ES2620153T3 - Tratamientos para trastornos gastrointestinales - Google Patents

Abstract

Un péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que dicho péptido comprende la secuencia de aminoácidos**Fórmula**

Description

DESCRIPCION

Tratamientos para trastornos gastrointestinales

CAMPO DE LA INVENCION

5

[0001] Esta invencion se refiere a peptidos, composiciones y su uso en procedimientos para tratar trastornos gastrointestinales superiores.

ANTECEDENTES

10

[0002] La dispepsia funcional (DF) y la gastroparesia (GP) son trastornos gastrointestinales (GI) superiores que se caracterizan colectivamente por slntomas que incluyen distension abdominal, dolor epigastrico (abdominal superior) y/o ardor, nauseas, vomitos y saciedad temprana. Las opciones terapeuticas para pacientes de DF y GP son extremadamente limitadas, debido tanto a la falta de eficacia como a los perfiles de seguridad pobres para las terapias

15 existentes. La dispepsia se define como la presencia de uno o mas slntomas de dispepsia (dolor epigastrico, ardor, plenitud postprandial molesta, y saciedad temprana) que se consideran originarse desde la region gastroduodenal, en ausencia de cualquier trastorno organico, sistemico, o metabolico que probablemente explique los slntomas (ver Drossman, D. A., ed., Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders, 3rd Ed., McLean, VA: Degnon Associates, Inc., 2006). La DF se refiere a la dispepsia que no tiene explicacion estructural tras las investigaciones medicas 20 estandar, incluyendo la endoscopia superior. Los mecanismos patofisiologicos que pueden estar implicados en la DF incluyen, entre otros, vaciamiento gastrico retardado, acomodacion gastrica descompasada, hipersensibilidad a la distension gastrica, sensibilidad duodenal alterada a llpidos o acido, y motilidad duodenoyeyunal. La exposicion prolongada al acido duodenal tambien se ve en algunos pacientes de DF y GP, y esta exposicion puede retardar el vaciamiento gastrico y provocar slntomas similares a los de la DF y GP. La dispepsia es un slndrome comun que 25 representa aproximadamente el 30 % de los casos vistos de gastroenteritis, con la DF representando aproximadamente el 60 % de tales casos de dispepsia.

[0003] El GP se refiere a movilidad gastrica anormal caracterizada por un retraso en el vaciamiento gastrico en ausencia de obstruccion gastrica. El GP puede ser idiopatico o puede provocarse por diversas condiciones, incluyendo

30 diabetes mellitus de Tipo I o de Tipo II, infeccion vlrica, esclerodermia, trastornos del sistema nervioso tal como la enfermedad de Parkinson, trastornos metabolicos tales como impotirodismo, Ileo postoperatorio, y ciertos medicamentos, que incluyen medicamentos narcoticos para el dolor, los antidepresivos triclclicos los bloqueadores de canales de calcio. El tratamiento para el cancer, que incluye farmacos quimioterapicos y radiacion en el pecho y abdomen tambien puede provocar gastroparesia, tanto temporal como permanentemente. Los slntomas mas comunes 35 son la nausea, vomitos, distension abdominal, dolor epigastrico, perdida de peso y saciedad temprana. La gastroparesia es una condition cronica que puede llevar a hospitalizaciones frecuentes, disminucion de la calidad de vida, y aumento de la incapacidad y, en casos graves, aumento de la mortalidad. El GP sintomatico grave es comun en individuos que sufren diabetes, que afecta del 5 al 10 % de los diabeticos en una poblacion total de pacientes de 1 millon solo en los Estados Unidos.

40

[0004] Las opciones de tratamiento convencional para la FD y el GP, as! como otros trastornos gastrointestinales superiores, han sido de eficacia limitada para muchos pacientes. Por lo tanto, existe una necesidad para nuevos compuestos y procedimientos de tratamiento de la DF, el GP y otros trastornos gastrointestinales.

45 RESUMEN

[0005] La presente invencion proporciona un peptido o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo como se define en las reivindicaciones adjuntas. Tambien se proporcionan composiciones farmaceuticas y unidades de dosificacion como se define en las reivindicaciones adjuntas.

50

[0006] Mas generalmente, la presente divulgation presenta peptidos, composiciones y procedimientos relacionados para tratar trastornos y condiciones gastrointestinales (por ejemplo, GP, Ileo gastrico postoperatorio, un trastorno funcional del esofago, un trastorno funcional gastroduodenal, enfermedad por reflujo gastroesofagico (ERGE), o una ulcera duodenal o estomacal) as! como otras condiciones y trastornos se describen en el presente

55 documento. Las composiciones presentan peptidos que activan el guanilato-ciclasa C (CG-C) en el GI superior pero activa el GC-C en el GI inferior mucho mas debilmente o nada en absoluto. Sin ser obligatorio por ninguna teorla particular, los peptidos de la divulgacion son utiles porque pueden aliviar los slntomas de los trastornos GI superiores (total o en parte aumentando la movilidad GI superior y/o reduciendo el dolor/molestia epigastrica y la hinchazon abdominal) si provocar efectos pronunciados en el tacto GI inferior (por ejemplo, alteraciones de limitation de dosis

en los habitos intestinales, incluyendo diarrea) en niveles de dosis y frecuencia de dosificacion suficientes para reducir los sintomas GI superiores. Los peptidos de la divulgacion tambien son utiles para mejorar el dolor y la molestia gastrointestinal.

5 [0007] Un aspecto de la presente divulgacion proporciona un peptido o una sal farmaceuticamente aceptable

del mismo, en el que el peptido comprende la secuencia de aminoacidos:

Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaas Cysg Asnio Proii Alai2 Cysi3 Xaai4 Glyi5 Xaai6 Xaai7, o una sal

farmaceuticamente aceptable del mismo; en el que

10 Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, p-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Asp Y-carboxilado, Glu, D-Glu, Glu Y-carboxilado, acido a-aminosuberico (Asu), acido a-aminoad^pico (Aad), acido a-aminopimelico (Amp),

esta ausente;

15

Xaa2 es Asp, Asp Y-carboxilado, Glu, Glu Y-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o esta ausente;

Xaa3 es Asp, Asp Y-carboxilado, Glu, Glu Y-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o esta ausente;

Xaa4 es Cys o D-Cys;

Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, fosfato de 4-hidroxivalina, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr; Xaa7 es Tyr, Leu, Phe o Ile; 20 Xaas es Cys o D-Cys;

Xaai4 es Thr, Ala o Phe;

Xaai6 es Cys o D-Cys; y

Xaai7 es Tyr, D-Tyr, o esta ausente;

25 en el que:

si Xaai esta presente, Xaai, puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico;

30

si Xaai esta ausente y Xaa2 esta presente, entonces Xaa2 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico; o

35 si tanto Xaai como Xaa2 estan ausentes, entonces Xaa3 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico.

[0008] Un segundo aspecto de la presente divulgacion proporciona composiciones farmaceuticas que 40 comprenden un peptido de la presente divulgacion.

[0009] Un tercer aspecto de la presente divulgacion proporciona procedimientos para tratar un trastorno gastrointestinal, que incluye administrar una composicion farmaceutica de acuerdo con la presente divulgacion.

45 [0010] Los detalles de una o mas realizaciones de la divulgacion se establecen en la descripcion adjunta.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

[0011]

50

La Figura iA ilustra la reaccion de un peptido ejemplar de la presente invencion con fosfatasa alcalina.

La Figura iB ilustra la hidrolisis del control p-nitrofenilfosfato mediante fosfatasas.

La Figura 2 presenta un ejemplo que muestra que el Peptido 2 y el Peptido 4 promocionan la secrecion de fluido duodenal.

55 La Figura 3 presenta los resultados de un estudio sobre la estabilidad del Peptido 2, el Defosfopeptido 2, y el Peptido 3 en fluido intestinal (yeyuno) de raton.

La Figura 4 presenta los resultados de un estudio sobre el efecto de los Peptidos 2 y 3 sobre un vaciado de liquido gastrico en ratas diabeticas inducidas por STZ.

[0012] Estas figuras se proporcionan a modo de ejemplo y no se dirigen a limitar el ambito de la presente invencion.

DESCRIPCION DETALLADA

5

[0013] El guanilato ciclasa (CG-C) es un receptor transmembrana que se localiza en la superficie apical de las celulas epiteliales en el estomago y en el intestino. El receptor tiene un dominio extracelular de enlace a ligando, una region transmembrana unica y un dominio de guanilil ciclasa C-terminal. Cuando un ligando se une al dominio extracelular del GC-C, el dominio catalltico intracelular cataliza la produccion de cGMP a partir de GTP. In vivo, este

10 aumento en cGMP intracelular inicia una cascada de eventos que conduce a un aumento de secrecion de cloruro y bicarbonato en el diametro interior intestinal, aumento del pH luminal, disminucion de la absorcion de sodio luminal, aumento de la secrecion de fluido, y aceleracion del transito intestinal. El cGMP, que se segrega bidireccionalmente desde el epitelio en la mucosa y en el diametro interior, tambien se ha mostrado que amortigua el disparo de fibra aferente de tipo C, lo que sugiere un mecanismo potencial para los efectos analgesicos observados de agonistas GC- 15 C sobre dolor visceral.

[0014] La linaclotida, un peptido agonista GC-C que se administra de manera oral y actualmente en ensayos cllnicos para el tratamiento del slndrome de intestino irritable con estrenimiento (ISS-c) y estrenimiento cronico (CC), tiene numerosos efectos sobre la fisiologla GI que incluye: (1) dolor visceral reducido, (2) hinchazon reducida, y (3)

20 transito GI aumentado, que puede llevar a una mayor frecuencia de heces y consistencia de heces mejorada. La linaclotida administrada de manera oral actua localmente activando el GC-C en la superficie del diametro interior; no hay niveles detectables de linaclotida vistos sistematicamente despues de la administracion oral en niveles de dosis terapeutica. Por lo tanto, los resultados de los ensayos cllnicos de la linaclotida, as! como los estudios precllnicos que se han realizado con linaclotida y con peptidos relacionados, siguieren que los agonistas del peptido GC-C puede 25 usarse terapeuticamente.

[0015] Serla util tener un agonista GC-C que pudiera usarse para aliviar los trastornos y los slntomas GI superiores (por ejemplo, la dispepsia funcional (DF) y la gastroparesia (GP)) sin promover los efectos pronunciados sobre los habitos intestinales que pudieran resultar de la estimulacion de GC-C en las partes inferiores del tracto GI.

30 Un tal agonista GC-C disminuirla el potencial de los eventos GI inferiores adversos, incluyendo los habitos intestinales alterados y diarrea. El agonista del peptido GC-C descritos en el presente documento son mas activos en el tracto GI superior (por ejemplo, el estomago y el duodeno), y menos activos en el tracto GI inferior. Tales agonistas tendrlan beneficios en pacientes que sufren de trastornos GI superiores (por ejemplo, DF y GP) (1) reduciendo el dolor visceral a traves de la produccion de cGMP y/u otros mecanismos, (2) disminuyendo la distension abdominal, (3) aumentando 35 el vaciamiento gastrico y/o el transito del intestino delgado superior (por ejemplo, el transito duodenal), y (4) neutralizando acido en el duodeno promoviendo la secrecion de bicarbonato. De manera importante, estos agonistas, en virtud de su actividad dirigida al GI superior, podrlan aliviar los slntomas de la DF y GP sin provocar efectos pronunciados sobre los habitos intestinales (por ejemplo, esto podrla dar como resultado la estimulacion de GC-C en las partes inferiores del tracto GI).

40

[0016] En un aspecto, la divulgacion proporciona un nuevo agonista del peptido GC-C util para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, particularmente trastornos GI superiores tal como DF y GP. El agonista del peptido GC-C se disena para activarse en el GI superior, incluyendo el esofago, el estomago y el intestino delgado superior (duodeno) pero para ser menos activo conforme atraviesa el resto del intestino delgado y el intestino grueso. Los

45 peptidos de la divulgacion tambien son utiles para mejorar el dolor y la molestia gastrointestinal. El peptido agonista GC-C contiene un fosfoaminoacido, por ejemplo, una fosfoserina, para reemplazar un glutamato o aspartato conservado encontrado en otros peptidos agonistas GC-C. El fosfato de un fosfoaminoacido -OPO32-, tal como fosfoserina, es capaz de actuar como un biomimetico para el COO- de glutamato o aspartato de tal manera que el peptido que contiene el fosfoaminoacido es capaz de unirse a y activar el GC-C. El peptido que contiene 50 fosfoaminoacido puede desfosforilarse mediante fosfatos alcalinos intestinales, que reducen ampliamente el enlace GC-C y la actividad agonista del peptido. Los fosfatos alcalinos intestinales se encuentran a traves del tracto GI, y son mas activos en un entorno luminal alcalino, que incluye el intestino delgado. El peptido que contiene fosfoaminoacido es capaz de activar el GC-C en el tracto GI superior, incluyendo el entorno estomacal acido y el tracto GI superior, para promover la secrecion de fluido y de bicarbonato. Como el peptido promueve la secrecion aumentada de fluido y 55 bicarbonato en el GI superior, el diametro interior intestinal deviene mas alcalino, activando as! la actividad de la fosfatasa alcalina. Por lo tanto, a traves de la accion del peptido sobre el GC-C as! como del movimiento del peptido a traves del intestino, el fosfoaminoacido del peptido se convierte en aminoacido desfosforilado, reduciendo as! su actividad como un agonista GC-C conforme transita desde el GI superior hasta el inferior.

[0017] Tal como se usa en el presente documento, el termino "P-" que precede a un aminoacido o a una

abreviacion de tres letras del mismo, se refiere a un fosfoaminoacido. Por ejemplo, los terminos "P-Ser", "P-Thr", "P- Tyr", "P-Cys", "P-homo-Cys", "P-homo-Ser" y "P- homo-Thr" se refieren a fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina, fosfocistelna, fosfohomocistelna, fosfohomoserina, y fosfohomotreonina, respectivamente. Como se usa en el 5 presente documento, un fosfoaminoacido se refiere a un ester o tioester de un aminoacido y acido fosforico; por ejemplo, el hidrogeno sobre el alcohol o grupo funcional tiol se reemplaza por -P(O)(OH)2. Por ejemplo, P-Ser tiene la estructura

10

P-Thr tiene la estructura

imagen1

imagen2

15 P-Tyr tiene la estructura

imagen3

y P-Cys tiene la estructura

20

imagen4

[0018] En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del

mismo, en el que el peptido comprende la secuencia de aminoacidos 25

Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaas Cysg Asnio Pro-11 Alai2 Cysi3 Xaai4 Glyi5 Xaai6 Xaai7, o una sal

farmaceuticamente aceptable del mismo; en el que

Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, p-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Asp Y-carboxilado, 30 Glu, D-Glu, Glu Y-carboxilado, acido a-aminosuberico (Asu), acido a-aminoadlpico (Aad), acido a-aminopimelico (Amp), o esta ausente;

Xaa2 es Asp, Asp Y-carboxilado, Glu, Glu Y-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o esta ausente;

Xaa3 es Asp, Asp Y-carboxilado, Glu, Glu Y-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o esta ausente;

Xaa4 es Cys o D-Cys;

Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, fosfato de 4-hidroxivalina, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr;

5 Xaa7 es Tyr, Leu, Phe o Ile;

Xaa8 es Cys o D-Cys;

Xaa-M es Thr, Ala o Phe;

Xaa16 es Cys o D-Cys; y

Xaai7 es Tyr, D-Tyr, o esta ausente; en el que:

10

si Xaai esta presente, Xaai puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico;

15 si Xaai esta ausente y Xaa2 esta presente, entonces Xaa2 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico; o

si tanto Xaai como Xaa2 estan ausentes, entonces Xaa3 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, 20 acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico

[0019] En algunas realizaciones, tanto Xaa2 como Xaa3 estan ausentes. En otras realizaciones, Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 esta ausente. Aun en otras realizaciones, Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 es Asp o Glu.

25

[0020] En algunas realizaciones, Xaa7 es Tyr o Leu.

[0021] En algunas realizaciones, Xaai4 es Thr.

30 [0022] En algunas realizaciones, Xaai7 es Tyr o esta ausente.

[0023] En algunas realizaciones, Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, p-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr,

D-Thr, Asp, D-Asp, Glu o D-glu. En realizaciones adicionales, Xaai es Asp, D-Asp, Glu o D-glu.

35 [0024] En algunas realizaciones, Xaa6 es P-Ser o P-Thr. En realizaciones adicionales, Xaa6 es P-Ser.

[0025] En algunas realizaciones, Xaai, Xaa2 como Xaa3 estan ausentes y Xaa4 es D-Cys o Cys. En realizaciones adicionales, Xaa7 es Tyr o Leu. En realizaciones adicionales, Xaai4 es Thr. En realizaciones adicionales, Xaai7 es Tyr o esta ausente. En realizaciones adicionales, Xaa6 es P-Ser.

40

[0026] En algunas realizaciones, al menos uno entre Xaa4, Xaa8 o Xaai6 es Cys. En algunas realizaciones, al menos dos entre Xaa4, Xaa8 o Xaai6 son Cys. En algunas realizaciones, todos entre Xaa4, Xaa8 y Xaai6 son Cys. En algunas realizaciones, al menos uno entre Xaa4, Xaa8 o Xaai6 es D-Cys. En algunas realizaciones, al menos dos entre Xaa4, Xaa8 o Xaai6 son D-Cys. En algunas realizaciones, todos entre Xaa4, Xaa8 y Xaai6 son D-Cys.

45

[0027] En algunas realizaciones, se proporciona un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que el peptido comprende la secuencia de aminoacidos

Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cysg Asni0 Proii Alai2 Cysi3 Thri4 Glyi5 Cysi6 Xaai7, en la que Xaa7 es Tyr o Leu.

50 [0028] En algunas realizaciones, se proporciona un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en

el que el peptido comprende la secuencia de aminoacidos

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

[0029] En algunas realizaciones, se proporciona un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que el peptido no comprende mas de 50, 40, 30 o 20 aminoacidos. En realizaciones adicionales, el peptido no

5 comprende mas de 19, 18, 17, 16, 15 o 14 aminoacidos.

[0030] En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que el peptido consiste en la secuencia de aminoacidos

10 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Cys9 Asmo Prcrn Ala12 Cys13 Xaa14 Gly15 Xaa16 Xaa17, o una sal

farmaceuticamente aceptable del mismo; en el que

Xaa1 es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, p-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Asp Y-carboxilado, Glu, D-Glu, Glu Y-carboxilado, acido a-aminosuberico (Asu), acido a-aminoadfpico (Aad), acido a-aminopimelico 15 (Amp), o esta ausente;

Xaa2 es Asp, Asp Y-carboxilado, Glu, Glu Y-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o esta ausente;

Xaa3 es Asp, Asp Y-carboxilado, Glu, Glu Y-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o esta ausente;

Xaa4 es Cys o D-Cys;

20 Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, fosfato de 4-hidroxivalina, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr;

Xaa7 es Tyr, Leu, Phe o Ile;

Xaa8 es Cys o D-Cys;

Xaa14 es Thr, Ala o Phe;

Xaa16 es Cys o D-Cys; y Xaa17 es Tyr, D-Tyr, o esta ausente;

25

en el que:

si Xaa1 esta presente, Xaa1 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido 30 octanodioico;

si Xaa1 esta ausente y Xaa2 esta presente, entonces Xaa2 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico; o 35

si tanto Xaa1 como Xaa2 estan ausentes, entonces Xaa3 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico.

40 [0031] En algunas realizaciones, tanto Xaa2 como Xaa3 estan ausentes. En otras realizaciones, Xaa2 es Asp o

Glu y Xaa3 esta ausente. Aun en otras realizaciones, en las que Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 es Asp o Glu.

[0032] En algunas realizaciones, Xaa7 es Tyr o Leu.

[0033] En algunas realizaciones, Xaai4 es Thr.

[0034] En algunas realizaciones, Xaa17 es Tyr o esta ausente.

[0035] En algunas realizaciones, Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, p-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr,

D-Thr, Asp, D-Asp, Glu o D-glu. En realizaciones adicionales, Xaai es Asp, D-Asp, Glu o D-glu.

[0036] En algunas realizaciones, Xaa6 es P-Ser o P-Thr. En realizaciones adicionales, Xaa6 es P-Ser.

10

[0037] En algunas realizaciones, Xaai, Xaa2 y Xaa3 estan ausentes y Xaa4 es D-Cys o Cys. En realizaciones adicionales, Xaa7 es Tyr o Leu. En realizaciones adicionales, Xaai4 es Thr. En realizaciones adicionales, Xaai7 es Tyr o esta ausente. En realizaciones adicionales, Xaa6 es P-Ser.

i5 [0038] En algunas realizaciones, se proporciona un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en

el que el peptido consiste en la secuencia de aminoacidos

Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cysg Asnio Proii Alai2 Cysi3 Thri4 Glyi5 Cysi6 Xaai7, en la que Xaa7 es Tyr o Leu.

[0039] En algunas realizaciones, se proporciona un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en

20 el que el peptido consiste en la secuencia de aminoacidos

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

[0040] En algunos casos, el peptido se alsla. En otros, el peptido se purifica.

25

[0041] En algunas realizaciones, Xaa6 es cualquier aminoacido que puede fosforilarse.

[0042] En algunas realizaciones, se proporciona una sal farmaceuticamente aceptable del peptido. En algunos casos, la sal farmaceuticamente aceptable es una sal de cloruro.

30

Peptidos de variante

[0043] En algunas circunstancias puede desearse tratar pacientes con un peptido variante que se une a y activa los receptores GC-C intestinales, pero es menos activo o mas activo que la forma no variante del peptido. Puede surgir

35 actividad aumentada de afinidad aumentada para el receptor o una capacidad aumentada para activar el receptor una vez limitada o aumentada la estabilidad del peptido. Puede surgir actividad reducida de afinidad reducida para el receptor o una capacidad reducida para activar el receptor una vez limitada o reducida la estabilidad del peptido.

[0044] En algunos peptidos uno o ambos miembros de entre uno o ambos pares residuos Cys que normalmente 40 forman un enlace disulfuro se puede reemplazar por homocistelna, penicilamina, 3-mercaptoprolina (Kolodziej y col.

i996 Int J Pept Protein Res 48:274); p, p-dimetilcistelna (Hunt y col. i993 Int J Pept Protein Res 42:249) o acido diaminopropionico (Smith y col. i978 J Med Chem 2i:ii7) para formar enlaces transversales internos alternativos en

posiciones de enlaces disulfuro normales. En otras realizaciones, los vlncuios disulfuro pueden reemplazarse con reticulacion de hidrocarburos (Schafmeister y col. 2000 J Am Chem Soc 122:5891, Patgiri y col. 2008 Acc Chem Res 41:1289, Henchey y col. 2008 Curr Opin Chem Biol 12:692).

5 Production de peptidos

[0045] En una realization, los peptidos o los peptidos precursores de la divulgation se pueden producir por via recombinante en cualquier sistema de expresion de protelnas conocido, incluyendo, sin limitation a, bacterias (por ejemplo, E. coli o Bacillus subtilis), sistemas celulares de insectos (por ejemplo, sistemas celulares de Drosophila Sf9),

10 sistemas celulares de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. saccharomyces) o sistemas de expresion de hongos filamentosos, o sistemas de expresion celular de animales (por ejemplo, sistemas de expresion celular de mamlferos). Los peptidos o precursores de peptidos de la divulgacion tambien pueden sintetizarse de manera qulmica.

[0046] Si el peptido o peptido variante se producira por via recombinante, por ejemplo, en E. coli, la molecula

15 de acido nucleico que codifica el peptido puede codificar tambien una secuencia llder que permite la secretion del

peptido maduro desde la celula. Por lo tanto, la secuencia que codifica el peptido puede incluir la secuencia presecuencia y la prosecuencia de, por ejemplo, un peptido ST bacteriano que se genera de manera natural. El peptido maduro segregado puede purificarse desde el medio de cultivo.

20 [0047] La secuencia que codifica un peptido descrita en el presente documento puede insertarse en un vector

capaz de administrar y mantener la molecula de acido nucleico en una celula bacteriana. La molecula de ADN se puede insertar en un vector de replication autonoma (entre los vectores adecuados se incluyen, por ejemplo, pGEM3Z y pcDNA3, y derivados de los mismos). El acido nucleico puede ser un ADN bacteriano o ADN bacteriofago tal como lambda bacteriofaga o M13 y derivados de los mismos. La construction de un vector que contiene un acido nucleico

25 descrito en el presente documento puede seguirse por transformation de una celula huesped tal como una bacteria. Entre los huespedes bacterianos adecuados se incluyen, pero no se limitan a, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas y Salmonella. La construccion genetica tambien incluye, ademas de la codification de la molecula de acido nucleico, elementos que permiten la expresion, tal como un promotor y secuencias reguladoras. Los vectores de expresion pueden contener secuencias de control transcripcional que controla la initiation transcripcional, tal como secuencias

30 promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Una variedad de secuencias de control transcripcional son bien conocidas para los expertos en la materia. El vector de expresion puede incluir tambien una secuencia reguladora de traduction (por ejemplo, una secuencia 5' no traducida, una secuencia 3' no traducida, o un sitio de entrada del ribosoma interno). El vector puede ser capaz de realizar la replicacion autonoma o puede integrarse en el ADN huesped para garantizar la estabilidad durante la produccion del peptido.

35

[0048] La protelna que codifica la secuencia que incluye un peptido descrito en el presente documento puede fusionarse a un acido nucleico que codifica la etiqueta de afinidad, por ejemplo, glutationa S-transferasa (GST), protelna de enlace de maltosa E, protelna A, etiqueta de BANDERA, hexahistidina, etiqueta myc o etiqueta de la gripe HA, con el fin de facilitar la purification. La etiqueta de afinidad o fusion de informante une el marco de lectura del

40 peptido de interes al marco de lectura del gen que codifica la etiqueta de afinidad de tal manera que se genera una fusion traduccional. La expresion del gen de fusion da como resultado la traduccion de un unico peptido que incluye tanto el peptido de interes como la etiqueta de afinidad. En algunos casos en los que se utilizan las etiquetas de afinidad, la secuencia de ADN que codifica un sitio de reconocimiento de proteasa se fusionara entre los marcos de lectura para la etiqueta de afinidad y el peptido de interes.

45

[0049] Las construcciones y los procedimientos adecuados para la production de formas maduras e inmaduras de peptidos y variantes descritos en el presente documento en sistemas de expresion de protelnas diferentes a la bacteria, y bien conocidos para los expertos en la materia, tambien pueden usarse para producir peptidos en un sistema biologico.

50

[0050] Los peptidos producidos por via recombinante pueden fosforilarse usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia. En algunas realizaciones, se produce por via recombinante un peptido, se alsla de la celula en la que se expreso, y seguidamente se fosforila utilizando una protelna quinasa, por ejemplo, una quinasa de serina/treonina o una quinasa tirosina. Se conoce un gran numero de quinasas en la tecnica y pueden usarse para

55 este proposito. Alguien experto en la materia reconocera que las diferentes quinasas tienen especificidades de sustrato diferentes y seleccionaran una quinasa que se usara en la secuencia del peptido. En otras realizaciones, un peptido se produce por via recombinante en una celula que tambien expresa una quinasa de serina/treonina o una quinasa tirosina que fosforilara el peptido. En otras realizaciones, los peptidos pueden producirse por via recombinante incorporando un fosfoaminoacido. Los procedimientos para modificar el ARNt que incluyen, pero que no se limitan a,

modificar el anticodon, el sitio de fijacion del aminoacido, y o el vastago aceptador para permitir la incorporacion de aminoacidos no naturales y/o arbitrarios son conocidos en la materia (Biochem. Biophys. Res. Comm. (2008) 372: 480-485; Chem. Biol. (2009) 16:323-36; Nat. Methods (2007) 4:239-44; Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2006) 7:775-82; Methods (2005) 36:227-238; Methods (2005) 36:270-278; Annu. Rev. Biochem. (2004) 73:147-176; Nuc. Acids Res. 5 (2004) 32:6200-6211; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100:6353-6357; Royal Soc. Chem. (2004) 33:422-430).

[0051] En algunas realizaciones, los peptidos pueden producirse qulmicamente. Los peptidos pueden sintetizarse por una serie de diferentes procedimientos que incluyen la solucion y la slntesis de fase solida usando proteccion BOC o FMOC traduccional. Por ejemplo, el peptido puede sintetizarse sobre cloruro 2-Clorotritil o resina

10 Wang que usa acoplamientos de aminoacidos consecutivos. Se pueden usar los siguientes grupos de proteccion: Fluorenilmetiloxicarbonilo o ferf-butiloxicarbonilo (grupos alfa amino, N-terminal); tritilo o ferf-butilo (grupos tiol de Cy); ferf-butilo (Y-carboxilo de acido glutamico y el grupo hidroxilo de treonina, si esta presente); tritilo (funcion p-amida de la cadena lateral de asparagina y el grupo fenolico de la tirosina, si esta presente); tritilo o ferf-butildimetilsililo (grupo hidroxilo de serina, si esta presente) y ferf-butiloxicarbonilo (N-terminal antes de las modificaciones de la cadena lateral 15 posterior). El acoplamiento puede efectuarse con DIC o HOBt en presencia de una amina terciaria, y el peptido puede desprotegerse y eliminarse desde el soporte solido en el uso de un coctel K (acido trifluoroacetico 81 %, fenol 5 %, tioanisol 5 %, 1,2-etanoditiol 2,5 %, agua 3 %, dimetilsufida 2 %, yoduro de amonio 1,5 % p/p). Despues de retirar el acido trifluoroacetico y otros componentes volatiles el peptido puede precipitarse usando un disolvente organico. Se pueden formar enlaces disulfuro entre los residuos Cys usando dimetilsulfoxido (Tam y col. (1991) J. Am. Chem. Soc. 20 113 6657-62) o usando una estrategia de oxidacion de aire. El peptido resultante puede purificarse por cromatografla de fase inversa y liofilizarse.

[0052] Un fosfoaminoacido, por ejemplo, una fosfoserina, puede introducirse en un peptido mediante cualquier procedimiento conocido para alguien experto en la materia (ver, por ejemplo, G.K.Toth y col. (2007), Current Organic

25 Chemistry 11: 409-426). En algunas realizaciones, un fosfoaminoacido protegido analogo, por ejemplo, un analogo del aminoacido de fosfoserina, puede introducirse como parte de un ensamblaje de peptidos en fase solida; por ejemplo, como Fmoc-Ser[PO(OBzl)OH]-OH (T. Wakamiya y col. (1997), Bioorganic and Medicinal Chemistry 5: 135-145, 1997) o como Fmoc-Ser[PO(OAryl/Alkyl)2]-OH (G.K.Toth y col. (2007) Current Organic Chemistry, 11: 409-426). En otra realizacion, un aminoacido protegido analogo, por ejemplo, un analogo del aminoacido protegido de serina, puede 30 introducirse como parte de un montaje de peptidos en fase solida (por ejemplo, serina protegida por Fmoc con una proteccion de tritilo para la cadena lateral de hidroxilo). Despues del montaje completo de la cadena del peptido Ser[Trt] o Ser[SiMe2tBu] se puede desproteger de manera selectiva y el grupo fosfato puede introducirse usando una estrategia de fosforamidita / oxidacion (G. Shapiro y col. (1994) Tetrahedron Letters 35: 869-872; P. Hormozdiari y col. (1996) Tetrahedron Letters, 37: 8227-8230). En otras realizaciones, un peptido producido qulmicamente puede fosforilarse 35 usando una quinasa de serina/treonina o quinasa de tirosina como se describio anteriormente.

[0053] Los peptidos se pueden realizar, aislados o usados tanto en forma de base libre como de sales farmaceuticamente aceptables del mismo. Entre los ejemplos de sales se incluyen, sin limitacion a, acetato, cloruro, sales de sulfato y de fosfato del peptido.

40

Composiciones de peptidos y agonistas receptores GC-C

[0054] En otro aspecto, se proporcionan composiciones en las que los peptidos, solos o en combination, se pueden combinar con cualquier portador o medio farmaceuticamente aceptable. Los peptidos se pueden combinar

45 con materiales que no producen reacciones adversas, alergicas o de otra manera no deseadas cuando se administran al paciente. Los portadores o medios usados pueden incluir disolventes, dispersantes, revestimientos, agentes de promotion de la absorcion, agentes de liberation controlada, y uno o mas excipientes inertes (que incluyen almidones, polioles, agentes de granulation, celulosa microcristalina (por ejemplo., Celphere, granos de Celphere®), diluyentes, lubricantes, aglutinantes, agentes de desintegracion, y similares), etc. Si se desea, las dosificaciones de las tabletas 50 de las composiciones divulgadas pueden revestirse mediante tecnicas estandares acuosas o no acuosas.

[0055] Entre los ejemplos de excipientes para su uso como portadores farmaceuticamente aceptables y portadores inertes farmaceuticamente aceptables y los ingredientes adicionales anteriormente mencionados se incluyen, pero no se limitan a aglutinantes, rellenos, disgregantes, lubricantes, agentes antimicrobianos, y agentes de

55 revestimiento.

[0056] Tal como se usa en el presente documento, el termino "aglutinante" se refiere a cualquier aglutinante farmaceuticamente aceptable que se puede usar en la practica de la divulgation. Entre los ejemplos de aglutinantes farmaceuticamente aglutinantes se incluyen, sin limitacion a, un almidon (por ejemplo, almidon de malz, almidon de

patata o almidon pregelatinizado (por ejemplo, STARCH 1500® y STARCH 1500 LM®, vendido por Colorcon, Ltd.) y otros almidones), maltodextrina, gelatina, gomas naturales y sinteticas tal como acacia, tragacanto en polvo, goma de guar, celulosa y sus derivados (por ejemplo, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxietilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa (hipromelosa), etilcelulosa, acetato de celulosa, carboximetilcelulosa 5 de calcio, carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa, celulosa en polvo, celulosa microfina, celulosa microcristalina (por ejemplo, AVICEL™, tal como, AVICEL-PH-101 ™, -103™ y -105™, vendido por FMC Corporation, Marcus Hook, PA, ESTADOS UNIDOS)), alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona (por ejemplo, polivinilpirrolidona K30), y mezclas de los mismos.

10 [0057] Entre los ejemplos de aglutinantes que se pueden usar particularmente en composiciones farmaceuticas

se incluyen alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona (povidona), un almidon, maltodextrina o un eter de celulosa (tal como, por ejemplo, metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxietilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa).

15 [0058] Tal como se usa en el presente documento, el termino "relleno" se refiere a cualquier relleno

farmaceuticamente aceptable que se puede usar en la practica de la divulgacion. Entre los ejemplos de rellenos farmaceuticamente aglutinantes se incluyen, sin limitacion a, talco, carbonato calcico (por ejemplo, granulos o polvo), fosfato de calcio dibasico, fosfato de calcio tribasico, sulfato de calcio (por ejemplo, granulos o polvo), celulosa microcristalina (por ejemplo., Avicel PH101 o Celphere CP-305), celulosa microfina, celulosa en polvo, dextrates,

20 caolln, manitol, acido sillcico, sorbitol, almidon (por ejemplo, Almidon 1500), almidon pregelatinizado, lactosa, glucosa, fructosa, galactosa, trehalosa, sacarosa, maltosa, isomaltosa, rafinosa, maltitol, melezitosa, estaquiosa, lactitol, palatinita, xilitol, mioinositol, y mezclas de los mismos.

[0059] Entre los ejemplos de rellenos farmaceuticamente aceptables que pueden usarse particularmente para

25 revestir los peptidos se incluyen, sin limitacion a, talco, celulosa microcristalina (por ejemplo., Avicel PH 101 o Celphere CP-305), celulosa en polvo, dextrates, caolln, manitol, acido sillcico, sorbitol, almidon, almidon pregelatinizado, lactosa, glucosa, fructosa, galactosa, trehalosa, sacarosa, maltosa, isomaltosa, fosfato de calcio dibasico, rafinosa, maltitol, melezitosa, estaquiosa, lactitol, palatinita, xilitol, manitol, mioinositol, y mezclas de los mismos.

30 [0060] Tal como se usa en el presente documento, el termino "aditivos" se refiere a cualquier aditivo

farmaceuticamente aceptable. Entre los aditivos farmaceuticamente aceptables se incluyen, sin limitacion a, disgregantes, aditivos de dispersacion, lubricantes, deslizantes, antioxidantes, aditivos de revestimiento, diluyentes, surfactantes, aditivos aromatizantes, humectantes, aditivos de promocion de la absorcion, aditivos de liberacion controlada, aditivos antiaglomerantes, agentes antimicrobianos (por ejemplo, preservativos), colorantes, desecantes,

35 plastificantes y tinturas. Como se usa en el presente documento, un "excipiente" es cualquier aditivo, relleno, aglutinante o agente farmaceuticamente aceptable.

[0061] Las composiciones de la presente divulgacion pueden incluir tambien opcionalmente otros ingredientes terapeuticos, agentes antiaglomerantes, preservativos, agentes edulcorantes, colorantes, aromatizantes, desecantes,

40 plastificantes, tinturas, deslizantes, antiadherentes, agentes antiestaticos, surfactantes (agentes humectantes), antioxidantes, agentes de revestimiento de pellcula, y similares. Cualquier tal ingrediente opcional puede ser compatible con el compuesto descrito en el presente documento para asegurar la estabilidad de la formulacion. La composicion puede contener otros aditivos segun sea necesario, incluyendo por ejemplo lactosa, glucosa, fructosa, galactosa, trehalosa, sacarosa, maltosa, rafinosa, maltitol, melezitosa, estaquiosa, lactitol, palatinita, almidon, xilitol,

45 manitol, mioinositol, y similares, y mezclas de los mismos, y aminoacidos, por ejemplo, alanina, glicina y betalna, y peptidos y protelnas, por ejemplo, albumina.

[0062] Las composiciones pueden incluir, por ejemplo, diversos disolventes adicionales, dispersantes, revestimientos, aditivos de promocion de la absorcion, aditivos de liberacion controlada, y uno o mas aditivos inertes

50 (que incluyen, por ejemplo, almidones, polioles, aditivos de granulacion, celulosa microcristalina, diluyentes, lubricantes, aglutinantes, aditivos de desintegracion, y similares), etc. Si se desea, las dosificaciones de las tabletas de las composiciones divulgadas pueden revestirse mediante tecnicas estandares acuosas o no acuosas. Las composiciones tambien pueden incluir, por ejemplo, aditivos antiaglomerantes, preservativos, agentes edulcorantes, colorantes, aromatizantes, desecantes, plastificantes, tinturas, y similares.

55

[0063] Entre los disgregantes se pueden incluir, por ejemplo, agar-agar, carbonato calcico, celulosa microcristalina, croscarmelosa sodica, crospovidona, povidona, polacrilina de potasio, glicolato sodico de almidon, almidon de patata o tapioca, otros almidones, almidon pregelatinizado, arcillas, otras alginas, otras celulosas, gomas, y mezclas de los mismos.

[0064] Entre los lubricantes adecuados se incluyen, por ejemplo, estearato de calcio, estearato de magnesio,

aceite mineral, aceite mineral ligero, glicerina, sorbitol, manitol, glicol de polietileno, otros glicoles, acido estearico, lauril sulfato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado (por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de semilla de 5 algodon, aceite de girasol, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de malz y aceite de soja), estearato de zinc, oleato de etilo, laurato de etilo, agar, gel de sllice de Syloid (AEROSIL 200, W.R. Grace Co., Baltimore, MD Estados Unidos), un aerosol coagulado de sllice sintetico (Evonik Degussa Co., Plano, TX ESTADOS UNIDOS), un dioxido de silicio pirogenico (CAB-O-SIL, Cabot Co., Boston, MA ESTADOS UNIDOS), y mezclas de los mismos.

10 [0065] Entre los deslizantes adecuados se incluyen, por ejemplo, leucina, dioxido de silicio coloidal, trisilicato

de magnesio, celulosa en polvo, almidon, talco, y fosfato de calcio tribasico.

[0066] Entre los aditivos antiaglomerantes adecuados se incluyen, por ejemplo, silicato de calcio, silicato de magnesio, dioxido de silicio, dioxido de silicio coloidal, talco, y mezclas de los mismos.

15

[0067] Entre los aditivos microbianos adecuados se pueden usar, por ejemplo, como un preservativo para las composiciones peptldicas, se incluyen, por ejemplo, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, acido benzoico, alcohol bencllico, parabeno butllico, cloruro de cetilpiridinio, cresol, clorobutanol, acido dehidroacetico, etilparabeno, metilparabeno, fenol, alcohol fenetllico, fenoxietanol, acetato fenilmercurio, nitrato fenilmercurico, sorbato de potasio,

20 propilparabeno, benzoato sodico, dehidroacetato de sodio, propionato de sodio, acido sorbico, tiomersal, timo, y mezclas de los mismos.

[0068] Entre los antioxidantes adecuados se incluyen, por ejemplo, BHA (butilhidroxianisol), BHT (butilhidroxitolueno), vitamina E, galato de propilo, acido ascorbico y sales o esteres de los mismos, tocoferol y esteres

25 de los mismos, acido alfalipoico y betacaroteno.

[0069] Entre los aditivos adecuados se incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, acetoftalato de celulosa, etilcelulosa, gelatina, esmalte farmaceutico, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, glicol de polietileno, acetoftalato de polivinilo, goma laca, sacarosa, dioxido

30 de titanio, cera de carnuaba, cera microcristalina, y mezclas de los mismos. Entre los revestimientos protectores adecuados se incluyen Aquacoat (por ejemplo, Dispersion Acuosa de Etilcelulosa de Aquacoat, 15 % p/p, Biopollmero FMC, ECD-30), Eudragit (por ejemplo, Eudragit E PO PEEL, Roehm Pharma Polymers) y Opadry (por ejemplo, dispersion de Opadry AMB, 20 % p/p, Colorcon).

35 [0070] En ciertas realizaciones, entre los aditivos adecuados para la composicion de peptidos se incluye uno o

mas entre sacarosa, talco, estearato de magnesio, crospovidona o BHA.

[0071] Las composiciones de la presente divulgacion pueden incluir tambien otros excipientes, agentes, y

categorlas de los mismos incluyendo pero no limitandose a L-histidina, Pluronic®, Poloxamers (tal como Lutrol® y

40 Poloxamer 188), acido ascorbico, glutation, potenciadores de la permeabilidad (por ejemplo, llpidos, colato de sodio, acilcarnitina, salicilatos, mezcla las sales biliares, micelas de acidos grasos, quelantes, acidos grasos, surfactantes, gliceridos de cadena media), inhibidores de la proteasa (por ejemplo, inhibidor de la tripsina de soja, acidos organicos), agentes de disminucion del pH y potenciadores de la absorcion eficaces para promover la biocapacidad (incluyendo pero no limitandose a los descritos en el documento US 6086918 y el documento US 5912014), materiales para

45 tabletas masticables (como dextrosa, fructosa, lactosa monohidrato, lactosa y aspartamo, lactosa y celulosa, maltodextrina, maltosa, manitol, celulosa microcristalina y goma de guar, sorbitol cristalino); parenterales (como manitol y povidona); plastificantes (como sebacato de dibutilo, plastificantes para revestimientos, ftalato de polivinilacetato); lubricantes en polvo (como behenato de glicerilo); capsulas de gelatina blanda (como solucion especial de sorbitol); esferas para revestimiento (como esferas de azucar); agentes esferificantes (como behenato de

50 glicerilo y celulosa microcristalina); agentes de suspension/gelificacion (como carragenina, goma de gellan, manitol, celulosa microcristalina, povidona, glicolato sodico de almidon, goma de xantano); edulcorantes (como aspartamo, aspartamo y lactosa, dextrosa, fructosa, miel, maltodextrina, maltosa, manitol, melazas, sorbitol cristalino, solucion especial de sorbitol, sacarosa); agentes de granulacion humeda (como carbonato de calcio, lactosa anhidra, lactosa monohidrato, maltodextrina, manitol, celulosa microcristalina, povidona, almidon), caramelo, carboximetilcelulosa de

55 sodio, sabor crema de cereza y sabor cereza, acido cltrico anhidro, acido cltrico, azucar glas, D&C Rojo Numero 33, D&C Amarillo #10 Aluminio Lago, edetato disodico, alcohol etllico 15 %, FD& C Amarillo Numero 6 aluminio lago, FD&C Azul #1 Aluminio Lago, FD&C Azul Numero 1, FD&C azul numero 2 aluminio lago, FD&C Verde Numero 3, FD&C Rojo Numero 40, FD&C Amarillo Numero 6 Aluminio Lago, FD&C Amarillo Numero 6, FD&C Amarillo Numero 10, palmitoestearato de glicerol, monostearato de glicerilo, Carmln de Indigo, lecitina, manitol, parabenos de metilo y

propilo, glicirricinato de monoamonio, sabor de naranja natural y artificial, esmalte farmaceutico, poloxamer 188, Polidextrosa, polisorbato 20, polisorbato 80, povidona, almidon de malz pregelatinizado, almidon pregelatinizado, oxido de hierro rojo, sodio de sacarina, eter carboximetillco de sodio, cloruro de sodio, citrato sodico, fosfato de sodio, sabor de fresa, oxido de hierro negro sintetico, oxido de hierro rojo sintetico, dioxido de titanio, y cera blanca.

5

[0072] En algunas realizaciones, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un peptido

descrito en el presente documento y uno o mas agentes estabilizantes seleccionados de entre Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+, una combinacion de los mismos, y/o una amina primaria con impedimento esterico. En realizaciones adicionales, el agente es Mg2+, Ca2+ o Zn2+ o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, se 10 proporciona el cation, sin limitacion, como acetato de magnesio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de calcio, cloruro de calcio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, acetato de zinc, cloruro de zinc, fosfato de zinc, sulfato de zinc, acetato de manganeso, cloruro de manganeso, fosfato de manganeso, sulfato de manganeso, acetato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, sulfato de potasio, acetato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, sulfato de sodio, acetato de aluminio, cloruro de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de 15 aluminio. En realizaciones adicionales, se proporciona el cation como cloruro de magnesio, cloruro de calcio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, acetato de zinc, cloruro de manganeso, cloruro de potasio, cloruro de sodio o cloruro de aluminio. En otras realizaciones, se proporciona el cation como cloruro de calcio, cloruro de magnesio o acetato de zinc.

20 [0073] En otra realizacion, el agente estabilizante es una amina primaria con impedimento esterico. En una

realizacion adicional, la amina primaria con impedimento esterico es un aminoacido. Aun en otra realizacion, el aminoacido es un aminoacido que se genera de manera natural. Aun en una realizacion adicional, el aminoacido que se genera de manera natural se selecciona de entre el grupo que consiste en histidina, fenilalanina, alanina, acido glutamico, acido aspartico, glutamina, leucina, metionina, asparagina, tirosina, treonina, isoleucina, triptofano, glicina 25 y valina; aun mas, el aminoacido que se genera de manera natural es leucina, isoleucina, alanina o metionina. En otra realizacion, la amina primaria con impedimento esterico es un aminoacido que no se genera de manera natural (por ejemplo, acido carboxllico 1-aminocyiclohexano). En una realizacion adicional, la amina primaria con impedimento esterico es ciclohexalamina, 2-metilbutilamina o una amina polimerica tal como quitosano. En otra realizacion, una o mas amina primaria con impedimento esterico pueden usarse en una composicion.

30

[0074] En algunos casos, la amina primaria con impedimento esterico tiene la siguiente formula:

imagen5

35 en la que R1, R2 y R3 independientemente seleccionados de entre: H, C(O)OH, C1-C6 alkyl, alquil eter C1-C6, alquil tioeter C1-C6, acido carboxllico alquil C1-C6, carboxilamida de alquilo C1-C6 y alkilaurllico, en la que cualquier grupo puede sustituirse individualmente o de manera multiple con: halogeno o amino, y siempre que no mas de dos de los R1, R2 y R3 sean H. En otra realizacion, no mas de uno de los R1, R2 y R3 es H.

40 [0075] En otras realizaciones, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un portador

farmaceuticamente aceptable, un peptido, un cation seleccionado de entre Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o A13+, o una mezcla de los mismos, y una amina primaria con impedimento esterico. En una realizacion, el cation es Mg2+, Ca2+ o Zn2+ o una mezcla de los mismos. En una realizacion adicional, la composicion farmaceutica comprende ademas un aglutinante farmaceuticamente aceptable y/o un deslizante, lubricante o aditivo farmaceuticamente aceptable que 45 actua tanto como deslizante como como lubricante y/o un antioxidante. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se aplica a un portador. En algunas realizaciones, el portador es un relleno.

[0076] En algunos casos la relacion molar de cation:amina primaria con impedimento esterico: peptido en la

solucion acuosa aplicada al portador es 5-100:5-50:1. En algunos casos, la relacion molar de cation:amina primaria

50 con impedimento esterico puede ser igual o superior a 2:1 (por ejemplo, entre 5:1 y 2:1). Por lo tanto, en algunos

casos, la relacion molar de cation:amina primaria con impedimento esterico:peptido aplicada al portador es 100:50:1, 100:30:1, 80:40:1, 80:30:1, 80:20:1, 60:30:1, 60:20:1, 50:30:1, 50:20:1, 40:20:1, 20:20:1, 10:10:1, 10:5:1 o 5:10:1.

Cuando el aglutinante, por ejemplo, metilcelulosa, esta presente en la solucion del peptido agonista GC-C aplicada al portador puede estar presente al 0,5 % - 2,5 % en peso (por ejemplo, 0,7 %-1,7 % o 0,7 % - 1 % o 1,5 % o 0,7 %).

[0077] Se ha descubierto que un cation seleccionado de entre Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ y Al3+ es util para 5 suprimir la formation de un producto de oxidation de los polipeptidos agonistas receptores GC-C durante el

almacenamiento. Tambien se ha descubierto que una amina primaria con impedimento esterico es util para suprimir la formacion de un formaldheido imina aducto ("producto formaldheido imina") de los polipeptidos agonistas receptores GC-C durante el almacenamiento. Por lo tanto, las formulaciones del polipeptido agonista receptor GC-C comprenden un cation seleccionado de entre Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+-por ejemplo, un cation divalente seleccionado 10 de entre Zn2+, Mg2+ and Ca2+-y/o una amina primaria con impedimento esterico, tal como un aminoacido, tiene una vida util suficiente (como medida por pureza cromatografica y/o por un ensayo peso/peso) para la fabrication, almacenamiento y distribution del farmaco. Ademas, mientras que la presencia de una amina con impedimento esterico puede aumentar la formacion de un producto de hidrolisis de linaclotida durante el almacenamiento, la combination de una amina primaria con impedimento esterico y un cation, por ejemplo, pero que no se limitan a, la 15 combinacion de leucina y Ca2+, suprime la formacion del producto de hidrolisis del polipeptido agonista receptor GC- C as! como el producto de oxidacion del polipeptido agonista receptor GC-C durante el almacenamiento, lo que conduce a una estabilidad global mayor como se determina por el ensayo peso/peso y/o por pureza cromatografica.

[0078] En una realization adicional, la composition farmaceutica comprende ademas un aglutinante o aditivo 20 farmaceuticamente aceptable y/o un deslizante, lubricante o aditivo farmaceuticamente aceptable que actua tanto

como deslizante como como lubricante y/o un antioxidante.

[0079] Entre las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la divulgation se incluira generalmente una cantidad de compuesto(s) activo(s) con un diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable, tal como una solucion

25 esteril acuosa, para dar una gama de concentraciones finales, dependiendo del uso pretendido. Las tecnicas de preparation se conocen generalmente bien en la materia, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, Mack Publishing Company, 1995).

[0080] Para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, los peptidos descritos en el presente documento se 30 administran preferentemente de manera oral, por ejemplo, como una tableta, capsula, bolsita que contiene una

cantidad predeterminada de la pelotilla del ingrediente activo, gel, pasta, jarabe, bolo, remedio, mezcla, polvo, polvo liofilizado, granulos, como una solucion o una suspension en un llquido acuoso o en un llquido no acuoso; como una emulsion llquida de aceite en agua o una emulsion llquida de agua en aceite, a traves de una formulation liposomica (ver, por ejemplo, el documento EP 736299) o en alguna otra forma. Las composiciones administradas de manera oral 35 pueden incluir aglutinantes, lubricantes, diluyentes inertes, lubricantes, superficie activa o agentes dispersantes, agentes aromatizantes, y humectantes. Las formulaciones administradas de manera oral tal como tabletas pueden revestirse o marcarse opcionalmente y pueden formularse de manera que proporcionen una liberation sostenida y retardada o controlada del ingrediente activo del mismo. Los peptidos pueden coadministrarse con otros agentes usados para tratar trastornos gastrointestinales que incluyen, pero no se limitan a los agentes descritos en el presente 40 documento.

[0081] En otro aspecto, las composiciones farmaceuticas adecuadas pueden comprender uno o mas agentes terapeuticos diferentes. Entre tales agentes terapeuticos se pueden incluir, sin limitation, agentes analgesicos; agentes antisecretores, incluyendo inhibidores de la bomba de protones, antagonistas de la bomba de acido,

45 antagonistas del receptor H2; inhibidores de la PDE5; antagonistas de GABA-B; secuestrantes del acido de biliar; agentes procineticos y promotores de la movilidad; antidepresivos; antibioticos; antiemeticos; y agentes protectores de mucosa.

Procedimientos de tratamiento 50

[0082] En algunas realizaciones de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para trastornos gastrointestinales.

[0083] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es un trastorno GI superior. En una realizacion 55 adicional, el trastorno es GP, Ileo gastrico postoperatorio, un trastorno funcional del esofago, un trastorno funcional

gastroduodenal, enfermedad por reflujo gastroesofagico (ERGE), enfermedad cellaca, mucositis, o una ulcera duodenal o estomacal.

[0084] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es GP. En realizaciones adicionales, el GP es GP

idiopatico, diabetico o post operatorio.

[0085] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es un lleo gastrico postoperatorio.

[0086] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es un trastorno funcional del esofago.

[0087] En algunas realizaciones, el trastorno esofagico es pirosis funcional, dolor toracico funcional y origen

esofagico presumido, disfagia funcional o globo.

10 [0088] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es un trastorno funcional gastroduodenal.

[0089] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es DF, un trastorno de flatulencias, un trastorno

de nauseas o vomitos, o un slndrome de rumiacion. En una realizacion adicional, el trastorno gastroduodenal funcional es DF. En algunas realizaciones, la DF es slndrome de distres postprandial o slndrome de dolor epigastrico. En 15 algunas realizaciones, el trastorno de eructos es aerofagia o eructos excesivos no especificados. En algunas realizaciones, el trastorno de las nauseas o vomitos en una nausea idiopatica cronica, un vomito funcional o un slndrome de vomito clclico.

20

25

30

[0090] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es enfermedad por reflujo gastroesofagico (ERGE).

[0091] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es la enfermedad cellaca.

[0092] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es mucositis.

[0093] En algunas realizaciones, el trastorno gastrointestinal es una ulcera duodenal o estomacal.

[0094] los peptidos y agonistas descritos en el presente documento se pueden usar solos o en una terapia de

combinacion para el tratamiento, la prevencion o la reduccion del dolor visceral asociado con un trastorno o dolor gastrointestinal superior asociado con otro trastorno como se describio anteriormente.

[0095] Los agonistas receptores GC-C descritos en el presente documento se pueden administrar en

combinacion con otros agentes. Por ejemplo, los peptidos se pueden administrar con un peptido o compuesto analgesico. El peptido o compuesto analgesico se puede acoplar covalentemente a un peptido descrito en el presente 35 documento o puede ser un agente separado que se administra junto con o secuencialmente con un peptido describe en el presente documento en una terapia de combinacion. Los agonistas receptores GC-C describe en el presente documento pueden administrarse en combinacion con otros agentes usados para tratar los trastornos GI superiores que incluyen antidepresivos, agentes promotores de la movilidad o procineticos, antiemeticos, antibioticos, inhibidores de la bomba de protones, bloqueadores de acido (por ejemplo, histamina antagonistas del receptor H2), antagonistas 40 de la bomba de acido, inhibidores de la PDE5, agonistas de GABA-B, secuestrantes del acido de biliar, y agentes de proteccion de la mucosa.

[0096] En algunas realizaciones, entre los agentes analgesicos que se pueden usar con los peptidos descritos en el presente documento incluyen bloqueadores del canal del Ca (por ejemplo, ziconotida), antagonistas de los

45 receptores 5HT (por ejemplo, antagonistas de los receptores 5HT3, 5HT4 y 5HT1), agonistas 5HT4 (por ejemplo, tegaserod (Zelnorm®), mosaprida, metoclopramida, zacoprida, cisaprida, renzaprida, derivados de benzimidazolona tales como BIMU 1 y BIMU 8, y lirexaprida), agonistas 5HT1 (por ejemplo, sumatriptan y buspirona), agonistas de los receptores opiaceos (por ejemplo, loperamida, fedotozina, pentapeptido de encefalina, morfina, difeniloxilato, frakefamide, trimebutina y fentanilo), agonistas de los receptores CCK (por ejemplo, loxiglumida y dexgloxiflumida), 50 antagonistas del receptor NK1 (por ejemplo, aprepitant, vofopitant, ezlopitant, R-673 (Hoffmann-La Roche Ltd), SR- 48968 y SR-14033, (Sanofi Synthelabo), CP- 122,721 (Pfizer, Inc.), GW679769 (Glaxo Smith Kline) y TAK-637 (Takeda/Abbot)), antagonistas del receptor NK2 (por ejemplo, nepadutant, saredutant, GW597599 (Glaxo Smith Kline), SR-144190 (Sanofi-Synthelabo) y UK-290795 (Pfizer Inc)), antagonistas del receptor NK3 (por ejemplo, osanetant (SR-142801; Sanofi-Synthelabo), SR-241586 y talnetant), inhibidores de la recaptacion de norepinefrinaserotonina 55 (NSRI) (por ejemplo, milnacipran), agonistas de los receptores vaniloides y cannabinoides, sialorphin peptidos relacionados con sialorphin. Se describen los agentes analgesicos de diversas clases en la literatura.

[0097] En algunas realizaciones, uno o mas agentes terapeuticos distintos pueden usarse en combinacion con los peptidos descritos en el presente documento. Entre tales agentes se incluyen antidepresivos, agentes promotores

de la movilidad o procineticos, antiemeticos, antibioticos, inhibidores de la bomba de protones, bloqueadores de acido (por ejemplo, histaminas antagonistas del receptor H2), antagonistas de la bomba de acido, inhibidores de la PDE5, agonistas de GABA - B, secuestrantes del acido de biliar, y agentes de proteccion de la mucosa.

5 [0098] Entre los ejemplos de antidepresivos se incluyen, sin limitacion, antidepresivos triclclicos tal como

amitriptilina (Elavil®), desipramina (Norpramin®), imipramina (Tofranil®), amoxapina (Asendin®), nortriptilina; los inhibidores selectivos de la recaptacion de serotonina (ISRS) tal como paroxetina (Paxil®), fluoxetina (Prozac®), sertralina (Zoloft®), y citralopram (Celexa®); y otros tales como doxepina (Sinequan®) y trazodona (Desyrel®).

10 [0099] Entre los ejemplos de agentes promotores de la movilidad y procineticos se incluyen, sin limitacion,

itoprida, octreotida, betanecol, metoclopramida (Reglan®), domperidona (Motilium®), eritromicina (y derivados de la misma) y cisaprida (Propulsid®). Un ejemplo de antimeticos incluye, sin limitacion, proclorperazina.

[0100] Entre los ejemplos de antibioticos que se pueden usar se incluyen aquellos que pueden usarse para 15 tratar las infecciones de la Heliobacterpylori, tal como amoxicilina, tetraciclina, metronidazol, o claritromicina. Otros

antibioticos tales como eritromicina y derivados de la misma pueden usarse tambien en combination con los peptidos describe en el presente documento.

[0101] Entre los ejemplos de inhibidores de la bomba de protones se incluyen, sin limitacion, omeprazol 20 (Prilosec®), esomeprazol (Nex- ium®), lansoprazol (Prevacid®), pantoprazol (Protonix®) y rabeprazol (Aciphex®).

Entre los ejemplos de bloqueadores de los receptores H2 se incluyen, sin limitacion, incluyendo cimetidina, ranitidina, famotidina y nizatidina. Entre los ejemplos de antagonistas de la bomba de acido se incluyen, sin limitacion, revaprazan, CS-526 (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2007) 323:308-317), PF-03716556 (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009) 328(2):671-9), y YH1885 (Drug Metab. Dispos. (2001) 29(1):54-9).

25

[0102] Entre los ejemplos de inhibidores de PDE5 se incluyen, sin limitacion, avanafilo, lodenafilo, mirodenafilo, citrato de sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo y udenafilo. Entre los agonistas de GABA-B se incluye, sin limitacion, baclofeno y XP19986 (CAS Registry No. 847353-30-4). Entre los ejemplos de secuestrantes del acido de biliar se incluyen, sin limitacion, GT102-279, colestiramina, colesevelam, clorhidrato de colesevelam, acido ursodesoxicolico,

30 colestipol, colestilan, sevelamero, polidialilamina reticulada con epiclorohidrina, derivados de dialquilaminoalquilo de un dextrano reticulado, y N(cicloalquil)alquilaminas. Entre los ejemplos de agentes protectores de la mucosa se incluyen, sin limitacion, sucralfato (Carafato), teprenona, polaprezinc, cetraxato y subsaliciclato de bismuto.

[0103] La terapia de combinacion puede lograrse administrando dos o mas agentes, por ejemplo, un agonista 35 del receptor GC-C describe en el presente documento y otro peptido o compuesto terapeutico, cada uno de los cuales

formulado y administrado por separado, o mediante la administration de dos o mas agentes en una unica formulation. Tambien se abarcan otras combinaciones por terapia de combinacion. Por ejemplo, se pueden formular dos agentes juntos y administrarse junto con una formulacion separada que contiene un tercer agente. Mientras que dos o mas agentes en la terapia de combinacion pueden administrarse de manera simultanea, no es necesario. Por ejemplo, la 40 administracion de un primer agente (o combinacion de agentes) puede preceder la administracion de un segundo agente (o combinacion de agentes) por minutos, horas, dlas, o semanas. Por lo tanto, los dos o mas agentes se pueden administrar en minutos entre si o en 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, o 24 horas entre si o en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, o 14 dlas entre si o en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 semanas entre si. Son posibles en algunos casos incluso intervalos mayores. Mientras en muchos casos es deseable que dos o mas agentes usados en una terapia de 45 combinacion esten presentes dentro del cuerpo del paciente al mismo tiempo, no es necesario.

Dosificacion

[0104] El intervalo de dosis para seres humanos adultos puede ser generalmente de 5 pg a 100 mg/al dla de 50 manera oral del peptido agonista GC-C descrito en el presente documento. Las tabletas, capsulas, u otras formas de

presentation de presentation en unidades discretas pueden contener convenientemente una cantidad del compuesto descrito en el presente documento es eficaz en tales dosificaciones o como un multiplo de la misma, por ejemplo, unidades que contienen de 25 pg a 2mg o aproximadamente de 100 pg a 1 mg. La cantidad de compuesto precisa prescrita a un paciente sera la responsabilidad del medico que lo asista. Sin embargo, la dosis empleada dependera 55 de una serie de factores, que incluyen la edad y el sexo del paciente, el trastorno preciso que se esta tratando, y su severidad.

[0105] En diversas realizaciones, la unidad de dosificacion se administra con comida en cualquier momento del dla, sin comida en cualquier momento del dla, con comida despues de un ayuno nocturno (por ejemplo, con el

desayuno), antes de acostarse despues de una merienda baja en grasa. En una realizacion particular, la unidad de dosificacion se administra antes o despues del consumo de comida (por ejemplo, una comida). En una realizacion adicional, la unidad de dosificacion se administra de aproximadamente 15 minutos a 1 hora antes del consumo de comida. En diversas realizaciones, la unidad de dosificacion se administra una vez al dla, dos veces al dla, tres veces 5 al dla, cuatro veces al dla, cinco veces al dla o seis veces al dla. En ciertas realizaciones la unidad de dosificacion y la dosis diaria son equivalentes.

[0106] En las realizaciones de la terapia de combinacion de la presente divulgacion, la cantidad precisa de

cada uno de los dos o mas ingredientes activos en una unidad de dosificacion dependera de la dosificacion deseada 10 de cada componente. Por lo tanto, puede ser util crear una unidad de dosificacion que, cuando se administre de acuerdo con un calendario de dosificacion particular (por ejemplo, un calendario de dosificacion que especifica una cierta serie de unidades y un tiempo particular para su administracion), administraran la misma dosificacion de cada componente como se administrarla si el paciente estuviera tratandose solo de un unico componente. En otras circunstancias, podrla ser deseable crear una unidad de dosificacion que administrara una dosificacion de uno o mas 15 componentes que es menor que la que se administrarla si el paciente estuviera tratandose solo con un unico componente. Por ultimo, podrla ser deseable crear una unidad de dosificacion que administrara una dosificacion de uno o mas componentes que es mayor que la que se administrarla si el paciente estuviera tratandose solo con un unico componente.

20 [0107] La composition farmaceutica puede incluir ingredientes adicionales, pero no se limita a los ingredientes

y excipientes activos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, uno o mas agentes terapeuticos de la unidad de dosificacion pueden existir en una formulation de liberation extendida o controlada y no pueden existir agentes terapeuticos adicionales en la formulacion de liberacion extendida. Por ejemplo, un peptido o un agonista describe en el presente documento puede existir en una formulacion de liberacion controlada o en una formulacion de 25 liberacion extendida en la misma unidad de dosificacion con otro agente que puede o puede no ser una formulacion de liberacion controlada o una formulacion de liberacion extendida. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, puede ser deseable proporcionar la liberacion inmediata de uno o mas de los agentes descritos en el presente documento, y la liberacion controlada de uno o mas agentes diferentes.

30 [0108] La presente invention se ha descrito con referencia a ciertas realizaciones ejemplares de la misma. Sin

embargo, sera evidente facilmente para aquellos expertos en la materia que es posible realizar la invencion de formas especlficas diferentes a las de las realizaciones ejemplares descritas anteriormente. Las realizaciones ejemplares son meramente ilustrativas y no deberlan considerarse restrictivas de ninguna manera. El ambito de la invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas, en lugar de mediante la description anterior.

35

EJEMPLOS

[0109] Los peptidos agonistas GC-C o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos como se

describieron en el presente documento se prepararon mediante slntesis qulmica de fase solida y plegado natural 40 (oxidation de aire) por la American Peptide Company (Sunnyvale, CA). Los peptidos y sus secuencias se muestran a continuation (en los que la secuencia de aminoacidos es el codigo de una letra estandar y "pS" es fosfoserina):

Nombre del Peptido

Secuencia de Aminoacidos

Peptido 1*

CCpSLCCNPACTGCY

Defosfopeptido 1

CCSLCCNPACTGCY

Peptido 2*

CCpSLCCNPACTGC

Defosfopeptido 2

CCSLCCNPACTGC

Peptido 3

CCELCCNPACTGCY

Peptido 4

CCEFCCNPACTGCY

Peptido de 5*

DDCCpSLCCNPACTGCY

Peptido de 6*

DDCCpSYCCNPACTGCY

*Denota un peptido de la presente invencion

Ejemplo 1: Efectos de la fosfatasa alcalina y acida sobre sustratos de peptido 45

[0110] Para las reacciones de la fosfatasa alcalina, las reservas de peptido se prepararon a 1 mg/ml en Tris-

HCL 0,1 M pH 8, que se almacenaron a -20 °C hasta que se llevaron a cabo los ensayos. Para las reacciones de fosfatasa acida, las reservas de peptido se prepararon a 1 mg/ml en fosfato de sodio 50 mM pH6, que se almacenaron

a -20 °C hasta que se llevaron a cabo los ensayos. Reaccion de la fosfatasa alcalina

5 [0111] La fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP) se obtuvo de New England BioLabs, Ipswich, MA. Cat #

M0290S. La solucion de reaccion CIP se prepare mediante disolucion con tampon (KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8, MgCl2 1 mM, glicerol 50 %) para 0,5 unidades/pl. Las soluciones de la reaccion de fosfatasa alcalina se ensamblaron en cantidades de 20 pl que contenlan:

10 2 pl 10X tampon CIP (NaCL 1M, Tris-HCL 500 mM pH 8, MgCl2 100 mM)

2 pl de reserva de peptido (1 mg/ml)

12 pl de H2O

4 pl de fosfatasa alcalina (0, 0,5 o 2 unidades)

15 [0112] Las soluciones de reaccion se mezclaron suavemente y se incubaron durante 90 minutos a 37 °C. Estas

soluciones de reaccion se almacenaron a -20 °C hasta el analisis. Para el analisis, las soluciones de reaccion se diluyeron desde 7,5 pl de peptido CIP tratado hasta 50 pl con 0,1 % acido formico en agua hasta una concentracion final de 10 pM. La solucion final de 20 pl se analizo por LCMS con condiciones como las que se muestran en la Tabla

1 a continuacion.

20

[0113] Las reacciones de control se ensamblaron para una actividad enzimatica que contenla 10 ml p- nitrofenilfosfato en lugar del peptido. Despues de la incubacion, las reacciones se diluyeron con 0,1 pl de 100 mM de tampon de borato pH9 y se leyo la absorbencia de 405nm para supervisar la aparicion de p-nitrofenol.

25 Reacciones de la fosfatasa acida

[0114] La fosfatasa acida de la patata (PoAP) se obtuvo de Sigma, St. Louis, MS. Cat #P1146 y fosfatasa acida de la prostata del ser humano (HuPrAP) se obtuvo de MP Biochemicals, Solon, OH. Cat # 153872. Las fosfatasas acidas se disolvieron para proporcionar una solucion que contiene 0,5 unidades AP/pl usando un acetato de sodio 50

30 mM pH5, MgCl2 0,2 mM. Las reacciones de la fosfatasa acida se ensamblaron en cantidades de 20 pl que contenlan:

2 pl 10X tampon fosfatasa acida (acetato sodico 500 mM pH5, MgCl2 2 mM)

2 pl de reserva de peptido (1 mg/ml)

12 pl de H2O

35 4 pL de fosfatasa acida (0,5 o 2 unidades)

[0115] Las soluciones de reaccion se mezclaron suavemente y se incubaron durante 90 minutos a 37 °C. Las soluciones de reaccion se almacenaron a -20 °C para el posterior analisis. Para el analisis, se diluyeron reacciones de fosfatasa acida 7,5 pl en 50 ul con acido formico 0,1 % en agua para una concentracion final de 10 mM. Las reacciones

40 finales de 20 pl se analizaron por LCMS con condiciones como las mostradas en la Tabla 1 a continuacion. Las reacciones de control para la actividad enzimatica se ensamblaron y diluyeron en p-nitrofenilfosfato 10 mM en lugar del peptido. Despues de la incubacion, las reacciones se diluyeron con 0,1 pl de 100 mM de tampon de borato pH9 y se leyo la absorbencia de 405 nm para supervisar la aparicion de p-nitrofenol.

45

Tabla 1: Analisis LCMS

5

MS:

Modo del Ion:

Intervalo de Exploracion: HPLC:

Columna:

Caudal:

Temperatura de Columna Muestreador Automatico Temperatura:

Volumen de Inyeccion: Fases Moviles:

Gradiente:

Thermo Scientific LTQ Orbitrap Discovery Ion positivo por electrospray (ESI+)

200 - 2 000 m/z Aguas Acquity UPLC

Thermo Hypersil Gold aQ, 2,1 x 50 mm, 1,9 mm 400 ml/min 40 °C

4 °C 20 ml

A = acido formico al 0,1 % en H2O

B = acido formico al 0,1 % en 85:15 (v/v) acetonitrilo:metanol

Tiempo (min) % A

% B

0

98 2

2,4

98 2

25,2

20 80

26,2

20 80

27,2

10 90

30,2

98 2

35

98 2

[0116] Las tablas 2 y 3 muestran que bajo las condiciones usadas para el ensayo, 0,5 unidades de fostatasa

alcalina intestinal de ternera (pH8) y 0,5 unidades de tanto fosfatasa acida de patata como fosfatasa acida de prostata de ser humano (pH5) hidrolizaron eficazmente el p-nitrofenilfosfato.

10 [0117] La sensibilidad del Peptido 1 y el Peptido 2 al tratamiento de fosfatasa se evaluo mediante el analisis de

lis productos de reaccion por LCMS. Las Tablas 2 y 3 muestran que la fosfatasa alcalina intestinal de ternera pH8 desfosforilo eficazmente el Peptido 1 y el Peptido 2. En contraste con la fosfatasa alcalina, la fosfatasa acida de la patata y de la glandula prostatica del ser humano fueron muy ineficientes en la desfosforilacion del Peptido 1 bajo condiciones en las que hidrolizaron de manera eficiente el p-nitrofenilfosfato (Tabla 2). La fosfatasa acida de la glandula 15 prostatica del ser humano tambien fue muy ineficiente en la desfosforilacion del Peptido 2 (Tabla 3).

20

[0118] Como un control independiente, el Peptido 3 se trato con y sin fosfatasa alcalina intestinal de ternera y

las reacciones resultantes se analizaron por LCMS. El Peptido 3 no fue afectado por el tratamiento CIO (no se muestran los datos)

Tabla 2: Desfosforilacion del Peptido 1

Sustrato

p-nitrofenilfosfato Peptido 1

Restante (%) Defosfo (%) Restante (%) Defosfo (%)

Fosfatasa alcalina pH8

0 100 0 100

Fosfatasa acida de patata pH 5

0 100 77,8 22,1

Fosfatasa acida de prostata de ser humano pH 5

0 100 93,8 6,2

Tabla 3: Desfosforilacion del Peptido 2

Sustrato

p-nitrofenilfosfato Peptido 2

Restante (%) Defosfo (%) Restante (%) Defosfo (%)

Fosfatasa alcalina pH8

0 100 0 100

Fosfatasa acida prostatica de sei humano pH5

0 100 95,9 4,1

Ejemplo 2: acumulacion de gGMP en celulas T84 para analisis de la actividad GC-C 5

[0119] Para el ensayo de gGMP, se cultivaron 4,5 x 105 celulas/ml de celulas T84 durante la noche en 24 placas de cultivo de tejido de pocillo. Al dia siguiente, las celulas T84 se lavaron dos veces con 1 ml de DMEM + MES 20 mM (pH 5) o DMEM + bicarbonato sodico 50 mM (pH8) en cuyos buferes no se contenian suero. Despues del segundo lavado, las celulas se incubaron con 450 pl de isobutilmetilzantina 1 mM (IBMX) en tampones de tanto pH5 como pH8

10 durante 10 minutos a 37 °C para inhibir cualquier actividad de la fosfodiesterasa. Los peptidos se diluyeron en tampones de tanto pH5 como pH8 en una concentracion de 10x. La solucion de peptido de 50 pl se diluyo en un volumen final de 500 pl con las celulas T84, trayendo cada concentracion de peptido a 1x. Se realizo un analisis de curva de once puntos para cada peptido, con concentraciones de peptido finales probadas en cada ensayo, en nM: 10000,3000, 1000,300, 100,30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1.

15

[0120] No existia un control de peptido usado para determinar los niveles endogenos de cGMP. Los peptidos se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Despues de 30 minutos, los sobrenadantes se retiraron y las celulas se sometieron a lisis HCL 0,1 M. Las celulas se sometieron a lisis durante 30 minutos en hielo. Despues de 30 minutos, los lisados se administraron por pipeta y se colocaron en una placa de pocillo 96 HPLC y se a 10000x g durante 10

20 minutos para retirar los residuos celulares. Los sobrenadantes del giro anterior se retiraron y se colocaron en una placa de pocillo fresca 96 HPLC. Las muestras se diluyeron con un volumen igual de acetato de amonio 1 M (pH7) para neutralizar las muestras para una mejor cromatografia. Se preparo una curva estandar de 2x cGMP en HCL 0,1 M y seguidamente se diluyo con un volumen igual de acetato de amonio 1 M, con las concentraciones finales siguientes en nM: 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1.

25

[0121] Las concentraciones de cGMP se determinaron desde cada muestra las usando condiciones LC/MS en la Tabla 4 y una curva estandar calculada. Los valores de EC50 se calcularon a partir de las curvas de concentracion- respuesta generadas con el software GraphPad Prism.

30

Tabla 4: Condiciones LC/MS:

MS:

Thermo Quantum

Modo del Ion:

ESI+

Tipo de Exploracion:

MRM

Compuesto:

Transicion Tiempo de Permanencia (ms) Energfa de Colision (V) Tubo Lente Tiempo de Retencion (min)

cGMP

346 >152 100 28 139 1.0

HPLC:

Agilent Technologies 1200 Series con CTC Analytics HTS PAL

Columna:

Thermo Hypersil Gold 2,1 x 50 mm tamano de particula de 5 micras

Caudal:

400 uL/min

Columna

Compuesto:

Tiempo de Transicion r . , . Permanencia (ms) Energfa de Tubo Tiempo de Colision (V) Lente Retencion (min)

Temperatura:

Caudal

Muestreador Automatico

Temperatura:

0 0 CD

Inyeccion Volumen:

20 uL

Fases Moviles:

A = 98:2 Agua:Acetonitrilo + 0,1 % Acido Formico B = 2:98 Agua:Acetonitrilo + 0,1 % Acido Formico

Gradiente:

Tiempo (min) % A % B

0

100

0

0,3

30 70

2,00

30 70

2,01

100 0

4

100 0

[0122] La capacidad del Peptido 1 y del Peptido 2 y de sus formas desfosforiladas para estimular la slntesis en

celulas T84 humanas a pH 5 se probo incubando las celulas con los peptidos seguido de la determinacion de cGMP intracelular acumulado por LC-MS. La Tabla 5 muestra que el Peptido 1 y el Peptido 2 tienen similares potencias a las 5 del Peptido 3 en la estimulacion de la slntesis cGMP a pH 5. Sin embargo, el Peptido 1 y el Peptido 2 desfosforilados fueron menos potentes en el ensayo T84 que el Peptido 3.

Tabla 5: respuesta cGMP de las celulas T84

Peptido

EC50 at pH 5 (nM)

Peptido 3

16

Peptido 1

9,8

Defosfopeptido 1

128

Peptido 2

10,4

Defosfopeptido 2

78,1

10

[0123] La respuesta cGMP de las celulas T84 al Peptido 5 y al Peptido 6 tambien se midieron en duplicado en una manera similar a la descrita anteriormente. El EC50, a pH 5 para el Peptido 5 fue 14,7 nM y el EC50, a pH 5 para el Peptido 6 fue 39,2 nM.

15

Ejemplo 3: Enlace de Radioligando Competitivo sobre celulas T84

[0124] Las celulas T84 humanas intactas de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) se usaron para experimentos de enlace de radioligandos competitivos. Las celulas T84 se cultivaron en monocapas en

20 frascos de plastico T-150 al 60-70 % de confluencia en el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco: promedio F-12 50/50 de jamon (DMEM/F12) + 5 % suero bovino fetal (FBS). Las celulas se cosecharon por raspado suave con un raspador celular y las celulas se recolectaron por centrifugado a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Las celulas se lavaron dos veces suspendiendo de nuevo suavemente en el tampon fosfato salino (PBS) y se recopilaron por centrifugado como anteriormente.

[0125] Se prepare el radioligando de parada.[125I] mediante la disolucion de cien microgramos (100 pg) de NTFYCCELCCNPAC-AGCY (Enteroxina Stp; Bachem H-6248) en 0,5 ml de agua y se enviaron a Perkin-Elmer Life y Analytical Sciences (N. Billerica, MA) para yodacion usando el procedimiento de la lactoperoxidasa recitado en (Marchanolis, J.J., "An enzymic method for the trace iodination of immunoglobulins and other proteins," Biochem. J.

5 1969, 113, 299-305). Perkin-Elmer purifico el trazador etiquetado por HPLC usando una columna Waters C-18 mBondapak (25 cm) equilibrada previamente con acetato de amonio 10 mM pH 5.8. Se aplico un gradiente de acetonitrilo del 0 al 25 % a la columna en 60 min, seguido de una elucion isocratica en acetonitrilo al 25 % durante otros 20 min. Este procedimiento separa dos formas monoyodadas entre si y a partir de un precursor sin etiqueta. El segundo pico monoyodado (Pico 2) que se eludio despues de 64 min y que correspondio a la yodacion de la cuarta 10 tirosina, se uso como el trazador etiquetado en el ensayo. El trazador etiquetado tuvo una actividad especlfica de 2200 Ci/mmol. A su llegada, el trazador se almaceno en allcuotas a -20 °C.

[0126] Las reacciones de enlace se ensamblaron en duplicado en 0,2 ml que contienen: 2,5 x 105 celulas T84 (protelna 0,25 mg), 200000 cpm parada-[125I](41 fmol, 200 pM), competidor de 0,1 a 3000 nM, y albumina de suero

15 bovino 0,5 % (BSA). Los ensayos de enlace se llevaron a cabo a pH 5.0 en DMEM/2-(N-morfonilo) acido etanosulfonico (MES) 20 nM. Los ensayos de enlace a pH 8.0 se llevaron a cabo en DMEM/N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2-Acido Etanosulfonico (HEPES) 20 mM/bicarbonato sodico 50 mM. Las reacciones de control no contenlan un competidor (total) o no contenla celulas.

20 [0127] Las soluciones de tampon se prepararon primero, despues la proteasa libre BSA se anadio al 0,5 %. El

radioligando se anadio a la concentracion final de 0,001 pCi/pl. La preparation de las soluciones de reserva de peptido competidor se realizo disolviendo peptidos en 1 mg/ml en fosfato de sodio 50 mM pH 6.0. Las concentraciones se calcularon a partir del peso molecular del peptido proporcionado en el Certificado de Analisis. Las disoluciones competidoras se llevaron a cabo en fosfato de sodio 50 mM pH 6.0 que contenla 20 veces la concentracion final del 25 peptido que se probarla en la reaction de enlace (competidor 20x).

[0128] Las reacciones de enlace se ensamblaron en el siguiente orden:

i Radioligando y BSA en solution tampon.

30 ii 10 pl de competidor 20X. iii Celulas T84.

Las reacciones de enlace se mezclaron suavemente y se incubaron a 37 °C durante 1 h. La separation de la union de membrana a partir del radioligando libre se llevo a cabo aplicando las reacciones de enlace a filtros de fibra de vidrio 35 Whatman GF/C de 2,5 cm (penetrados con polivinilpirrolidona al 1 % en PBS) usando filtration al vaclo. Los filtros se enjuagaron dos veces con 5 ml de tampon PBS congelado y las medidas del radioligando atrapado se llevaron a cabo en un contador de centelleo. La determination de enlace especlfica se realizo sustrayendo la radioactividad limitante a partir de una reaccion que contenla exceso de competidor (1 pM) de la radioactividad llmite para cada muestra. La generation de curvas de enlace de radioligandos se realizo usando GraphPad Prism (software GraphPad, San Diego, 40 CA) y los datos se analizaron con regresion no lineal para calcular la concentracion de competidor que resulto en llmites de radioligando al 50 % (IC50). La constante de equilibrio de disociacion aparente (Ki) para cada competidor se obtuvo, a partir de los valores IC50 y una estimation determinada previamente de la disociacion constante del radioligando, Kd = 15 nM, usando el procedimiento de (Cheng and Prusoff, (1973) Biochem. Pharmacol. 22(23) 30993108). La concentracion de radioligando de 200 pM usada en los ensayos fue muy pequena en comparacion con su 45 constante de disociacion, el IC50 y los valores ki calculados (Tabla 5) tenlan un efecto identico.

Tabla 6: Ensayo de enlace de radioligando competitivo

Peptido

Kj a pH 5 (nM)

Peptido 3

1,2

Peptido 1

1,1

Defosfopeptido 1

10,5

Peptido 2

0,6

Defosfopeptido 2

4,5

[0129] La Tabla 6 muestra que el Peptido 1 y el Peptido 2 tienen similares potencias a las del Peptido 3 en el enlace a pH 5. Sin embargo, el Peptido 1 y el Peptido 2 desfosforilados tienen afinidades inferiores para GC-C a las del Peptido 3 en el ensayo de enlace.

5 Ejemplo 4: Transito Gastrointestinal en Ratones

[0130] El objetivo del ensayo fue probar el efecto de los peptidos agonistas de guanilato ciclasa C sobre el transito gastrointestinal in vivo en ratones. Los agonistas de guanilato ciclasa C administrados de manera oral han demostrado aumentar el % de Distancia Recorrida por una comida de carbon en ratones.

10

[0131] Para el ensayo, a los ratones CD-1 hembra (n=10 por grupo) que pesaban entre 25-30 g se dejaron ayunar durante la noche y se les dio acceso al agua ad libitum. El carbon activado (20 g; malla 100; Sigma car# 242276) se suspendio en goma 200 ml de goma arabica (100 mg/ml), y se agito durante al menos una hora. Los peptidos probados se prepararon en un vehlculo Tris 20 mM a pH 6.9.

15

[0132] Los peptidos probados y el vehlculo se administraron en dosis de 200 ml por sonda oral. Siete minutos despues de la dosificacion de los peptidos de prueba, se dosificaron por sonda oral 200 pl de suspension carbon/goma arabiga. Despues de 15 minutos, los ratones se sacrificaron por sobredosis de CO2. Se retiro el tracto gastrointestinal desde el esofago hasta el intestino ciego. La longitud total del intestino delgado se midio desde la union pilorica hasta

20 la union ileocecal. La distancia recorrida por el carbon se midio desde la union pilorica hasta el frente de carbon. La Distancia Recorrida (%) se determino como (distancia recorrida por el carbon/longitud total del intestino delgado) x 100. Se introdujeron los datos en el programa informatico GraphPad Prism y se analizaron por ANOVA usando la prueba post-hoc de comparacion multiple de Bonferroni. Las parcelas de datos y de ED50 tambien se determinaron usando el paquete de software GraphPad Prism.

25

[0133] Los efectos dependientes de la dosis de dosis agudas del Peptido 4, Peptido 1, Peptido 2, la forma desfosforilada del Peptido 1 y la forma desfosforilada del Peptido 2 en el transito GI se determinaron en ratones CD hembra. La distancia recorrida por el frente de carbon despues de siete minutos, expresada como un porcentaje de longitud total del intestino delgado se uso para calcular los valores de ED50 (Tabla 7).

30

Tabla 7: Aceleracion del transito GI superior en ratones

Peptido

ED50 (mg/kg)

Peptido 4

2,06

Peptido 1

5,61

Defosfopeptido 1

12,7

Peptido 2

2,47

Defosfopeptido 2

6,03

[0134] La Tabla 7 muestra que las formas desfosforiladas del Peptido 1 y del Peptido 2 exhibieron potencia

35 reducida cuando se compararon con sus peptidos respectivos cuando se administraron de manera oral en el modelo de transito GI superior en ratones.

Ejemplo 5: Secrecion de fluido en asas intestinales de rata

40 [0135] El efecto de los peptidos agonistas GC-C en secrecion se estudiaron mediante la inyeccion de los

peptidos agonistas GC-C descritos en el presente documento directamente en una asa aislada en ratas de tipo salvaje.

[0136] Las asas se aislaron mediante ligadura quirurgica de tres asas en el intestino delgado de la rata. La

metodologla para la formation de asas ligadas fue similar a la descrita en (London y col., 1997, Am J Physiol, p.G93- 45 105). Las asas se centraron mas o menos y en longitudes de 1-3 cm. Las asas se inyectaron con 200 pl de tanto peptido/agonista GC-C (0,1-5 mg) como vehlculo (Tris 20 mM, pH 7.5 o Ringer Krebs, Glucosa 10 mM, tampon HEPES(KRGH)). Despues de un tiempo de recuperation de hasta 90 minutos las asas se extirparon. Se registraron los pesos para cada asa antes y despues de la retirada del fluido contenido en las mismas. La longitud de cada asa tambien se registro. Se calculo una proportion de peso a longitud (P/L) para cada asa para determinar los efectos del

peptido agonista GC-C describe en el presente documento sobre la secrecion. El volumen del fluido de la asa tambien se determino.

[0137] Los datos que muestran aumentos en la secrecion de fluido, pH aumentado y secrecion de bicarbonato

5 en las asas duodenales ligadas en las ratas se muestran en la Figura 2 y en la Tabla 8. La Figura 2 muestra que el Peptido 2 tiene una potencia similar a la del Peptido 4 con respecto a la induccion de acumulacion de fluido en las asas duodenales de rata ligadas. La Tabla 8 proporciona los resultados de las asas duodenales en ratas ligadas usando 2,5 pg de peptido por asa.

10 Tabla 8: Secrecion de Fluido. aumento de pH, y secrecion de bicarbonato

Peptido

Tasa de acumulacion de fluido pl/min/cm pH pH Tasa de acumulacion de HCO3 Meq/min/cm3

Vehicle

0,5 7,5 0,00002

Peptido 4

2,0 8,2 0,00008

Peptido 2

2,3 8,1 0,00008

Defosfopeptido 2

2,3 ND ND

Peptido 1

1,8 7,7 0,00007

Defosfopeptido 1

2,0 7,7 0,00008

Ejemplo 6. Metabolismo in vitro en Fluido de Asa de Yeyuno de Raton

15 [0138] El objetivo de este estudio fue determinar la estabilidad de los peptidos fosforilados en fluido de asa de

yeyuno en raton. Peptido 2, peptido 2 desfosforilado (defosfopeptido 2), peptido 3, y peptido 2 etiquetado isotopicamente se usaron en el estudio. El peptido 2 etiquetado isotopicamente se sintetizo con alamina y leucina etiquetadas 13C, 15N (es decir, con una secuencia CCpS[13C6, 15N]LCcNp[13C6, 15N]ACTGC).

20 [0139] Cada peptido se sintetizo por la American Peptide Company, Inc., y se almaceno disecado a -20 °C. Se

preparo una solucion de 1 mg/ml para cada uno de los peptidos no etiquetados en hidrocloruro de aminoetano tris (hidroximetilo) (Tris-HCl) 1 M, pH 8 justo antes de llevar a cabo el ensayo de fluido en asa intestinal de raton. Se preparo una solucion de 500 ng/ml de peptido 2 no etiquetado 13C, 15N en acido formico 0,1 % en agua y se utilizo para diluir las muestras de yeyuno para los analisis LC-Mc/MS.

25

[0140] Para estudiar el metabolismo del peptido 2, defosfopeptido 2, y del peptido 3 in vitro, se incubaron los peptidos en el fluido de yeyuno de rato extraldo de las asas ligadas del intestino delgado de ratones. Para recolectar el llquido, de hizo ayunar a los ratones durante la noche con acceso total a agua. Se anestesiaron con isofluorano por cirugla y se sometieron a laparotomla en la que el intestino delgado se exteriorizo. Se realizaron asas de yeyuno de 3

30 a 4 cm de longitud con suturas que empezaban por 7 cm desde el esflnter pilorico del estomago. Una vez se formaron las asas, se inyectaron con 200 pl de tampon fosfato salino (PBS) (10 mM, pH 7.4). La pared abdominal y la piel de los animales se saturo seguidamente, y se permitio a los animales recuperarse durante 30 minutos. Despues de la recuperacion, se sacrificaron los animales, las asas se extirparon y los fluidos interiores se recuperaron y almacenaron a -80 °C hasta su uso.

35

[0141] Para cada peptido, se anadio 25 p/l de la solucion de reserva de peptido de 1 mg/ml a 25 pl de Tris-HCl 1 M y 25 pl de tampon fosfatasa intestinal de ternera (CIP) 10x que contenla Tris-HCl 500 mM, cloruro sodico (NaCl) 1 M, cloruro de magnesio (MgCL) 0,1 mM, pH 8. Se iniciaron las reacciones anadiendo 175 pl del fluido de asa de yeyuno de raton o 175 pl del tampon Tris-HCl 1 M pH 8 para controlar las reacciones. La concentracion final de cada

40 peptido fue de 100 pg/ml. Las reacciones se mezclaron continuamente y se mantuvieron a 37 °C sobre un agitador de placa. A 0, 2, 5, 10, 20, 30, 60, 90 y 120 minutos despues de anadir el fluido de asa intestinal de raton, se tomo una allcuota de 25 pl y se anadio a 25 pl de acido tricloroacetico 12 % a 4 °C para detener la reaccion. Se anadio 200 pl adicionales de acido formico 0,1 °C a estas reacciones para fines de dilucion. Estas muestras se diluyeron seguidamente adicionalmente tomando 20 pl de cada muestra y anadiendola a 480 pl de acido formico 0,1 % en agua

45 que contenla 500 ng/ml del peptido 2 etiquetado como 13C, 15N estandar interno.

[0142] La concentracion de peptido 2, defosfopeptido 2, y de peptido 3 in las muestras se mudieron por LC-

MS/MS. Se analizaron todas las muestras utilizando un espectometro de masa cadruple triple Applied Biosystems/MDS SCIEX API 4000 equipado con un sistema de cromatografia Kquida de alto rendimiento (HPLC). El espectometro de pasa se hizo funcionar en modo de supervision de reaccion multiple (MRM), con una resolucion establecida de 1,2 Da. El instrumento y los parametros cromatograficos para cada compuesto se resumen en la Tabla 5 9.

Tabla 9: Peptido 2, defosfopeptido 2 (defosfo-Pep. 2), peptido 3, y peptido 2 etiquetado como 13C. 15N (iso-lab.-Pep.

2) Parametros del Procedimiento LC-MS/MS

MS:

Applied Biosystems APl 4000

Modo del Ion

ESI+

Tipo de Exploracion:

MRM

Compuesto:

Transicion Permanencia Tiempo (ms) Permanencia Potencial (V) Energia de Colision (V) Potencial de Salida de la Celula (V) Tiempo de Referencia (min)

Peptido 2

677 > 627 100 65 20 11 2,5

dephosp.-Pep. 2

636 > 627 100 65 20 11 2,5

Peptido 3

740 >182 100 65 30 14 2,5

Iso-lab-Pep. 2

682 >633 100 65 11 2,5

HPLCt

Agilent Technologies 1200 Series

Columna:

Atlantis T3, 2,1 x 50 mm 5 uM (PN: 186003734)

Caudal:

400 uL/min

Temperatura:

o o O

Muestreador automatico.

O) o o

Compuesto:

Transicion Permanencia Tiempo (ms) Permanencia Potencial (V) Energia de Colision (V) Potencial de Salida de la Celula (V) Tiempo de Referencia (min)

Inyeccion Volumen:

20 ml,

Fases Moviles:

A - acido casero 0,1 % en agua

B = acido formico 0,1 % en agua de alcohol de isopropilo de acetonitrilo 85:10:5 (V:V:V)

Gradiente:

Tiempo (min) % A % B

0 98 2

0,5 98 2

0,6 20 80

2,0 20 80

2,1 98 2

5,0 98 2

[0143] Los datos LC-MS/MS se procesaron usando el software Analyst version 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS SCIEX). La relacion del area de pico (relacion del area de pico de analito con el area de pico estandar) se uso para calcular el porcentaje restante de cada peptido.

5

[0144] La Figura 3 muestra el porcentaje restante del peptido 2 y del fosfopeptido 2, y el peptido 3 en los nueve puntos medidos durante los 120 minutos de incubacion en el fluido de yeyuno de raton y la reaccion de control (Tris- HCl 1 M) a 37 °C. Despues de la incubacion en el fluido de asa de yeyuno de raton, solo el 5,3 % del peptido 2 permanecio despues de 120 minutos. El metabolito, defosfopeptido 2, se formo en esta reaccion y aumento la

10 concentracion durante los primeros 20 minutos, entonces mostro una lenta disminucion durante el tiempo restante. En la reaccion de control, el peptido 2 no se metabolizo y no se formo defosfopeptido 2. Despues de la incubacion en el fluido de yeyuno de raton, solo el 5,6 % del defosfopeptido 2 permanecio despues de 120 minutos. Por el contrario, el defosfopeptido 2 no se metabolizo en la reaccion de control. El Peptido 3 se metabolizo rapidamente y no se detecto despues de 90 minutos en el fluido de yeyuno de raton. En la reaccion de control, el peptido 3 no se metabolizo.

15

[0145] El Peptido 2, su metabolito defosfopeptido 2, y su peptido 3 se metabolizaron en el fluido de asa de yeyuno de raton. La formacion de defosfopeptido 2 se observo cuando el peptido 2 se incubo en el fluido de asa de yeyuno de raton a 37 °C. El defosfopeptido 2 y el peptido 3 se degradaron mas rapido en el fluido intestinal de raton que el peptido 2.

20

Ejemplo 7: Vaciamiento Gastrico en Ratas Diabeticas Inducidas por Strepozotocin (STZ)

[0146] El efecto de los peptidos 2 y 3 administrados por sonda oral sobre el vaciamiento gastrico de llquido (LGE) en ratas diabeticas inducidas por strepozotocin (STZ) se estudio. Las ratas macho (Sprague-Dawley; n=60) que

25 pesaban ~300 g (suministradas por Taconic) se alojaron en condiciones controladas de temperatura ambiente (22 °C) y luz (12:12 h ciclo de luz oscura) con acceso libre a comida y agua. Despues de un periodo de aclimatacion de una semana, el protocolo STZ para induccion de diabetes de tipo I se inicio.

[0147] Para inducir la diabetes de tipo I en animales en el grupo (n=50) experimental de STZ, se administro un 30 regimen diario de inyecciones intraperitoneales de STZ (20 mg/kg) contenidas en un tampon de citrato durante 5 dlas.

Un grupo de control recibio un volumen similar del vehlculo (n=10) en el mismo calendario de inyeccion. Se dio 9 semanas a todos los animales para desarrollar diabetes/recuperarse de las inyecciones. Se supervisaron los niveles de glucosa en sangre despues de 5 dlas de inyeccion de STZ en el dla 0 (es decir, en el dla 6) y en la semana 1,2 y 10 (es decir, al inicio de la semana 10 - el dla del experimento). Se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola, 35 excepto en el dla del experimento de Vaciamiento Gastrico Llquido (LGE) (comiendo de la semana 10), en la que la sangre se tomo directamente del corazon.

[0148] El procedimiento LGE implica 6 grupos (n=10/grupo) de los cuales cinco eran diabeticos y un grupo era no diabetico. Antes del experimento LGE, se retuvieron los alimentos durante la noche, mientras que el agua se retuvo

40 2 horas antes de comenzar el procedimiento de vaciamiento gastrico.

[0149] El peptido 3 y el peptido 2 se disolvieron de manera separada en un vehlculo de la solucion de sacarosa 20 % que contenla rojo de fenol 0,1 mg/ml. Las dosis de farmaco para los compuestos empleados fueron (en mg/kg): 0,1 (peptido 2 y 3), 0,3 y 1,0 (peptido 2 solo). Para probar su efecto sobre LGE, se administro entonces un volumen

45 de 0,5 ml de la solucion de farmaco a traves de una aguja de calibre 18 (6 cm de longitud) en el estomago de tanto los animales diabeticos como los animales de control. Cada animal en los grupos experimentales diabeticos recibio una unica dosis del farmaco de un compuesto de Ironwood (peptido 2 o 3). En el grupo no diabetico, se administro a los animales un volumen similar de solo la solucion vehlculo. Se permitio a todos los animales 15 minutos para que el vaciamiento gastrico tuviera lugar, despues del cual se eutanasiaron con isoflurano.

50

[0150] Despues de la eutanasia, mediante laparotomla, se accedio al estomago y se ligo en cada animal en el esflnter esofagico inferior y en el esflnter pilorico. A continuacion, se expuso el corazon a traves de una incision en el diafragma, se tomo una muestra de sangre y se evaluo el nivel de glucosa con un glucometro. Se extirpo entonces el estomago del animal y se almaceno durante la noche en un tubo de 10 ml que contenla etanol 95 %. A continuacion,

55 el tejido se homogeneizo, centrifugo (dos veces a 40000 rpm durante 30 min) y se probo el sobrenadante para absorbencia en un espectrofotometro (BioMate 3, Thermospectronic, Inc.) a longitud de onda de 410 nm. Se compararon los resultados con un "valor cero" derivado a partir de la administracion de la solucion de sacarosa/rojo

de fenol en el estomago de un animal que se sacrifico inmediatamente y se retiro su estomago para determinar el "porcentaje retenido" para cada grupo.

[0151] Se analizaron los datos en terminos de porcentaje promedio (± SEM) del llquido retenido en animales 5 sacrificados en un punto de tiempo de 15 min. La significacion estadlstica se determino usando las pruebas post hoc

de comparacion ANOVA y Student-Newman-Keuls. La significacion estadlstica se establecio en P <0,05.

[0152] Los niveles de glucosa en ayuno de tanto los animales diabeticos STZ como los animales de control fueron >300 mg/dl en el dla del experimento de vaciamiento gastrico. Los pesos globales de los animales diabeticos

10 STZ fueron sensiblemente menores (aproximadamente 150 g de media) que de los animales no diabeticos en el dla del experimento. Ambos grupos de animales empezaron en aproximadamente 300 g en el momento del tratamiento con STZ; los animales no tratados ganaron, de media, 130 g durante las 10 semanas antes del tratamiento LGE, mientras que los animales diabeticos STZ permanecieron en un peso constante (~300g) hasta el ayuno (aproximadamente 280 g de media).

15

[0153] Los experimentos se realizaron para determinar el efecto de los peptidos 2 y 3 en LGE en ratas diabeticas inducidas por STZ (9 dlas). Una dosis de peptido 3 (0,1 mg/kg) y tres dosis de peptido 2 se evaluaron. Los datos (Figura 4) indican que:

20 [0154] Las ratas diabeticas inducidas por STZ exhiben un retraso significante en el vaciamiento gastrico de un

llquido comido despues de 15 min de administracion de vehlculo comparado con las ratas de control (retencion 88,24+7,12 % comparada con 45,34+7,1 % en controles).

[0155] Esta diferencia significante entre animales diabeticos STZ y controles tambien se extendio a aquellos

25 animales diabeticos a los que se administro el peptido 2 y el peptido 3 como se calculo en la prueba post hoc de comparacion multiple de Student-Newman-Keuls. En el caso del Peptido 2, las dos mayores dosis (0,3 y 1,0 mg/kg) potenciaron significativamente el LGE en comparacion con los animales diabeticos que recibieron solo la solucion vehlculo.

30 [0156] Los resultados del presente estudio muestran que hubo un retraso significante en la tasa de LGE en

animales diabeticos inducidos por STZ (vehlculo dado) en comparacion con los controles no diabeticos. Ademas, los datos del analisis unidireccional de la varianza (ANOVA) que emplean multiples pruebas de comparacion post hoc (Student-Newman-Keuls) indican que habla presentes diferencias estadlsticamente significantes en LGE entre los animales diabeticos STZ a los que se administro de manera oral la solucion vehlculo en comparacion con aquellos 35 que recibieron el peptido 3 (0,1 mg/kg) o el peptido 2 (0,3 o 1,0 mg/kg). Sin embargo, en comparacion con los controles no diabeticos que recibieron solo la solucion vehlculo, estas diferencias anteriormente mencionadas no fueron evidentes.

[0157] Estas observaciones demuestran que el peptido 3 fue eficaz en las dosis estudiadas (0,1 mg/kg) en la 40 restauracion LGE en aquellos niveles de control no diabeticos. Del mismo modo, el peptido 2 en dosis de 0,3 y 1,0

mg/kg dadas de manera oral restauraron LGE en animales diabeticos inducidos por STZ en aquellos controles normales. En la dosis mas baja (0,1 mg/kg), el peptido 2 no restauro estadlsticamente significativamente LGE en aquellos controles normales, no obstante, los resultados mostraron una tendencia visual hacia una disminucion del porcentaje de llquido retenido.

45

OTRAS REALIZACIONES

[0158] El debate anterior divulga y describe de manera meramente ejemplar las realizaciones de la presente invention. Alguien experto en la materia reconocera facilmente a partir de tal debate y a partir de los dibujos y

50 reivindicaciones adjuntas, que diversos cambios, modificaciones y variaciones pueden realizarse en la misma sin alejarse del ambito de la invencion como se define en las siguientes reivindicaciones.

<110> Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Currie, Mark G. Fretzen, Angelika Kessler, Marco Zimmer, Daniel P.

55 <120> Tratamiento Para Trastornos Gastrointestinales

<130> 223355-077US1-304578

<150> 61/259264

<151> 2009-11-09 <160> 16

<170> PatentIn version 3.5 5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial 10 <220>

<223> Secuencia Artificial <220>

<221 > MISC_FEATURE 15 <222> (1)..(1)

<223> Xaa1, es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, beta-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Asp gamma- carboxilado, Glu, D-Glu, Glu gamma-carboxilado, acido alfa-aminosuberico (Asu), acido alfa-aminoadlpico (Aad), acido a-aminopimelico (Amp), o es

20 <220>

<221 > VARIANTE <222> (1)..(1)

<223> si Xaa1 esta presente, Xaa1 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico 25

<220>

<221 > VARIANTE <222> (1)..(2)

<223> si Xaa1 esta ausente y Xaa2 esta presente, entonces Xaa2 puede modificarse sobre su grupo amino mediante 30 metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico

<220>

<221 > VARIANTE 35 <222> (1)..(3)

<223> si tanto Xaa1 como Xaa2 estan ausentes, entonces Xaa3 puede modificarse sobre su grupo amino mediante metilo, acido etanodioico, acido propanodioico, acido butanodioico, acido pentanodioico, acido hexanodioico, acido heptanodioico o acido octanodioico

40 <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (2)..(3)

<223> Xaa2 and Xaa3 son independientemente ASP, Asp gamma-carboxilado, Glu, Glu gamma-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o ausente 45

<220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (4)..(4)

<223> Xaa4 es Cys o D-Cys 50

<220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (6)..(6)

<223> Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, fosfato de 4-hidroxivalina, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr 55

<220>

<221 > VARIANTE <222> (6)..(6)

<223> Xaa6 puede ser cualquier aminoacido que puede fosforilarse

<220>

<221> VARIANTE <222> (6)..(6)

5 <223> Xaa6 puede ser cualquier aminoacido que puede fosforilarse <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (7)..(7)

10 <223> Xaa7 es Tyr, Leu, Phe o Ile <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (8)..(8)

15 <223> Xaa8 es Cys o D-Cys <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (14)..(14)

20 <223> Xaa14 es Thr, Ala o Phe <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (16)..(16)

25 <223> Xaa16 es Cys o D-Cys <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (17)..(17)

30 <223> Xaa17 es Tyr

<400> 1

Cys 1

35

<210>2 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial 40 <220>

<223> (Peptido 5)

<220>

<221 > MOD_RES <222> (5)..(5)

45 <223> FOSFORILACION <400>2

Asp Asp Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10 15

50

<210>3 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial 55

D-Tyr, o esta ausente

Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 5 10

<220>

<223> Secuencia Artificial <220>

5 <221 > MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> FOSFORILACION

<400>3

10

Asp Asp Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 15 10 15

<210>4 <211> 16 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> (Peptido 6)

20

<220>

<221 > MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> FOSFORILACION 25

<400> 4

Asp Asp Cys Cys Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 15

30 <210>5 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Secuencia Artificial

<220>

<221 > MOD_RES 40 <222> (5)..(5)

<223> FOSFORILACION

<400> 5

Asp Asp Cys Cys Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys

15 10 15

45

<210>6 <211> 14 <212> PRT

50 <213> Secuencia Artificial <220>

<223> (Peptido 1)

<221 > MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> FOSFORILACION 5

<400>6

Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10

10 <210>7 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> (Peptido 2)

<220>

<221 > MOD_RES 20 <222> (3)..(3)

<223> FOSFORILACION

<400> 7

25

Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys

15 10

<210>8 <211> 14 <212> PRT

30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial

35 <220>

<221 > MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> FOSFORILACION

40 <400> 8

Cys Cys Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 " ‘ "

<210>9 45 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

50 <223> Secuencia Artificial <220>

<221 > MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> FOSFORILACION

5 <400>9

Cys Cys Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 15 10

<210> 10 10 <211> 14 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

15 <223> (Peptido 1 Desfosforilado)

<400> 10

Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10

20

<210> 11 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial 25

<220>

<223> (Peptido 2 Desfosforilado)

<400> 11 30

Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 15 10

<210> 12 <211> 14 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> (Peptido 3) 40

<400> 12

Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr

15 10

45 <210> 13 <211> 14 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

50 <220>

<223> (Peptido 4)

<400> 13

Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 ’ * *

5

<210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli

10

<400> 14

Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly 15 10 15

Cys Tyr

15 <210> 15 <211> 14 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial 20 <220>

<223> Secuencia Artificial <220>

<221 > MOD_RES 25 <222> (3)..(3)

<223> FOSFORILACION

<220>

<221 > MISC_FEATURE 30 <222> (4)..(4)

<223> Xaa es Tyr o Leu

<220>

<221 > MISC_FEATURE 35 <222> (14). .(14)

<223> Xaa es Tyr, D-Tyr, o esta ausente <400> 15

Cys Cys Ser Xaa Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Xaa

15 10

40

<210> 16 <211> 13 <212> PRT

45 <213> Secuencia Artificial <220>

<223>Peptido2 radiomarcado

<220>

<221 > MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> FOSFORILACION 5

<220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (4)..(4)

<223> [1 3c6, 15N] Radiomarcados.

10

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9)

<223> [1 3c6, 15N] Radiomarcados. 15

<400> 16

Cys Cys Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 1 5 10 ^ ~

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que dicho peptido comprende la

   secuencia de aminoacidos:

   Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

   Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

   Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

   Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

   Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

   Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

   Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; or Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

   El peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que consiste en la secuencia de aminoacidos:

   Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

   Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

   Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

   Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

   Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;

   Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;

   Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; or Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.
2. 3. El peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que dicho peptido consiste en la secuencia de aminoacidos Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

   15
3. 4. El peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que

   dicho peptido no comprende mas de 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15 o 14 aminoacidos.
4. 5. El peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las

   20 reivindicaciones 1-4, en el que dicho peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo se afsla o purifica.
5. 6. Una composicion farmaceutica que comprende un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

   25 7. Una composicion farmaceutica que comprende un portador farmaceuticamente aceptable, un peptido

   de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o uno o mas agentes seleccionados de entre (i) un cation seleccionado de entre Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+, y (ii) una amina primaria con impedimento esterico.
6. 2.

   dicho peptido

   10
7. 8. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que dicho Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+ se proporciona como acetato de magnesio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de calcio, cloruro de calcio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, acetato de zinc, cloruro de zinc, fosfato de zinc, sulfato de zinc, acetato de manganeso, cloruro de manganeso, fosfato de manganeso, sulfato de manganeso, acetato

   5 de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, sulfato de potasio, acetato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, sulfato de sodio, acetato de aluminio, cloruro de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio.
8. 9. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que la amina primaria con impedimento esterico es un aminoacido seleccionado de entre un aminoacido que se genera de forma natural, un

   10 aminoacido que no se genera de forma natural y un derivado del aminoacido; y en la que el aminoacido que se genera de forma natural es histidina, fenilalanina, alanina, acido glutamico, acido aspartico, glutamina, leucina, metionina, asparagina, tirosina, treonina, isoleucina, triptofano o valina o el aminoacido que no se genera de manera natural es acido carboxflico 1-aminociclohexano, lantanina o teanina.

   15 10. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que la amina primaria con

   impedimento esterico tiene la formula:

   imagen1

   20 en la que R1, R2 y R3 independientemente seleccionados de entre: H, C(O)OH, C1-C6 alquil, alquil eter C1-C6, alquil tioeter C1-C6, acido carboxflico alquil C1-C6, carboxilamida de alquilo C1-C6 y alquilaurflico, en la que cualquier grupo puede sustituirse individualmente o de manera multiple con: halogeno o amino, y siempre que no mas de uno de los R1, R2 y R3 es H.

   25 11. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que la amina primaria con

   impedimento esterico se selecciona de entre ciclohexilamina, 2-metilbutilamina, una amina polimerica, y quitosano.
9. 12. La composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-11, que comprende ademas un antioxidante, un aglutinante, un aditivo o un relleno farmaceuticamente aceptable.

   30
10. 13. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que el aglutinante o aditivo farmaceuticamente aceptable se selecciona de entre alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona (povidona), un almidon, maltodextrina y un eter de celulosa.

    35 14. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que el aglutinante o aditivo

    farmaceuticamente aceptable es un eter de celulosa seleccionado de entre: alcohol de polivinilo, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxietilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa.
11. 15. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que el relleno

    40 farmaceuticamente aceptable es celulosa, isomaltosa, manitol, lactosa o fosfato de calcio dibasico.
12. 16. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 15, en la que el relleno

    farmaceuticamente aceptable es celulosa seleccionada de entre celulosa microfina o celulosa microcristalina.

    45 17. La composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-11, que

    comprende ademas un agente terapeutico adicional.
13. 18. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 17, en la que dicho agente terapeutico

    adicional se seleccione de entre uno o mas entre un agente analgesico, un antidepresivo, un agente estimulante de la 50 movilidad o procinetico, un antimetico, un antibiotico, un inhibidor de la bomba de protones, un bloqueador acido, un inhibidor de la PDE5, un antagonista de la bomba de acido, un antagonista de la GABA-B, un secuestrante de acidos

    biliares y un agente protector de mucosa.
14. 19. Una unidad de dosificacion que comprende la composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-18.

    5
15. 20. La unidad de dosificacion de acuerdo con la reivindicacion 19, en la que dicha unidad de dosificacion es una capsula, una tableta, o comprende de 5 mg a 1 mg de dicho peptido.
16. 21. Una composicion farmaceutica para su uso en tratamiento de un trastorno gastrointestinal, en la que la 10 composicion farmaceutica comprende un peptido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una

    cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
17. 22. La composicion farmaceutica para su uso de la reivindicacion 21, en la que dicho trastorno

    gastrointestinal es gastroparesia, Ileo gastrico postoperatorio, un trastorno funcional del esofago, un trastorno funcional

    15 gastroduodenal, enfermedad por reflujo gastroesofagico (ERGE), enfermedad cellaca, mucositis, o una ulcera duodenal o estomacal.
18. 23. La composicion farmaceutica para su uso de la reivindicacion 22, en la que dicho trastorno

    gastrointestinal es gastroparesia seleccionado de entre gastroparesia idiopatica, diabetica o postoperatoria.

    20
19. 24. La composicion farmaceutica para su uso de la reivindicacion 22, en la que dicho trastorno

    gastrointestinal es un trastorno funcional del esofago seleccionado de entre acidez estomacal, dolor toracico funcional de presunto origen esofagico, disfagia funcional y globo.

    25 25. La composicion farmaceutica para su uso de la reivindicacion 22, en la que dicho trastorno

    gastrointestinal es un trastorno funcional gastroduodenal seleccionado de entre dispepsia funcional, un trastorno de flatulencias, un trastorno de nauseas o vomitos, y un slndrome de rumiacion.