 0,0016 | 72 + 1,22 | 33 ± 1,22* | 32 ± 1,22* | 32 ± 1,22* | 33 ± 1,22* | 30 ± 0,00* | 32 ± 1,22* | 32 + 1,22* |
| P 0,008 | 74 ± 1,87 | 33 + 1,22* | 34 ± 1,00* | 30 ± 1,58* | 30 ± 0,00* | 33 ± 1,22* | 31 ± 1,00* | 32 + 1,22* |
| P0,04 | 71 ± 1,00 | 33 + 1,22* | 29 ± 1,00* | 30 ± 0,00* | 31 + 1,00* | 33 ± 1,22* | 33 ± 0,00* | 33 ± 1,22* |
| P 0,2 | 73 + 1,22 | 31 ± 1,00* | 51 + 1,87 *§# | 56 ± 1,87 *§# | 52 ± 1,22 *§# | 54 ± 1,00 *§# | 53 + 1,22 *§# | 33 ± 1,22* |
| P 1 | 72 + 1,22 | 31 + 1,00* | 73 ± 1,22§# | 73 ± 1,22§# | 71 ± i,00§# | 74 ± I,oo§# | 71 ± l,00§# | 33 ± 1,22* |
| P5 | 72 + 0,79 | 32 ± 0,79* | 100 ± 4,42 *§# | 98 + 4,28 *§# | 99 ± 3,51 *§# | 93 ± 3,00 *§# | 86 + 2,45 *§# | 33 + 1,18* |
• · · •»·
35/48
MB = medida basal antes da cirurgia, MI = medida inicial do 14° dia do pós-operatório, antes da administração do peptídeo; MF = medida final do 14° dia pós-cirúrgico, em diferentes tempos após a administração do peptídeo ou salina; g = peso em gramas Doses do peptídeo em pg/kg.
O peptídeo ou salina foram administrados no 14° dia, logo após a determinação da MI. Os valores da MB, MI e MFs estão representados em gramas (g) ± epm.
*p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial do 14° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
Os dados obtidos demonstraram que o peptídeo foi capaz de acarretar efeito antihiperalgésico, no modelo de dor neuropática, que perdurou por até 3 dias após administração de uma única.
Para a determinação das doses efetivas: 50, 60 e 90%, foram utilizados os resultados obtidos 1 hora após o tratamento dos animais com o peptídeo sintético nas doses de 0,0016; 0,008; 0,04; 0,2 e 1 pg/kg. Para determinação das doses-efetivas, os dados foram analisados através da determinação da porcentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia), seguida da determinação da porcentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados com o peptídeo com o grupo controle, através do programa CurveExpert 1.3. A análise de regressão demonstrou que estas doses correspondem a 0,205517; 0,283173 e 0,5747158 pg/kg, respectivamente.
EXEMPLO 11B. DETERMINAÇÃO DA ALODINIA.
A alodinia foi avaliada por ensaio quantitativo, em resposta a estímulo tátil aplicado às patas do rato, segundo método descrito por Chaplan et al. (1994), modificado. Neste teste, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas plásticas, com fundo de arame, para permitir acesso às patas destes animais. Foi empregada uma série logarítmica de 10 filamentos de von Frey (Aesthesiometer Semmer-Weinsteín, Stoelting Co., E.U.A). A calibração dos filamentos é definida como log 10 (mg x 10), tendo os seguintes valores (o valor em gramas está entre parênteses):
36/48 • · * F• * »
r ·· « *
* *»· »
·» «
• · * • * • · • · « · * * »
« « « · * · • · ♦ i.
• « » « « » «· « *
4,74 (5,495g); 4,93 (8,511g); 5,07 (ll,749g) e 5,18 (15,13óg). Cabe ressaltar que os filamentos com peso superior à 15,136g não foram empregados nos estudos de alodinia.
Os filamentos foram aplicados, um a um, perpendicularmente, sob a área plantar de ambas as patas posteriores e mantidos por um período de 8 segundos. O filamento capaz de elicitar a retirada da pata, duas vezes consecutivas, foi considerado como a força em gramas necessária para elicitar a resposta (100% de resposta). Na ausência de resposta ao maior estímulo (15,135g), este filamento será considerado como valor de corte.
O valor da força (em log) para induzir 50% de resposta de retirada da pata foi calculado pela aplicação de uma função psicométrica integral de Gauss, utilizando programa de computador Psycofit
Os tempos para aplicação do teste e os tratamentos foram os mesmos que os utilizados para determinação da hiperalgesia (tabela 12).
Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medidas iniciais e finais ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
TABELA 12: DETERMINAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 SOBRE A ALODINIA INDUZIDA POR CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO.
| Tratamentos | MB | MI | MF lh | MF 3h | MF 24h | MF 48h | MF 72h | MF 96h |
| Salina | 5,04+ | 4,23+ | 4,22+ | 4,22+ | 4,22± | 4,22± | 4,22± | 4,22+ |
| 0,02* | 0,01* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | |
| P 0,0016 | 5,02+ | 4,22± | 4,22± | 4,22+ | 4,22± | 4,22+ | 4,22± | 4,22± |
| 0,03 | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | |
| P 0,008 | 4,99± | 4,22± | 4,22± | 4,22± | 4,22± | 4,22+ | 4,22+ | 4,22± |
| 0,02 | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | |
| P 0,04 | 4,97± | 4,22± | 4,22± | 4,22+ | 4,22± | 4,26± | 4,22± | 4,22+ |
| 0,99 | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,00* | 0,04* | 0,00* | 0,00* |
37/48 ·· • * ·· • · ··· • · • · ·· ··
| P 0,2 | 5,03± 0,02 | 4,22± 0,00* | 4,41± 0,00 *§# | 4,41± 0,00 *§# | 4,41± 0,00 *§# | 4,41± 0,00 *§# | 4,41± 0,00 *§# | 4,22± 0,00* |
| P 1 | 5,06+ | 4,23± | 4,62+ | 4,62± | 4,62± | 4,62± | 4,62± | 4,22+ |
| 0,02 | 0,01* | 0,00 *§# | 0,00 *§# | 0,00 *§# | 0,00 *§# | 0,00 *§# | 0,00 | |
| P5 | 4,99± | 4,23± | 4,94+ | 4,98+ | 4,97± | 4,93± | 4,85± | 4,21± |
| 0,03 | 0,00* | 0,05§# | 0,04§# | 0,03 §# | 0,04 §# | 0,02§# | 0,01 §# |
MB = medida basal antes da cirurgia, MI = medida inicial do 14° dia do pós-operatório, antes da administração do peptídeo; MF = medida final do 14° dia pós-cirúrgico, em diferentes tempos após a administração do peptídeo ou salina; dados expressos como log 10 (mg x 10) ± epm.
Doses do peptídeo em pg/kg.
O peptídeo ou salina foram administrados no 14° dia, logo após a determinação da ΜΪ. *p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial do 14° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina
Os dados obtidos demonstraram que o peptídeo foi capaz de acarretar efeito antialodínico, no modelo de dor neuropática, que perdurou por até 3 dias após administração de uma única dose.
EXEMPLO 11C. DERTEMINAÇÃO DA DOR ESPONTÂNEA.
Para avaliação da dor espontânea, os ratos foram observados no 14° dia após a cirurgia de constrição do nervo ciático, antes e 1, 3, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas após a administração do peptídeo (5 pg/kg) ou salina, por via oral (tabelas 13 e 14). Para a observação dos sinais que caracterizam a dor espontânea, os animais foram colocados um a um, e uma caixa de plástico transparente. Após o período de habituação de 30 minutos, os ratos foram observados durante 10 minutos, determinando-se a duração do tempo (em segundos) de lambida e de levantamento (posição de guarda) da pata. As atividades de lambida e levantamento da pata, realizadas como parte do comportamento normal de “grooming” dos animais, não foram consideradas.
38/48 • · • · • · • ·
TABELA 13. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO CNF021.03 SOBRE A DOR ESPONTÂNEA INDUZIDA POR CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO - DURAÇÃO DO TEMPO (EM S) DE LAMBIDA DA PATA
| Tratamentos | MI | MF lh | MF 3h | MF 24h | MF 48h | MF 72h | MF 96h | MF 120 |
| Salina | 24 ± | 21 ± | 20 ± | 21 ± | 21 + | 22 ± | 22 + | 22 ± |
| 0,6 | 0,3 | 0,8 | 0,5 | 0,5 | 0,6 | 0,5 | 0,6 | |
| Peptídeo | 22 ± | 2± | 2 + | 2 + | 1,5 + | 1,5 ± | 21 ± | 21 ± |
| 0,64 | 0,21*# | 0,21*# | 0,39*# | 0,22*# | 0,22*# | 0,26 | 0,38 |
MI = medida inicial do 14° dia do pós-operatório, antes da administração do peptídeo; MF = medida final do 14° dia pós-cirúrgico, em diferentes tempos após a administração do peptídeo ou salina
Dados expressos como tempo (em segundos) de lambida da pata. Os dados representam 10 a média ± epm de 5 animais por grupo.
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
TABELA 14. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO 15 CNF021.03 SOBRE A DOR ESPONTÂNEA INDUZIDA POR CONSTRIÇÃO DO
NERVO CIÁTICO - DURAÇÃO DO TEMPO (EM S) DE LEVANTAMENTO DA PATA.
| Tratamentos | MI | MF lh | MF 3h | MF 24h | MF 48h | MF 72h | MF 96h | MF 120 |
| Salina | 97 + | 97 ± | 96 ± | 96 + | 96 + | 95 ± | 96 + | 96 + |
| 0,37 | 0,42 | 0,58 | 0,42 | 0,48 | 0,47 | 0,40 | 0,51 | |
| Peptídeo | 97 ± | 2 + | 2± | 2 + | 1,0 + | 2 + | 1,5 + | 95 ± |
| 0,43 | 0,21*# | 0,26*# | 0,22*# | 0,16*# | 0,26*# | 0,16*# | 0,50 |
39/48 • · ♦ · « * • ·
ΜΙ = medida inicial do 14° dia do pós-operatório, antes da administração do peptídeo;
MF = medida final do 14° dia pós-cirúrgico, em diferentes tempos após a administração do peptídeo ou salina
Dados expressos como tempo (em segundos) de levantamento da pata. Os dados representam a média ± epm de 5 animais por grupo.
*p<0.05 por comparação com a medida inicial # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
Os resultados demonstram que o peptídeo foi capaz de interferir tanto com o tempo de lambida quanto de levantamento da pata (tabelas 13 e 14), mostrando o efeito inibitório deste peptídeo sobre a dor espontânea no modelo de dor neuropática.
EXEMPLO 12. PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO.
Demonstrado o efeito antinociceptivo do peptídeo na hiperalgesia e alodinia induzidas por constrição do nervo ciático, foi investigada a participação de receptores opióides, neste efeito. Para tanto, os animais foram tratados com CTOP, antagonista específico de receptor μ (20 pg/pata), nor-BNI, antagonista específico de receptor κ (50 pg/pata) ou com ICI 174,864, antagonista específico de receptor ô (10 pg/pata), por via intraplantar, O peptídeo foi administrado na dose de 5 pg/kg, por via oral, imediatamente antes da injeção dos antagonistas opióides. Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medidas iniciais e finais ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais (tabelas 15 e 16).
TABELA 15. CARACTERIZAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTI-HIPERALGÉSICO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO; 2, NO MODELO DE DOR NEUROPÁTICA
40/48
| Tratamentos | MB | MI | MFlh | MF 3h |
| Salina (p.o.) | 73 ± 1,66 | 37 ±3,33* | 35 ±0* | 30 ±0* |
| Peptídeo (p.o.) | 72 ± 1,44 | 35 + 2,04* | 114±6,57*§# | 121 ±5,91*§# |
| Peptídeo+ ICI (i.pl.) | 72 ± 1,22 | 34 ± 1,87* | 35 ±1,87* | 37 ±2,55* |
| Peptídeo+ norBNI (i.pl.) | 73 ± 1,22 | 35 ± 1,58* | 69± 1,87*§# | 75 ± 1,58*§# |
| Peptídeo+ CTOP (i.pl.) | 72 ± 1,22 | 41 + 1,88* | 105±4,18*§# | 112 ± 5,83*§# |
| Salina + ICI (i.pl.) | 71 ±1,00 | 31 ±1,00* | 32 ±1,22* | 31 ±1,00* |
| Salina -t- norBNI (i.pl.) | 72+1,22 | 32 ± 1,22* | 32 ±1,22* | 31 ± 1,00* |
| Salina + CTOP (i.pl.) | 72+1,22 | 28 ± 1,22* | 30 ±1,58* | 30 ± 1,58* |
Ο ----MB = medida basal antes da cirurgia, MI = medida inicial do 14° dia do pós-operatório, antes da administração do peptídeo; MF = medida final do 14° dia pós-cirúrgico, em diferentes tempos após a administração do peptídeo ou salina; dados como a média de gramas (g) ± epm.
*p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial do 14° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
Os dados demonstraram que o antagonista de receptores delta foi capaz de reverter totalmente o efeito antinociceptivo do peptídeo sobre a hiperalgesia induzida pela constrição crônica do nervo ciático. Já o antagonista de receptores opióides kappa reverteu parcialmente este efeito. O antagonista de receptores mu não alterou o efeito do peptídeo.
TABELA 16. CARACTERIZAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTI-ALODÍNICO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE DOR NEUROPÁTICA
| Tratamentos | MB | MI | MF lh | MF 3h |
| Salina (p.o.) | 5,03 ± 0,03 | 4,28 ± 0,06* | 4,22 ± 0* | 4,22 ± 0* |
41/48 • · · · · • · · ♦ • · · · · • · · • · · ·
| Peptídeo (p.o.) | 5,00 ± 0,03 | 4,27 + 0,04* | 5,08 ± 0,01 §# | 5,09 ±0§# |
| Peptídeo+ ICI (i.pl.) | 4,96 ± 0,04 | 4,29 ± 0,04* | 4,22 + 0* | 4,22 ± 0* |
| Peptídeo+ norBNI (i.pl.) | 5,03 + 0,02 | 4,25 + 0,03* | 4,62 + 0*§# | 4,62 + 0*§# |
| Peptídeo+ CTOP (i.pl.) | 4,99 ± 0,02 | 4,29 ± 0,04* | 5,00±0,05§# | 4,99 + 0,02§# |
| Salina + ICI (i.pl.) | 5,08 + 0,01 | 4,22 + 0* | 4,22 ± 0* | 4,22 + 0* |
| Salina + norBNI (i.pl.) | 5,08 + 0 | 4,22 ± 0* | 4,22 + 0* | 4,22 ± 0* |
| Salina + CTOP (i.pl.) | 5,08 + 0 | 4,22 ± 0* | 4,22 + 0* | 4,22 + 0* |
O peptídeo ou salina foram administrados no 14° dia, logo após a determinação da MI. Os valores da Mis e MFs estão representados como a média de log 10 (mg x 10) ±epm. *p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial do 14° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
Os dados demonstraram que o antagonista de receptores delta foi capaz de reverter totalmente o efeito antinociceptivo do peptídeo sobre a alodinia induzida pela constrição crônica do nervo ciático. Já o antagonista de receptores opióides kappa reverteu parcialmente este efeito, enquanto que o antagonista de receptores mu não alterou o efeito do peptídeo.
EXEMPLO 13. ATIVIDADE ANALGÉSICA DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ
ID NO: 2 EM MODELO DE CÂNCER, UM MODELO DE DOR PERSISTENTE - ESTUDOS COM O TUMOR DE WALKER 256.
As células de tumor de Walker 256 foram cedidas gentilmente pelo Prof, Dr. Rui Curi, do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. O animal portador do tumor foi sacrificado e o tecido tumoral foi retirado, colocado em placa de Petri contendo salina 0,9%. Em seguida, o tumor foi cortado em partes menores e transferido para um béquer contendo salina. O material foi triturado com uma tesoura de corte fino, até que o tumor fosse totalmente fragmentado. A seguir, este material foi filtrado em gaze e o líquido coletado em um béquer. Todos os procedimentos foram realizados em gelo. O material do béquer foi transferido para tubos de plástico de 50 ml e centrifugado a 4 °C, por 10 minutos, à
42/48
1200 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspenso em salina 0,9%. Para contagem de células, a suspensão de células foi diluída (1:100) em salina. Uma alíquota (200 μΐ) foi retirada e colocada em um tubo de ensaio contendo 200 μΐ de corante azul de Tripan 1%. A contagem do número de células foi realizada em microscópio óptico utilizando câmara de Neubauer. A viabilidade celular foi determinada considerando viáveis as células refringentes à luz.
Após a contagem do número de células, 1 ml da suspensão, contendo lxlO7 células, foi injetado, por via intraperitoneal, no flanco direito dos ratos para obtenção de tumor líquido (ascite).
Os ratos com ascite foram sacrificados e o líquido ascítico extraído e colocado em um tubo de ensaio contendo EDTA. O líquido foi diluído 100 vezes com tampão salina-fosfato (PBS), pH 7,4. A contagem de células foi feita após diluição com corante azul de Tripan, conforme descrito em anteriormente. Foi injetado, por via i.pl., em uma das patas (direita) posteriores do ratos, o volume de 100 μΐ contendo lxlO6 células. A concentração da suspensão de células foi baseada em ensaios preliminares para determinação de indução de dor por estas células. Neste ajuste da concentração final foi levado em consideração o volume de antibiótico (Benzetacil®), adicionado à suspensão (150.000 unidades de antibiótico para cada 10 ml de solução de célula), com o objetivo de minimizar a contaminação por bactérias no local. O grupo controle foi constituído de animais injetados com tampão salina-fosfato (PBS), pH 7,4. na pata esquerda, na mesmas condições experimentais.
Para avaliação do efeito antinociceptivo do peptídeo sintético neste modelo, os animais foram tratados com o peptídeo, na dose de 6 pg/kg, ou salina (controle), por via oral, 5 dias após a implantação do tumor de Walker em uma das patas. Os animais foram avaliados quanto a hiperalgesia, alodinia e dor espontânea antes (medida basalMB), 5 dias após (medida inicial-MI) à implantação do tumor (antes de qualquer tratamento farmacológico) e 2 horas após a administração do peptídeo.
Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medidas iniciais e finais ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais.
• ♦ * ·
43/48
« · · ♦ · • « · • ♦ · «
TABELA 17. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO CNF021.03 SOBRE A HIPERALGESIA INDUZIDA PELO TUMOR DE WALKER 256.
| Tratamentos | MB | MI | MF |
| Salina (p.o.) | 69 ± 1,42 | 29 ± 2,97* | 29 + 2,29* |
| Peptídeo (6 pg/kg, p.o.) | 69 + 1,30 | 27+1,01* | 76 + 2,29§# |
MB = medida basal antes da injeção do tumor, MI = medida do 5° dia após a implantação do tumor, antes da administração do peptídeo; MF = medida do 5° dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do peptídeo; dados como a média de gramas (g) ± epm *p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial no 5° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina),
TABELA 18. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO CNF021.03 SOBRE A ALODINIA INDUZIDA PELO TUMOR DE WALKER 256.
| Tratamentos | MB | MI | MF |
| Salina (p.o.) | 5,01 ± 0,04 | 4,41+0,00* | 4,41+0,00* |
| Peptídeo (6 gg/kg, p.o.) | 4,97 + 0,00 | 4,41 ±0,00* | 4,97 ± 0,00§# |
MB = medida basal antes da injeção do tumor, MI = medida do 5o dia após a implantação do tumor, antes da administração do peptídeo; MF = medida do 5o dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do peptídeo; dados expressos como a média de log 10 (mg x 10) ± epm.
*p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial no 5° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
44/48 • 4 •
4
444 4 444 4 4 444
4444 4 4 4 4 4*44
444 4 4 44 44
4444444 44 4 4
4 4 444 4 · · · ·
TABELA 19. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO CNF021.03 SOBRE A DOR ESPONTÂNEA INDUZIDA PELO TUMOR DE WALKER 256
| Levantamento | Lambida | |||||
| Tratamentos | MB | MI | MF | MB | MI | MF |
| Salina (p.o.) | 0± 0,00 | 107 + 10,52* | 117 ± 15,16* | 0± 0,00 | 17± 4,91* | 16 ± 4,66* |
| Peptídeo (6 μ&^, p.o.) | 0± 0,00 | 204 + 30,74* | 25 + 7,72* §# | 0± 0,00 | 15 + 1,46* | 1,6 + 0,81*§# |
MB = medida basal antes da injeção do tumor, MI = medida do 5° dia após a implantação do tumor, antes da administração do peptídeo; MF = medida do 5° dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do peptídeo; dados expressos como a média de tempo (em segundos) de levantamento ou lambida da pata ± epm.
*p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial no 5° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
Os dados obtidos demonstraram que o peptídeo foi capaz de acarretar antinocicepção na hiperalgesia (tabela 17), na alodinia (tabela 18) e na dor espontânea (tabela 19) induzidas pelo tumor de Walker.
O
EXEMPLO 14. AVALIAÇAO DA PARTICIPAÇAO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO
SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE DOR DE CÂNCER INDUZIDO PELO TUMOR DE WALKER 256.
Demonstrado o efeito antinociceptivo do peptídeo sobre a hiperalgesia e alodinia induzidas pelo tumor de Walker 256, foi investigada a participação de receptores opióides, neste efeito. Para tanto, os animais foram tratados com CTOP, antagonista específico de receptor μ (20 μg/pata), nor-BNI, antagonista específico de receptor κ (50 μg/pata) ou com ICI 174,864, antagonista específico de receptor Ô (10 pg/pata), por via intraplantar. O peptídeo foi administrado na dose de 6 pg/kg, por via oral, imediatamente antes da injeção dos antagonistas opióides. Os resultados foram
Λ ·™! ι. .«Mi.»»'! »| hiiaiiiuiiiimiiih ,·’ι!Γ.Β.“Γ’·.ι™.ιι™!Τ!ιί ™ '.71’Τ·!1’’1.' ιϊι 11ι1J11111111ι ii 'mm·1 wmwww» • · « · · · · • · ♦ · · ·
45/48 analisados através da comparação das médias das medidas iniciais e finais ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais.
TABELA 20. CARACTERIZAÇAO DA PARTICIPAÇAO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTI-HIPERALGÉSICO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE CÂNCER INDUZIDO PELO TUMOR DE WALKER 256.
| Tratamentos | MB | MI | MF |
| Salina (p.o.) | 68 ± 1,66 | 40 + 0,00* | 38 ± 1,66* |
| Peptídeo (p.o.) | 71 ± 1,25 | 36 ±2,39* | 75±2,88§# |
| Peptídeo+ ICI (i.pl.) | 67 ± 1,22 | 33 ±3,39* | 52±1,22*§# |
| Peptídeo+ norBNI (i.pl.) | 69 ± 1,53 | 32 ±2,14* | 32 ± 1,05* |
| Peptídeo+ CTOP (i.pl.) | 70 ± 1,29 | 37 ±2,81* | 72 ± 2,81§# |
| Salina + ICI (i.pl.) | 68 ±3,33 | 30 ±2,88* | 30 ±2,88* |
| Salina + norBNI (i.pl.) | 70 ± 2,88 | 33 ±3,33* | 32 ± 1,66* |
| Salina + CTOP (i.pl.) | 68 ± 1,66 | 35 ±2,88* | 32 ± 1,66* |
MB = medida basal antes da injeção do tumor, MI = medida do 5° dia após a implantação do tumor, antes da administração do peptídeo; MF = medida do 5° dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do peptídeo; dados como a média de gramas (g) ± epm *p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial no 5° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
Os dados demonstraram que o antagonista de receptores kappa foi capaz de reverter totalmente o efeito antinociceptivo do peptídeo. Já o antagonista de receptores opióides delta reverteu parcialmente este efeito, enquanto o antagonista de receptores mu não alterou o efeito do peptídeo.
WnWBjtffywwWROTpwwwntwgwwwyfliililiyi ιι iiiiiiwbibt wwwif j.i ιι· iw ll iiiiw Biijty whui «ιι111 11.<i uiiiii.1111111 u11111111 uii| 111.111iii mii iijii i iiiiijnit 1; 1 < 1,1111 ui ww wiw niirruwiwnnwwn 11 wifiMigffwww,Wfi
46/48 ♦ * • · • ·
« · * · · · • · « · · • » * · * • · · · * • · · * • · · * *
TABELA 21. CARACTERIZAÇÃO DA PARTICIPÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTIALODÍNICO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE CÂNCER INDUZIDO PELO TUMOR DE WALKER 256
| Tratamentos | MB | MI | MF |
| Salina (p.o.) | 5,01 ±0,04 | 4,41 ± 0,00* | 4,59 + 0,18* |
| Peptídeo (p.o.) | 4,97 ± 0,00 | 4,41 ± 0,00* | 4,97 ± 0,00§# |
| Peptídeo+ ICI (i.pl.) | 4,99 ± 0,02 | 4,41 ± 0,00* | 4,56±0,03*§# |
| Peptídeo+ norBNI (i.pl.) | 4,97 ± 0,00 | 4,41 ± 0,00* | 4,41 ±0,00* |
| Peptídeo+ CTOP (i.pl.) | 5,03 ± 0,02 | 4,41 ± 0,00* | 4,98 ±0,03*# |
| Salina + ICI (i.pl.) | 4,97 ± 0,00 | 4,41 ± 0,00* | 4,41 ±0,00* |
| Salina + norBNI (i.pl.) | 4,97 ± 0,00 | 4,41 ± 0,00* | 4,41 ±0,00* |
| Salina + CTOP (i.pl.) | 4,97 ± 0,00 | 4,41 ± 0,00* | 4,41 ±0,00* |
MB - medida basal antes da injeção do tumor, MI ~ medida do 5° dia após a implantação do tumor, antes da administração do peptídeo; MF = medida do 5° dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do peptídeo; dados expressos como a média de log 10 (mg x 10) ± epm.
*p<0.05 por comparação com a medida basal §p<0.05 por comparação com a medida inicial no 5° dia # p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
Os dados demonstraram que o antagonista de receptores kappa foi capaz de reverter totalmente o efeito antinociceptivo do peptídeo no modelo de alodinia. Já o antagonista de receptores opióides delta reverteu parcialmente este efeito, enquanto o antagonista de receptores mu não alterou o efeito do peptídeo.
EXEMPLO 15. AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DA PLACA-QUENTE.
Este teste é utilizado para avaliação de drogas que interferem com a nocicepção, no Sistema Nervoso Central, como por exemplo morfina e seus derivados, uma vez que o estímulo térmico ativa diretamente o nociceptor, sem que ocorra uma lesão tecidual com consequente inflamação. Foi demonstrado que neste modelo, a resposta dos • · * • · ·
47/48 • · · * · » · • ♦ · · · · · • · · · · * ···«··· • « 9 * · · · animais em lamber as patas anteriores é dependente de uma estimulação de centros supraespinhais do sistema nervoso central.
Este teste foi realizado de acordo com o método descrito por Jacob, J.J.C. and Ramabadran, K. (Br. J. Pharmacol., 64:91-8, 1978). Para a realização do teste é utilizada uma placa de metal aquecida em banho maria sob temperatura constante de 50°C ± 1. Os camundongos são colocados um a um, sobre a placa aquecida e o tempo cronometrado (em segundos - s) até que os mesmos apresentem a reação de lamber as duas patas anteriores. Este procedimento foi realizado antes (medida inicial - MI) e 2 horas após o tratamento dos animais (medida final - MF) com salina (controle) ou com o peptídeo sintético (1 e 3 pg/kg em 200 pl), por via oral, sendo cada animal considerado como controle dele mesmo. Os resultados foram analisados comparando-se as médias das MI e MF ou, quando determinado, através de comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais (tabela 22).
TABELA 22. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, AVALIADO NO MODELO DA PLACA-QUENTE
| Tratmento | MI (s) ± epm | MF (s) + epm |
| Salina (p.o.) | 19 + 0,54 | 19 ±0,45 |
| Peptídeo 1 pg/kg (p.o.) | 18 ±0,64 | 25 ± 0,68 * |
| Peptídeo 3 pg/kg (p.o.) | 22+1,01 | 27 ± 1,06* |
MI = medida inicial; MF = medida final; dados como a média de segundos (s) ± epm *p<0.05 por comparação com a medida inicial.
Os resultados demonstram que o peptídeo sintético foi capaz de causar antinocicepção também no modelo de avaliação de drogas com efeito central.
EXEMPLO 16. ATIVIDADE ANALGÉSICA DO PEPTÍDEO SINTÉTICO MODIFICADO SEQ ID NO: 3.
Para indução de hiperalgesia, prostaglandina E2, na dose de 100 ng/pata foi administrada por via intraplantar (i.pl.) A hiperalgesia foi avaliada antes (medida inicial - MI) e 3 horas após (medida final - MF) a injeção do irritante.
48/48
Para a avaliação da sensibilidade dolorosa, foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos, O limiar de dor, representado pela força (em gramas) necessária para a retirada da pata, foi determinado antes (medida inicial) e 3 horas após (medida final) a injeção intraplantar de prostaglatidina E2 (100 ng/pata).
O peptídeo sintético modificado SEQ ID NO: 3 foi diluído em um volume de 11 ml de salina. Cada animal recebeu 2 ml desta solução, administrada por via oral (p.o.), imediatamente antes da indução da hiperalgesia. Animais injetados com salina, por via oral, foram utilizados como controles. Para indução de hiperalgesia, prostaglandina £2, na dose de 100 ng/pata foi administrada por via intraplantar (i.pl.). A hiperalgesia foi avaliada antes (medida inicial - MI) e 3 horas após (medida final - MF) após a injeção do irritante.
| Tratamentos | MI (gramas) ± epm | MF (gramas) + epm |
| Salina (p.o.) + PGE2 (i.pl.) | 76 ± 1,05 | 59 + 1,54* |
| Peptídeo (p.o.) + PGE2 (i.pl·) | 76+1,00 | 110 + 2,74 *# |
*p<0.05 por comparação com a medida inicial.
#p<0.05 por comparação com o grupo controle (salina).
Os resultados demonstram efeito antinociceptivo do peptídeo sintético modificado SEQ ID NO: 3, no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2.
1/3
Claims (17)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição farmacêutica caracterizada por conter um ou mais carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis e um ou mais compostos tetradecapeptídeos contendo as sequências SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, seus sais ou solvatos.
- 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser na forma de solução, suspensão, pasta, gel, cápsula, comprimido, drágea, pó, grânulo, liófilo, sistemas de liberação controlada, micropartículas, micro ou nanoesferas, lispossomas ou associada a revestimento orgânico.
- 3. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizada por conter diluente à base de água.
- 4. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada por ser para uso oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, tópica, pulmonar, intranasal, bucal, retal, sublingual, intraperitoneal, intradérmica ou intratecal.
- 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser para uso oral.
- 6. Uso de um ou mais compostos tetradecapeptídeos contendo as sequências SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, seus sais ou solvatos, caracterizado por ser na preparação de composições analgésicas ou úteis no tratamento, diagnóstico ou prevenção de condições moduladas por receptores opióides.
- 7. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os compostos tetradecapeptídeos contendo as sequências SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, seus sais ou solvatos serem agonistas diretos ou indiretos de receptores opióides.
- 8. Uso de acordo com as reivindicações 6 a 7, caracterizado por os compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, seus sais ou solvatos serem antagonistas diretos ou indiretos de receptores opióides.Petição 870170087810, de 13/11/2017, pág. 19/252/3
- 9. Uso de acordo com as reivindicações 6 a 8, caracterizado por ser na preparação de composições farmacêuticas úteis no tratamento, diagnóstico ou prevenção de condições moduladas por receptores opióides.
- 10. Uso de acordo com as reivindicações 6 a 9, caracterizado por ser na preparação de composições farmacêuticas úteis no tratamento, diagnóstico ou prevenção de condições moduladas por receptores opióides do tipo kappa.
- 11. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ser utilizado na preparação de composições farmacêuticas analgésicas.
- 12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser utilizado na preparação de composições farmacêuticas analgésicas orais.
- 13. Uso de acordo com as reivindicações 11 a 12, caracterizado por ser utilizado na preparação de composições farmacêuticas analgésicas com longa duração.
- 14. Uso de acordo com as reivindicações 11 a 12, caracterizado por ser utilizado na preparação de composições farmacêuticas analgésicas com duração de até 5 dias.
- 15. Uso de acordo com as reivindicações 6 a 14 caracterizado pelo fato de que o composto apresenta hidroxilação do resíduo de prolina na posição 4 ou y-carboxilação do resíduo de glutamato nas posições 5 ou 10.
- 16. Uso de acordo com as reivindicações 6 a 15 caracterizado pelo fato de que um ou mais L-aminoácidos é substituído por um ou mais D-aminoácido ou aminoácido não convencional.
- 17. Uso de acordo com as reivindicações 6 a 16, caracterizado por ser para preparação de composições úteis no tratamento, diagnóstico ou prevenção de dor aguda ou crônica, incluindo dores oncológicas, dores neuropáticas como neuralgia do trigêmeo, distrofia simpática, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, pós-acidente vascular cerebral, neuropatia diabética, dores associadas a neoplasias, fibromialgia, dor dentária, dismenorréia, cólica renal, menstruai ou biliar, dores articulares, artrites incluindo artrite reumatóide ou artrites degenerativas, hipertensão intra-ocular, dor pós-artroscopia, dor pós-laparoscopia ginecológica, dor produzida por nefrolitotomia percutânea, dor pósPetição 870170087810, de 13/11/2017, pág. 20/253/3 prostectomia retropúbica radical, dor pós-toracotomia, dor pós-tonsilectomia em pacientes pediátricos, dor pós-histerectomia, dor pós-operação cesariana ou queimaduras, dependência de cocaína ou de opióides, proliferação celular, carcinoma pulmonar de células pequenas, depressão e psicose, inflamação, condições associadas por aumento de angiogênese, feridas, doenças isquêmicas coronarianas, doença de Parkinson e discinesias, encefalopatia hepática, doenças cognitivas, doença de Alzheimer, prurido decorrente de colestase hepática ou hiperinsulinemia em mulheres com ovário policístico.Petição 870170087810, de 13/11/2017, pág. 21/25
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0502399-8A BRPI0502399B1 (pt) | 2005-05-02 | 2005-05-02 | Compostos análogos a peptídeos analgésicos derivados de veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, seus usos, composições, métodos de preparação e de puruficação |
| PT05738454T PT1765851E (pt) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | Compostos análogos de péptidos analgésicos derivados do veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, suas utilizações, composições, métodos de preparação e purificação |
| CN2005800213191A CN101048170B (zh) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | 源自响尾蛇crotalus durissus terrificus蛇毒的 止痛肽的类似化合物、它们的用途、组合物、 制备和纯化方法 |
| AT05738454T ATE533776T1 (de) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | Analoge verbindungen analgetischer peptide, abgeleitet vom crotalus durissus terrificus schlangengift, ihre verwendungen, zusammensetzungen und verfahren ihrer herstellung und reinigung |
| ES05738454T ES2377635T3 (es) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | Compuestos análogos de péptidos analgésicos derivados del veneno de serpientes Crotalus durissus terrificus, sus usos, composiciones, procedimientos de preparación y purificación |
| JP2007511790A JP4777344B2 (ja) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | 南米ガラガラヘビ（ｃｒｏｔａｌｕｓｄｕｒｉｓｓｕｓｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓｓｎａｋｅｓ）毒液に由来する鎮痛ペプチドの類似化合物、これらの使用、組成物、調製と精製の方法 |
| US11/579,615 US9109041B2 (en) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | Analog compounds of analgesic peptides derived from the venom of crotalus durissus terrificus snakes, their uses, compositions, methods of preparation and purification |
| EP05738454A EP1765851B1 (en) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | Analog compounds of analgesic peptides derived from the venom of crotalus durissus terrificus snakes, their uses, compositions, methods of preparation and purification |
| AU2005239771A AU2005239771B2 (en) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | Analgesic peptides derived from the venom of crotalus durissus terrificuss snakes |
| PCT/BR2005/000073 WO2005107357A2 (en) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | Analgesic peptides derived from the venom of crotalus durissus terrificuss snakes |
| CA2565731A CA2565731C (en) | 2004-05-06 | 2005-05-06 | Analog compounds of analgesic peptides derived from the venom of crotalus durissus terrificus snakes, their uses, compositions, methods of preparation and purification |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0502399-8A BRPI0502399B1 (pt) | 2005-05-02 | 2005-05-02 | Compostos análogos a peptídeos analgésicos derivados de veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, seus usos, composições, métodos de preparação e de puruficação |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0502399A BRPI0502399A (pt) | 2006-12-12 |
| BRPI0502399B1 true BRPI0502399B1 (pt) | 2018-05-02 |
Family
ID=37496262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0502399-8A BRPI0502399B1 (pt) | 2004-05-06 | 2005-05-02 | Compostos análogos a peptídeos analgésicos derivados de veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, seus usos, composições, métodos de preparação e de puruficação |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BR (1) | BRPI0502399B1 (pt) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR102016023153A2 (pt) | 2016-10-04 | 2018-05-02 | Fundação Butantan | Composição, uso, e, método para tratar doenças neurodegenerativas |
-
2005
- 2005-05-02 BR BRPI0502399-8A patent/BRPI0502399B1/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0502399A (pt) | 2006-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5891849A (en) | Methods and formulations for preventing progression of neuropathic pain | |
| Konno et al. | Crotalphine, a novel potent analgesic peptide from the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus | |
| US8748575B2 (en) | Therapeutic peptides | |
| JPH05500750A (ja) | 血小板凝集阻害剤 | |
| KR20120115495A (ko) | 위장 장애의 치료 | |
| CN101522711B (zh) | 具有改进性质的重组表面活性剂 | |
| US9109041B2 (en) | Analog compounds of analgesic peptides derived from the venom of crotalus durissus terrificus snakes, their uses, compositions, methods of preparation and purification | |
| US6265541B1 (en) | Uses of α-conotoxin peptides | |
| JP2022545554A (ja) | Ｑ－ｅｒペプチド | |
| JP2008504234A6 (ja) | 南米ガラガラヘビ（ｃｒｏｔａｌｕｓｄｕｒｉｓｓｕｓｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓｓｎａｋｅｓ）毒液に由来する鎮痛ペプチドの類似化合物、これらの使用、組成物、調製と精製の方法 | |
| EP2578226B1 (en) | Peptide for treating amyotrophic lateral sclerosis | |
| JP6430938B2 (ja) | 合成ポリペプチドＰｎＴｘ（１９）、医薬組成物及びその使用 | |
| AU2014331704A1 (en) | Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of opioid induced dysfunctions | |
| BRPI0502399B1 (pt) | Compostos análogos a peptídeos analgésicos derivados de veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, seus usos, composições, métodos de preparação e de puruficação | |
| AU6520399A (en) | Contulakin-g, analogs thereof and uses therefor | |
| ES2291372T3 (es) | Agonistas y antagonistas de urotensina-ii. | |
| KR102449653B1 (ko) | Kv1.3 칼륨 채널 길항제 | |
| US6525021B1 (en) | Contulakin-G, analogs thereof and uses therefor | |
| US20230203107A1 (en) | Peptide for treating sepsis derived from rv3364c protein of mycobacterium tuberculosis | |
| WO2022171098A1 (zh) | 一种dapk1磷酸化底物的人工小分子干扰肽及其制药用途 | |
| JP2023529825A (ja) | コンフォメーション化された拘束型α－ＲＧＩＡアナログ | |
| KR20220117319A (ko) | 레트로-인버소 펩타이드 | |
| JP2002536970A (ja) | タウ−コノトキシン・ペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B25M | Entry on limitation or onus of patent assignment [chapter 25.13 patent gazette] |
Owner name: YARA CURY (BR/SP) , FUNDACAO DE AMPARO A PESQUISA Free format text: REF: PROC. INPI NO 52400031036/2012-78 E PROCESSO DE ARROLAMENTO DE BENS DA SECRETARIA DA RECEITA FEDERAL - SP NO 16643.720002/2011-54 ANOTADO O ARROLAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE EM EPIGRAFE, CONFORME DETERMINACAO DA SECRETARIA DA RECEITA FEDERAL DO ESTADO DE SAO PAULO, NOS TERMOS DO 5O, DO ART. 64 DA LEI NO 9.532/97. |
|
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] | ||
| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 16A ANUIDADE. |
|
| B24D | Patent annual fee: restoration after fee payment | ||
| B25M | Entry on limitation or onus of patent assignment [chapter 25.13 patent gazette] |
Owner name: FUNDACAO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DE SAO PAULO - FAPESP (BR/SP) ; BIOSINTETICA FARMACEUTICA LTDA. (BR/SP) ; YARA CURY (BR/SP) Free format text: ANOTACAO DE LIMITACAO OU ONUSREF.: PROCESSO SEI/INPI 52402.011242/2023-02PROCESSO ADMINISTRATIVO RFB NO 16643.720002/2011-54 CONFORME DETERMINADO PELO PROCURADOR DA FAZENDA NACIONAL REINER ZENTHOFER MUELLER, FICA ANOTADO, DE ACORDO COM O ART. 59, II, DA LPI, O ARROLAMENTO DA REFERIDA PATENTE NA PARTE QUE CABE A ?BIOSINTETICA FARMACEUTICA LTDA.?. |