MX2012005368A - Tratamientos para transtornos gastrointestinales. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona péptidos que son útiles para el tratamiento de trastornos gastrointestinales. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para tratar trastornos gastrointestinales y composiciones farmacéuticas para lograr lo mismo. En algunas modalidades, estas composiciones farmacéuticas incluyen formas de dosis orales.

Description

TRATAMIENTOS PARA TRASTORNOS GASTROINTESTINALES Campo de la Invención Esta invención se refiere a péptidos, composiciones y métodos para tratar trastornos del tracto gastrointestinal superior .

Antecedentes de la Invención La dispepsia funcional (FD, por sus siglas en inglés) y la gastroparesia (GP) son trastornos del tracto gastrointestinal superior (GI, por sus siglas en inglés) que se caracterizan colectivamente por síntomas que incluyen sensación de plenitud, dolor epigástrico (abdominal superior) y/o quemadura, nausea, vómito y hartazgo temprano. Las opciones terapéuticas para pacientes con FD y GP están extremadamente limitadas, debido tanto a la carencia de eficiencia como a los pobres perfiles de seguridad para las terapias existentes. La dispepsia se define como la presencia de uno o más síntomas de dispepsia (dolor epigástrico, quemadura, hartura postpandrial molesta, y hartazgo temprano) que se considera que se originan de la región gastroduodenal, en la ausencia de cualquier enfermedad orgánica, sistémica o metabólica que probablemente va a explicar los síntomas (ver Drossman, D.A., ed. , Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders, 3rd Ed. , McLean, VA: Degnon Associates, Inc., 2006). La FD se refiere a dispepsia que no REF. :230478 tiene explicación estructural después de investigaciones médicas normales, que incluyen endoscopia superior. Los mecanismos patofisiológicos que pueden estar comprendidos en FD incluyen, entre otros, vaciamiento gástrico retrasado, acomodo gástrico deteriorado, hipersensibilidad a distensión gástrica, sensibilidad duodenal alterada a lípidos o ácidos, y motilidad duodenoyeyunal anormal. También se ve una exposición ácida, duodenal, prolongada en algunos pacientes con FD y GP, y esta exposición puede desacelerar el vaciamiento gástrico y provocar síntomas tipo FD y GP. La dispepsia es un síndrome común que da cuenta de aproximadamente 30 % de los casos vistos por los gastroenterólogos , con la FD que representa aproximadamente 60 % de todos los casos de dispepsia.

La GP se refiere a motilidad gástrica anormal caracterizada por vaciamiento gástrico retrasado en la ausencia de obstrucción mecánica. La GP puede ser idiopática o se puede provocar por varias condiciones, que incluyen diabetes mellitus Tipo I o Tipo II, infección viral, escleroderma, trastornos del sistema nervioso tal como enfermedad de Parkinson, trastornos metabólicos tal como hipotiroidismo, cólico post-operativo, y ciertos medicamentos, que incluyen medicamentos narcóticos contra el dolor, antidepresivos tricíclicos y bloqueadores del canal de calcio. El tratamiento de cáncer, incluyendo fármacos quimioterapéuticos y radiación al pecho y abdomen también puede provocar gastroparesis , ya sea de manera temporal o de forma permanente. Los síntomas más comunes son nausea, vómito, sensación de plenitud, dolor epigástrico, pérdida de peso y hartazgo temprano. La gastroparesia.es una condición crónica que puede conducir a hospitalización frecuente, a calidad disminuida de vida, y ha incapacidad incrementada, y en algunos casos, a mortalidad incrementada. La GP sintomática severa es común en individuos que padecen de diabetes, que afecta de 5-10 % de los diabéticos para una población total de pacientes de 1 millón sólo en los Estados Unidos de América.

Las opciones convencionales de tratamiento para FD y GP, así como otros trastornos gastrointestinales superiores, han sido de eficiencia limitada para muchos pacientes. De esta manera, existe la necesidad de nuevos compuestos y métodos para tratar FD, GP y otros trastornos gastrointestinales .

Breve Descripción de la Invención La presente invención presenta péptidos, composiciones, y métodos relacionados para tratar condiciones y trastornos gastrointestinales superiores (por ejemplo, dispepsia, GP, cólico gástrico post-operativo, un trastorno esofágico funcional, un trastorno gastroduodenal funcional, enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD, por sus siglas en inglés) , o una úlcera duodenal o estomacal) así como otras condiciones y trastornos se describen en la presente. Las composiciones presentan péptidos que activan la guanilato-ciclasa C (GC-C) en el GI superior pero activan la GC-C en el GI inferior mucho más débilmente o para nada. Sin que se una a ninguna teoría particular, los péptidos de la invención son útiles debido a que pueden aliviar síntomas de trastornos del GI superior (en totalidad o en parte al incrementar la motilidad del GI superior y/o al reducir el dolor/incomodidad epigástrica y sensación de plenitud) sin provocar efectos pronunciados en el tracto GI inferior (por ejemplo, alteraciones que limitan la dosis en los hábitos del intestino, incluyendo diarrea) a niveles de dosis y frecuencia de dosificación, suficiente para reducir los síntomas GI superiores. Los péptidos de la invención también son útiles para mejorar incomodidad y dolor gastrointestinal.

Un aspecto de la presente invención proporciona un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Cys9 Asni0 Pron Ala12 Cysi3 Xaai4 Glyi5 Xaa16 Xaai , o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; en donde Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, ß-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, D-Glu, Glu ?-carboxilada, a-ácido aminosubérico (Asu) , a-ácido aminoadípico (Aad) , a-ácido aminopimélico (Apm) , o está ausente; Xaa2 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilada, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa3 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilada, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa4 es Cys o D-Cys; Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, -hidroxivalina-fosfato, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr; Xaa es Tyr, Leu, Phe o lie; Xaa8 es Cys o D-Cys; Xaaa4 es Thr, Ala o Phe; Xaaie es Cys o D-Cys ; y Xaa17 es Tyr, D-Tyr, o está ausente; en donde: si Xaai está presente, se puede modificar Xaai en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; si Xaai está ausente y Xaa2 está presente, entonces se puede modificar Xaa2 en su grupo metilo por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; o si tanto Xaai como Xaa2 están ausentes, entonces Xaa3 se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico .

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido de la presente invención.

Un tercer aspecto de la presente invención proporciona métodos para tratar un trastorno gastrointestinal, que incluye administrar una composición farmacéutica de acuerdo a la presente invención.

Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en la descripción anexa.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1A ilustra la reacción de un péptido de ejemplo de la presente invención con fosfatasa alcalina.

La Figura IB ilustra la hidrólisis del p-nitrofenilfosfato de control por fosfatasas; La Figura 2 presenta un ejemplo que muestra que el Péptido 2 y el Péptido 4 promueven la secreción de fluido duodenal .

La Figura 3 presenta los resultados de un estudio de la estabilidad del Péptido 2, Desfosfo-péptido 2, y Péptido 3 en fluido intestinal (yeyuno) de ratón; La Figura 4 presenta los resultados de un estudio del efecto de los Péptidos 2 y 3 en el vaciamiento gástrico líquido en ratas diabéticas inducidas con STZ; Estas figuras se proporcionan a manera de ejemplo y no se propone que limiten el alcance de la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención La guanilato-ciclasa C (GC-C) es un receptor transmembrana que está localizado en la superficie apical de células epiteliales en el estómago y en el intestino. El receptor tiene un dominio extracelular de unión a ligando, una región transmembrana individual y un dominio de guanilil-ciclasa C-terminal. Cuando un ligando se une al dominio extracelular de GC-C, el dominio catalítico intracelular cataliza la producción de cG P a partir de GTP . Jn vivo, este incremento en cGMP intracelular inicia una cascada de eventos que conduce a secreción incrementada de cloruro y bicarbonato en el lumen intestinal, pH luminal incrementado, absorción disminuida de sodio luminal, secreción incrementada de fluido, y aceleración de tránsito intestinal. cGMP, que se segrega bidireccionalmente del epitelio en la mucosa y lumen, también se ha mostrado que amortigua la activación de fibras C aferentes, sugiriendo un mecanismo potencial para los efectos analgésicos observados de los agonistas de GC-C en dolor visceral.

. El linaclótido, un agonista peptídico de GC-C que se administra oralmente y actualmente en ensayos clínicos para tratamiento de síndrome de intestino irritable con constipación (IBS-c, por sus siglas en inglés) y constipación crónica (CC) , tiene numerosos efectos en la fisiología de GI inferior que incluyen: (1) dolor visceral reducido (2) sensación reducida de plenitud, y (3) tránsito incrementado de GI, lo que puede conducir a frecuencia incrementada de evacuación y consistencia mejorada de evacuación. El linaclótido administrado oralmente actúa de manera local al activar GC-C en la superficie luminal; no hay niveles detectables de linaclótido vistos sistemáticamente después de la administración oral a niveles de dosis terapéuticas. De esta manera, los resultados de ensayos clínicos de linaclótido, así como de estudios pre-clínicos que se han realizado con linaclótido y péptidos relacionados, sugieren que los agonistas peptídicos de GC-C se pueden usar de manera terapéutica .

Sería útil tener un agonista de GC-C que se pudiera usar para aliviar síntomas y trastornos del GI superior (por ejemplo, dispepsia funcional (FD) y gastroparesis (GP) ) sin promover efectos pronunciados en los hábitos del intestino que pueden resultar de la estimulación de GC-C en las partes inferiores del tracto GI. Este agonista de GC-C disminuiría el potencial de eventos adversos en el GI inferior, incluyendo diarrea y hábitos alterados del intestino. Los agonistas peptídicos de GC-C descritos en la presente son más activos en el tracto GI superior (por ejemplo, el estómago y el duodeno) , y menos activos en el tracto GI inferior. Estos agonistas tendrían beneficios en pacientes que padecen de trastornos GI superior (por ejemplo, FD y GP) al (1) reducir el dolor visceral a través de la producción de cGMP y/u otros mecanismos, (2) disminuir la sensación de plenitud, (3) incrementar el vaciamiento gástrico y/o el tránsito en el intestino delgado superior (por ejemplo, tránsito duodenal) , y (4) neutralizar el ácido en el duodeno al promover la secreción de bicarbonato. De manera importante, estos agonistas, en virtud de su actividad dirigida al GI superior, serán capaces de aliviar los síntomas de FD y GP sin provocar efectos pronunciados en los hábitos del intestino (por ejemplo, que pueden resultar de la estimulación de GC-C en las partes inferiores del tracto GI) .

En un aspecto, la invención proporciona un nuevo agonista peptídico de GC-C útil para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, particularmente trastornos del GI superior tal como FD y GP. El agonista peptídico de GC-C se dísela para ser activo en el GI superior, incluyendo el esófago, estómago e intestino delgado o superior (duodeno) pero para ser menos activo conforme recorre el resto del intestino delgado e intestino grueso. Los péptidos de la invención también son útiles para mejorar la incomodidad y el dolor gastrointestinal. El agonista peptídico de GC-C contiene un fosfoamino ácido, por ejemplo, una fosfoserina, para reemplazar un glutamato o aspartato conservado encontrado en otros péptidos agonistas de GC-C. El fosfato de un ácido fosfoamino ácido -OP032", tal como fosfoserina, es capaz de actuar como un biomimético para el COO" del glutamato o aspartato tal que el péptido que contiene fosfoamino ácido es capaz de unirse a y activar GC-C. El péptido que contiene fosfoamino ácido se puede desfosforilar por fosfatasas alcalinas intestinales, lo que reduce en su mayor parte la actividad agonista y unión del GC-C del péptido. Las fosfatasas alcalinas intestinales se encuentran a todo lo largo del tracto GI, y son más activas en un ambiente luminal alcalino, incluyendo el intestino delgado. El péptido que contiene fosfoamino ácido es capaz de activar GC-C en el tracto GI superior, incluyendo el ambiente ácido del estómago y el tracto GI superior, para promover la secreción del fluido y bicarbonato. Puesto que el péptido promueve secreción incrementada de fluido y bicarbonato en el GI superior, el lumen intestinal llega a ser más alcalino, activando de esta manera la actividad de fosfatasa alcalina. De esta manera a través de la acción del péptido en GC-C así como el movimiento del péptido a través del intestino, el fosfoamino ácido del péptido se convierte al aminoácido desfosforilado, disminuyendo de este modo su actividad conforme un agonista de GC-C transita desde el GI superior la GI inferior.

Como se usa en la presente, el término "P- que precede un aminoácido o la vibración de tres letras del mismo, se refiere a un fosfoaminoácido . Por ejemplo, los términos "P-Ser" , "P-Thr", "P-Tyr" , "P-Cys", "P-homo-Cys" , "P-homo-Ser" y "P-homo-Thr" se refieren a fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina, fosfocisteina, fosfohomocisteína, fosfohomoserina, y fosfohomotreonina, respectivamente. Como se usa en l presente, un fosfoaminoácido se refiere a un éster o tioéster de un aminoácido y ácido fosfórico; por ejemplo, el hidrógeno en el grupo funcional alcohol o tiol se reemplaza por -P(0) (0H)2-Por ejemplo, P-Ser tiene la estructura P-Thr tiene la estructura P-Tyr tiene la y P-Cys tiene la En un aspecto, la presente invención proporciona un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaae Xaa7 Xaa8 Cys9 Asn10 Pron Ala12 Cysi3 Xaai4 Glyi5 Xaai6 Xaai7, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; en donde Xaax es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, ß-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, D-Glu, Glu ?-carboxilada, a-ácido aminosubérico (Asu) , a-ácido aminoadípico (Aad) , a-ácido aminopimélico (Apm) , o está ausente; Xaa2 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilada, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa3 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilada, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa4 es Cys o D-Cys ; Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, 4 -hidroxivalina-fosfato, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr; Xaa7 es Tyr, Leu, Phe o lie; Xaa8 es Cys o D-Cys; Xaai4 es Thr, Ala o Phe; Xaa16 es Cys o D-Cys; y Xaaiv es Tyr, D-Tyr, o está ausente; en donde : si Xaax está presente, se puede modificar Xaai en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; si Xaax está ausente y Xaa2 está presente, entonces se puede modificar Xaa2 en su grupo metilo por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; o si tanto Xaaj. como Xaa2 están ausentes, entonces Xaa3 se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico.

En algunas modalidades, están ausentes tanto Xaa2 como Xaa3. En otras modalidades, Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 está ausente. En aún otras modalidades, Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 es Asp o Glu.

En algunas modalidades, Xaa7 es Tyr o Leu. En algunas modalidades, Xaai es Thr.

En algunas modalidades, Xaai7 es Tyr o está ausente.

En algunas modalidades, Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, ß-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu o D-Glu. En modalidades adicionales, Xaai es Asp, D-Asp, Glu o D-Glu.

En algunas modalidades, Xaa6 es P-Ser o P-Thr. En modalidades adicionales, Xaa6 es P-Ser.

En algunas modalidades, Xaai, xaa2 y Xaa3 están ausentes y Xaa es D-Cys o Cys . En modalidades adicionales, Xaa7 es Tyr o Leu. En modalidades adicionales, Xaai4 es Thr. En modalidades adicionales, Xaai7 es Tyr o está ausente. En modalidades adicionales, Xaa6 es P-Ser.

En algunas modalidades, al menos uno de Xaa4, Xaa8 o Xaaie es Cys. En algunas modalidades, al menos dos de Xaa4, Xaa8 o Xaax6 son Cys. En algunas modalidades, todos de Xaa , Xaa8 y Xaai6 son Cys. En algunas modalidades, al menos uno de Xaa4, Xaa8 o Xaai6 es D-Cys. En algunas modalidades, al menos dos de Xaa4/ Xaa8 o Xaai6 son D-Cys. En algunas modalidades, todos de Xaa4, Xaa8 y Xaais son D-Cys.

En algunas modalidades, se proporciona un péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pron Alai2 Cysi3 Thr14 Glyis Cysi6 Xaai7, en donde Xaa7 es Tyr o Leu.

En algunas modalidades, se proporciona un péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos Asp Asp Cys cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

En algunas modalidades, se proporciona un péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido comprende no más de 50, 40, 30 o 20 aminoácidos. En modalidades adicionales, el péptido comprende no más de 19, 18, 17, 16, 15 o 14 aminoácidos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido consiste de la secuencia de aminoácidos Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Cys9 Asn10 Prou Al i2 Cysi3 XaaH Glyi5 aai6 Xaai7, o una sal f rmacéuticamente aceptable de la misma; en donde Xaax es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, ß-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, D-Glu, Glu ?-carboxilada, a-ácido aminosubérico (Asu) , a-ácido aminoadípico (Aad) , a-ácido aminopimélico (Apm) , o está ausente; Xaa2 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilada, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa3 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilada, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa es Cys o D-Cys ; Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, -hidroxivalina-fosfato, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr; Xaa7 es Tyr, Leu, Phe o lie; Xaa8 es Cys o D-Cys ; Xaai4 es T r, Ala o Phe; Xaai6 es Cys o D-Cys ; y Xaai? es Tyr, D-Tyr, o está ausente; en donde : si Xaax está presente, se puede modificar Xaax en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; si Xaai está ausente y Xaa2 está presente, entonces se puede modificar Xaa2 en su grupo metilo por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; o si tanto Xaai como Xaa2 están ausentes, entonces Xaa3 se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico .

En algunas modalidades, ambos de Xaa2 y Xaa3 están ausentes. En otras modalidades, Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 está ausente. En aun otras modalidades, en donde Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 es Asp o Glu.

En algunas modalidades, Xaa7 es Tyr o Leu.

En algunas modalidades, Xaai4 es Thr.

En algunas modalidades, Xaa17 es Tyr o está ausente. En algunas modalidades, Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D- Gln, Pro, Ala, ß-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu o D-Glu. En modalidades adicionales, Xaai es Asp, D-Asp, Glu o D-Glu.

En algunas modalidades, Xaa6 es P-Ser o P-Thr. En modalidades adicionales, Xaa6 es P-Ser.

En algunas modalidades, Xaai, Xaa2 y Xaa3 están ausentes y Xaa4 es D-Cys o Cys . En modalidades adicionales, Xaa7 es Tyr o Leu. En modalidades adicionales, Xaai4 es Thr. En modalidades adicionales, Xaai7 es Tyr o está ausente. En modalidades adicionales, Xaa6 es P-Ser.

En algunas modalidades, se proporciona un péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Fron Alai2 Cysi3 Thri4 Glyi5 Cysi6 Xaa17, en donde Xaa7. es Tyr o Leu.

En algunas modalidades, se proporciona un péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido consiste de la secuencia de aminoácidos Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

En algunos casos, el péptido está aislado. En otros, el péptido está purificado, En algunas modalidades, Xaa6 es cualquier aminoácido que se pueda fosforilar.

En algunas modalidades, se proporciona una sal farmacéuticamente aceptable del péptido. En algunas modalidades, la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de cloruro .

Péptidos Variantes En algunas circunstancias puede ser deseable tratar pacientes con un péptido variante que se une a y activa los receptores intestinales de GC-c, pero es menos activo o más activo que la forma no variante del péptido. Puede surgir actividad reducida a partir de afinidad reducida para el receptor o una capacidad reducida para activar el receptor una vez unido o estabilidad reducida del péptido. Puede surgir actividad incrementada de la afinidad incrementada para el receptor o una capacidad incrementada para activar el receptor una vez unido o estabilidad incrementada del péptido .

En algunos péptidos, uno o más miembros de uno o ambos pares de residuos Cys que forman normalmente un enlace de sulfuro se pueden reemplazar por homocisteína penicilamina, 3-mercaptoprolina (Kolodziej et al. 1996 Int J Pept Protein Res 48:274); ß, ß-dimethylcysteine (Hunt et al. 1993 Int J Pept Protein Res 42:249) o ácido diaminopropiónico (Smith et al. 1978 J Med Chem 21:117) para formar reticulaciones internas alternativas en las posiciones de enlaces normales de disulfuro. En otras modalidades, los enlaces de sulfuro se pueden reemplazar por reticulación de hidrocarburos (Schafmeister et al. 2000 J Am Chem Soc 122:5891, Patgiri et al. 2008 Acc Chem Res 41:1289, Henchey et al. 2008 Curr Opin Chem Biol 12:692) .

Producción de Péptidos En una modalidad, se pueden producir de manera recombinante péptidos o péptidos precursores de la invención en cualquier sistema conocido de expresión de proteína, que incluye, sin limitación, bacterias (por ejemplo, E. coli o Bacillus subtilis) , sistemas de células insectiles (por ejemplo, sistemas de células Drosophila Sf9) , sistemas de células de levadura (por ejemplo, S. cerevisia , S. saccharomyces) o sistemas de expresión fúngicos filamentosos, o sistemas de expresión de células animales (por ejemplo, sistemas de expresión de células mamíferas) . Los péptidos o péptidos precursores de la invención también se pueden sintetizar de manera química.

Si el péptido o péptido variante se va a producir de manera recombinante , por ejemplo, E. coli, la molécula de ácido nicleico que codifica para el péptido también puede codificar para una secuencia guía que permite la secreción del péptido maduro a partir de la célula. De esta manera, la secuencia que codifica para el péptido puede incluir la pre-secuencia y la pro-secuencia de, por ejemplo, un péptido ST bacteriano que se presenta de forma natural. El péptido maduro, segregado se puede purificar del medio de cultivo.

La secuencia que codifica para un péptido descrito en la presente se puede insertar en un vector capaz de distribuir y mantener la molécula de ácido nucleico en una célula bacteriana. La molécula de ADN se puede insertar en un vector de replicación autónoma (los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, pGEM3Z y pcDNA3 , y derivados de los mismos) . El ácido nucleico del vector puede ser un ADN bacteriano o de bacteriófago tal como bacteriófago lambda o I3 y derivado de los mismos. La construcción de un vector que contiene ácido nucleico descrito en la presente se puede seguir por la transformación de una célula hospedadora tal como una bacteria. Los hospedadores bacterianos adecuados incluyen pero no se limitan a, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas y Salmonella. La construcción genética también incluye,' además de la molécula de ácido nicleico codificadora, elementos que permiten la expresión, tal como un promotor y secuencias reguladoras. Los vectores de expresión pueden contener secuencias de control trascripcional que controlan el inicio trascripcional , tal como secuencias promotoras, intensificadoras , operadoras y represoras. Una variedad de secuencias de control trascripcional son bien conocidas por los expertos en la técnica. El vector de expresión también puede incluir una secuencia reguladora de traducción (por ejemplo, una secuencia 5' no traducida, una secuencia 3' no traducida, o un sitio de entrada a ribosoma interno) . El vector puede ser capaz de replicación autónoma o puede integrarse en el ADN del hospedador para asegurar la estabilidad durante la producción del péptido.

La secuencia codificadora de proteína que incluye un péptido descrito en la presente también se puede fusionar a un ácido nucleico que codifica para una marca de afinidad peptídica, por ejemplo, glutationa-S-transíerasa (GST) , proteína de unión a maltosa E, proteína A, marca FLAG, hexa-histidina, marca myc o la marca HA de influenza, a fin de facilitar la purificación. La marca de afinidad o la fusión indicadora une el cuadro de lectura del péptido de interés al cuadro de lectura del gen que codifica para la marca de afinidad tal que se genere una fusión de traducción. La expresión del gen de fusión da por resultado la traducción de un péptido individual que incluye tanto el péptido de interés como la marca de afinidad. En algunos casos, donde se utilizan marcas de afinidad, la secuencia de ADN que codifica para un sitio de reconocimiento de proteasa se fusionará entre los cuadros de lectura para la marca de afinidad y el péptido de interés.

Para producir péptidos en un sistema biológico también se pueden usar construcciones genéticas y métodos adecuados para la producción de formas inmaduras y maduras de los péptidos y variantes descritos en la presente en sistemas de expresión de proteína diferentes de bacterias, y que son bien conocidos en la técnica.

Los péptidos producidos de manera recombinante se pueden fosforilar usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas modalidades, un péptido se produce de manera recombinante, se aisla de la célula en la cual se expresó y luego se fosforila usando una proteína-cinasa, por ejemplo, una cerina/treonina-cinasa o una tirosina-cinasa . En la técnica se conocen un gran número de cinasas y se pueden usar para este propósito. Un experto en la técnica reconocerá que diferentes cinasas tienen diferentes especificidades de substrato y elegirá una cinasa para el uso en base a la secuencia del péptido. En otras modalidades, un péptido se produce de manera recombinante en una célula que también expresa una serina/treonina/cinasa o una tirosina-cinasa que fosforilará el péptido. En otras modalidades, los péptidos se pueden producir de manera recombinante al incorporar un fosfoaminoácido . En la técnica se conocen métodos para modificar ARNt que incluyen, pero no se limitan a, modificar el anti-codón, el sitio de unión de aminoácido, y/o el tallo aceptador para permitir la incorporación de aminoácidos no naturales y/o arbitrarios (Biochem. Biophys. Res. Comm. (2008) 372: 480-485; Chem. Biol. (2009) 16:323-36; Nat . Methods (2007) 4:239-44; Nat . Rev. Mol. Cell Biol. (2006) 7:775-82; Methods (2005) 36:227-238; Methods (2005) 36:270-278; Annu. Rev. Biochem. (2004) 73:147-176; Nuc . Acids Res. (2004) 32:6200-6211; Proc . Nati. Acad. Sci. USA (2003) 100:6353-6357; Royal Soc . Chem. (2004) 33 :422-430) .

En algunas modalidades, se pueden producir químicamente los péptidos. Los péptidos se pueden sintetizar por varios métodos diferentes que incluyen síntesis en fase de solución y en fase sólida usando protección tradicional con BOC o FMOC. Por ejemplo, el péptido se puede sintetizar en 2-Clorotritilcloruro o resina de Wang usando acoplamientos consecutivos de aminoácidos. Se pueden usar los siguientes grupos protectores: Fluorenilmetiloxicarbonilo o ter-butiloxicarbonilo (grupos alfa-amino, N-terminal) ; tritilo o ter-butilo (grupos tiol de Cy) ; ter-butilo (?-carboxilo de ácido glutámico y el grupo hidroxilo de treonina, si está presente) ; tritilo (función ß-amida de la cadena lateral de asparagina y el grupo fenólico de tirosina, si está presente) ; tritilo o ter-butildimetilsililo (grupo hidroxi de serina, si está presente) y ter-Butiloxicarbonilo (N-terminal antes de las modificaciones subsiguientes de la cadena lateral. Se puede efectuar el acoplamiento con DIC y HOBt en la presencia de una amina terciaria, y el péptido se puede desproteger y escindir del soporte sólido al usar cóctel K (ácido trifluoroacético 81 %, fenol 5 %, tioanisol 5 %, 1,2-etanoditiol 2.5 %, agua 3 %, dimetilsulfuro 2 %, yoduro de amonio 1.5 % p/p) · Después de la remoción de ácido trifluoroacético y otros volátiles, el péptido se puede precipitar usando un solvente orgánico. Se pueden formar enlaces de disulfuro entre los residuos Cys usando sulfóxido de dimetilo (Tam et al. (1991) J. Am. Chem. Soc . 113:6657-62) o usando una estrategia de oxidación con aire. El péptido resultante se puede purificar por cromatografía de fase inversa y liofilizar.

Se puede introducir un fosfoaminoácido, por ejemplo, una fosfoserina en un péptido por cualquier método conocido por el experto en la técnica (ver, por ejemplo, G.K.Toth et al. (2007), Current Organic Chemistry 11: 409-426) . En algunas modalidades, se puede introducir un análogo de fosfoaminoácido protegido, por ejemplo, un análogo de aminoácido fosfoserina, como parte del montaje peptídico en fase sólida; por ejemplo como Fmoc-Ser [PO (OBzl) OH] -OH (T. Wakamiya et al. (1997), Bioorganic and Medicinal Chemistry 5: 135-145, 1997) o como Fmoc-Ser [PO (OAryl/Alquil) 2] -OH (G.K.Toth et al. (2007) Current Organic Chemistry, 11: 409-426) . En otra modalidad, se puede introducir un análogo de aminoácido protegido, por ejemplo, un análogo de aminoácidos de serina, protegido como parte del montaje peptídico en fase sólida (por ejemplo serina protegida con Fmoc con una protección de tritilo para la cadena lateral de hidroxilo) . Después del montaje completo de la cadena peptídica Ser [Trt] o Ser [SiMe2tBu] se puede desproteger selectivamente y el grupo fosfato se puede introducir usando una estrategia de fosforamidita/oxidación (G. Shapiro et al. (1994) Tetrahedron Letters 35: 869-872; P. Hormozdiari et al. (1996) Tetrahedron Letters, 37: 8227-8230). En otras modalidades, se puede fosforilar un péptido químicamente producido usando una serina/treonina-cinasa o una tirosina-cinasa como se describe anteriormente .

Se pueden producir, aislar o usar péptidos ya sea en la forma de la base libre o como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los ejemplos estables incluyen sin limitación, sales de acetato, cloruro, sulfato y fosfato del péptido .

Composiciones de Péptidos y Agonistas del Receptor de GC-C En otro aspecto, se proporcionan composiciones en donde se pueden combinar los péptidos, solos o en combinación, con cualquier portador o medio farmacéuticamente aceptable. Los péptidos se pueden combinar con materiales que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro modo indeseada cuando se administran a un paciente. Los portadores o medios usados pueden incluir solventes, dispersantes, revestimientos, agentes promotores de absorción, agentes de liberación controlada y uno o más excipientes inertes (que incluyen almidones, polioles, agentes granuladores , celulosa microcristalina (por ejemplo, celfere, cuentas de CelfereMR) , diluyentes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes, y similares), etc. Si se desea, las dosis de tableta de la composición descrita se pueden revestir por técnicas acuosas o no acuosas normales.

Los ejemplos de excipientes para el uso como los portadores farmacéuticamente aceptables y los portadores inertes farmacéuticamente aceptables y los ingredientes adicionales mencionados anteriormente incluyen, pero no se limitan a aglutinantes, agentes de relleno, desintegrantes, lubricantes, agentes antimicrobianos y agentes de revestimiento .

Como se usa en la presente, el término "aglutinante" se refiere a cualquier aglutinante farmacéuticamente aceptable que se puede usar en la práctica de la invención. Los ejemplos de aglutinantes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, un almidón (por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata y almidón pre-gelatinizado (por ejemplo, STA CH 1500MR y STARCH 1500 LMMR, vendido por Colorcon, Ltd.) y otro almidones), maltodextrina, gelatina, gomas naturales y sintéticas, tal como goma de acacia, tragacanto en polvo, goma de guar, celulosa y sus derivados (por ejemplo, metilcelulosa, hidroxietil-celulosa, hidroxietil-metilcelulosa, hidroxipropil-celulosa e hidroxipropil-metilcelulosa (hipromelosa) , etil-celulosa, acetato de celulosa, carboximetil-celulosa cálcica, carboximetil-celulosasódica, carboximetilcelulosa, celulosa en polvo, celulosa microfina, celulosa microcristalina (por ejemplo AVICELMR, tal como, AVICEL-PH-101MR, -103R y -105MR, vendida por FMC Corporation, Marcus Hook, PA, EUA) ) , alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona (por ejemplo, polivinil pirrolidona K30) , y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de aglutinantes que se pueden usar de manera particular en composiciones farmacéuticas incluyen alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona (povidona) , un almidón, maltodextrina o un éter de celulosa (tal como por ejemplo, metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxietilmetilcelulosa, hidroxipropil celulosa e hidroxipropilmetilcelulosa) .

Como se usa en la presente, el término "agente de relleno" se refiere a cualquier agente de relleno farmacéuticamente aceptable que se puede usar en la práctica de la invención. Los ejemplos de agentes de relleno farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, talco, carbonato de calcio, por ejemplo, gránulos o polvos) , fosfato de calcio dibásico, fosfato de calcio tribásico, sulfato de ¦ calcio (por ejemplo, gránulos o polvos), celulosa microcristalina (por ejemplo, Avicel PH101 o Celphere CP- 305) , celulosa microfina, celulosa en polvo, dextratos, caolín, manitol, ácido salicílico, sorbitol, almidón (por ejemplo, Almidón 1500) , almidón pre-gelatinizado, lactosa, glucosa, fructosa, galactosa, trehalosa, sacarosa, maltosa, isomalta, rafinosa, maltitol, melezitosa, estaquiosa, lactitol, palatinita, xilitol, mioinositol, y mezclas de los mismos .

Los ejemplos de agentes de relleno farmacéuticamente aceptables que se pueden usar de manera particular para revestir los péptidos incluyen, sin limitación, talco, celulosa microcristalina (por ejemplo, Avicel PH101 o Celphere CP-305) , celulosa en polvo, dextratos, caolín, mannitol, ácido silícico, sorbitol, almidón, almidón pre-gelatinizado, lactosa, glucosa, fructosa, galactosa, trehalosa, sacarosa, maltosa, isomalta, fosfato cálcico dibásico, rafinosa, maltitol, melezitosa, estaquiosa, lactitol, palatinita, xilitol, mannitol, mioinositol, y mezclas de los mismos.

Como se usa en la presente, el término "aditivo" se refiere a cualquier aditivo farmacéuticamente aceptable. Los aditivos farmacéuticamente aceptables · incluyen, sin limitación, desintegrantes, aditivos dispersantes, lubricantes, deslizantes, antioxidantes, aditivos de revestimiento, diluyentes, agentes tensioactivos , aditivos saborizantes , humectantes, aditivos promotores de absorción, aditivos de liberación controlada, aditivos anticonglomeración, agentes anti-microbianos (por ejemplo, conservadores) , colorantes, desecantes, plastificantes y tintes. Como se usa en la presente, un "excipiente" es cualquier aditivo, agente de relleno, aglutinante o agente farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones de la presente invención también pueden incluir de manera opcional otros ingredientes terapéuticos, agentes anti-conglomeración, conservadores, agentes edulcorantes, colorantes, sabores, desecantes, plastificantes , tintes, deslizantes, anti-adherentes , agentes antiestáticos, agentes tensioactivos (agentes humectantes), antioxidantes, agentes de revestimiento de película y similares. Cualquier ingrediente opcional debe ser compatible con el compuesto descrito en la presente para asegurar la estabilidad de la formulación. La composición puede contener otros aditivos como se necesite, incluyendo por ejemplo lactosa, glucosa, fructosa, galactosa, trehalosa, sacarosa, maltosa, rafinosa, maltitol, melezitosa, estaquiosa, lactitol, palatinita, almidón, xilitol, manitol, mioinositol y similares, hidratos de los mismos, aminoácidos, por ejemplo, alanina, glicina y betaína, y péptidos y proteínas, por ejemplo albumen.

Las composiciones pueden incluir, por ejemplo, varios solventes adicionales, dispersantes, revestimientos, aditivos promotores de absorción, aditivos de liberación controlada, y uno o más aditivos inertes (que incluyen, por ejemplo, almidones, polioles, aditivos granuladores, celulosa microcristalina, diluyentes, lubricantes, aglutinantes, aditivos desintegrantes, y similares), etc. Si se desea, las dosis de tableta de las composiciones descritas se pueden revestir por técnicas acuosas o no acuosas normales . Las composiciones también pueden incluir, por ejemplo, aditivos anti-conglomeración, conservadores, aditivos edulcorantes, colorantes, sabores, desecantes, plastificantes , tintes y similares.

Los desintegrantes adecuados incluyen por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, celulosa microcristalina, croscarmelosa sódica, crospovidona, povidona, polacrilina potásica, almidón-glicolato de sodio, almidón de patata o tapioca, otros almidones, almidón pre-gelatinizado, arcillas, otras alginas, otras celulosas, gomas, y mezclas de los mismos .

Los lubricantes adecuados incluyen, por ejemplo, estearato de calcio, estearato de magnesio, aceite mineral, aceite ' mineral ligero, glicerina, sorbitol, manitol, polietilenglicol , otros de glicoles, ácido esteárico, lauril-sulfato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado (por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya, estearato de zinc, oleato de etilo, laurato de etilo, agar, gel de sílice siloide (AEROSIL 200, W.R. Grace Co., Baltimore, MD EUA) , un aerosol cuajado de sílice sintética (Evonik Degussa Co., Plano, TX EUA), un dióxido de silicio pirogénico (CAB-O-SIL, Cabot Co., Boston, MA EUA), y mezclas de los mismos.

Los deslizantes adecuados incluyen, por ejemplo, leucina, dióxido de silicio coloidal, trisilicato de magnesio, celulosa en polvo, almidón, talco, y fosfato de calcio tribásico.

Los aditivos anti-conglomeración adecuados incluyen, por ejemplo, silicato de calcio, silicato de magnesio, dióxido de silicio, dióxido de silicio coloidal, talco, y mezclas de los mismos.

Los aditivos antimicrobianos adecuados que se pueden usar, por ejemplo, como un conservador para las composiciones peptídicas incluyen, por ejemplo, cloruro de benzalconio, cloruro benzetonio, ácido benzoico, alcohol bencílico, butil-parabeno, cloruro de cetilpiridinio, cresol, clorobutanol , ácido deshidroacético, etilparabeno, metilparabeno, fenol, alcohol feniletílico, fenoxietanol , acetato de fenilmercurio, nitrato de fenilmercurio, sorbato de potasio, propilparabeno, benzoato de sodio, deshidroacetato de sodio, propionato de sodio, ácido sórbico, timersol, timo, y mezclas de los mismos.

Los antioxidantes adecuados incluyen, por ejemplo, BHA (hidroxianisol butilado) , BHT (hidroxitolueno butilado) , vitamina E, galato de propilo, ácido ascórbico y sales o ásteres de los mismos, tocoferol y ésteres del mismo, ácido alfa-lipoico y beta-caroteno.

Los aditivos de revestimiento adecuados incluyen, por ejemplo, carboximetil-celulosa sódica, acetato-ftalato de celulosa, etilcelulosa, gelatina, barniz farmacéutico, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa- ftalato, metilcelulosa, polietilenglicol , acetato- ftalato de polivinilo, goma laca, sacarosa, dióxido de titanio, cera de carnauba, cera microcristalina, y mezclas de estos. Los revestimientos protectores adecuados incluyen Aquacoat (por ejemplo, Dispersión Acuosa de Etilcelulosa Aquacoat, 15 % p/p, FMC Biopolymer, ECD-30) , Eudragit (por ejemplo, Eudragit E PO PE-EL, Roehm Pharma Polymers) y Opadry (por ejemplo dispersión Opadry AMB, 20 % p/p, Colorcon) .

En ciertas modalidades, los aditivos adecuados para la composición de péptidos incluyen uno o más de sacarosa, talco, estearato de magnesio, crospovidona o BHA.

Las composiciones de la presente invención también pueden incluir otros excipientes, agentes, y categorías de los mismos que incluyen pero no se limitan a L-histidina, PluronicMR, Poloxameros (tal como LutrolMR y Poloxamer 188) , ácido ascórbico, glutationa, mej oradores de permeabilidad (por ejemplo, lípidos, colato de sodio, acilcarnitina, salicilatos, sales biliares mezcladas, micelas de ácidos grasos, queladores, ácido graso, agentes tensioactivos, glicéridos de cadena media) , inhibidores de proteasa (por ejemplo, inhibidor de tripsina de soya, ácidos orgánicos) , agentes disminuidores de pH y mej oradores de absorción efectivos para promover la disponibilidad (incluyendo pero no limitado a aquellos descritos en US 6086918 y US 5912014), materiales para tabletas masticables (tal como dextrosa, fructosa, monohidrato de lactosa, lactosa y aspartame, lactosa y celulosa, maltodextriña, maltosa, mannitol, celulosa microcristalina y goma guar, sorbitol cristalino) ; parenterales (tal como mannitol y povidona) ; plastificantes (tal como sebacato de dibutilo, plastificantes para revestimientos, ftalato de polivinilacetato) ; lubricantes en polvo (tal como behenato de glicerilo) ; cápsulas de gelatina blanda (tal como solución especial de sorbitol) ; esferas para revestimiento (tal como esferas de azúcar) ; agentes de esferonización (tal como behenato de glicerilo y celulosa microcristalina) ; agentes de suspensión/formación de gel (tal como carragenina, goma gelan, mannitol, celulosa microcristalina, povidona, almidón-glicolato de sodio, goma de xantano) ; edulcorantes (tal como aspartame, aspartame y lactosa, dextrosa, fructosa, miel, maltodextrina, maltosa, mannitol, molasa, sorbitol cristalino, solución especial de sorbitol, sacarosa) ; agentes de granulación húmeda (tal como carbonato de calcio, lactosa anhidra, monohidrato de lactosa, maltodextrina, mannitol, celulosa microcristalina, povidona, almidón) , caramelo, carboximetilcelulosa sódica, sabor de crema de cereza y sabor cereza, ácido cítrico anhidro, ácido cítrico, azúcar de confitería, Rojo D&C No. 33, Amarillo D&C #10 Amarillo lago, edetato de disodio, alcohol etílico 15 %, Amarillo FD & C No. 6 amarillo lago, Azul FD&C #1 Aluminio lago, Azul FD&C No. 1, Azul FD&C no. 2 aluminio lago, Verde FD&C No.3, Rojo FD&C No. 40, Amarillo FD&C No. 6 Aluminio Lago, Amarillo FD&C No. 6, Amarillo FD&C No.10, palmitoestearato de glicerol, monoestearato de glicerilo, índigo carmín, lecitina, manitol, metil- y propil-parabenos , glicirrizinato de monomonio, sabor naranja natural y artificial, barniz farmacéutico, poloxámero 188, Polidextrosa, polisorbato 20, polisorbatoe 80, polividona, almidón de maíz pregelatinizado, almidón pregelatinizado, óxido de hierro rojo, sacarina sódica, carboximetil-éter sódico, cloruro de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio, sabor fresa, óxido de hierro negro sintético, óxido de hierro rojo sintético, dióxido de titanio y cera blanca.

En algunas modalidades, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido descrito en la presente y uno o más agentes estabilizadores seleccionados de Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+, una combinación de los mismos, y/o una amina primaria estéricamente impedida. En modalidades adicionales, el agente es Mg2+, Ca+ o Zn+ o una combinación de los mismos. En modalidades adicionales se proporciona el catión, sin limitación, como acetato de magnesio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de calcio, cloruro de calcio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, acetato de zinc, cloruro de .zinc, fosfato de zinc, sulfato de zinc, acetato de manganeso, cloruro de manganeso, fosfato de manganeso, sulfato de manganeso, acetato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, sulfato de potasio, acetato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, sulfato de sodio, acetato de aluminio, cloruro de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio. En modalidades adicionales, se proporciona el catión como cloruro de magnesio, cloruro de calcio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, acetato de zinc, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio o cloruro de aluminio. En otras modalidades, el catión se proporciona como cloruro de calcio, cloruro de magnesio o acetato de zinc.

En otra modalidad, el agente estabilizador es una amina primaria esféricamente impedida. En una modalidad adicional, la amina primaria estéricamente impedida es un aminoácido. En aún una modalidad adicional, el aminoácido es un aminoácido que se presenta de forma natural. En aún una modalidad adicional, el aminoácido que se presenta de forma natural se selecciona del grupo que consiste de: histidina, fenilalanina, alanina, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina, leucina, metionina, asparagina, tirosina, treonina, isoleucina, triptofano, glicina y valina; aún adicionalmente, el aminoácido que se presenta de forma natural es leucina, isoleucina, alanina o metionina. En otra modalidad, la amina primaria estéricamente impedida es un aminoácido que no se presenta de forma natural (por ejemplo, ácido 1-aminociclohexano-carboxílico) . En una modalidad adicional, la amina primaria estéricamente impedida es ciclohexilamina, 2-metilbutilamina o una amina polimérica tal como quitosan. En otra modalidad, se pueden usar una o más aminas primarias estéricamente impedidas en una composición.

En algunos casos, la amina primaria estéricamente impedida tiene la fórmula: en donde Rlt R2 y R3 se seleccionan independientemente a partir de: H, C(0)OH, Ci-C6 alquilo, Ci-C6 alquiléter, Ci-Ce alquiltioéter , ácido Ci-C6 alquil-carboxílico, Ci-C6 alquil -carboxilamida y alquilarilo, en donde cualquier grupo se puede sustituir de manera individual o múltiple con: halógeno o amino, y con la condición que no más de Rl7 R2 y R3 sean H. En otra modalidad, no más de uno de Ri, R2 y R3 es H.

En otras modalidades, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador, péptido o catión farmacéuticamente aceptable seleccionada a partir de Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+, o una mezcla de esto, y una amina primaria estéricamente impedida. En una modalidad, el catión es Mg2+, Ca2+ o Zn2+ o una mezcla de esto. En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende además un aglutinante farmacéuticamente aceptable y/o un deslizante, lubricante o aditivo farmacéuticamente aceptable ^ que actúa tanto como un deslizante como un lubricante y/o como un antioxidante. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se aplica a un portador. En algunas modalidades, el portador es un agente de relleno.

En algunos casos, la relación molar de catión: amina primaria estéricamente impedida: péptido en la solución acuosa aplicada al portador es 5-100:5-50:1. En algunas casos, la relación molar de catión: amina primaria estéricamente impedida puede ser igual a o mayor que 2:1 (por ejemplo, entre 5:1 y 2:1) . De esta manera, en algunos casos, la relación molar de catión: amina primaria estéricamente impedida: péptido aplicada al portador es 100:50:1, 100:30:1, 80:40:1, 80:30:1, 80:20:1, 60:30:1, 60:20:1, 50:30:1, 50:20:1, 40:20:1, 20:20:1, 10:10:1, 10:5:1 o 5:10:1. Cuando el aglutinante, por ejemplo, metilcelulosa, está presente en la solución del péptido agonista de GC-C aplicada al portador se puede presentar a 0.5 % - 2.5 % en peso (por ejemplo, 0.7 %-1.7 % o 0.7 % - 1 % o 1.5 % o 0.7 %) .

Se ha encontrado que un catión seleccionado a partir de Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ y Al3+ es útil para suprimir la formación de un producto de oxidación de polipéptidos agonistas del receptor de GC-C durante el almacenamiento . También se ha encontrado que una amina primaria estéricamente impedida es útil para suprimir la formación de un aducto de formaldehído-imina ("producto de formaldehído-imina" ) de los polipéptidos agonistas del receptor de GC-C durante el almacenamiento. De esta manera, las formulaciones de polipéptido agonista del receptor de GC-C que comprenden un catión seleccionado a partir de Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+ por ejemplo, un catión divalente seleccionado de Zn2+, Mg2+ y Ca+ y/o una amina primaria estéricamente impedida, tal como un aminoácido, tienen una suficiente vida en anaquel (como se mide por pureza cromatográfica y/o por un ensayo de peso/peso) para la producción, almacenamiento y distribución del fármaco. Adicionalmente, en tanto que la presencia de una amina estéricamente impedida sola puede incrementar la formación de un producto de hidrólisis de linaclótido durante el almacenamiento, la combinación de una amina primaria estéricamente impedida y un catión, por ejemplo, pero no limitado a, la combinación de leucina y Ca2+, suprime la formación del producto de hidrólisis del polipéptido agonista del receptor de GC-C así como el producto de oxidación del polipéptido agonista del receptor de GC-C durante el almacenamiento, conduciendo a una estabilidad total aún mayor como se determina por un ensayo de peso/peso y/o por pureza cromatográfica .

En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende además un aglutinante o aditivo farmacéuticamente aceptable, y/o un deslizante, lubricante, o aditivo farmacéuticamente aceptable que actúa tanto como un deslizante como un lubricante y/o como un antioxidante.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas de acuerdo con la invención incluirán en general una cantidad de los compuestos activos con un diluyente o excipiente farmacéutico aceptable, tal como una solución acuosa estéril, para dar un intervalo de concentraciones finales, dependiendo del uso propuesto. Las técnicas de preparación en general son bien conocidas en la técnica, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, Mack Publishing Company, 1995) .

Para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, los péptidos descritos en la presente se administran preferentemente de manera oral, por ejemplo, como una tableta, cápsula, sobre que contiene una cantidad predeterminada del gránulo, gel, pasta, jarabe, bolo, eluptuario, suspensión espesa, polvo, polvo liofilizado, gránulos de ingrediente activo, como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite, mediante una formulación liposomal (ver, por ejemplo, EP 736299) o en alguna otra forma. Las composiciones oralmente administradas pueden incluir aglutinantes, lubricantes, diluyentes inertes, lubricantes, agentes activos en la superficie o dispersantes, agentes saborizantes , y humectantes. Las formulaciones oralmente administradas tal como tabletas se pueden revestir o marcar opcionalmente y se pueden formular para proporcionar liberación sostenida, retrasada o controladas del ingrediente activo en la misma. Los péptidos se pueden co-administrar con otros agentes usados para tratar trastornos gastrointestinales incluyen pero no se limitan a los agentes descritos en la presente.

En otro aspecto, las composiciones farmacéuticas adecuadas pueden comprender uno o más agentes terapéuticos diferentes. Estos agentes terapéuticos incluyen, sin limitación, agentes analgésicos; agentes anti-secretorios, incluyendo inhibidores de la bomba de protones, antagonistas de la bomba acida, antagonistas del receptor de H2 ; inhibidores de PDE5; antagonistas de GABA-B; secuestrantes de ácidos biliares; agentes procinéticos y de promotilidad; antidepresivos; antibióticos; antieméticos; y agentes mucosoprotectores .

Métodos de Tratamiento En algunas modalidades de la invención, se proporciona un método de tratamiento para trastornos gastrointestinales .

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal es un trastorno de GI superior. En una modalidad adicional, el trastorno es GP, cólico gástrico post-operativo, un trastorno esofágico funcional, un trastorno gastroduodenal funcional, enfermedad de reflujo gastroesof gico (GERD) , enfermedad celiaca, mucositis, o una úlcera duodenal o estomacal .

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal es GP. En modalidades adicionales, la GP es GP idiopática, diabética o post-quirúrgica .

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal es cólico gástrico post-operativo.

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal es un trastorno esofágico funcional.

En algunas modalidades, el trastorno esofágico funcional es acidez gástrica funcional, dolor de pecho funcional de origen esofágico presumido, disfagia funcional o globus .

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal es un trastorno gastroduodenal funcional.

En algunas modalidades, el trastorno gastroduodenal funcional es FD, un trastorno de eructo, un trastorno de nausea o vomito, o un síndrome de ruminación. En una modalidad adicional, el trastorno gastroduodenal funcional es FD. En algunas modalidades, la FD es síndrome de esfuerzo postprandial o síndrome de dolor epigástrico. En algunas modalidades, el trastorno de eructo es aerofagia o eructo excesivo no especificado. En algunas modalidades, el trastorno de nausea o vomito es nausea ideopática crónica, o un mito funcional o síndrome de vómito cíclico.

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal enfermedad de reflujo gastroesof gico (GERD) .

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal es enfermedad celiaca.

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal es mucositis .

En algunas modalidades, el trastorno gastrointestinal es una úlcera duodenal o estomacal.

Los péptidos y agonistas descritos en la presente se pueden usar solos o en terapia de combinación para el tratamiento, prevención o reducción de dolor visceral asociado con un trastorno gastrointestinal superior o dolor asociado con otro trastorno como se describe en la presente.

Los agonistas del receptor de GC-C descritos en la presente se pueden administrar en combinación con otros agentes. Por ejemplo, los péptidos se pueden administrar con un compuesto o péptido analgésico. El compuesto o péptido analgésico se puede unir de manera covalente a un péptido descrito en la presente o puede ser un agente separador que se administra conjuntamente con, o de manera secuencial con, un péptido descrito en la presente en una terapia de combinación. Los agonistas del receptor de GC-C descritos en la presente también se pueden administrar en combinación con otros agentes usados para tratar trastornos de GI superior incluyendo antidepresivos, agentes de promotilidad o procinéticos , antieméticos, antibióticos, inhibidores de la bomba de protones, bloqueadores ácidos (por ejemplo, antagonistas del receptor de histamina H2) , antagonistas de la bomba ácida, inhibidores de PDE5, agonistas de GABA-B, secuestrantes de ácidos biliares, y agentes mucosoprotectores .

En algunas modalidades, los agentes analgésicos útiles que se pueden usar con los péptidos descritos en la presente incluyen bloqueadores de canal de calcio, por ejemplo ziconotido) , antagonistas del receptor de 5HT (por ejemplo, antagonistas del receptor de 5HT3 , 5HT4 y 5HT1) , agonistas de 5HT4 (por ejemplo, tegaserod (ZelnormMR) , mosaprida, metoclopramida, zacoprida, cisaprida, renzaprida, derivados de bencimidazolona tal como BIMU l y BIMU 8, y lirexaprida) , agonistas de 5HT1 (por ejemplo, sumatriptan y buspirona) , agonistas de receptores opioides (por ejemplo, loperamida, fedotozina, pentapéptido de encefalina, morfina, difeniloxilato, fracefamida, trimebutina y fentanilo) , agonistas del receptor CCK (por ejemplo, loxiglumida y dexloxiglumida) , antagonistas del receptor de NK1 (por ejemplo, aprepitant, vofopitant, ezlopitant, R-673 (Hoffmann-La Roche Ltd) , SR-48968 y SR-14033, (Sanofi Synthelabo) , CP-122,721 (Pfizer, Inc.), GW679769 (Glaxo Smith Kline) y TAK-637 (Takeda/Abbot) ) , antagonistas del receptor de NK2 (por ejemplo, nepadutant, saredutant, GW597599 (Glaxo Smith Kline) , SR-144190 (Sanofi-Synthelabo) y UK-290795 (Pfizer Inc) ) , antagonistas del receptor de NK3 (por ejemplo, osanetant (SR-142801; Sanofi-Synthelabo) , SR-241586 y talnetant) , inhibidores de la recaptación de norepinefrina-serotonina (NSRI) (por ejemplo, milnacipran) , agonistas del receptor vanilloide y canabanoide, sialorfina y péptidos relacionados a sialorfina. Agentes analgésicos en las varias clases se describen en la literatura.

En algunas modalidades, se puede usar uno o más agentes terapéuticos diferentes en combinación con los péptidos descritos en la presente. Estos agentes incluyen antidepresivos, agentes promotilidad o procinéticos , antieméticos, antibióticos, inhibidores de la bomba de protones, bloqueadores ácidos (por ejemplo, antagonistas del receptor de histamina H2) , antagonistas de la bomba ácida, inhibidores de PDE5, agonistas de GABA-B, secuestrantes de ácidos biliares, y agentes mucusoprotectores.

Los ejemplos de antidepresivos incluyen, sin limitación, antidepresivos tricíclicos tal como amitriptilina (ElavilMR) , desipramina (NorpraminMR) , imipramina (TofranilMR) , amoxapina (AsendinMR) , nortriptilina; inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (SSRI) tal como paroxetina (PaxilMR) , fluoxetina (ProzacMR) , sertralina (ZoloftMR) , y citralopram (CelexaMR) ; y otros tal como doxepina (Sinequan™) y trazodona (DesyrelMR) .

Los ejemplos de agentes promotolidad y procinéticos incluyen, sin limitación, itoprida, octreotido, betanecol, metoclopramida (ReglanMR) , domperidona (MotiliumMR) , eritromicina (y derivados de la misma) y cisaprida (PropulsidMR) . Un ejemplo de antieméticos incluye, sin limitación, proclorperazina .

Los ejemplos de antibióticos que se pueden usar incluyen aquellos que se pueden usar para tratar infecciones de Heliobacter pylori, tal como amoxicilina, tetraciclina, metronidazol, o claritromicina . Otros antibióticos tal como eritromicina y derivados de la misma también se pueden usar en combinación con los péptidos descritos en la presente.

Los ejemplos de inhibidores de la bomba de protones incluyen, sin limitación, omeprazol (PrilosecMR) , esomeprazol (NexiumMR) , lansoprazol (PrevacidMR) , pantoprazol (ProtonixMR) y rabeprazol (AciphexMR) . Los ejemplos de bloqueadores de receptor de H2 incluyen, sin limitación, cimetidina, ranitidina, famotidina y nizatidina. Los ejemplos de antagonistas de la bomba acida incluyen, sin limitación, revaprazan, CS-526 (J. Pharmacol . Exp. Ther. (2007) 323:308-317), PF-03716556 (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009) 328 (2): 671-9), y YH1885 (Drug Metab. Dispos. (2001) 29(l):54-9).

Los ejemplos de inhibidores de PDE5 incluyen, sin limitación, avanafil, lodenafil, mirodenafil, citrato de sildenafilo, tadalafil, vardenafil y udenafil. Los agonistas de GABA-B incluyen, sin limitación, baclofen y XP19986 (Registro CAS No. 847353-30-4) . Los ejemplos de secuestrantes de ácidos biliares incluyen, sin limitación, GT102-279, colestiramina, colesevelam, clorhidrato de colesevelam, ácido ursodeoxicólico, colestipol, colestilan, sevelamer, polidialilamina reticuladas con epiclorhidrina, derivados de dialquilaminoalquilo de un dextrano reticulado y N-(cicloalquil) alquilaminas . Los ejemplos de agentes mucosoprotectores incluyen, sin limitación, sucralfato (Carafato) , teprenona, polaprezinc, cetraxato y subsaliciclato de bismuto.

La terapia de combinación se puede lograr al administrar dos o más agentes, por ejemplo, un agonista del receptor de GC-C descrito en la presente y otro compuesto péptido terapéutico, cada uno de los cuales se formula y administra de manera separada o al administrar dos o más agentes en una formulación individual. Otras combinaciones también se abarcan por la terapia de combinación. Por ejemplo, se pueden formular dos agentes conjuntamente y administrar en unión con una formulación separada que contiene un tercer agente. En tanto que los dos o más agentes en la terapia de combinación se pueden administrar de manera simultánea, no necesita ser así. Por ejemplo, la administración de un primer agente (o combinación de agentes) puede preceder la administración de un segundo agente (o combinación de agente) por minutos, horas, días, o semanas. De esta manera, los dos o más agentes se pueden administrar en el espacio de minutos entre sí o en el espacio de 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, o 24 horas entre sí o en el espacio de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 días entre sí o en espacio de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 semanas entre sí. En algunos casos son posibles intervalos aún más prolongados. En tanto que en muchos casos es deseable que los dos o más agentes usando en la terapia de combinación estén presentes dentro del cuerpo del paciente al mismo tiempo, esto necesita ser así .

DOSIS El intervalo de dosis para adultos humanos puede ser en general de 5 yg a 100 mg/día oralmente del agonista peptídico de GC-C descrito en la presente. Las tabletas, cápsulas u otras formas de presentación proporcionadas en unidad discretas pueden contener de manera conveniente una cantidad del compuesto descrito en la presente que es efectiva a esa dosis o como un múltiple o de la misma, por ejemplo unidades que contienen 25 yg a 2 mg o alrededor de 100 ]iq a 1 mg. La cantidad precisa de compuesto prescrita a un paciente será la responsabilidad del facultativo que atiende. Sin embargo, la dosis empleada dependerá de varios factores que incluyen la edad y género del paciente, el trastorno preciso que se trata, y su severidad.

En varias modalidades, la unidad de dosis se administra con alimento en cualquier momento del día, sin alimento en cualquier momento del día, con alimento después de un ayuno durante la noche (por ejemplo, con el desayuno), a la hora de dormirse después de un aperitivo de bajo contenido de grasa. En una modalidad particular, la unidad de dosis se administra antes de o subsiguiente al consumo de alimentos (por ejemplo una comida) . En una modalidad adicional, la unidad de dosis se administra aproximadamente 15 minutos a 1 hora antes del consumo de alimento. En varias modalidades, la unidad de dosis se administra una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, cinco veces al día o seis veces al día. En ciertas modalidades, la unidad de dosis y la dosis diaria son equivalentes .

En las modalidades de terapia de combinación de la presente invención, la cantidad precisa de cada uno de los dos o más ingredientes activos en una unidad de dosis dependerá de la dosis deseada de cada componente. De esta manera, puede ser útil crear una unidad de dosis que cuando se administra de acuerdo a un programa particular de dosis (por ejemplo, un programa de dosis que incluye un cierto número de unidades y una sincronización particular para la administración) , distribuirá la misma dosis de cada componente como se administrará si el paciente se estuviera tratando con sólo un componente individual. En otros casos, puede ser deseable crear una unidad de dosis que distribuirá una dosis de uno o más componentes que es menor que aquella que se administrará si el paciente se estuviera tratando sólo con un componente individual. Finalmente, puede ser deseable crear una unidad de dosis que distribuirá una dosis de uno o más componentes que es mayor de lo que se administrará si el paciente se estuviera tratando sólo con un componente individual .

La composición farmacéutica puede incluir ingredientes adicionales que incluyen pero no se limitan a los ingredientes activos y excipientes descritos en la presente. En ciertas modalidades, uno o más agentes terapéuticos de la unidad de dosis pueden existir en una formulación de liberación extendida o controlada y los agentes terapéuticos adicionales pueden no existir en la formulación de liberación prolongada. Por ejemplo, un péptido agonista descrito en la presente puede existir en una formulación de liberación controlada en una formulación de liberación extendida en la misma unidad de dosis con otro agente que puede estar o no ya sea en una formulación de liberación controlada o de liberación extendida. De esta manera, en ciertas modalidades, puede ser deseable proporcionar la liberación inmediata de uno o más de los agentes descritos en la presente, y la liberación controlada de uno o más agentes diferentes.

La presente invención se ha descrito con referencia a ciertas modalidades de ejemplo de la misma. Sin embargo, será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que es posible incorporar la invención en formas específicas diferentes de aquellas de las modalidades de ejemplo descritas anteriormente. Esto se puede hacer sin apartarse del espíritu de la invención. Las modalidades de ejemplo son sólo ilustrativas y no se deben considerar de ningún modo restrictivas. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones anexas y sus equivalentes, en lugar de por la descripción precedente .

Ej emplos Los péptidos agonistas de GC-C o sales farmacéuticamente aceptable de los mismos como se describe en la presente se prepararon por síntesis química en fase sólida y plegado natural (oxidación con aire) por American Péptido Company (Sunnyvale, CA) . Los péptidos y sus secuencias se muestran a continuación (en donde la secuencia de aminoácidos es el código normal de una letra y "pS" es fosfoserina) : Ejemplo 1: Efectos de Fosfatasa Alcalina y Acida en Substratos Peptídicos Para las reacciones de fosfatasa alcalina, se prepararon soluciones concentradas de péptidos a 1 mg/mL en Tris-HCl 0.1 M pH 8, que se almacenaron a -20°C hasta que se llevaron a cabo los ensayos. Para las reacciones de fosfatasa acida, se prepararon soluciones concentradas de péptidos 1 mg/mL en fosfato de sodio 50 mM pH 6, que se almacenó a -20°C hasta que se llevaron a cabo los ensayos.

Reacción de Fosfatasa Alcalina Se obtuvo fosfatasa alcalina de intestino de becerro (CIP) de New England BioLabs, Ipswich, MA. Cat # M0290S. La solución de reacción de CIP se preparó por dilución con amortiguador (KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8, MgCl2 1 mM, 50 % de glicerol) a 0.5 unidades/yL. Las soluciones de reacción de fosfatasa alcalina se montaron en cantidades de 20 µ?, que contienen: 2 µL de amortiguador 10X CIP (NaCl 1 M, Tris-HCl 500 mM pH 8, MgCl2 100 mM) 2 de solución concentradas de péptido (1 mg/mL) 12 L de H20 4 i de fosfatasa alcalina (0, 0.5 o 2 unidades) Las soluciones de reacción se mezclaron suavemente y se incubaron durante 90 minutos a 37°C. Estas soluciones de reacción se almacenaron a -20 °C hasta el análisis. Para el análisis, la solución de reacción se eluyeron de 7.5 µ?, de péptido tratado con CIP a 50 µL de ácido fórmico al 0.1 % en agua o una concentración final de 10 µ?. La solución final de 20 entonces se analizó por LCMS con condiciones como se muestra en la Tabla 1 posterior.

Se montaron reacciones de control para la actividad enzimática que contienen p-nitrofenilfosfato 10 mM en lugar de péptido. Después de la incubación, las reacciones se diluyeron con 0.1 mL de amortiguador de borato 100 mM pH 9 y se leyeron a la absorbancia de 405 nm para monitorizar la aparición de p-nitrofenol .

Reacciones de Fosfatasa Acida Se obtuvo fosfatasa ácida de patata (PoAP) de Sigma, St. Louis, MS . Cat #P1146 y se obtuvo fosfatasa ácida de próstata humana (HuPrAP) de MP Biochemicals , Solón, OH. Cat # 153872. Las fosfatasas ácidas se disolvieron para proporcionar una solución que contiene 0.5 unidades de AP/pL usando acetato de sodio 50 raM pH 5, MgCl2 0.2 mM. Las reacciones de fosfatasa acida se montaron en cantidades de 20 que contienen: 2 pL de fosfatasa ácida 10X (acetato de sodio 500 mM pH 5, MgCl2 2 mM) 2 L de solución concentrada de péptido (1 mg/mL) 12 pL de H20 4 µ?, de fosfatasa ácida (0.5 o 2 unidades) Las soluciones de reacción se mezclaron suavemente y se incubaron durante 90 minutos a 37°C. La solución de reacción se almacenaron a -20°C para análisis posterior. Para el análisis, se diluyeron reacciones de fosfatasa ácida de 7.5 iL a 50 yL con ácido fórmico al 0.1 % en agua a una concentración final de 10 µ?. Las reacciones finales de 20 pL se analizaron por LCMS con las condiciones como se muestra en la Tabla 1 posterior. Las reacciones de control para la actividad enzimática se montaron y diluyeron a p-nitrof enilf osfato 10 mM en lugar de péptido. Después de la incubación, las reacciones se diluyeron con 0.1 mL de amortiguador de borato 100 mM pH 9 y se añadieron a la absorbancia de 405 nm para monitorizar la aparición de p-nitrofenol .

Tabla 1: Análisis por LCMS Las Tablas 2 y 3 muestran que bajo las condiciones usadas para el ensayo, 0.5 unidades de fosfatasa alcalina de intestino de becerro (pH 8) y 0.5 unidades de ya sea fosfatasa ácida de patata y fosfatasa acida de próstata humana (pH 5) hidrolizaron de forma eficiente p-nitrofenilfosfato .

La sensibilidad del Péptido 1 y el Péptido 2 al tratamiento de fosfatasa se valoro al analizar los productos de reacción por LC- S. Las Tablas 2 y 3 muestran que a pH 8 la fosfatasa alcalina de intestino de becerro desfosforiló de manera eficiente el Péptido 1 y el Péptido 2. En contraste a la fosfatasa alcalina, las fosfatasas ácidas de patata y ácidas de glándula de próstata humana fueron muy ineficientes en la desfosforilación del Péptido 1 bajo condiciones donde hidrolizaron de manera eficiente p-nitrofenilfosfato (Tabla 2) . La fosfatasa ácida de glándula de próstata humana también fue muy ineficiente en la desfosforilación del Péptido 2 (Tabla 3) .

Como un control separado, se trató el Péptido 3 con y sin fosfatasa alcalina de intestino de becerro y las reacciones resultantes se analizaron por LC-MS. El Péptido 3 no se afectó por el tratamiento con CIP (datos no mostrados) Tabla 2: Desfosforilación de Péptido 1 Tabla 3: Desfosforilación de Péptido 2 Ejemplo 2: Acumulación de cGMP en Células T84 para Análisis de Actividad de GC-C Para el ensayo de cGMP, se cultivaron durante la noche 4.5 x 105 células/mL de células T84 en placas de cultivo de tejido de 24 concavidades. El siguiente día, las células T84 se lavaron dos veces con 1 mL de DMEM + MES 20 mM (pH 5) o DMEM + bicarbonato de sodio 50 mM (pH8) en el cual estos amortiguadores no contienen suero. Después del segundo lavado, las células se incubaron con 450 pL de isobutilmetilxantina 1 mM (IBMX) en ya sea los amortiguadores de pH 5 o pH 8 durante 10 minutos a 37°C para inhibir cualquier actividad de fosfodiesterasa . Los péptidos entonces se diluyeron ya sea en amortiguador de pH 5 o pH 8 a una concentración lOx. La solución de péptido de 50 µ?· se diluyó a un volumen final de 500 yL con las células T84, poniendo cada concentración de péptido a lx. Un análisis de curva de once puntos se llevó a cabo para cada péptido, con concentraciones finales de péptido probadas en cada ensayo, en nM: 10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1.

No hubo control de péptido usado para determinar niveles endógenos cGMP. Los Péptidos se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Después de 30 minutos, los sobrenadantes se removieron y las células se lisaron con HC1 0.1 M. Las células se lisaron durante 30 minutos en hielo. Después de 30 minutos, los sobrenadantes se removieron y las células se lisaron con HPLC 0.1 M. las células se lisaron durante 30 minutos en hielo. Después de 30 minutos, los lisados se tomaron en pipeta y se colocaron en una placa de HPLC de 96 concavidades y se centrifugaron a 10,000x g durante 10 minutos para remover cualquier desecho celular. Los sobrenadantes del centrifugado previo se removieron y se colocaron en una placa fresca de HPLC de 96 concavidades. Las muestras se diluyeron con un volumen igual de acetato de amonio 1 M (pH 7) para neutralizar las muestras para una mejor cromatografía. Se preparó una curva normal de cGMP 2x en HC1 0.1 M y luego se diluyó con un volumen igual de acetato de amonio 1 M con las siguientes concentraciones finales en nM: 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1.

Se determinaron las concentraciones de cGMP de cada muestra usando las condiciones de LC/MS en la Tabla 4 y una curva normal calculada. Se calcularon los valores de EC50 de las curvas de concentración-respuesta generadas con el Software GraphPad Prism.

Tabla 4 : Condiciones de LC/MS La capacidad del Péptido 1 y Péptido 2 y sus formas desfosforiladas para estimular la síntesis de cGMP en células T84 humanas a pH 5 se probó al incubar las células con los péptidos seguido por la determinación del cGMP intracelular acumulado por LC-MS. La Tabla 5 muestra que el Péptido 1 y el Péptido 2 tienen potencias similares a aquella del Péptido 3 al estimular la síntesis de cGMP a pH 5. Sin embargo, el Péptido 1 y el Péptido 2 desfosforilados fueron menos potentes en el ensayo T84 que el Péptido 3.

Tabla 5 : respuesta de cGMP de células T84 La respuesta de cGMP de las células T84 al Péptido 5 y al Péptido 6 también se midió el duplicado de una manera similar a aquella descrita anteriormente. La EC50 a pH 5 para el Péptido 5 fue 14.7 nM y la EC50 a pH 5 para el Péptido 6 fue 39.2 nM .

Ejemplo 3: Unión Competitiva a Radioligando en Células T84 Células T84 humanas intactas de Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés; Manassas, VA) se usaron para experimentos de unión competitiva a radioligando. Las células T84 se cultivaron en monocapas en matraces de plástico T-150 a 60-70 % de confluencia en medio Eagle modificado de Dulbecco: medio F-12 50/50 de Ham (DMEM/F12) + suero bovino fetal al 5 % (FBS) . Las células se recolectaron por raspado suave con un raspador celular y las células se recolectaron por centrifuga a 2000 g durante 10 minutos a 4°C. Las células se lavaron dos veces al resuspender suavemente en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y al recolectar por centrifugación como antes.

Se preparó el radioligando [125I] -STp al disolver cien microgramos (100 pg) de NTFYCCELCCNPACAGCY (Enterotoxina STp; Bachem H-6248) en 0.5 mL agua y se envió a Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences (N. Billerica, MA) para ionización usando el método de lactoperoxidasa citado en (Marchanolis, J.J., "An enzymic method for the trace iodination of immunoglobulins and other proteins" , Biochem. J. 1969, 113, 299-305) . Perkin-Elmer purificó el trazador marcado por HPLC usando una columna Waters C-18 µBondapak (25 cm) previamente puesta en equilibrio con acetato de amonio 10 mM pH 5.8. Se aplicó un gradiente de acetonitrilo al 0 a 25 % a la columna en 60 min, seguido por elución isocrática a 25 % de Acetonitrilo durante otros 20 minutos. Este método separó dos formas monoyodadas una de la otra y del precursor no marcado. El segundo pico monoyodado (Pico 2) que eluyó después de 64 minutos y correspondió a ionización de la cuarta tirosina, se usó como el trazador marcado en el ensayo. El trazador marcado tiene una actividad específica de 2200 Ci/mmol. Al arribo, el trazador se almacenó en alícuotas a -20°C.

Las reacciones de unión se montaron en duplicado en 0.2 mL que contiene: 2.5 x 105 células T84 (0.25 mg de proteína), 200,000 cpm [125I] -STp (41 fmol, 200 pM) , competidor 0.1 a 3,000 nM, y albúmina de suero bovino al 0.5 % (BSA) . Los ensayos de unión se llevaron a cabo a pH 5.0 en DMEM/ácido 2- (N-morfolino) -etanosulfónico 20 mM (MES) . Los ensayos de unión a pH 8.0 se realizaron en DMEM/ cido N-2-Hidroxietilpiperazina-N' -2 -Etano-Sulfónico 20 mM (HEPES) /bicarbonato de sodio 50 mM. Las reacciones de control no contienen un competidor (total) o sin células.

Las soluciones de amortiguador se prepararon primero, luego se adicionó al 0.5 % BSA libre de proteasa. El radioligando se adicionó a una concentración final de 0.001 Ci/ L. La preparación de las soluciones concentradas de péptido competidor se hicieron al disolver péptidos a 1 mg/mL en fosfato de sodio 50 mM pH 6.0. Las concentraciones se calcularon del peso molecular del péptido proporcionado en el Certificado de Análisis. Se hicieron diluciones de competidor en fosfato de sodio 50 mM pH 6.0 que contuvo 20 veces la concentración final de péptido que se va a probar en la reacción de unión (competidor 20X) .

Las reacciones de unión se montaron en el siguiente orden : i. Radioligando y BSA en solución de amortiguador. ii. 10 L de competidor 20X. iii. células T84.

Las reacciones de unión se mezclaron suavemente y se incubaron a 37°C durante l h. La separación del radioligando unido a membrana del radioligando libre se llevó a cabo al aplicar las reacciones de unión a filtros de fibra de vidrio 2,5 cm Whatman GF/C (pretratados con polivinilpirrolidona al 1 % en PBS) usando filtración al vacío. Los filtros se enjuagaron dos veces con 5 mL de amortiguador de PBS enfriado con hielo y se llevaron a cabo mediciones del radioligando atrapado en un contador de escintilación. La determinación de la unión específica se hizo al sustraer la radioactividad unida de una reacción que contuvo competidor en exceso (1 µ?) de la radioactividad unida de cada muestra. La generación de curvas de unión competitiva a radioligando se hicieron usando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) y los datos se analizaron con regresión no lineal para calcular la concentración de competidor que dio por resultado 50 % de radioligando unido (IC50) . La constante de equilibrio de disociación aparente (?±) para cada competidor se obtuvo, de los valores de IC50 y un estimado previamente determinado de la constante de disociación para el radioligando, i¾ = 15 nM, usando el método de (Cheng and Prusoff, (1973) Biochem. Pharmacol . 22(23) 3099-3108) . La concentración de radioligando de 200 pM usada en los ensayos fue muy pequeña en comparación a su constante de disociación, la IC50 calculada y los valores de K± (Tabla 5) fueron en efecto idénticos.

Tabla 6: Ensayo de unión competitiva a radioligando La Tabla 6 muestra que el Péptido 1 y el Péptido 2 tienen potencias similares a aquella del Péptido 3 en la unión a pH 5. Sin embargo, el Péptido 1 y el Péptido 2 desfosforilados tienen menores afinidades para GC-C que el Péptido 3 en el ensayo de unión.

Ejemplo 4: Tránsito Gastrointestinal en Ratones El propósito de este ensayo fue probar el efecto de los péptidos agonistas de guanilato-ciclasa C en el tránsito gastrointestinal in vivo en ratones. Se ha demostrado que los agonistas de guanilato-ciclasa C, oralmente dosificados, incrementan el por ciento de distancia recorrida por una comida de carbón en ratones .

Para el ensayo, ratones CD-1 hembras (n=l0 por grupo) que pesan 25-30 g se ayunaron durante la noche y se les dio acceso a agua ad libitum. Se suspendió carbón activado (20g; malla 100; Sigma cat# 242276) en 200 mL de goma arábiga (100 mg/mL) , y se agitó durante al menos una hora. Los péptidos de prueba se prepararon en un vehículo Tris 20 mM pH 6.9.

Se administraron el péptido de prueba y el vehículo en dosis de 200 µ?, por cebadura oral. Siete minutos después de la dosificación de los péptidos de prueba, se dosificaron por cebadura oral 200 ]i de la suspensión de carbón/goma arábiga. Después de 15 minutos, los ratones se sacrificaron por sobredosis de C02. El tracto gastrointestinal se removió del esófago al intestino ciego. La longitud total del intestino delgado se midió desde el punto pilórico a la unión ileocecal. La distancia recorrida por el carbón se midió desde la unión pilórica al frente de carbón. La distancia recorrida (%) se determinó como (distancia recorrida por carbón/longitud total del intestino delgado) x 100. Se introdujeron los datos en el programa de software GraphPad Prism y se analizaron por ANOVA usando prueba de múltiple comparación Bonferroni post-hoc. También se determinaron gráficas de datos y ED50 usando el paquete de software GraphPad Prism.

Los efectos dependientes de la dosis de dosis agudas del Péptido 4, Péptido 1, Péptido 2, la forma desfosforilada del Péptido 1 y la forma desfosforilada de Péptido 2 en el tránsito GI se determinaron en los ratones CD hembras. La distancia recorrida por el frente del carbón después de siete minutos, expresada como por ciento de longitud total de intestino delgado se midió para calcular los valores de ED50 (Tabla 7) .

Tabla 7: Aceleración de tránsito GI superior en ratones La Tabla 7 muestra que las formas desfosforiladas de Péptido 1 y Péptido 2 exhibieron potencia reducida en comparación a sus respectivos péptidos cuando se administran oralmente en el modelo de tránsito GI superior en ratones. Ejemplo 5: Secreción de Fluido en Asas Intestinales de Rata.

Se estudió el efecto de los péptidos agonistas de GC-C en la secreción al inyectar péptidos agonistas de GC-C descritos en la presente directamente en una asa aislada en ratas tipo silvestre.

Se aislaron asas al ligar quirúrgicamente tres asas en el intestino delgado de la rata. La metodología para la formación de asas ligadas fue similar a aquella descrita en (London et al., 1997, Am J Physiol, p.G93-105). Las asas se centran aproximadamente y a longitudes de 1-3 cm. Las asas se inyectaron con 200 µ? de ya sea péptido/agonista de GC-C (0.1-5 µg) o vehículo (Tris 20 mM, pH 7.5 o Krebs Ringer, Glucosa 10 mM, amortiguador HEPES (KRGH) ) . Después de un tiempo de recuperación de hasta 90 minutos se escindieron las asas. Se registraron los pesos para cada asa antes y después de la remoción del fluido contenido en las mismas. La longitud de cada asa también se registró. Se calculó para cada asa una relación de peso a longitud (P/L) para determinar los efectos del péptido agonista de GC-C descrito en la presente en la secreción. También se determinó el volumen de fluido de asa.

En la Figura 2 y en la Tabla 8 se muestran los datos que muestran incrementos en la secreción de fluido, incremento de pH y secreción de bicarbonato en asas duodenales ligadas en ratas. La Figura 2 muestra que el Péptido 2 tiene una potencia similar a aquella del péptido 4 con respecto a la inducción de acumulación de fluido en asas duodenales ligadas de rata. La Tabla 8 proporciona los resultados en asas duodenales ligadas de rata usando 2.5 µ? de péptido por asa.

Tabla 8: Secreción de fluido, incremento de pH y secreción de bicarbonato Ejemplo 6. Metabolismo In vitro en Fluido de Asa de Yeyuno de Ratón El propósito de este estudio fue determinar la estabilidad de péptidos fosforilados en el fluido de asa yeyunal de ratón. En el estudio se usaron el Péptido 2, el péptido 2 desfosforilado (desfosfopéptido 2), el péptido 3, y el péptido 2 isotópicamente marcado. El péptido 2 isotópicamente marcado se sintetizó con alanina y leucina marcadas con 13C, 15N (es decir, con una secuencia CCpS[13C6, 15N] LCCNP [13C6, 15N]ACTGC) .

Cada péptido se sintetizó por American Péptido Company, Inc., y se almacenó desecado a -20°C. Se preparó una solución a 1 mg/mL para cada uno de los péptidos no marcados en clorhidrato de tris (hidroximetil) -aminometano 1 M (Tris-HC1) , pH 8 justo antes de llevar a cabo el ensayo de fluido de asa intestinal de ratón. Se preparó una solución a 500 ng/mL de péptido 2 marcado con 13C, 15N en ácido fórmico al 0.1 % en agua y se utilizó para diluir las muestras de yeyuno para análisis LC-MS/MS pos-ensayo.

Para estudiar el metabolismo del péptido 2, desfosfo-péptido 2, y el péptido 3 in vitro, los péptidos se incubaron en fluido de yeyuno de ratón extraído de asas ligadas en el intestino delgado de ratón. Para recolectar el fluido, los ratones ayunaron durante la noche con acceso completo a agua. Entonces se anestesiaron con isofluorano para cirugía y se sometieron a laparotomía en la cual se esteriorizó el intestino delgado. Las asas de yeyuno de 3 a 4 cm de longitud se hicieron con suturas iniciando a 7 cm desde el esfínter pilórico del estómago. Una vez que se formaron las asas, se inyectaron con 200 L de amortiguador de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) (10 mM, pH 7.4) . La pared abdominal y la piel de los animales entonces se suturó, y los animales se dejaron recuperar durante 30 minutos. Después de la recuperación, los animales se sacrificaron, las asas entonces se escindieron y se recuperó el fluido interior y se almacenó a-80°C hasta el uso.

Para cada péptido, se adicionaron 25 L de la solución concentrada de péptido a 1 mg/mL a 25 µL de Tris-HCl 1 M y 25 pL de amortiguador de fosfatasa intestinal de becerro lOx (CIP) que contiene Tris-HCl 500 mM, cloruro de sodio 1 M (NaCl) , cloruro de magnesio (MgCl2) , 0.1 mM pH 8. Las reacciones se iniciaron al adicionar 175 L del fluido de asa de yeyuno de ratón o 175 \i~L del amortiguador Tris-HCl 1 M pH8 para las reacciones de control. La concentración final de cada péptido fue 100 yg/mL. Las reacciones se mezclaron y mantuvieron continuamente a 37°C en un agitador de palca. A 0, 2, 5, 10, 20, 30, 60, 90 y 120 minutos después de adicionar el fluido de asa intestinal de ratón, se tomó una alícuota de 25 y se adicionó a 25 yL de ácido tricloroacét ico al 12 % a 4°C para determinar la reacción. Se adicionaron 200 yL adicionales de ácido fórmico al 0.1 % en agua estas reacciones para propósitos de dilución. Estas muestras entonces se diluyeron adicionalmente al tomar 20 yL de cada muestra y al adicionar a 480 µ?? de ácido fórmico al 0.1 % en agua que contiene 500 ng/mL del péptido 2 marcado con 13C, 15N de norma interna.

La concentración del péptido 2 del desfosfo-péptido 2, y del péptido 3 en las muestras se midió por LC-MS/MS. Todas las muestras se analizaron usando un espectrómetro de masa cuadrupolo triple Applied Biosystems/MDS SCIEX API 4000 equipado con un sistema de cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC, por sus siglas en inglés El espectrómetro de masa se operó en modo de monitoreo de múltiple reacción (MRM, por sus siglas en inglés), con resolución ajustada a 1.2 Da. Los parámetros cromatográf icos y el instrumento para cada compuesto se resumen en la Tabla 9.

Tabla 9: Péptido 2, desfosfo-péptido 2 (desfosfo . -Pep . 2), péptido 3, y péptido 2 marcado con 13C, 15N - (iso-lab. -Pep. 2) Parámetros del Método de LC-MS/MS Los datos de LC-MS/MS se procesaron usando el software Analyst versión 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS SCIEX) . La relación de área pico (relación de área pico de analito a área pico de norma interna) se calculó para usar el por ciento restante de cada péptido.

La Figura 3 presenta el por ciento restante de péptido 2 y desfosfo-péptido 2, y péptido 3 en los nueve puntos de tiempo medidos durante la incubación de 120 minutos en fluido de yeyuno de ratón y en la reacción de control (Tris-HCl 1 M) a 37°C. Después de la incubación en el fluido de asa yeyunal de ratón, sólo permanecieron 5.3 % del péptido 2 después de 120 minutos. El metabolito, desfosfo-péptido 2, se formó en esta reacción y se incrementó de concentración durante los primeros 20 minutos luego mostró una disminución lenta para el tiempo restante. En la reacción de control, no se metabolizó el péptido 2 y no se formó desfosfo-péptido 2. Después de la incubación en el fluido de yeyuno de ratón, sólo permanecieron 5.6 % del desfosfo-péptido 2 después de 120 minutos. En contraste, desfosfo-péptido 2 no se metabolizó en la reacción de control. El Péptido 3 se metabolizó rápidamente y no se detectó después de 90 minutos en el fluido de yeyuno de ratón. En la reacción de control, no se metabolizó el péptido 3.

El Péptido 2, su metabolito desfosfo-péptido 2, y el péptido 3 se metabolizaron en el fluido de asa de yeyuno de ratón. La formación de desfosfo-péptido 2 se observó cuando se incubó péptido 2 en fluido de asa de yeyuno de ratón a 37 °C. El desfosfo-péptido 2 y el péptido 3 se degradaron más rápido en el fluido intestinal de ratón que el péptido 2.

Ejemplo 7: Vaciamiento Gástrico Líquido en Ratas Diabéticas Inducidas con Estrepozotocina (STZ) El efecto de los péptidos 2 y 3 administrados mediante cebador oral en el vaciamiento gástrico líquido (LGE, por sus siglas en inglés) en ratas diabéticas inducidas con estrepozotocina (STZ, por sus siglas en inglés) se estudió. Ratas macho adultas (Sprague-Dawley; n=60) que pesan -300 g (suministradas por Taconic) en condiciones de control de temperatura ambiente (22°C) y luz (ciclo de luz-oscuridad 12:12 h) con acceso libre a agua y alimento. Después de un período de aclimatación de una semana, se inició el protocolo de STZ para inducir diabetes tipo I.

Para inducir diabetes tipo I en animales en el grupo experimental de STZ (n=50) , se administró durante 5 días un régimen diario de inyecciones intraperitoneales de STZ (20 mg/kg) contenida en amortiguador de citrato. Un grupo de control recibió un volumen igual del vehículo (n=10) durante el mismo programa de inyección. A todos los animales se les dio 9 semanas para desarrollar diabetes/recuperación de las inyecciones. Se monitorizaron los niveles sanguíneos de glucosa después de 5 días de la inyección de STZ en el día 0 (es decir, en el día 6) y en la semana 1, 2 y 10 (es decir, comienzo de la semana 10, el día del experimento) . Se tomaron muestras sanguíneas de la vena de la cola, excepto en el día del experimento de vaciamiento gástrico líquido (LGE) (comienzo de la semana 10) , en la cual se tomó sangre directamente del corazón.

El procedimiento de LGE comprendió 6 grupos (n=10/grupo) de los cuales cinco grupos fueron diabéticos y un grupo no fue diabético. Antes del experimento de LGE, se retiró durante la noche el alimento, en tanto que se retiró agua 2 horas antes de iniciar el procedimiento de vaciamiento gástrico .

Se disolvieron el péptido 3 y el péptido 2 de manera separada en un vehículo de solución de sacarosa al 20 % que contiene 0.1 mg/ml de rojo fenol. Las dosis de fármaco para los compuestos empleados fueron (en mg/kg) : 0.1 (péptido 2 y 3), 0.3 y 1.0 (sólo péptido 2) . Para probar su efecto en LGE, entonces se distribuyó un volumen de 0.5 mi de la solución de fármaco mediante una aguja de cebadura de calibre 18 (6 cm de longitud) en el estómago ya sea de animales diabéticos o de animales de control. Cada animal en los grupos experimentales diabéticos recibió una dosis individual de fármaco de un compuesto Ironwood (péptido 2 o 3) . En el grupo no diabético, los animales se administraron con un volumen similar de sólo la solución de vehículo. Se les permitió a todos los animales 15 minutos para que se presentara el vaciamiento gástrico, después de lo cual se sometieron a eutanasia con isoflurano.

Después de la eutanasia, mediante una laparotomía, se tuvo acceso al estómago y se ligó en cada animal en el esfínter esofágico inferior y en el esfínter pilórico. Entonces, se expuso el corazón a través de una incisión en el diafragma, se tomó una muestra de sangre y se valoró el nivel de glucosa con un glucómetro. El estómago entonces se escindió del animal y se almacenó durante la noche en un tubo de 10 mi que contiene etanol a 95 %. Entonces, se homogenizó el tejido, se centrifugó (dos veces a 40,000 g durante 30 min) y el sobrenadante se probó para la absorbancia en un espectrofotómetro (BioMate 3, Thermospectronic , Inc.) a una longitud de onda de 410 nm. Los resultados se compararon a un "valor cero" derivado de la administración de la solución de sacarosa/rojo fenol al estómago de un animal que se sacrificó inmediatamente y su estómago se removió para determinar el "por ciento retenido" para cada grupo.

Se analizaron los datos en términos del porcentaje medio (± SEM) del líquido retenido en los animales sacrificados en un punto de tiempo de 15 min. Se determinó el significado estadístico usando ANOVA y prueba post hoc de comparación de Student-Newman-Keuls . Se estableció el significado estadístico a P <0.05.· Los niveles en ayuno de glucosa tanto de los animales diabéticos por STZ como de los animales de control fue >300mg/dL en el día del experimento de vaciamiento gástrico. Los pesos totales de los animales diabéticos por STZ fueron apreciablemente menores (aproximadamente 150 g en promedio) que los animales no diabéticos en el día del experimento. Ambos grupos de animales iniciaron a aproximadamente 300 g en el momento del tratamiento con STZ; los amonales no tratados ganaron, en promedio, 130 g durante las 10 semanas antes del tratamiento con LGE, en tanto que los animales diabéticos por STZ permanecieron a un peso constante (~ 300 g) hasta el ayuno (aproximadamente 280 g en promedio) .

Los experimentos se realizaron para determinar el efecto de los péptidos 2 y 3 en LGE en ratas diabéticas inducidas por STZ (9 semanas). Una dosis del péptido 3 (0.1 mg/kg) y tres dosis del péptido 2 se evaluaron. Los datos (Figura 4) indican que: Las ratas diabéticas inducidas con STZ exhiben un retraso significativo en el vaciamiento gástrico de una comida líquida después de 15 minutos de administración de vehículo en comparación a ratas de control (88.24+7.12 % de retención en comparación a 45.34+7.1 % en controles).

Esta diferencia significativa entre animales diabéticos con STZ y controles también se extiende a aquellos animales diabéticos que se administraron con el péptido 2 y el péptido 3 como se calcula por la prueba post hoc de múltiple comparación de Student-Newman-Keuls. En el caso del péptido 2, las dos dosis más altas (0.3 y 1.0 mg/kg) mejoraron significativamente LGE en comparación a animales diabéticos que recibieron sólo la solución de vehículo.

Los resultados del presente estudio muestran que hubo un retraso significativo en la velocidad de LGE en animales diabéticos inducidos con STZ (vehículo dado) en comparación a controles no diabéticos. Adicionalmente , los datos del análisis de varianza unidireccional (ANOVA) que emplean la prueba post hoc de múltiples comparaciones (Student-Newman-Keuls) indican que estuvieron presentes diferentes estadísticamente significativas en LGE entre los animales diabéticos con STZ que se administraron oralmente con solución de vehículo en comparación a aquellos que recibieron el péptido 3 (0.1 mg/kg) o péptido 2 (0.3 o 1.0 mg/kg) . Sin embargo, en comparación a los controles no diabéticos que recibieron sólo la solución de vehículo, estas diferencias mencionadas anteriormente no fueron evidentes.

Estas observaciones demuestran que el péptido 3 fue efectivo a la dosis estudiada (0.1 mg/kg) en restaurar LGE a aquellos de niveles de control no diabéticos. De manera similar, el péptido 2 a las dosis de 0.3 y 1.0 mg/kg dadas oralmente restauró LGE en animales diabéticos inducidos con STZ a aquellos de controles normales. A la dosis más baja (0.1 mg/kg), el péptido 2 no restaura significativamente de forma estadística LGE a aquellos de controles normales, sin embargo los resultados mostraron una tendencia visual hacia una disminución del por ciento del líquido retenido.

Otras Modalidades Todas las publicaciones y patentes referidas en esta descripción se incorporan en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente individual se indicará de manera específica e individualmente, para que se incorpore como referencia. Si el significado de los términos en cualquiera de las patentes o publicaciones incorporadas como referencia entra en conflicto con el significado de los términos usados en esta descripción, se propone que controle el significado de los términos en esta descripción. Además, el análisis anterior describe y da a conocer sólo modalidades de ejemplo de la presente invención. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente de este análisis y de las figuras anexas y de las reivindicaciones, que se pueden hacer varios cambios, modificaciones y variaciones en la presente sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se define en las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (83)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque el péptido comprende la secuencia de aminoácidos Xaax Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Cys9 Asni0 Proii Ala12 Cys13 Xaai4 Glyi5 Xaai6 Xaai7, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; en donde Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, ß-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, D-Glu, Glu ?-carboxilada, ácido a-aminosubérico (Asu) , ácido -aminoadípico (Aad) , ácido -aminopimélico (Apm) , o está ausente; Xaa2 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilada, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa3 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilada, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa4 es Cys o D-Cys; Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, 4 -hidroxivalina-fosfato, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr; Xaa7 es Tyr, Leu, Phe o lie; Xaa8 es Cys o D-Cys; Xaai4 es Thr, Ala o Phe; Xaaie es Cys o D-Cys; y Xaai7 es Tyr, D-Tyr, o está ausente; 5 en donde : si Xaai está presente, Xaai se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; 10 si Xaax está ausente y Xaa2 está presente, entonces Xaa2 se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; o 15 si tanto Xaai como Xaa2 están ausentes, entonces Xaa3 se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o octanodioico. 20

2. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Xaa2 y Xaa3 están ambos ausentes.

3. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, 25. caracterizado porque Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 está ausente.

4. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 es Asp o Glu.

5. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque Xaa7 es Tyr o Leu.

6. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque Xaa1 es Thr.

7. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque Xaa17 es Tyr o está ausente .

8. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, ß-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu o D-Glu.

9. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque Xaai es Asp, D-Asp, Glu o D-Glu.

10. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque Xaa6 es P-Ser o P-Thr.

11. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque Xaa6 es P-Ser.

12. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Xaai, Xaa2 y Xaa3 están ausentes.

13. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque Xaa7 es Tyr o Leu.

14. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado porque XaaX4 es Thr.

15. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-14, caracterizado porque Xaai7 es Tyr o está ausente.

16. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, caracterizado porque Xaa6 es P-Ser.

17. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido comprende la secuencia de aminoácidos Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pron Alai2 Cysi3 Thri4 Gly15 CysiS Xaai7, caracterizado porque Xaa7 es Tyr o Leu.

18. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende la secuencia de aminoácidos : Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

19. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el péptido comprende no más de 50, 40, 30 o 20 aminoácidos.

20. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido comprende no más de 19, 18, 17, 16, 15 o 14 aminoácidos.

21. Un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa Cys5 Xaa6 Xaa Cys8 Cys9 Asni0 Pron Alai2 Cysi3 Xaai4 Glyis Cysi6 Xaai7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque Xaax es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, (3-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Adsp ?-carboxilado, Glu, D-Glu, Glu ?-carboxilado, ácido a-aminosubérico (Asu) , ácido a-aminoadípico (Aad) , ácido -aminopimélico (Apm) , o está ausente; Xaa2 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa3 es Asp, Asp ?-carboxilado, Glu, Glu ?-carboxilado, Asu, Aad, Apm, o está ausente; Xaa4 es Cys o D-Cys ; Xaa6 es P-Ser, P-Thr, P-homo-Ser, 4 -hidroxivalina-fosfato, P-homo-Thr, P-Cys o P-Tyr; Xaa7 es Tyr, Leu, Phe o lie; Xaa8 es Cys o D-Cys ; Xaai4 es Thr, Ala o Phe; Xaai6 es Cys o D-Cys ; y XaaX7 es Tyr, D-Tyr, o está ausente; en donde : si Xaai está presente, Xaax se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; si Xaai está ausente y Xaa2 está presente, entonces Xaa2 se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o ácido octanodioico; o si tanto Xaax como Xaa2 están ausentes, entonces Xaa3 se puede modificar en su grupo amino por metilo, ácido etanodioico, ácido propanodioico, ácido butanodioico, ácido pentanodioico, ácido hexanodioico, ácido heptanodioico o octanodioico.

22. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Xaa2 y Xaa3 están ambos ausentes.

23. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 está ausente.

24. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Xaa2 es Asp o Glu y Xaa3 es Asp o Glu.

25. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizado porque Xaa7 es Tyr o Leu.

26. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-25, caracterizado porque Xaai4 es Thr.

27. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-26, caracterizado porque Xaai7 es Tyr o está ausente.

28. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-27, caracterizado porque Xaai es Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, ß-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu o D-Glu.

29. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque Xaai es Asp, D-Asp, Glu o D-Glu.

30. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-29, caracterizado porque Xaa6 es P-Ser o P-Thr .

31. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque Xaa6 es P-Ser.

32. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Xaaif Xaa2 y Xaa3 están ausentes.

33. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque Xaa7 es Tyr o Leu.

34. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33, caracterizado porque Xaai4 es Thr.

35. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-34, caracterizado porque Xaa17 es Tyr o está ausente.

36. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-35, caracterizado porque Xaa6 es P-Ser.

37. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el péptido consiste de la secuencia de aminoácidos Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pron Alai2 Cysi3 Thri Glyi5 Cysis Xaai7, en donde Xaa7 es Tyr o Leu.

38. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el péptido consiste de la secuencia de aminoácidos : Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.

39. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizado porque el péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo está aislado.

40. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo está purificado.

41. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-40.

42. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-40 y uno o más agentes seleccionados de (i) un catión seleccionado de Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+, o (ii) una amina primaria estéricamente impedida.

43. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque el agente es Mg2+, Ca+, Zn+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+.

44. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42 . o 43, caracterizada porque se proporciona Mg+, Ca2+, Zn+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+ como acetato de magnesio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de calcio, cloruro de calcio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, acetato de zinc, cloruro de zinc, fosfato de zinc, sulfato de zinc, acetato de manganeso, cloruro de manganeso, fosfato de manganeso, sulfato de manganeso, acetato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, sulfato de potasio, acetato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, sulfato de sodio, acetato de aluminio, cloruro de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio.

45. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque el agente es una amina primaria estéricamente impedida.

46. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la amina primaria estéricamente impedida es un aminoácido.

47. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque el aminoácido es un aminoácido que se presenta de manera natural, un aminoácido que no se presenta de forma natural o un derivado de aminoácido.

48. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el aminoácido que se presenta de forma natural es histidina, fenilalanina, alanina, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina, leucina, metionina, asparagina, tirosina, treonina, isoleucina, triptofano o valina o el aminoácido que no se presenta de forma natural es ácido 1-aminociclohexano-carboxílico, lantanina o teanina.

49. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque la amina primaria estéricamente impedida tiene la fórmula: : en donde R1( R2 y R3 se seleccionan independientemente a partir de: H, C(0)OH, Ci-C6 alquilo, Ci-C6 alquiléter, Ci-C6 alquitioéter, ácido Ci-C6 alquil-carboxílico, C1-C6 alquil-carboxilamida y alquilarilo, en donde cualquier grupo se puede sustituir de manera individual o de forma múltiple con: halógeno o amino, y con la condición que no más de uno de R1( R2 y R3 sea H.

50. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la amina primaria estéricamente impedida es ciclohexilamina o 2-metilbutilamina .

51. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque la amina primaria estéricamente impedida es una amina polimérica.

52. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la amina polimérica es quitosan.

53. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-52, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende adicionalmente Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2\ K\ Na+ o Al3+.

54. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ o Al3+ se proporciona como acetato de magnesio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de calcio, cloruro de calcio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, acetato de zinc, cloruro de zinc, fosfato de zinc, sulfato de zinc, acetato de manganeso, cloruro de manganeso, fosfato de manganeso, sulfato de manganeso, acetato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, sulfato de potasio, acetato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, sulfato de sodio, acetato de aluminio, cloruro de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio .

55. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-54, caracterizada porque además comprende un antioxidante.

56. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque el antioxidante es BHA, vitamina E o galato de propilo.

57. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-56, caracterizada porque además comprende un aditivo o aglutinante farmacéuticamente aceptable.

58. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque el aglutinante o aditivo farmacéuticamente aceptable se selecciona a partir de alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona (povidona) , un almidón, maltodextrina o un éter de celulosa.

59. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque el aditivo o aglutinante farmacéuticamente aceptable es alcohol polivinílico.

60. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el aditivo o aglutinante farmacéuticamente aceptable es éter de celulosa.

61. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el éter de celulosa se selecciona a partir de: metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxietilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa .

62. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-61, caracterizada porque demás comprende un agente de relleno farmacéuticamente aceptable .

63. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque el agente de relleno farmacéuticamente aceptable es celulosa, isomalta, manitol, lactosa o fosfato de calcio dibásico.

64. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque la celulosa se selecciona de celulosa microfina y celulosa microcristalina .

65. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-64, caracterizada porque además comprende un agente terapéutico adicional.

66.. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque el agente terapéutico adicional se selecciona de uno o más de un agente analgésico, un antidepresivo, un agente promotilidad o procinético, un antiemético, un antibiótico, un inhibidor de la bomba de protones, un bloqueador ácido, un inhibidor de PDE5, un antagonista de la bomba acida, un agonista de GABA-B, un secuestrante de ácidos biliares o un agente mucoso protector.

67. Una unidad de dosis, caracterizada porque comprende la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 41-67.

68. La unidad de dosis de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque la unidad de dosis es una cápsula o tableta.

69. La unidad de dosis de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque cada una de la unidad de dosis comprende 5 yg a 1 mg del péptido.

70. Un método para tratar un trastorno gastrointestinal, caracterizado porque comprende administrar la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 41-69.

71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es gastroparesia, cólico gástrico post-operativo, trastorno esofágico funcional, un trastorno gastroduodenal funcional, enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) , enfermedad celiaca, mucositis, o una úlcera duodenal o estomacal.

72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es gastroparesia .

73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la gastroparesia es gastroparesia idiopática, diabética o post-quirúrgica .

74. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es cólico gástrico post-operativo.

75. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es un trastorno esofágico funcional.

76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el trastorno esofágico funcional es acidez gástrica funcional, dolor de pecho funcional de origen esofágico presumido, disfagia funcional o globus .

77. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es un trastorno gastroduodenal funcional.

78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el trastorno gastroduodenal funcional es dispepsia funcional, un trastorno de eructo, un trastorno de nausea o vómito, o un síndrome de ruminación.

79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la dispepsia funcional es síndrome de esfuerzo postprandial o síndrome de dolor epigástrico.

80. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el trastorno de eructo es aerofagia o eructo excesivo no especificado.

81. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el trastorno de nausea o vómito es nausea idiopática crónica, síndrome de vómito funcional o vómito cíclico.

82. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es enfermedad de reflujo gastroesof gico (GERD) .

83. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es una úlcera duodenal o estomacal.