KR102449653B1 - Kv1.3 칼륨 채널 길항제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있고 그의 활성을 억제할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물, 및 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부의 치료 또는 예방을 위한 상기 화합물 및 상기 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

Kv1.3 칼륨 채널 길항제 {KV1.3 POTASSIUM CHANNEL ANTAGONISTS}
본 발명은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있고 그의 활성을 억제할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물, 및 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부의 치료 또는 예방을 위한 상기 화합물 및 상기 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
자가면역 질환은 숙주의 면역 반응이 외래 항원과 자기 분자 (자가항원)를 구별하지 못함으로써, 이상 면역 반응을 유발시킬 때 발생되는 80가지 초과의 별개 질환 군이다. 자가면역 질환의 원인은 여전히 불확실하지만, 유전적 요인과 환경적 요소가 복합적으로 작용하여 야기되는 것으로 생각된다.
다발성 경화증, 건선 및 류마티스 관절염과 같은 면역-염증 장애는 공통의 병원성 원칙을 공유하고 있다. 그들의 발병 기전은 자극시 만성 염증 과정을 매개하는 자가반응성 기억 T 세포를 특징으로 한다. 특히, 통상적으로 자가면역 질환에서 발생하는 반복적인 항원 공격으로 인해, 수명이 긴 중앙 기억 세포 (TCM)가 유발되는데, 이는 나이브 세포와 마찬가지로 림프절로 귀소되어 그들의 동족 항원과 접촉하여, 짧은 수명의 이펙터 기억 세포 (TEM)로 분화되는데, 이는 항원 유도된 활성화를 위해 림프절로 귀소될 필요가 없다. 활성화된 TEM 세포는 TEM 이펙터로 변하여, 염증 부위로 신속하게 이동하는데, 여기서 이들은 다량의 염증 유발성 시토카인을 생성시킨다. CD8+ TEM 세포는 다량의 퍼포린을 추가로 생산하므로, 고도로 파괴적이다.
현행 자가면역 질환에 대한 치료는 소염 약물과 강력한 면역억제제 및 면역조정제의 전신 사용을 포함한다. 그러나, 이들 약물은 수많은 부작용을 유발시키는데, 이러한 부작용은, 예를 들어 감염 및 신생물 형성의 위험을 동반하면서, 전체로서 면역 체계를 억제하는 것을 포함한다. 더욱이, 일부 환자에게는 상기 약물이 임상적으로 유의적인 차도를 유도할 수 없다.
전압 의존성 Kv1.3 K+ 채널은 인간 게놈 내의 76개 칼륨 채널 중 하나이고, 인간 T 림프구에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 모든 인간 T 세포는 Kv1.3 채널 뿐만 아니라 칼슘-활성화된 KCa3.1을 발현하는데, 이는 함께, T 세포 활성화와 증식에 필요한 칼슘 유입에 대한 균형 잡힌 칼륨 배출을 제공한다. 소정의 세포에 의해 발현된 채널의 수는 그의 활성화 및 분화 상태에 좌우된다. 항원 또는 미토겐 자극된 CD4+ 및 CD8+ TEM 세포는 Kv1.3의 대략 4- 내지 5-배 증가된 발현을 나타내는 반면, 인간 나이브 또는 TCM 세포는 칼슘-활성화된 KCa3.1 채널을 상향 조절하여 막 전위와 Ca2+ 시그널링을 활성화된 상태로 조절한다.
이러한 TEM 세포 내에서의 차등 과발현 관점에서 보면, Kv1.3 채널은 그의 발병 기전이 자가반응성 TEM 세포와 관련이 있는 자가면역 질환, 예컨대 예를 들어 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선 및 제1형 당뇨병 뿐만 아니라 다른 만성 염증 질환, 예컨대 예를 들어 치주염을 치료하기 위한, 전도유망한 새로운 TEM-세포-특이적 치료 표적을 구성한다.
더욱이, Kv1.3 채널이 체중을 조절하는 데 있어서 일정 역할을 한다는 지표가 있다. 따라서 Kv1.3 채널은 또한, 비만을 치료하기 위한 전도유망한 표적을 구성한다.
따라서, Kv1.3 채널과의 강력하고도 특이적인 상호 작용을 나타내고 그의 활성을 차단 또는 저하시킬 수 있는, Kv1.3 채널 특이적 치료 화합물이 지속적으로 필요하다.
본 발명의 한 목적은 칼륨 채널 Kv1.3과 특이적으로 결합할 수 있고 그의 활성을 억제 또는 저하시킬 수 있는 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 자가면역 질환, 예컨대 예를 들어 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선 및/또는 제1형 당뇨병, 비만 및/또는 치주염을 치료하는 데 사용하기 위한, 상기 억제 화합물 및 이러한 억제 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다.
다음 설명 및 청구범위로부터 명백한 바와 같은 이들 및 다른 목적은 독립항들의 주제에 의해 획득된다. 바람직한 실시양태 중 일부는 종속항에 의해 규정된다.
제1 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이다:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C [서열식별번호 (SEQ ID NO): 23],
여기서 X1=T,Q,S,Y,N; X2=I,F,V,A,L,W; X3=I,T,Y,S,V,A,L; X4=K,S,T,Y,R; X5=R,T,K,S,Y; X6=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X7=P,S,T; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X11=D,R,P,K,E,S,T,Y; X12=P,H,V,I,L,A; X13=R,K,Q,N; X14=K,D,A,R,E,V,L,I; X15=E,Q,A,L,D,N,V,I; X16=Y,N,S,T,Q; X17=A,G,V,I,L; X18=K,R, X19=Y,N,Q,T,S 및 X20=G,R,K.
제1 측면의 변형에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (서열식별번호: 23),
여기서 X1=T,Q,S,Y,N; X2=I,F,V,A,L,W; X3=I,T,Y,S,V,A,L; X4=K,S,T,Y,R; X5=R,T,K,S,Y; X6=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X7=P,S,T; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X11=D,R,P,K,E,S,T,Y; X12=P,H,V,I,L,A; X13=R,K,Q,N; X14=K,D,A,R,E,V,L,I; X15=E,Q,A,L,D,N,V,I; X16=Y,N,S,T,Q; X17=A,G,V,I,L; X18=K,R, X19=Y,N,Q,T,S 및 X20=G,R,K이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 1);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K.
제2 측면의 변형에서, 본 발명은 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며,
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이다:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 27);
여기서 X1=P,I,F,V,A,L,W; X2=K,S,T,Y,R; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K.
제3 측면의 변형에서, 본 발명은 서열식별번호: 27에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며,
여기서 X1=P,I,F,V,A,L,W; X2=K,S,T,Y,R; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.
또한 또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.
또한 또 다른 측면에서 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한 또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가 측면에서 또한, 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 측면에서 또한, 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부를 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물을, 이의 투여를 필요로 하는 포유류에게 투여함으로써, 이러한 포유류에게서 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가 측면에서 또한, 본 발명에 따른 화합물, 핵산 서열, 벡터 또는 제약 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
도 1 패치-클램프에 의한 Kv1.3, Kv1.5 및 Kv1.1 채널 억제의 측정.
도 2 서열 목록 cgtx 538-548.
도 3 화합물 1-8 (C1-8)의 효과.
화합물 1: cgtx 538
화합물 2: cgtx 539
화합물 3: cgtx 540
화합물 4: cgtx 541
화합물 5: cgtx 542
화합물 6: cgtx 543
화합물 7: cgtx-544
화합물 8: cgtx 547
좌측은 외부 용액의 적용 후 (흑색), 화합물 적용 후 (청색) 및 퀴니딘 적용 후 (회색) hERG 전류 추적을 예시한다. 우측 패널은 시간 경과에 따른 피크 전류 진폭의 변화를 제시한 것이다. 점선은 상기 화합물 적용을 표시한다. 각 화합물 농도의 효과를 10 또는 20 스윕에 대해 평가하였다. 모든 화합물은 hERG에 대한 효과가 전혀 없거나 또는 단지 작은 효과를 나타내는 것으로 여겨졌다. 대신, 퀴니딘은 전류를 완전히 차단하였다. 화합물 적용의 시작부터 기록된 스윕의 종료까지의 런 다운이 일어났다는 것에 주목해야 한다.
도 4 Sf21 세포 (a)에서 발현되고 TEM 세포 (b)에서 내생적으로 발현된 Kv1.3 채널의 대표적인 전압 의존성 활성화. (c) 전압 의존성 Kv1.3 활성화에 대한 펄스 프로토콜.
도 5 Sf21 (중간 및 상부 라인) 및 TEM 세포 (하부 라인)에서 발현된 Kv1.3 채널의 특징적인 정규화 전압-전류-상관 관계; 각각 n=41, n=12 및 n=29. Sf21 바큘로바이러스(Baculovirus) 발현 시스템을 이용하여, 다량의 Kv1.3 칼륨 채널을 발현하는 것이 가능하다.
도 6 TEM 세포와 Sf21 세포의 비교. Sf21 (a) 및 TEM (b) 세포에서 발현된 Kv1.3 채널의 cgtx-544에 의한 차단. 증가 농도의 Kv1.3 길항작용 펩티드의 존재하의 대표적인 원시 전류 추적 및 시간 용량 반응이 제시되어 있다.
도 7 래트 무릎 내에서의 관절염의 국소 유도를 도시적으로 나타낸 것이다.
도 8 국소 관절염의 유도 후 무릎 관절의 종창.
도 9 말초 혈액에서 WBC 계수치에 근거한 실험용 동물의 면역 상태; AI: 관절염 유도, 나이브 동물 = NaCl "면역화된 동물", 면역화된 동물 = mBSA를 포함한 프로인트 아주반트로 처리된 동물.
도 10 cgtx-544 처리된 동물과 처리되지 않은 대조군 동물 (각 군: n=14; 마름모꼴을 동반한 실선: 처리되지 않은 대조군 동물; 사각형을 동반한 파선: cgtx-544 처리된 동물) 간의 무릎 관절의 종창 차이.
도 11 메토트렉세이트 (MTX) 표준 요법을 이용한 관절염 래트에서 절대적 무릎 종창 증가의 차이를 시간 과정에 따라 도시한 것이다. 제-21일 및 제-14일에 2회 면역화시킨 후, 제0일에 메틸화 BSA를 관절내 주사함으로써 항원 유도성 관절염 (AIA)을 유도하였다. 고 용량 MTX 요법은 MTX 1 mg/kg 체중을 제-21일에 시작하여 제0일까지 1 x 매주 s.c. 투여하였다. 저 용량 MTX 요법은 MTX 100 μg/kg 체중을 제-3일에 시작하여 제6일까지 매일 i.v. 투여하였고, 비히클 대조군에게는 0.9% NaCl을 제0일에 시작하여 제6일까지 매일 i.v. 투여하였다. 무릎 종창의 절대적 증가는 각 군에 대하여 별도로, 비-유도된 무릎 값과 관절염 유도된 무릎 값 간의 차이이다. 값은 평균 ± SD이다. 채워진 원을 동반한 점선: MTX s.c. 1 x 매주 군 (군 J, n=7); 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1 x 매일 군 (군 L, n=7); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H, n=14).
도 12 cgtx-544 펩티드 요법과 비교 시 메토트렉세이트 (MTX) 표준 요법을 이용한 관절염 래트에서 절대적 무릎 종창 증가의 차이를 시간 과정에 따라 도시한 것이다. 제-21일 및 제-14일에 2회 면역화시킨 후, 제0일에 메틸화 BSA를 관절내 주사함으로써 항원 유도성 관절염 (AIA)을 유도하였다. 저 용량 MTX 요법은 MTX 100 μg/kg 체중을 제-3일에 시작하여 제6일까지 매일 i.v. 투여하였다. 비교하면, cgtx-544 요법 군에게는 cgtx-544 1 mg/kg 체중을 제-3일에 시작하여 제6일까지 매일 i.v. 투여하였고, 비히클 대조군에게는 또한 0.9% NaCl을 제0일에 시작하여 매일 i.v. 투여하였다. 무릎 종창의 절대적 증가는 각 군에 대하여 별도로, 비-유도된 무릎 값과 관절염 유도된 무릎 값 간의 차이이다. 값은 평균 ± SD이다. 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1x 매일 군 (군 L, n=7); 사각형을 동반한 파선: cgtx-544 요법 군 (군 I; n=14); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H, n=14).
도 13 메토트렉세이트 (MTX) 표준 요법을 이용한 관절염 래트에서 상대적 무릎 종창 증가의 차이를 시간 과정에 따라 도시한 것이다. 제-21일 및 제-14일에 2회 면역화시킨 후, 제0일에 메틸화 BSA를 관절내 주사함으로써 항원 유도성 관절염 (AIA)을 유도하였다. 고 용량 MTX 요법은 MTX 1 mg/kg 체중을 제-21일에 시작하여 제0일까지 1 x 매주 s.c. 투여하였다. 저 용량 MTX 요법은 MTX 100 μg/kg 체중을 제-3일에 시작하여 제6일까지 매일 i.v. 투여하였고, 비히클 대조군에게는 0.9% NaCl을 제0일에 시작하여 제6일까지 매일 i.v. 투여하였다. 무릎 종창의 상대적 증가는 값을 정규화시킨 후 각 군에 대하여 별도로, 비-유도된 무릎 값과 관절염 유도된 무릎 값 간의 차이이다. 정규화된 값 (제-21일=1)은 평균 ± SD이다. 채워진 원을 동반한 점선: MTX s.c. 1 x 매주 군 (군 J, n=7); 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1 x 매일 군 (군 L, n=7); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H, n=14).
도 14 cgtx-544 요법과 비교 시 메토트렉세이트 (MTX) 표준 요법을 이용한 관절염 래트에서 상대적 무릎 종창 증가의 차이를 시간 과정에 따라 도시한 것이다. 제-21일 및 제-14일에 2회 면역화시킨 후, 제0일에 메틸화 BSA를 관절내 주사함으로써 항원 유도성 관절염 (AIA)을 유도하였다. 저 용량 MTX 요법은 MTX 100 μg/kg 체중을 제-3일에 시작하여 제6일까지 매일 i.v. 투여하였다. 비교하면, cgtx-544 요법 군에게는 cgtx-544 1 mg/kg 체중을 제-3일에 시작하여 제6일까지 매일 i.v. 투여하였고, 비히클 대조군에게는 또한 0.9% NaCl을 제0일에 시작하여 매일 i.v. 투여하였다. 무릎 종창의 상대적 증가는 값을 정규화시킨 후 각 군에 대하여 별도로, 비-유도된 무릎 값과 관절염 유도된 무릎 값 간의 차이이다. 정규화된 값 (제-21일=1)은 평균 ± SD이다. 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1x 매일 군 (군 L, n=7); 사각형을 동반한 파선: cgtx-544 펩티드 요법 군 (군 I; n=14); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H, n=14).
도 15 cgtx-544 요법과 비교 시 메토트렉세이트 (MTX) 표준 요법을 이용한 관절염 래트의 면역 상태. 백혈구 (WBC) 계수 절대치; 값은 평균 ± SD (n=7)이다. 채워진 원을 동반한 점선: MTX s.c. 1 x 매주 군 (군 J, n=7); 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1 x 매일 군 (군 L, n=7); 사각형을 동반한 파선: cgtx-544 펩티드 요법 i.v. 1 x 매일 군 (군 I, n=7); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 i.v. 1 x 매일 군 (군 H, n=7). 흑색 화살표: 엠. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis) (750 μg) 및 mBSA를 이용한 면역화 시간. 시스멕스(Sysmex) XT-2000i.V를 이용하여 EDTA 백혈구를 측정하였다.
도 16 cgtx-544 요법과 비교 시 메토트렉세이트 (MTX) 표준 요법을 이용한 관절염 래트에서의 호중구 과립구를 시간 과정에 따라 도시한 것이다. a. 절대 값은 평균 ± SD (n=7)이다. 채워진 원을 동반한 점선: MTX s.c. 1 x 매주 군 (군 J, n=7); 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1 x 매일 군 (군 L, n=7); 사각형을 동반한 파선: cgtx-544 요법 i.v. 1 x 매일 군 (군 I, n=7); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 i.v. 1 x 매일 군 (군 H, n=7). 흑색 화살표: 엠. 투베르쿨로시스 (750 μg) 및 mBSA를 이용한 면역화 시간. b. 상대적 호중구 (%)는 WBC의 총량과 관련이 있다. 값은 평균 ± SD (n=7)이다. 채워진 원을 동반한 점선: MTX s.c. 1 x 매주 군 (군 J, n=7); 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1 x 매일 군 (군 L, n=7); 사각형을 동반한 파선: cgtx-544 요법 i.v. 1 x 매일 군 (군 I, n=7); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 i.v. 1 x 매일 군 (군 H, n=7). 흑색 화살표 (제-21일 및 제-14일로 추정된다): 엠. 투베르쿨로시스 (750 μg) 및 mBSA를 이용한 면역화 시간. 시스멕스 XT-2000i.V를 이용하여 EDTA 백혈구를 측정하였다.
도 17 cgtx-544 요법과 비교 시 메토트렉세이트 (MTX) 표준 요법을 이용한 관절염 래트에서의 림프구를 시간 과정에 따라 도시한 것이다. a. 절대 값은 평균 ± SD (n=7)이다. 채워진 원을 동반한 점선: MTX s.c. 1 x 매주 군 (군 J, n=7); 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1 x 매일 군 (군 L, n=7); 사각형을 동반한 파선: cgtx-544-펩티드 요법 i.v. 1 x 매일 군 (군 I, n=7); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 i.v. 1 x 매일 군 (군 H, n=7). 흑색 화살표: 엠. 투베르쿨로시스 (750 μg) 및 mBSA를 이용한 면역화 시간. b. cgtx-544 요법과 비교 시 메토트렉세이트 (MTX) 표준 요법을 이용한 관절염 래트에서의 림프구의 백분율 - 상대적 림프구 (%)는 WBC의 총량과 관련이 있다. 값은 평균 ± SD (n=7)이다. 채워진 원을 동반한 점선: MTX s.c. 1 x 매주 군 (군 J, n=7); 삼각형을 동반한 긴 파선: MTX i.v. 1 x 매일 군 (군 L, n=7); 사각형을 동반한 파선: cgtx-544 요법 i.v. 1 x 매일 군 (군 I, n=7); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 i.v. 1 x 매일 군 (군 H, n=7). 흑색 화살표: 엠. 투베르쿨로시스 (750 μg) 및 mBSA를 이용한 면역화 시간. 시스멕스 XT-2000i.V를 이용하여 EDTA 백혈구를 측정하였다.
도 18 예방적 치료 및 용량 의존성 - 시간 과정에 따른 무릎 직경의 상대적 증가 (고/중간/저 용량). 값은 평균 ± SD이다. 삼각형을 동반한 긴 파선: cgtx-544 펩티드 5 mg/kg 체중 요법 군 (군 N, n=5); 흑색 사각형을 동반한 파선: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 I, n=14); 채워진 원을 동반한 점선: cgtx-544 펩티드 0.1 mg/kg 체중 요법 군 (군 M, n=5); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H #15-19, n=5). 백색 사각형을 동반한 실선: 유도되지 않은 무릎 직경 증가가 없음 (군 I, N, M 및 H; 유도되지 않은 좌측 무릎).
도 19 cgtx-544 효능 결과의 통계적 분석: 관절염 유도 후 제1일 (a) 및 제3일 (b)에 cgtx-544 펩티드 요법 (고/중간/저 용량)을 이용한 경우 및 이용하지 않은 경우의 상대적 무릎 종창의 차이. 모든 박스 플롯은 중앙값, 사분위 범위, 샘플 최소값 및 최대값을 제시한다. 유의성 분석을 위해, 비히클 대조군을 요법 군과 비교하였다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 20 치유적 치료 - d=0 또는 d=1에 치료를 시작함 - cgtx-544 펩티드 요법 (치료는 d0 및 d1에 시작함)을 이용한 경우 및 이용하지 않은 경우의 관절염 래트에서 무릎 직경의 차이 (개체내, 유도된 무릎 직경에서 유도되지 않은 무릎 직경을 차감함)를 시간 과정에 따라 도시한 것이다. 값은 평균 ± SD이다. 삼각형을 동반한 긴 파선 - d1에 치료를 시작함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 Q, n=7); 채워진 원을 동반한 점선 - d0에 치료를 시작함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 P, n=6); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H). 백색 사각형을 동반한 실선: 유도되지 않은 무릎 직경 증가가 없음 (군 Q, P 및 H; 유도되지 않은 좌측 무릎).
도 21 관절염 유도 후 제1일 (a), 제2일 (b) 및 제3일 (c)에 cgtx-544 효능 결과의 통계적 분석: cgtx-544 펩티드 요법 - 치유적 치료 (d0/d1에 시작함)를 이용한 경우 및 이용하지 않은 경우의 상대적 무릎 종창의 차이. 모든 박스 플롯은 중앙값, 사분위 범위, 샘플 최소값 및 최대값을 제시한다. 유의성 분석을 위해, 비히클 대조군을 요법 군과 비교하였다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 22 치유적 치료 - d=0 또는 d=1에 치료를 시작함 - cgtx-544 펩티드 요법 (치료는 d0 및 d1에 시작함)을 이용한 경우 및 이용하지 않은 경우의 관절염 래트에서 WBC 계수치를 시간 과정에 따라 도시한 것이다. 백혈구 (WBC) 계수 절대치: 값은 평균 ± SD이다. 삼각형을 동반한 긴 파선 - d1에 치료를 시작함: cgtx-544(Mix) 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 Q, n=7); 채워진 원을 동반한 점선 - d0에 치료를 시작함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 P, n=6); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H, n=5). 흑색 화살표: 엠. 투베르쿨로시스 (750 μg) 및 mBSA를 이용한 면역화 시간.
도 23 치유적 치료 - d=0 또는 d=1에 치료를 시작함 - cgtx-544 펩티드 요법 (치료는 d0 및 d1에 시작함)을 이용한 경우 및 이용하지 않은 경우의 관절염 래트에서 WBC의 퍼센트에 있어서 호중구 과립구의 상대적 양을 시간 과정에 따라 도시한 것이다. WBC의 총량 대비 호중구 (%). 값은 평균 ± SD이다. 삼각형을 동반한 긴 파선 - d1에 치료를 시작함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 Q, n=7); 채워진 원을 동반한 점선 - d0에 치료를 시작함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 P, n=6); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H, n=5). 흑색 화살표: 엠. 투베르쿨로시스 (750 μg) 및 mBSA를 이용한 면역화 시간.
도 24 치유적 치료 - d=0 또는 d=1에 치료를 시작함 - cgtx-544 펩티드 요법 (치료는 d0 및 d1에 시작함)을 이용한 경우 및 이용하지 않은 경우의 관절염 래트에서 WBC의 퍼센트에 있어서 림프구의 상대적 양을 시간 과정에 따라 도시한 것이다. WBC의 총량 대비 림프구 (%). 값은 평균 ± SD이다. 삼각형을 동반한 긴 파선 - d1에 치료를 시작함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 Q, n=7); 채워진 원을 동반한 점선 - d0에 치료를 시작함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 P, n=6); 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H, n=5). 흑색 화살표: 엠. 투베르쿨로시스 (750 μg) 및 mBSA를 이용한 면역화 시간.
도 25 치유적 치료 (1주 1회 또는 1주 2회) - 무릎 관절 직경의 상대적 증가를 시간 경과에 따라 도시한 것이다. 값은 평균 ± SD이다. 삼각형을 동반한 긴 파선 - d1에 단일 치료함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 R6-10, n=5); 채워진 원을 동반한 점선 - d1 및 d4에 단일 치료함: cgtx-544 펩티드 1 mg/kg 체중 요법 군 (군 R1-5, n=5); 제4일이 될 때까지 양쪽 군을 합하였다. 마름모꼴을 동반한 실선: 비히클 (NaCl) 대조군 (군 H, n=5).
도 26 치유적 치료 (1주 1회 또는 1주 2회) - cgtx-544 효능의 통계적 분석: 관절염 유도 후 제2일 (A) 및 제5일 (B)에 cgtx-544 펩티드 요법을 이용한 경우 및 이용하지 않은 경우의 상대적 무릎 종창의 차이. 모든 박스 플롯은 중앙값, 사분위 범위, 샘플 최소값 및 최대값을 제시한다. 유의성 분석을 위해, 비히클 대조군을 요법 군과 비교하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 27 mBSA 특이적 항체의 분석. 실험군 H 및 I에서, 모든 동물은 면역화 및 AIA 유도 기간 동안 항원 mBSA에 대항하여 항체를 생산하였다. 대조군 F (나이브 동물)에서는 특이적 mBSA 항체가 검출될 수 없었다.
도 28 MTX 효능 결과의 통계적 분석: 관절염 유도 후 제1일 (A) 및 제3일 (B)에 MTX 요법 (고/저 용량)을 이용한 경우 및 이용하지 않은 경우의 상대적 무릎 종창의 차이. 모든 박스 플롯은 중앙값, 사분위 범위, 샘플 최소값 및 최대값을 제시한다. 유의성 분석을 위해, 비히클 대조군을 요법 군과 비교하였다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s. 유의적이지 않음.
도 29 펩티드 합성 도식.
도 30 폴딩 후 cgtx-544 펩티드의 UPLC 프로파일.
도 31 cgtx-544(Sing)의 IC50. a. cgtx-544(Sing)는 그 결과를 힐(Hill) 곡선에 피팅할 때 6.9 nM의 IC50 값을 표시하였다. b. 증가 농도의 cgtx-544(Sing)를 이용한 단계별 전류 감소. c. 상이한 농도의 cgtx-544(Sing)에서 측정하는 동안의 전류 추적.
도 32 cgtx-544(Sing)의 선택성. a. cgtx-544(Sing)는 그 결과를 힐 곡선에 피팅할 때 Kv1.1 상에서 약 6 μM의 IC50 값을 표시하였다. b. Kv1.1 상에서 증가 농도의 cgtx-544(Sing)를 이용한 단계별 전류 감소. c. Kv1.1 상에서 상이한 농도의 cgtx-544(Sing)에서 측정하는 동안의 전류 추적. d. cgtx-544(Sing)의 10 μM 용액은 Kv1.5 전류의 유의적 감소를 유도하지 못한 반면, 그 전류는 퀴니딘에 대해 민감하였다. e. cgtx-544(Sing)의 100 nM 용액은 안정적으로 형질감염된 CHO 세포에서 Kv1.2 전류를 변경시키지 못하였다. 농도 > 1 μM은 단지 약간 감소된 전류를 초래하였다. IC50은 2.5 μM으로 확립되었다.
도 33 37℃ 하의 인간 혈청 중에서의 cgtx-544(Sing)의 붕괴. 공지된 양의 cgtx-544(Sing)를 3명의 혈액 공여자로부터의 인간 혈액 혈청에 부가하고, 37℃에서 57일의 기간 동안 인큐베이션하였다. 상기 펩티드의 차단 활성을 상기 기간에 걸쳐 Kv1.3 채널 상에서 측정하였다. 상기 펩티드는 16시간 동안 여전히 안정적이고, 이는 45일 후에도 계속해서 검출될 수 있었다. 57일에는 차단 효과가 더 이상 가시적이지 않았다. 붕괴는 C(t) = IC50 (t0)/IC50(t).C0으로써 결정된 바와 같이, cgtx-544 (Sing)의 농도의 감소로서 묘사된다. 이러한 붕괴는 간단한 붕괴 곡선: C(t) = C0.2(-t/t1/2) (여기서 C0는 용액 중의 펩티드의 초기 농도이고, t0는 37℃ 지점에서의 0분 인큐베이션이며, t1/2은 반감기임)으로써 피팅된다.
도 34 i.v. 주사 후 처리된 래트의 혈청 중의 cgtx-544(Sing)의 감소. 결합되지 않은 순환성 cgtx-544(Sing)의 농도는 표준 곡선을 기준으로 하여 계산하였다. 평균의 표준 오차가 오차 막대로 묘사된다 (n=6).
도 35 A. cgtx-544의 연장된 인큐베이션은 피코몰 IC50 값을 생성한다. Kv1.3 전류를 초기 피크 전류 및 비-특이적 칼륨 채널 차단제 퀴니딘에 의한 완전한 차단 (데이터는 제시되지 않음)에 대해 정규화하였다. 대조군 조건 (상부 곡선, n=11) 하에서는 전류가 최소한 10분 동안 안정적이지만, cgtx-544 (하부 곡선, n=13)를 단일 적용하면 (화살표), 차단이 유발되는데, 이는 시간 경과에 따라 증가된다. B. 연장된 인큐베이션 시간에서 cgtx-544의 용량 반응 곡선. 흑색 파선에서는, 단기간 인큐베이션 시간을 이용한 경우의 cgtx-544에 대한 용량 반응 곡선이 제시된다. 흑색 실선 곡선은 cgtx-544를 연장된 시간, 즉 15분 동안 Kv1.3 채널과 함께 인큐베이션하는 경우의 결과이다. 장기간 인큐베이션 시간 (흑색 점)을 이용한 경우의 60% 차단과 비교 시 단기간 인큐베이션 시간 (백색 점)을 이용한 경우에 관찰된 20% 차단으로 인해, 용량 반응 곡선이 좌측으로 이동하였으며, 따라서 IC50 (수평 점선)이 더 낮다. C. 장기간 인큐베이션 시간 및 단기간 인큐베이션 시간을 이용한 경우의 Kv1.3 및 Kv1.1 상에서 cgtx-544의 IC50 값.
본 발명을 다음에 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 본원에 기재된 특별한 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않는 것으로 이해해야 하는데, 이는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 본원에 사용된 전문 용어는 단지 특별한 실시양태를 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범위 (이는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임)를 제한하지 않는 것으로 또한 이해해야 한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 1 문자 및 3 문자 아미노산 약어는 IUPAC 명명법에 상응한다 (예를 들어, 문헌 [European Journal of Biochemistry, 138:9-37, 1984] 참조).
하기 정의가 도입된다:
본 명세서 및 의도한 청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태는 또한, 문맥상 달리 명백하게 표시되지 않는 한은 각각의 복수를 포함한다.
용어 "포함하다" 및 변형, 예컨대 "포함하는"은 제한적이 아닌 것으로 이해해야 한다. 본 발명의 목적상, 용어 "이루어지는"은 용어 "포함하는"의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다. 나중에 특정 군이 적어도 특정 수의 실시양태를 포함하는 것으로 규정되면, 이는 또한, 바람직하게 이들 실시양태만으로 이루어지는 군을 포괄한다는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "약" 및 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 해당 특징의 기술적 효과를 여전히 보장할 것으로 이해하는 정확도 간격을 의미한다. 상기 용어는 전형적으로, 표시된 수치 값으로부터의 편차 ±10% 및 바람직하게 ±5%를 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩티드"는 아미노산의 분자 쇄를 지칭하고, 특이적 길이의 생성물을 지칭하지 않으므로; 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 펩티드의 정의 내에 포함된다. 이러한 정의에 따른 펩티드는 자연 발생적 펩티드와, 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있는 합성 펩티드 둘 다일 수 있다. 상기 정의 내에는 상기 펩티드의 기능성 유도체, 즉 예를 들어 바람직하게 각각의 아미노산의 실체를 변화시키지 않으면서, 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산의 측쇄, 유리 아미노 및/또는 카르복시-말단을 변형시킴으로써, 화학적으로 변형되는 펩티드가 추가로 포함된다. 예를 들어, 특정 펩티드의 아미노산의 측쇄 또는 유리 아미노 또는 카르복시 말단은, 예를 들어 예를 들어 글리코실화, 아미드화, 인산화, 유비퀴틴화, 카르복실화 등에 의해 변형될 수 있다. 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 펩티드는 PEG화, HES화 또는 PAS화에 의해 변형될 수 있다.
본원에 개시된 화합물은 놀랍게도, 다른 칼륨 채널, 예컨대 예를 들어 Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG 또는 큰 전도도 Ca2+-활성화된 K+ 채널 (BK 채널)에 비해 Kv1.3 칼륨 채널과 선택적으로 결합할 수 있는 것으로 본 발명의 발명자들에 의해 밝혀졌다. TEM 세포에 Kv1.3이 우세하다는 사실을 고려해 볼 때, 본 발명에 따른 화합물은 따라서, TEM-세포 매개된 질환, 예컨대 예를 들어 자가면역 질환에 대한 강력한 치료제를 구성한다. 더욱이, 본원에 개시된 화합물은 부작용 감소 이점을 제공하는데, 이는 상기 화합물이 다른 유형의 세포 또는 조직에 분포된 다른 칼륨 채널의 활성을 실질적으로 조정하지 않기 때문이다.
따라서, 본 발명은 일반적으로, 다른 칼륨 채널, 예컨대 예를 들어 Kv1.1에 비해 Kv1.3 칼륨 채널과 선택적으로 결합할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 이러한 화합물은 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하는 것으로 고려된다. 상기 화합물은 펩티드, 항체 또는 소분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서 상기 화합물은 본 발명의 제1, 제2 및 제3 측면에 대하여 기재된 바와 같은 펩티드 및 그의 변이체이다.
칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있는 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서 상기 항체는 또한, 항체 변이체 또는 단편, 예컨대 예를 들어 단일 쇄 항체, 디아보디, 미니보디, 단일 쇄 Fv 단편 (sc(Fv)), sc(Fv)2 항체, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편으로부터 선택될 수 있는데, 단 상기 항체 변이체 또는 단편은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "소분자"는 저 분자량을 갖는 작은 유기 화합물을 지칭한다.
소분자는 자연에서 발생하는 것으로 공지되지 않은 합성 화합물, 또는 자연 공급원, 예컨대 예를 들어, 세포, 식물, 진균, 동물 등으로부터 단리되거나 또는 자연 공급원에서 발생하는 것으로 공지된 자연 발생적 화합물일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 소분자는 바람직하게 5000 달톤 미만, 보다 바람직하게 4000 달톤 미만, 보다 바람직하게 3000 달톤 미만, 보다 바람직하게 2000 달톤 미만 또는 보다 더 바람직하게 1000 달톤 미만의 분자량를 갖는다. 특히 바람직한 실시양태에서 본 발명의 맥락에서 소분자는 800 달톤 미만의 분자량을 갖는다.
또 다른 바람직한 실시양태에서 본 발명의 맥락에서 소분자는 50 내지 3000 달톤, 바람직하게 100 내지 2000 달톤, 보다 바람직하게 100 내지 1500 달톤 및 보다 더 바람직하게 100 내지 1000 달톤의 분자량을 갖는다. 가장 바람직하게 본 발명의 맥락에서 소분자는 100 내지 800 달톤의 분자량을 갖는다.
칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있는 소분자는, 예를 들어 작은 화합물 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다.
따라서, 제1, 제2 및 제3 측면 및 그의 변형에서의 본 발명은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있는 펩티드 화합물에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 화합물은 다른 칼륨 채널, 예컨대 예를 들어 Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG 또는 큰 전도도 Ca2+-활성화된 K+ 채널 (BK 채널)에 비해 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 칼륨 채널 Kv1.1에 비해 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (서열식별번호: 23),
여기서 X1=T,Q,S,Y,N; X2=I,F,V,A,L,W; X3=I,T,Y,S,V,A,L; X4=K,S,T,Y,R; X5=R,T,K,S,Y; X6=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X7=P,S,T; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X11=D,R,P,K,E,S,T,Y; X12=P,H,V,I,L,A; X13=R,K,Q,N; X14=K,D,A,R,E,V,L,I; X15=E,Q,A,L,D,N,V,I; X16=Y,N,S,T,Q; X17=A,G,V,I,L; X18=K,R, X19=Y,N,Q,T,S 및 X20=G,R,K.
제1 측면의 변형에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 23에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=T,Q,S,Y,N; X2=I,F,V,A,L,W; X3=I,T,Y,S,V,A,L; X4=K,S,T,Y,R; X5=R,T,K,S,Y; X6=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X7=P,S,T; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X11=D,R,P,K,E,S,T,Y; X12=P,H,V,I,L,A; X13=R,K,Q,N; X14=K,D,A,R,E,V,L,I; X15=E,Q,A,L,D,N,V,I; X16=Y,N,S,T,Q; X17=A,G,V,I,L; X18=K,R, X19=Y,N,Q,T,S 및 X20=G,R,K이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제1 측면의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (서열식별번호: 24);
여기서 X1=T,Q; X2=I,F; X3=I,T; X4=K,S; X5=R,T,K; X6=T,G,S,N,I; X7=P,S; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W; X11=D,R,P,K,E,S; X12=P,H,V; X13=R,K,Q; X14=K,D,A,R; X15=E,Q,A,L; X16=Y,N; X17=A,G; X18=K,R, X19=Y,N 및 X20=G,R.
제1 측면의 변형의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 24에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=T,Q; X2=I,F; X3=I,T; X4=K,S; X5=R,T,K; X6=T,G,S,N,I; X7=P,S; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W; X11=D,R,P,K,E,S; X12=P,H,V; X13=R,K,Q; X14=K,D,A,R; X15=E,Q,A,L; X16=Y,N; X17=A,G; X18=K,R, X19=Y,N 및 X20=G,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제1 측면 및 그의 변형의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 25 (cgtx-544) 또는 서열식별번호: 26 (cgtx 547)의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 이러한 맥락에서, 제1 측면 및 그의 변형의 또 다른 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 25 (cgtx-544)와 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 백분율 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성의 결정은 바람직하게, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877]의 수학적 알고리즘을 이용하여 달성된다. 이러한 알고리즘은, 예를 들어 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)에서 입수 가능한 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]의 BLASTn 및 BLASTp 프로그램 내로 혼입된다. 퍼센트 동일성의 결정은 바람직하게, BLASTn 및 BLASTp 프로그램의 표준 파라미터를 이용하여 수행된다. BLAST 폴리뉴클레오티드 검색은 바람직하게, BLASTn 프로그램을 이용하여 수행된다. 일반적 파라미터에 대해서는, "최대 표적 서열" 박스를 100으로 설정할 수 있고, "짧은 조회" 박스에 체크 표시를 할 수 있으며, "예상 임계치" 박스를 10으로 설정할 수 있고 "단어 크기" 박스를 28로 설정할 수 있다. 스코어링 파라미터에 대해서는, "매치/미스매치 스코어"를 1,-2로 설정할 수 있고, "갭 코스트" 박스를 선형으로 설정할 수 있다. 필터 및 마스킹 파라미터에 대해서는, "낮은 복잡성 영역" 박스에 체크 표시하지 않을 수 있고, "종 특이적 반복 서열" 박스에 체크 표시하지 않을 수 있으며, "단지 조회 테이블에 대한 마스크" 박스에 체크 표시할 수 있고, "마스크 소문자" 박스에 체크 표시하지 않을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 바람직하게, BLASTp 프로그램을 이용하여 수행된다. 일반적 파라미터에 대해서는, "최대 표적 서열" 박스를 100으로 설정할 수 있고, "짧은 조회" 박스에 체크 표시를 할 수 있으며, "예상 임계치" 박스를 10으로 설정할 수 있고 "단어 크기" 박스를 "3"으로 설정할 수 있다. 스코어링 파라미터에 대해서는, "매트릭스" 박스를 "BLOSUM62"로 설정할 수 있고, "갭 코스트" 박스를 "실존: 11 연장:1"로 설정할 수 있으며, "구성 조정" 박스는 "조건부 구성 스코어 매트릭스 조정"으로 설정될 수 있다. 필터 및 마스킹 파라미터에 대해서는, "낮은 복잡성 영역" 박스에 체크 표시하지 않을 수 있고, "단지 조회 테이블에 대한 마스크" 박스에 체크 표시하지 않을 수 있으며, "마스크 소문자" 박스에 체크 표시하지 않을 수 있다.
제1 측면 및 그의 변형의 보다 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 25 (cgtx-544)의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
후술되는 실시양태들은 바람직하게, 본 발명의 제1 측면 및 그의 변형의 화합물을 지칭한다. 그러나, 이들 실시양태, 예를 들어 다음에 논의되는 바와 같은 펩티드의 길이, Kv1.1과 비교한 Kv1.3에 대한 선택성 등이 본 발명의 제2 및 제3 측면 및 그의 변형 뿐만 아니라 후술되는 바와 같은 그의 바람직한 실시양태의 화합물에도 적용된다는 것을 이해하는 것이 필요하다.
추가의 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 화합물은 펩티드이다.
본 발명에 따른 화합물이 펩티드인 경우, 본 발명에 따른 화합물은 바람직하게, 1000개 미만의 아미노산, 500개 미만의 아미노산, 200개 미만의 아미노산, 바람직하게 150개 미만의 아미노산, 100개 미만의 아미노산, 90개 미만의 아미노산, 80개 미만의 아미노산, 70개 미만의 아미노산, 60개 미만의 아미노산, 50개 미만의 아미노산 또는 40개 미만의 아미노산의 길이를 갖는다.
추가의 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 화합물은 적어도 20개 내지 1000개의 아미노산, 바람직하게 적어도 25개 내지 500개의 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 30개 내지 200개의 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 34개 내지 150개의 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 34개 내지 100개의 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 34개 내지 90개의 아미노산, 및 보다 더 바람직하게 적어도 34개 내지 80개의 아미노산, 적어도 34개 내지 70개의 아미노산, 34개 내지 60개의 아미노산, 34개 내지 50개의 아미노산 또는 34개 내지 40개의 아미노산의 길이를 갖는다.
보다 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 화합물은 표시된 바와 같은 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진다.
본 발명에 따른 화합물에 포함된 아미노산은 L- 또는 D-아미노산일 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 화합물에 포함된 아미노산은 L-아미노산이다. 일부 실시양태에서, 특히 단백질 분해에 대한 높은 저항성이 요망되는 경우에는, D-아미노산이 바람직할 수 있다.
상이한 칼륨 채널의 활성을 동시에 억제하는 화합물은 상이한 칼륨 채널이 상이한 유형의 세포에 차등 분포되기 때문에, 살아있는 유기체에 적용되는 경우에 상당한 부작용을 나타낼 수도 있다. 따라서, 본 발명은 다른 칼륨 채널과 비교 시, 특히 칼륨 채널 Kv1.1과 비교 시 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있는 화합물을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택적으로 결합하는"은 본 발명에 따른 화합물이 다른 이온 채널에 비해, 특히 예컨대 예를 들어, Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG 또는 큰 전도도 Ca2+-활성화된 K+ 채널 (BK 채널)과 같은 다른 칼륨 채널에 비해 Kv1.3 채널과 우선적으로 결합하는 것을 지칭한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 화합물은 칼륨 채널 Kv1.1에 비해 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 화합물은 Kv1.1 채널과 결합할 때보다 실질적으로 더 높은 친화도로 Kv1.3 채널과 결합한다.
본 발명의 맥락에서 독소 HsTx 1은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있는 화합물로서 간주되지 않는데, 이는 상기 독소가 Kv1.1 채널과 결합하여 이를 강력하게 억제하기 때문이다.
바람직한 실시양태에서 본 발명에 따라서 Kv1.3과 선택적으로 결합하는 화합물은 이러한 화합물이 Kv1.1 채널과 결합하는 경우의 Kd 값과 비교 시 적어도 2배, 5배, 10배, 100배, 1000배, 2000배, 바람직하게 적어도 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000배 더 낮은 Kd 값으로 칼륨 채널 Kv1.3과 결합한다. 추가의 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따라서 Kv1.3과 선택적으로 결합하는 화합물은 이러한 화합물이 다른 칼륨 채널, 예컨대 예를 들어 Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG 또는 큰 전도도 Ca2+-활성화된 K+ 채널 (BK 채널)과 결합하는 경우의 Kd 값과 비교 시 적어도 4000, 5000 또는 10000배 더 낮은 Kd 값으로 칼륨 채널 Kv1.3과 결합한다.
특히 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따라서 Kv1.3과 선택적으로 결합하는 화합물은 이러한 화합물이 Kv1.1 채널과 결합하는 경우의 Kd 값과 비교 시 적어도 4000, 5000 또는 10000배 더 낮은 Kd 값으로 칼륨 채널 Kv1.3과 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 전형적으로 약 0.1 nM 내지 약 250 nM, 약 0.5 nM 내지 약 250 nM, 약 1 nM 내지 약 225 nM, 약 1 nM 내지 약 200 nM, 보다 더 바람직하게 약 1 nM 내지 약 100 nM, 및 가장 바람직하게 약 1 nM 내지 약 50 nM의 Kd 값으로 칼륨 채널 Kv1.3과 결합한다.
본 발명에 따른 화합물은 바람직하게 0.1 mM 초과, 0.2 mM 초과, 0.3 mM 초과, 0.4 mM 초과 또는 0.5 mM 초과의 Kd 값으로 다른 칼륨 채널, 예컨대 예를 들어 Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG 또는 큰 전도도 Ca2+-활성화된 K+ 채널 (BK 채널)과 결합한다. 특히 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 화합물은 0.1 mM 초과, 0.2 mM 초과, 0.3 mM 초과, 0.4 mM 초과 또는 0.5 mM 초과의 Kd 값으로 Kv1.1 채널과 결합한다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 바람직하게, 약 0.5 내지 약 200 nM, 예컨대 약 1 또는 2 nM 내지 약 200 nM의 Kd 값으로 칼륨 채널 Kv1.3과 결합하고, 0.1 mM 초과, 0.2 mM 초과, 0.3 mM 초과, 0.4 mM 초과 또는 0.5 mM 초과의 Kd 값으로 Kv1.1 채널과 결합한다. 보다 바람직하게, 본 발명에 따른 화합물은 약 0.5 내지 약 100 nM, 예컨대 약 1 또는 2 nM 내지 약 100 nM의 Kd 값으로 칼륨 채널 Kv1.3과 결합하고, 0.1 mM 초과, 0.2 mM 초과, 0.3 mM 초과, 0.4 mM 초과 또는 0.5 mM 초과의 Kd 값으로 Kv1.1 채널과 결합한다. 보다 더 바람직하게, 본 발명에 따른 화합물은 약 0.5 내지 약 50 nM, 예컨대 약 1 또는 2 nM 내지 약 50 nM의 Kd 값으로 칼륨 채널 Kv1.3과 결합하고, 0.5 mM 초과의 Kd 값으로 Kv1.1 채널과 결합한다.
본 발명에 따른 화합물은 바람직하게, 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있고 그의 활성을 차단 또는 저하시킬 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3의 활성을 대조군과 비교 시 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 보다 바람직하게 80% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 저하시킬 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3의 활성을 100%만큼 차단시킬 수 있다.
Kv1.3 채널과 선택적으로 결합할 수 있고 그의 활성을 차단 또는 저하시킬 수 있는 본 발명에 따른 화합물의 능력은 관련 기술분야에 공지된 검정에 의해 시험할 수 있다. 예를 들어, 한 가지 접근 방식에서 Kv1.3 또는 또 다른 칼륨 채널, 예컨대 예를 들어 Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG 또는 큰 전도도 Ca2+-활성화된 K+ 채널 (BK 채널)을 발현하는 포유류 세포주를 본 발명의 화합물과 접촉시킬 수 있고, 채널 전류를, 예를 들어 문헌 [Grissmer et al. (Mol Pharmacol 45; 1227-34 (1994))] 또는 하기 본원의 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 패치 클램프 방법에 의해 측정할 수 있다. 각 화합물은, 예를 들어 상이한 농도에서 시험할 수 있다. 이어서, 힐 방정식을 피크 전류의 측정된 감소에 피팅함으로써 본 발명에 따른 화합물의 Kd 값을 결정할 수 있다.
예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같이 Kd를 결정하는 방법은 측정되는 채널의 수를 고려하지 않고, 본 개시내용의 목적상 Kd가 IC50 값에 상응하는 이유는 무엇인지 이해해야 한다 (용어 Kd 및 IC50은 본원에서 동의어로 사용된다). 불완전하게 폴딩된 펩티드를 포함하는 혼합물과 비교 시 완전하게 폴딩되고 정제된 펩티드를 사용하는 경우에 더 낮은 Kd 값이 관찰될 수 있는 것으로 이해해야 한다 (실시예 2 참조).
일부 실시양태에서 본 발명에 따른 화합물은 그의 N-말단 아미노 기 또는 그의 C-말단 카르복시 기에, TEM 세포를 인식할 수 있고 이를 표적화할 수 있는 항체 또는 다른 분자를 부착시킬 수 있다.
본 발명의 화합물은 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 펩티드는, 예를 들어 초기에는 문헌 [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85; 7129 (1963)]에 기재되고, 나중에 문헌 [Meienhofer et al., J. Peptide Prot. Res. 13; 35 (1979) 및 Fields, et al., Peptide Res. 4; 95 (1991)]에 의해 변형된 바와 같은 원리에 따라서, 고체 상 Fmoc 화학을 이용하여 합성할 수 있다. 이러한 합성은, 예를 들어 자동화 펩티드 합성기 상에서 수행할 수 있다. 일단 합성되면, 자동화 펩티드 서열 분석기를 이용하여 서열을 검증할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 언급된 칼륨 채널, 예컨대 예를 들어 칼륨 채널 Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG 또는 큰 전도도 Ca2+-활성화된 K+ 채널 (BK 채널)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 통상의 기술자는 임의의 적합한 공개 데이터베이스, 예컨대 예를 들어 NCBI 데이터베이스 (예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)로부터 이들 채널의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열, 및 그의 오르토로그 및 스플라이스 이소형을 용이하게 검색할 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 1);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K.
바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 HsTx 1 (서열식별번호: 32)이 아니다.
제2 측면의 변형에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 HsTx 1이 아니다.
제2 측면의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지며:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 2);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N 및 X18=G,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 HsTx 1이 아니다.
제2 측면의 변형의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N 및 X18=G,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 HsTx 1이 아니다.
제2 측면의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (서열식별번호: 3);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=K,R, X15=Y,N,Q,T,S 및 X16=G,R,K.
제2 측면의 변형의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=K,R, X15=Y,N,Q,T,S 및 X16=G,R,K이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (서열식별번호: 4);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=K,R, X15=Y,N 및 X16=G,R.
제2 측면의 변형의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=K,R, X15=Y,N 및 X16=G,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (서열식별번호: 5);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L 및 X16=K,R.
제2 측면의 변형의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L 및 X16=K,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (서열식별번호: 6);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G 및 X16=K,R.
제2 측면의 변형의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G 및 X16=K,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (서열식별번호: 7);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I 및 X14=K,R.
제2 측면의 변형의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I 및 X14=K,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (서열식별번호: 8);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L 및 X14=K,R.
제2 측면의 변형의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L 및 X14=K,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 9 (cgtx 538)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
제2 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 10);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N 및 X10=K,D,A,R,E,V,L,I.
제2 측면의 변형의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 10에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N 및 X10=K,D,A,R,E,V,L,I이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 11);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N 및 X10=K,D,A,R,E,V,L,I.
제2 측면의 변형의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N 및 X10=K,D,A,R,E,V,L,I이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 12 (cgtx 539)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
제2 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 13);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q,N; X7=K,D,A,R,E,V,L,I 및 X8=E,Q,A,L,D,N,V,I.
제2 측면의 변형의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 13에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q,N; X7=K,D,A,R,E,V,L,I 및 X8=E,Q,A,L,D,N,V,I이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지며:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 14);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=T,G,S,N,I; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q; X7=K,D,A,R 및 X8=E,Q,A,L이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 변형의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 14에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=T,G,S,N,I; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q; X7=K,D,A,R 및 X8=E,Q,A,L이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 15 (cgtx 540)에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
제2 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (서열식별번호: 16);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,Q,T,S 및 X15=G,R,K.
제2 측면의 변형의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 16에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,Q,T,S 및 X15=G,R,K이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (서열식별번호: 17);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N 및 X15=G,R.
제2 측면의 변형의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 17에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N 및 X15=G,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 더 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 18 (cgtx 541) 또는 서열식별번호: 19 (cgtx 542)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
제2 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 20);
여기서 X1=R,T,K,S,Y; X2=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X3=P,S,T; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X7=D,R,P,K,E,S,T,Y; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N; X10=K,D,A,R,E,V,L,I 및 X11=E,Q,A,L,D,N,V,I.
제2 측면의 변형의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 20에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1= R,T,K,S,Y; X2=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X3=P,S,T; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X7=D,R,P,K,E,S,T,Y; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N; X10=K,D,A,R,E,V,L,I 및 X11=E,Q,A,L,D,N,V,I이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 21);
여기서 X1=R,T,K; X2=T,G,S,N,I; X3=P,S; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W; X7=D,R,P,K,E,S; X8=P,H,V; X9=R,K,Q; X10=K,D,A,R 및 X11=E,Q,A,L.
제2 측면의 변형의 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 21에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=R,T,K; X2=T,G,S,N,I; X3=P,S; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W; X7=D,R,P,K,E,S; X8=P,H,V; X9=R,K,Q; X10=K,D,A,R 및 X11=E,Q,A,L이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제2 측면의 보다 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 22 (cgtx 545)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
제3 측면에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 27);
여기서 X1=P,I,F,V,A,L,W; X2=K,S,T,Y,R; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K.
제3 측면의 변형에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 27에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=P,I,F,V,A,L,W; X2=K,S,T,Y,R; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제3 측면의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 28);
여기서 X1=P,I,F; X2=K,S; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N 및 X18=G,R.
제3 측면의 변형의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한, 서열식별번호: 28에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물에 관한 것이며:
여기서 X1=P,I,F; X2=K,S; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N 및 X18=G,R이고;
여기서 화합물은 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있다.
제3 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 서열식별번호: 29 (cgtx 543), 서열식별번호: 30 (cgtx 546) 또는 서열식별번호: 31 (cgtx 548)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물이 서열식별번호: 9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 또는 31에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어는 것이 특히 바람직하고, 서열식별번호: 25에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물이 가장 바람직하다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 또는 31에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전술된 화합물은 0 내지 5개, 즉 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있는데, 단 상기 화합물은 Kv1.3 칼륨 채널과 여전히 선택적으로 결합할 수 있고/있거나 그의 활성을 차단 또는 저하시킬 수 있어야 한다. 이러한 아미노산 돌연변이를 수반한 화합물이 변이체로 지칭되고, 이는 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
치환은 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있고, 바람직하게 치환은 보존적 치환이다. 보존적 치환은 특정 아미노산을, 치환되는 아미노산과 유사한 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환은 또한, 자연 발생적 아미노산을 비-자연 아미노산으로 교환하는 것일 수 있다.
용어 "아미노산 결실" 및 "아미노산 삽입"은 관련 기술분야에서 통상적이고도 널리 공지된 그들의 의미에 따라서 본원에 사용된다.
본 발명은 또 다른 측면에서 또한, 본 발명에 따른 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 소정의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 자연 발생적 또는 합성 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 또한, 원래 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드에 의해 치환되고/되거나 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 (화학적으로) 변형된다는 점에서 원래의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체와 상이할 수 있는 소정의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체의 유도체를 포괄하는데, 단 이러한 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체는 그의 각각의 아미노산 서열을 여전히 코딩할 수 있어야 한다.
유전 코드의 축중으로 인해, 본 발명에 따른 소정의 아미노산 서열은 상이한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본 발명은 추가 측면에서 또한, 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
이러한 벡터는 본 발명에 따른 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하고 바람직하게는 상이한 숙주 세포 간의 전이를 위해 설계되는 임의의 분자상 비히클, 예컨대 예를 들어 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 임의의 다른 비히클일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는 원핵 또는 진핵 발현 벡터이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 목적하는 코딩 서열 및 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적당한 DNA 서열을 함유하고, 특별한 숙주 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 또는 포유류)에서 또는 시험관내 발현 시스템에서 단백질 발현을 유도할 수 있는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 기능적 요소, 예컨대 예를 들어, 전사될 핵산 서열과 작동적으로 연결되는 프로모터, 전사의 적당한 종결을 허용해 주는 종결 서열 및 선별성 마커를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 프로모터의 성질이 상기 벡터가 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 사용될 것인지의 여부에 좌우될 것이란 사실을 알고 있다. 장기간 동안 안정적 발현을 수득하기 위해, 상기 발현 벡터는 복제 기점 (ORI)을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 발현이 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 달성되어야 하는지 아니면 시험관내 발현 시스템에서 달성되어야 하는지에 따라서, 벡터는 원핵 및/또는 진핵 발현 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 미니염색체, 박테리아 파지, 레트로바이러스 벡터 등일 수 있다. 통상의 기술자는 특이적 필요성에 따라서 적당한 벡터를 어떻게 선택하는 지를 잘 알고 있을 것이다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 지칭한다.
적용 분야에 따라서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다. 전형적인 원핵 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 예를 들어 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) [이. 콜라이 (E. coli)]를 포함한다. 전형적인 진핵 숙주 세포는, 예를 들어 효모 세포, 예컨대 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 예컨대 예를 들어 Sf9/Sf21 세포, 식물 세포 및 포유류 세포, 예컨대 예를 들어 COS, CHO 및 HeLa 세포를 포함한다.
본 발명은 추가 측면에서 또한, 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 본 발명에 따른 화합물 중 2개 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 제약 조성물은 본 발명에 따른 화합물 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서 본 발명의 제약 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 화합물은 서열식별번호: 9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 또는 31의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 화합물의 군으로부터 선택된다.
치료적 사용을 위해 본 개시내용 전반에 걸쳐 특히 바람직한 것으로 간주되는 펩티드는 서열식별번호: 25 (cgtx-544), 서열식별번호: 29 (cgtx 543), 및 서열식별번호: 9 (cgtx 538)의 펩티드이다. 후술되는 대부분의 실험은 서열식별번호: 25 (cgtx-544)의 펩티드를 이용하여 수행하였다는 것에 주목해야 한다. 그러나, 서열식별번호: 29 (cgtx 543), 및 서열식별번호: 9 (cgtx 538)의 펩티드도 또한, hERG와 비교한 그들의 선택성에 관하여 시험하였고, 그들의 서열 유사성에 근거하여, cgtx 544에 관해서와 유사한 효과가 이들 펩티드에 대해서도 마찬가지로 관찰될 수 있다고 결론내는 것이 합리적인 것으로 보인다.
이들 펩티드 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 고체 상 합성에 의해 제조할 수 있다. 이들 펩티드는 시스테인 잔기를 포함하므로, 최적의 활성을 달성하기 위해서는 천연 상태로의 능동적 폴딩이 필요할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 활성은 완전하게 폴딩된 펩티드를 정제함으로써 추가로 증강시킬 수 있다. 폴딩은 합성된 펩티드를 산화시켜 시스테인 잔기 간에 디술피드 브릿지를 달성함으로써 이루어질 수 있다. 이는 상기 펩티드를 실시예 8에 기재되는 바와 같이 대기 산소의 존재하에, 예를 들어 약 8.0의 pH 하의 인산염 완충제 중에서 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 폴딩에 이어 질량 분광측정할 수 있는데, 이는 이와 같이 폴딩된 펩티드가 디술피드 브릿지 형성 동안 수소 원자의 상실에 상응하는 약간 감소된 질량을 나타낼 것이기 때문이다. cgtx 544의 경우에는 질량 상의 차이가 4212 대 4220.2 Da일 것이다.
완전하게 폴딩된 펩티드의 정제는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 HPLC 정제에 의해 달성될 수 있다. 적합한 접근 방식이 실시예 8에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은, 예를 들어 흡입성 분말 알약, 정제, 래커 정제, 당피정, 과립제, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐제, 수성, 알콜성 또는 오일성 용액제, 시럽, 에멀젼 또는 현탁제의 형태로 경구 투여할 수 있거나, 또는 예를 들어, 좌제의 형태로 직장 투여할 수 있다.
투여는 또한, 비내 또는 설하로 수행될 수 있다.
투여는 추가로 비경구적으로, 예를 들어 주사 또는 주입용 용액제의 형태로 피하, 근육내 또는 정맥내 수행될 수 있다. 다른 적합한 투여 형태는, 예를 들어 연고, 팅크제, 분무제 또는 경피 치료 시스템의 형태로, 예를 들어 경피 또는 국소 투여하거나, 또는 비내 분무제 또는 에어로솔 혼합물의 형태로 흡입 투여한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 특히 바람직한 것으로 간주되는 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여이다.
알약, 정제, 당피정 및 경질 젤라틴 캡슐제를 제조하기 위해, 예를 들어, 락토스, 전분, 예를 들어 옥수수 전분 또는 전분 유도체, 탈크, 스테아르산 또는 그의 염 등을 사용하는 것이 가능하다. 연질 젤라틴 캡슐제 및 좌제에 대한 담체는, 예를 들어 지방, 왁스, 반고체 및 액체 폴리올, 자연 또는 경화 오일 등이다. 용액제, 예를 들어 주사용 용액제, 또는 에멀젼 또는 시럽을 제조하는 데 적합한 담체는, 예를 들어 물, 생리학적 염화나트륨 용액, 알콜, 예컨대 에탄올, 글리세롤, 폴리올, 수크로스, 전환 당, 글루코스, 만니톨, 식물성 오일 등이다. 제약 조성물은 또한, 부가제, 예를 들어 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 안정화제, 유화제, 분산제, 보존제, 감미제, 착색제, 향미제, 방향제, 증점제, 희석제, 완충제 물질, 용매, 가용화제, 데포 효과를 달성하기 위한 작용제, 삼투압을 변경시키기 위한 염, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물의 각종 상이한 형태에 적합한 부형제의 예는 문헌 ["Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller]에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서 제약 조성물은 지속 방출 제형일 수 있다.
일부 실시양태에서 본 발명에 따른 제약 조성물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 화합물 이외에도, 자가면역 질환의 치료에 적합한 다른 면역억제제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 면역억제제의 예는, 예를 들어 코르티솔, 히드로코르티솔, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 니트로소우레아, 메토트렉세이트, 머캅토푸린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, 시클로스포린, 라파마이신, 아자티오프린, 프레드니손 및 데옥시스페르구알린 및 인터페론을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서 전술된 추가의 면역억제제를 포함하는 별도의 조성물을, 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 포함하는 제약 조성물과 조합하여 그의 투여를 필요로 하는 포유류에게 투여할 수 있다.
추가 측면에서 본 발명은 이펙터 기억 세포 (TEM-세포)와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 바람직하게, 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 목적상 용어 "치료"는 특정 질환의 치유적 완화를 지칭하는 반면, 용어 "예방"은 예방적 예방을 지칭한다. 상기 용어 둘 다는 각각의 질환의 완전한 차도 또는 방지를 의미하는 것이 아니라 오히려, 제약상 활성 작용제를 치유적 또는 예방적 목적으로 투여하지 않은 상황과 비교 시 개선이 있다는 것을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
특히 바람직한 실시양태에서 본 발명은 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서 용어 "자가면역 질환(들)"은 자기 코딩된 실체, 즉 자기 항원에 대하여 유도되는 부적당한 면역 반응에 의해 야기된 질환 상태를 지칭한다. 상기 정의 내에는 신체가 자신의 조직을 공격할 수 있게 하는 면역 체계 결함에 의해 야기된 임의의 많은 장애가 포괄된다. 바람직한 실시양태에서, 자가면역 질환은 T 세포 매개된 자가면역 장애이다.
본 발명의 화합물 및 제약 조성물에 의해 치료되거나 또는 예방될 수 있는 자가면역 질환의 예는, 예를 들어 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 제1형 당뇨병, 혈관염, 하시모토병, 천식, 아토피성 피부염, 자가면역 눈 질환, 쇼그렌 증후군, 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM), 애디슨병, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군 (APS), 재생불량성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염, 복강 질환, 크론병, 임신성 유천포창, 굿패스쳐 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 특발성 혈소판감소성 자반증, 가와사키병, 홍반성 루푸스, 중증 근무력증, 안진전 근간대성경련 증후군, 시신경염, 오드 갑상선염, 천포창, 악성 빈혈, 다발관절염 (개에서), 원발성 담즙성 간경변, 라이터 증후군, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염, 온난 자가면역 용혈성 빈혈, 베게너 육아종증, ANCA-관련 전신 혈관염, 처그-스트라우스 증후군, 현미경적 다발혈관염, 대장염, 염증성 장 질환, 포도막염 및 건선성 관절염을 포함한다.
이들 자가면역 질환 중 일부는 TEM-세포와 연결되었는데, 예를 들어 ANCA-관련 전신 혈관염 (Abdulahad, Nephrology, 2009 vol. 14 pp 26), 처그-스트라우스 증후군, 베게너 육아종증, 현미경적 다발혈관염 (Berden, Arthritis & Rheumatism, 2009, vol.60, pp 1578), 강직성 척추염, 베체트병, 대장염, 크론병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 제1형 당뇨병 (Ulivieri, Expert Rev. Vaccines, 2013 vol. 12 pp 297), 전신성 홍반성 루푸스 (Devarajan, Immunol . Res, 2013 vol. 57 pp 12), 포도막염 (Amadi-Obi, Nephrology, 2009, vol 14 pp 26), 및 건선성 관절염 (De Vlam, Acta Derm . Venereol, 2014, vol. 94, pp 627)이다.
이와 동일한 것이 비만에도 적용된다 (Xu, Human Molecular Genetics, 2003, vol. 12, pp 551).
cgtx 544가 TEM-세포 상에서 선택적으로 작용하고 류마티스 관절염에 대한 효과를 나타내는 것으로 제시된 바 있다는 것을 고려해 볼 때, cgtx 544 및 본원에 개시된 다른 펩티드를 이용하여 상기 질환을 치료 또는 예방할 수 있다고 추정하는 것이 합리적인 것으로 보인다.
바람직한 실시양태에서 본 발명의 화합물 및 제약 조성물에 의해 치료 또는 예방하고자 하는 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 제1형 당뇨병 및 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
기관 또는 조직을 새로운 숙주 내로 이식하는 것은 종종, 이러한 새로운 기관 또는 조직 (예를 들어, 심장, 간, 신장, 췌장 또는 피부)에 대항한 T 세포 매개된 면역 반응으로 인해, 이식된 기관 또는 조직의 거부를 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 기관 또는 조직 이식 거부의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다. 기관 이식 거부는 또한, TEM-세포와 관련이 있는 것으로 제시된 바 있다 (예를 들어, 문헌 [Macedo, Transplantation, 2012 vol 93 pp 813] 참조). cgtx 544 및 본원에 개시된 다른 펩티드의 높은 선택성을 고려해 볼 때, cgtx 544 및 본원에 개시된 다른 펩티드를 이용하여 상기 질환을 치료 또는 예방할 수 있다고 추정하는 것이 합리적인 것으로 보인다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물을, 이의 투여를 필요로 하는 포유류에게 투여함으로써, 이러한 포유류에게서 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 제1형 당뇨병 및 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포유류"는, 예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소 등을 포함한다. 바람직한 포유류는 인간이다.
본 발명에 따른 제약 조성물의 단위 투여 형태는 이용하고자 의도된 1일 투여량 범위와 같은 정도의 본 발명에 따른 화합물의 임의의 적합한 유효량을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 제약 조성물의 투여를 필요로 하는 포유류는, 예를 들어 T 세포 매개된 질환, 바람직하게 T 세포 매개된 자가면역 질환으로 인해 고통받고 있거나 또는 이러한 질환이 발생할 위험이 있는 포유류이다. 바람직한 실시양태에서 상기 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 제1형 당뇨병 및 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 추가 측면에서 또한, 본 발명에 따른 화합물, 본 발명에 따른 핵산 서열, 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 제약 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기에 관한 것이다:
(1) 하기 아미노산 서열을 포함하는 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 1);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K.
바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 HsTx 1 (서열식별번호: 32)이 아니다.
(2) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (1)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 2);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N 및 X18=G,R.
바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 HsTx 1이 아니다.
(3) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (1)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (서열식별번호: 3);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=K,R, X15=Y,N,Q,T,S 및 X16=G,R,K.
(4) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (3)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (서열식별번호: 4);
여기서 X1=A,V,I X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=K,R, X15=Y,N 및 X16=G,R.
(5) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (1)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (서열식별번호: 5);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L 및 X16=K,R.
(6) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (5)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (서열식별번호: 6);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G 및 X16=K,R.
(7) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (1)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (서열식별번호: 7);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I 및 X14=K,R.
(8) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (7)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (서열식별번호: 8);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L 및 X14=K,R.
(9) 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 (8)에 따른 화합물.
(10) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (1)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 10);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N 및 X10=K,D,A,R,E,V,L,I.
(11) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (10)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 11);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N 및 X10=K,D,A,R,E,V,L,I.
(12) 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 (11)에 따른 화합물.
(13) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (1)에 따른 화합물:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 13);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q,N; X7=K,D,A,R,E,V,L,I 및 X8=E,Q,A,L,D,N,V,I.
(14) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 따른 화합물:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 14);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=T,G,S,N,I; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q; X7=K,D,A,R 및 X8=E,Q,A,L.
(15) 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 (14)에 따른 화합물.
(16) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (1)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (서열식별번호: 16);
여기서 X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,Q,T,S 및 X15=G,R,K.
(17) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (16)에 따른 화합물:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (서열식별번호: 17);
여기서 X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N 및 X15=G,R.
(18) 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 (17)에 따른 화합물.
(19) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (1)에 따른 화합물:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 20);
여기서 X1=R,T,K,S,Y; X2=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X3=P,S,T; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X7=D,R,P,K,E,S,T,Y; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N; X10=K,D,A,R,E,V,L,I 및 X11=E,Q,A,L,D,N,V,I.
(20) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (19)에 따른 화합물:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (서열식별번호: 21);
여기서 X1=R,T,K; X2=T,G,S,N,I; X3=P,S; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W; X7=D,R,P,K,E,S; X8=P,H,V; X9=R,K,Q; X10=K,D,A,R 및 X11=E,Q,A,L.
(21) 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 (20)에 따른 화합물.
(22) 하기 아미노산 서열을 포함하는 화합물:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (서열식별번호: 23),
여기서 X1=T,Q,S,Y,N; X2=I,F,V,A,L,W; X3=I,T,Y,S,V,A,L; X4=K,S,T,Y,R; X5=R,T,K,S,Y; X6=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X7=P,S,T; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X11=D,R,P,K,E,S,T,Y; X12=P,H,V,I,L,A; X13=R,K,Q,N; X14=K,D,A,R,E,V,L,I; X15=E,Q,A,L,D,N,V,I; X16=Y,N,S,T,Q; X17=A,G,V,I,L; X18=K,R, X19=Y,N,Q,T,S 및 X20=G,R,K.
(23) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (22)에 따른 화합물:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (서열식별번호: 24);
여기서 X1=T,Q; X2=I,F; X3=I,T; X4=K,S; X5=R,T,K; X6=T,G,S,N,I; X7=P,S; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W; X11=D,R,P,K,E,S; X12=P,H,V; X13=R,K,Q; X14=K,D,A,R; X15=E,Q,A,L; X16=Y,N; X17=A,G; X18=K,R, X19=Y,N 및 X20=G,R.
(24) 서열식별번호: 25 또는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 (23)에 따른 화합물.
(25) 하기 아미노산 서열을 포함하는 화합물:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 27);
여기서 X1=P,I,F,V,A,L,W; X2=K,S,T,Y,R; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S 및 X18=G,R,K.
(26) 하기 아미노산 서열을 포함하는 (25)에 따른 화합물:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (서열식별번호: 28);
여기서 X1=P,I,F; X2=K,S; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N 및 X18=G,R.
(27) 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30 또는 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 (26)에 따른 화합물.
(28) 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있는, (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (13), (14), (17), (19), (20), (22), (23), (25) 또는 (26) 중 임의의 것에 따른 화합물.
(29) 칼륨 채널 Kv1.1과 비교 시 칼륨 채널 Kv1.3과 선택적으로 결합할 수 있는, (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (13), (14), (17), (19), (20), (22), (23), (25) 또는 (26) 중 임의의 것에 따른 화합물.
(30) (1) 내지 (27) 중 임의의 것에 언급된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열.
(31) (30)에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
(32) (30)에 따른 핵산 서열 또는 (31)에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
(33) (1) 내지 (29) 중 임의의 것에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물.
(34) 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부의 치료에 사용하기 위한, (1) 내지 (29) 중 임의의 것에 따른 화합물 또는 (33)에 따른 제약 조성물.
(35) 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부를 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, (1) 내지 (29) 중 임의의 것에 따른 화합물 또는 (33)에 따른 제약 조성물의 용도.
(36) (1) 내지 (29) 중 임의의 것에 따른 화합물 또는 (33)에 따른 제약 조성물을, 이의 투여를 필요로 하는 포유류에게 투여함으로써, 이러한 포유류에게서 자가면역 질환, 비만, 치주염 및/또는 조직 이식 거부를 치료 또는 예방하는 방법.
(37) (30)에 따른 핵산 서열, (31)에 따른 벡터 또는 (32)에 따른 숙주 세포를 이용하여, (1) 내지 (29) 중 임의의 것에 따른 화합물을 제조하는 방법.
실시예
실시예 1 - 전기생리학적 측정
인간 Kv1.3 (hKv1.3) 채널을 발현하는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (Sf21) 세포를 사용함으로써 칼륨 전류를 측정하였다. 이러한 채널 활성은 -40 mV보다 더 양성인 전압에 대한 막 탈분극시 유도된다. 활성화 역학은 신속하고도 강력하게 전압 의존성인 반면, 불활성화는 훨씬 더 느리고 상당한 전압 의존성을 나타내지 않는다. Sf21 세포에서는, hKv1.3이 +40 mV에서 250 pA - 5 nA의 평균 전류 진폭을 갖는다.
감염 후 1 - 3일에, 포트-A-패치(Port-A-Patch) [나니온 테크놀로지 게엠베하(Nanion Technologies GmbH)]를 이용하여, 칼륨 전류를 평면 패치 클램프 기술로 기록하였다. 이온 전류는 200 ms 동안 +40 mV의 탈분극 전위에 대한 전압 단계에 의해 활성화시켰다.
Sf21 세포를, 10% FBS (태내 소 혈청), 2 mM 글루타민, 1x 유청(Yeastolate) (50x 스톡 용액으로부터 유래됨) 및 0.1% 플루로닉(Pluronic®) F68 (BASF)을 보충시킨 그레이스(Grace) 곤충 세포 배지에서 배양하여 2 - 3 x 106개 세포/ml의 세포 밀도가 되도록 하였다.
전기생리학적 완충제는 다음과 같다:
외부 완충제: 160 mM NaCl
4.5 mM KCl
1 mM MgCl2
2 mM CaCl2
5 mM D-글루코스 1수화물
10 mM HEPES / NaoH pH 7.4.
내부 완충제: 75 mM KCl
10 mM NaCl
70 mM K-플루오라이드
2 mM MgCl2
10 mM EGTA
10 mM HEPES / KOH pH 7.2.
본원에 기재된 펩티드 (서열식별번호: 1 내지 31) 및 특히 cgtx-544 (서열식별번호: 25)의 선택성을 입증하기 위해, Kv1.3, Kv1.1 및 Kv1.5에 대한 cgtx-544의 결합에 관한 IC50을 결정하였다. HsTx 1 (서열식별번호: 32)이 대조군으로서 시험되었다.
펩티드를 20 mM NaPO4 완충제 pH 8.2에 1 μg/μl으로 용해시키고 (1 ml 폴딩 완충제 중 1 mg), 실온에서 상기와 동일한 완충제 3x 1L, 플로트-리저(Float-a-Lyzer) 컷 오프 500 Da [스펙트라포르(Spectrapor)]에 대항하여 투석하였다.
HsTx 1 결합은 시험된 채널에 따라, 예를 들어 100 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 및 1 μM의 각종 농도에서 시험하였다. Kv 1.1, Kv1.3 및 Kv1.5에 대한 대표적인 측정이 도 1 a), 1 b), 및 1 c)에 각각 도시되어 있다.
Kv1.3에 대한 HsTx 1 결합에 관한 IC50은 25 ± 2.1 nM였다. Kv1.1에 대한 HsTx 1 결합에 관한 IC50은 11.3 μM였다. Kv1.5에 대해서는 결합이 검출될 수 없었다. 따라서, HsTx 1은 Kv1.1에 비해 Kv1.3에 대하여 약 450배 더 높은 선택성을 갖는다.
Cgtx-544 결합은 시험된 채널에 따라서, 예를 들어 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 1μM, 및 5μM의 각종 농도에서 시험하였다. Kv1.1, Kv1.3 및 Kv1.5에 대한 대표적인 측정이 도 1 d), 1 e), 및 1 f)에 각각 도시되어 있다.
Kv1.3에 대한 cgtx-544 결합에 관한 IC50은 6.9 nM였다. 10 μM의 농도까지는 Kv1.5에 대한 결합이 전혀 검출될 수 없었다. Kv1.1은 10 μM에서 약 22% 차단되었다. 따라서, cgtx-544는 HsTx 1과 비교 시, Kv1.1에 비해 Kv1.3에 대하여 더 높은 선택성을 갖는다.
실시예 2 - Kv1 .3 및 hERG에 대한 결합의 비교
하기 실시예에서는, Kv1.3 및 hERG에 대한 선택된 펩티드의 결합을 전기생리학적 측정에 의해 비교하였다.
세포 시스템
Kv1.3에 대한 결합을 결정하기 위해, Kv1.3을 내생적으로 발현하는 저캣(Jurkat) 세포를 사용하였다. hERG에 대한 결합의 경우에는, hERG를 안정적으로 발현하는 HEK 세포를 사용하였다.
세포 배양
표준 세포 배양 기술을 이용하여 세포 배양을 수행하였다. 간략하게 설명하면, 세포를 DMEM-기반 배지 중에서 10 cm 배양 디쉬 또는 T75 배양 플라스크 상에서 성장시켰다. 약 60 - 80%의 밀집도를 이용하여, 세포를 2 - 3일마다 분할시켰다. 패치라이너 (나니온) 상에서 기록하기 위해, 저캣 세포를 재현탁시킨 다음, 원심분리기에서 회전시켰다. 회전시키기 전에, HEK 세포를 트립신으로 처리하여, 상기 세포를 디쉬 표면으로부터 분리시켰다. 회전시킨 후, 세포를 외부 기록 완충제에 재현탁시켜, ml당 대략 1 - 2 백만개 세포의 밀도가 되도록 하였다.
내부 기록 용액: 50 mM KCl
10 mM NaCl
60 mM KF
20 mM EGTA
10 mM HEPES/KOH, pH 7.2, (Osm: 약 290 mOsm).
5 mM Mg-ATP 및 0.3 mM Na-GTP를 상기 내부 용액에 신선하게 가하고, pH를 7.2로 조정하였다.
외부 기록 완충제: 140 mM NaCl
4 mM KCl
1 mM MgCl2
2 mM CaCl2
5 mM D-글루코스 1수화물
10 mM HEPES/NaOH pH 7.4, (Osm: 약 298 mOsm).
화합물
하기 화합물을 시험하였다:
화합물 1: cgtx 538
화합물 2: cgtx 539
화합물 3: cgtx 540
화합물 4: cgtx 541
화합물 5: cgtx 542
화합물 6: cgtx 543
화합물 7: cgtx-544
화합물 8: cgtx 547.
전기생리학적 측정
8개 이하의 채널을 동시에 기록하는 패치라이너를 이용하여 전기생리학적 기록을 수행하였다. 상기 패치라이너는 평면 패치 클램프에 대한 보로실리케이트 유리 칩 (NPC-16)을 활용하고 패치컨트롤HT(PatchControlHT) 소프트웨어를 통하여 작동하는 자동화 패치 클램프 시스템이다. 저캣 세포에 대해서는 3-5 MΩ의 저항을 수반하고 HEK 세포에 대해서는 2-3 MΩ의 저항을 수반하는 NPC-16 칩을 기록에 사용하였다. 기록하는 동안, 세포를 "세포 호텔"에 놓아두었는데, 여기서 이들 세포를 주기적으로 위아래로 피펫팅하여 생존력을 유지시켰다. 세포는 대략 2 - 3시간 동안 생존하였다.
패치컨트롤HT 소프트웨어
패치라이너를 작동시키기 위해 2개의 프로그램을 컴퓨터 상에서 동시에 수행한다 - 나니온의 패치컨트롤HT 및 패치마스터(PatchMaster; HEKA).
패치마스터는 HEKA EPC10 증폭기를 제어하고, 기록을 실행한다. 이러한 프로그램 내에서 펄스 프로토콜 및 온라인 분석을 생성시킬 수 있다. 패치컨트롤HT를 이용하여, 전체 세포로 가기 위해 세포를 붙잡고 밀봉하여 목적하는 기록을 수득하는 것으로부터 완전한 실험 루틴을 규정한다. 패치컨트롤HT와 패치마스터 간의 양방향 통신으로, 패치컨트롤HT는 세포 상태 (기가 씰, 전체 세포 구성)에 따라서 그의 행동을 조정할 수 있다.
상기 프로그램은 용액 교환을 수행하는 피펫을 포함한 패치라이너의 로봇 기능을 완전히 탐색한다. 동시에, 패치컨트롤HT는 또한 상기 증폭기를 제어하고 모든 중요한 패치 파라미터를 패치마스터에서 판독한다. 패치컨트롤HT는 실험에 대한 모든 파라미터와 성공 기준이 정의되는 그래픽 사용자 인터페이스이다. 성공 기준이 기록 웰에 도달하지 않는다면, 패치컨트롤HT이 그러한 특별한 웰로부터의 기록을 중단시키는 옵션이 가능하다.
실험 루틴
적당한 기록 조건을 확립하기 위해, 칩 충전, 세포 포착, 밀봉 및 전체 세포 모드로의 침입을 패치라이너의 표준 절차 기능에 의해 수행하였다. 이러한 루틴의 끝에서, 상기 증폭기의 환경 (예를 유지, 홀딩 전위, 느린 정전 용량 보상 및 이득)은 원하는 기록을 위해 적절하게 설정한 다음, 기록을 시작하였다.
각 실험 내에서, 세포를 외부 용액으로 3회 세척하여 안정적 기록을 보장하였다. 화합물 1-8을 hERG 발현성 세포 상에서 추가로 시험하였다. 각 화합물의 노출 시간은 총 4분이었고, 각 실험은 24분 수행하였다.
전압 프로토콜
hERG의 경우: hERG 전류는 500 ms 동안 -80 mV 내지 -40 mV의 홀딩 전위로부터의 전압 단계 프로토콜을 이용한 다음, 500 ms 동안 +40 mV로의 단계, 꼬리 전류를 수득하기 위해 500 ms 동안 -40 mV 시험 펄스를 이용한 다음, 상기 홀딩 전위로 복귀하여 유도하였다. 상기 단계를 10초마다 반복하였다.
상기 프로토콜을 지속적으로 수행하였고, 온라인 결과를 지속적으로 판독하였다. 이를 수행하여, 세척 및/또는 화합물 적용에 기인한 변화를 모니터링할 수 있었고 정상 상태의 도달을 평가할 수 있었다.
데이터 분석
데이터 기록 및 분석은 2x EPC10 쿼드로(Quadro) 증폭기, 패치마스터 소프트웨어 패키지 [HEKA 일렉트로닉스(HEKA Electronics; 독일 람브레히트/팔츠)], 엑셀(Excel) 및 이고르(Igor) [웨이브메트릭스(WaveMetrics; 미국)]를 이용하여 수행하였다.
hERG에 대한 약리학을 위해, 제2의 -40 mV 단계 (꼬리 전류)에서의 피크 진폭을 패치마스터 내의 온라인 분석 기능을 이용하여 계산하였다. -40 mV로의 제1 단계로부터 계산된 누출량을 상기 피크에서 차감하여 실제 피크를 계산했으며, 이는 시간의 함수로서 플롯될 수 있었다.
이고르의 농도 반응 곡선을 계산하기 위해 값들을 엑셀로 내보냈다. 이고르 (웨이브메트릭스; 미국)를 사용하여 수치를 뽑아내고 내보냈다. 농도 반응 곡선은 이고르에 구축하였다. 힐 방정식을 각 화합물에 대한 IC50을 추정하기 위해 피팅하였고, IC50은 최대 차단과 비교하여 계산하였다. 값은 가능한 경우 평균 ± S.E.M으로서 나타낸다.
결과
hERG 전류에 대하여 시험된 화합물 1-8
Kv1.3 전류에 대한 화합물 1-8의 전기생리학적 측정은 이들 펩티드가 활성이었다는 사실을 표시하였다. 따라서, 화합물 1-8을 hERG 발현성 HEK 세포 상에서 시험하였다. 이들 화합물의 효과를 조사하기 위해, 2-점 스크리닝 과정을 수행하였다. 통상적으로, 3개 내지 5개의 세포를 시험하여 정확도를 보장하였다. 각 실험은 3회 세척으로 시작하여 안정적 전류를 보장하였다. hERG 전류는 약간 증가하였지만, 두 번째 세척 후에 안정적으로 되었다. 화합물 1, 2, 4, 5, 7, 및 8은 hERG 전류에 대하여 단지 낮은 효과를 나타내는 것으로 보였다. 통상적으로, 화합물 1-8의 효과는 또한, hERG 전류의 런 다운 효과에 의해 설명될 수 있었다. 그 결과가 도 3에 제시되어 있다. 모든 화합물의 평균 전류 차단 ± SEM에 관한 요약이 표 1에 제시된다.
<표 1>
Figure 112017001433924-pct00001
표 1: 화합물 1-8의 효과의 요약. 시험 농도는 각 화합물에 대하여 상이하다. 정규화된 차단은 각 화합물 적용이 끝날 무렵 정상 상태 전류로부터 계산하였다. 모든 화합물은 보다 저 농도에서 hERG 전류에 대하여 효과를 전혀 나타내지 않거나 또는 작은 효과만을 나타내는 것으로 보였다. 보다 고 농도에서는, 화합물이 hERG에 영향을 미치는 것으로 보였지만, 이들 효과는 hERG 전류의 런 다운에 기인한 것일 수 있었다.
추가의 분석
완전하게 폴딩된 펩티드를 정제하지 않고서도, 실시예 8에 기재된 바와 같은 폴딩 프로토콜을 각각의 펩티드에 적용한 후에 상기 분석을 수행하였다.
또한, cgtx-544를 상기 언급된 바와 같이 폴딩 및 정제하였다. 이어서, 이러한 cgtx-544 (Sing)를 이용하여 상기 분석을 반복하였다. 추가로, 그 다음 cgtx-544 (Sing)를 장기간, 즉 약 20분 (펩티드의 긴 작동 속도와 더 잘 상관이 있는 시간) 동안 인큐베이션함으로써 Kv1.3 상에서 시험하였다. 이들 조건 하에서 cgtx-544(Sing)는 정제되지 않은 cgtx-544의 6.9 nM과 비교 시 폴딩 및 정제 후에 약 900 pM의 IC50을 표시한다 (실시예 1 참조). 그 결과가 도 35에 도시되어 있다.
실시예 3 - 인간 및 래트 혈장에서의 cgtx -544 (서열식별번호: 25)의 안정성
1. 인간 및 래트 혈청 샘플에서의 생체외 안정성의 결정
그 목표는 실온 (RT) 및 37℃에서 상이한 인큐베이션 시간 후 포유류의 혈장에서의 cgtx-544 펩티드의 안정성을 시험하는 것이었다. 안정성은 RT 및 37℃에서 상이한 인큐베이션 시간 후 cgtx-544의 IC50 값으로서 정의되었다. 혈장은 건강한 래트 또는 인간으로부터의 신선한 혈액 샘플로부터 제조하였다. 헤파린을 신선한 혈액 샘플에 가하여 막힘(clogging)을 방지하였다. RT에서 2000 xg로 2분 동안 원심분리시킴으로써 혈장 제조를 수행하였다.
실험을 시작하기 전에 cgtx-544의 IC50을 규정하였는데 - 전기생리학적 검정은 (n=5 세포에 대하여) 46.1 nM ± 3.9 nM의 IC50 값을 산출하였다. 이들 실험에 사용된 cgtx-544 펩티드는 불완전하게 폴딩되었기 때문에, 정상치보다 더 높은 IC50이 결정되었다. 상기 제조된 인간 및 래트 혈장의 음성 대조군은 Sf21 곤충 세포에서 발현된 Kv1.3 채널에 대한 혈장 성분의 비특이적 결합을 전혀 나타내지 않았다.
혈장 내에서의 안정성과 활성을 조사하기 위해, 상기 펩티드를 20 μM의 최종 농도로 신선하게 제조된 인간 및 래트 혈장에 가하였다. 그 샘플을 2개의 분취액으로 분할하고 37℃ 및 실온 (RT, 20℃)에서 인큐베이션하였다. 전기생리학적 분석을 위해, 상기 샘플의 일련의 희석물을 제조하였다.
시점 0 h: 상기 펩티드를 혈장에 부가한 직후, 샘플을 분석하였고 이는 Kv1.3 채널에 대한 강력한 친화성을 표시하였다. 인간 혈장 내에서의 cgtx-544에 대한 IC50 값은 20.9 nM으로 개선되었고, 래트 혈장 내에서의 IC50 값은 15.0 nM으로 개선되었다 (데이터는 제시되지 않음).
시점 24 h: 그 다음 24시간 동안에는, 37℃ 및 RT에서 저장된 펩티드 프로브의 활성 상의 유의적 변화를 검출할 수 없었다.
시점 48 h: 48시간 후, 37℃에서 인큐베이션된 펩티드의 활성은 저하되었고, 인간 혈장 또는 래트 혈장에서 인큐베이션된 cgtx-544의 IC50 값은 t=0 h과 비교 시 2배 더 높았다 (각각 37.3 nM 및 57.8 nM). RT에서 저장된 cgtx-544의 활성은 변화되지 않은 채로 유지되었다.
시점 14일: 37℃에서 인큐베이션한 지 14일 후, 활성을 검출하지 못하였다. RT에서 인큐베이션된 cgtx-544 프로브는 변화되지 않은 활성을 표시하였다.
실시예 4 - 단리된 인간 T EM 세포 상에서의 cgtx -544 (서열식별번호: 25) 효능
1. 단리된 인간 T EM 에서 Kv1 .3 전류의 분석
곤충 세포주 스포도프테라 프루기페르다 (Sf21)를 재조합 이온 채널의 이종 발현을 위해 바큘로바이러스 감염 시스템과 조합하여 사용하였다. Sf21 세포는 고도로 특이적인 단백질 발현과 정확한 번역 후 변형을 부여하여, 생체내 이온 채널의 전기생리학적 파라미터의 제안된 비교 가능성을 수반한 기능적 채널을 생성시킨다. 따라서, Sf21 세포에서 발현된 칼륨 선택적 이온 채널 Kv1.3의 전기생리학적 특성과 TEM 세포에서 내생적으로 발현된 Kv1.3 채널의 전기생리학적 특성을 비교하는 것이 필요하였다.
특징적인 전압 의존성 Kv1.3 채널 활성화를 비교하기 위해, 20 mV 단계 (활성화 펄스 200 ms)에서 -60 mV에서 +60 mV까지의 전형적인 전압 프로토콜을 이용하였다. 세포를 -100 mV의 홀딩 전위에서 클램핑하였다. 도 4는 2개의 개별적 Sf21 및 TEM 세포의 전류 반응 (각각 도 4a 및 4b) 및 전압 의존성 Kv1.3 활성화에 대한 펄스 프로토콜 (도 4c)을 제시한 것이다.
도 5는 상응하는 정규화된 전압-전류-상관 관계를 제시한 것이다. Kv1.3은 홀딩 전위 (-100 mV)에서 -20 mV까지의 막의 탈분극에서 개방되기 시작하고, +60 mV에서 그의 최대 개방 상태에 도달한다. 심지어 Kv1.3의 발현이 Sf21 세포에서 훨씬 더 높긴 하지만, 그 특징적인 전압 의존성 활성화는 변화지 않은 채로 있다.
명백하게도 Kv1.3 활성으로부터 유래되는 최대 관찰 전류, 및 인가된 전압은 모든 Kv1.3 채널의 전체 전도도를 평가할 수 있게 해준다. 따라서, 단일 Kv1.3 채널의 공지된 전도도를 이용하여 채널의 수를 추출할 수 있다. 최대 K+ 외향 전류는 전류 추적의 처음 20% 동안 활성화되었지만 차단되지 않은 전류와 최대로 차단된 (완전 차단) 전류 간의 차이로서 정의된다. 감염 조건의 변동에 의해, 조사의 필요에 따라서 Sf21 세포에서의 Kv1.3의 발현 수준을 제어하는 것이 가능하다. 본 발명자들의 표준 조건 하에서 2 - 5 nA의 최대 전류, 33 - 50 nS의 전도도 및 세포당 2500개 - 3800개 채널 수를 평가할 수 있다.
Sf21 세포에서의 이종 발현 시스템은 시험관 내에서 약리학적으로 흥미로운 이온 채널을 전기생리학적으로 분석하는 데 적합한 방법을 표시한다. 이들 관찰 결과에 근거하여, Kv1.3 이온 채널을 폴딩하고 이를 Sf21 세포의 혈장 막 내로 삽입하는 것이 TEM 세포에서의 천연 Kv1.3 단백질과 거의 동등한 수준이라는 것을 추정할 수 있다.
이종 발현된 Kv1.3 채널이, 전기생리학적 파라미터를 평가함으로써 약물 표적화를 연구하기 위한 모델 시스템으로서 제공될 수 있다는 사실이 명백하게 입증될 수 있었다. 특이적 Kv1.3 차단은 펩티드 화합물 cgtx-544를 이용하여 수행할 수 있었다. 이러한 펩티드는 앞서 제시된 바와 같고 또한 단리된 인간 TEM 세포 상에서 시험된 바와 같이, Kv1.3 채널에 대한 고 친화성을 나타낸다 (도 6). 이들 실험에 사용된 cgtx-544가 불완전하게 폴딩되었고 정상치보다 더 높은 IC50을 나타낸다는 것에 주목해야 한다. 그럼에도 불구하고, 상기 화합물은 Kv1.3 형질감염된 Sf21 세포 상에서, 인간 TEM 세포 상에서와 동일한 값을 나타내었다 (도 6).
실시예 5 - 펩티드 cgtx -544 (서열식별번호: 25)를 이용한 항원 유도성 관절염의 요법
1. 실험 모델
1. AIA - 항원 유도성 관절염
래트에서의 질환 모델 항원 유도성 관절염 (AIA)은 인간에서의 류마티스 관절염의 많은 특징과 닮은 T 세포 의존성 자가면역 관절염을 나타낸다. 따라서, 이러한 시스템은 본원에 개시된 T 세포 억제 펩티드의 치료적 성공을 평가하기 위한 질환 모델로서 제공될 수 있다. 현행 요법 (예를 들어, 전신 세포증식억제제를 사용함)에 비해 상기 치료적 접근 방식이 갖는 한 가지 주요 이점은 질환의 발생과 인과 관계가 있는 면역 체계의 작은 서브세트만이 억제되는 반면, 예를 들어 타고난 면역 체계와 같은 면역 방어의 다른 중요한 구성 요소는 여전히 손상되지 않는다는 사실이다. 또한, 이러한 질환 모델은 cgtx-펩티드의 생체내 효능과 면역관용을 시험할 수 있게 해준다.
2. 관절염의 유도
전체 실험은 4주의 기간 내에 이루어진다. 사전-면역화는 불완전 프로인트 아주반트 (IFA) 중에서의 mBSA와 엠. 투베르쿨로시스 제제의 혼합물을 피하 주사함으로써, 제-21일 (실험 시작일) 및 제-14일에 이루어진다. 하나의 무릎 관절에서의 국소 염증 유도는 제0일에 우측 무릎에 항원 mBSA를 단일 관절내 주사함으로써 유도된다. 이러한 실험 설정에서는, 두 번째 (좌측) 처리되지 않은 무릎 관절이 개체 내의 대조군으로서 제공된다.
유도 후 처음 몇시간 동안에는 상기 처리된 무릎 관절에 심한 종창 반응이 발생하고, 통상적으로 유도 후 제1일 및 제2일에 최대 종창에 도달한다. 이러한 표현형은 추가 2 내지 3일 동안 안정적이고, 그 후에는 종창이 다시 경감된다.
이러한 계획으로 실험용 동물의 >95%에서 국부적인 재현성 관절염의 유도가 허용된다. 음성 대조군 실험에서는 동일한 부피 (mBSA 유도 용액에 대해서와 같음)의 0.9% NaCl를 대조군 동물의 무릎에 투여하였다 (도 7 및 8 참조).
2. 물질 및 방법
2.1 동물
체중 (BW)이 180-200 g인 대략 8주령의 암컷 루이스(Lewis) 래트 [장비에 (Janvier; 프랑스)]. 상기 동물을 통상적인 사육 조건하에 놓아두었다 - 마크롤론(Makrolon) 우리 유형 IV당 5마리 동물; 12시간 낮/밤 리듬으로 음식물과 물을 무제한으로 공급함; 22 +/- 2℃ 하의 실온; 55 +/- 5% 하의 공기 습도.
2.2. 면역화, 동물 면역화 & 국소 관절염의 유도를 위한 에멀젼의 생성
2.2.1. 면역화를 위한 에멀젼 및 면역화 과정
2.2.1.1. 물질: 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37 Ra (BD 231141)
불완전 프로인트 아주반트 [시그마(Sigma) F5506]
mBSA (시그마 A1009-1G)
0.9% NaCl [브라운(Braun)]
이소플루란 [애보트(Abbott)].
2.2.1.2. 사전-면역화 에멀젼:
용액 A: mBSA 스톡 용액 (50 mg/ml):
20 ml 수성 주사제를 무균 조건하에 1개의 바이알 mBSA (1 g)에 부가한다. 멸균성 용액을 4℃ 하에 수개월 동안 저장할 수 있다.
용액 B: 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 스톡 용액 (10 mg/ml):
10 ml (1개 바이알)의 불완전 프로인트 아주반트를, 100 mg 박테리아를 함유하는 엠. 투베르쿨로시스의 1개 바이알에 부가한다. 이 용액을 4℃ 하에 1개월 동안 저장할 수 있다.
혼합물의 제조:
양쪽 성분을 등 부피로 혼합하면, 에멀젼이 생성된다 (클린 벤치에서 무균 조건하에 혼합한다). 그 성분을 하기에 기재되는 바와 같이 15 ml 또는 50 ml 팔콘(Falcon) 튜브 내로 피펫팅한다:
1. 용액 A - mBSA 스톡 용액
2. 용액 B - 엠. 투베르쿨로시스 용액.
상기 성분들을 부가한 직후에, 튜브를 20초 동안 와동시킨다. 마지막 제조 단계에서, 진한 에멀젼이 형성될 때까지 초음파 처리기 (60%의 진폭으로 0.5 주기)를 이용하여 상기 용액을 유화시킨다.
2.2.1.3. 사전-면역화
최종 관절염 유도 전에 상기 동물을 2회 사전-면역화시켰다. 사전-면역화는 제-21일 및 제-14일에 이루어졌다. 이들 시점에 면역화 용액을 피하 주사하였다. 5% 이소플루란을 이용하여 마취 상태를 유도한 후, 2% 이소플루란으로 마취를 유지시켰다. 25 G 캐눌라를 이용함으로써 총 500 μl의 유화된 용액을 적용하였다. 125 μl의 사전 면역화 에멀젼을 꼬리 기전의 2개 측면 (우측 및 좌측) 뿐만 아니라 좌측 및 우측 견갑골 위의 2개 측면에 피하 주사하였다.
2.2.1.4. 국소 관절염의 유도
제0일에, 항원 (50 μl 0.9% NaCl 중의 500 μg mBSA)을 우측 무릎 관절에 관절내 투여함으로써 관절염을 유도하였다. 좌측 무릎은 건드리지 않은 채로 두어 개체 내의 대조군으로서 사용하였다. 상기 동물을 마취시키고 주사 부위를 소독하였다. 이러한 적용은 짧고 미세한 캐눌라 (30 G, 1/2)로 수행하여 조직 손상을 최소화하였다. 항원을 투여하고 캐눌라를 빼낸 후, 그 관절을 여러 번 천천히 구부리며 연장시켰다.
2.2.2. 무릎 관절의 종창 측정
무릎 관절의 시상(sagittal) 직경을 캘리퍼로 결정하였다. 실험용 동물을 단기간 동안 마취시키고 뒤쪽에 위치시켰다. 다리를 90도 각도로 조정하고, 무릎의 시상 직경 측정을 3회 수행하였다.
2.2.3. 혈액 채취
혈액 채취를 위해, 상기 동물을 간단하게 마취시키고, 꼬리를 소독한 다음, 꼬리 정맥을 캐눌라로 뚫고, 헤파린 코팅된 피펫을 이용하여 50 μl의 혈액을 채취한 다음, 이를 5 μl의 안정화제 (CPD) 및 1 μl 헤파린 (0.9% NaCl 중에서 1:4로 희석된 1.5 U/μl)과 혼합하였다.
2.2.3. 혈액학
쿨터(Coulter) 계수기를 이용하여 자동화 방식으로 백혈구 (WBC)를 계수하였다.
2.2.4. 체중의 측정
실험용 동물의 체중을 8:00과 9:00 AM 사이에 1일 1회 측정하였다.
2.2.5. 무릎 관절의 종창의 임상적 검사 및 측정
국소 관절염의 유도 후, 실험용 동물을 매일 검사하였다. 무릎 관절의 종창을 측정하였고 일반적인 건강 상태를 스코어링하였다.
2.3. 실험용 동물의 처리
펩티드 cgtx-544 (서열식별번호: 25)를 0.6 ml 부피의 0.9% NaCl 중에서 1 mg/kg 체중 (BW)으로 투여하면서 제-3일에 상기 동물의 처리를 시작하거나, 또는 또 다른 한편으론 대조군 동물에 대해서는, 동일한 부피의 0.9% NaCl (부형제)를 투여하면서 그 처리를 시작하였다. 상기 펩티드 또는 부형제는 각각, 마취시킨 동물의 꼬리 정맥에 i.v. 투여하였다. 이와 같이 처리된 동물은 처리 후 대략 1시간 동안 관찰하였다.
3. 결과
사전-면역화 기 동안, 실험용 동물을 집중적으로 모니터링하였고, 제-21일, 제-14일, 제-7일, 제0일 및 제7일에 혈액 샘플을 채취하여 상기 동물의 면역 상태를 모니터링하였다. 상응하는 분석 시점에 염증의 발생과 말초 혈액 내의 백혈구 (WBC, 백혈구)의 계수치 간에 매우 좋은 상관관계가 있었다.
최근에 면역화된 동물 (제-21일 및 제-14일)의 말초 혈액 내의 WBC의 수는 처리되지 않은 동물과 비교 시 현저하게 증가된다 (도 9 참조). WBC의 수는 제-14일과 제-7일 사이에 최대에 도달하고 그 후에는 떨어진다. WBC의 증가는 면역화에 의해 유도된 염증의 중증도와 상관이 있다.
국소 관절염의 유도 직후, WBC는 단기간 증가를 나타낸다 (도 9 참조). 그러나, 이러한 단기간 증가는 더 작은데, 이는 염증 반응이 국한되기 때문이다. 0.9% NaCl로 면역화된 대조군 동물은 WBC 계수치에 있어서 어떠한 차이도 나타내지 않았다.
사전-면역화된 동물에서는, mBSA-주사에 의한 국소 관절염의 유도 후 수 시간 만에 우측 무릎 관절의 중증 종창 반응이 발생한다 (도 8 참조). 이와는 반대로, 개체 내의 대조군 무릎으로서 제공되는, 처리되지 않은 좌측 무릎은 종창 반응의 어떠한 징후도 나타내지 않는다.
cgtx-544 펩티드로 처리시킨 동물을 처리되지 않은 (부형제) 대조군과 비교한 결과, cgtx-544 처리로 인해, 처리되지 않은 대조군 동물과 비교 시 무릎 관절 종창이 명백하게 감소되는 것으로 밝혀졌다 (도 10 참조). cgtx-544로 처리된 동물이 처리되지 않은 대조군 동물과 비교 시 무릎 관절 종창의 명백한 감소와 종창의 더 신속한 퇴행을 나타내는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 5a - RA의 AIA 래트 모델에서 cgtx -544 펩티드의 예방적 효능
1. 물질 및 방법
완전 프로인트 아주반트 중의 항원 mBSA 및 750 μg 열 불활성화 미코박테리움 (엠.) 투베르쿨로시스의 에멀젼을 이용하여 제-21일 및 제-14일에 2회 면역화시킨 후, 실시예 5에 기재된 바와 같이 제0일에 우측 무릎에 메틸화 BSA를 관절내 주사함으로써 AIA를 유도하였다. cgtx-544 펩티드 효능 연구를 위해, 제-3일에 시작하여 래트에게 0.1, 1 또는 5 mg/kg cgtx-544 펩티드 (저, 중간 및 고 용량 수준)의 정맥내 주사제 또는 비히클 (0.9% NaCl)을 10일 동안 (제-3일에서 제6일까지) 매일 투여하였다.
캘리퍼를 이용하여 무릎 관절 직경을 삼중으로 측정함으로써 관절염 중증도를 모니터링하였다. 값을 제-21일로 정규화하였다. 무릎 종창 값의 차이는 우측 (유도된) 무릎 직경에서 좌측 (비-유도된) 무릎 직경을 차감함으로써 계산하였다.
혈액학적 파라미터를 모니터링하기 위해, 혈액 샘플을 규칙적으로 취하였다. 혈액학적 파라미터를 유도 전 매주, 유도 당일 및 유도 후 10일 (제-21일, 제-14일, 제-7일, 제0일 및 제10일)에 모든 동물에게서 평가하였다. 처리되지 않은 동물 (제-21일)의 혈액학적 데이터는 문헌 (Waynforth & Flecknell, 1992)에 보고된 바와 거의 동등한 수준이었다. 특히 백혈구 (WBC), 호중구 과립구 및 림프구의 절대적 계수치를 분석하였고, 마지막 2개는 또한, 총 WBC의 백분율로 언급되었다. 비히클과 cgtx-544 펩티드 요법 군 둘 다로부터의 7마리 개체의 EDTA 백혈구를 시스멕스 XT-2000i로 측정하였다.
2. 결과
시험된 모든 용량 수준의 cgtx-544 (0.1, 1, 및 5 mg/kg BW)는 처리된 동물에게서 무릎 종창에 대한 명백하게 감소성이고, 용량 의존성이면서 통계상 유의적인 효과를 나타내었다 (도 18).
결과의 통계적 분석을 위해, 웰시(Welsh)의 2개 샘플 t-검정을 이용하였다. 다음에는, 시험된 모든 용량 수준의 cgtx-544 (0.1, 1, 및 5 mg/kg BW)의 통계적 분석이 제1일 및 제3일에 제시된다. 시험된 모든 용량 수준은 비히클 대조군과 비교 시 무릎 종창에 있어서 통계상 유의적인 감소를 나타내었다 (도 19).
요약하면, AIA 모델에서의 cgtx-544 펩티드 요법은 염증성 관절염 증상, 특히 무릎 종창에 대하여 강력한 효과를 나타냈는데, 최대 70% 감소를 나타냈다. 처리한지 7일 후, 상기 요법 군에서의 무릎 직경은 추가로 감소되어, 비-유도된 개체 내의 대조군 무릎과 거의 동등한 수준의 직경으로 되었다. 더욱이, cgtx-544 펩티드 처리된 개체의 WBC, 호중구 과립구 및 림프구 (데이터는 제시되지 않음)는 비히클 처리된 개체와 거의 동등한 수준의 절대적 및 상대적 세포 계수치를 나타내었다.
실시예 5B - RA의 AIA 래트 모델에서 cgtx -544의 치유적 효능
1. 물질 및 방법
완전 프로인트 아주반트 중의 항원 mBSA 및 750 μg 열 불활성화 미코박테리움 (엠.) 투베르쿨로시스의 에멀젼을 이용하여 제-21일 및 제-14일에 2회 면역화시킨 후, 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 제0일에 우측 무릎에 메틸화 BSA를 관절내 주사함으로써 AIA를 유도하였다. cgtx-544 펩티드 효능 연구를 위해, 관절염 유도 직후 제0일에 시작하거나 또는 제1일에 시작하여 래트에게 1 mg/kg cgtx-544 펩티드의 정맥내 주사제를 매일 투여하였다. 대조군 동물에게는 비히클 (0.9% NaCl)의 주사제를 매일 투여하였다.
캘리퍼를 이용하여 무릎 관절 직경을 삼중으로 측정함으로써 관절염 중증도를 모니터링하였다. 값을 제-21일로 정규화하였다. 무릎 종창 값의 차이는 우측 (유도된) 무릎 직경에서 좌측 (비-유도된) 무릎 직경을 차감함으로써 계산하였다.
2. 결과
cgtx-544(Mix) (1 mg/kg BW)를 이용하여 양쪽 시험 시점에서 처리를 시작한 결과, 처리된 동물에게서 무릎 종창에 대한 명백하게 감소성이면서 통계상 유의적인 효과가 나타났다 (도 20).
결과의 통계적 분석을 위해, 웰시의 2개 샘플 t-검정을 이용하였다. 다음에는, cgtx-544의 양쪽 처리 요법 (d0 및 d1)의 통계적 분석이 제1일, 제2일 및 제3일에 대하여 제시된다. 양쪽 처리 요법은 비히클 대조군과 비교 시 무릎 종창에 있어서 통계상 유의적인 감소를 나타내었다 (도 21).
시간 과정에 따른 백혈구 (WBC) 계수치가 도 22에 제시되어 있다. 시간 과정에 따른 호중구가 도 23에 제시되어 있다. 시간 과정에 따른 림프구가 도 24에 제시되어 있다.
cgtx-544(Mix) 처리는 무릎 관절 종창에 있어서 유의적 감소를 나타낸다. 처리된 동물에게서의 잔여 종창은 항체/항원 반응에 기인한 것으로 추정되었다. 따라서, 면역화된 동물 뿐만 아니라 나이브 동물을 대상으로 하여, mBSA 특이적 항체의 존재에 관하여 시험하였다. mBSA에 대항한 항체는, 관절염 유도 후 7일에 군 H 및 I의 모든 면역화된 동물에게서 검출될 수 있었다 (도 27). 나이브 동물 (실험군 F)은 mBSA에 대한 어떠한 반응성도 나타내지 않았다. cgtx-544 요법은 B-림프구 및 항체 형성을 억제하는 것으로 보이지 않는다. 부가적으로, cgtx-544 펩티드 요법하에 10일 후에 면역화된 동물은 cgtx-544(Mix) (L544-2a와 trx-태그의 융합 단백질, 데이터는 제시되지 않음)에 대한 반응성을 전혀 나타내지 않았다.
요약하면, AIA 모델에서의 cgtx-544 펩티드 요법은 염증성 관절염 증상, 특히 무릎 종창에 대하여 강력한 효과를 나타냈는데, 관절염 유도 직후 제0일에 요법을 시작한 경우에는 최대 40% 감소를 나타냈거나 또는 제1일에 요법을 시작한 경우에는 최대 58% 감소를 나타냈다. 처리한지 7일 후, 상기 요법 군에서의 무릎 직경은 추가로 감소되어, 비-유도된 개체 내의 대조군 무릎과 거의 동등한 수준의 직경으로 되었다. 더욱이, cgtx-544 펩티드 처리된 개체의 WBC, 호중구 과립구 및 림프구는 비히클 처리된 개체와 거의 동등한 수준의 절대적 및 상대적 세포 계수치를 나타내었다.
실시예 5C - RA의 AIA 래트 모델에서 cgtx -544(Mix)의 지속된 효능
앞서의 실험 (실시예 5A 및 5B 참조)은 cgtx-544가 상이한 치료 요법 - 치유적 및 예방적 요법 -을 매일 적용한 경우에 AIA 래트 모델에서 탁월한 효능을 갖는다는 사실을 입증해 주었다. 본 발명자들은 cgtx-544를 이용한 치료 간격이 얼마나 오랫동안 지속될 지에 관한 암시를 얻기 위해 cgtx-544의 활성이 AIA 모델에서 지속되는 기간을 명확히 하고자 하였다. 따라서, 매주 1회 적용하는 계획에 따른 치유적 치료 요법을 설정하였다.
1. 물질 및 방법
완전 프로인트 아주반트 중의 항원 mBSA 및 750 μg 열 불활성화 미코박테리움 (엠.) 투베르쿨로시스의 에멀젼을 이용하여 제-21일 및 제-14일에 2회 면역화시킨 후, 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 제0일에 우측 무릎에 메틸화 BSA를 관절내 주사함으로써 AIA를 유도하였다. cgtx-544 펩티드 효능 및 지속된 요법 효과 연구를 위해, 래트 (10마리 개체)에게 관절염 유도 후 제1일 (d1)에 1 mg/kg cgtx-544 펩티드를 단일 정맥내 주사하였다. 제4일 (d4)에는 cgtx-544 요법 군을 2개의 하위군으로 나누었는데, 각각 5마리 개체를 배정하였다. 제1 하위군에게는 cgtx-544를 두 번째 주사하여, 두 번째 주사가 종창의 추가 감소를 야기시킬 것인지에 관하여 평가하였다. 제2 하위군에게는 부가의 용량을 투여하지 않았다. 대조군 동물에게는 제1일에 비히클 (0.9% NaCl)을 단일 주사하였다.
캘리퍼를 이용하여 무릎 관절 직경을 삼중으로 측정함으로써 관절염 중증도를 모니터링하였다. 값을 제-21일로 정규화하였다. 무릎 종창 값의 차이는 우측 (유도된) 무릎 직경에서 좌측 (비-유도된) 무릎 직경을 차감함으로써 계산하였다.
2. 결과
cgtx-544 (1 mg/kg BW)로 단일 주사 (1 x d1)한 결과, 적용 후 24시간에 처리된 동물에게서 무릎 종창의 명백하고도 통계상 유의적인 감소가 나타났다 (도 25). 종창은 제4일에 두 번째 단일 주사 (1 x d1 및 1 x d4) 후에 유의적 값으로 다시 감소될 수 있었다. 무릎 종창은 첫 번째 주사 및 두 번째 주사 후에 동일한 수준을 유지하였고 증가되지 않았다.
결과의 통계적 분석을 위해, 웰시의 2개 샘플 t-검정을 이용하였다. 다음에는, cgtx-544의 양쪽 처리 요법 (1 x d1 또는 1 x d1 및 1 x d4)의 통계적 분석이 제2일 (군을 나누기 전) 및 제5일 (나눠진 군)에 대해 제시된다. 양쪽 처리 요법은 비히클 대조군과 비교 시 각 주사 후 24시간에 무릎 종창에 있어서 통계상 유의적인 감소를 나타냈다 (도 26).
요약하면, AIA 모델에서의 cgtx-544 펩티드 요법은 염증성 관절염 증상, 특히 무릎 종창에 대하여 강력하고도 지속적인 효과를 나타냈는데, 단일 주사 후 24시간에 종창 감소가 개시되었다. 단일 주사한지 3일 후에도, cgtx-544 펩티드는 지속적인 활성과 임상 효과를 명확하게 보여주었는데, 무릎 종창의 수준은 일정하게 유지되었다. 따라서, 상기 펩티드는 AIA 래트 모델에서 지속적인 치료 효과를 위해 매일 투여할 필요가 없다. 따라서, i.v. 투여의 경우에는 3-4일의 치료 간격 (또는 잠재적 s.c. 투여 경로의 경우에는 이보다 더 길다)을 달성하는 것이 가능할 수 있다.
실시예 6 - AIA 래트 모델에서 메토트렉세이트 (MTX) 요법과 cgtx -544 펩티드 (서열식별번호: 25) 요법의 비교
1. AIA 래트 모델에서 메토트렉세이트 (MTX) 요법과 cgtx -544 (서열식별번호: 25) 요법의 비교
질환의 형태와 중증도에 따라서, 메토트렉세이트 (MTX)를 이용한 요법은 그 용량과 요법 면에서 상이하다. 표준 요법과 거의 동등한 수준으로, 본 발명자들은 AIA 래트 모델에서 1 mg/kg 체중을 1 x 매주 s.c. 투여하는 고 용량 MTX 요법 (군 J, n=7) 및 100 μg/kg 체중을 1 x 매일 i.v. 투여하는 저 용량 MTX 요법 (군 L, n=7)을 검사하였다. 고 용량 MTX 요법은 실험 첫째 날 (제-21일)에 시작하였고, 추가 3회 투여하였다 (제-14일, 제-7일, 제0일). 저 용량 MTX 요법은 관절염 유도 3일 전에 (제-3일) 시작하였고, 관절염 유도 후에 추가 7일 지속되었다. 그 결과를 cgtx-544 요법 군 I (1 mg/kg 체중 cgtx-544, 군 L과 동일한 요법) 및 비히클 대조군 H (0.9% NaCl을 유도 당일, 즉 제0일에 시작하여 1 x 매일 i.v. 투여함)와 비교하였다. 캘리퍼를 이용하여 무릎 관절 직경을 삼중으로 측정함으로써 관절염 중증도를 모니터링하였다. 면역 상태를 모니터링하기 위해 EDTA 백혈구 샘플을 규칙적으로 취하였다.
1.1 MTX 요법은 cgtx-544 요법과 비교 시 무릎 종창을 덜한 정도로 감소시킨다
첫째, 고 용량 (J) 및 저 용량 (L) MTX 요법 군의 무릎 파라미터를 비히클 대조군 (H)과 비교하여, 용량 및 요법에 따라서 가능한 효능 차이를 제시한다. 둘째, 동일한 요법 (매일 i.v. 적용)을 이용한 3개 군, 즉 저 용량 (L) MTX 요법 군, cgtx-544 요법 군 (I) 및 비히클 대조군 (H)을 비교한다. 종창의 절대적 증가 차이는 우측 (유도된) 무릎 직경에서 좌측 (비-유도된) 무릎 직경을 차감함으로써 계산하였다. MTX 고 용량 요법 군과 저 용량 요법 군 둘 다의 실험 개시시 계산된 차이는 제로에 근접하였는데 (각각 0.01 ± 0.06 mm 및 0.0 ± 0.03 mm), 이는 양쪽 무릎이 크기 면에서 거의 동등한 수준이었기 때문이다. 관절염 유도 후 1일에, 그 차이는 각각 3.17 ± 1.26 mm 및 3.45 ± 0.87 mm까지 상승된다 (도 11).
cgtx-544 요법 군과는 반대로, 종창의 감소는 3.79 ± 1.10 mm의 절대적 차이를 갖는 비히클 대조군과 비교 시 매우 신속하지 않다 (도 12).
0과 1 사이의 크기 조정을 이용하여 값을 정규화시키는 경우에는, 종창의 상대적 증가를 실험 개시시 (제-21일) 0으로 설정하고, 종창의 상대적 증가 차이를 앞서와 같이 계산하였다. MTX 고 용량 요법 군과 저 용량 요법 군의 상대적 차이는 각각 0.39 ± 0.16 및 0.43 ± 0.11이 되었다 (도 13).
비교하면, 비히클 대조군과 cgtx-544 요법 군은 각각 0.46 ± 0.14 및 0.18 ± 0.05가 되었다 (도 14). 요약하기 위해, 비히클 대조군 대비하여 본 발명자들은 MTX 고 용량 요법 래트에서 평균 15%의 무릎 종창 감소를 관찰하였고 MTX 저 용량 요법 래트에서 평균 7%의 무릎 종창 감소를 관찰하였는데, 이는 관절염 유도 후 24시간에 cgtx-544-요법 래트에서의 60% 감소와 비교되었다.
1.2 증식성 세포에 대한 MTX의 세포증식억제 효과
모든 개체의 건강 상태를 스크리닝하기 위해, 완전 헤모그램(haemogram)을 다시 사용하였다. MTX 고 용량 요법 군과 저 용량 요법 군 둘 다로부터의 7마리 개체의 EDTA 백혈구를, 유도 전 매주, 유도 당일 및 유도 후 4일 및 7일 (제-21일, 제-14일, 제-7일, 제0일, 제4일 및 제7일; i.v. 적용을 시작한 경우에는 MTX 저 용량 요법 군을 제-3일에 부가적으로 투여하였다)에 시스멕스 XT-2000i.V로 측정하였다. 처리되지 않은 동물 (제-21일)의 혈액학적 데이터는 상기 문헌에 제공된 데이터와 거의 동등한 수준이다.
1.2.1 백혈구
실험을 시작할 때 (제-21일), MTX 고 용량 요법 군 및 저 용량 요법 군의 백혈구 계수치는 각각 9.41 ± 1.42 x 103/μl 및 11.66 ± 2.81 x 103/μl이 되었다. 면역 체계의 염증성 반응으로 인해, WBC 계수치는 제1 및 제2 면역화 후에 각각 20.79 ± 5.96 x 103/μl 및 24.01 ± 3.81 x 103/μl까지 상승하였다 (제-7일). 값은 비히클 대조군 및 cgtx-544 요법 군과 거의 동등한 수준이다. 7일 이내에, WBC 계수치는 약간 감소하였다. 관절염 유도 후 4일에, MTX 고 용량 요법 군의 WBC 계수치는 다시 증가하였는데, 이는 상기 유도와 관계된 급성 염증 과정에 기인하는 것으로 추정된다. 이러한 효과가 cgtx-544 요법 군 및 비히클 대조군에서도 존재하는지는 말할 수 없는데, 이는 이들 2개 군에 대해서는 상기 날짜에 EDTA 백혈구를 분석하지 않았기 때문이다. 또한, MTX 저 용량 요법 군에 대해서는, WBC 계수치가 적당한 비교로서 제공될 수 없는데, 이는 MTX의 세포독성 효과가 관절염 유도 후 4일에 혈액 조성에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 관절염을 유도한지 추가 7일이 지난 후, WBC 계수치는 MTX 고 용량 요법 군과 저 용량 요법 군 둘 다에서 각각 14.68 ± 2.15 x 103/μl 및 6.63 ± 1.37 x 103/μl로 추가로 감소되었으므로 (제7일) (도 15), 이는 MTX 저 용량 요법의 세포증식억제 효과를 나타낸다. WBC 계수치는 실험 개시시와 비교 시 거의 50%만큼 감소되었다. 이와는 반대로, MTX 고 용량 요법 군의 WBC 계수치는 cgtx-544 요법 군 및 비히클 대조군의 것과 거의 동등한 수준이다.
1.2.2 호중구 과립구
실험을 시작할 때 (제-21일), MTX 고 용량 요법 군 및 저 용량 요법 군의 절대적 호중구 과립구 계수치는 각각 1.55 ± 0.52 x 103/μl 및 1.93 ± 0.6 x 103/μl로 되었다 (도 16a) [각각 총 WBC 계수치의 16.39 ± 4.85% 상대적 호중구 및 총 WBC 계수치의 16.64 ± 4.07% 상대적 호중구에 등가임 (도 16b)]. WBC 계수치로서, 호중구 과립구 계수치는 또한, 제1 및 제2 면역화 후에 각각 7.54 ± 3.19 x 103/μl 및 10.77 ± 2.7 x 103/μl까지 상승하였다 (제-7일, 각각 WBC의 35.46 ± 7.08% 및 WBC의 44.33 ± 5.4%에 등가임). 7일 이내에, 호중구 과립구 계수치는 감소하였고, 유도 후 7일에 MTX 고 용량 요법 군의 계수치는 실험 시작시의 계수치와 거의 동등한 수준이었다 (1.94 ± 1.1 x 103/μl; WBC의 12.63 ± 6.1%에 등가임). 이러한 효과는 또한, cgtx-544 요법 군 및 비히클 대조군에서도 관찰되었다. MTX 저 용량 요법 군은 훨씬 더 높은 감소를 나타냈는데, 0.33 ± 0.36 x 103/μl 호중구 과립구로 되었다 (제7일; WBC의 4.41 ± 4.63%에 등가임).
1.2.3 림프구
실험을 시작할 때 (제-21일), MTX 고 용량 요법 군 및 저 용량 요법 군의 절대적 림프구 계수치는 각각 7.39 ± 1.05 x 103/μl 및 9.21 ± 2.4 x 103/μl이 되었다 (도 17a) [각각 WBC의 78.77 ± 4.76% 및 WBC의 78.97 ± 3.94%에 등가임 (도 17b)]. MTX 고 용량 요법 군과 저 용량 요법 군 둘 다에서의 림프구 계수치는 WBC 및 호중구 과립구 계수치와 상이하게, 제1 및 제2 면역화 후에 상당히 상승하지 못하였는데, 각각 11.68 ± 2.8 x 103/μl 및 11.83 ± 1.35 x 103/μl로 계수되었다 (제-7일). 이는 각각 WBC의 57.01 ± 6.45% 및 WBC의 49.83 ± 5.45%에 등가이고 (제-7일), 감소된 백분율을 나타내는데, 이는 총 WBC 계수치가 강하게 증가하였기 때문이다. 7일 이내에, WBC의 림프구 백분율은 다시 증가하였고, 유도 후 7일에 MTX 고 용량 요법 군에서는, 실험 시작시의 백분율과 거의 동등한 수준이었는데 (WBC의 78.16 ± 7.20%; 제7일), 이는 훨씬 더 높은 (WBC의 93.13 ± 4.66%; 제7일) MTX 저 용량 요법 군에서와 다르다. 실험 시작시와 비교 시, MTX 고 용량 요법 군의 절대적 계수치는 증가하였고 MTX 저 용량 요법 군의 절대적 계수치는 감소하였다: 각각 11.38 ± 1.15 x 103/μl 및 6.14 ± 1.11 x 103/μl (제7일). MTX 저 용량 요법 군의 절대적 림프구 계수치가 실험 시작시와 비교 시 관절염 유도 후 7일에 감소되긴 하지만, 이는 여전히 모든 백혈구의 약 93%를 나타낸다. 이로써, 백혈구의 다른 하위집단이 림프구 집단보다 세포독성 효과에 의해 더 영향을 받는것으로 가정할 수 있다.
MTX로 처리하면, 디히드로폴레이트 환원효소가 억제되고 증식성 세포에 대한 세포증식억제 효과가 초래된다. 전신 면역억제를 나타내지 않았던 cgtx-544 요법하의 개체와는 달리, MTX-처리된 개체는 비히클 대조군과 비교 시 헤모그램에 있어서 상이한 효과를 나타내었다. 관절염 유도 후 7일에, 저 용량 처리된 개체는 WBC 계수치, 호중구 과립구 계수치 및 림프구 계수치가 감소되었다. 더욱이, 이로써, 모든 백혈구 백분율에 있어서 상이한 조성이 야기되었다. 더욱이, 본 발명자들은 관절염 유도 후 24시간에 cgtx-544 요법 래트에서의 60%와 비교 시, 양쪽 MTX 요법에서는 무릎 종창이 훨씬 더 작게 감소되었다는 것을 (7% 및 15%) 관찰하였다.
MTX 효능 결과의 통계적 분석을 위해, 웰시의 2개 샘플 t-검정을 이용하였다. 다음에는, 시험된 모든 MTX 용량 수준 (0.1 mg/kg BW i.v. 및 1 mg/kg BW s.c.)의 통계적 분석이 제1일 및 제3일에 대해 제시된다 (도 28).
요약하면, MTX로 처리하면, 디히드로폴레이트 환원효소가 억제되고 증식성 세포에 대한 세포증식억제 효과가 초래된다. cgtx-544 펩티드 요법하의 개체와는 달리, MTX-처리된 개체는 비히클 대조군과 비교 시 헤모그램에 있어서 상이한 효과를 나타내었다. 관절염 유도 후 7일에, 저 용량 처리된 개체는 WBC 계수치, 호중구 과립구 계수치 및 림프구 계수치가 감소되었다. 부가적으로, 이로써, 모든 백혈구 백분율에 있어서 상이한 조성이 야기되었다. 더욱이, 본 발명자들은 관절염 유도 후 24시간에 cgtx-544 펩티드 요법 래트에서의 최대 70%와 비교 시, 양쪽 MTX 요법에서는 무릎 종창이 훨씬 더 작게 감소되었다는 것을 (7% 및 15%) 관찰하였다.
실시예 7 - cgtx -544의 추가 성상 확인
cgtx-544 펩티드는 변형을 수반하지 않은 38개의 자연 아미노산으로 이루어지고, 대략 4220 Da의 분자량을 갖는다. 이는 전갈 펩티드의 α-KTx6 서브패밀리(subfamily)와 특정의 기능적 도메인 유사성을 공유한다. cgtx-544는 4개의 디술피드 브릿지에 의해 통제되고, 그 3D 구조는 α-나선/β-시트 입체 형태를 포함한다.
cgtx -544의 제조
도 29는 cgtx-544 펩티드의 제조 단계의 도식적 고찰을 제공한다. 펩티드 합성은 F-moc 전략을 이용하여 불용성 폴리스티롤 수지 상에서 수행한다. 고체 상 부착된 펩티드의 유리 N-말단 아민을 단일 N-보호된 아미노산 단위와 커플링시킨다. 이어서, 이러한 단위를 탈보호시키면 (F-moc 기를 피페리딘에 의해 염기성 pH 하에 절단시킨다), 새로운 N-말단 아민이 생겨났는데, 이에 추가의 아미노산을 부착시킬 수 있다. Tert-부틸옥시카르보닐 (Boc) 기가 영구적 측쇄 보호 기로서 제공되고, 이는 펩티드 합성을 끝낸 후에, TFA (트리플루오로아세트산)로 처리함으로써 절단시킨다.
펩티드 합성을 완료한 후, 이러한 펩티드를 탈보호시키고 폴리스티롤 수지로부터 절단하였다. 이러한 시점에, 미가공 펩티드 생성물은 약 50%의 순도를 표시하고, 이어서 분석적 UPLC 및 LC-MS를 수행하였다. 후속 단계에서는, 미가공 펩티드를 정제용 HPLC에 의해 정제하면, 순도가 ≥ 90%인 선형 펩티드 생성물이 생성된다.
cgtx -544 펩티드의 폴딩
이러한 펩티드 용액는 산화 (디술피드 결합의 형성)에 의해 폴딩된다. 폴딩 방법은 대기 산소의 존재하에 pH 8.3의 인산염 완충제 중에서의 결합 형성에 근거한다. 이러한 프로토콜에 따라서 폴딩된 cgtx-544를 HPLC 분석한 결과, 상기 펩티드가 폴딩된 변이체와 부분적으로 폴딩된 변이체의 혼합물로서 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 중간체 폴딩 생성물이 cgtx-544(Mix)로서 지칭된다. 상이한 단리된 UPLC-피트의 물질을 이용하여 생성된 전기생리학적 데이터에 근거하여, 폴딩 혼합물 중에서의 하나의 피크 (체류 시간 12.77분)는 천연 활성 펩티드와 상관이 있는 반면, 다른 모든 피크는 전기생리학적 활성과 상관이 없었다고 결론지었다 (도 30). 따라서, 폴딩 반응 후, 활성 펩티드 (체류 시간 12.77분)를, 폴딩된 펩티드와 부분적으로 폴딩된 펩티드의 cgtx-544 혼합물로부터 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이러한 정제 단계 후, 활성 펩티드 - cgtx-544(Sing)로서 지칭됨 -는 통상적으로, 95% 초과의 순도를 갖는 것으로 추정되었다. 정제된 cgtx-544(Sing) 펩티드는 RT 및 4℃ 하에 수 주 동안 0.9% NaCl 용액에서 고도로 가용성이고 안정적이다.
공정 개발로 인해, 상기 정제된 펩티드 cgtx-544(Sing)는 소규모 포맷으로만 생성되었다. 따라서, 물질은 제한되었고, 이는 Kv1.3, Kv1.1, Kv1.2 및 Kv1.5에 대한 cgtx-544(Sing)의 IC50 값을 확인하고자 의도한 실험에 사용하였다 (실시예 8 참조). cgtx-544의 정제되지 않은 폴딩 혼합물 [cgtx-544(Mix)]은 용어 cgtx-544 (sing)에 의해 달리 표시되지 않는 한 본원에 기재된 다른 모든 실험에 사용하였다 (실시예 1 내지 6). 이러한 혼합물 중의 활성 물질의 함량은 15%인 것으로 계산되었다.
요약하면, cgtx-544 펩티드는 생화학적 분석에 중요한 하기 생화학적 특성을 나타낸다:
● cgtx-544는 6개의 리신과 2개의 아르기닌 아미노산을 함유하는 고도로 염기성인 펩티드이고, 저 농도 (< 100 ng/ml)에서 유리 바이알의 표면에 부착될 수 있다.
● 8개의 시스테인 아미노산을 함유하는데, 이는 4개의 디술피드 브릿지에 의해 연결되어 있다.
● 등전점: 9.29.
● 디술피드 브릿지가 결합된 경우의 MW: 4212 Da; 환원된 형태에서의 MW: 4220.2 Da.
● 4개의 디술피드 브릿지가 존재하기 때문에, cgtx-544의 구조는 치밀하다.
실시예 8 - 전기생리학적 분석에 근거한 cgtx -544 (sing)의 이온 채널 선택성의 추가 성상 확인
1. 물질 및 방법
이온 채널은 실시예 1, 2, 및 4에 기재된 바와 같이 바큘로바이러스 (Kv1.1-, Kv1.3- 및 Kv1.5-구축물) 감염된 Sf21 세포 또는 안정적으로 형질감염된 CHO 세포 (Kv1.2)를 통하여 발현되었다. 전기생리학적 분석을 자동화 패치 클램프 장치 "패치라이너" (나니온 테크놀로지; 독일 뮌헨) 상에서 수행하였다. 이러한 패치라이너는 평면 패치 클램프 방법에 근거하여, 유리 피펫 대신 보로실리케이트 유리 칩 (NPC-16)이다. 상기 패치라이너는 4개의 세포를 동시에 기록할 수 있다. 모든 채널 기록이 전체 세포 방식으로 만들어졌다. 데이터 기록은 패치마스터 소프트웨어 [HEKA 일렉트로닉스 (독일 람브레히트/팔츠)]를 이용하여 수행하였다. 실험 결과의 가시화는 IGOR 소프트웨어 (웨이브메트릭스, 미국)를 이용하여 실현하였다. 평균 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로서 제시된다.
시험 화합물을 농축된 스톡 용액 (주로 1.5 μg/μl)으로서 사용하였다. 스톡 용액을 완충제에서 희석시켜, 필요한 최종 농도로 만들었다.
2. 결과
2.1 IC 50 - 표적 채널 Kv1 .3의 분석
화학적 분석 후 (실시예 7 참조), 펩티드를 대기 산소로 산화시킴으로써 폴딩하고, 이와 같이 정확하게 폴딩된 (생물학상 활성) 펩티드 분획을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이러한 정제된 cgtx-544 펩티드는 단일 피크에 대하여 cgtx-544(Sing)로 지명되었다.
cgtx-544(Sing)를 전기생리학적으로 분석하면, 6.9 nM의 탁월한 IC50 값이 초래되었다 (도 31).
2.2 Kv1.1, Kv1 .2 및 Kv1 .5 상에서 cgtx -544(Sing)의 전기생리학적 분석
Kv1.1, Kv1.2 및 Kv1.5 상에서 cgtx-544(Sing)를 전기생리학적으로 분석한 결과, cgtx-544가 고도로 선택적인 것으로 입증되었다. Kv1.1, Kv1.2 및 Kv1.5 상에서 cgtx-544(Sing)를 전기생리학적으로 성상 확인한 결과가 도 32에 요약되어 있다.
실시예 9 - cgtx -544(Sing)의 프로테아제 저항성
실시예 3에 기재된 실험에 덧붙여, cgtx-544 펩티드의 안정성을 시험관내 조건하에 혈액 혈청 샘플에서 시험하였다. 따라서, 인간 혈액 혈청 내에서의 cgtx-544(Sing)의 안정성은 공지된 양의 cgtx-544(Sing)를 인간 혈액 혈청에 부가하고 연속해서 37℃ 하에 인큐베이션함으로써 결정하였다. ctx-544(Sing)의 차단 활성은 57일의 기간에 걸쳐 Kv1.3 채널 상에서 측정하였다. cgtx-544(Sing)는 인간 혈액 혈청에서 극도로 안정적이다. 그의 활성은 적어도 16시간 동안 일정하게 유지되고, 57일 후에 더 이상의 펩티드 차단 효과가 검출될 수 없을 때까지 서서히 붕괴된다. 이는 cgtx-544가 혈액 프로테아제의 작용에 대해 매우 저항성이란 사실을 입증해준다 (도 33).
혈청의 부재하에서 수행된 측정과 대비하여 차단 효력 상의 감소는 전혀 관찰되지 않았는데, IC50은 7 nM 범위를 유지하였다. 펩티드를 수반하지 않은 혈청 대조군 샘플은 Kv1.3의 비특이적 차단을 전혀 나타내지 않았다. 따라서, 관찰된 차단 효과는 오로지 cgtx-544(Sing)의 효과에 기인한다고 결론지었다. 57일에 걸쳐 인큐베이션된 용액에서 측정된 cgtx-544(Sing)의 농도를 나타내긴 하였지만, cgtx-544(Sing)의 50% 활성은 37℃ 하의 인간 혈청에서 5일 동안 보존되었다.
요약하면, 37℃ 하의 인간 혈청에서 cgtx-544의 영속성은 매우 높다. cgtx-544는 혈청 구성 성분과 결합하지 않고 - 이와 결합한다고 하더라도 - 극히 낮은 친화도로만 결합한다), 인간 혈청에 존재하는 프로테아제에 의한 분해에 대해 극도로 저항성이다.
실시예 10 - cgtx -544 (Sing)의 생체내 반감기
본 연구의 목적은 래트에서 cgtx-544(Sing)의 생체내 반감기를 평가하기 위한 생물학적 검정을 이행하는 것이었다. 앞서의 실험 (실시예 3) 결과, cgtx-544는 혈청 내로 스파이킹되고 37℃ 하에 인큐베이션될 때, 신속하게 분해되지 않는 것으로 제시된 바 있다.
1. 물질 및 방법
래트에게 cgtx-544(Sing) (750 μg/kg BW)를 i.v. 주사하였다. 혈액을 시점 0, 1, 10 및 60분에 채취하였다. 연속해서, 혈액 샘플로부터 혈청을 제조하였다. 이들 샘플 중의 cgtx-544 함량은, CHO 세포에서 발현된 Kv1.3 채널에 대한 차단 효과를 측정함으로써 전기생리학적으로 분석하였다. 펩티드를 수반하지 않은 혈청 대조군 샘플 (0분)은 Kv1.3의 비특이적 차단을 전혀 나타내지 않았고, 1분 샘플의 cgtx-544(Sing) 활성이 100%로서 간주되었다. 세 번째 시점 (60분)에서 수집된 샘플은 원래의 차단 활성의 10%를 나타내었다. 상기 래트에서 결합되지 않은 cgtx-544(Sing)의 양을 연구하기 위해, 상기 언급된 시점에서 순환성 혈액 내에 존재하는 cgtx-544(Sing)의 양을, 보정 곡선을 통하여 계산하였다. 이러한 보정 곡선은 공지된 양의 cgtx-544(Sing)를 혈액 혈청에 부가하고 연속해서 Kv1.3 채널 상에서 전기생리학적으로 측정함으로써 수득하였다. 이들 스파이크된 샘플에 의한 Kv1.3 전류의 차단은 혈청의 부재하에 cgtx-544(Sing)로 수득된 것과 유사하였다 (데이터는 제시되지 않음).
2. 결과
처리된 래트의 혈액 내에서의 cgtx-544(Sing)의 붕괴는 전형적인 붕괴 곡선에 따른데, 이로써 대략 t1/2=26분의 반감기가 산출되고 (도 34), 순환성 혈액 내의 cgtx-544(Sing)의 근사 농도는 62 nM이다. 이러한 농도는 Kv1.3 채널의 완전한 차단을 달성하기에 충분하다. 상기 반감기는 다른 펩티드 채널 차단제에 대하여 관찰된 범위 내에 있다 - ShK 독소의 변이체는 20 내지 50분의 반감기를 표시한다.
요약하면, 래트에서 i.v. 적용 후 cgtx-544의 생체내 반감기는 경쟁인자 펩티드 ShK의 범위 내에 있다. 그 생체내 반감기는 대략 26분이다. cgtx-544의 작은 크기와 치밀한 구조 때문에, 상기 펩티드는 아마도 신장 여과를 통하여 혈액으로부터 제거되는 것으로 추정된다. 인간에서의 cgtx-544의 반감기는 래트에서 보다 더 길다고 추정하는 것이 합리적인데, 이는 래트가 인간보다 훨씬 더 신속한 대사률을 갖고 있기 때문이다. 생체내 반감기는 약물 효과의 지속 기간에 상응하지 않는데, 이는 상기 펩티드가 이온 채널과 치밀하게 결합되고 이를 장시간 동안 차단하기 때문이다.
실시예 11 - 임상 데이터
현재까지 임상 연구는 수행되지 않았다.
최초의 인체 대상 연구
1상 연구는 건강한 대상체에게서 무작위로 분류되고, 이중 맹검의 위약-제어된 단일 센터 시험일 수 있다.
본 연구의 첫 번째 부분은 보다 저 용량 군에 대하여 4명 대상체 (3 + 1)의 코호트 및 보다 고 용량 군에 대하여 8명 대상체 (2 + 6)의 코호트에서 단일-용량, 용량-단계적 상승 연구일 수 있다. 출발 용량은 "건강한 성인 지원자의 치료를 위한 초기 임상 시험에서 최대 안전한 출발 용량을 예측하는" 업계의 FDA 지침에 명시된 바와 같은 독성 연구에서 NOAEL로부터 추정될 것이다.
1a상의 두 번째 부분은 다중 용량 연구로서 설계될 수 있다. 8명 대상체 (6 + 2)의 한 코호트는 7일 연속 매일 적용을 위해 MTD 아래의 하나의 용량 수준에 노출될 것이다.
이러한 표준 1a상 연구의 일차 목표는 건강한 대상체에게서 cgtx-544의 안전성, 내약성 및 약동학을 평가하는 것일 수 있다.
개념 증명 연구
이러한 2a상 연구는 중간 수준 내지 중중의 플라크 건선을 동반한 환자에게서 무작위로 분류된, 이중 맹검, 위약-제어된, 다중 센터, 개념 증명 및 용량 조사 연구일 수 있다.
계획된 2a상 개념 증명 연구는 80명의 성인 환자 (20 + 60)와 3가지 용량 수준을 포함할 것이다. 각 용량 수준은 12주의 기간 동안 20명의 환자에게서 시험될 것이다.
일차 종말점: 제12주에 PASI 75를 달성하는 대상체 (기준선 PASI로부터 75% 이상의 개선을 나타내는 환자)의 비율.
이차 종말점: 부작용, 생체 신호, 실험실 파라미터, 신체 검사 및 EEG를 평가하여 cgtx-544의 안전성을 12주 이하 동안 평가함.
첫 번째 치료 후 12주 동안 상이한 시점에서 cgtx-544의 약동학. 제12주에 "청정한" 또는 "거의 청정한" IGA 스코어를 달성하는 대상체의 비율.
제12주에 PASI 50을 달성하는 대상체 (기준선 PASI로부터 50% 이상의 개선을 나타내는 환자)의 비율.
제12주에 PASI 90을 달성하는 대상체 (기준선 PASI로부터 90% 이상의 개선을 나타내는 환자)의 비율.
혈관염에 대하여 유사한 연구를 수행할 수 있다. 종말점은 그에 따라서 평가될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> conoGenetix biosciences GmbH <120> Kv1.3 potassium channel antagonists <130> C 9297 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Val" /replace="Ile" /replace="Leu" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Arg" /replace="Lys" /replace="Thr" /replace="Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="Thr" /replace="Lys" /replace="Ser" /replace="Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace="Gly" /replace="Ser" /replace="Asn" /replace="Ile" /replace="Lys" /replace="Gln" /replace="Ala" /replace="Val" /replace="Leu" /replace="Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="Ser" /replace="Thr" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Arg" /replace="Pro" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> /replace="Gln" /replace="Asn" /replace="Glu" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace="Tyr" 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Pro 1 5 10 15 Cys Lys Ala Gln Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Asn Arg Cys 35 <210> 26 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound cgtx 547 <400> 26 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Asn Arg Cys 35 <210> 27 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Ile" /replace="Phe" /replace="Val" /replace="Ala" /replace="Leu" /replace="Trp" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Lys" /replace="Thr" /replace="Tyr" /replace="Arg" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace="Arg" /replace="Lys" /replace="Ser" /replace="Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace="Thr" /replace="Ser" /replace="Asn" /replace="Ile" /replace="Lys" /replace="Gln" /replace="Ala" /replace="Val" /replace="Leu" /replace="Tyr" 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VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace="Thr" /replace="Ser" /replace="Asn" /replace="Ile" <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> /replace="Pro" <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> /replace="Arg" /replace="Lys" <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> /replace="Asp" /replace="Asn" /replace="Glu" <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace="Ala" /replace="Tyr" /replace="Leu" /replace="Trp" <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> /replace="Asp" /replace="Arg" /replace="Pro" /replace="Glu" /replace="Ser" <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> /replace="His" /replace="Val" <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> /replace="Arg" /replace="Gln" <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> /replace="Lys" /replace="Ala" /replace="Arg" <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> /replace="Glu" /replace="Gln" /replace="Leu" <220> <221> VARIANT <222> (26)..(26) <223> /replace="Asn" <220> <221> VARIANT <222> (27)..(27) <223> /replace="Ala" <220> <221> VARIANT <222> (35)..(35) <223> /replace="Arg" <220> <221> VARIANT <222> (37)..(37) <223> /replace="Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (38)..(38) <223> /replace="Gly" <400> 28 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Asn Arg Cys 35 <210> 29 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound cgtx 543 <400> 29 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Asn Arg Cys 35 <210> 30 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound cgtx 546 <400> 30 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Asn Arg Cys 35 <210> 31 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound cgtx 548 <400> 31 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Asn Arg Cys 35 <210> 32 <211> 34 <212> PRT <213> Heterometrus spinifer <400> 32 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys

Claims (9)

  1. 서열식별번호: 25의 아미노산 서열로 이루어진 화합물.
  2. 제1항에 언급된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열.
  3. 류마티스 관절염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 제1항에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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