PT1765851E - Compostos análogos de péptidos analgésicos derivados do veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, suas utilizações, composições, métodos de preparação e purificação - Google Patents

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DESCRIÇÃO "COMPOSTOS ANÁLOGOS DE PÉPTIDOS ANALGÉSICOS DERIVADOS DO VENENO DE SERPENTES CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS, SUAS UTILIZAÇÕES, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS DE PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO"

Campo da invenção: A presente invenção refere-se a compostos que induzem a analgesia ou actuam sobre receptores opióides em mamíferos. Mais especificamente, esta invenção refere-se a compostos análogos de péptidos com efeito analgésico derivados do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus, as suas utilizações, composições farmacêuticas e métodos de preparação e de purificação.

Antecedentes da invenção:

De acordo com os dados da Sociedade Brasileira para o Estudo da Dor (SEBD, 2004 http: //www. dor. orq·.br/ dor impactos. asp) , a dor afecta pelo menos 30% dos indivíduos durante algum momento das suas vidas e, em 10% a 40% destes indivíduos, a dor perdura durante mais do que um dia. A dor constitui a principal causa de sofrimento, incapacidade laborai e provoca sérias consequências e psicossociais e económicas. Aproximadamente 40% destes 2 ΡΕ1765851 indivíduos faltam ao trabalho durante vários dias. Não existem estatísticas oficiais sobre o impacto da dor na população Brasileira, no entanto a sua ocorrência aumentou substancialmente nos últimos anos. Além disso, a incidência de dor crónica no mundo oscila de 7% a 40% da população. Como consequência, de 50% a 60% destes indivíduos que sofrem de dor crónica tornam-se parcialmente ou totalmente, temporariamente ou permanentemente incapacitados, comprometendo de forma significativa a qualidade de vida. A utilização terapêutica dos venenos de serpente em humanos data do início do século XX (Brazil, V. Biol. Med. São Paulo, 1: 7-21, 1934, Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398-408; Klobusitzky D. Anais do instituto Pinheiros, 1: 3-23, 1938) e a literatura apresenta revisões importantes da utilização destes venenos na qualidade de agentes terapêuticos. Estas revisões mostram, por exemplo, que a utilização do veneno de Crotalus adamanteus para o tratamento de epilepsia e a utilização do veneno de Agkistrodon piscivorus, Vipera ruselli e Notechís scutatus na forma de agentes hemostáticos (Klobusitzky, D. Anais do Instituto Pinheiros, 1: 3-23, 1938).

Relatórios sobre as propriedades analgésicas de venenos de serpente observados em seres humanos datam do início da década de 30 (Monaelesser & Taguet, 1933, apud em Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398-408, 1950). Relativamente ao efeito analgésico do veneno da serpente cascavel da América do Sul (Crotalus durissus terrificus) , 3 ΡΕ1765851 aqui de seguida referido como "CdtV", os primeiros estudos foram realizados pelo Dr. Vital Brazil. Nestes estudos, o Dr. Vital Brazil preparou soluções altamente diluídas de veneno crotálico, denominadas soluto crotálico. A solução crotálica foi distribuída a vários médicos no Brasil e no estrangeiro e foi utilizada para o tratamento de várias algias, especialmente de origem neoplásica. Os resultados deste estudo demonstraram que o veneno de cascavel é altamente eficaz para o tratamento de várias algias (Brazil, V. Biol. Med. São Paulo, 1: 7-21, 1934, Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398-408, 1950).

Relativamente à utilização de produtos derivados do veneno de serpente para o tratamento de algias, vale a pena mencionar-se o desenvolvimento de um produto denominado anaveneno, produzido no Instituto Butantan, pela mistura destes venenos com formaldeído. Estes produtos foram indicados para o tratamento de diferentes algias, particularmente nos casos em que os analgésicos convencionais não apresentavam efeitos. Este produto demonstrou um efeito analgésico potente, uma vez que este produto poderia substituir o tratamento com morfina. O anaveneno também apresentou um efeito analgésico duradouro, uma vez que os pacientes eram geralmente tratados com o anaveneno com intervalos de desde 1 a 3 dias entre doses.

Apesar dos resultados observados pelo Dr. Vital Brazil, que ilustram o efeito analgésico do veneno de serpente Crotalus duríssus terrífícus, a substância activa 4 ΡΕ1765851 presente no veneno em bruto, responsável pelo efeito analgésico, não era conhecida.

Iniciaram-se em 1990 estudos dos mecanismos da acção analgésica deste veneno, utilizando modelos experimentais da avaliação da dor.

Estes estudos mostraram que o CdtV, administrado em ratinhos, induz um efeito de antinocicepção de longa duração, quando avaliado no teste da placa quente, sugerindo que este veneno é capaz de causar analgesia através de uma acção no Sistema Nervoso Central (Giorgi R. et al., Toxicon, 31: 1257-65, 1993; Picolo G. et al. Toxicon 36: 223-227, 1998). Estudos farmacológicos mostraram o envolvimento de receptores opióides do tipo kappa (Giorgi R. et al., Toxicon, 31: 1257-65, 1993; Brigatte P. et al. Toxicon 39: 1399-1410, 2001), em antinocicepção observada no teste de placa quente. Os tratamentos prolongados utilizando o veneno induziram a tolerância ao efeito de antinocicepção no teste de placa quente, mas não dependência física. A tolerância é mediada por mecanismos farma-codinâmicos. A tolerância cruzada com a morfina não foi observada (Brigatte P. et al. Toxicon 39: 1399-1410, 2001) . Por outro lado devido ao efeito de antinocicepção de longa duração do veneno (5 dias após a administração de uma única dose), não ocorre qualquer desenvolvimento do fenómeno de tolerância se o veneno for administrado a cada 5 dias, durante até 65 dias após o início do tratamento (Brigatte P. et al. Toxicon 39: 1399-1410, 2001) . 5 ΡΕ1765851

Além do efeito observado no teste da placa quente, a acção analgésica foi demonstrada para o veneno em bruto em dois modelos experimentais de dor inflamatória: o modelo das contorções abdominais induzidas por ácido acético (Giorgi R. et al., Toxicon, 31: 1257-65, 1993) e em hiperalgesia induzida pela carragenina (Picolo G. et al., Eur J Pharmacol 391: 55-62, 2000) . No modelo da carragenina, o efeito analgésico do veneno é também um efeito analgésico prolongado, que persiste até 5 dias após a administração de uma única dose do veneno. Este efeito envolve a participação de receptores opióides delta periféricos (Picolo G. et al., Eur J Pharmacol 391: 55-62, 2000).

Por outro lado, no modelo da hiperalgesia induzido pela prostaglandina, a acção de antinocicepção do veneno crotálico é mediada pelos receptores opióides kappa e delta (Picolo G. et al. Eur J Pharmacol 469: 57-64, 2003) . Em ambos os modelos de hiperalgesia (carragenina e prostaglandina), a antinocicepção induzida pelo CdtV também envolve o estimulo da via L-arginina/Óxido Nítrico (NO)/GMPc, da proteína cinase dependente de GMPc e activação dos canais de potássio sensíveis ao ATP (Picolo G. et al. Eur J Pharmacol 469: 57-64, 2003, Picolo e Cury, Life Science 75: 559-73, 2004). É importante enfatizar que o veneno é também capaz de induzir antinocicepção em modelos de dor 6 ΡΕ1765851 persistente, tal como no modelo de dor neuropática induzida por constrição crónica do nervo ciático de ratinhos (Gutierrez, V. P., Chacur, M. , Sampaio, S.C., Picolo, G., Cury, Y. Memórias do Instituto Butantan vol. 60, p. 50, 2003) e no modelo de dor de cancro induzida pela injecção intraplantar de células de carcinoma Walker 256 em ratinhos (Brigatte, P., Sampaio S.C., Gutierrez, V., Curi, R. Rangel-Santos, A.C., Guerra, J.L., Cury Y., XXXVI Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, Programa e Resumos, p. 195, 2004) . O efeito do veneno no modelo de dor neuropática é também prolongado, dado que foi detectado durante até 3 dias após a administração de uma única dose do veneno. Tal como observado nos modelos de hiperalgesia induzidos pela carragenina ou prostaglandina, receptores opióides kappa e delta, a via da L-arginina/NO/GMPc e a abertura de canais de potássio sensíveis ao ATP são responsáveis pelo efeito do veneno neste modelo (Gutierrez, V.P., Chacur, M. , Sampaio, S.C., Picolo, G., Cury, Y. Memórias do Instituto Butantan, vol. 60, p. 50, 2003).

Os venenos de serpente são constituídos por uma mistura complexa de proteínas e péptidos biologicamente activos. Várias substâncias activas com indicações terapêuticas diferentes foram já isoladas a partir destes venenos. Como exemplos, temos a patente US5182260 (Maraganore, J.H., 1993), na qual foi isolado um polipéptido inibidor da activação plaquetária a partir do 7 ΡΕ1765851 veneno da serpente norte americana Water Moccasin, ou a patente US5763403 (Lyan, E.C.Y., 1998), na qual foi obtida uma proteína anticoagulante de lúpus a partir do veneno de serpentes Agkistrodon halys brevicaudus, ou a patente US6489451 (Li, B.X., 2002), na qual foi purificada uma enzima antitrombótica a partir do veneno de serpentes Agkistrodon acutus. Relativamente a produtos utilizados no tratamento da dor, a patente Americana US6555109 (Shulov, A., 2003) descreve uma fracção não tóxica, isolada do veneno de serpentes Vipera xanthina palestinae, e os seus produtos derivados foram utilizados para controlar diversos tipos de dor, incluindo dor crónica. Além disso, a patente Americana US6613745 (Gopalakrishnakone, P., 2003) apresenta péptidos com sequências de aminoácidos derivadas ou baseadas na sequência de aminoácidos de um factor analgésico presente no veneno da Cobra-Rei (Ophiophagus hannah) . A actividade analgésica da crotamina, uma toxina presente no veneno de serpentes Crotalus durissus terri-ficus, é também encontrada na literatura. Estudos demonstraram que existe uma relação dose-resposta analgésica, quando se injecta crotamina purificada pelas vias subcutânea ou intraperitoneal em ratinhos. O efeito analgésico foi inibido por naloxona, sugerindo o envolvimento de receptores opióides (Mancin C.A. et al., Toxin 36:12, 1927-1937, 1998). O ópio e os seus produtos derivados são ΡΕ1765851 analgésicos potentes, que também têm outros efeitos farmacológicos. Os opióides endógenos e exógenos estão entre os analgésicos mais usados para controlar a dor, particularmente a dor crónica ou sem tratamento, por exemplo as dores que ocorrem no cancro, dor neuropática e dor inflamatória crónica. Estes fármacos, através da acção em receptores específicos, induzem a analgesia em seres humanos e em animais, através da modificação da resposta patofisiológica a estímulos nocivos químicos, mecânicos ou térmicos (Yaksh, T.L. Acta Anaesth. Scand. 41: 94-111, 1997) .

Foram identificadas pelo menos três famílias distintas de péptidos opióides: as encefalinas, as endor-finas e as dinorfinas. Cada família é derivada de um percursor polipetídico distinto e numa distribuição anatómica característica. Estes percursores, designados proence-falina, pro-opiomelanocortina e prodinorfina, possuem a sequência de aminoácidos Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu, (onde Tyr, Gly, Phe, Met e Leu correspondem aos aminoácidos tirosina, glicina, fenilalanina, metionina e leucina, res-pectivamente), localizada na porção N-terminal dos péptidos opióides (Przewlocki R. e Przewlocka B. Eur. J. Pharmacol. 429: 79-91, 2001, Reisine T. e Pasternak, G. Em: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman J.G. e Limbird L.E. eds, 9a ed, Nova Iorque, McGraw-Hill, pp. 521-555, 1996).

Os opióides, pela acção em terminações nervosas 9 ΡΕ1765851 aferentes, inibem a adenilil ciclase, com diminuição da produção de AMPc (Schultz, J.E.J. e Gross, G.J. Pharmacol. Ther., 89: 123-137, 2001) e inibindo a abertura dos canais de cálcio, com consequente bloqueio da libertação de neurotransmissores (Junien, J.L. e Wettstein, J.G. Life Science, 51: 2009-18, 1992; Zaki, P.A. et al. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 36: 379-401, 1996; Yaksh, T.L. Acta

Anaesth. Scand. 41: 94-111, 1997).

Além disso, os opióides activam a via L-arginina-óxido nitrico-GMPc, induzindo a abertura dos canais de potássio, com consequente hiperpolarização da membrana celular, (Ferreira, S.H. et al. Eur. J. Pharmacol., 1217: 225-7, 1991; Ferreira, S.H. et al. Br. J. Pharmacol., 114: 303-8, 1995; Nozaki-Taguchi, N. e Yamarnoto, T. Anesth.

Anal., 87: 388-93, 1998; Amarante, L.H e Duarte, I.D. Eur J Pharmacol., 454:19-23, 2002). O efeito antinociceptivo de agonistas opióides sobre canais de K+ envolve tanto canais de K+ sensíveis a ATP, como canais de K+ dependentes de voltagem (Welch, S. e Dunlow, L.D. J. Pharmacol. Exp. Ther., 267: 390-399, 1993; Rodrigues, A.R A. e Duarte I. D.G. Br. J. Pharmacol, 129: 110-114, 2000; Schultz, J. E.J. e Gross, G. J. Pharmacol. Ther., 89: 123-137,2 001) .

Adicionalmente, vários estudos têm mostrado que analgésicos opióides, incluindo agonistas κ opióides afectam a actividade de proteína cinase activada por agentes mitogénicos (MAPK) (Li, J.G., et al, J. Biol. Chem., 274: 12087-12094, 1999; Eitan, S. et al, J. 10 ΡΕ1765851

Neuroscience, 23: 8360-8369, 2003; Lesscher, H.M.B. et al, Neuroscience, 116: 139-144, 2003).

Para além da existência de múltiplos péptidos que apresentam actividade opióide, a existência de múltiplos receptores opióides foi caracterizada farmacologicamente. Assim, considera-se que os analgésico opióides exercem seus efeitos por interacção com receptores específicos, constituídos de pelo menos 3 classes principais: μ (mu), κ (kappa) e δ {delta) (Yaksh, T. L. Eur. J. Anaesthesiol. 1: 201-243, 1984), distribuídos no Sistema Nervoso Central e em tecidos periféricos, com actividades farmacológicas, distribuição anatómica e função distintas (Junien, J.L. e Wettstein, J.G. Life Science, 51: 2009-2018, 1992; Yaksh, T.L. Acta Anaesth. Scand. 41: 94-111, 1997).

As acções centrais e periféricas dos opióides são componentes importantes da sua utilização terapêutica. Os receptores mu são responsáveis pela maioria dos efeitos analgésicos dos opióides e por alguns dos seus efeitos adversos, tais como a depressão respiratória e cardiovascular, euforia, dependência, sedação e alteração de várias funções neuroendócrinas [Brownstein, M.J. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 90: 5391-5393, 1993].

Aqueles efeitos secundários ocorrem principalmente como uma consequência da acção daqueles agonistas no Sistema Nervoso Central. Esta é a razão principal da limitação da utilização destes analgésicos no controlo da 11 ΡΕ1765851 dor. Os receptores opióides delta são, provavelmente, mais importantes na periferia, apesar de também causarem analgesia central. Além a analgesia, estes receptores modulam a motilidade gastrointestinal e várias funções hormonais. Por outro lado, os receptores opióides kappa induzem analgesia sem causar os efeitos colaterais caracteristicos dos receptores μ, como prisão de ventre, prurido, depressão respiratória, dependência fisica e/ou adição. Porém, os receptores kappa mantêm alguns efeitos mediados centralmente, como sedação e disforia, mas não dependência fisica (Vanvoigtlander et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 224: 7-12, 1983; Wood, P.L. e Iyengar, S. Em:

The opiate receptors. Pasternak, G.W. ed. Humana Press, Clifton, N.I., 1988). Estes receptores são responsáveis pelo balanço na ingestão de água, de comida, motilidade intestinal, controlo de temperatura e várias funções endócrinas (Leander, J. Pharmacol. Exp. Ther., 227: 35-41, 1983; Leander et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 234, 463- 469, 1985; Morley et al., Peptides 4, 797-800, 1983;

Manzanares et al., Neuroendocrinology 52, 200-205, 1990;

Iyengar et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 238, 429-436, 1986). A morfina e a codeína, os analgésicos opióides mais utilizados clinicamente, actuam como agonistas de receptores opióides mu. Estes opióides causam efeitos adversos indesejáveis bem conhecidos, como por exemplo, o desenvolvimento de dependência física. Agonistas de receptores kappa ou de receptores delta actuam como 12 ΡΕ1765851 analgésicos por acção em receptores opióides do tipo kappa ou delta, respectivamente. A vantagem destes agonistas relativamente aos agonistas clássicos de receptores mu, por exemplo a morfina, decorre de sua capacidade de causar analgesia sem induzir os efeitos comportamentais secundários indesejáveis descritos para a morfina. Sabe-se que o grau de relação estrutural entre o receptor opióide e o seu ligando é responsável pela selectividade e pela especificidade do receptor. No entanto, vários trabalhos indicam que interacções especificas dos péptidos opióides com vários compartimentos da membrana podem contribuir para a capacidade destes opióides interagirem selectivamente com receptores específicos (Janecka A. et al. Mini Rev Med Chem. 2: 565-572, 2002; Naito A. e Nishimura K. Curr Top Med Chem. 4: 135-145, 2004; Singh VK et al. Neuroimmuno-modulation. 4: 285-297, 1997). Esta invenção refere-se a novos péptidos que não são homólogos das encefalinas, endorfinas ou dinorfinas, ou dos péptidos sintéticos com actividade opióide preferencial em receptores opióides kappa. É conhecido na literatura que a ocorrência de efeitos adversos utilizando opióides para fins terapêuticos diminui com o aumento da especificidade e da selectividade para um tipo ou subtipo de receptores. Aqueles agonistas que têm afinidade para receptores kappa e/ou delta, têm mostrado uma potente actividade analgésica, sem apresentar os efeitos adversos graves, tais como dependência física, depressão da respiração e inibição do movimento da 13 ΡΕ1765851 musculatura lisa, efeitos que são observados para a morfina e derivados agonistas de receptores nu (Nagase, H.; Kawai, K.; Kawamura, K.; Hayakawa, J.; Endoh, T. ; patente US6323212, 2001) . Efeitos adversos tais como a dependência física e a depressão respiratória induzidos pró opióides são associados com a acção destes fármacos no Sistema Nervoso Central. Os opióides convencionais como a morfina, a naloxona, o levorfanol, as encefalinas, as endorfinas e as dinorfinas e análogos são geralmente moléculas hidrofóbicas e portanto, capazes de permear membranas tais como a barreira hemato-encefálica, se acumular facilmente em órgãos e tecidos adiposos. Essa permeabilidade tem sido associada também aos efeitos adversos no Sistema Nervoso Central, como a euforia e adição. Além disso, estes péptidos devem ser administrados em altas doses o que causa reacções tóxicas associadas com a exposição prolongada aos opióides (patente US5602100; Brown, W.L., 1997). Foram encontradas no estado da técnica algumas patentes que sugerem a utilização combinada de vários antagonistas e agonistas, formulados ou não, como agentes antinociceptivos e anti-inflamatórios. Estes estudos sugerem utilização de composições farmacêuticas com acção concomitante em diferentes vias nociceptivas e/ou mecanismos inflamatórios, interferindo na origem de ambos os processos (nociceptivo e inflamatório), por exemplo, em processos cirúrgicos como procedimentos orais e/ou dentais. Estes agentes podem ser: um antagonista de receptor 5HT-2, um antagonista de receptor 5HT-3, um antagonista da histamina, um agonista de serotonina, um inibidor da ciclo-oxigenase, um antagonista 14 ΡΕ1765851 de receptor neurocinina 1, um antagonista de receptor neurocinina 2, um antagonista de purinorreceptores, um antagonista de canal de cálcio, um antagonista de receptor BI de bradicinina, um antagonista de receptor B2 de bradicinina e um agonista do receptor opióide mu. Além disso, é também descrita naquelas patentes a associação de fármacos para o tratamento da destruição de cartilagem (patente US6420432; Demopulos, G., 2002; US2003096807 Al;

Demopulos, G., 2003).

Foram encontrados no estado da técnica muitos trabalhos sobre a farmacologia molecular e a manipulação genética dos péptidos opióides, receptores opióides e agonistas e antagonistas dos receptores opióides. Esses estudos cobrem os efeitos bioquímicos e moleculares dos opióides, a localização neuroquímica dos opióides endo-génicos e seus receptores relacionados com o comportamento. Além disso, foi também investigada a relação destes opióides com a analgesia e a dor, o stress, a tolerância e a dependência, a aprendizagem e a memória, o abuso de álcool e de drogas, a actividade sexual e hormonal, a gravidez e o desenvolvimento endócrino, a actividade cerebral geral e a locomoção, os distúrbios neurológicos, as funções gastrintestinal, renal e hepática e respostas cardiovasculares (Bodnar, R e Hadjimarkou, Peptides, 24, 1241-1302, 2003).

Na patente US5866346 (Yu. L., 1999), Lei Yu descreve o método de utilização das dinorfinas como 15 ΡΕ1765851 ligandos para o receptor X0R1. Assim, compostos que são agonistas preferenciais de receptores opióides kappa, poderiam ser ligandos para os receptores X0R1.

Apesar da utilização de venenos de serpentes e de péptidos que actuam sobre receptores opióides ter sido descrita na literatura, a natureza da substância activa analgésico presente no veneno de serpente de Crotalus durissus terrificus, ou a sua eficácia, quando administrado na forma purificada, incluindo vias orais de administração não foi ainda determinada. Tais dados também não explicaram a eficácia de compostos análogos a tal substância activa, nem sua acção especifica sobre receptores opióides.

Descrição da Invenção:

Esta invenção baseia-se na descoberta e caracterização da substância analgésica activa presente no veneno de Crotalus durissus terrificus. Confirma também o efeito analgésico de tal substância quando administrada na sua forma purificada, incluindo por via de administração oral. Esta invenção também se baseia na evidenciação da eficácia analgésica de compostos análogos à substância activa presente no veneno de Crotalus durissus terrificus, bem como na evidenciação da acção de tais compostos nos receptores opióides. A descrição refere-se a novos compostos análogos à substância analgésica presente no veneno de Crotalus 16 ΡΕ1765851 durissus terrificus, que tem propriedades farmacológicas que mimetizam compostos com a estrutura:

Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys (SEQ ID NO: 1) na qual:

Xaa é sempre piroglutamato, RI = Phe ou Trp ou Tyr ou Leu ou Thr, R2 = Pro ou Arg, R3 = Glx ou Asx ou Gly, R4 = Asn ou Gin ou Leu, R5 = Glx ou Asx, R6 = Glx ou Lys, os seus sais, ou solvatos, excepto quando o composto é um tetradecapéptido em que RI = Phe, R2 = Pro, R3 = Glu, R4 = Asn, R5 = Glu e R6 = Gin, os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular (SEQ ID NO: 2).

Como primeiro aspecto principal independente, esta invenção refere-se a um péptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos:

Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys na qual:

Xaa é piroglutamato, 17 ΡΕ1765851 RI = Phe ou Trp ou Tyr ou Leu ou Thr, R2 = Pro ou Arg, R3 = Glx ou Asx ou Gly, R4 = Asn ou Gin ou Leu, R5 = Glx ou Asx, e R6 = Glx ou Lys,

Em que os resíduos cisteína nas posições 7e e 14 são ligadas por uma ponte dissulfureto intramolecular (SEQ ID NO: 4); um seu sal ou solvato.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a compostos de acordo com a SEQ ID NO: 1, caracterizados pelos resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estarem ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular (SEQ ID NO: 4); em particular compostos análogos ao tetradecapépti-do com a sequência de aminoácidos Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys, em que Xaa é piroglutamato e os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular (SEQ ID NO: 2); como por exemplo tetradecapéptidos que apresentam a sequência de péptidos SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO 4.

De acordo com esta invenção o termo "purificado" corresponde a compostos substancialmente isentos de contaminantes provenientes de componentes celulares, outros constituintes do veneno, do meio de cultura ou outros materiais tais como reagentes utilizados na síntese química 18 ΡΕ1765851 dos "compostos". Preferencialmente, os "compostos purificados" estão numa quantidade superior a 50% da massa seca da mistura; mais preferencialmente, numa quantidade superior a 90% da massa seca da mistura, particularmente superior a 95%.

Num sequndo aspecto principal independente, a presente invenção inclui composições farmacêuticas caracte-rizadas por conter num ou mais veículos ou diluentes farma-ceuticamente aceitáveis e um ou mais compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais ou solvatos, preferencialmente purificados.

Exemplos de composições farmacêuticas incluídas nesta invenção são, por exemplo: soluções, suspensões, pastas, cápsulas de gel, comprimidos, pós, grânulos, liófi-los, sistemas de libertação controlada, micropartículas, micro ou nanoesferas, lipossomas e formulações associadas a revestimentos orgânicos, etc. Possíveis vias de administração para as composições farmacêuticas incluídas na presente invenção são: oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, tópica, pulmonar, intranasal, bucal, rectal, sublingual, intradérmica, intraperitoneal, intratecal, etc., em formas para libertação imediata, retardada, prolongada ou controlada. Exemplos de formas farmacêuticas, veículos, diluentes e vias de administração incluídas na presente invenção estão descritos (sem todavia se limitar), por exemplo, no livro Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, EUA. 19 ΡΕ1765851

Noutro aspecto especifico, quando as composições são liquidas, semi-sólidas, ou em formas secas para reconstituição, estas contêm um diluente à base de água. Noutro aspecto especifico, as composições podem ser para administração oral, apresentando vantagem relativamente a composições injectáveis, relativamente ao conforto do paciente utilizando estas vias de administração e aceitação pelos pacientes.

Como o terceiro aspecto independente principal, esta invenção inclui a utilização de um ou mais compostos que contêm as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, os seus sais ou solvatos, preferencialmente purificados ou puros, na preparação de composições farmacêuticas analgésicas ou úteis no tratamento, diagnóstico ou prevenção de condições moduladas por receptores opióides.

Num aspecto especifico, esta invenção inclui o uso de um ou mais compostos que contêm as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, os seus sais ou solvatos, preferencialmente purificados ou puros, na preparação de composições com propriedades agonistas ou antagonistas, directas ou indirectas, de receptores opióides; especialmente receptores opióides do tipo kappa.

Como outro aspecto especifico, a presente invenção inclui a utilização de um ou mais compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus 20 ΡΕ1765851 sais ou solvatos, preferencialmente purificados ou puros, como substâncias analgésicas, particularmente em composições farmacêuticas para administração oral e/ou compostos com efeitos analgésicos com longa duração, até 5 dias após a administração.

Como outro aspecto especifico, a presente invenção inclui a utilização de um ou mais compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais ou solvatos, preferencialmente purificados ou puros, para a preparação de composições úteis no tratamento, diagnóstico ou prevenção de dor aguda ou crónica, incluindo dores oncológicas, dores neuropáticas como a neuralgia do trigémeo, distrofia simpática, neuralgia pós-herpética, dor do membro fantasma, pós-acidente vascular cerebral, neuro-patia diabética, dores associadas a neoplasias, fibro-mialgia, dor dentária, dismenorreia, cólica renal, menstrual ou biliar, dores articulares, artrites incluindo artrite reumatóide ou artrite degenerativa, hipertensão intra-ocular, dor pós-artroscopia, dor pós-laparoscopia ginecológica, dor produzida por nefrolitotomia percutânea, dor pós-prostatectomia retropúbica radical, dor pós-toracotomia, dor pós-amigdalectomia em pacientes pediátricos, dor pós-histerectomia, dor pós-operação cesariana ou dores de queimaduras, dependência de cocaína ou de opi-óides, proliferação celular, carcinoma pulmonar de células pequenas, depressão e psicose, inflamação, condições associadas devidas ao aumento da angiogénese, feridas, doenças isquémicas coronárias, doença de Parkinson e discinesias, 21 ΡΕ1765851 encefalopatia hepática, doenças cognitivas, doença de Alzheimer, prurido decorrente de colestase hepática ou hiperinsulinemia em mulheres com ovário poliquistico.

Ainda noutro aspecto principal independente, esta descrição inclui métodos de tratamento, diagnóstico e prevenção de condições dolorosas ou condições mediadas por receptores opióides com o uso de um ou mais compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais ou solvatos ou compostos análogos, preferencialmente purificados ou puros.

Como um aspecto específico, a presente descrição inclui métodos para o tratamento, o diagnóstico e a prevenção de condições moduladas por receptores opióides, com a utilização de um ou mais compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, com propriedades agonistas ou antagonistas, directas ou indirectas, sobre receptores opióides; particularmente receptores opióides kappa.

Como outro aspecto específico, a presente descrição inclui métodos para o tratamento, o diagnóstico e a prevenção de condições com dor caracterizados pela utilização de um ou mais compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, por administração oral e/ou em composições farmacêuticas com efeito analgésico duradouro de até 5 dias após a administração. 22 ΡΕ1765851

Como outro aspecto específico, a presente descrição inclui métodos para o tratamento, o diagnóstico e a prevenção, utilizando um ou mais compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, para condições tais como dor aguda ou crónica, incluindo dores oncológicas, dores neuropáticas como neuralgia do trigémeo, distrofia simpática, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, pós-acidente vascular cerebral, neuropatia diabética, dores associadas a neoplasias, fibromialgia, dor dentária, dismenorreia, cólica renal, menstrual ou biliar, dores articulares, artrite incluindo artrite reumatóide ou artrite degenerativa, hipertensão intra-ocular, dor pós-artroscopia, dor pós-laparoscopia ginecológica, dor produzida por nefrolitotomia percutânea, dor pós-prosta-tectomia retropúbica radical, dor pós-toracotomia, dor pós-amigdalectomia em pacientes pediátricos, dor pós-histe-rectomia, dor pós-operação de cesariana ou dor de queimaduras, dependência de cocaína ou de opióides, proliferação celular, carcinoma pulmonar de células pequenas, depressão e psicose, inflamação, condições associadas por aumento de angiogénese, feridas, doenças isquémicas coronárias, doença de Parkinson e discinesias, encefalopatia hepática, doenças cognitivas, doença de Alzheimer, prurido decorrente de colestase hepática ou hiperinsulinemia em mulheres com ovário poliquistico.

Como o quinto aspecto principal independente, a presente invenção inclui processos de produção e purificação de compostos análogos a péptidos contendo as 23 ΡΕ1765851 sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus sais ou solvatos.

Como aspecto especifico a presente invenção compreende processos de produção de compostos contendo a sequência SEQ ID NO 4, e seus sais, contendo uma ponte dissulfureto intramolecular entre os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14, caracterizados por envolver numa etapa de oxidação dos sulfidrilos das posições 7 e 14, com um agente enzimático ou por oxidação com agentes oxidantes (tais como iodo, ar, oxigénio ou ferricianeto de potássio) ou ainda caracterizados por envolver numa etapa de purificação de um composto contendo em sua estrutura a sequência de aminoácidos:

Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys (SEQ ID NO: 5) em que R5 = Glx ou Asx, R6 = Glx ou Lys e em que os resíduos de cisteína estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular.

Noutro aspecto específico esta invenção compreende processos de produção de compostos contendo as sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, seus 24 ΡΕ1765851 sais, ou solvatos, purificados, através da purificação de misturas de compostos de origem sintética, semi-sintética ou biológica; como por exemplo: o veneno em bruto de Crotalus durissus terrificus ou ainda culturas celulares, de microorganismos recombinantes, ou os seus respectivos Usados, utilizando processos de precipitação selectiva e/ou separação por cromatografia.

No caso da precipitação selectiva, o uso de soluções de ácido trifluoroacético em misturas de acetonitrilo e água, especialmente numa concentração de cerca de 0,1% de ácido trif luoroacético em misturas de acetonitrilo e água numa proporção de aproximadamente 1:2 é particularmente útil.

Para a separação por cromatograf ia, o uso de colunas de HPLC com fase reversa e a aplicação de fase móvel com gradiente de concentração, e o uso soluções de ácido trif luoroacético em acetonitrilo e água como fase móvel é particularmente útil.

Exemplos de processos de síntese e purificação de compostos análogos aos péptidos com sequência SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 incluem, por exemplo (sem todavia se limitar), aqueles descritos na publicação "Amino Acid and Peptide Synthesis", 2a Edição, Oxford University Press, Bath, Grã Bretanha; Principies of Biochemistry, 3a Edição, Worth Publishers, EUA. 25 ΡΕ1765851

Como sexto aspecto principal independente, esta presente invenção compreende métodos para a identificação de compostos que mimetizam a actividade analgésica de um péptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 caracterizados por compreenderem as etapas de: a) avaliação da actividade biológica de um péptido que consiste em SEQ ID NO: 1, para determinação da actividade analgésica, b) avaliação da actividade biológica de um composto a ser testado (controlo), para determinar sua actividade analgésica e c) comparar os resultados obtidos para a actividade biológica da SEQ ID NO: 1 com os resultados obtidos do composto a ser testado. ou a) inserir um péptido marcado que consiste em SEQ ID NO: 1, em contacto com uma amostra, b) adicionar um composto de teste à amostra de teste em contacto com um péptido marcado que consiste em SEQ ID NO: 1, e c) avaliar a ligação da sequência de aminoácidos marcada SEQ ID NO: 1, com a amostra em teste. São descritos exemplos de métodos de identificação de compostos que mimetizam a actividade 26 ΡΕ1765851 analgésica de péptidos (sem todavia se limitar), por exemplo, na publicação US5877026 (Lampe R.A., 1999).

Esta invenção é ilustrada de forma complementar pelos seguintes exemplos experimentais, não limitantes: EXEMPLO 1. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DO ENPAK-k A PARTIR DO VENENO DE Crotalus durissus terrificus. 20 mg veneno bruto liofilizado, de serpentes Crotalus durissus terrificus (fornecido pelo Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan) foram diluídos em 1,5 ml de uma solução 1:2 de acetonitrilo/água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA). O sobrenadante foi fraccionado por uma coluna Sep-Pak Ci8 (2 g, 12 cc, Millipore) e eluído em diferentes concentrações de acetonitrilo/água (contendo 0,1% de TFA). Este procedimento foi repetido 60 vezes, e a amostra obtida das fracções de cada concentração de acetonitrilo/água foi liofilizada. A fracção obtida da eluição de 20% de acetonitrilo/água (contendo 0,1% de ácido trifluoroacético - TFA) foi dissolvida em água e submetida a uma coluna de HPLC de fase reversa (Shimadzu Co. Ltd.), usando uma coluna CAPCELL PAK Cie, 6 mm x 150 mm (Shiseido Co. Ltd.) com um gradiente linear de 15% a 35% de acetonitrilo/água (contendo 0,1 % de TFA) , com um caudal de 1 ml/min durante 25 minutos à temperatura ambiente. A fracção obtida no tempo de retenção de 10,7 minutos foi recolhida com monitorização 27 ΡΕ1765851 espectrof otométrica de UV, no comprimento de onda de 215 nm. A fracção obtida foi novamente submetida ao HPLC, utilizando uma coluna CAPCELL PAK Ci8, 6 mm x 150 mm em isocrático de 15% de acetonitrilo/água (contendo 0,1 % de TFA) , com caudal de 1 ml/min à temperatura ambiente, e a fracção obtida no tempo de retenção de 14 minutos foi recolhida com monitorização espectrofotométrica de UV, no comprimento de onda de 215 nm. A fracção resultante demonstrou alto grau de pureza em espectrometria de massa MALDI-TOF usando Ettan MALDI-Tof/Pro (Amersham Bioscien-ces), com pico iónico molecular [(M+H)+, monoisotópico] a m/z 1534, 6. Esta fracção foi liofilizada e denominada de ENPAK-k nesta invenção. EXEMPLO 2. DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE ENPAK-k. A sequência de aminoácidos do péptido resultante foi determinada por espectrometria de massa, uma vez que a sequência não foi obtida por degradação de Edman, devido ao bloqueio do N-terminal.

Inicialmente, a ponte dissulfureto foi reduzida e alquilada. Uma aliquota do ENPAK-k puro resultante foi dissolvida em 10 μΐϋ de água. A esta solução foi adicionado 10 μΐϋ de 5 mM de ditiotreitol em 25 mM de tampão de bicarbonato de amónio, e a solução foi mantida a 60 °C 28 ΡΕ1765851 durante 30 min. Após arrefecer à temperatura ambiente, adicionou-se 10 μ]Ι de uma solução 55 mM de iodoacetamida em 25 mM de tampão de bicarbonato de amónio e depois manteve-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. 0 espectro MALDI-TOF MS deste produto mostrou um pico iónico molecular [(M+H)+, monoisotópico] a m/z 1650,7, demonstrando que existe uma ponte dissulfureto no péptido natural. A sequência do péptido reduzido-alquilado foi analisada por espectrometria de massa ESI tandem usando Q-Tof Ultima™ (Micromass) . O espectro de massa do ião duplamente carregado [(M+2H)2+, monoisotópico] a m/z 825,90 proporcionou séries de iões b e y, gerando uma sequência de 14 resíduos de aminoácidos hipotéticos representada por: pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys/Gln-Gly-Glu-Ser-Lys/Gln-Pro-Cys, considerando os dados obtidos com a espectrometria de massa, em que pGlu representa resíduos piroglutamato, e Lys/Gln implica que é possível tanto Lys ou Gin nesta posição. Os 2 resíduos de Cys estão ligados um ao outro por uma ponte dissulfureto.

Assim, existiriam 4 possíveis sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 que corresponderiam ao ENPAK-k. As seguintes sequências foram obtidas: pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 2) 29 ΡΕ1765851 pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 3) pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 6) pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 7)

Onde os resíduos de cisteína estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular e os aminoácidos são representados pelo código de três letras correspondendo, respectivamente a: pGlu = piroglutamato

Phe = fenilalanina

Ser = serina

Pro = prolina

Glu = ácido glutâmico

Asn = asparagina

Cys = cisteína

Gin = glutamina

Lys = lisina

Gly = glicina

Estas sequências de aminoácidos, quando 30 ΡΕ1765851 comparadas com sequências de proteínas conhecidas, depositadas na base de dados Swiss Prot, mostraram que o péptido SEQ ID NO: 2 tem identidade com a sequência de aminoácidos da porção C-terminal da crotapotina, subunidade ácida, não tóxica da crotoxina do veneno de serpente da espécie Crotalus durissus terrificus (Faure G, Guillaume JL, Camoin L, Saliou B, Bon C. Biochemistry, 1991, 13, 8074-8083); excepto pelo fato dos resíduos de cisteína na porção C-terminal da crotapotina não apresentarem ponte dissulfureto intramolecular como o péptido SEQ ID NO: 2: porção C-terminal da crotapotina, subunidade ácida não tóxica da crotoxina do veneno de serpente da espécie Crotalus durissus terrificus: pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 8) EXEMPLO 3. SÍNTESE DOS PÉPTIDOS SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, COMO EXEMPLO NÃO LIMITANTE.

Os péptidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 foram obtidos através de síntese peptídica manual em fase sólida, através da estratégia Fmoc, utilizando-se como suporte sólido a resina H-

Cys(Trt)-2-ClTrt.

Cada um dos péptidos sintetizados foi então 31 ΡΕ1765851 clivado da resina pela adição de ácido acético/trifluo-roetanol/diclorometano (1:1:8) à temperatura ambiente, durante 1 hora, seguido pela desprotecção através de uma solução de TFA/tioanisol/1,2-etanoditiol (94:5:1), também à temperatura ambiente, durante 2 horas. Após os tratamentos, adicionou-se éter à solução de TFA para precipitar os péptidos. 0 precipitado foi lavado 3 vezes com éter para se obter os não refinados sem SH. A ponte dissulfureto foi formada pelo tratamento com solução de metanol e iodo a 0,1 M à temperatura ambiente, durante 30 minutos, seguido pela adição de uma solução aquosa de ácido ascórbico a 0,1 M. Em seguida, os péptidos não refinados obtidos foram purificados por HLPC de fase reversa utilizando YMC-Pak ODS, 20 x 150 mm (Yamamura Kagaku Co. Ltd.) com gradiente linear de 15% a 35% de acetonitrilo/água contendo 0,1% TFA com caudal de 8 ml/min durante 25 minutos, à temperatura ambiente. A comparação dos péptidos sintéticos resultantes: pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 2) pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 3) 1 Γ pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys (SEQ ID NO: 6) 32 ΡΕ1765851 I---1 pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 7) onde os resíduos de cisteína estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular, com o péptido natural ENPAK-k, em HPLC e espectrometria de massa, demonstrou que o péptido SEQ ID NO: 2 é idêntico ao ENPAK-k natural. De forma complementar, o péptido SEQ ID NO: 2 demonstrou a mesma actividade analgésica que o ENPAK-k natural. 0 péptido SEQ ID NO: 3 também demonstrou actividade analgésica, enquanto que os outros 2 péptidos (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7) se mostraram inactivos em condições semelhantes.

Com base em estudos de modelação molecular das sequências SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, foram provadas outras sequências importantes para a presente invenção:

Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys (SEQ ID NO: 1)

Particularmente I-1

Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys (SEQ ID NO: 4) em que: 33 ΡΕ1765851

Xaa é sempre piroglutamato, RI = Phe ou Trp ou Tyr ou Leu ou Thr, R2 = Pro ou Arg, R3 = Glx ou Asx ou Gly, R4 = Asn ou Gin ou Leu, R5 = Glx ou Asx, R6 = Glx ou Lys.

EXEMPLO 4. IDENTIFICAÇÃO DA FRACÇÃO ANALGÉSICA EM CADA ETAPA DE PURIFICAÇÃO: MODELO DE PRESSÃO DE PATA

Para avaliar a sensibilidade à dor em animais, utilizaram-se Ratos Wistar macho, pesando entre 170-190 g, fornecidos pelo Biotério Central do Instituto Butantan. Os animais foram mantidos no laboratório, com ciclo cla-ro/escuro de 12/12 horas e temperatura controlada a 22±1°C, com acesso à água e ração à saciedade. O protocolo utilizado foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan (CEUAIB) sob o número de protocolo 019/2000.

Para a avaliação da sensibilidade à dor, utilizou-se o teste de pressão da pata de ratos (Analgesy-

Meter Ugo Basile®, Itália), realizado de acordo com o método descrito por Randall & Selitto ( Randall L.O. e Selitto J.J. Arch. Intern. Pharmacodyn. 111: 209-219, 1957) .

Neste teste, uma força em grama (g), de magnitude crescente (16 g/s), é continuamente aplicada sobre o dorso 34 ΡΕ1765851 de uma das patas posteriores do rato e interrompida quando o animal apresenta a reacção de "retirada" da pata. Neste modelo, o limiar de dor é representado como a força (g) necessária para a indução da reacção. Este teste foi aplicado antes do inicio dos tratamentos (medição inicial) e 3 horas após (medição final) a indução da hiperalgesia.

Para indução de hiperalgesia, foi preparada uma solução-mãe de prostaglandina E2 (PGE2) , dissolvendo-se 500 pg de PGE2 em 1 ml de etanol. No momento do uso, esta solução-mãe foi novamente diluída em solução salina estéril. A dose de prostaglandina utilizada foi de 100 ng em 100 μΐ de solução salina, administrada por via i.pl. A hiperalgesia foi avaliada 3 horas após a injecção de PGE2. A cada etapa da purificação, o material obtido no fraccionamento foi diluído num volume de 11 ml de solução salina. Cada animal recebeu 2 ml desta solução, administrada por via oral, imediatamente antes da indução da hiperalgesia. Animais injectados com solução salina, por via oral, foram utilizados como controlos. EXEMPLO 5. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA E DA DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO NATURAL ENPAK-k ISOLADO DO VENENO DE Crotalus durissus terrificus O péptido natural, ENPAK-k, isolado a partir da purificação de 60 mg de veneno bruto, conforme o EXEMPLO 1, foi diluído num volume de 33 ml de solução salina. Cada animal recebeu 2 ml desta solução, administrada por via 35 ΡΕ1765851 oral (p.o.)/ imediatamente antes da indução da hiper-algesia. Animais que receberam solução salina, por via oral, foram utilizados como controlos.

Para a avaliação da sensibilidade à dor foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos. 0 limiar de dor, representado pela força (em gramas) necessária para a retirada da pata, foi determinado antes (tempo 0) e 3, 72 e 120 horas (medições finais) após o tratamento, p.o., com o péptido natural (ENPAK-k) ou solução salina (grupo controlo) . Injectou-se prostaglandina (100 ng/pata), utilizada como agente hiperalgésico, 3 horas antes de cada medição final. Os dados apresentados na Tabela 1 representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo. TABELA 1: EFICÁCIA E DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO NATURAL (ENPAK-k) ISOLADO DO VENENO DE Crotalus durissus terrificus.

Tratamento 0 h MI (g) ± D.M.P. 3 h MF (g) ± D.M.P. 72 h MF (g) ± D.M.P. 120 h MF (g) ± D.M.P. Solução salina 76 ± 1,00 56 ± 1,87* 58 ± 1,22* 57 ± 1,22* Péptido Natural 77 ± 2,00 118 ± 2,56*# 113 ± 2,55*# 112 ± 3,39*# * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina) MI = medição inicial; MF = medição final; g = peso em grama 36 ΡΕ1765851

Este exemplo mostra não só a eficácia, mas também a longa duração do efeito antinociceptivo do péptido natural ENPAK-k isolado do veneno de serpentes Crotalus duris-sus terrificus.

EXEMPLO 6. CURVAS DOSE-RESPOSTA DA ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2 COMO EXEMPLO NÃO LIMITANTE 0 péptido sintético SEQ ID NO: 2, em diferentes doses, foi diluído em solução salina, e administrado por diferentes vias, imediatamente antes da indução da hipe-ralgesia. Animais que receberam solução salina pelas mesmas vias, foram utilizados como controlos.

Para indução de hiperalgesia, administrou-se prostaglandina E2, à dose de 100 ng/pata por via intra-plantar (i.pl.). A hiperalgesia foi avaliada antes (medição inicial - MI) e 3 horas após (medição final - MF) a injecção de PGE2.

Para a avaliação da sensibilidade à dor, foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos. O limiar de dor, representado pela força (em grama) necessária para induzir a retirada da pata, foi determinado antes (medição inicial) e 3 horas após (medição final) a injecção intraplantar de prostaglandina E2 (100 ng/pata). O péptido sintético foi administrado, pelas seguintes vias e nas seguintes doses, imediatamente antes do estímulo hiperal-gésico: 37 ΡΕ1765851 A) Via oral, num volume de 2 ml, nas doses de 0,0016; 0,008; 0,04; 0,2; 1; 5 e 25 μg/kg, imediatamente antes da indução da hiperalgesia (tabela 2). B) Por via intraplantar, num volume de 50 μΐ, nas doses de 0,00000256; 0,0000128; 0,00032 e 0,001 6 μg/pata, imediatamente antes da indução da hiperalgesia (tabela 3). C) Por via intravenosa, num volume de 200 μ]6, nas doses de 0,0000128, 0,000064, 0,00032, 0,0016 e 0,008 pg/kg, imediatamente antes da indução da hiperalgesia (tabela 4). D) Um grupo adicional foi testado, utilizando-se morfina, como controlo positivo. A morfina foi administrada, por via oral, nas doses de 0,004; 0,2; 1 e 5 pg/kg (tabela 5).

Utilizou-se solução salina, administrada pelas respectivas vias, como controlo de todas as experiências.

Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medições iniciais e finais ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais, e foram utilizados para definir a DE50, DEõo e DE90.

Nas tabelas 2, 3, 4 e 5: MI = medição inicial; MF = medição final; g = peso em grama; doses do péptido em pg/kg, quando administrado pelas vias oral e intravenosa, ou em μg/pata, quando administrado pela via intraplantar. 38 ΡΕ1765851

Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo. TABELA 2: CURVA DOSE-RESPOSTA DA ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, ADMINISTRADO POR VIA ORAL, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2.

Tratamento MI (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Solução salina (p.o.) + PGE2 (i.pl.) 77 ± 1,34 56 ± 1,30 * Péptido (0,0016, p.o.) + PGE2 (i.pl.) 78 ± 1,22 64 ± 1,00 * Péptido (0,008, p.o.) + PGE2 (i.pl.) 79 ± 1,22 71 ± 2,39 # Péptido (0,04, p.o.) + PGE2 (i.pl.) 77 ± 1,22 75 ± 1,87 # Péptido (0,2, p.o.) + PGE2 (i.pl.) 77 ± 1,22 84 ± 1,87 # Péptido (1,0, p.o.) + PGE2 (i.pl.) 77 ± 1,22 108 ± 2,00 *# Péptido (5,0, p.o.) + PGE2 (i.pl.) 78 ± 1,22 130 ± 1,58 *# Péptido (25,0, p.o.) + PGE2 (i.pl.) 79 ± 1,22 133 ± 3,39 *# * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina).

Estes resultados mostraram o potente efeito analgésico do péptido sintético SEQ ID NO: 2, administrado por via oral, no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2. Para determinação de 50, 60 e 90% das doses eficazes, os dados foram analisados através da determinação da percentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia), comparando-se as medições finais com as medições iniciais, seguida da determinação da percentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados (péptido) e 39 ΡΕ1765851 controlo (solução salina). Estes dados foram analisados através do programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as doses 50, 60 e 90% das eficazes do péptido, neste exemplo, foram 0,004146; 0,006348 e 0,02106 μς/]<ς, respectivamente. É importante notar que apenas as doses de 0,0016; 0,008; 0,04 e 0,2 foram utilizadas para a determinação das doses eficazes. TABELA 3: CURVA DOSE-RESPOSTA DA ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, ADMINISTRADO POR VIA INTRAPLANTAR, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2 .

Tratamento MT (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Solução salina (i.pl.) + PGE2 (i.pl.) 75 ± 1,83 40 ± 3,10* Péptido (0,00000256, i.pl.) + PGE2 (i.pl.) 72 ± 1,12 57 ± 5,34 * Péptido (0,0000128, i.pl.) + PGE2 (i.pl.) 71 ± 2,39 62 ± 3,22# Péptido (0,00032, i.pl.) + PGE2 (i.pl.) 67 ± 2,35 60 ± 3,25# Péptido (0,0016, i.pl.) + PGE2 (i.pl.) 72 ± 1,84 67 ± 1,12# * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina)

Estes resultados mostram o potente efeito analgésico do péptido sintético SEQ ID NO: 2, administrado por via intraplantar, no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2. Para determinação das doses eficazes a 50, 60 e 90%, os dados foram analisados através da determinação da 40 ΡΕ1765851 percentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia) , comparando-se as medições finais com as medições iniciais, seguida da determinação da percentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados (péptido) e controlo (solução salina). Estes dados foram analisados utilizando o programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as doses eficazes a 50, 60 e 90 % do péptido, neste exemplo, foram 0,000002327; 0,000004904 e 0,0028758 μg/kg, respectivamente.

TABELA 4: CURVA DOSE-RESPOSTA DA ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, ADMINISTRADO POR VIA INTRAVENOSA, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2 .

Tratamento MI (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Solução salina + PGE2 (i.pl.) 72 ± 1,83 44 ± 2,67* Péptido (0,0000128) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) 70 ± 2,05 54 ± 3,04* Péptido (0,000064) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) 68 ± 1,44 54 ± 2,39 Péptido (0,00032) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) 67 ± 2,35 63 ± 5,16# Péptido (0,0016) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) 74 ± 0,92 67 ± 2,35# Péptido (0,008) (i.v.) + PGE2 (i.pl.) 69 ± 2,26 73 ± 4,74# * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina)

Estes resultados mostram o potente efeito analgésico do péptido sintético SEQ ID NO: 2, administrado 41 ΡΕ1765851 por via intravenosa, no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2. Para determinação das doses eficazes a 50, 60 e 90%, os dados foram analisados através da determinação da percentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia), comparando-se as medições finais com as medições iniciais, seguida da determinação da percentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados (péptido) e controlo (solução salina). Estes dados foram analisados utilizando o programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as doses eficazes a 50, 60 e 90 % do péptido, neste exemplo, foram 0,0000458; 0,0002144 e 0, 002701 μg/kg, respectivamente. TABELA 5: CURVA DOSE-RESPOSTA DA ACTIVIDADE ANALGÉSICA DA MORFINA, ADMINISTRADA POR VIA ORAL, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2.

Tratamento MI (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Solução salina (p.o.) + PGE2 (i.pl.) 77 ± 2,55 59 ± 1,87* Morfina (0,004) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) 77 ± 1,22 59 ± 1,87* Morfina (0,2) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) 76 ± 1,87 70 ± 1,58 Morfina (1) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) 78 ± 1,22 85 ± 1,58# Morfina (5) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) 78 ± 1,22 109 ± 1,87*# Morfina (0,008) (p.o.) + PGE2 (i.pl.) 69 ± 2,26 73 ± 4,74# Dose de morfina = μς/kg * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina) 42 ΡΕ1765851

Estes resultados mostram o efeito analgésico da morfina, administrada por via oral, no modelo de hiperal-gesia induzida por PGE2. Para determinação das doses eficazes a 50, 60 e 90%, os dados foram analisados através da determinação da percentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia), comparando-se as medições finais com as medições iniciais, seguida da determinação da percentagem de reversão da hiperalgesia, comparando-se os grupos tratados (péptido) e controlo (solução salina). Estes dados foram analisados utilizando o programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as doses eficazes a 50, 60 e 90 % do péptido, neste exemplo, foram 0,0551516; 0,100504 e 0,326728 μg/kg, respectivamente. EXEMPLO 7. AVALIAÇÃO DA DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2

Demonstrado o efeito antinociceptivo do péptido no modelo de hiperalgesia induzida por prostaglandina E2, foi investigada a duração deste efeito. Para a avaliação da sensibilidade à dor, foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos. O limiar de dor, representado pela força (em grama) necessária para a retirada da pata, foi determinado antes (medição inicial) e 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas após a administração, por via oral, do péptido sintético na dose de 1 μg/kg ou solução salina (controlo). Administrou-se PGE2, na dose de 100 ng/pata, aos diferentes grupos, sempre 3 horas antes da medição final (tabela 6). 43 ΡΕ1765851 TABELA 6: DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NA HIPERALGESIA INDUZIDA POR PGE2.

Tempo após a administração do péptido (horas) 0 24 48 72 96 120 144 Tratamentos MI (g)± D.M.P. MF (g)± D.M.P. MF (g)± D.M.P. MF (g)± D.M.P. MF (g)± D.M.P. MF (g)± D.M.P. MF (g)± D.M.P. Solução salina 78 ± 1,66 58 ± 1, 66* 62 ± 1,66* 58 ± 3,33* 56 ± 1,87* 57 ± 2,55* 57 ± 1,22* Péptido 79 ± 1,00 126 ± 3,32*# 121 ± 1,87*# 111 ± 4,3 *# 117 ± 2,5*# 130 ± 2,24*# 59 ± 2,39* * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina) MI = medição inicial; MF = medição final; g = peso em gramas

Os resultados demonstraram que o efeito antinociceptivo do péptido foi detectado até às 120 horas após uma única administração. EXEMPLO 8. AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PGE2

Para a avaliação da sensibilidade à dor, foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos. O limiar de 44 ΡΕ1765851 dor, representado pela força (em grama) necessária para induzir a retirada da pata, foi determinado antes (medição inicial, MI) e 3 horas após (medição final, MF) a injecção intraplantar de prostaglandina E2 (100 ng/pata). 0 péptido sintético (1 μg/kg) ou solução salina (grupo controlo), foram administrados por via oral, imediatamente antes do estimulo hiperalgésico (PGE2) . ICI174,864 - ICI (10 μρ/pata), um antagonista de receptores opióides delta, nor Binaltrofimina - BNI (50 μg/pata), um antagonista de receptores opióides kappa e CTOP (20 μg/pata), um antagonista de receptores opióides mu foram administrados por via intraplantar (i.pl.) concomitantemente à injecção de PGE2 (tabela 7) . Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo.

Além disso, os antagonistas de receptores kappa e delta foram também testados na antinocicepção induzida pelo péptido, na dose de 5 μg/kg (tabela 8) . Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo. TABELA 7: AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇAO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO (1 μg/kg) NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2

Tratamentos MI (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Solução salina + PGE2 78 ± 1,44 56 ± 1,25 * Péptido + PGE2 77 ± 1,22 111 ± 3,32*# 45 ΡΕ1765851 (continuação)

Tratamentos MT (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Péptido + PGE2 + ICI174,864 78 ± 1,22 114 ± 1,00*# Péptido + PGE2 + nor-Binaltrofimina 77 ± 1,22 56 ± 1,87* Péptido + PGE2 + CTOP 77 ± 1,22 114 ± 1,87*# Solução salina + PGE2 + ICI174,864 75 ± 2,04 57 ± 3,32* Solução salina + PGE2 + nor-Binaltrofimina 72 ± 1,44 56 ± 1,25* Solução salina + PGE2 + CTOP 74 ± 2,39 56 ± 2,39* * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina) MI = medição inicial; MF = medição final; g = peso em gramas

Esses dados indicam que no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2 os receptores opióides do tipo kappa estão envolvidos na actividade antinociceptiva do péptido sintético SEQ ID NO: 2 (1 μς/]<ς) . TABELA 8: AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO (5 μς/]^) NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR PROSTAGLANDINA E2

Tratamentos MI (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Solução salina + PGE2 78 ± 1,44 59 ± 2,39* Péptido + PGE2 77 ± 1,22 147 ± 2,55*# Péptido + PGE2 + nor-BNI 77 ± 1,05 58 ± 2,47* 46 ΡΕ1765851 (continuação)

Tratamentos MI (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Péptido + PGE2 + ICI174,864 77 ± 1,05 145 ± 2,89*# Solução salina + PGE2 + nor-BNI 72 ± 1,44 56 ± 1,25* Solução salina + PGE2 + ICI174,864 75 ± 2,04 57 ± 3,32* * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina) MI = medição inicial; MF = medição final; g = peso em gramas

Estes dados indicam que no modelo de hiperalgesia induzida por PGE2 os receptores opióides do tipo kappa estão envolvidos na actividade antinociceptiva do péptido sintético SEQ ID NO: 2, mesmo quando utilizado em maior dose (5 μg/kg).

EXEMPLO 9. ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR CARRAGENINA COMO EXEMPLO NÃO LIMITANTE 0 efeito antinociceptivo do péptido sintético foi avaliado na hiperalgesia induzida pela carragenina. 0 teste de pressão na pata de ratos foi aplicado antes (medição inicial) e 3 horas após (medição final) da hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina (200 μg/pata). O péptido sintético foi administrado, por via oral (2 mL), na dose de 1 pg/kg, imediatamente antes da indução da 47 ΡΕ1765851 hiperalgesia (tabela 9) . Utilizou-se solução salina, administrada pela mesma via como controlo. Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo.

TABELA 9: EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR CARRAGENINA

Tratamentos MI (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Solução salina + carragenina 77 ± 2,00 57 ± 2,00* Péptido + carragenina 77 ± 2,00 116 ± 1,87*# * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina) MI = medição inicial; MF = medição final; g = peso em gramas

Os dados demonstram que o péptido sintético foi capaz de provocar antinocicepção também no modelo de hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina.

EXEMPLO 10. DETERMINAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPI-ÓIDES NA ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR CARRAGENINA

Tal como determinado no modelo da PGE2, a participação de receptores opióides no efeito antinociceptivo do péptido SEQ ID NO: 2, foi investigada no modelo da hiperalgesia induzida pela carragenina (tabela 10) . Deste modo, os animais foram tratados com CTOP, um antagonista 48 ΡΕ1765851 específico de receptor μ (20 μg/pata) , nor-BNI, um antagonista específico de receptor κ (50 μρ/pata) ou com ICI 174.864, antagonista específico de receptor δ (10 μg/pata), injectados concomitante à carragenina. O péptido foi administrado na dose de 1 μg/kg, por via oral, imediatamente antes da carragenina. Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo.

TABELA 10: AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO (1 μg/kg) NO MODELO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR CARRAGENINA

Tratamentos Ml (g) ± D.M.P. MF (g) ± D.M.P. Solução salina + carragenina 75 ± 2,04 57 ± 2,00* Péptido + carragenina 77 ± 1,22 129 ± 1,87*# Péptido + carragenina + CTOP 76 ± 1,87 126 ± 2,92*# Péptido + carragenina + nor-BNI 78 ± 2,00 56 ± 1,00* Péptido + carragenina + ICI174,864 77 ± 1,22 128 ± 2,00*# Solução salina + carragenina + CTOP 73 ± 1,25 49 ± 1,25* Solução salina + carragenina + nor-BNI 72 ± 1,12 52 ± 2,79* Solução salina + carragenina + ICI174,864 72 ± 1,7 51 ± 2,47* * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina) MI = medição inicial; MF = medição final; g = peso em gramas 49 ΡΕ1765851

Tal como observado no modelo da hiperalgesia induzida por PGE2, apenas o antagonista de receptores opióides kappa foi capaz de reverter totalmente o efeito antinociceptivo do péptido. EXEMPLO 11. ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NA HIPERALGESIA INDUZIDA PELA CONSTRIÇÃO CRÓNICA DO NERVO CIÁTICO, UM MODELO DE DOR PERSISTENTE.

Para a indução de dor neuropática, foi realizada cirurgia no nervo ciático, de acordo com o método descrito por Bennett, G.J e Xie, Y.K. (Pain, 33: 87-107, 1988) . Os animais foram anestesiados com halotano. O nervo ciático foi exposto na região mediana da coxa, afastando-se o músculo biceps femoral. Perto da trifurcação do nervo ciático, a 7 mm de distância da trifurcação, foram realizadas 4 ligações frouxas (categute cromado 4-0) ao seu redor, distantes entre si em aproximadamente 1 mm. As ligações foram realizadas ao longo do nervo, até 4-5 mm do ponto inicial. A incisão foi suturada em camadas, utilizando fio de sutura de seda número 4-0.

EXEMPLO 11 A. AVALIAÇÃO DA HIPERALGESIA

Para avaliação da hiperalgesia, foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos (Analgesy-Meter Ugo Basile®, Itália), realizado de acordo com o método descrito por Randall & Sellito (1957). O teste foi aplicado antes (medição basal-MB) e no 14° dia após a cirurgia, para 50 ΡΕ1765851 caracterizar o aparecimento da dor neuropática. No 14° dia após a cirurgia, o teste foi aplicado antes (medição inicial - MI ) e 1, 3, 24, 48, 72 e 96 horas após a administração do péptido sintético, nas doses de 0,0016; 0,008; 0,04; 0,2; 1 e 5 μg/kg, por via oral, ou solução salina, como controlo (tabela 11).

Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medições basal e inicial ou através da comparação das médias das medições inicial e final ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo. TABELA 11: DURAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 SOBRE A HIPERALGESIA INDUZIDA POR CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO.

Tratamentos MB MI MF MF MF MF MF MF 1 h 3 h 24 h 48 h 72 h 96 h Solução 73 ± 33 ± 30 ± 30 ± 30 ± 34 ± 33 ± 33 ± salina 1,44 1,44* 0,00* O o o X- 0,00* 1,25* 1,44* 1,44* P 0,0016 72 ± 33 ± 32 ± 32 ± 33 ± 30 ± 32 ± 32 ± 1,22 1,22* 1,22* 1,22* 1,22* 0,00* 1,22* 1,22* P 0,008 74 ± 33 ± 34 ± 30 ± 30 ± 33 ± 31 ± 32 ± 1,87 1,22* * O o \—1 1,58* 0,00* 1,22* 1,00* 1,22* P 0,04 71 ± 33 ± 29 ± 30 ± 31 ± 33 ± 33 ± 33 ± 1,00 1,22* * O o \—1 O o o X- 1,00* 1,22* 0,00* 1,22* 51 ΡΕ1765851 (continuação)

Tratamentos MB MI MF 1 h MF 3 h MF 24 h MF 48 h MF 72 h MF 96 h P 0,2 73 ± 31 ± 51 ± 56 ± 52 ± 54 ± 53 ± 33 ± 1,22 1,00* 1,87*§# 1,87*§# 1,22*§# 1,00*§# 1,22*§# 1,22* P 1 72 ± 31 ± 73 ± 73 ± 71 ± 74 ± 71 ± 33 ± 1,22 1,00* 1,22§# 1,22§# 1,00§# 1,00§# 1,00§# 1,22* P 5 72 ± 32 ± 100 ± 98 ± 99 ± 93 ± 86 ± 33 ± 0,79 0.79* 4,42*§# 4,28*§# 3,51*§# 3,00*§# 2,45*§# 1,18* MB = medição basal antes da cirurgia, MI = medição inicial no 14° dia após a cirurgia, antes da administração do péptido; MF = medição final do 140 dia após a cirurgia, em diferentes tempos após a administração do péptido ou da solução salina; g = peso em gramas Doses do péptido em μg/'kg. 0 péptido ou solução salina foram administrados no 14° dia, logo após ε determinação da MI. Os valores da MB, MI e MFs estão representados em grama (g) ± D.M.P. • * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 14° dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina)

Os dados obtidos demonstraram que o péptido foi capaz de provocar efeito anti-hiperalgésico, no modelo de 52 ΡΕ1765851 dor neuropática, que perdurou por até 3 dias após uma única administração.

Os resultados obtidos 1 hora após o tratamento dos animais com o péptido sintético nas doses de 0,0016; 0, 008; 0,04; 0,2 e 1 μς/]<ρ foram usados para a determinação das doses eficazes a 50, 60 e 90%. Os dados foram analisados através da determinação da percentagem de diminuição do limiar de dor (hiperalgesia) , por comparação das medições basal e inicial, seguida da determinação da percentagem de reversão da hiperalgesia, em comparação dos grupos tratados (péptido) e controlo (solução salina). Estes dados foram analisados utilizando o programa CurveExpert 1.3. Os resultados demonstraram que as doses eficazes a 50, 60 e 90 % do péptido, neste exemplo, correspondem a 0, 205517; 0, 283173 e 0, 5747158 μρ/]<:ρ, respectivamente. EXEMPLO 11B. DETERMINAÇÃO DA ALODINIA. A alodinia foi avaliada por ensaio quantitativo, em resposta a estímulo táctil aplicado às patas do rato, segundo método descrito por Chaplan et al. (1994), modificado. Neste teste, os ratos foram colocados, individualmente, em gaiolas plásticas, com fundo de arame, para permitir acesso às patas destes animais. Resumidamente, foi aplicada uma série logarítmica de 10 monofilamentos Semmer-Weinstein calibrados (filamentos de von Frey, Aesthe- 53 ΡΕ1765851 siometer Semmer-Weinstein, Stoelting Co., E.U.A) à pata traseira direita para determinar a rigidez do limite de intensidade do estimulo necessário para provocar uma resposta de retirada da pata. 0 logaritmo da rigidez dos filamentos é definido como log 10 (mg x 10), tendo os seguintes valores (o valor em grama está entre parêntesis): 3, 61 (0,407 g) ; 3, 84 (0, 692 g) ; 4, 08 (1,202 g) ; 4,17 (1,479 g) ; 4,31 (2,041 g) ; 4,56 (3, 630 g) ; 4,74 (5, 495 g) ; 4,93 (8,511 g); 5,07 (11,749 g) e 5,18 (15,136 g). É importante notar que os filamentos com peso superior 15,136g não foram utilizados nos estudos de alodinia.

Os filamentos foram aplicados, um a um, perpendicularmente, sob a área plantar de ambas as patas posteriores e mantidos por um período de 8 segundos. O filamento capaz de provocar a retirada da pata, duas vezes consecutivas, foi considerado como a força em gramas necessária para provocar a resposta (100% de resposta). Na ausência de resposta ao maior estímulo (15,135 g) , este filamento será considerado como valor de corte.

As respostas comportamentais foram usadas para calcular o limiar (limiar absoluta), calculado pela aplicação de uma função psicométrica integral de gaussiana, utilizando um método de ajuste de máxima semelhança. Este método de ajuste permite análises paramétricas.

Os tempos para aplicação do teste e os tratamen- 54 ΡΕ1765851 tos foram os mesmos que os utilizados para determinação da hiperalgesia (tabela 12).

Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medições basal e inicial ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo. TABELA 12: DETERMINAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 SOBRE A ALODINIA INDUZIDA POR CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO.

Trata- MB MI MF MF MF MF MF MF mentos 1 h 3 h 24 h 48 h 72 h 96 h Solução 5, 04± 4,23± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± salina 0,02* 0,01* -X o o o -X O o o -X o o o -X o o o -X O o o O O o X- P 0,0016 5, 02± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 0,03 0,00* -X o o o -X o o o -X o o o -X o o o -X o o o 0,00* P 0,008 4, 99± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 0,02 0,00* 0,00* 0,00* 0,00* -X o o o 0,00* 0,00* P 0,04 4, 97± 4,22± 4,22± 4,22± 4,22± 4,26± 4,22± 4, 22± 0,02 0,00* 0,00* 0,00* 0,00* 0,04* 0,00* 0,00* P 0,2 5, 03± 4,22± 4,41± 4, 41± 4, 41± 4, 41± 4, 41± 4, 22± 0,02 0,00* 0,00*§# 0, 00*§# o,oo*§# 0,00*§# o,oo*§# 0,00* P 1 5, 06± 4, 23± 4, 62± 4, 62± 4, 62± 4, 62± 4, 62± 4, 22± 0,02 0,01* 0,00*§# 0, 00*§# o,oo*§# 0,00*§# o,oo*§# 0,00 ΡΕ1765851 55 (continuação) Trata- MB MI MF MF MF MF MF MF mentos 1 h 3 h 24 h 48 h 72 h 96 h P 5 4,99 ± 4,23± 4, 94± 4, 98± 4, 97± 4, 93± 4, 85± 4,21± 0,03 0,00* 0,05§# 0, 04§# 0,03§# 0,04§# 0, 02§# 0,01§# MB = medição basal antes da cirurgia, MI = medição inicial do 14° dia após a cirurgia, antes da administração do péptido; MF = medição final do 14° dia após a cirurgia, em diferentes tempos após a administração do péptido ou da solução salina; dados expressos como log 10 (mg x 10) ± D.M.P.. Doses do péptido em μg/kg. O péptido ou solução salina foram administrados no 14° dia, logo após a determinação da MI. * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 14° dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina).

Os dados obtidos demonstraram que o péptido foi capaz de provocar efeito anti-alodínico, no modelo de dor neuropática, detectado até 3 dias após administração de uma única dose. 56 ΡΕ1765851 EXEMPLO 11C. DERTEMINAÇÃO DA DOR ESPONTÂNEA.

Para avaliação da dor espontânea, os ratos foram observados no 14° dia após a cirurgia de constrição do nervo ciático, antes e 1, 3, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas após a administração do péptido (5 μg/kg) ou solução salina, por via oral (tabelas 13 e 14) . Para a observação dos sinais que caracterizam a dor espontânea, os animais foram colocados um a um, numa caixa de plástico transparente. Após o período de habituação de 30 minutos, os ratos foram observados durante 10 minutos, determinando-se a duração (em segundos) de lambidela e de levantamento da pata. As actividades de lambidela e levantamento da pata, realizadas como parte do comportamento normal de tratamento dos animais, não foram consideradas.

TABELA 13. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDEO SINTÉTICO CNF021.03 SOBRE A DOR ESPONTÂNEA INDUZIDA POR CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO - DURAÇÃO DO TEMPO (EM S) DE LAMBIDELA DA PATA

Tratamentos MI MF MF MF MF MF MF MF 1 h 3 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h Solução 24 ± 21 ± 20 ± 21 ± 21 ± 22 ± 22 ± 22 ± salina 0,6 0,3 0,8 0,5 0,5 0,6 0, 5 0,6 P 0,0016 22 ± 2 ± 2 ± 2 ± 1,5 ± 1,5 ± 21 ± 21 ± 0,64 0,21*# 0,21*# 0,39*# 0,22*# 0,22*# 0,26 0,38 ΡΕ1765851 57 (continuação) Tratamentos MI MF MF MF MF MF MF MF 1 h 3 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h ΜΙ = medição inicial do 14° dia após a cirurgia, antes da administração do péptido; MF = medição final do 14° dia após a cirurgia, em diferentes tempos após a administração do péptido ou solução salina. Dados expressos como tempo (em segundos) de lambidela da pata. Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo. * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição do grupo controlo (solução salina) ._ TABELA 14. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO CNF021.03 SOBRE A DOR ESPONTÂNEA INDUZIDA POR CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO - DURAÇÃO DO TEMPO (EM S) DE LEVANTAMENTO DA PATA.

Tratamentos MI MF MF MF MF MF MF MF 1 h 3 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h Solução 97 ± 97 ± 96 ± 96 ± 96 ± 95 ± 96 ± 96 ± salina 0,37 0,42 0,58 0,42 0,48 0,47 0,40 0,51 Péptido 97 ± 2 ± 2 ± 2 ± 1,0 ± 2 ± 1,5 ± 95 ± 0,43 0,21*# 0,26*# 0,22*# 0,16*# 0,26*# 0,16*# 0,50 58 ΡΕ1765851 ΜΙ = medição inicial do 14° dia após a cirurgia, antes da administração do péptido; MF =medição final do 14° dia após a cirurgia, em diferentes tempos após a administração do péptido ou solução salina Dados expressos como tempo (em segundos) de levantamento da pata. Os dados representam a média ± D.M.P.. de 5 animais por grupo. * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição inicial # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição do grupo controlo (solução salina)._ (continuação)

Tratamentos MI MF MF MF MF MF MF MF 1 h 3 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h

Os resultados demonstram que o péptido foi capaz de interferir tanto com o tempo de lambidela como de levantamento da pata (tabelas 13 e 14), mostrando o efeito inibitório deste péptido sobre a dor espontânea no modelo de dor neuropática. EXEMPLO 12. PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE CONSTRIÇÃO DO NERVO CIÁTICO.

Após se demonstrar o efeito antinociceptivo do péptido na hiperalgesia e alodinia induzidas por constrição crónica do nervo ciático, foi investigado o envolvimento de 59 ΡΕ1765851 receptores opióides neste efeito. Para tal, os animais foram tratados com CTOP, um antagonista especifico de receptor μ (20 μg/pata), nor-BNI, um antagonista especifico de receptor κ (50 μg/pata) ou com ICI 174,864, um antagonista especifico de receptor δ (10 pg/pata). Os antagonistas foram injectados por via intraplantar. 0 péptido foi administrado na dose de 5 pg/kg, por via oral, imediatamente antes da injecção dos antagonistas opióides.

Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medições basal e inicial, ou das medições inicial e final ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais (tabelas 15 e 16).

TABELA 15. CARACTERIZAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTI-HIPERALGÉSICO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE DOR NEUROPÁTICA

Tratamentos MB MI MF lh MF 3h Solução salina (p.o.) 73±1,66 37±3,33* 35±0* 30±0* Péptido (p.o.) 72±1,44 35±2,04*# 114±6,57*§# 121±5,91*§# Péptido + ICI (i.pl.) 72±1,22 34±1,87*# 35±1,87* 37±2,55* Péptido + nor-BNI (i.pl.) 73±1,22 35±1,58* 69±1,87*§# 75±1,58*§# Péptido + CTOP (i.pl.) 72±1,22 41±1,88* 105±4,18*§# 112±5,83*§# Solução salina + ICI (i.pl.) 71±1,00 31±1,00* 32±1,22* 31±1,00* Solução salina + nor-BNI 12+1,22 32±1,22 * 32±1,22* 31±1,00* (i.pl.) 60 ΡΕ1765851 MB = medição basal antes da cirurgia, MI = medição inicial do 14° dia após a cirurgia, antes da administração do péptido; MF = medição final do 14° dia após a cirurgia, em diferentes tempos após a administração do péptido ou solução salina (controlo), os dados são apresentados como a média de grama (g) ± * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 14° dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina). (continuação)

Tratamentos MB MI MF lh MF 3h Solução salina + CTOP (i.pl.) 7211,22 2811,22 * 3011,58* 3011,58*

Os dados demonstraram que o antagonista do receptor opióide delta bloqueou o efeito anti-hiperalgésico no modelo da constrição crónica do nervo ciático. 0 antagonista do receptor opióide kappa reverteu parcialmente este efeito. O antagonista de receptores mu não alterou o efeito do péptido.

TABELA 16. CARACTERIZAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTI-ALODÍNICO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE DOR NEUROPATICA

Tratamentos MB MI MF lh MF 3h Solução salina (p.o.) 5,0310,03 4,2810,06* 4,2210* 4,2210* Péptido (p.o.) 5,0010,03 4,2710,04* 5,0810,01§# 5,0910§# Péptido + ICI (i.pl.) 4,9610,04 4,2910,04* 4,221 0** 4,2210** ΡΕ1765851 61 (continuação) Tratamentos MB MI MF lh MF 3h Péptido + nor-ΒΝΙ (i.pl.) 5,0310,02 4,2510,03* 4,621 0*§# 4,62+0*§# Péptido + CTOP (i.pl.) 4,9910,02 4,2910,04* 5, 0010,05§# 4,9910,02§# Solução salina + ICI (i.pl.) 5,0810,01 4,2210* 4,221 0* 4,22+0* Solução salina + nor-BNI (i.pl.) 5,0810 4,2210* 4,2210* 4,2210* Solução salina + CTOP (i.pl.) 7211,22 4,2210* 4,2210* 4,2210* MB = medição basal antes da cirurgia, MI = medição inicial do 14° dia após a cirurgia, antes da administração do péptido; MF = medição final do 14° dia após a cirurgia, em diferentes tempos após a administração do péptido ou solução salina (controlo) . 0 péptido ou a solução salina foram administrados no 14° dia imediatamente após a determinação da MI. Os valores das Mis e MFs são representadas como a média de log 10 (mg x 10) D.M.P.. * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 14° dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina).

Os dados demonstraram que o antagonista do receptor opióide delta bloqueou o efeito anti-alodínico do péptido no modelo da constrição crónica do nervo ciático. 0 62 ΡΕ1765851 antagonista do receptor opióide kappa inibiu parcialmente este efeito, enquanto que o antagonista de receptores mu não alterou o efeito do péptido. EXEMPLO 13. ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 EM MODELO DE DOR DE CANCRO, UM MODELO DE DOR PERSISTENTE - ESTUDOS COM O TUMOR DE WALKER 256

As células de tumor de Walker 256 foram cedidas gentilmente pelo Prof. Dr. Rui Curi, do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. 0 animal portador do tumor foi sacrificado e o tecido tumoral foi retirado, colocado em placa de Petri contendo solução salina a 0,9%. De seguida, o tumor foi cortado em partes mais pequenas e transferido para um balão contendo solução salina. O material foi triturado com uma tesoura de corte fino, até se fragmentar totalmente o tumor. Depois, este material foi filtrado em gaze e o líquido recolhido num balão. Todos os procedimentos foram realizados em gelo. 0 material do balão foi transferido para tubos de plástico de 50 mL e centrifugado a 4°C, durante 10 minutos, a 1200 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o preci pitado ressuspendido em solução salina a 0,9%. Para as contagens de células, a suspensão de células foi diluída (1:100) em solução salina. Uma alíquota (200 μΐύ foi retirada e colocada num tubo de ensaio contendo 200 μΐϋ de corante azul de Tripano 1%. O número de células foi determinado num microscópio óptico utilizando câmara de 63 ΡΕ1765851

Neubauer. A viabilidade celular foi determinada considerando viáveis as células refrangentes à luz.

Após se determinar o número de células, injectou-se 1 ml da suspensão, contendo 1 x 107 células, por via intraperitoneal, no flanco direito dos ratos para obtenção de tumor liquido (ascite).

Cinco dias após a injecção, os ratos com ascite foram sacrificados e o liquido ascitico recolhido da cavidade peritoneal e colocado num tubo de ensaio contendo EDTA. 0 liquido foi diluído 100 vezes com tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4. A contagem de células foi feita após diluição com corante azul de Tripano, conforme descrito acima. A contagem de células tumorais foi ajustada a 1 x 106 células em 100 μύ, por diluição com PBS. Este número de células foi determinado em testes preliminares para a indução de dor por cancro em ratos. Neste ajuste do número final de células, foi levado em consideração o volume de antibiótico (Benzetacil®) adicionado à suspensão (150000 unidades de antibiótico/10 ml de suspensão). O antibiótico foi utilizado de modo a evitar a contaminação microbiana. As células foram injectadas por via intraplantar numa das patas posteriores do rato. Os animais de grupo controlo foram injectados com PBS na pata contralateral, na mesmas condições experimentais.

Para avaliação do efeito antinociceptivo do péptido sintético neste modelo, os animais foram tratados com o péptido, na dose de 6 pg/kg, ou solução salina 64 ΡΕ1765851 (controlo), por via oral, 5 dias após a injecção das células do tumor de Walker. Determinaram-se a hiperalgesia, alodinia e dor espontânea antes (medição basal - MB) e 5 dias após a injecção das células tumorais, antes (medição inicial - MI) e 2 horas após (medição final - MF) a administração do péptido.

Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medições basal e inicial, ou das medições inicial e final ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais (tabelas 17, 18, 19). TABELA 17. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO CNF021.03 SOBRE A HIPERALGESIA INDUZIDA PELO TUMOR DE WALKER 256

Tratamentos MB MI MF Solução salina (p.o.) 69 ± 1,42 29 ± 2,97* 29 ± 2,29* Péptido (6 μq/'kq p.o.) 69 ± 1,30 27 ± 1,01* 76 ± 2,29§# MB = medição basal antes da injecção do tumor, MI = medição do 5o dia após a implantação do tumor, antes da administração do péptido, MF = medição do 5o dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do péptido, os dados são apresentados como a média de gramas (g) ± D.M.P. * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 5o dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina). 65 ΡΕ1765851 TABELA 18. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO CNF021.O3 SOBRE A ALODINIA INDUZIDA PELO TUMOR DE WALKER 256. MB = medição basal antes da injecção do tumor, MI = medição do 5o dia após a implantação do tumor, antes da administração do péptido; MF = medição do 5o dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do péptido, os dados são apresentados como a média de log 10 (mg x 10) ± D.M.P.. * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 5o dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina).

Tratamentos MB MI MF Solução salina (p.o.) 5,01 ± 0,04 \—1 ± 0,00 * 4,41 ± 0,00* Péptido (6 μg/kg p.o.) 4,97 ± 0,00 \—1 1+ O o o X- 4,97 ± 0,00§# TABELA 19. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO CNF021.03 SOBRE A DOR ESPONTÂNEA INDUZIDA PELO TUMOR DE WALKER 256

Levantamento Lanbidela Tratamentos MB MI MF MB MI MF Solução salina (p.o.) 0 ± 107 ± 117 ± 0 ± 17 ± 16 ± 0,00 10,52* 15,16* 0,00 4,91* 4,66* 66 ΡΕ1765851 MB = medição basal antes da injecção do tumor, MI = medição do 5o dia após a implantação do tumor, antes da administração do péptido; MF = medição do 5o dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do péptido, os dados são expressos como o valor médio da duração (em segundos) de levantamento ou lambidela da pata ± D.M.P.. * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 5o dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina). (continuação)

Levantamento Lambidela Tratamentos MB MI MF MB MI MF Péptido (6 μg/kg p.o.) 0 ± 204 ± 25 ± 0 ± 15 ± 1, 6 ± 0,00 30,74* 7,72*§# 0,00 1,46* 0,81*§#

Os resultados demonstraram que o péptido bloqueia a hiperalgesia (tabela 17), a alodinia (tabela 18) e a dor espontânea (tabela 19) induzidas pelo tumor de Walker. Estes dados mostraram que o péptido é capaz de inibir a dor provocada pro cancro. EXEMPLO 14. AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE DOR DE CANCRO INDUZIDO PELO TUMOR DE WALKER 256.

Após se demonstrar o efeito antinociceptivo do péptido sobre a hiperalgesia e alodinia induzidas pelo 67 ΡΕ1765851 tumor de Walker 256, foi investigada a participação de receptores opióides neste efeito. Para tal, os animais foram tratados com CTOP, um antagonista especifico do receptor μ (20 μρ/pata) , nor-BNI, um antagonista especifico do receptor κ (50 μρ/pata) ou com ICI 174, 864, antagonista específico do receptor δ (10 pg/pata), por via intraplantar. O péptido foi administrado na dose de 6 pg/kg, por via oral, imediatamente antes da injecção dos antagonistas opióides. Os resultados foram analisados através da comparação das médias das medições basal e inicial, ou das medições inicial e final ou, quando determinado, através da comparação das médias obtidas nos diferentes grupos experimentais (tabela 20). TABELA 20. CARACTERIZAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTI-HIPERALGÉSICO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DE CANCRO INDUZIDO PELO TUMOR DE WALKER 256

Tratamentos MB MI MF Solução salina (p.o.) 68 ± 1,66 40 ± 0,00* 38 ± 1,66* Péptido (p.o.) 71 ± 1,25 36 ± 2,39* 75 ± 2,88*§# Péptido + ICI (i.pl.) 67 ± 1,22 33 ± 3,39* 52 ± 1,22*§# Péptido + nor-BNI (i.pl.) 69 ± 1,53 32 ± 2,14* 32 ± 1,05* Péptido + CTOP (i.pl.) 70 ± 1,29 37 ± 2,81* 72 ± 2,81§# Solução salina + ICI (i.pl.) 68 ± 3,33 30 ± 2,88* 30 ± 2,88* Solução salina + nor-BNI (i.pl.) 70 ± 2,88 33 ± 3,33* 32 ± 1,66* Solução salina + CTOP (i.pl.) 68 ± 1,66 35 ± 2,88* 32 ± 1,66* ΡΕ1765851 68 (continuação)

Tratamentos

MB

MI

MF MB = medição basal antes da injecção do tumor, MI = medição no 5o dia após a implantação do tumor, antes da administração do péptido; MF =medição do 5o dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do péptido; dados como a média de gramas (g) ± D.M.P.. * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 5o dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina). _

Os dados demonstraram que o antagonista do receptor kappa bloqueou o efeito anti-hiperalgésico do péptido. O antagonista do receptor opióide delta inibiu parcialmente este efeito, enquanto o antagonista do receptor mu não alterou o efeito do péptido. TABELA 21. CARACTERIZAÇÃO DA PARTICIPÇÃO DE RECEPTORES OPIÓIDES NO EFEITO ANTI-ALODÍNICO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, NO MODELO DE CANCRO INDUZIDO PELO TUMOR DE WALKER 256

Tratamentos MB MI MF Solução salina (p.o.) 5,01±0,04 4,41±0,00* 4,59 ± 0,18* Péptido (p.o.) 4,97±0,00 4,41±0,00* 4,97±0,00§# Péptido + ICI (i.pl.) 4,99±0,02 4,41±0,00* 4,56±0,03*§# Péptido + nor-BNI (i.pl.) 4,97±0,00 4,41±0,00* 4,41±0,00* 69 ΡΕ1765851 MB = medição basal antes da injecção do tumor, MI = medição do 5o dia após a implantação do tumor, antes da administração do péptido; MF = medição do 5o dia após a implantação do tumor e 2 horas após a administração do péptido; os dados são apresentados como o valor médio de log 10 (mg x 10) ± D.M.P.. * * p<0,05 significativamente diferente dos valores médios da medição basal § p<0,05 significativamente diferente dos valores médios no 5o dia # p<0,05 significativamente diferente dos valores médios do grupo de controlo (solução salina). (continuação)

Tratamentos MB MI MF Péptido + CTOP (i.pl.) 5,03±0,02 4,4110,00* 4,9810,03*# Solução salina + ICI (i.pl.) 4,97+0,00 4,4110,00* 4,41+0,00* Solução salina + nor-BNI (i.pl.) 4,97±0,00 4,4110,00* 4,4110,00* Solução salina + CTOP (i.pl.) 4,97±0,00 4,4110,00* 4,4110,00*

Os dados demonstraram que o antagonista do rece-ptor kappa foi capaz de reverter totalmente o efeito anti-alodínico do péptido. O antagonista do receptor opióide delta inibiu parcialmente este efeito, enquanto o antagonista do receptor mu não alterou o efeito do péptido. EXEMPLO 15. AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2 NO MODELO DA PLACA QUENTE.

Este teste é utilizado para avaliação de fármacos que interferem com a nocicepção no Sistema Nervoso Central, 70 ΡΕ1765851 como por exemplo, morfina e seus produtos derivados, uma vez que o estimulo térmico activa directamente o noci-ceptor, evitando a lesão tecidular e a consequente inflamação. Os dados obtidos neste teste indicam que o efeito antinociceptivo de um composto é principalmente devido a uma resposta integrada supra-espinhal.

Este teste foi realizado de acordo com o método descrito por Jacob, J.J.C. e Ramabadran, K. (Br. J. Pharmacol., 64: 91-8, 1978). Para este teste, os ratinhos foram colocados sobre uma placa de metal mantida a 50°C ± 1. Os resultados são expressos como tempo de latência (em segundos - s) para observar as lambidelas de ambas as patas anteriores (tempo de reacção). Este teste foi realizado antes (medição inicial - MI) e 2 horas após o tratamento dos animais (medição final - MF) com solução salina (controlo) ou com o péptido sintético (1 e 3 μq/kg em 200 μΐ^ , por via oral. Cada animal foi considerado como o seu próprio controlo. Os resultados foram analisados comparando s valores médios de MI e MF ou, quando determinado, através da comparação dos valores médios obtidos nos diferentes grupos experimentais (tabela 22).

TABELA 22. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO PÉPTIDO SINTÉTICO SEQ ID NO: 2, AVALIADO NO MODELO DA PLACA-QUENTE

Tratamento MI (s) ± D.M.P.. MF (s) ± D.M.P.. Solução salina (p.o.) 19 ± 0,54 19 ± 0,45 Péptido 1 μg/kg (p.o.) 18 ± 0,64 25 ± 0,68* 71 ΡΕ1765851 (continuação)

Tratamento MI (s) ± D.M.P.. MF (s) ± D.M.P.. Péptido 3 (jg/kg (p.o.) 22 ± 1,01 27 ± 1,06* MI = medição inicial; MF = medição final; os dados são apresentados como a média de gramas (g) ± D.M.P.. * p<0,05 Significativamente inicial. diferentes dos valores médios da medição

Os resultados demonstram que o péptido sintético induz antinocicepção também através de uma acção no Sistema Nervoso Central. EXEMPLO 16. ACTIVIDADE ANALGÉSICA DO PÉPTIDO SINTÉTICO MODIFICADO SEQ ID NO: 3.

Para indução de hiperalgesia, administrou-se prostaglandina E2, na dose de 100 ng/pata por via intraplantar (i.pl.). A hiperalgesia foi avaliada antes (medição inicial - MI) e 3 horas após (medição final - MF) a injecção de PGE2.

Para a avaliação da sensibilidade à dor, foi utilizado o teste de pressão da pata de ratos. O limiar de dor, representado pela força (em gramas) necessária para a retirada da pata, foi determinado antes (medição inicial) e 3 horas após (medição final) da injecção intraplantar de prostaglandina E2 (100 ng/pata). 72 ΡΕ1765851 0 péptido sintético modificado SEQ ID NO: 3 foi diluído num volume de 11 ml de solução salina. Cada animal recebeu 2 mL desta solução, administrada por via oral (p.o.), imediatamente antes da indução da hiperalgesia. Animais injectados com solução salina, por via oral, foram utilizados como controlo.

Tratamentos MI (s) ± D.M.P. MF (s) ± D.M.P. Solução salina (p.o.) + PEG2 (i.pl.) 76 ± 1,05 59 ± 1,54* Péptido (p.o.) + PEG2 (i.pl.) 76 ± 1,00 110 ± 2,74*# Os dados são apresentados como a média de gramas (g) ± D.M.P.. * p<0,05 Significativamente diferente dos valores médios da medição inicial. # p<0,05 Significativamente diferente dos valores controlo (solução salina). médios do grupo

Os resultados demonstram efeito antinociceptivo do péptido sintético modificado SEQ ID NO: 3, na hiperalgesia induzida por PGE2.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> NOME DO REQUERENTE: Laboratório Biosintética Ltda.; et al <12 0> TITULO DA INVENÇÃO: Compostos análogos a péptidos analgésicos derivados de veneno de serpentes crotalus durissus terrificus, seus usos, composições, métodos de preparação e de purificação <130> REFERÊNCIA DO FICHEIRO: PI0401702-1 <140> PRESENTE PEDIDO DE PATENTE: <141> PRESENTE DATA DE REGISTO: 2005-05-06 <150> PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR: BR PI040702-1 <151> DATA DE REGISTO DE PATENTE ANTERIOR: 2004-05-06 <160> NÚMER ODE SEQ ID NOS: 8 73 ΡΕ1765851 <170> SOFTWARE: Patentln <210> SEQ ID NO: 1 <211> TAMANHO: 14 <212> TIPO: PÉPTIDO <213> ORGANISMO: <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: PÉPTIDO <222> LOCALIZAÇÃO: OPIÓIDES; ou Leu ou = Asn ou <223> OUTRA INFORMAÇÃO: ANALGÉSICO; EFEITO SOBRE RECEPTORES Xaa(l) é sempre piroglutamato; Xaa(2) = Phe ou Trp ou Tyr Thr; Xaa(4) = Pro ou Arg; Xaa(5) = Glx ou Asx ou Gly; Xaa(6) Gin ou Leu; Xaa(10) = Glx ou Asx; Xaa(12) = Glx ou Lys <400> SEQUÊNCIA: 1

Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys 15 10 <210> SEQ ID NO: 2 <211> TAMANHO: 14 <212> TIPO: PÉPTIDO <213> ORGANISMO: <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: PÉPTIDO <222> LOCALIZAÇÃO: CROTALUS Xaa(l) é <223> OUTRA INFORMAÇÃO: ANALGÉSICO; ISOLADO DE VENENO DE DURISSUS TERRIFICUS; EFEITO SOBRE RECEPTORES OPIÓIDES; sempre piroglutamato <400> SEQUÊNCIA: 2

Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gin Gly Glu Ser Gin Pro Cys 15 10 <210> SEQ ID NO: 3 <211> TAMANHO: 14 <212> TIPO: PÉPTIDO <213> ORGANISMO: <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: PÉPTIDO <222> LOCALIZAÇÃO: OPIÓIDES; <223> OUTRA INFORMAÇÃO: ANALGÉSICO; EFEITO SOBRE RECEPTORES Xaa(l) é sempre piroglutamato <400> SEQUÊNCIA: 3

Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gin Gly Glu Ser Lys Pro Cys 15 10 <210> SEQ ID NO: 4 <211> TAMANHO: 14 <212> TIPO: PÉPTIDO <213> ORGANISMO: 74 ΡΕ1765851 <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: PÉPTIDO <222> LOCALIZAÇÃO: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa(l) é sempre piroglutamato; Xaa(2) = Phe ou Trp ou Tyr ou Leu ou Thr; Xaa(4) = Pro ou Arg; Xaa(5) = Glx ou Asx ou Gly; Xaa(6) = Asn ou Gin ou Leu; Xaa(10) = Glx ou Asx; Xaa(12) = Glx ou Lys; <400> SEQUÊNCIA: 4

Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys 15 10 <210> SEQ ID NO: 5 <211> TAMANHO: 8 <212> TIPO: PÉPTIDO <213> ORGANISMO: <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: PÉPTIDO <222> LOCALIZAÇÃO: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: INTERMEDIÁRIO NA PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS ANALGÉSICOS OU QUE ACTUAM EM RECEPTORES OPIÓIDES; Xaa(4) = Glx ou Asx; Xaa (6) = Glx ou Asx <400> SEQUÊNCIA: 5 Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys 1 5 <210> SEQ ID NO: 6 <211> TAMANHO: 14 <212> TIPO: PÉPTIDO <213> ORGANISMO: <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: PÉPTIDO <222> LOCALIZAÇÃO: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa(l) é sempre piroglutamato <400> SEQUÊNCIA: 6

Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Lys Gly Glu Ser Gin Pro Cys 15 10 <210> SEQ ID NO: 7 <211> TAMANHO: 14 <212> TIPO: PÉPTIDO <213> ORGANISMO: <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: PÉPTIDO <222> LOCALIZAÇÃO: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa(l) é sempre piroglutamato <400> SEQUÊNCIA: 7

Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Lys Gly Glu Ser Lys Pro Cys 15 10 75 ΡΕ1765851 <210> SEQ ID NO: 8 <211> TAMANHO: 14 <212> TIPO: PÉPTIDO <213> ORGANISMO: <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: PÉPTIDO <222> LOCALIZAÇÃO: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: PORÇÃO C-TERMINAL DA CROTAPOTINA, UNIDADE ÁCIDA NÃO TÓXICA DA CROTOXINA DO VENEO DE SERPENTE DA ESPÉCIE CORTALUS DURISSUS TERRIFICUS (SWISS PROT/PO8878); Xaa(l) é sempre piroglutamato <400> SEQUÊNCIA: 8

Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gin Gly Glu Ser Gin Pro Cys 15 10

Lisboa, 19 de Dezembro de 2011

Claims (32)

1. ΡΕ1765851 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um péptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos: Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys em que: Xaa é sempre piroglutamato, RI = Phe ou Trp ou Tyr ou Leu ou Thr, R2 = Pro ou Arg, R3 = Glx ou Asx ou Gly, R4 = Asn ou Gin ou Leu, R5 = Glx ou Asx, e R6 = Glx ou Lys, em que os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular (SEQ ID NO: 4); um seu sal ou um seu solvato. 2. 0 péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado consistir na sequência de aminoácido Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys, em que os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular (SEQ ID NO: 2). 3. 0 péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado consistir na sequência de aminoácido Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys, em que os 2 ΡΕ1765851 resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular (SEQ ID NO: 3). 4. 0 péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R2 ser Pro. 5. 0 péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Pro ser hidroxilado. 6. 0 péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R3 ser Glu. 7. 0 péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R5 ser Glu. 8. 0 péptido de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado por Glu ser γ-carboxilado. 9. 0 péptido de acordo com a reivindicação 1 que consiste na sequência de aminoácidos: Xaa-Rl-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys em que: Xaa é sempre piroglutamato, RI = Phe ou Trp ou Tyr ou Leu ou Thr, R2 = Pro ou Arg, R3 = Glx ou Asx ou Gly, R4 = Asn ou Gin ou Leu, R5 = Glx ou Asx, e 3 ΡΕ1765851 R6 = Glx ou Lys, em que os resíduos de cisteína nas posições 7 e 14 estão ligados por uma ponte dissulfureto intramolecular; ou um seu sal ou um seu solvato (SEQ ID NO: 4).
2. 10. O péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R2 ser Pro.
3. 11. O péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Pro ser hidroxilado.
4. 12. O péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R3 ser Glu.
5. 13. O péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R5 ser Glu.
6. 14. O péptido de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado por Glu ser γ-carboxilado.
7. 15. O péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo péptido ser capaz de causar analgesia num indivíduo.
8. 16. Uma composição farmacêutica caracterizada por conter um ou mais veículos ou diluentes farmaceuti-camente aceitáveis e um ou mais péptidos compreendendo a sequência SEQ ID NO: 4. 4 ΡΕ1765851
9. 17. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelos referidos péptidos compreenderem a sequência SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
10. 18. A Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação, caracterizada por estar na forma de uma solução, uma suspensão, uma pasta, uma cápsula, um gel, um comprimido, uma drageia, um pó, um grânulo, um liófilo, um sistema de libertação controlada, um microparticula, uma microesfera, uma nanoesfera, um lipossoma, ou compreender um revestimento orgânico.
11. 19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por compreender um diluente à base de água.
12. 20. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pela composição ser formulada para utilização oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, tópica, pulmonar, intranasal, bucal, rectal, sublingual, intradérmica, intraperitoneal ou intratecal.
13. 21. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ser formulada para uso oral.
14. 22. O péptido compreendendo a sequência SEQ ID NO: 4, para utilização no tratamento, diagnóstico ou prevenção de uma condição modulada por receptores opióides. 5 ΡΕ1765851 23. 0 péptido para utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por compreender a sequência SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
15. 24. O péptido para utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por ser um agonista directo ou indirecto de receptores opióides. 25. 0 péptido para utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por ser um antagonista directos ou indirecto de receptores opióides. 26. 0 péptido para utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela condição ser modulada por receptores opióides do tipo kappa. 27. 0 péptido para utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por ser utilizado na preparação de uma composição farmacêutica analgésica. 28. 0 péptido para utilização de acordo com a reivindicação 27, pela composição ter um efeito analgésico de longa duração. 29. 0 péptido para utilização de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo efeito analgésico durar até 5 dias. 6 ΡΕ1765851
16. 30. O péptido compreendendo a sequência SEQ ID NO: 4 para utilização no tratamento, diagnóstico ou prevenção da dor.
17. 31. O péptido para utilização de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por compreender a sequência SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
18. 32. O péptido para utilização de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela dor ser aguda ou crónica.
19. 33. O péptido para utilização de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela dor ser seleccionada do grupo que consiste em: dor oncológica, dor neuropática, dores associadas a neoplasias, fibromialgia, dor dentária, dismenorreia, cólica renal, menstrual ou biliar, dores articulares, artrite, hipertensão intra-ocular, dor pós-artroscopia, dor pós-laparoscopia ginecológica, dor produzida por nefrolitotomia percutânea, dor pós-prostatectomia retropúbica radical, dor pós-toracotomia, dor pós-amigda-lectomia em pacientes pediátricos, dor pós-histerectomia, dor pós-operação por cesariana, e dor associada a: queimaduras, dependência de cocaína, dependência de opiáceos, proliferação celular, carcinoma pulmonar de células pequenas, depressão, psicose, inflamação, condições associadas com um aumento da angiogénese, feridas, doenças isquémicas coronárias, doença de Parkinson, discinesia, encefalopatia hepática, doença cognitivas, doença de Alzheimer, prurido decorrente de colestase hepática e hiperinsulinemia. 7 ΡΕ1765851 34. 0 péptido para utilização de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pela dor neuropática ser seleccionada do grupo que consiste em neuralgia do trigé-meo, distrofia simpática, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, pós-acidente vascular cerebral e neuro-patia diabética. 35. 0 péptido para utilização de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pela artrite ser artrite reumatóide ou artrite degenerativa.
20. 36. Um processo para a produção do péptido da reivindicação 1, caracterizado por compreender a oxidação de grupos sulfidrilo nos resíduos cisteína nas posições 7 e 14, formando aí uma pontes dissulfureto intramolecular entre os resíduos de cisteína. 37. 0 processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo uso de iodo como agente oxidante. 38. 0 processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por compreender síntese peptídica em fase sólida. 39. 0 processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo referido péptido compreender a sequência SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. 8 ΡΕ1765851
21. 40. O processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por compreender a utilização da resina H-Cys(Trt)-2-ClTrt como suporte sólido.
22. 41. Um processo para a produção de um péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a purificação de uma mistura de compostos de origem sintética ou semi-sintética.
23. 42. Um processo para a produção de um péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a purificação de uma mistura de compostos de origem biológica. 43. 0 processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pela mistura consistir de veneno em bruto da serpente Crotalus durissus terrificus.
24. 44. O processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pela mistura ser obtida a partir de uma cultura celular ou de um microorganismo recombinante.
25. 45. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 ou 44, caracterizado por compreender a precipitação selectiva de péptidos.
26. 46. O processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por compreender a utilização de uma solução de ácido trifluoroacético em acetonitrilo e água como agente para precipitação selectiva. 9 ΡΕ1765851 47. 0 processo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por compreender a aplicação de uma solução de aproximadamente 0,1 % de ácido trifluoroacético numa mistura de cerca de 1 parte de acetonitrilo para 2 partes de água.
27. 48. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado por compreender cromatografia.
28. 49. O processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por compreender a utilização de colunas de HPLC de fase reversa.
29. 50. O processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por compreender a utilização de fase móvel com gradiente de concentração.
30. 51. O processo de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por compreender a utilização de uma solução de ácido trifluoroacético numa mistura de água e acetonitrilo, como fase móvel.
31. 52. Um método para a identificação de compostos que mimetizam a actividade analgésica de um péptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, caracterizado por compreender a) a avaliação da actividade biológica de um péptido que 10 ΡΕ1765851 consiste em SEQ ID NO: 1, para determinação da actividade analgésica do péptido, b) a avaliação da actividade biológica de um composto a ser testado, para determinar a actividade analgésica do composto a ser testado; e, c) comparar os resultados obtidos para a actividade biológica do péptido com os resultados obtidos para a actividade biológica do composto de teste.
32. 53. Um método para a identificação de compostos que mimetizam a actividade analgésica de um péptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, caracterizado por compreender a) colocar um péptido marcado consistindo em SEQ ID NO: 1 em contacto com uma amostra, b) adicionar um composto teste a amostra em contacto com o péptido marcado; e, c) medir a ligação do péptido marcado com a amostra. Lisboa, 19 de Dezembro de 2011