KR20120115495A - 위장 장애의 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 위장 장애의 치료에 유용한 펩티드를 제공한다. 또한 본 발명은 위장 장애를 치료하는 조성물 및 방법과, 그를 성취하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이들 제약 조성물은 경구 투여 형태를 포함한다.

Description

위장 장애의 치료{TREATMENTS FOR GASTROINTESTINAL DISORDERS}

본 발명은 상부 위장 장애의 치료를 위한 펩티드, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

우선권 주장

본 출원은 2009년 11월 09일에 출원된 미국 출원 일련 번호 61/259,264를 우선권 주장한다. 전술한 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 명칭이 "IW077US_ST25.txt" (6.64 킬로바이트)인 서열 목록을 전체적으로 참고로 포함하는데, 서열 목록은 2010년 11월 3일에 생성되어 본 출원과 함께 전자 출원되었다.

기능성 소화불량 (functional dyspepsia, FD) 및 위마비 (gastroparesis, GP)는 팽만감, 명치 (상복부) 통증 및/또는 작열감, 오심, 구토 및 조기 만복감을 포함하는 증상을 총체적으로 특징으로 하는 상부 위장 (gastrointestinal, GI) 장애이다. FD 및 GP 환자에 있어서의 치료 옵션은 기존의 요법에 있어서의 효능의 결여 및 불량한 안전성 프로파일로 인하여 극도로 제한된다. 소화불량은 증상을 설명할 가능성이 있는 임의의 기질성, 전신성 또는 대사성 질환의 부재 하에 위십이지장 영역에서 발원되는 것으로 여겨지는 한 가지 이상의 소화불량 증상 (명치 통증, 작열감, 성가신 식후 포만감, 및 조기 만복감)의 존재로서 정의된다 (문헌 [Drossman, D.A., ed., Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders, 3rd Ed., McLean, VA: Degnon Associates, Inc., 2006] 참조). FD는 상부 내시경 검사를 포함하는 표준 의학 연구 후 구조적 설명을 갖지 않는 소화불량을 나타낸다. FD에 연루될 수도 있는 병리생리학적 기작은 특히 위 배출 지연, 위 적응 이상, 위 팽만에 대한 과민성, 지질 또는 산에 대한 십이지장 민감성의 변경, 및 비정상적 십이지장공장 운동을 포함한다. 연장된 십이지장 산 노출이 일부 FD 및 GP 환자에서 또한 보이며, 이러한 노출은 위 배출을 느려지게 하여 FD 또는 GP-유사 증상을 야기할 수 있다. 소화불량은 위장과 전문의가 보는 사례 중 약 30%를 차지하는 일반적인 증후군이며, 이때 FD는 모든 그러한 소화불량 사례의 약 60%를 나타낸다.

GP는 기계적 폐쇄의 부재 하에서의 위 배출 지연을 특징으로 하는 비정상적인 위운동을 나타낸다. GP는 특발성일 수 있거나, 또는 제I형 또는 제II형 진성당뇨병, 바이러스 감염, 경피증, 신경계 장애, 예를 들어 파킨슨병, 대사 장애, 예컨대 갑상선 기능저하, 수술후 장폐색증 및 마약성 진통제, 삼환계 항우울제 및 칼슘 채널 차단제를 포함하는 특정 의약을 포함하는 다양한 상태에 의해 야기될 수 있다. 또한 흉부 및 복부에의 방사선 및 화학요법 약물을 포함하는 암의 치료가 일시적으로 또는 영구적으로 위마비를 야기할 수 있다. 가장 일반적인 증상으로는 오심, 구토, 팽만감, 명치 통증, 체중 감소 및 조기 만복감이 있다. 위마비는 빈번한 입원, 삶의 질의 저하, 및 장애 증가와, 심각한 경우, 사망 증가에 이르게 될 수 있는 만성 병태이다. 증상을 나타내는 중증 GP는 당뇨병을 앓고 있는 개체에 있어서 일반적이며, 이는 미국에서만 100만명의 총 환자 집단에 있어서 당뇨병 환자 중 5-10%에게서 발생한다.

FD 및 GP와, 기타 상부 위장 장애의 통상적인 치료 옵션은 많은 환자에 있어서 효능이 제한적이었다. 따라서, FD, GP 및 기타 위장 장애를 치료하는 새로운 화합물 및 방법에 대한 필요성이 남아있다.

본 발명은 상부 위장 장애 및 병태 (예를 들어, 소화불량, GP, 수술 후 위장폐색, 기능성 식도 장애, 기능성 위십이지장 장애, 위식도 역류 질환 (gastroesophageal reflux disease, GERD), 또는 십이지장 또는 위 궤양)를 치료하기 위한 펩티드, 조성물 및 관련 방법을 특징으로 하며, 이외에도 다른 병태 및 장애가 본원에 기술되어 있다. 본 조성물은 상부 GI에서는 구아닐레이트 시클라제 C (GC-C)를 활성화시키지만 하부 GI에서는 GC-C를 훨씬 더 약하게 활성화시키거나 전혀 활성화시키지 않는 펩티드를 특징으로 한다. 임의의 특정 이론에 의해 구애됨이 없이, 본 발명의 펩티드는 상부 GI 증상을 감소시키기에 충분한 투여 빈도 및 용량 수준에서 하부 GI관에서 현저한 효과 (예를 들어, 설사를 비롯하여 배변 습관의 용량 제한적 변화)를 야기하지 않고서 (전적으로 또는 부분적으로 상부 GI 운동성을 증가시키고/시키거나 명치 통증/불쾌감 및 팽만감을 감소시킴으로써) 상부 GI 장애의 증상을 완화시킬 수 있기 때문에 유용하다. 또한 본 발명의 펩티드는 위장 통증 및 불쾌감을 개선시키는 데 유용하다.

본 발명의 일 측면은 하기의 아미노산 서열 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Cys₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Xaa₁₄ Gly₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇

상기 서열에서,

Xaa₁은 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, D-Glu, γ-카르복실화 Glu, α-아미노수베르산 (Asu), α-아미노아디프산 (Aad), α-아미노피멜산 (Apm)이거나, 부재하며;

Xaa₂는 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하고;

Xaa₃은 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하며;

Xaa₄는 Cys 또는 D-Cys이고;

Xaa₆은 P-Ser, P-Thr, P-호모-Ser, 4-히드록시발린 포스페이트, P-호모-Thr, P-Cys 또는 P-Tyr이며;

Xaa₇은 Tyr, Leu, Phe 또는 Ile이고;

Xaa₈은 Cys 또는 D-Cys이며;

Xaa₁₄는 Thr, Ala 또는 Phe이고;

Xaa₁₆은 Cys 또는 D-Cys이며;

Xaa₁₇은 Tyr, D-Tyr이거나, 부재하고;

여기서,

Xaa₁이 존재할 경우, Xaa₁은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나;

Xaa₁이 부재하고 Xaa₂가 존재한다면, Xaa₂는 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나; 또는

Xaa₁ 및 Xaa₂ 둘 모두가 부재한다면, Xaa₃은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산으로 변형될 수 있다.

본 발명의 제2 측면은 본 발명의 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 제3 측면은 본 발명에 따른 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 위장 장애의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세사항은 첨부된 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 나타내어져 있다.

도 1A는 본 발명의 예시적인 펩티드와 알칼리성 포스파타제의 반응을 도시한다.
도 1B는 포스파타제에 의한 대조 p-니트로페닐포스페이트의 가수분해를 도시한다.
도 2는 펩티드 2 및 펩티드 4가 십이지장액 분비를 촉진함을 보여주는 일례를 제시한다.
도 3은 마우스 장액 (공장액)에서의 펩티드 2, 데포스포-펩티드 2, 및 펩티드 3의 안정성에 대한 연구 결과를 제시하며;
도 4는 STZ-유도된 당뇨병 래트에서 액체 위 배출에 대한 펩티드 2 및 3의 영향에 대한 연구 결과를 제시한다.
이들 도면은 예로서 제공되며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

구아닐레이트 시클라제 C (GC-C)는 위 및 장에서 상피 세포의 정단 표면에 위치하는 막관통 수용체이다. 상기 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 막관통 영역 및 C-말단 구아닐릴 시클라제 도메인을 갖는다. 리간드가 GC-C의 세포외 도메인에 결합할 경우, 세포내 촉매 도메인은 GTP로부터의 cGMP의 생성을 촉매한다. 생체내에서, 이러한 세포내 cGMP의 증가는 클로라이드 및 비카르보네이트의 장관강 내로의 분비를 증가시키고, 내강 pH를 증가시키고, 내강 나트륨 흡수를 감소시키고, 액 분비를 증가시키고, 장관 통과를 가속화하는 사건의 캐스케이드를 개시한다. 상피로부터 점막 및 내강 내로 두 방향으로 분비되는 cGMP는 또한 구심성 C 섬유 발화를 약해지게 하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 내장통에 대한 GC-C 효능제의 관찰된 진통 효과에 대한 잠재적인 기작을 제안한다.

경구 투여되는 것으로서 현재 변비를 동반한 과민성 장 증후군 (irritable bowel syndrome with constipation, IBS-c) 및 만성 변비 (chronic constipation, CC)의 치료용으로 임상 시험 중에 있는 펩티드 GC-C 효능제인 리나클로티드는 (1) 내장통 감소, (2) 팽만감 감소, 및 (3) GI 통과 증가를 비롯하여 하부 GI 생리 기능에 대하여 다수의 효과를 가지며, 이는 배변 빈도를 증가시키고 변의 굳기를 개선시킬 수 있다. 경구 투여되는 리나클로티드는 내강 표면에서 GC-C를 활성화시킴으로써 국소적으로 작용하며, 치료적 용량 수준으로 경구 투여한 후 전신적으로 관찰되는 검출가능한 수준의 리나클로티드는 없다. 따라서, 리나클로티드 및 관련 펩티드를 이용하여 행해진 전임상 연구뿐만 아니라 리나클로티드의 임상 실험 결과도 GC-C 펩티드 효능제가 치료적으로 사용될 수 있음을 제안한다.

하부의 GI관에서 GC-C의 자극에서 생길 수 있는 배변 습관에 대한 현저한 효과를 촉진하지 않고서 상부 GI 장애 및 증상 (예를 들어, 기능성 소화불량 (FD) 및 위마비 (GP))을 완화시키는 데 사용될 수 있는 GC-C 효능제가 있는 것이 유용하다. 그러한 GC-C 효능제는 배변 습관 변화 및 설사를 포함하는 하부 GI 유해 사례에 대한 잠재성을 감소시킨다. 본원에 기재된 GC-C 효능제는 상부 GI관 (예를 들어, 위 및 십이지장)에서 더욱 큰 활성을 가지며, 하부 GI관에서 더욱 적은 활성을 갖는다. 그러한 효능제는 (1) cGMP 생성 및/또는 기타 기작을 통한 내장통의 감소, (2) 팽만감의 감소, (3) 위 배출 및/또는 상부 소장 통과 (예를 들어, 십이지장 통과)의 증가, 및 (4) 비카르보네이트 분비 촉진에 의한 십이지장에서의 산의 중화에 의해 상부 GI 장애 (예를 들어, FD 및 GP)를 앓고 있는 환자에 있어서 이득이 있다. 중요하게는, 이들 효능제는 상부 GI에 표적화된 그의 활성에 의해, 배변 습관에 대한 현저한 효과 (예를 들어, 이는 하부의 GI관에서 GC-C의 자극에서 생길 수 있음)를 야기하지 않고 FD 및 GP의 증상을 완화시킬 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 위장 장애, 특히 상부 GI 장애, 예컨대 FD 및 GP의 치료에 유용한 신규한 GC-C 펩티드 효능제를 제공한다. GC-C 펩티드 효능제는 식도, 위 및 상부 소장 (십이지장)을 비롯한 상부 GI에서 활성을 갖지만 이것이 나머지의 소장 및 대장을 횡단할 때에는 활성이 덜하도록 디자인된다. 본 발명의 펩티드는 위장 통증 및 불쾌감의 개선에 또한 유용하다. GC-C 효능제 펩티드는 포스포아미노산, 예를 들어 포스포세린을 함유하여 다른 GC-C 효능제 펩티드에서 발견되는 보존된 글루타메이트 또는 아스파르테이트를 대체한다. 포스포세린과 같은 포스포아미노산의 포스페이트 -OPO₃ ^{2 -}는 글루타메이트 또는 아스파르테이트의 COO^-에 대한 생체모방체 (biomimetic)로서 작용할 수 있어서 포스포아미노산-함유 펩티드는 GC-C에 결합하여 그럴 활성화시킬 수 있다. 포스포아미노산-함유 펩티드는 장 알칼리성 포스파타제에 의해 탈인산화될 수 있는데, 이는 상기 펩티드의 효능제 활성 및 GC-C 결합을 크게 감소시킨다. 장 알칼리성 포스파타제는 GI관 전체에 걸쳐 발견되며, 소장을 비롯하여 알칼리성 내강 환경에서 가장 큰 활성을 갖는다. 포스포아미노산-함유 펩티드는 산성 위 환경 및 상부 GI관을 비롯하여 상부 GI관에서 GC-C를 활성화시켜 액 및 비카르보네이트 분비를 촉진할 수 있다. 본 펩티드는 상부 GI에서 액 및 비카르보네이트 분비 증가를 촉진하기 때문에, 장관강은 더욱 알칼리성으로 되고 그에 따라 알칼리성 포스파타제 활성이 활성화된다. 따라서, 장을 통한 본 펩티드의 이동뿐만 아니라 GC-C에 대한 본 펩티드의 작용을 통해서도 펩티드의 포스포아미노산은 탈인산화 아미노산으로 전환되고 그에 의해 이것이 상부 GI로부터 하부 GI로 통과될 때 GC-C 효능제로서의 그의 활성이 감소된다.

본원에서 사용될 때, 아미노산 또는 그의 3문자 약어 앞의 "P-"라는 용어는 포스포아미노산을 나타낸다. 예를 들어, "P-Ser", "P-Thr", "P-Tyr", "P-Cys", "P-호모-Cys", "P-호모-Ser" 및 "P-호모-Thr"이라는 용어는 각각 포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신, 포스포시스테인, 포스포호모시스테인, 포스포호모세린 및 포스포호모트레오닌을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 포스포아미노산은 인산 및 아미노산의 에스테르 또는 티오에스테르를 나타내며, 예를 들어 알콜 또는 티올 관능기 상의 수소는 -P(O)(OH)₂에 의해 대체된다. 예를 들어, P-Ser은 구조식

을 가지며, P-Thr은 구조식

을 가지며, P-Tyr은 구조식

을 가지며, P-Cys은 구조식

을 갖는다.

일 측면에서, 본 발명은 하기의 아미노산 서열 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Cys₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Xaa₁₄ Gly₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇

상기 서열에서,

Xaa₁은 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, D-Glu, γ-카르복실화 Glu, α-아미노수베르산 (Asu), α-아미노아디프산 (Aad), α-아미노피멜산 (Apm)이거나, 부재하며;

Xaa₂는 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하고;

Xaa₃은 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하며;

Xaa₄는 Cys 또는 D-Cys이고;

Xaa₆은 P-Ser, P-Thr, P-호모-Ser, 4-히드록시발린 포스페이트, P-호모-Thr, P-Cys 또는 P-Tyr이며;

Xaa₇은 Tyr, Leu, Phe 또는 Ile이고;

Xaa₈은 Cys 또는 D-Cys이며;

Xaa₁₄는 Thr, Ala 또는 Phe이고;

Xaa₁₆은 Cys 또는 D-Cys이며;

Xaa₁₇은 Tyr, D-Tyr이거나, 부재하고;

여기서,

Xaa₁이 존재할 경우, Xaa₁은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나;

Xaa₁이 부재하고 Xaa₂가 존재한다면, Xaa₂는 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나; 또는

Xaa₁ 및 Xaa₂ 둘 모두가 부재한다면, Xaa₃은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있다.

일부 실시양태에서, Xaa₂ 및 Xaa₃ 둘 모두가 부재한다. 다른 실시양태에서, Xaa₂는 Asp 또는 Glu이며 Xaa₃은 부재한다. 또 다른 실시양태에서, Xaa₂는 Asp 또는 Glu이며 Xaa₃은 Asp 또는 Glu이다.

일부 실시양태에서, Xaa₇은 Tyr 또는 Leu이다.

일부 실시양태에서, Xaa₁₄는 Thr이다.

일부 실시양태에서, Xaa₁₇은 Tyr이거나 부재한다.

일부 실시양태에서, Xaa₁은 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu 또는 D-Glu이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₁은 Asp, D-Asp, Glu 또는 D-Glu이다.

일부 실시양태에서, Xaa₆은 P-Ser 또는 P-Thr이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₆은 P-Ser이다.

일부 실시양태에서, Xaa₁, Xaa₂ 및 Xaa₃은 부재하며 Xaa₄는 D-Cys 또는 Cys이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₇은 Tyr 또는 Leu이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₁₄는 Thr이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₁₇은 Tyr이거나 부재한다. 추가의 실시양태에서, Xaa₆은 P-Ser이다.

일부 실시양태에서, Xaa₄, Xaa₈ 또는 Xaa₁₆ 중 적어도 하나는 Cys이다. 일부 실시양태에서, Xaa₄, Xaa₈ 또는 Xaa₁₆ 중 적어도 둘은 Cys이다. 일부 실시양태에서, Xaa₄, Xaa₈ 및 Xaa₁₆ 모두가 Cys이다. 일부 실시양태에서, Xaa₄, Xaa₈ 또는 Xaa₁₆ 중 적어도 하나는 D-Cys이다. 일부 실시양태에서, Xaa₄, Xaa₈ 또는 Xaa₁₆ 중 적어도 둘은 D-Cys이다. 일부 실시양태에서, Xaa₄, Xaa₈ 및 Xaa₁₆ 모두는 D-Cys이다.

일부 실시양태에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다.

Cys₄ Cys₅ P-Ser₆ Xaa₇ Cys₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Thr₁₄ Gly₁₅ Cys₁₆ Xaa₁₇

상기 서열에서, Xaa₇은 Tyr 또는 Leu이다.

일부 실시양태에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다.

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; 또는

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

일부 실시양태에서, 50, 40, 30 또는 20개 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다. 추가의 실시양태에서, 펩티드는 19, 18, 17, 16, 15 또는 14개 이하의 아미노산을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 아미노산 서열 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Cys₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Xaa₁₄ Gly₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇

상기 서열에서,

Xaa₁은 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, D-Glu, γ-카르복실화 Glu, α-아미노수베르산 (Asu), α-아미노아디프산 (Aad), α-아미노피멜산 (Apm)이거나, 부재하며;

Xaa₂는 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하고;

Xaa₃은 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하며;

Xaa₄는 Cys 또는 D-Cys이고;

Xaa₆은 P-Ser, P-Thr, P-호모-Ser, 4-히드록시발린 포스페이트, P-호모-Thr, P-Cys 또는 P-Tyr이며;

Xaa₇은 Tyr, Leu, Phe 또는 Ile이고;

Xaa₈은 Cys 또는 D-Cys이며;

Xaa₁₄는 Thr, Ala 또는 Phe이고;

Xaa₁₆은 Cys 또는 D-Cys이며;

Xaa₁₇은 Tyr, D-Tyr이거나, 부재하고;

여기서,

Xaa₁이 존재할 경우, Xaa₁은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나;

Xaa₁이 부재하고 Xaa₂가 존재한다면, Xaa₂는 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나; 또는

Xaa₁ 및 Xaa₂ 둘 모두가 부재한다면, Xaa₃은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있다.

일부 실시양태에서, Xaa₂ 및 Xaa₃ 둘 모두가 부재한다. 다른 실시양태에서, Xaa₂는 Asp 또는 Glu이며 Xaa₃은 부재한다. 또 다른 실시양태에서, Xaa₂는 Asp 또는 Glu이며 Xaa₃은 Asp 또는 Glu이다.

일부 실시양태에서, Xaa₇은 Tyr 또는 Leu이다.

일부 실시양태에서, Xaa₁₄는 Thr이다.

일부 실시양태에서, Xaa₁₇은 Tyr이거나 부재한다.

일부 실시양태에서, Xaa₁은 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu 또는 D-Glu이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₁은 Asp, D-Asp, Glu 또는 D-Glu이다.

일부 실시양태에서, Xaa₆은 P-Ser 또는 P-Thr이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₆은 P-Ser이다.

일부 실시양태에서, Xaa₁, Xaa₂ 및 Xaa₃은 부재하며 Xaa₄는 D-Cys 또는 Cys이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₇은 Tyr 또는 Leu이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₁₄는 Thr이다. 추가의 실시양태에서, Xaa₁₇은 Tyr이거나 부재한다. 추가의 실시양태에서, Xaa₆은 P-Ser이다.

일부 실시양태에서, 하기의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다.

Cys₄ Cys₅ P-Ser₆ Xaa₇ Cys₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Thr₁₄ Gly₁₅ Cys₁₆ Xaa₁₇

상기 서열에서, Xaa₇은 Tyr 또는 Leu이다.

일부 실시양태에서, 하기의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다.

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; 또는

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

일부 예에서, 펩티드는 단리된 것이다. 다른 것에서, 펩티드는 정제된 것이다.

일부 실시양태에서, Xaa₆은 인산화될 수 있는 임의의 아미노산이다.

일부 실시양태에서, 펩티드의 제약상 허용되는 염이 제공된다. 일부 예에서, 제약상 허용되는 염은 클로라이드 염이다.

변이 펩티드

일부 상황에서, 장 GC-C 수용체에 결합하여 그를 활성화시키지만 비변이 형태의 펩티드보다 활성이 더 작거나 활성이 더 큰 변이 펩티드로 환자를 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 감소된 활성은 수용체에 대한 친화성의 감소 또는 일단 결합되면 수용체를 활성화시키는 능력의 감소 또는 펩티드의 안정성의 감소에서 생길 수 있다. 증가된 활성은 수용체에 대한 친화성의 증가 또는 일단 결합되면 수용체를 활성화시키는 능력의 증가 또는 펩티드의 안정성의 증가에서 생길 수 있다.

일부의 펩티드에서, 정상적으로 디술피드 결합을 형성하는 Cys 잔기들의 하나 또는 둘 모두의 쌍의 하나 또는 둘 모두의 구성원은 호모시스테인, 페니실라민, 3-메르캅토프롤린 (문헌 [Kolodziej et al. 1996 Int J Pept Protein Res 48:274]); β,β-디메틸시스테인 (문헌 [Hunt et al. 1993 Int J Pept Protein Res 42:249]) 또는 디아미노프로피온산 (문헌 [Smith et al. 1978 J Med Chem 21:117])에 의해 대체되어 정상적인 디술피드 결합 위치에서 대안적인 내부 가교결합을 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 디술피드 결합은 탄화수소 가교결합에 의해 대체될 수 있다 (문헌 [Schafmeister et al. 2000 J Am Chem Soc 122:5891], [Patgiri et al. 2008 Acc Chem Res 41:1289], [Henchey et al. 2008 Curr Opin Chem Biol 12:692]).

펩티드의 생성

일 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 또는 전구체 펩티드는 제한 없이 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli) 또는 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)), 곤충 세포 시스템 (예를 들어, 드로소필라(Drosophila) Sf9 세포 시스템), 효모 세포 시스템 (예를 들어, 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae), 에스. 사카로미세스 (S. saccharomyces)) 또는 사상 진균 발현 시스템, 또는 동물 세포 발현 시스템 (예를 들어, 포유동물 세포 발현 시스템)을 포함하는 임의의 공지된 단백질 발현 시스템에서 재조합적으로 생성될 수 있다. 또한 본 발명의 펩티드 또는 전구체 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다.

펩티드 또는 변이 펩티드가 재조합적으로, 예를 들어 이. 콜라이에 의해 생성될 경우, 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 세포로부터 성숙 펩티드의 분비를 가능케 하는 리더 서열을 또한 코딩할 수 있다. 따라서, 펩티드를 코딩하는 서열은 예를 들어 천연 박테리아 ST 펩티드의 프리 (pre) 서열 및 프로 (pro) 서열을 포함할 수 있다. 분비형 성숙 펩티드는 배양 배지로부터 정제될 수 있다.

본원에 기재된 펩티드를 코딩하는 서열은 박테리아 세포에서 핵산 분자를 전달 및 유지할 수 있는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 상기 DNA 분자는 자율 복제 벡터 내로 삽입될 수 있다 (적합한 벡터는 예를 들어 pGEM3Z 및 pcDNA3과 그의 유도체를 포함함). 벡터 핵산은 박테리아 또는 박테리오파지 DNA, 예컨대 박테리오파지 람다 또는 M13 및 그의 유도체일 수 있다. 본원에 기재된 핵산을 함유하는 벡터의 구축에 이어 숙주 세포, 예컨대 박테리아를 형질전환시킬 수 있다. 적합한 박테리아 숙주는 이. 콜라이, 비. 서브틸리스, 슈도모나스 (Pseudomonas) 및 살모넬라 (Salmonella)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 당해 유전자 구축물은 핵산 분자를 코딩하는 것에 더하여, 발현을 허용하는 요소, 예컨대 프로모터 및 조절 서열을 또한 포함한다. 발현 벡터는 전사 개시를 제어하는 전사 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 (operator), 및 리프레서 (repressor) 서열을 함유할 수 있다. 다양한 전사 제어 서열이 당업자에게 익히 공지되어 있다. 발현 벡터는 번역 조절 서열 (예를 들어, 비번역 5' 서열, 비번역 3' 서열, 또는 내부 리보솜 침입 부위 (internal ribosome entry site))을 또한 포함할 수 있다. 벡터는 자율 복제가 가능할 수 있거나 또는 이것은 펩티드 생성 동안 안정성을 보장하기 위하여 숙주 DNA 내로 통합될 수 있다.

또한 본원에 기재된 펩티드를 포함하는 단백질 코딩 서열은 정제를 돕기 위하여 펩티드 친화성 태그, 예를 들어 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질, 단백질 A, FLAG 태그, 헥사-히스티딘, myc 태그 또는 인플루엔자 HA 태그를 코딩하는 핵산에 융합될 수 있다. 친화성 태그 또는 리포터 융합은 관심있는 펩티드의 리딩 프레임을 친화성 태그를 코딩하는 유전자의 리딩 프레임에 연결시켜서 번역 융합물이 생성되게 한다. 융합 유전자의 발현에 의해 관심있는 펩티드 및 친화성 태그 둘 모두를 포함하는 단일 펩티드가 번역된다. 친화성 태그가 이용되는 일부의 예에서, 프로테아제 인식 부위를 코딩하는 DNA 서열은 친화성 태그 및 관심있는 펩티드의 리딩 프레임들 사이에서 융합될 것이다.

당업자에게 익히 공지된 것으로, 박테리아 이외의 단백질 발현 시스템에서 본원에 기재된 펩티드 및 변이체의 미성숙 및 성숙 형태의 생성에 적합한 방법 및 유전자 구축물이 생물 시스템에서 펩티드를 생성하는 데 또한 사용될 수 있다.

재조합적으로 생성되는 펩티드는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 인산화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 재조합적으로 생성되고, 그가 발현된 세포로부터 단리되고, 그 후 단백질 키나제, 예를 들어 세린/트레오닌 키나제 또는 티로신 키나제를 사용하여 인산화된다. 다수의 키나제가 당업계에 공지되어 있으며, 이 목적을 위하여 사용될 수 있다. 당업자라면 상이한 키나제들이 상이한 기질 특이성을 가짐을 인식할 것이며, 펩티드의 서열을 기반으로 하여 사용할 키나제를 선택할 것이다. 다른 실시양태에서, 펩티드는 펩티드를 인산화할 세린/트레오닌 키나제 또는 티로신 키나제를 또한 발현하는 세포에서 재조합적으로 생성된다. 다른 실시양태에서, 펩티드는 포스포아미노산의 혼입에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다. 비천연 및/또는 임의적 아미노산의 혼입을 허용하기 위하여 안티코돈, 아미노산 부착 부위 및/또는 억셉터 스템 (accepter stem)을 변형시키는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, tRNA를 변형시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Biochem. Biophys. Res. Comm. (2008) 372: 480-485]; [Chem. Biol. (2009) 16:323-36]; [Nat. Methods (2007) 4:239-44]; [Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2006) 7:775-82]; [Methods (2005) 36:227-238]; [Methods (2005) 36:270-278]; [Annu. Rev. Biochem. (2004) 73:147-176]; [Nuc. Acids Res. (2004) 32:6200-6211]; [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100:6353-6357]; [Royal Soc. Chem. (2004) 33:422-430]).

일부 실시양태에서, 펩티드는 화학적으로 생성될 수 있다. 펩티드는 전통적인 BOC 또는 FMOC 보호를 이용하여 용액 및 고체상 합성법을 포함하는 다수의 상이한 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 연속 아미노산 커플링을 이용하여 2-클로로트리틸클로라이드 또는 왕 (Wang) 수지 상에서 합성될 수 있다. 하기 보호기가 사용될 수 있다: 플루오레닐메틸옥시카르보닐 또는 tert-부틸옥시카르보닐 (알파-아미노 기, N-말단); 트리틸 또는 tert-부틸 (Cy의 티올 기); tert-부틸 (글루탐산의 γ-카르복실 및 트레오닌의 히드록실 기 - 존재할 경우); 트리틸 (아스파라긴 측쇄의 β-아미드 작용체 및 티로신의 페놀 기 - 존재할 경우); 트리틸 또는 tert-부틸디메틸실릴 (세린의 히드록시기 - 존재할 경우) 및 tert-부틸옥시카르보닐 (후속적인 측쇄 변형 이전의 N-말단). 커플링은 3급 아민의 존재하에 DIC 및 HOBt를 이용하여 행해질 수 있으며, 펩티드는 탈보호되고 고체 지지체로부터 절단될 수 있으며 이는 칵테일 K (트리플루오로아세트산 81%, 페놀 5%, 티오아니솔 5%, 1,2-에탄디티올 2.5%, 물 3%, 디메틸술피드 2%, 아이오딘화암모늄 1.5% (w/w))를 이용한다. 트리플루오로아세트산 및 다른 휘발성 물질의 제거 후, 펩티드를 유기 용매를 이용하여 침전시킬 수 있다. Cys 잔기들 사이의 디술피드 결합을 디메틸 술폭시드 (문헌 [Tam et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6657-62])를 사용하여 또는 공기 산화 방법을 이용하여 형성시킬 수 있다. 생성된 펩티드는 역상 크로마토그래피에 의해 정제되고 동결건조될 수 있다.

포스포아미노산, 예를 들어, 포스포세린이 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 펩티드 내로 도입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [G.K.Toth et al. (2007)], [Current Organic Chemistry 11: 409-426] 참조). 일부 실시양태에서, 보호된 포스포아미노산 유사체, 예를 들어, 포스포세린 아미노산 유사체가 고체상 상에서의 펩티드 어셈블리의 일부로서, 예를 들어 Fmoc-Ser[PO(OBzl)OH]-OH (문헌 [T. Wakamiya et al. (1997), Bioorganic and Medicinal Chemistry 5: 135-145, 1997])으로서 또는 Fmoc-Ser[PO(O아릴/알킬)₂]-OH (문헌 [G.K.Toth et al. (2007) Current Organic Chemistry, 11: 409-426])로서 도입될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 보호된 아미노산 유사체, 예를 들어 보호된 세린 아미노산 유사체가 고체상 상에서의 펩티드 어셈블리의 일부로서 도입될 수 있다 (예를 들어, 히드록실 측쇄에 있어서 트리틸 보호를 이용한 Fmoc-보호된 세린). 펩티드 사슬의 완전한 어셈블리 후 Ser[Trt] 또는 Ser[SiMe₂ tBu]는 선택적으로 탈보호될 수 있으며 포스페이트 기가 포스포르아미다이트/산화 방법을 이용하여 도입될 수 있다 (문헌 [G. Shapiro et al. (1994) Tetrahedron Letters 35: 869-872]; [P. Hormozdiari et al. (1996) Tetrahedron Letters, 37: 8227-8230]). 다른 실시양태에서, 화학적으로 제조된 펩티드는 상기에 기재된 바와 같이 세린/트레오닌 키나제 또는 티로신 키나제를 이용하여 인산화될 수 있다.

펩티드는 유리 염기의 형태로 또는 그의 제약상 허용되는 염으로서 제조, 단리 또는 사용될 수 있다. 염의 예는 제한 없이 펩티드의 아세테이트, 클로라이드, 술페이트 및 포스페이트 염을 포함한다.

펩티드 및 GC -C 수용체 효능제의 조성물

또 다른 측면에서, 단독의 또는 조합된 펩티드들이 임의의 제약상 허용되는 담체 또는 매질과 배합될 수 있는 조성물이 제공된다. 펩티드는 환자에게 투여될 때 부작용, 알레르기 반응 또는 다르게는 원하지 않는 반응을 생성하지 않는 물질과 배합될 수 있다. 사용되는 담체 또는 매질은 용매, 분산제, 코팅물, 흡수 촉진제, 조절 방출제 및 하나 이상의 불활성 부형제 (이는 전분, 폴리올, 과립화제, 미세결정질 셀룰로스 (예를 들어, 셀피어 (celphere), 셀피어 비즈 (Celphere beads)^®, 희석제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 포함할 수 있음) 등을 포함할 수 있다. 요망될 경우, 개시된 조성물의 정제 투여형은 표준 수성 또는 비수성 기법에 의해 코팅될 수 있다.

제약상 허용되는 담체 및 제약상 허용되는 불활성 담체 및 전술한 추가의 성분으로서 사용하기 위한 부형제의 예는 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 항미생물제 및 코팅제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "결합제"라는 용어는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 임의의 제약상 허용되는 결합제를 나타낸다. 제약상 허용되는 결합제의 예는 제한 없이 전분 (예를 들어, 옥수수 전분, 감자 전분 및 예비젤라틴화 전분 (예를 들어, 컬러콘, 엘티디. (Colorcon, Ltd.)가 판매하는 스타치 (STARCH) 1500^® 및 스타치 1500 LM^®) 및 기타 전분), 말토덱스트린, 젤라틴, 천연 및 합성 고무, 예컨대 아라비아 고무, 분말형 트래거캔스, 구아 고무, 셀룰로스 및 그의 유도체 (예를 들어, 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시에틸 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (히프로멜로스), 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스 칼슘, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 분말형 셀룰로스, 초미세 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 (예를 들어, 아비셀(AVICEL)^TM, 예컨대 아비셀-PH-101^TM, -103^TM 및 -105^TM, 미국 펜실베이니아주 마르쿠스 후크의 에프엠씨 코포레이션 (FMC Corporation)에 의해 판매됨), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 (예를 들어, 폴리비닐 피롤리돈 K30), 및 그의 혼합물을 포함한다.

특히 제약 조성물에 사용될 수 있는 결합제의 예는 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 (포비돈), 전분, 말토덱스트린 또는 셀룰로스 에테르 (예를 들어, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시에틸 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스과 같은 것)를 포함한다.

본원에서 사용될 때, "충전제"라는 용어는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 임의의 제약상 허용되는 충전제를 나타낸다. 제약상 허용되는 충전제의 예는 제한 없이 활석, 탄산칼슘 (예를 들어, 과립 또는 분말), 이염기성 인산칼슘, 3염기성 인산칼슘, 황산칼슘 (예를 들어, 과립 또는 분말), 미세결정질 셀룰로스 (예를 들어, 아비셀 PH101 또는 셀피어 CP-305), 초미세 셀룰로스, 분말형 셀룰로스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분 (예를 들어, 스타치 1500), 예비젤라틴화 전분, 락토스, 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 트레할로스, 수크로스, 말토스, 이소몰트, 라피노스, 말티톨, 멜레지토스, 스타키오스, 락티톨, 팔라티나이트, 크실리톨, 미오이노시톨 및 그의 혼합물을 포함한다.

특히 펩티드 코팅에 사용될 수 있는 제약상 허용되는 충전제의 예는 제한 없이 활석, 미세결정질 셀룰로스 (예를 들어, 아비셀 PH101 또는 셀피어 CP-305), 분말형 셀룰로스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분, 예비젤라틴화 전분, 락토스, 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 트레할로스, 수크로스, 말토스, 이소몰트, 이염기성 인산칼슘, 라피노스, 말티톨, 멜레지토스, 스타키오스, 락티톨, 팔라티나이트, 크실리톨, 만니톨, 미오이노시톨 및 그의 혼합물을 포함한다.

본원에서 사용될 때, "첨가제"라는 용어는 임의의 제약상 허용되는 첨가제를 나타낸다. 제약상 허용되는 첨가제는 제한 없이 붕해제, 분산 첨가제, 윤활제, 글리단트, 항산화제, 코팅 첨가제, 희석제, 계면활성제, 착향 첨가제, 습윤제, 흡수 촉진 첨가제, 조절 방출 첨가제, 케이킹 방지 첨가제, 항미생물제 (예를 들어, 보존제), 착색제, 건조제, 가소제 및 염료를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "부형제"는 임의의 제약상 허용되는 첨가제, 충전제, 결합제 또는 작용제 (agent)이다.

본 발명의 조성물은 또한 다른 치료 성분, 케이킹 방지제, 보존제, 감미제, 착색제, 착향제, 건조제, 가소제, 염료, 글리단트, 부착 방지제, 정전기 방지제, 계면활성제 (습윤화제), 항산화제, 필름 코팅제 등을 임의로 포함할 수 있다. 임의의 그러한 임의 성분은 제형의 안정성을 보증하기 위하여 본원에 기재된 화합물과 양립가능하여야 한다. 조성물은 필요할 경우 다른 첨가제를 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 락토스, 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 트레할로스, 수크로스, 말토스, 라피노스, 말티톨, 멜레지토스, 스타키오스, 락티톨, 팔라티나이트, 전분, 크실리톨, 만니톨, 미오이노시톨 등과 그의 수화물, 및 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신 및 베타인, 및 펩티드 및 단백질, 예를 들어 알부민을 포함한다.

조성물은 예를 들어 다양한 추가의 용매, 분산제, 코팅, 흡수 촉진 첨가제, 조절 방출 첨가제, 및 하나 이상의 불활성 첨가제 (이는 예를 들어 전분, 폴리올, 과립화 첨가제, 미세결정질 셀룰로스, 희석제, 윤활제, 결합제, 붕해 첨가제 등을 포함함) 등을 포함할 수 있다. 요망될 경우, 개시된 조성물의 정제 투여형은 표준 수성 또는 비수성 기법에 의해 코팅될 수 있다. 또한 조성물은 예를 들어 케이킹 방지 첨가제, 보존제, 감미 첨가제, 착색제, 착향제, 건조제, 가소제, 염료 등을 포함할 수 있다.

적합한 붕해제는 예를 들어 아가-아가, 탄산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 포비돈, 폴라크릴린 포타슘, 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 기타 전분, 예비젤라틴화 전분, 점토, 기타 알긴, 기타 셀룰로스, 고무 및 그의 혼합물을 포함한다.

적합한 윤활제는 예를 들어 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 광유, 경유, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 기타 글리콜, 스테아르산, 나트륨 라우릴 술페이트, 활석, 수소화 식물유 (예를 들어, 땅콩유, 면실유, 해바라기유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유), 스테아르산아연, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레이트, 한천, 실로이드 실리카 겔 (에어로실 (AEROSIL) 200, 미국 메릴랜드주 볼티모어의 더블유.알. 그레이스 컴퍼니 (W.R. Grace Co.)), 합성 실리카의 응결 에어로졸 (미국 텍사스주 플라노의 에보니크 데구사 컴퍼니 (Evonik Degussa Co.)), 발열성 이산화규소 (캅-오-실 (CAB-O-SIL), 미국 매사추세츠주 보스턴의 캐보트 컴퍼니 (Cabot Co.)), 및 그의 혼합물을 포함한다.

적합한 글리단트는 예를 들어 류신, 콜로이드성 이산화규소, 삼규산마그네슘, 분말형 셀룰로스, 전분, 활석, 및 삼염기성 인산칼슘을 포함한다.

적합한 케이킹 방지 첨가제는 예를 들어 규산칼슘, 규산마그네슘, 이산화규소, 콜로이드성 이산화규소, 활석 및 그의 혼합물을 포함한다.

예를 들어 펩티드 조성물용 보존제로서 사용될 수 있는 적합한 항미생물 첨가제는 예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알콜, 부틸 파라벤, 세틸피리디늄 클로라이드, 크레졸, 클로로부탄올, 데히드로아세트산, 에틸파라벤, 메틸파라벤, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페녹시에탄올, 페닐 수은 아세테이트, 페닐수은 니트레이트, 소르브산칼륨, 프로필파라벤, 벤조산나트륨, 나트륨 데히드로아세테이트, 프로피온산나트륨, 소르브산, 티메르솔, 티모, 및 그의 혼합물을 포함한다.

적합한 항산화제는 예를 들어 BHA (부틸화 히드록시아니솔), BHT (부틸화 히드록시톨루엔), 비타민 E, 프로필 갈레이트, 아스코르브산 및 그의 염 또는 에스테르, 토코페롤 및 그의 에스테르, 알파-리포산 및 베타-카로틴을 포함한다.

적합한 코팅 첨가제는 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 제약용 유약, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트, 메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 셸락, 수크로스, 이산화티타늄, 카르나우바 왁스, 미세결정질 왁스 및 그의 혼합물을 포함한다. 적합한 보호 코팅은 아쿠아코트 (Aquacoat) (예를 들어, 아쿠아코트 에틸셀룰로스 수성 분산액, 15% (w/w), 에프엠씨 바이오폴리머 (FMC Biopolymer), ECD-30), 유드라짓 (Eudragit) (예를 들어, 유드라짓 E PO PE-EL, 룀 파르마 폴리머즈 (Roehm Pharma Polymers)) 및 오파드라이 (Opadry) (예를 들어 오파드라이 AMB 분산액, 20% (w/w), 컬러콘)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 펩티드 조성물용으로 적합한 첨가제는 수크로스, 활석, 스테아르산마그네슘, 크로스포비돈 또는 BHA 중 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 조성물은 다른 부형제, 작용제 및 그의 카테고리를 또한 포함할 수 있으며, 이는 L-히스티딘, 플루로닉 (Pluronic)^®, 폴록사머 (Poloxamer) (예컨대 루트롤 (Lutrol)^® 및 폴록사머 188), 아스코르브산, 글루타티온, 투과성 향상제 (예를 들어, 지질, 나트륨 콜레이트, 아실카르니틴, 살리실레이트, 혼합 담즙염, 지방산 미셀, 킬레이트제, 지방산, 계면활성제, 중쇄 글리세리드), 프로테아제 억제제 (예를 들어, 대두 트립신 억제제, 유기산), pH 저하제 및 생체이용성을 촉진하는데 효과적인 흡수 향상제 (US 6086918 및 US 5912014에 기재된 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아님), 저작성 정제용 물질 (예컨대 덱스트로스, 프룩토스, 락토스 일수화물, 락토스 및 아스파탐, 락토스 및 셀룰로스, 말토덱스트린, 말토스, 만니톨, 미세결정질 셀룰로스 및 구아 고무, 결정질 소르비톨); 비경구용 물질 (예컨대 만니톨 및 포비돈); 가소제 (예컨대 디부틸 세바케이트, 코팅용 가소제, 폴리비닐아세테이트 프탈레이트); 분말형 윤활제 (예컨대 글리세릴 베헤네이트); 연질 젤라틴 캡슐 (예컨대 소르비톨 특수 용액); 코팅용 구체 (예컨대 당 구체); 구형화제 (예컨대 글리세릴 베헤네이트 및 미세결정질 셀룰로스); 현탁제/겔화제 (예컨대 카라기난, 겔란 고무, 만니톨, 미세결정질 셀룰로스, 포비돈, 나트륨 전분 글리콜레이트, 잔탄 고무); 감미제 (예컨대 아스파탐, 아스파탐 및 락토스, 덱스트로스, 프룩토스, 꿀, 말토덱스트린, 말토스, 만니톨, 당밀, 결정질 소르비톨, 소르비톨 특수 용액, 수크로스); 습식 과립화제 (예컨대 탄산칼슘, 무수 락토스, 락토스 일수화물, 말토덱스트린, 만니톨, 미세결정질 셀룰로스, 포비돈, 전분), 카라멜, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 체리 크림향 및 체리향, 무수 시트르산, 시트르산, 정제 가루 설탕, D&C 적색 33호, D&C 황색 10호 알루미늄 레이크, 에데트산이나트륨, 에틸 알콜 15%, FD&C 황색 6호 알루미늄 레이크, FD&C 청색 1호 알루미늄 레이크, FD&C 청색 1호, FD&C 청색 2호 알루미늄 레이크, FD&C 녹색 3호, FD&C 적색 40호, FD&C 황색 6호 알루미늄 레이크, FD&C 황색 6호, FD&C 황색 10호, 글리세롤 팔미토스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 인디고 카민, 레시틴, 만니톨, 메틸 및 프로필 파라벤, 모노 암모늄 글리시리지네이트, 천연 및 인공 오렌지향, 제약용 유약, 폴록사머 188, 폴리덱스트로스, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리비돈, 예비젤라틴화 옥수수 전분, 예비젤라틴화 전분, 적색 산화철, 사카린 나트륨, 나트륨 카르복시메틸 에테르, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 딸기향, 합성 흑색 산화철, 합성 적색 산화철, 이산화티타늄, 및 백색 왁스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드와, Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 또는 Al^{3 +}, 그의 조합 및/또는 입체 장애 1급 아민으로부터 선택되는 하나 이상의 안정화제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 추가의 실시양태에서, 작용제는 Mg^{2 +}, Ca^{2 +} 또는 Zn^{2 +} 또는 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, 양이온은 제한 없이 아세트산마그네슘, 염화마그네슘, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산칼슘, 염화칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 아세트산아연, 염화아연, 인산아연, 황산아연, 아세트산망가니즈, 염화망가니즈, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 아세트산칼륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 황산칼륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 아세트산알루미늄, 염화알루미늄, 인산알루미늄 또는 황산알루미늄으로서 제공된다. 추가의 실시양태에서, 양이온은 염화마그네슘, 염화칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 아세트산아연, 염화망가니즈, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 염화알루미늄으로서 제공된다. 다른 실시양태에서, 양이온은 염화칼슘, 염화마그네슘 또는 아세트산아연으로 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 안정화제는 입체 장애 1급 아민이다. 추가의 실시양태에서, 입체 장애 1급 아민은 아미노산이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 아미노산은 천연 아미노산이다. 다른 추가의 실시양태에서, 천연 아미노산은 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 트립토판, 글리신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또한 추가로, 천연 아미노산은 류신, 이소류신, 알라닌 또는 메티오닌이다. 또 다른 실시양태에서, 입체 장애 1급 아민은 비천연 아미노산 (예를 들어, 1-아미노시클로헥산 카르복실산)이다. 추가의 실시양태에서, 입체 장애 1급 아민은 시클로헥실아민, 2-메틸부틸아민 또는 중합체성 아민, 예컨대 키토산이다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 입체 장애 1급 아민이 조성물에서 사용될 수 있다.

일부의 경우, 입체 장애 1급 아민은 하기의 화학식:

을 가지며, 상기 식에서 R₁, R₂ 및 R₃은 독립적으로 H, C(O)OH, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알킬에테르, C₁-C₆ 알킬티오에테르, C₁-C₆ 알킬 카르복실산, C₁-C₆ 알킬 카르복실아미드 및 알킬아릴로부터 선택되고, 여기서, 임의의 기는 할로겐 또는 아미노로 단일 또는 다중 치환될 수 있으며, 단, R₁, R₂ 및 R₃ 중 둘 이하는 H이다. 또 다른 실시양태에서, R₁, R₂ 및 R₃ 중 하나 이하가 H이다.

다른 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체, 펩티드, Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 또는 Al^{3 +}, 또는 그의 혼합물로부터 선택된 양이온, 및 입체 장애 1급 아민을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 일 실시양태에서, 양이온은 Mg^{2 +}, Ca^{2 +} 또는 Zn²⁺ 또는 그의 혼합물이다. 추가의 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 결합제 및/또는 제약상 허용되는 글리단트, 윤활제, 또는 글리단트 및 윤활제 둘 모두로 작용하는 첨가제 및/또는 항산화제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 담체에 적용된다. 일부 실시양태에서, 담체는 충전제이다.

일부의 경우, 담체에 적용되는 수용액 중 양이온:입체 장애 1급 아민:펩티드의 몰비는 5-100:5-50:1이다. 일부의 경우, 양이온:입체 장애 1급 아민의 몰비는 2:1과 동일하거나 그보다 클 수 있다 (예를 들어, 5:1 내지 2:1). 따라서, 일부의 경우 담체에 적용되는 양이온:입체 장애 1급 아민:펩티드의 몰비는 100:50:1, 100:30:1, 80:40:1, 80:30:1, 80:20:1, 60:30:1, 60:20:1, 50:30:1, 50:20:1, 40:20:1, 20:20:1, 10:10:1, 10:5:1 또는 5:10:1이다. 담체에 적용되는 GC-C 효능제 펩티드 용액에 결합제, 예를 들어 메틸셀룰로스가 존재할 경우, 이것은 0.5 중량% - 2.5 중량% (예를 들어, 0.7%-1.7% 또는 0.7% - 1% 또는 1.5% 또는 0.7%)로 존재할 수 있다.

Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 및 Al^{3 +}로부터 선택된 양이온은 보관 동안 GC-C 수용체 효능제 폴리펩티드의 산화 생성물의 형성을 억제하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. 또한, 입체 장애 1급 아민은 보관 동안 GC-C 수용체 효능제 폴리펩티드의 포름알데히드 이민 부가물 ("포름알데히드 이민 생성물")의 형성을 억제하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. 따라서, Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 또는 Al^{3 +}으로부터 선택된 양이온 - 예를 들어, Zn^{2 +}, Mg^{2 +} 및 Ca^{2 +}로부터 선택된 이가 양이온 - 및/또는 입체 장애 1급 아민, 예컨대 아미노산을 포함하는 GC-C 수용체 효능제 폴리펩티드 제형은 약물의 제조, 보관 및 분배에 충분한 보관 수명 (크로마토그래피 순도에 의해 및/또는 중량/중량 검정에 의해 측정할 때)을 갖는다. 또한, 입체 장애 아민 단독의 존재는 보관 동안 리나클로타이드의 가수분해 생성물의 형성을 증가시킬 있는 반면, 입체 장애 1급 아민과 양이온의 조합, 예를 들어, 비제한적으로 류신과 Ca^{2 +}의 조합은 보관 동안 GC-C 수용체 효능제 폴리펩티드의 산화 생성물뿐만 아니라 GC-C 수용체 효능제 폴리펩티드의 가수분해 생성물의 형성도 억제하며, 이는 중량/중량 검정에 의해 및/또는 크로마토그래피 순도에 의해 결정할 때 훨씬 더 큰 전체 안정성에 이르게 된다.

추가의 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 결합제 또는 첨가제, 및/또는 제약상 허용되는 글리단트, 윤활제 또는 글리단트 및 윤활제 둘 모두로 작용하는 첨가제 및/또는 항산화제를 추가로 포함한다.

본 발명에 따른 적합한 제약 조성물은 일반적으로 사용 의도에 따라 최종 농도의 범위를 제공하기 위하여 소정량의 활성 화합물(들)을 허용되는 제약 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균 수용액과 함께 포함한다. 제조 기법은 일반적으로 당업계에 익히 공지되어 있으며, 이는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, Mack Publishing Company, 1995)]에 의해 예시되는 바와 같다.

위장 장애의 치료에 있어서, 바람직하게는 본원에 기재된 펩티드는 예를 들어 예정량의 활성 성분의 펠렛, 겔, 페이스트, 시럽, 볼루스, 연약, 슬러리, 분말, 동결건조 분말, 과립을 함유하는 사쉐제, 캡슐, 정제로서, 수성 액체 또는 비수성 액체 중 용액 또는 현탁액으로서, 수중유형 액체 에멀젼 또는 유중수형 액체 에멀젼으로서, 리포솜 제형 (예를 들어 EP 736299 참조)을 통하여 또는 일부 다른 형태로 경구 투여된다. 경구 투여되는 조성물은 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 윤활 표면 활성제 또는 분산제, 착향제 및 습윤제를 포함할 수 있다. 정제와 같은 경구 투여되는 제형은 임의로 코팅 또는 스코어링될 수 있으며, 그 내부의 활성 성분의 지속 방출, 지연 방출 또는 조절 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 펩티드는 본원에 기재된 작용제들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 위장 장애 치료에 사용되는 다른 작용제와 공동 투여될 수 있다.

또 다른 측면에서, 적합한 제약 조성물은 하나 이상의 다른 치료제를 포함할 수 있다. 그러한 치료제는 제한 없이 진통제; 양성자 펌프 억제제, 산 펌프 길항제, H2 수용체 길항제를 포함하는 분비 억제제; PDE5 억제제; GABA-B 길항제; 담즙산 봉쇄제; 운동 촉진 및 기능 조정제; 항우울제; 항생제; 구토 방지제; 및 점막 보호제를 포함한다.

치료 방법

본 발명의 일부 실시양태에서, 위장 장애의 치료 방법이 제공된다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 상부 GI 장애이다. 추가의 실시양태에서, 상기 장애는 GP, 수술 후 위장폐색, 기능성 식도 장애, 기능성 위십이지장 장애, 위식도 역류 질환 (GERD), 셀리악병, 점막염, 또는 십이지장 또는 위 궤양이다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 GP이다. 추가의 실시양태에서, GP는 특발성, 당뇨병성 또는 수술 후 GP이다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 수술 후 위장폐색이다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 기능성 식도 장애이다.

일부 실시양태에서, 기능성 식도 장애는 기능성 흉부 작열감, 식도 기원으로 추정되는 기능성 흉통, 기능성 연하 곤란 또는 구감 (globus)이다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 기능성 위십이지장 장애이다.

일부 실시양태에서, 기능성 위십이지장 장애는 FD, 트림 장애, 오심 또는 구토 장애 또는 되새김 증후군이다. 추가의 실시양태에서, 기능성 위십이지장 장애는 FD이다. 일부 실시양태에서, FD는 식후 불편 증후군 또는 명치 통증 증후군이다. 일부 실시양태에서, 트림 장애는 공기 연하증 또는 상세불명 과다 트림이다. 일부 실시양태에서, 오심 또는 구토 장애는 만성 특발성 오심, 기능성 구토 또는 주기성 구토 증후군이다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 위식도 역류 질환 (GERD)이다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 셀리악병이다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 점막염이다.

일부 실시양태에서, 위장 장애는 십이지장 또는 위 궤양이다.

본원에 기재된 펩티드 및 효능제는 상부 위장 장애와 결부된 내장통 또는 본원에 기재된 또 다른 장애와 결부된 통증의 치료, 예방 또는 감소를 위한 병용 요법에서 또는 단독으로 사용될 수 있다.

본원에 기재된 GC-C 수용체 효능제는 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 진통 펩티드 또는 화합물과 함께 투여될 수 있다. 진통 펩티드 또는 화합물은 본원에 기재된 펩티드에 공유 결합에 의해 부착될 수 있거나, 또는 이것은 병용 요법에서 본원에 기재된 펩티드와 함께 또는 순차적으로 투여되는 별도의 작용제일 수 있다. 본원에 기재된 GC-C 수용체 효능제는 또한 상부 GI 장애의 치료에 사용되는 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있으며, 상기 작용제는 항우울제, 위장관 운동 촉진 또는 항진제, 구토 방지제, 항생제, 양성자 펌프 억제제, 산 차단제 (예를 들어, 히스타민 H2 수용체 길항제), 산 펌프 길항제, PDE5 억제제, GABA-B 효능제, 담즙산 봉쇄제, 및 점막 보호제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드와 함께 사용될 수 있는 유용한 진통제는 Ca 채널 차단제 (예를 들어, 지코노티드), 5HT 수용체 길항제 (예를 들어, 5HT3, 5HT4 및 5HT1 수용체 길항제), 5HT4 효능제 (예를 들어, 테가세로드 (젤놈 ( Zelnorm)^®, 모사프리드, 메토클로프라미드, 자코프리드, 시사프리드, 렌자프리드, 벤즈이미다졸론 유도체, 예컨대 BIMU 1 및 BIMU 8, 및 리렉사프리드), 5HT1 효능제 (예를 들어, 수마트립탄 및 부스피론), 오피오이드 수용체 효능제 (예를 들어, 로페라미드, 페도토진, 엔케팔린 펜타펩티드, 모르핀, 디페닐옥실레이트, 프라케파미드, 트리메부틴 및 펜타닐), CCK 수용체 효능제 (예를 들어, 록시글루미드 및 덱슬록시글루미드), NK1 수용체 길항제 (예를 들어, 아프레피탄트, 보포피탄트, 에즐로피탄트, R-673 (호프만-라 로슈 엘티디. (Hoffmann-La Roche Ltd.)), SR-48968 및 SR-14033, (사노피 신테라보 (Sanofi Synthelabo)), CP-122,721 (화이자, 인크. (Pfizer, Inc.)), GW679769 (글락소 스미스 클라인 (Glaxo Smith Kline)) 및 TAK-637 (타케다/애보트 (Takeda/Abbot))), NK2 수용체 길항제 (예를 들어, 네파두탄트, 사레두탄트, GW597599 (글락소 스미스 클라인), SR-144190 (사노피 신테라보) 및 UK-290795 (화이자 인크.)), NK3 수용체 길항제 (예를 들어, 오사네탄트 (SR-142801; 사노피-신테라보), SR-241586 및 탈네탄트), 노르에피네프린-세로토닌 재흡수 억제제 (NSRI) (예를 들어, 밀나시프란), 바닐로이드 및 카나바노이드 수용체 효능제, 시알로르핀 및 시아로르핀-관련 펩티드를 포함한다. 다양한 종류의 진통제가 문헌에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 다른 치료제가 본원에 기재된 펩티드와 조합되어 사용될 수 있다. 그러한 작용제는 항우울제, 위장관 운동 촉진 또는 항진제, 구토 방지제, 항생제, 양성자 펌프 억제제, 산 차단제 (예를 들어, 히스타민 H2 수용체 길항제), 산 펌프 길항제, PDE5 억제제, GABA-B 효능제, 담즙산 봉쇄제, 및 점막 보호제를 포함한다.

항우울제의 예는 제한 없이 삼환계 항우울제, 예컨대 아미트립틸린 (엘라빌 (Elavil)^®), 데시프라민 (노르프라민 (Norpramin)^®), 이미프라민 (토프라닐 (Tofranil)^®), 아목사핀 (아센딘 (Asendin)^®), 노르트립틸린; 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (SSRI), 예컨대 파록세틴 (팍실 (Paxil)^®), 플루옥세틴 (프로작 (Prozac)^®), 세르트랄린 (졸로프트 (Zoloft)^®), 및 시트랄로프람 (셀렉사 (Celexa)^®) 및 기타, 예컨대 독세핀 (시네콴 (Sinequan)^®) 및 트라조돈 (데시렐 (Desyrel)^®)을 포함한다.

기능 조정 및 운동 촉진제의 예는 제한 없이 이토프리드, 옥트레오티드, 베타네콜, 메토클로프라미드 (레글란 (Reglan)^®), 돔페리돈 (모틸리움 (Motilium)^®), 에리트로마이신 (및 그의 유도체) 및 시사프리드 (프로풀시드 (Propulsid)^®)를 포함한다. 구토 방지제의 예는 제한 없이 프로클로르페라진을 포함한다.

사용될 수 있는 항생제의 예는 헬리코박터 파일로리 (Heliobacter pylori) 감염 치료에 사용될 수 있는 것, 예컨대 아목시실린, 테트라사이클린, 메트로니다졸 또는 클라리트로마이신을 포함한다. 또한 다른 항생제, 예컨대 에리트로마이신 및 그의 유도체가 본원에 기재된 펩티드와 조합되어 사용될 수 있다.

양성자 펌프 억제제의 예는 제한 없이 오메프라졸 (프릴로섹 (Prilosec)^®), 에소메프라졸 (넥시움 (Nexium)^®), 란소프라졸 (프레바시드 (Prevacid)^®), 판토프라졸 (프로토닉스 (Protonix)^®) 및 라베프라졸 (아시펙스 (Aciphex)^®))를 포함한다. H2 수용체 차단제의 예는 제한 없이 시메티딘, 라니티딘, 파모티딘 및 니자티딘을 포함한다. 산 펌프 길항제의 예는 제한 없이 레바프라잔, CS-526 (문헌 [J. Pharmacol. Exp. Ther. (2007) 323:308-317]), PF-03716556 (문헌 [J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009) 328(2):671-9]), 및 YH1885 (문헌 [Drug Metab. Dispos. (2001) 29(1):54-9])를 포함한다.

PDE5 억제제의 예는 제한 없이 아바나필, 로데나필, 미로데나필, 실데나필 시트레이트, 타달라필, 바르데나필 및 우데나필을 포함한다. GABA-B 효능제는 제한 없이 바클로펜 및 XP19986 (CAS 등록 번호 847353-30-4)을 포함한다. 담즙산 봉쇄제의 예는 제한 없이 GT102-279, 콜레스티라민, 콜레세벨람, 콜레세벨람 히드로클로라이드, 우르소데옥시콜릭산, 콜레스티폴, 콜레스틸란, 세벨라메르, 에피클로로하이드린과 가교결합된 폴리디알릴아민, 가교결합된 덱스트란의 디알킬아미노알킬 유도체, 및 N-(시클로알킬)알킬아민을 포함한다. 점막 보호제의 예는 제한 없이 수크랄페이트 (카라페이트 (Carafate)), 테프레논, 폴라프레징크, 세트락세이트 및 비스무트 서브살리시클레이트를 포함한다.

병용 요법은 각각이 별도로 제형화되어 투여되는 2가지 이상의 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 GC-C 수용체 효능제 및 또 다른 치료 펩티드 또는 화합물을 투여함으로써 또는 단일 제형 형태의 2가지 이상의 작용제를 투여함으로써 달성될 수 있다. 다른 조합이 병용 요법에 또한 포함된다. 예를 들어, 두 작용제는 함께 제형화되고 제3 작용제를 함유하는 별도의 제형과 함께 투여될 수 있다. 병용 요법에서 2가지 이상의 작용제가 동시에 투여될 수 있지만, 이들은 그러할 필요는 없다. 예를 들어, 제1 작용제 (또는 작용제들의 조합)의 투여는 수 분, 수 시간, 수 일 또는 수 주만큼 제2 작용제 (또는 작용제들의 조합)의 투여에 선행할 수 있다. 따라서, 상기 2가지 이상의 작용제는 서로 수 분 이내에, 또는 서로 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 또는 24시간 이내에, 또는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14일 이내에, 또는 서로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 이내에 투여될 수 있다. 일부의 경우, 훨씬 더 긴 간격이 가능하다. 많은 경우, 병용 요법에 사용되는 2가지 이상의 작용제가 동일 시점에 환자의 체내에 존재하는 것이 바람직하지만, 이는 그러할 필요는 없다.

투여량

성인에 있어서의 용량 범위는 일반적으로 본원에 기재된 GC-C 펩티드의 경구 투여의 경우 일일 5 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 불연속 단위로 제공되는 정제, 캡슐 또는 다른 형태의 제시물은 편리하게는 그러한 투여량으로 또는 그의 다수의 것으로서 효과적인 양의 본원에 기재된 화합물, 예를 들어 25 ㎍ 내지 2 mg 또는 대략 100 ㎍ 내지 1 mg을 함유하는 단위를 포함할 수 있다. 환자에게 처방되는 화합물의 정확한 양은 주치의의 책임일 것이다. 그러나, 이용되는 용량은 다수의 인자에 의존적일 것이며, 상기 인자는 환자의 연령 및 성별, 치료되는 정확한 장애, 및 그의 중증도를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 투여 단위는 하루의 임의의 시점에서 음식과 함께, 하루의 임의의 시점에서 음식 없이, 밤새 공복 후 음식과 함께 (예를 들어, 아침식사와 함께), 저지방 스낵 후 취침시에 투여된다. 특정한 한 실시양태에서, 투여 단위는 음식 소비 (예를 들어, 식사) 전 또는 후에 투여된다. 추가의 실시양태에서, 투여 단위는 음식을 소비하기 대략 15분 내지 1시간 전에 투여된다. 다양한 실시양태에서, 투여 단위는 일일 1회, 일일 2회, 일일 3회, 일일 4회, 일일 5회 또는 일일 6회 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여 단위 및 일일 용량은 동등하다.

본 발명의 병용 요법 실시양태에서, 투여 단위 중 2가지 이상의 활성 성분 각각의 정확한 양은 각각의 성분의 요망되는 투여량에 의존적일 것이다. 따라서, 특정 투여 스케줄 (예를 들어, 특정한 단위 수 및 특정한 투여 타이밍을 특정하는 투여 스케줄)에 따라 투여될 때, 환자가 단지 단일 성분으로 치료되는 경우에 투여되는 것과 동일한 투여량의 각각의 성분을 전달하는 투여 단위를 생성하는 것이 유용할 수 있다. 다른 경우, 환자가 단지 단일 성분으로 치료되는 경우 투여되는 것보다 더 적은 투여량의 하나 이상의 성분을 전달하는 투여 단위를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 마지막으로, 환자가 단지 단일 성분으로 치료되는 경우 투여되는 것보다 더 많은 투여량의 하나 이상의 성분을 전달하는 투여 단위를 생성하는 것이 바람직할 수 있다.

제약 조성물은 본원에 기재된 활성 성분 및 부형제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 추가의 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 단위의 하나 이상의 치료제는 장기간 또는 조절 방출 제형으로 존재할 수 있으며, 추가의 치료제는 장기간 방출 제형에 존재하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 펩티드 또는 효능제는 조절 방출 또는 장기간 방출 제형내에 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있는 또 다른 작용제와 함께 동일 투여 단위의 조절 방출 제형 또는 장기간 방출 제형 내에 존재할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제들 중 하나 이상의 즉시 방출, 및 하나 이상의 다른 작용제의 조절 방출을 제공하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명을 그의 예시적인 특정 실시양태를 참고로 하여 기재하였다. 그러나, 상기에 기재된 예시적인 실시양태의 것 이외의 특정 형태로 본 발명을 구현하는 것이 가능함이 당업자에게 쉽게 자명해질 것이다. 이는 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있다. 예시적인 실시양태는 단지 예시적인 것이며, 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 여겨져서는 안된다. 본 발명의 범주는 이전의 설명에 의해서라기보다는 오히려 첨부된 특허청구범위 및 그의 등가물에 의해 규정된다.

실시예

본원에 기재된 GC-C 효능제 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염은 아메리칸 펩티드 컴퍼니 (American Peptide Company, 미국 캘리포니아주 서니베일)에서 고체상 화학 합성 및 천연 폴딩 (공기 산화)에 의해 제조하였다. 펩티드 및 그의 서열을 하기에 나타냈다 (여기서, 아미노산 서열은 표준 1문자 코드이며, "pS"는 포스포세린임):

실시예 1: 펩티드 기질에 대한 알칼리성 및 산성 포스파타제의 영향

알칼리성 포스파타제 반응에 있어서, 펩티드 스톡을 pH 8의 0.1 M 트리스 (Tris)-HCl 중 1 mg/mL로 제조하고, 검정을 수행할 때까지 이를 -20℃에서 보관하였다. 산성 포스파타제 반응에 있어서, 펩티드 스톡을 pH 6의 50 mM 인산나트륨 중 1 mg/mL로 제조하고, 검정을 수행할 때까지 이를 -20℃에서 보관하였다.

알칼리성 포스파타제 반응

송아지 장 알칼리성 포스파타제 (Calf intestinal alkaline phosphatase, CIP)를 미국 매사추세츠주 입스위치의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England BioLabs)로부터 카탈로그 번호 M0290S로 획득하였다. CIP 반응 용액은 완충제 (50 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂, 50% 글리세롤)을 이용하여 0.5 단위/μL로 희석시킴으로써 제조하였다. 알칼리성 포스파타제 반응 용액을 20 μL의 양으로 어셈블링하였으며, 이는 하기를 함유하였다:

2 μL의 10X CIP 완충제 (1 M NaCl, 500 mM 트리스-HCl pH 8, 100 mM MgCl₂)

2 μL의 펩티드 스톡 (1 mg/mL)

12 μL의 H₂O

4 μL의 알칼리성 포스파타제 (0, 0.5 또는 2 단위)

반응 용액을 온건하게 혼합하고, 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 이들 반응 용액을 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 분석을 위하여, 반응 용액을 10 μM의 최종 농도로 물 중 0.1% 포름산을 이용하여 7.5 μL의 CIP 처리 펩티드로부터 50 μL로 희석시켰다. 그 후 20 μL의 최종 용액을 하기 표 1에 나타낸 조건을 이용하여 LCMS로 분석하였다.

펩티드 대신 10 mM의 p-니트로페닐포스페이트를 함유하는 대조 반응물을 효소 활성용으로 어셈블링하였다. 인큐베이션 후, 반응물을 pH 9의 0.1 mL의 100 mM 보레이트 완충제로 희석시키고, 405 nm의 흡광도에서 판독하여 p-니트로페놀의 출현을 모니터링하였다.

산성 포스파타제 반응

감자 산성 포스파타제 (PoAP)를 미국 미주리주 세인트루이스의 시그마 (Sigma)로부터 카탈로그 번호 P1146으로 획득하고, 인간 전립선 산성 포스파타제 (HuPrAP)를 미국 오하이오주 소론의 엠피 바이오케미칼스 (MP Biochemicals)로부터 카탈로그 번호 153872로 획득하였다. pH 5의 50 mM 아세트산나트륨, 0.2 mM MgCl₂를 이용하여 산성 포스파타제를 용해시켜 0.5 단위의 AP/μL를 함유하는 용액을 제공하였다. 하기를 함유하는 산성 포스파타제 반응물을 20 μL의 양으로 어셈블링하였다:

2 μL의 10X 산성 포스파타제 완충제 (500 mM 아세트산나트륨 pH 5, 2 mM MgCl₂)

2 μL의 펩티드 스톡 (1 mg/mL)

12 μL의 H₂O

4 μL의 산성 포스파타제 (0.5 또는 2 단위)

반응 용액을 온건하게 혼합하고, 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 이들 반응 용액을 이후에 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 분석을 위하여, 7.5 μL의 산성 포스파타제 반응물을 10 μM의 최종 농도로 물 중 0.1% 포름산을 이용하여 50 μL로 희석시켰다. 그 후 20 μL의 최종 반응물을 하기 표 1에 나타낸 조건을 이용하여 LCMS로 분석하였다. 효소 활성을 위한 대조 반응물을 어셈블링하고 펩티드 대신 10 mM의 p-니트로페닐포스페이트로 희석시켰다. 인큐베이션 후, 반응물을 pH 9의 0.1 mL의 100 mM 보레이트 완충제로 희석시키고, 405 nm의 흡광도에서 판독하여 p-니트로페놀의 출현을 모니터링하였다.

표 2 및 표 3은 검정에 사용한 조건 하에서, 0.5 단위의 송아지 장 알칼리성 포스파타제 (pH 8) 및 0.5 단위의 감자 산성 포스파타제 또는 인간 전립선 산성 포스파타제 (pH 5)가 p-니트로페닐포스페이트를 효율적으로 가수분해시켰음을 나타낸다.

포스파타제 처리에 대한 펩티드 1 및 펩티드 2의 민감성은 LC-MS에 의해 반응 생성물을 분석함으로써 평가하였다. 표 2 및 표 3은 pH 8에서 송아지 장 알칼리성 포스파타제가 펩티드 1 및 펩티드 2를 효율적으로 탈인산화하였음을 나타낸다. 알칼리성 포스파타제와는 대조적으로, 감자 산성 및 인간 전립선 산성 포스파타제는 이들이 p-니트로페닐포스페이트를 효율적으로 가수분해시킨 조건 하에서 펩티드 1을 탈인산화하는 데 있어서 매우 비효율적이었다 (표 2). 인간 전립선 산성 포스파타제도 펩티드 2를 탈인산화하는 데 있어서 매우 비효율적이었다 (표 3).

별도의 대조군으로서, 펩티드 3을 송아지 장 알칼리성 포스파타제로 처리하거나 처리하지 않았으며, 생성된 반응물을 LC-MS에 의해 분석하였다. 펩티드 3은 CIP 처리에 의해 영향을 받지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).

실시예 2: GC -C 활성의 분석을 위한 T84 세포에서의 cGMP 의 축적

cGMP 검정에 있어서, 4.5 x 10⁵개의 세포/mL의 T84 세포를 24웰 조직 배양 플레이트에서 밤새 성장시켰다. 다음날, T84 세포를 1 mL의 DMEM + 20 mM MES (pH 5) 또는 DMEM + 50 mM 중탄산나트륨 (pH 8)으로 2회 세척하였으며, 여기서, 이들 완충제는 혈청을 함유하지 않았다. 두 번째 세척 후, 세포를 pH 5 또는 pH 8 완충제 중 어느 하나에서 37℃에서 10분 동안 450 μL의 1 mM 이소부틸메틸잔틴 (IBMX)과 함께 인큐베이션하여 임의의 포스포디에스테라제 활성을 억제하였다. 그 후 펩티드를 pH 5 또는 pH 8의 완충제에서 10x 농도로 희석시켰다. 50 μL의 펩티드 용액을 T84 세포를 함유하는 500 μL의 최종 부피로 희석시켜 각각의 펩티드 농도가 1x가 되게 하였다. 11개의 지점의 곡선 분석을 각각의 펩티드에 대하여 행하였으며, 이때 각각의 검정에서 시험한 최종 펩티드 농도는 nM 단위로 10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1이었다.

cGMP의 내인성 수준을 결정하기 위하여 사용하는 펩티드 대조군은 없었다. 펩티드를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후, 상청액을 제거하고, 세포를 0.1 M HCl로 용해시켰다. 세포를 얼음 상에서 30분 동안 용해시켰다. 30분 후, 용해물을 피펫으로 제거하여 96웰 HPLC 플레이트 내에 넣고, 10,000x g에서 10분 동안 스피닝하여 임의의 세포 잔해물을 제거하였다. 이전의 스핀으로부터의 상청액을 취하여 새로운 96웰 HPLC 플레이트 내에 넣었다. 샘플을 동일한 부피의 1 M 아세트산암모늄 (pH 7)으로 희석시켜 샘플을 중화시켰으며 이는 더욱 우수한 크로마토그래피를 위한 것이었다. 2x cGMP 표준 곡선을 0.1 M HCl에서 만들고, 그 후 동일한 부피의 1 M 아세트산암모늄으로 희석시켰으며, 이때 최종 농도는 nM 단위로 하기와 같았다: 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1.

cGMP 농도를 계산된 표준 곡선 및 표 4의 LC/MS 조건을 이용하여 각각의 샘플로부터 결정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 생성한 농도-반응 곡선으로부터 EC₅₀ 값을 계산하였다.

인간 T84 세포를 펩티드와 함께 인큐베이션하고, 이어서 축적된 세포내 cGMP를 LC-MS에 의해 결정함으로써 펩티드 1 및 펩티드 2와 이들의 탈인산화 형태가 pH 5에서 인간 T84 세포에서 cGMP 합성을 자극하는 능력을 시험하였다. 표 5는 펩티드 1 및 펩티드 2가 pH 5에서 cGMP 합성을 자극하는 데 있어서 펩티드 3의 것과 유사한 효력을 가짐을 보여준다. 그러나, 탈인산화 펩티드 1 및 펩티드 2는 T84 검정에서 펩티드 3보다 덜 강력하였다.

펩티드 5 및 펩티드 6에 대한 T84 세포의 cGMP 반응을 상기에 기재한 것과 유사한 방식으로 이중으로 또한 측정하였다. 펩티드 5에 있어서 pH 5에서의 EC₅₀ 은 14.7 nM였으며, 펩티드 6에 있어서 pH 5에서의 EC₅₀은 39.2 nM이었다.

실시예 3: T84 세포 상에서의 경쟁적 방사성 리간드 결합

아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, ATCC; 미국 버지니아주 매너서스)으로부터의 무손상 인간 T84 세포를 경쟁적 방사성 리간드 결합 실험에 사용하였다. T84 세포를 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium): 햄 (Ham's) F-12 50/50 배지 (DMEM/F12) + 5% 소 태아 혈청 (FBS)에서 60-70% 융합도로 T-150 플라스틱 플라스크 상에서 단층으로 성장시켰다. 세포를 세포 스크레이퍼 (scraper)를 이용하여 온화하게 긁어냄으로써 수거하고, 4℃에서 10분 동안 2000 g에서 원심분리함으로써 세포를 수집하였다. 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)에서 온화하게 재현탁시키고 세포를 상기와 같이 원심분리에 의해 수집함으로써 2회 세척하였다.

[¹²⁵I]-STp 방사성 리간드는 0.5 mL 물에 100 마이크로그램 (100 ㎍)의 NTFYCCELCCNPACAGCY (장독소 STp; 바켐 (Bachem) H-6248)를 용해시킴으로써 제조하였으며, 이는 문헌 [Marchanolis, J.J., "An enzymic method for the trace iodination of immunoglobulins and other proteins", Biochem . J. 1969, 113, 299-305]에 언급된 락토퍼옥시다제 방법을 사용한 아이오딘화를 위하여 퍼킨-엘머 라이프 앤드 애널리티칼 사이언시즈 (Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences) (미국 매사추세츠주 노스 빌레리카)로 보냈다. 퍼킨-엘머는 pH 5.8의 10 mM 아세트산암모늄으로 이전에 평형화한 워터스 (Waters) C-18 마이크로본다팩 (μBondapak) 칼럼 (25 cm)을 이용하여 HPLC에 의해 표지 추적자를 정제하였다. 0 내지 25% 구배의 아세토니트릴을 60분 내에 칼럼에 적용하고, 이어서 추가의 20분 동안 25% 아세토니트릴에서 등용매 용리를 하였다. 이 방법에 의해 서로로부터 그리고 미표지 전구체로부터 2가지 일아이오딘화 형태를 분리하였다. 64분 후에 용리되며 제4 티로신의 아이오딘화에 상응하는 것인 제2 일아이오딘화 피크 (피크 2)를 본 검정에서 표지된 추적자로서 사용하였다. 표지된 추적자는 비활성이 2200 Ci/mmol이었다. 도착시에 추적자를 -20℃에서 분취물로 보관하였다.

하기를 함유하는 결합 반응물을 0.2 mL로 이중으로 어셈블링하였다: 2.5 x 10⁵개의 T84 세포 (0.25 mg의 단백질), 200,000 cpm [¹²⁵I]-STp (41 fmol, 200 pM), 0.1 내지 3,000 nM의 경쟁자, 및 0.5%의 소 혈청 알부민 (BSA). 결합 검정을 pH 5.0에서 DMEM/20 mM 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES)에서 행하였다. pH 8.0에서의 결합 검정을 DMEM/20 mM N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄 술폰산 (HEPES)/50 mM 중탄산나트륨에서 수행하였다. 대조 반응물은 경쟁자 (전체)를 함유하지 않거나 세포를 함유하지 않았다.

완충 용액을 먼저 제조하고, 그 후 프로테아제가 없는 BSA를 0.5%로 첨가하였다. 방사성 리간드를 0.001 μCi/μL의 최종 농도로 첨가하였다. 경쟁자 펩티드 스톡 용액은 펩티드를 pH 6.0의 50 mM 인산나트륨 중에 1 mg/mL로 용해시킴으로써 제조하였다. 분석 증명서에 제공된 펩티드 분자량으로부터 농도를 계산하였다. 경쟁자 희석물은 pH 6.0의 50 mM 인산나트륨에서 만들었으며, 이는 결합 반응에서 시험할 펩티드의 최종 농도의 20배를 함유하였다 (20X 경쟁자).

결합 반응물을 하기 순서로 어셈블링하였다:

i. 완충 용액 중 방사성 리간드 및 BSA.

ii. 10 μL의 20X 경쟁자.

iii. T84 세포.

결합 반응물을 온건하게 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 유리 방사성 리간드로부터 막 결합물을 분리하는 것은 진공 여과를 이용하여 결합 반응물을 2.5 cm 와트만 (Whatman) GF/C 유리-섬유 필터 (PBS 중 1% 폴리비닐피롤리돈으로 전처리함)에 적용함으로써 행하였다. 필터를 5 mL의 빙냉 PBS 완충제로 2회 헹구고, 포획된 방사성 리간드의 측정을 신틸레이션 카운터에서 행하였다. 과량의 경쟁자 (1 μM)를 함유하는 반응물로부터의 결합 방사능을 각각의 샘플의 결합 방사능으로부터 제함으로써 비특이성을 결정하였다. 경쟁적 방사성 리간드 결합 곡선의 생성은 그래프패드 프리즘 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 행하였으며, 데이터를 비선형 회귀에 의해 분석하여 50% 방사성 리간드 결합을 산출한 경쟁자의 농도를 계산하였다 (IC₅₀). 각각의 경쟁자의 겉보기 해리 평형 상수 (K_i)는 문헌 [Cheng and Prusoff, (1973) Biochem. Pharmacol. 22(23) 3099-3108]의 방법을 이용하여, 이전에 결정된 방사성 리간드의 해리 상수의 개산치, K_d

15 nM 및 IC₅₀ 값으로부터 획득하였다. 이 검정에서 사용한 200 pM의 방사성 리간드의 농도는 그의 해리 상수와 비교하여 너무 작았으며, 계산된 IC₅₀ 및 K_i 값 (표 5)은 사실상 동일하였다.

표 6은 펩티드 1 및 펩티드 2가 pH 5에서의 결합에 있어서 펩티드 3의 것과 유사한 효력을 가짐을 보여준다. 그러나, 탈인산화된 펩티드 1 및 펩티드 2는 결합 검정에서 GC-C에 대한 친화도가 펩티드 3보다 더 낮았다.

실시예 4: 마우스에서의 위장 통과

본 검정의 목적은 마우스에서 생체내 위장 통과에 대한 구아닐레이트 시클라제 C 효능제 펩티드의 영향을 시험하는 것이었다. 경구 투여된 구아닐레이트 시클라제 C 효능제는 마우스에서 목탄분이 이동한 거리의 %를 증가시키는 것으로 입증되었다.

본 검정에 있어서, 25-30 g으로 칭량되는 암컷 CD-1 마우스 (n = 10마리/군)을 밤새 단식시키고, 물에는 임의대로 접근하게 하였다. 활성탄 (20 g; 100 메시; 시그마 카탈로그 번호 242276)을 200 mL의 검 아라빅에 현탁시키고 (100 mg/mL), 적어도 1시간 동안 교반시켰다. pH 6.9의 20 mM 트리스 비히클 중 시험 펩티드를 제조하였다.

시험 펩티드 및 비히클을 위관 영양법에 의해 200 μL의 용량으로 투여하였다. 시험 펩티드를 투여한지 7분 후, 200 μL의 목탄/검 아라빅 현탁물을 위관 영양법에 의해 투여하였다. 15분 후, 마우스를 CO₂ 과잉투입에 의해 희생시켰다. 위장관을 식도로부터 맹장까지 제거하였다. 소장의 총 길이를 유문 접합부로부터 회맹 접합부까지 측정하였다. 목탄이 이동하는 거리를 유문 접합부로부터 목탄 앞부분까지 측정하였다. 이동 거리 (%)를 (목탄이 이동한 거리/소장의 총 길이) x 100으로 결정하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 소프트웨어 프로그램에 입력하고, 본페로니 (Bonferroni) 사후 다중 비교 검정을 이용하여 ANOVA에 의해 분석하였다. 또한 ED₅₀ 및 데이터의 플롯을 그래프패드 프리즘 소프트웨어 패키지를 이용하여 결정하였다.

GI 통과에 대한 펩티드 4, 펩티드 1, 펩티드 2, 탈인산화 형태의 펩티드 1 및 탈인산화 형태의 펩티드 2의 급성 용량의 용량 의존적 영향을 암컷 CD 마우스에서 결정하였다. 7분 후 목탄 앞부분이 이동한 거리를 소장의 총 길이의 퍼센트로 표현한 것을 이용하여 ED₅₀ 값을 계산하였다 (표 7).

표 7은 탈인산화 형태의 펩티드 1 및 펩티드 2가 마우스에서 상부 GI 통과 모델에서 경구 투여될 때 그의 각각의 펩티드와 비교할 때 감소된 효력을 나타냈음을 보여준다.

실시예 5: 래트 장 루프에서의 액 분비

본원에 기재된 GC-C 효능제 펩티드를 야생형 래트에서 단리된 루프 내로 직접적으로 주사함으로써 분비에 대한 GC-C 효능제 펩티드의 영향을 연구하였다.

래트의 소장에서 3개의 루프를 외과적으로 결찰시킴으로써 루프를 단리하였다. 결찰 루프 형성 방법은 문헌 [London et al., 1997, Am J Physiol, p.G93-105]에 기재된 것과 유사하였다. 루프들을 대충 중심부에 1-3 cm의 길이로 두었다. 루프에 200 μL의 펩티드/GC-C 효능제 (0.1-5 ㎍) 또는 비히클 (20 mM 트리스, pH 7.5 또는 크렙스 링거액 (Krebs Ringer), 10 mM 글루코스, HEPES 완충제 (KRGH))를 주입하였다. 90분 이하의 회복 시간 후 루프를 절제해 냈다. 그 안에 함유된 액의 제거 전후에 각각의 루프의 중량을 기록하였다. 각각의 루프의 길이를 또한 기록하였다. 각각의 루프에 있어서 중량 대 길이의 비 (W/L)를 계산하여 분비에 대한 본원에 기재된 GC-C 효능제 펩티드의 영향을 결정하였다. 루프액 부피를 또한 결정하였다.

래트에서 결찰 십이지장 루프에 있어서 액 분비의 증가, pH 증가 및 비카르보네이트 분비를 보여주는 데이터를 도 2 및 표 8에 제시하였다. 도 2는 펩티드 2가 결찰 래트 십이지장 루프에서의 액 축적의 유도와 관련하여 펩티드 4의 것과 유사한 효력을 가짐을 보여준다. 표 8은 루프당 2.5 ㎍의 펩티드를 이용한 결찰 래트 십이지장 루프에서의 결과를 제공한다.

실시예 6: 마우스 공장 루프액에서의 시험관내 대사

이 연구의 목적은 마우스 공장 루프액에서의 인산화 펩티드의 안정성을 결정하는 것이었다. 펩티드 2, 탈인산화된 펩티드 2 (데포스포-펩티드 2), 펩티드 3, 및 방사성 동위원소 표지된 펩티드 2를 본 연구에서 사용하였다. 방사성 동위원소 표지된 펩티드 2는 ¹³C, ¹⁵N-표지된 알라닌 및 류신을 이용하여 합성하였다 (즉, 서열 CCpS[¹³C_{6 ,} ¹⁵N]LCCNP[¹³C_{6 ,} ¹⁵N]ACTGC를 가짐).

각각의 펩티드는 아메리칸 펩티드 컴퍼니, 인크. (American Peptide Company, Inc.)가 합성하였으며, 이를 -20℃에서 건조 보관하였다. 마우스 장 루프액 검정을 행하기 직전에 pH 8의 1 M 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄 히드로클로라이드 (트리스-HCl) 중에서 비표지 펩티드 각각의 1 mg/mL 용액을 제조하였다. 물 중 0.1% 포름산 중에 ¹³C, ¹⁵N-표지 펩티드 2의 500 ng/mL 용액을 제조하고, 이를 이용하여 공장 샘플을 희석시켰는데, 이는 검정후의 LC-MS/MS 분석을 위한 것이었다.

시험관내에서 펩티드 2, 데포스포-펩티드 2, 및 펩티드 3의 대사를 연구하기 위하여, 펩티드를 마우스의 소장 내의 결찰 루프로부터 추출한 마우스 공장액에서 인큐베이션하였다. 상기 액의 수집을 위하여, 마우스를 밤새 단식시키고, 이때 물에는 충분히 접근하게 하였다. 그 후 상기 마우스를 수술을 위하여 이소플루오란으로 마취시키고, 개복 수술을 하였으며, 여기서 소장이 노출되었다. 위의 유문 괄약근으로부터 7 cm에서 시작하여 봉합사를 이용하여 길이가 3 내지 4 cm인 공장 루프를 만들었다. 일단 루프가 형성되면, 이것에 200 μL의 포스페이트 완충 염수 (PBS) 완충제 (10 mM, pH 7.4)를 주입하였다. 그 후 상기 동물의 복부의 벽 및 피부를 봉합하고, 동물을 30분 동안 회복시켰다. 회복 후, 상기 동물을 희생시키고, 그 후 루프를 절개해 내고, 내부의 액을 회수하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

각각의 펩티드에 있어서, 25 μL의 1 mg/mL의 펩티드 스톡 용액을 25 μL의 1 M 트리스-HCl과, 25 μL의 10x 송아지 장 포스파타제 (calf intestinal phosphatase, CIP) 완충제 (500 mM 트리스-HCl, 1 M 염화나트륨 (NaCl), 0.1 mM 염화마그네슘 (MgCl₂)을 함유함, pH 8)에 첨가하였다. 175 μL의 마우스 공장 루프액 또는 175 μL의 대조 반응용의 pH 8의 1 M 트리스-HCl 완충제의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 각각의 펩티드의 최종 농도는 100 ㎍/mL이었다. 반응물을 플레이트 진탕기 상에서 계속적으로 혼합하고 37℃에서 유지하였다. 마우스 장 루프액을 첨가한지 0, 2, 5, 10, 20, 30, 60, 90 및 120분에, 25 μL의 분취물을 취하고, 25 μL의 4℃의 12% 트리클로로아세트산에 첨가하여 반응을 중지시켰다. 희석을 위하여 이들 반응물에 물 중 0.1% 포름산을 추가로 200 μL 첨가하였다. 그 후 20 μL의 각각의 샘플을 취하고 이것을 물 중 0.1% 포름산 480 μL에 첨가함으로써 이들 샘플을 추가로 희석시켰는데, 이는 500 ng/mL의 내부 표준물 13C, 15N-표지 펩티드 2를 함유하였다.

샘플 중 펩티드 2, 데포스포-펩티드 2, 및 펩티드 3의 농도를 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템을 갖춘 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)/MDS SCIEX API 4000 삼중 사중극자 질량 분광측정계를 이용하여 모든 샘플을 분석하였다. 질량 분광측정계는 분해능 설정치를 1.2 Da로 하여 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring, MRM) 모드로 작동시켰다. 각각의 화합물에 있어서의 기기 및 크로마토그래피 파라미터가 표 9에 요약되어 있다.

LC-MS/MS 데이터를 애널리스트 (Analyst) 버전 1.4.2 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈/MDS SCIEX)를 사용하여 처리하였다. 피크 면적 비 (분석물 피크 면적 대 내부 표준 피크 면적의 비)를 이용하여 각각의 펩티드의 잔류%를 계산하였다.

도 3은 마우스 공장액에서의 그리고 대조 반응물 (1 M 트리스-HCl)에서의 37℃에서의 120분의 인큐베이션 동안 측정한 9개의 시점에서 펩티드 2 및 데포스포-펩티드 2, 및 펩티드 3의 잔류%를 나타낸다. 마우스 공장 루프액에서의 인큐베이션 후, 단지 5.3%의 펩티드 2가 120분 후에 남아있었다. 대사산물인 데포스포-펩티드 2가 이 반응에서 형성되었으며, 이는 처음 20분 동안 농도가 증가하였고 그 후 남아있는 시간 동안 느린 감소를 나타냈다. 대조 반응에서, 펩티드 2는 대사되지 않았으며, 데포스포-펩티드 2는 전혀 형성되지 않았다. 마우스 공장액에서의 인큐베이션 후, 단지 5.6%의 데포스포-펩티드 2가 120분 후에 남아있었다. 이와는 대조적으로, 데포스포-펩티드 2는 대조 반응에서 대사되지 않았다. 펩티드 3은 마우스 공장액에서 90분 후 급속하게 대사되어 검출되지 않았다. 대조 반응에서, 펩티드 3은 대사되지 않았다.

펩티드 2, 그의 대사산물인 데포스포-펩티드 2, 및 펩티드 3은 마우스 공장 루프액에서 대사되었다. 펩티드 2를 37℃에서 마우스 공장 루프액에서 인큐베이션할 때 데포스포-펩티드 2의 형성이 관찰되었다. 데포스포-펩티드 2 및 펩티드 3은 마우스 장액에서 펩티드 2보다 더 빠르게 분해되었다.

실시예 7: 스트레포조토신 ( STZ )-유도된 당뇨병 래트에서의 액체 위 배출

스트레포조토신 (STZ)-유도된 당뇨병 래트에서 액체 위 배출 (LGE)에 대한 위관 영양법을 통하여 투여된 펩티드 2 및 3의 영향을 연구하였다. 체중이 약 300 g인 성체 수컷 래트 (스프라그-돌리 (Sprague-Dawley); n = 60) (타코닉 (Taconic)에 의해 공급됨)를 실온 (22℃) 및 광 (12:12 h의 명암 주기)의 제어된 조건에서 수용하고, 이때 음식과 물에 자유롭게 접근하게 하였다. 1주일의 순응 기간 후, 제I형 당뇨병 유도를 위한 STZ 프로토콜을 개시하였다.

STZ 실험군 (n = 50) 내의 동물에서 제I형 당뇨병을 유도하기 위하여, 시트레이트 완충제 중에 함유된 STZ (20 mg/kg)의 매일 요법의 복강내 주사제를 5일 동안 투여하였다. 대조군은 동일한 주사 스케줄에 걸쳐 동일한 부피의 비히클 (n = 10)을 투여받았다. 모든 동물에게는 주사로부터의 당뇨병 발병/회복을 위하여 9주를 제공하였다. 혈당 수준은 STZ 주사 5일 후에 0일 (즉, 6일째), 및 1, 2 및 10주 (즉, 10주의 시작 - 실험일)에 모니터링하였다. 혈액을 심장으로부터 직접적으로 채혈한 액체 위 배출 (LGE) 실험일 (10주의 시작)을 제외하고는 혈액 샘플을 꼬리 정맥으로부터 취하였다.

LGE 절차는 6개의 군 (n = 10/군)을 포함하였으며, 이 중 5개의 군은 당뇨병 군이었고 하나의 군은 비당뇨병 군이었다. LGE 실험 이전에, 음식을 밤새 주지 않았으며, 반면에 물은 위 배출 절차를 시작하기 2시간 전에 주지 않았다.

펩티드 3 및 펩티드 2를 0.1 mg/ml의 페놀 레드를 함유하는 20% 수크로스 용액의 비히클에 개별적으로 용해시켰다. 이용한 화합물의 약물 용량은 (mg/kg 단위로) 0.1 (펩티드 2 및 3), 0.3 및 1.0 (단지 펩티드 2)이었다. 그 후 LGE에 대한 이들의 영향을 시험하기 위하여, 0.5 ml 부피의 약물 용액을 당뇨병 동물의 위 또는 대조 동물의 위 내로 18-게이지 위관영양 니들 (길이: 6 cm)을 통하여 전달하였다. 당뇨병 실험군 내의 각각의 동물은 아이런우드 (Ironwood) 화합물 (펩티드 2 또는 3)의 단회 약물 용량을 받았다. 비당뇨병 군에서는 동물에게 유사한 부피의 비히클 용액만을 투여하였다. 그 후 모든 동물은 위 배출이 일어나게 하기 위하여 15분을 허용하였으며, 그 후 상기 동물을 이소플루란으로 안락사시켰다.

안락사 후, 개복 수술을 통하여 위에 접근하고, 위를 각각의 동물에서 하부 식도 괄약근 및 유문 괄약근에서 결찰시켰다. 다음, 횡경막에서의 절개를 통하여 심장을 노출시키고, 혈액 샘플을 취하고, 글루코스 수준을 혈당측정기로 평가하였다. 그 후 위를 동물로부터 절제하고, 95% 에탄올을 함유하는 10 ml 튜브에서 밤새 보관하였다. 다음, 상기 조직을 균질화하고, 원심분리하고 (40,000 g에서 30분 동안 2회), 상청액을 분광광도계 (바이오메이트 (BioMate) 3, 서모스펙트로닉, 인크. (Thermospectronic, Inc.))에서 410 nm의 파장에서 흡광도에 대하여 검사하였다. 결과는 각각의 군에 있어서 즉각적으로 희생시켜 그의 위를 꺼내어 "보유된 퍼센트"를 결정한 동물의 위에 수크로스/페놀 레드 용액을 투여한 것으로부터 도출한 "제로 값"과 비교하였다.

데이터는 15분의 시점에서 희생시킨 동물에서 보유된 액체의 백분율 평균 (±SEM) 측면에서 분석하였다. 통계적 유의도는 ANOVA 및 스튜던트-뉴만-쿨스 (Student-Newman-Keuls) 사후 비교 검정을 이용하여 결정하였다. 통계적 유의도를 P < 0.05에서 확립하였다.

STZ 당뇨병 동물 및 대조 동물 둘 모두의 공복 글루코스 수준은 위 배출 실험일에 > 300 mg/dL였다. STZ 당뇨병 동물의 전체 중량은 실험일에 비당뇨병 동물보다 인지가능하게 더 적었다 (평균 약 150 g). 두 군 모두의 동물은 STZ를 이용한 처리 시점에 대략 300 g에서 시작하였으며, 비처리 동물은 LGE 처리 전 10주에 걸쳐 평균 130 g 증가한 반면, STZ 당뇨병 동물은 단식할 때까지 (평균 약 280 g) 이 일정한 체중 (대략 300 g)에 머물렀다.

STZ-유도된 당뇨병 래트 (9주)에서 LGE에 대한 펩티드 2 및 3의 영향을 결정하기 위하여 실험을 행하였다. 펩티드 3의 1가지 용량 (0.1 mg/kg) 및 펩티드 2의 3가지 용량을 평가하였다. 데이터 (도 4)는 하기를 나타낸다:

STZ-유도된 당뇨병 래트는 대조 래트와 비교하여 15분의 비히클 투여 후 액체 먹이의 위 배출에 있어서 유의한 지연을 나타낸다 (대조군에 있어서 45.34±7.1%와 비교하여 88.24±7.12%의 보유율).

STZ 당뇨병 동물과 대조군 사이의 이러한 유의한 차이는 스튜던트-뉴만-쿨스 사후 다중 비교 검정에 의해 계산할 때 펩티드 2 및 펩티드 3을 투여한 당뇨병 동물까지 또한 확장되었다. 펩티드 2의 경우, 더욱 큰 2가지 용량 (0.3 및 1.0 mg/kg)은 비히클 용액만을 받은 당뇨병 동물과 비교할 때 LGE를 유의하게 향상시켰다.

본 연구의 결과는 비당뇨병 대조군과 비교하여 STZ-유도된 당뇨병 동물 (비히클을 제공함)에서 LGE의 속도의 유의한 지연이 있었음을 보여주었다. 더욱이, 사후 다중 비교 검정 (스튜던트-뉴만-쿨스)을 이용한 일원 배치 분산 분석 (ANOVA)은 펩티드 3 (0.1 mg/kg) 또는 펩티드 2 (0.3 또는 1.0 mg/kg)를 받은 동물과 비교하여 비히클 용액을 경구 투여한 STZ-당뇨병 동물들 사이에서 LGE에서의 통계적으로 유의한 차이가 존재하였음을 나타낸다. 그러나, 비히클 용액만을 받은 비당뇨병 대조군과 비교하면 이들 전술한 차이는 명백하지 않았다.

이러한 관찰은 LGE를 비당뇨병 대조군 수준의 것으로 회복시키는 데 있어서 펩티드 3이 연구한 용량 (0.1 mg/kg)에서 효과적이었음을 입증한다. 이와 유사하게, 경구적으로 제공한 0.3 및 1.0 mg/kg의 용량의 펩티드 2는 STZ-유도된 당뇨병 동물에서의 LGE를 정상 대조군의 것으로 회복시켰다. 최저 용량 (0.1 mg/kg)에서 펩티드 2는 LGE를 정상 대조군의 것으로 통계적으로 유의하게 회복시키지 못하였지만, 그럼에도 불구하고 결과는 보유된 액체의 퍼센트의 감소쪽으로의 시각적 추세를 나타냈다.

기타 실시양태

본 개시내용에서 참조된 모든 간행물 및 특허는 마치 가각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참고로 포함되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 특허 또는 간행물 중 임의의 것에서의 용어의 의미가 본 개시내용에서 사용되는 용어의 의미와 상충된다면, 본 개시내용에서의 용어의 의미가 우선하는 것으로 의도된다. 더욱이, 전술한 토의는 단지 본 발명의 예시적인 실시양태를 개시하고 기재한다. 당업자라면 하기 특허청구범위에 규정된 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고서 다양한 변화, 변형 및 변동이 그 안에서 행해질 수 있음을 그러한 토의로부터 그리고 첨부된 도면 및 특허청구범위로부터 쉽게 인식할 것이다.

SEQUENCE LISTING Sequence Listing - Amendment - Rule 13ter <110> Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Currie, Mark G. Fretzen, Angelika Kessler, Marco Zimmer, Daniel P. <120> Treatments of Gastrointestinal Disorders <130> 223355/077PCT1/304577 <140> PCT/US2010/056042 <141> 2010-11-09 <150> 61/259,264 <151> 2009-11-09 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa1 is Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, b-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, gamma-carboxylated Asp, Glu, D-Glu, gamma-carboxylated Glu, a-aminosuberic acid (Asu), a-aminoadipic acid (Aad), a-aminopimelic acid (Apm), or is absent <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> if Xaa1 is present, Xaa1 may be modified on its amino group by methyl, ethanedioic acid, propanedioic acid, butanedioic acid, pentanedioic acid, hexanedioic acid, heptanedioic acid or octanedioic acid <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2) <223> if Xaa1 is absent and Xaa2 is present, then Xaa2 may be modified on its amino group by methyl, ethanedioic acid, propanedioic acid, butanedioic acid, pentanedioic acid, hexanedioic acid, heptanedioic acid or octanedioic acid <220> <221> VARIANT <222> (1)..(3) <223> if both Xaa1 and Xaa2 are absent, then Xaa3 may be modified on its amino group by methyl, ethanedioic acid, propanedioic acid, butanedioic acid, pentanedioic acid, hexanedioic acid, heptanedioic acid or octanedioic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa2 and Xaa3 are independently Asp, gamma-carboxylated Asp, Glu, gamma-carboxylated Glu, Asu, Aad, Apm, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa4 is Cys or D-Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa6 is P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, 4-hydroxyvaline phosphate, P-homo-Thr, P-Cys or P-Tyr <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa6 may be any amino acid that may be phosphorylated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa7 is Tyr, Leu, Phe or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa8 is Cys or D-Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa14 is Thr, Ala or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa16 is Cys or D-Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa17 is Tyr, D-Tyr, or is absent <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Asn Pro Ala Cys Xaa Gly Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 2 Asp Asp Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 3 Asp Asp Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 4 Asp Asp Cys Cys Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 5 Asp Asp Cys Cys Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <400> 6 Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <400> 7 Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <400> 8 Cys Cys Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <400> 9 Cys Cys Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <400> 10 Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <400> 11 Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <400> 12 Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <400> 13 Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Tyr <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Tyr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Tyr, D-Tyr, or is absent <400> 15 Cys Cys Ser Xaa Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Xaa 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> [13C6, 15N] Radiolabelled. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> [13C6, 15N] Radiolabelled. <400> 16 Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 1 5 10

Claims (83)

1. 하기의 아미노산 서열 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
   Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Cys₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Xaa₁₄ Gly₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇
   상기 서열에서,
   Xaa₁은 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, D-Glu, γ-카르복실화 Glu, α-아미노수베르산 (Asu), α-아미노아디프산 (Aad), α-아미노피멜산 (Apm)이거나, 부재하며;
   Xaa₂는 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하고;
   Xaa₃은 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하며;
   Xaa₄는 Cys 또는 D-Cys이고;
   Xaa₆은 P-Ser, P-Thr, P-호모-Ser, 4-히드록시발린 포스페이트, P-호모-Thr, P-Cys 또는 P-Tyr이며;
   Xaa₇은 Tyr, Leu, Phe 또는 Ile이고;
   Xaa₈은 Cys 또는 D-Cys이며;
   Xaa₁₄는 Thr, Ala 또는 Phe이고;
   Xaa₁₆은 Cys 또는 D-Cys이며;
   Xaa₁₇은 Tyr, D-Tyr이거나, 부재하고;
   여기서,
   Xaa₁이 존재할 경우, Xaa₁은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나;
   Xaa₁이 부재하고 Xaa₂가 존재한다면, Xaa₂는 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나; 또는
   Xaa₁ 및 Xaa₂ 둘 모두가 부재한다면, Xaa₃은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있다.
2. 제1항에 있어서, Xaa₂ 및 Xaa₃ 둘 모두가 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 용되는 염.
3. 제1항에 있어서, Xaa₂가 Asp 또는 Glu이며, Xaa₃이 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
4. 제1항에 있어서, Xaa₂가 Asp 또는 Glu이며, Xaa₃이 Asp 또는 Glu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₇이 Tyr 또는 Leu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₁₄가 Thr인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₁₇이 Tyr이거나 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₁이 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu 또는 D-Glu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
9. 제8항에 있어서, Xaa₁이 Asp, D-Asp, Glu 또는 D-Glu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₆이 P-Ser 또는 P-Thr인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
11. 제10항에 있어서, Xaa₆이 P-Ser인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
12. 제1항에 있어서, Xaa₁, Xaa₂ 및 Xaa₃이 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
13. 제12항에 있어서, Xaa₇이 Tyr 또는 Leu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, Xaa₁₄가 Thr인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₁₇이 Tyr이거나 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₆이 P-Ser인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
17. 제16항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Cys₄ Cys₅ P-Ser₆ Xaa₇ Cys₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Thr₁₄ Gly₁₅ Cys₁₆ Xaa₁₇
    상기 서열에서, Xaa₇은 Tyr 또는 Leu이다.
18. 제1항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
    Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
    Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
    Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
    Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
    Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
    Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; 또는
    Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 50, 40, 30 또는 20개 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
20. 제19항에 있어서, 19, 18, 17, 16, 15 또는 14개 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
21. 하기 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Cys₅ Xaa₆ Xaa₇ Cys₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Xaa₁₄ Gly₁₅ Cys₁₆ Xaa₁₇
    상기 서열에서,
    Xaa₁은 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, D-Glu, γ-카르복실화 Glu, α-아미노수베르산 (Asu), α-아미노아디프산 (Aad), α-아미노피멜산 (Apm)이거나, 부재하며;
    Xaa₂는 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하고;
    Xaa₃은 Asp, γ-카르복실화 Asp, Glu, γ-카르복실화 Glu, Asu, Aad, Apm이거나, 부재하며;
    Xaa₄는 Cys 또는 D-Cys이고;
    Xaa₆은 P-Ser, P-Thr, P-호모-Ser, 4-히드록시발린 포스페이트, P-호모-Thr, P-Cys 또는 P-Tyr이며;
    Xaa₇은 Tyr, Leu, Phe 또는 Ile이고;
    Xaa₈은 Cys 또는 D-Cys이며;
    Xaa₁₄는 Thr, Ala 또는 Phe이고;
    Xaa₁₆은 Cys 또는 D-Cys이며;
    Xaa₁₇은 Tyr, D-Tyr이거나, 부재하고;
    여기서,
    Xaa₁이 존재할 경우, Xaa₁은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나;
    Xaa₁이 부재하고 Xaa₂가 존재한다면, Xaa₂는 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있거나; 또는
    Xaa₁ 및 Xaa₂ 둘 모두가 부재한다면, Xaa₃은 그의 아미노 기에서 메틸, 에탄디오산, 프로판디오산, 부탄디오산, 펜탄디오산, 헥산디오산, 헵탄디오산 또는 옥탄디오산에 의해 변형될 수 있다.
22. 제21항에 있어서, Xaa₂ 및 Xaa₃ 둘 모두가 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
23. 제21항에 있어서, Xaa₂가 Asp 또는 Glu이며, Xaa₃이 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
24. 제21항에 있어서, Xaa₂가 Asp 또는 Glu이며, Xaa₃이 Asp 또는 Glu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₇이 Tyr 또는 Leu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₁₄가 Thr인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₁₇이 Tyr이거나 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₁이 Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu 또는 D-Glu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
29. 제28항에 있어서, Xaa₁이 Asp, D-Asp, Glu 또는 D-Glu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₆이 P-Ser 또는 P-Thr인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
31. 제30항에 있어서, Xaa₆이 P-Ser인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
32. 제21항에 있어서, Xaa₁, Xaa₂ 및 Xaa₃이 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
33. 제32항에 있어서, Xaa₇이 Tyr 또는 Leu인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
34. 제32항 또는 제33항에 있어서, Xaa₁₄가 Thr인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₁₇이 Tyr이거나 부재하는 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa₆이 P-Ser인 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
37. 제36항에 있어서, 하기 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Cys₄ Cys₅ P-Ser₆ Xaa₇ Cys₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Thr₁₄ Gly₁₅ Cys₁₆ Xaa₁₇
    상기 서열에서, Xaa₇은 Tyr 또는 Leu이다.
38. 제32항에 있어서, 하기 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
    Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
    Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
    Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
    Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
    Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
    Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; 또는
    Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.
39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
40. 제39항에 있어서, 정제된 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
42. 제약상 허용되는 담체, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및 (i) Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 또는 Al^{3 +}로부터 선택된 양이온, 또는 (ii) 입체 장애 1급 아민으로부터 선택된 하나 이상의 작용제를 포함하는 제약 조성물.
43. 제42항에 있어서, 상기 작용제가 Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 또는 Al^{3 +}인 제약 조성물.
44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 또는 Al^{3 +}가 아세트산마그네슘, 염화마그네슘, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산칼슘, 염화칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 아세트산아연, 염화아연, 인산아연, 황산아연, 아세트산망가니즈, 염화망가니즈, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 아세트산칼륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 황산칼륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 아세트산알루미늄, 염화알루미늄, 인산알루미늄 또는 황산알루미늄으로서 제공되는 것인 제약 조성물.
45. 제42항에 있어서, 상기 작용제가 입체 장애 1급 아민인 제약 조성물.
46. 제45항에 있어서, 입체 장애 1급 아민이 아미노산인 제약 조성물.
47. 제46항에 있어서, 아미노산이 천연 아미노산, 비천연 아미노산 또는 아미노산 유도체인 제약 조성물.
48. 제47항에 있어서, 천연 아미노산이 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 트립토판 또는 발린이거나, 또는 비천연 아미노산이 1-아미노시클로헥산 카르복실산, 란타닌 또는 테아닌인 제약 조성물.
49. 제42항에 있어서, 입체 장애 1급 아민이 하기의 화학식을 갖는 것인 제약 조성물.
    

    

    
    상기 식에서, R₁, R₂ 및 R₃은 독립적으로 H, C(O)OH, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알킬에테르, C₁-C₆ 알킬티오에테르, C₁-C₆ 알킬 카르복실산, C₁-C₆ 알킬 카르복실아미드 및 알킬아릴로부터 선택되고, 여기서, 임의의 기는 할로겐 또는 아미노로 단일 또는 다중 치환될 수 있으며, 단, R₁, R₂ 및 R₃ 중 하나 이하는 H이다.
50. 제49항에 있어서, 입체 장애 1급 아민이 시클로헥실아민 또는 2-메틸부틸아민인 제약 조성물.
51. 제42항에 있어서, 입체 장애 1급 아민이 중합체성 아민인 제약 조성물.
52. 제51항에 있어서, 중합체성 아민이 키토산인 제약 조성물.
53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 또는 Al^{3 +}를 추가로 포함하는 제약 조성물.
54. 제50항에 있어서, 상기 Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, K⁺, Na⁺ 또는 Al^{3 +}이 아세트산마그네슘, 염화마그네슘, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산칼슘, 염화칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 아세트산아연, 염화아연, 인산아연, 황산아연, 아세트산망가니즈, 염화망가니즈, 인산망가니즈, 황산망가니즈, 아세트산칼륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 황산칼륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 아세트산알루미늄, 염화알루미늄, 인산알루미늄 또는 황산알루미늄으로서 제공되는 것인 제약 조성물.
55. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
56. 제55항에 있어서, 상기 항산화제가 BHA, 비타민 E 또는 프로필 갈레이트인 제약 조성물.
57. 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 결합제 또는 첨가제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
58. 제57항에 있어서, 제약상 허용되는 결합제 또는 첨가제가 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈 (포비돈), 전분, 말토덱스트린 또는 셀룰로스 에테르로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
59. 제58항에 있어서, 제약상 허용되는 결합제 또는 첨가제가 폴리비닐 알콜인 제약 조성물.
60. 제59항에 있어서, 제약상 허용되는 결합제 또는 첨가제가 셀룰로스 에테르인 제약 조성물.
61. 제60항에 있어서, 셀룰로스 에테르가 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시에틸 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
62. 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 충전제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
63. 제62항에 있어서, 제약상 허용되는 충전제가 셀룰로스, 이소몰트, 만니톨, 락토스 또는 이염기성 인산칼슘인 제약 조성물.
64. 제63항에 있어서, 셀룰로스가 초미세 셀룰로스 및 미세결정질 셀룰로스로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
65. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
66. 제65항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 진통제, 항우울제, 위장관 운동 촉진 또는 항진제, 구토 방지제, 항생제, 양성자 펌프 억제제, 산 차단제, PDE5 억제제, 산 펌프 길항제, GABA-B 효능제, 담즙산 봉쇄제 또는 점막 보호제 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
67. 제41항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 포함하는 투여 단위.
68. 제67항에 있어서, 캡슐 또는 정제인 투여 단위.
69. 제69항에 있어서, 각각이 5 ㎍ 내지 1 mg 의 상기 펩티드를 포함하는 투여 단위.
70. 제41항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 위장 장애를 치료하는 방법.
71. 제70항에 있어서, 상기 위장 장애가 위마비, 수술 후 위장폐색, 기능성 식도 장애, 기능성 위십이지장 장애, 위식도 역류 질환 (GERD), 셀리악병, 점막염, 또는 십이지장 또는 위 궤양인 방법.
72. 제71항에 있어서, 상기 위장 장애가 위마비인 방법.
73. 제72항에 있어서, 상기 위마비가 특발성, 당뇨병성 또는 수술 후 위마비인 방법.
74. 제71항에 있어서, 상기 위장 장애가 수술 후 위장폐색인 방법.
75. 제71항에 있어서, 상기 위장 장애가 기능성 식도 장애인 방법.
76. 제75항에 있어서, 상기 기능성 식도 장애가 기능성 흉부 작열감, 식도 기원으로 추정되는 기능성 흉통, 기능성 연하 곤란 또는 구감 (globus)인 방법.
77. 제71항에 있어서, 상기 위장 장애가 기능성 위십이지장 장애인 방법.
78. 제77항에 있어서, 상기 기능성 위십이지장 장애가 기능성 소화불량, 트림 장애, 오심 또는 구토 장애, 또는 되새김 증후군인 방법.
79. 제78항에 있어서, 상기 기능성 소화불량이 식후 불편 증후군 또는 명치 통증 증후군인 방법.
80. 제78항에 있어서, 상기 트림 장애가 공기 연하증 또는 상세불명 과다 트림인 방법.
81. 제78항에 있어서, 상기 오심 또는 구토 장애가 만성 특발성 오심, 기능성 구토 또는 주기성 구토 증후군인 방법.
82. 제71항에 있어서, 상기 위장 장애가 위식도 역류 질환 (GERD)인 방법.
83. 제71항에 있어서, 상기 위장 장애가 십이지장 또는 위 궤양인 방법.
    

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