JP2008504234A - 南米ガラガラヘビ（ｃｒｏｔａｌｕｓｄｕｒｉｓｓｕｓｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓｓｎａｋｅｓ）毒液に由来する鎮痛ペプチドの類似化合物、これらの使用、組成物、調製と精製の方法 - Google Patents
南米ガラガラヘビ（ｃｒｏｔａｌｕｓｄｕｒｉｓｓｕｓｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓｓｎａｋｅｓ）毒液に由来する鎮痛ペプチドの類似化合物、これらの使用、組成物、調製と精製の方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、南米ガラガラヘビのような種のヘビから由来する鎮痛ペプチドを含めたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４を有するペプチドの類似化合物、疼痛状態またはオピオイド受容体によって仲介される状態の治療、診断および予防におけるこれらの使用、これらの医薬組成物、および鎮痛化合物の同定における使用を含めたこれらの調製および精製の方法に関する。
Description
本発明は痛覚脱失を誘発するか、または哺乳動物のオピオイド受容体に作用する化合物に関する。より詳細には、本発明は南米ガラガラヘビの毒液に由来する鎮痛効果を有するペプチドの類似化合物、これらの使用、医薬組成物、および調製と精製の方法に関する。
Ｓｏｃｉｅｄａｄｅ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ ｐａｒａ ｏ Ｅｓｔｕｄｏ ｄａ Ｄｏｒ［Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐａｉｎ］（ＳＢＥＤ，２００４ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｒ．ｏｒｇ．ｂｒ／ｄｏｒ＿ｉｍｐａｃｔｏｓ．ａｓｐ）からのデータによると、疼痛は個々人の少なくとも３０％に彼らの人生のいくつかの時期で影響を及ぼしており、これら個々人のうちの１０％から４０％で疼痛は１日以上続く。疼痛は苦痛、就労不能の主な原因であり、深刻な心理社会的および経済的結果を引き起こす。これら個々人のうちの約４０％は多くの就労日を失う。ブラジルの人口における、疼痛状態の影響についての公式の統計は無いが、しかしながらこの発生は昨年大幅に増大した。加えて、世界における慢性疼痛の発生率は人口の７％から４０％で振れている。結果として、慢性疼痛を患うこれら個々人のうちの５０％から６０％が部分的もしくは総合的に、一時的もしくは永続的に活動不能となり、生活の質が大幅におびやかされる。
人間で観察されるヘビ毒液の医療使用は２０世紀初頭に遡り（Ｂｒａｓｉｌ，Ｖ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，１：７〜２１，１９３４、Ｂｒａｚｉｌ、Ｖ．Ａｎ．Ｐａｕｌ．Ｍｅｄ．Ｃｉｒ．，６０：３９８〜４０８，１９５０、Ｋｌｏｂｕｓｉｔｚｋｙ Ｄ．Ａｎａｉｓ ｄｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｐｉｎｈｅｉｒｏｓ，１：３〜２３，１９３８）、文献は医療薬剤としてのこれら毒液の使用の重要な概説を提示している。これらの概説は、例えば癲癇の治療のためのトウブダイヤガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｔｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）の毒液の使用、および止血剤としてのヌママムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）、ラッセルクサリヘビ（Ｖｉｐｅｒａ ｒｕｓｅｌｌｉ）およびタイガースネーク（Ｎｏｔｅｃｈｉｓ ｓｃｔａｔｕｓ）からの毒液の使用（Ｋｌｏｂｕｓｉｔｚｋｙ Ｄ．Ａｎａｉｓ ｄｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｐｉｎｈｅｉｒｏｓ，１：３〜２３，１９３８）を示している。
人間で観察されるヘビ毒液の鎮痛特性についての報告は’３０年代の初頭に遡る（Ｍｏｎａｅｌｅｓｓｅｒ＆Ｔａｇｕｅｔ，１９３３，ａｐｕｄ ｏｎ Ｂｒａｚｉｌ，Ｖ．Ａｎ．Ｐａｕｌ．Ｍｅｄ．Ｃｉｒ．，６０：３９８〜４０８，１９５０）。南米ガラガラヘビ（これ以降は「ＣｄｔＶ」と称される）の毒液の鎮痛効果について、最初の研究はＶｉｔａｌ Ｂｒａｚｉｌ博士によって行われた。これらの研究で、Ｖｉｔａｌ Ｂｒａｚｉｌ博士は極めて希薄なマムシ科の毒液溶液を調製してクロタリド溶質と名付けた。クロタリド溶液はブラジルおよび外国の幾人かの医師に配られ、主に腫瘍性起源の多様な疼痛状態および疾患の治療に使用した。この研究の結果は、ガラガラヘビの毒液が多様な疼痛症候群の治療に極めて効果的であることを実証した（Ｂｒａｓｉｌ，Ｖ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，１：７〜２１，１９３４、Ｂｒａｚｉｌ、Ｖ．Ａｎ．Ｐａｕｌ．Ｍｅｄ．Ｃｉｒ．，６０：３９８〜４０８，１９５０）。
疼痛状態の治療のためのヘビ毒液由来生成物の使用に関連して、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｕｔａｎｔａｎでホルムアルデヒドとこれらの毒液の混合物によって生成されたアナベノムと呼ばれる生成物の開発は強調に値する。これらの生成物は多様な疼痛状態、特に、通常の鎮痛剤が効果を有さないケースの治療に用いられた。この生成物はモルヒネによる治療に置き換わることが可能であり、強力な鎮痛効果を示した。アナベノムはまた、患者が通常では１から３日の投与間間隔でアナベノムによって治療されるという、長時間持続する鎮痛効果を示した。
南米ガラガラヘビ毒液の鎮痛効果を示すＶｉｔａｌ Ｂｒａｚｉｌ博士によって観察された結果にもかかわらず、未精製毒液中に存在する鎮痛効果に関与する活性物質は知られなかった。
疼痛評価の実験モデルを使用したこの毒液の鎮痛作用のメカニズムの研究は１９９０年に始まった。
これらの研究は、マウスに注射したＣｄｔＶがホットプレート試験で評価されたときに長期持続性の鎮痛効果を誘発することを示し、この毒液が中枢神経系への作用を通じて痛覚脱失を生じさせることが可能であることを示唆した（Ｇｉｏｒｇｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ，３１：１２５７〜６５，１９９３、Ｐｉｃｏｌｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ ３６：２２３〜２２７，１９９８）。薬理学的研究は、ホットプレート試験で観察される鎮痛へのκオピオイド受容体の関与を示した（Ｇｉｏｒｇｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ，３１：１２５７〜６５，１９９３、Ｂｒｉｇａｔｔｅ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ ３９：１３９９〜１４１０，２００１）。毒液を使用した長期治療はホットプレート試験で鎮痛効果への耐性を誘発したが、しかし身体依存性を誘発しなかった。耐性は薬物動力学的メカニズムによってもたらされる。モルヒネとの交差耐性は観察されなかった（Ｂｒｉｇａｔｔｅ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ ３９：１３９９〜１４１０，２００１）。他方で、毒液の長期持続性（１回服用量の投与後５日間）の鎮痛効果のせいで、毒液が５日毎に投与されれば治療の開始後最大で６５日まで耐性現象の進展は無い（Ｂｒｉｇａｔｔｅ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ ３９：１３９９〜１４１０，２００１）。
ホットプレート試験で観察される効果に加えて、炎症性疼痛の２つの実験モデルすなわち酢酸によって誘発される腹部捻れのモデル（Ｇｉｏｒｇｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ，３１：１２５７〜６５，１９９３）、およびカラギーナンによって誘発される痛覚過敏症（Ｐｉｃｏｌｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３９１：５５〜６２，２０００）で未精製毒液に関して鎮痛作用が示された。カラギーナンのモデルでは、毒液の鎮痛効果はやはり長期持続性効果であり、毒液の１回服用量の投与後最大で５日まで持続する。この効果は末梢のδオピオイド受容体の関与を含む（Ｐｉｃｏｌｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３９１：５５〜６２，２０００）。
他方で、プロスタグランジンによって誘発される痛覚過敏症のモデルでは、クロタリド毒液の鎮痛作用はκおよびδオピオイド受容体によって仲介される（Ｐｉｃｏｌｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４６９：５７〜６４，２００３）。痛覚過敏症の両方のモデル（カラギーナンおよびプロスタグランジン）で、ＣｄｔＶによって誘発される鎮痛はまた、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼによるＬ−アルギニン／一酸化窒素（ＮＯ）／ｃＧＭＰ経路の刺激およびＡＴＰ感受性カリウムチャンネルの活性化も含む（Ｐｉｃｏｌｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４６９：５７〜６４，２００３、Ｐｉｃｏｌｏ ａｎｄ Ｃｕｒｙ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７５：５５９〜７３，２００４）。
毒液がラットの坐骨神経の慢性の圧迫によって誘発される神経障害性の痛みのモデル（Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｖ．Ｐ．，Ｃｈａｃｕｒ，Ｍ．，Ｓａｍｐａｉｏ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｉｃｏｌｏ，Ｇ．Ｃｕｒｙ，Ｙ． Ｍｅｍｏｒｉａｓ ｄｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｂｕｔａｎｔａｎ ｖｏｌ．６０，ｐ．５０，２００３）、およびラットにおいてＷａｌｋｅｒ２５６癌細胞の足底内注射によって誘発される癌の痛みのモデル（Ｂｒｉｇａｔｔｅ，Ｐ．，Ｓａｍｐａｉｏ，Ｓ．Ｃ．，Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｖ．，Ｃｕｒｉ，Ｒ．，Ｒａｎｇｅｌ−Ｓａｎｔｏｓ，Ａ．Ｃ．，Ｇｕｅｒｒａ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｕｒｙ，Ｙ．，ＸＸＸＶＩ Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｏｌｏｇｉａ ｅ Ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ，Ｐｒｏｇｒａｍａ ｅ Ｒｅｓｕｍｏｓ，ｐ．１９５，２００４）のように持続性の疼痛のモデルで鎮痛を誘発することもやはり可能であることを強調することが大切である。神経障害性の痛みのモデルにおける毒液の効果もやはり、毒液の１回服用量の投与後の最大で３日間であることが検知されたので長期である。カラギーナンまたはプロスタグランジンによって誘発される痛覚過敏症のモデルで観察されるように、κおよびδオピオイド受容体、Ｌ−アルギニン／ＮＯ／ｃＧＭＰ経路、およびＡＴＰ感受性カリウムチャンネルの開放はこのモデルにおける毒液の効果に関与する（Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｖ．Ｐ．，Ｃｈａｃｕｒ，Ｍ．，Ｓａｍｐａｉｏ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｉｃｏｌｏ，Ｇ．Ｃｕｒｙ，Ｙ． Ｍｅｍｏｒｉａｓ ｄｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｂｕｔａｎｔａｎ ｖｏｌ．６０，ｐ．５０，２００３）。
ヘビ毒液はタンパク質および生物学的に活性なペプチドの複雑な混合物によって構成される。異なる治療兆候を有するいくつかの活性物質がこれらの毒液から既に単離された。例として、筆者らは血小板活性化のポリペプチド阻害剤が北米ヌママムシの毒液から単離された米国特許第５，１８２，２６０号（Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ，Ｊ．Ｈ．，１９９３）、またはループス性抗凝固因子たんぱく質が中国マムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ ｓｎａｋｅｓ）の毒液から得られた米国特許第５，７６３，４０３号（Ｌｙａｎ，Ｅ．Ｃ．Ｙ．，１９９８）、または抗血栓酵素がアメリカマムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｕｔｕｓ）の毒液から精製された米国特許第６，４８９，４５１号（Ｌｉ，Ｂ．Ｘ．，２００２）を有する。痛みの治療に使用される生成物に関連して、米国特許第６，５５５，１０９号（Ｓｈｕｌｏｖ，Ａ．，２００３）は慢性の疼痛を含む多様なタイプの痛みを抑制するために使用されるクサリヘビ（Ｖｉｐｅｒａ ｘａｎｔｈｉｎａ ｐａｌｅｓｔｉｎａｅ ｓｎａｋｅｓ）の毒液から単離された非毒性画分、およびこれに由来する生成物を記述している。さらに、米国特許第６，６１３，７４５号（Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｋｏｎｅ，Ｐ．，２００３）はキングコブラ（Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ ｈａｎｎａｈ）の毒液中に存在する鎮痛因子のアミノ酸配列から由来するかまたはこれに基づいたアミノ酸配列を有するペプチドを提示している。
南米ガラガラヘビの毒液中に存在する毒素クロタミンの鎮痛活性もやはり文献中に見出される。精製されたクロタミンがマウスに皮下注射または腹腔内注射で注入されると鎮痛の用量反応関係が存在することを複数の研究が実証した。この鎮痛効果はナロキソンによって阻害され、オピオイド受容体の関与を示唆した（Ｍａｎｃｉｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｎ ３６：１２，１９２７〜１９３７，１９９８）。
アヘンおよびこれに由来する生成物は強力な鎮痛剤であり、他の薬理学的効果もやはり有する。内因性および外因性のオピオイドは中でも最も疼痛抑制、特に慢性または処置困難な痛み（例えば癌の痛み、神経障害性疼痛、および慢性の炎症性疼痛）の抑制に使用される。特定の受容体に作用することによって、これらの薬剤は人間および動物において鎮痛を誘発し、有害な化学的、機械的、または熱的刺激に対する病態生理学的応答を変える（Ｙａｋｓｈ，Ｔ．Ｌ．，Ａｃｔａ Ａｎａｅｓｔｈ．Ｓｃａｎｄ．４１：９４〜１１１，１９９７）。
内因性オピオイドペプチドの少なくとも３つの異なる族、すなわちエンケファリン、エンドルフィンおよびダイノルフィンが同定された。各々の族は異なるポリペプチド前駆体から由来し、特徴的な解剖学的分布を有する。プロエンケファリン、プロオピオメラノコルチンおよびプロダイノルフィンと命名されたこれらの前駆体はオピオイドペプチドのＮ末端部分に位置するＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ／Ｌｅｕ（ここでＴｙｒ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、およびＬｅｕはそれぞれチロシン、グリシン、フェニルアラニン、メチオニン、およびロイシンのアミノ酸に相当する）のアミノ酸配列を有する（Ｐｒｚｅｗｌｏｃｋｉ Ｒ．ａｎｄ Ｐｒｚｅｗｌｏｃｋａ Ｂ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２９：７９〜９１，２００１、Ｒｅｉｓｉｎｅ Ｔ．ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｇ．Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎ Ｊ．Ｇ．ｅ Ｌｉｍｂｉｒｄ Ｌ．Ｅ．ｅｄｓ，９ｔｈ ｅｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ｐｐ．５２１〜５５５，１９９６）。
求心性神経末端に作用することによってオピオイド類はアデニリルシクラーゼを阻害し、ｃＡＭＰの産生を減少させ（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｅ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８９：１２３〜１３７，２００１）、カルシウムチャンネルの開放を阻害して結果として神経伝達物質の放出を阻止する（Ｊｕｎｉｅｎ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１：２００９〜１８，１９９２、Ｚａｋｉ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３６：３７９〜４０１，１９９６、Ｙａｋｓｈ，Ｔ．Ｌ．，Ａｃｔａ Ａｎａｅｓｔｈ．Ｓｃａｎｄ．，４１：９４〜１１１，１９９７）。
加えて、オピオイド類はＬ−アルギニン−一酸化窒素−ＧＭＰｃ経路を活性化してカリウムチャンネルの開放を誘発し、結果として細胞膜の過分極を生じる（Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２１７：２２５〜７，１９９１、Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１４：３０３〜８，１９９５、Ｎｏｚａｋｉ−Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｎ．ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌ．，８７：３８８〜９３，１９９８、Ａｍａｒａｎｔｅ，Ｌ．Ｈ．ａｎｄ Ｄｕａｒｔｅ，Ｉ．Ｄ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５４：１９〜２３，２００２）。Ｋ＋チャンネルに与えるオピオイドアゴニストの鎮痛効果はＡＴＰ感受性および電圧依存性の両方のＫ＋チャンネルを含む（Ｗｅｌｃｈ，Ｓ．ａｎｄ Ｄｕｎｌｏｗ，Ｌ．Ｄ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６７：３９０〜３９９，１９９３、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ａ．Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｄｕａｒｔｅ Ｉ．Ｄ．Ｇ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２９：１１０〜１１４，２０００、Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｅ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８９：１２３〜１３７，２００１）。
加えて、κオピオイドアゴニストを含むオピオイド鎮痛剤がマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）に影響を与えることをいくつかの研究が示した（Ｌｉ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１２０８７〜１２０９４，１９９９、Ｅｉｔａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２３：８３６０〜８３６９，２００３、Ｌｅｓｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１１６：１３９〜１４４，２００３）。
オピオイド活性を呈する多数のペプチドの存在に加えて、多数のオピオイド受容体の存在が薬理学的に特性付けられた。このようにして、オピオイド鎮痛剤は少なくとも３つの主要な種類μ（ミュー）、κ（カッパ）およびδ（デルタ）で構成される特異的な受容体との相互作用によって効果を誘発し（Ｙａｋｓｈ，Ｔ．Ｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．１：２０１〜２４３，１９８４）、区別可能な薬理学的活性、解剖学的分布および機能を備えて中枢神経系および末梢組織に分布する（Ｊｕｎｉｅｎ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１：２００９〜２０１８，１９９２、Ｙａｋｓｈ，Ｔ．Ｌ．，Ａｃｔａ Ａｎａｅｓｔｈ．Ｓｃａｎｄ．４１：９４〜１１１，１９９７）と考えられる。
オピオイド類の中枢および末梢での作用はこれらの医療的使用の重要な構成要素である。μ受容体はオピオイド類の鎮痛効果の大部分、およびこれらの副作用のうちのいくつか（例えば呼吸器系および心臓血管の機能低下、多幸症、依存症、神経内分泌機能の鎮静および変化）に関与する（Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９０：５３９１〜５３９３，１９９３）。
これらの二次的効果は主に、中枢神経系におけるこれらアゴニストの作用の結果として生じる。これが、疼痛の抑制に十分に利用されないオピオイド鎮痛剤の主な理由である。δオピオイド受容体は末梢系でさらに重要であり得るが、しかしこれらは中枢の鎮痛もやはり生じさせる。鎮痛に加えて、これらの受容体は胃腸の運動およびホルモンの機能を変える。他方で、κオピオイド受容体はμ受容体の副作用（例えば便秘、掻痒、呼吸器官機能低下、身体的依存性および／または中毒）を引き起こすことなく鎮静を誘発する。しかしながら、κ受容体は鎮静および不快といったいくつかの中枢介在型の効果を持続させるが身体的依存性が無い（Ｖａｎｖｏｉｇｔｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２２４：７〜１２，１９８３、Ｗｏｏｄ，Ｐ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｉｎ：Ｔｈｅ ｏｐｉｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｇ．Ｗ．ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）。これらの受容体は飲料摂取バランス、食料摂取、腸の運動、体温調整、およびいくつかの内分泌機能に関与する（Ｌｅａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２２７：３５〜４１，１９８３、Ｌｅａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２３４：４６３〜４６９，１９８５、Ｍｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ４，７９７〜８００，１９８３、Ｍａｎｚａｎａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ５２，２００〜２０５，１９９０、Ｉｙｅｎｇａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２３８，４２９〜４３６，１９８６）。
最も臨床的に使用されるオピオイド鎮痛剤であるモルヒネおよびコデインはμオピオイド受容体のアゴニストとして作用する。これらのオピオイドはよく知られている望ましくない副作用、例えば身体的依存性の進行を引き起こす。κまたはδ受容体アゴニストはκおよびδオピオイド受容体にそれぞれ作用することによって鎮痛剤として作用する。これらのアゴニストの、例えばモルヒネといった古典的なμ受容体のアゴニストを上回る利点は、モルヒネについて述べられる望ましくない二次的な行動的影響を誘発することなく鎮痛を生じさせる能力から結果的に得られる。オピオイド受容体とこのリガンドの間の構造的関係が受容体の選択性および特異性に関与することは知られている。それにもかかわらず、いくつかの研究はいくつかの細胞膜区分とオピオイド受容体の特異的相互作用が、特異的受容体と選択的に相互作用するこれらのオピオイドの能力に貢献し得ることを示している（Ｊａｎｅｃｋａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２：５６５〜５７２，２００２、Ｎａｉｔｏ Ａ．ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｋ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．４：１３５〜１４５，２００４、Ｓｉｎｇｈ ＶＫ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．４：２８５〜２９７，１９９７）。本発明はエンケファリン、エンドルフィン、またはダイノルフィンとは同種でない新規のペプチド、およびκオピオイド受容体に優先的な活性を有する合成ペプチドにもやはり関する。
オピオイド特異性および選択性が受容体の特異的タイプもしくはサブタイプに関して増大すると治療目的でオピオイドを使用する副作用の発生が減少することは文献で知られている。κおよび／またはδオピオイド受容体に親和性を有するアゴニストは深刻な副作用（例えば身体的依存性、呼吸器官の機能低下および平滑筋組織の運動の阻害、モルヒネおよびμ受容体のアゴニスト誘導体で観察される効果）を呈することなく強力な鎮痛活性を示した（Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．，Ｋａｗａｉ，Ｋ．，Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｈａｙａｋａｗａ，Ｊ．，Ｅｎｄｏｈ，Ｔ．，米国特許第６，３２３，２１２号、２００１年）。オピオイドによって誘発される副作用（例えば身体的依存性および呼吸器官の機能低下）は中枢神経系へのこれらの薬剤の作用に付随する。モルヒネ、ナロキソン、レボルファノール、エンケファリン、エンドルフィン、およびダイノルフィン、および類似体のような従来式のオピオイドは概して疎水性の分子である。したがって、これらのオピオイドは血液脳関門のような膜を透過することが可能であって脂肪組織および器官に容易に蓄積する。この透過性が中枢神経系における副作用（例えば多幸症）および相加作用もやはり随伴してきた。さらに、これらのペプチドは高い服用量で投与されなければならず、これがオピオイドへの長期曝露に付随する毒性反応を引き起こす（米国特許第５，６０２，１００号、Ｂｒｏｗｎ，Ｗ．Ｌ．，１９９７）。当該技術において、製剤にされるかまたはされていない様々なアンタゴニストおよびアゴニストの、鎮痛剤および抗炎症剤としての組合せの使用を示唆しているいくつかの特許が見出された。これらの研究は、異なる疼痛経路および／または炎症のメカニズムにおける随伴作用を有する医薬組成物の使用を示唆しており、これらは両方の経過（疼痛および炎症）の原点に、例えば口腔および／または歯科処置のような外科的方法に介入する。これらの薬剤は５ＨＴ−２受容体アンタゴニスト、５ＨＴ−３受容体アンタゴニスト、ヒスタミンアンタゴニスト、セロトニンアゴニスト、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ニューロキニン１受容体アンタゴニスト、ニューロキニン２受容体アンタゴニスト、プリン受容体アンタゴニスト、カルシウムチャンネルアンタゴニスト、ブラジキニンＢ１受容体アンタゴニスト、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、およびμオピオイド受容体アゴニストであってもよい。さらに、軟骨組織破壊の治療のための薬剤の関連性もやはりこれらの特許（米国特許第６，４２０，４３２号、Ｄｅｍｏｐｕｌｏｓ，Ｇ．，２００２、米国特許出願２００３０９６８０７Ａ１、Ｄｅｍｏｐｕｌｏｓ，Ｇ．，２００３）に述べられている。
オピオイドペプチド、オピオイド受容体、およびオピオイド受容体のアゴニストとアンタゴニストの分子薬理学および遺伝子操作についての多くの研究が当該技術に見出される。これらの研究はオピオイドの生化学的および分子の効果、内因性オピオイドの神経化学的局在性、およびこれらの作用関連受容体の範囲にわたる。さらに、これらのオピオイドと、鎮痛と疼痛、ストレス、許容と依存、学習と記憶、アルコールと薬物の乱用、性的活性とホルモン活性、妊娠と内分泌の発達、全般的脳活性と移動運動、神経疾患、胃腸、腎臓および肝臓の機能、心臓血管の応答との関係もやはり調べられた（Ｂｏｄｎａｒ，Ｒ．ａｎｄ Ｈａｄｊｉｍａｒｋｏｕ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２４，１２４１〜１３０２，２００３）。
米国特許第５，８６６，３４６号（Ｙｕ，Ｌ．，１９９９）で、Ｌｅｉ ＹｕはＸＯＲ１受容体のためのリガンドとしてのダイノルフィンの使用の方法を記述している。したがって、κオピオイド受容体のアゴニストを優先する化合物はＸＯＲ１受容体のためのリガンドとなり得るであろう。
ヘビ毒液、およびオピオイド受容体に作用するペプチドの使用が文献に述べられてきたが、しかし南米ガラガラヘビ毒液中に存在する活性鎮痛物質の性質、または精製された形で投与（経口投与経路を含む）されたときの有効性は未だ判定されていない。そのようなデータはまた、そのような活性物質に類似した化合物の有効性もオピオイド受容体へのこれらの特異的作用も説明しなかった。
本発明は南米ガラガラヘビの毒液中に存在する活性鎮痛物質の発見および特性分析に基づいている。本発明はまた、精製された形で投与（経口投与経路を含む）されたときのそのような物質の鎮痛効果も確認する。本発明はまた、南米ガラガラヘビ毒液中に存在する活性物質の類似化合物の鎮痛効力の証拠、ならびにオピオイド受容体へのそのような化合物の作用の証拠に基づいている。
第１の主要な独立態様として、本発明は南米ガラガラヘビの毒液中に存在する鎮痛物質に類似した新規の化合物に言及し、これは、構造
Ｘａａ−Ｒ１−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｃｙｓ−Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｒ５−Ｓｅｒ−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１）
（ここで、
Ｘａａは常にピログルタメートであり、
Ｒ１＝ＰｈｅまたはＴｒｐまたはＴｙｒまたはＬｅｕまたはＴｈｒ、
Ｒ２＝ＰｒｏまたはＡｒｇ、
Ｒ３＝ＧｌｘまたはＡｓｘまたはＧｌｙ、
Ｒ４＝ＡｓｎまたはＧｌｎまたはＬｅｕ、
Ｒ５＝ＧｌｘまたはＡｓｘ、
Ｒ６＝ＧｌｘまたはＬｙｓである。）
を有する化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物を模倣する薬理学的特性を有する［ただし、該化合物が、Ｒ１＝Ｐｈｅ、Ｒ２＝Ｐｒｏ、Ｒ３＝Ｇｌｕ、Ｒ４＝Ａｓｎ、Ｒ５＝Ｇｌｕ、およびＲ６＝Ｇｌｎのテトラデカペプチドであり、位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している（配列番号２）場合を除く。］。
Ｘａａ−Ｒ１−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｃｙｓ−Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｒ５−Ｓｅｒ−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１）
（ここで、
Ｘａａは常にピログルタメートであり、
Ｒ１＝ＰｈｅまたはＴｒｐまたはＴｙｒまたはＬｅｕまたはＴｈｒ、
Ｒ２＝ＰｒｏまたはＡｒｇ、
Ｒ３＝ＧｌｘまたはＡｓｘまたはＧｌｙ、
Ｒ４＝ＡｓｎまたはＧｌｎまたはＬｅｕ、
Ｒ５＝ＧｌｘまたはＡｓｘ、
Ｒ６＝ＧｌｘまたはＬｙｓである。）
を有する化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物を模倣する薬理学的特性を有する［ただし、該化合物が、Ｒ１＝Ｐｈｅ、Ｒ２＝Ｐｒｏ、Ｒ３＝Ｇｌｕ、Ｒ４＝Ａｓｎ、Ｒ５＝Ｇｌｕ、およびＲ６＝Ｇｌｎのテトラデカペプチドであり、位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している（配列番号２）場合を除く。］。
より詳細には、この発明は、位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結していることを特徴とする、配列番号１の化合物（配列番号４）、特に、Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓのアミノ酸配列（ここで、Ｘａａはピログルタメートであり、位置７および１４にあるシステイン残基は分子内ジスルフィド架橋によって連結している）（配列番号２）を有するテトラデカペプチドに類似した化合物に言及し、例を挙げると配列番号１または配列番号４のペプチド配列を示すテトラデカペプチドである。
本発明によれば、「類似化合物」という概念は、たとえ部分的であっても鎮痛作用に関連して配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４の配列のペプチドの薬理学的特性、またはオピオイド受容体との直接的もしくは間接的相互作用、アゴニストもしくはアンタゴニストの薬理学的特性を与える部分を有する化学構造を有する化合物に適用される。
相補的な態様として、本発明は、薬物動力学および薬力学的特性の修正（１つ以上のＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸または従来にないアミノ酸の置換、または位置４にプロリン残基を示すこと、または位置５または１０のグルタミン酸残基のγカルボキシル化さえも含む）のためにペプチド擬似特性を追加、削除、または変更することを特徴とする、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４の配列のペプチドの薬理学的特性を模倣する化合物も含み、Ｄ−アミノ酸および従来にないアミノ酸の例は、例えば米国特許第６，６１３，７４５号（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，２００３）の公報または「Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒａｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅの出版物に述べられている（これらに限定しない）。
他の相補的な態様として、本発明は、精製されるかまたは純粋な形であることを特徴とする、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４の配列を示すペプチドに類似した化合物を含む。
本発明によれば、「精製された」という用語は細胞の成分から生じる混入物質、毒液の他の構成要素、培地、または「化合物」の化学合成に使用される試薬のような他の物質を実質的に含まない化合物に相当する。「精製された化合物」は混合物の乾燥質量の５０％を上回る量であることが好ましく、混合物の乾燥質量の９０％を上回る量であることがさらに好ましく、９５％を上回ることが特に好ましい。
第２の主要な独立態様として、本発明は、１つ以上の医薬として許容可能な担体もしくは希釈剤、および選択的に精製された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物を有することを特徴とする医薬組成物を含む。
この発明に含まれる医薬組成物の例は、例えば溶液、懸濁液、ペースト、カプセル、ゲル、錠剤、粉末、顆粒、親液性物質、制御された放出系、微粒子、ミクロもしくはナノスフィア、リポソームと有機コーティングが付随した製剤などを含む。本発明に含まれる医薬組成物に関して考え得る投与経路は、経口、筋肉内、静脈内、皮下、局所、肺、鼻腔内、頬、直腸、舌下、皮内、腹腔内、くも膜下などを含み、即時放出、遅延放出、長時間放出または制御された放出の形である。本発明に含まれる医薬の形状、担体、希釈剤、および投与経路は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡの本に述べられている（限定はしない）。
相補的な態様として、この発明は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を示すペプチドに類似した化合物と組み合わせて１つ以上の活性成分を同じ服用量単位中またはキットの形で含むことを特徴とする医薬組成物も含む。
他の特定の態様として、この組成物が液体、半固体、または再構成のための乾燥形状であるとき、これらは水性の希釈剤を含む。他の特定の態様として、この組成物は経口投与用であることが可能であり、これらの投与経路を使用した患者への快適性と受容性を考慮すると注射可能な組成物を上回る利点を与える。
第３の主要な独立態様として、本発明は選択的に精製されるかまたは純粋である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の、鎮痛医薬組成物の製剤、またはオピオイド受容体によって調節される状態の治療、診断または予防に有用な製剤での使用を含む。
特定の態様として、この発明は、選択的に精製されるかまたは純粋である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の、オピオイド受容体、特にκオピオイド受容体の直接的もしくは間接的アゴニストまたはアンタゴニストの特性を有する組成物の製剤での使用を含む。
他の特定の態様として、この発明は、選択的に精製されるかまたは純粋である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の、特に経口投与用の医薬組成物の鎮痛物質および／または投与後に最長で５日間の長期持続性鎮痛効果を有する化合物としての使用を含む。
他の特定の態様として、この発明は、選択的に精製されるかまたは純粋である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の、急性または慢性の疼痛（癌の痛み、三叉神経痛、片頭痛、交感神経性ジストロフィ、帯状疱疹後神経痛、幻肢痛、脳血管障害後（脳卒中）、糖尿病性神経障害のような神経障害性疼痛、新形成に伴う痛み、線維筋痛、歯痛、月経困難症、腎臓、月経または胆道痛、関節痛、関節リウマチもしくは変形性関節症を含む関節炎、眼内高血圧、関節鏡検査後の痛み、腹腔鏡検査後婦人科の痛み、経皮的腎結石摘出によって生じる痛み、根治的恥骨後前立腺摘出後の痛み、開胸術後の痛み、小児科患者の扁桃摘出後の痛み、子宮切除後の痛み、帝王切開手術後の痛みまたは火傷の痛みを含む）、コカインまたはオピオイド依存症、細胞増殖、小細胞肺癌、鬱病および精神障害、炎症、腫瘍性血管形成に付随する状態、外傷、冠状動脈虚血疾患、パーキンソン病およびジスキネジー、肝性脳症、認知的疾患、アルツハイマー病、多嚢胞性卵巣に伴う婦人の肝性胆汁鬱滞または高インスリン血症に起因する掻痒の治療、診断または予防に有用な組成物の製剤のための使用もやはり含む。
第４の主要な独立態様として、本発明は選択的に精製されるかまたは純粋である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の使用により、疼痛状態またはオピオイド受容体によって仲介される状態を治療、診断または予防するための方法を含む。
特定の態様として、この発明は、選択的に精製されるかまたは純粋であってオピオイド受容体、特にκオピオイド受容体への直接的もしくは間接的アゴニストまたはアンタゴニストの特性を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の使用により、オピオイド受容体によって調節される状態を治療、診断または予防するための方法を含む。
他の特定の態様として、この発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物の使用を特徴とする、経口投与経路および／または投与後に最長５日間までの長期持続性鎮痛効果の医薬組成物によって疼痛状態を治療、診断または予防するための方法を含む。
他の特定の態様として、この発明は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物を使用して急性または慢性の疼痛（癌の痛み、三叉神経痛、片頭痛、交感神経性ジストロフィ、帯状疱疹後神経痛、幻肢痛、脳血管障害（脳卒中）後、糖尿病性神経障害のような神経障害性疼痛、新形成に伴う痛み、線維筋痛、歯痛、月経困難症、腎臓、月経または胆道痛、関節痛、関節リウマチもしくは変形性関節症を含む関節炎、眼内高血圧、関節鏡検査後の痛み、腹腔鏡検査後婦人科の痛み、経皮的腎結石摘出によって生じる痛み、根治的恥骨後前立腺摘出後の痛み、開胸術後の痛み、小児科患者の扁桃摘出後の痛み、子宮切除後の痛み、帝王切開手術後の痛みまたは火傷の痛みを含む）、コカインまたはオピオイド依存症、細胞増殖、小細胞肺癌、鬱病および精神障害、炎症、腫瘍性血管形成に付随する状態、外傷、冠状動脈虚血疾患、パーキンソン病およびジスキネジー、肝性脳症、認知的疾患、アルツハイマー病、多嚢胞性卵巣に伴う婦人の肝性胆汁鬱滞または高インスリン血症に起因する掻痒といった状態を治療、診断または予防するための方法を含む。
第５の主要な独立態様として、本発明は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含むペプチドに類似した化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の生成および精製の方法を含む。
他の特定の態様として、この発明は、酵素薬剤によるか、または酸化剤（例えばヨウ素、空気、酸素またはフェリシアン化カリウム）での酸化を通じた位置７および１４のスルフヒドリルの酸化段階を含むことを特徴とし、または構造の中に以下のアミノ酸配列を含む化合物の精製段階を含むことをさらに特徴とする、位置７と１４のシステイン残基の間に分子内ジスルフィド架橋を有する配列番号４を含む化合物、これらの塩および類似化合物の生成方法を含む。
Ｒ５＝ＧｌｘまたはＡｓｘ、
Ｒ６＝ＧｌｘまたはＬｙｓであり、
システイン残基は分子内ジスルフィド架橋によって連結している。）
他の特定の態様として、この発明は、合成、半合成、または生物学的起源（例えば南米ガラガラヘビの未精製毒液、または遺伝子組換え微生物の細胞培養物、またはこれらそれぞれの溶解物）の化合物の混合物の、選択的沈降および／またはクロマトグラフィ法による選別を使用した精製を通じて精製される、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の生成方法を含む。
選択的沈降のケースでは、アセトニトリルおよび水の混合物中のトリフルオロ酢酸溶液、特に、アセトニトリルおよび水の約１：２の割合の混合物中の約０．１％の濃度のトリフルオロ酢酸溶液が特に有用である。
クロマトグラフィによる分離については、逆相のＨＰＬＣカラムの使用および勾配濃度を伴う移動相の利用、およびアセトニトリルおよび水中のトリフルオロ酢酸溶液の移動相としての使用が特に有用である。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドに類似した化合物の合成および精製の方法の例は、例えば（限定しないが）、「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｔｈ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＵＳＡの本に述べられた方法を含む。
第６の主要な独立態様として、本発明はアミノ酸配列番号２または配列番号３を有するペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物の同定の方法を含む。
第６の特定の態様として、この発明は、以下の段階を含むことを特徴とする、アミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物を同定するための方法を含む。
ａ）鎮痛活性を判定するためにアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドの生物学的活性を評価する段階、
ｂ）鎮痛活性を判定するために試験化合物（対照）の生物学的活性を評価する段階、および
ｃ）アミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列の生物学的活性について得られた結果を試験化合物（対照）で得られた結果と比較する段階。
または
ａ）印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドを試験サンプルと接触させて入れる段階、
ｂ）印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドと接触している試験サンプルに試験化合物を添加する段階、および
ｃ）試験サンプルと印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列のペプチド結合を評価する段階。
ａ）鎮痛活性を判定するためにアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドの生物学的活性を評価する段階、
ｂ）鎮痛活性を判定するために試験化合物（対照）の生物学的活性を評価する段階、および
ｃ）アミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列の生物学的活性について得られた結果を試験化合物（対照）で得られた結果と比較する段階。
または
ａ）印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドを試験サンプルと接触させて入れる段階、
ｂ）印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドと接触している試験サンプルに試験化合物を添加する段階、および
ｃ）試験サンプルと印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列のペプチド結合を評価する段階。
ペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物の同定の方法の例は、（限定されることなく）例えば米国特許第５，８７７，０２６号（Ｌａｍｐｅ，Ｒ．Ａ．，１９９９）の公報に述べられている。
本発明は以下の非限定的な実験例によって補完的に例示される。
（実施例１．南米ガラガラヘビの毒液からのＥＮＰＡＫ−ｋの単離と精製）
南米ガラガラヘビからの凍結乾燥未精製毒液２０ｍｇ（Ｈｅｒｐｅｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｕｔａｎｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供された）を、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む１：２のアセトニトリル／水の溶液１．５ｍｌ中で希釈した。上清液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８（２ｇ、１２ｃｃ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを通して分画し、多様な濃度のアセトニトリル／水（０．１％のＴＦＡを含む）の中で溶出処理した。この手順を６０回繰り返し、各々のアセトニトリル／水濃度の画分から得られたプールを凍結乾燥処理した。
南米ガラガラヘビからの凍結乾燥未精製毒液２０ｍｇ（Ｈｅｒｐｅｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｕｔａｎｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供された）を、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む１：２のアセトニトリル／水の溶液１．５ｍｌ中で希釈した。上清液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８（２ｇ、１２ｃｃ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを通して分画し、多様な濃度のアセトニトリル／水（０．１％のＴＦＡを含む）の中で溶出処理した。この手順を６０回繰り返し、各々のアセトニトリル／水濃度の画分から得られたプールを凍結乾燥処理した。
２０％のアセトニトリル／水（０．１％のトリフルオロ酢酸、ＴＦＡを含む）の溶出物から得られた画分を水に溶かし、１５％から３５％のアセトニトリル／水（０．１％のＴＦＡを含む）の直線的勾配でＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８、６ｍｍ×１５０ｍｍカラム（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して室温にて２５分間、１ｍｌ／ｍｉｎの流量でＨＰＬＣ逆相カラム（Ｓｈｉｍａｚｕ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）にかけた。１０．７分の保持時間から得られた画分を、２１５ｎｍの波長で紫外線分光光度計でモニターしながら集めた。
得られた画分を再び１５％アセトニトリル／水（０．１％のＴＦＡを含む）のアイソクラチックでＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８、６ｍｍ×１５０ｍｍカラムを使用して室温にて２５分間、１ｍｌ／ｍｉｎの流量でＨＰＬＣにかけ、１４分の保持時間から得られた画分を、２１５ｎｍの波長で紫外線分光光度計でモニタしながら集めた。結果として得られた画分はＥｔｔａｎ ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ／Ｐｒｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で、ｍ／ｚ１５３４．６の分子イオンピーク［（Ｍ＋Ｈ）＋、モノアイソトピック］で高い等級の純度を示した。この画分を凍結乾燥処理し、本発明におけるＥＮＰＡＫ−ｋと名付けた。
（実施例２．ＥＮＰＡＫ−ｋのアミノ酸配列の判定）
結果として得られたペプチドのアミノ酸配列を、Ｎ末端のブロッキングのせいで配列がエドマン分解法を通じて得られないので質量分析法によって決定した。
結果として得られたペプチドのアミノ酸配列を、Ｎ末端のブロッキングのせいで配列がエドマン分解法を通じて得られないので質量分析法によって決定した。
最初に、ジスルフィド架橋を還元し、アルキル化した。結果として得られた純粋のＥＮＰＡＫ−ｋのアリコートを１０μｌの水に溶解した。この溶液に、２５ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液中の５ｍＭのジチオトレイトールの１０μｌを添加し、この溶液を６０℃に３０分間維持した。室温で冷却した後、２５ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液中の５５ｍＭのヨードアセトアミド溶液１０μｌを添加し、次いで、室温に３０分間維持した。この生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳはｍ／ｚ１６５０．７で分子イオンピーク［（Ｍ＋Ｈ）＋、モノアイソトピック］を示し、自然のペプチド中にジスルフィド架橋が存在することを実証した。
還元されてアルキル化されたペプチドの配列を、Ｑ−Ｔｏｆ Ｕｌｔｉｍａ（商標）（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を使用したＥＳＩタンデム質量分析法を通じて分析した。ｍ／ｚ８２５．９０で二価に荷電したイオン［（Ｍ＋２Ｈ）２＋、モノアイソトピック］から得たタンデム質量スペクトルは一連のｂおよびｙイオンを供給し、質量分析法で得られたデータを考慮するとｐＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ／Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓで表される１４個の仮定のアミノ酸残基の配列を与えた（ここでｐＧｌｕはピログルタメート残基を示し、Ｌｙｓ／Ｇｌｎはこの位置でそれがＬｙｓまたはＧｌｎであることが可能であることを意味する）。２個のＣｙｓ残基はジスルフィド架橋によって互いに連結する。
したがって、ＥＮＰＡＫ−ｋに相当する４つの考え得る配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号７が存在することになる。以下の配列が得られた。
ｐＧｌｕ＝ピログルタメート
Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｓｅｒ＝セリン
Ｐｒｏ＝プロリン
Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｃｙｓ＝システイン
Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｌｙｓ＝リジン
Ｇｌｙ＝グリシン
によって表される。）
Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔデータベースに預託された知られているタンパク質配列と比較すると、これらのアミノ酸配列は配列番号２のペプチドが南米ガラガラヘビのヘビ毒から由来するクロタポチン（ｃｒｏｔａｐｏｔｉｎ）のＣ末端、クロトキシン（ｃｒｏｔｏｘｉｎ）の非毒性で酸性のサブユニットのアミノ酸配列との同一性を有することを示し（Ｆａｕｒｅ Ｇ．，Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｊ．Ｌ．，Ｃａｍｉｏｎ Ｌ，Ｓａｌｉｏｕ Ｂ．，Ｂｏｎ Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，１３，８０７４〜８０８３）、例外はクロタポチンのＣ末端にあるシステイン残基が配列番号２のペプチドのような分子内ジスルフィド架橋を与えないという事実である。南米ガラガラヘビのヘビ毒から由来するクロタポチンのＣ末端、クロトキシンの非毒性で酸性のサブユニットは以下の通りである。
（実施例３．非限定的例としての配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号７のペプチドの合成）
配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号７のペプチドを、手引書の固相でのペプチド合成を通じて、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−ＣｌＴｒｔ樹脂を固体担体として使用したＦｍｏｃ法を通じて得た。
配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号７のペプチドを、手引書の固相でのペプチド合成を通じて、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−ＣｌＴｒｔ樹脂を固体担体として使用したＦｍｏｃ法を通じて得た。
次いで、合成されたペプチドの各々１つを、室温下、１時間の酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン（１：１：８）の添加、続いてやはり室温下、２時間のＴＦＡ／チオアニソール／１，２−エタンジチオール（９４：５：１）溶液による保護解除を通じて樹脂から切り離した。処理後ＴＦＡ溶液にエーテルを加え、ペプチドを沈降させた。ＳＨの無い未精製ペプチドを得るために沈殿物をエーテルで３回洗浄した。メタノールとヨウ素の０．１Ｍ溶液による室温下、３０分間の処理、続いて０．１Ｍアスコルビン酸水溶液の添加によってジスルフィド架橋を形成した。続いて、得られた未精製のペプチドを、０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリル／水の１５％から３５％の直線的な勾配で室温下、８ｍｌ／ｍｉｎの流量で２５分間、ＹＭＣ−Ｐａｋ ＯＤＳ、２０×１５０ｍｍ（Ｙａｍａｍｕｒａ Ｋａｇａｋｕ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用した逆相ＨＰＬＣによって精製した。結果として得られた合成ペプチド、すなわち
のＨＰＬＣおよび質量分析法での自然のＥＮＰＡＫ−ｋペプチドとの比較は、配列番号２のペプチドが自然のＥＮＰＡＫ−ｋと同一であることを実証した。補足すると、配列番号２のペプチドは自然のＥＮＰＡＫ−ｋと同じ鎮痛活性を示した。配列番号３のペプチドもやはり鎮痛活性を示したが、その一方で他の２つのペプチド（配列番号６と配列番号７）は同じ条件下で不活性を示した。
配列番号２および配列番号３の配列の分子モデルの調査に基づいて、本発明に関して以下の他の重要な配列が証明された。
Ｘａａは常にピログルタメートであり、
Ｒ１＝ＰｈｅまたはＴｒｐまたはＴｙｒまたはＬｅｕまたはＴｈｒ、
Ｒ２＝ＰｒｏまたはＡｒｇ、
Ｒ３＝ＧｌｘまたはＡｓｘまたはＧｌｙ、
Ｒ４＝ＡｓｎまたはＧｌｎまたはＬｅｕ、
Ｒ５＝ＧｌｘまたはＡｓｘ、
Ｒ６＝ＧｌｘまたはＬｙｓである。）
（実施例４．各精製段階における鎮痛画分の同定：ラット足プレッシャー試験）
動物の疼痛感受性を評価するために、Ｂｉｏｔｅｒｉｏ Ｃｅｎｔｒａｌ ｏｆ ｔｈｅＢｕｔａｎｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供された体重１７０〜１９０ｇの雄のＷｉｓｔａｒラットを使用した。これらの動物は、１２／１２時間の明／暗サイクル、２２±１℃に制御された温度、水および食料に自由に接近可能な状態で実験室内に維持した。使用されたプロトコルはプロトコル番号０１９／２０００の下でＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｕｔａｎｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＥＵＡＩＢ）によって承認された。
動物の疼痛感受性を評価するために、Ｂｉｏｔｅｒｉｏ Ｃｅｎｔｒａｌ ｏｆ ｔｈｅＢｕｔａｎｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供された体重１７０〜１９０ｇの雄のＷｉｓｔａｒラットを使用した。これらの動物は、１２／１２時間の明／暗サイクル、２２±１℃に制御された温度、水および食料に自由に接近可能な状態で実験室内に維持した。使用されたプロトコルはプロトコル番号０１９／２０００の下でＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｕｔａｎｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＥＵＡＩＢ）によって承認された。
疼痛感受性の評価のために、ラット足プレッシャー試験を使用し（Ａｎａｌｇｅｓｙ−Ｍｅｔｅｒ Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ（登録商標）、Ｉｔａｌｙ）、ＲａｎｄａｌｌとＳｅｌｉｔｔｏによって記述された方法（Ｒａｎｄａｌｌ Ｌ．Ｏ．ａｎｄ Ｓｅｌｉｔｔｏ Ｊ．Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．１１１：２０９〜２１９，１９５７）に従って実施した。
この試験では、大きさを増大させながら（１６ｇ／ｓ）、力をグラム（ｇ）でラットの１本の後足の背面に連続して加え、動物が足を「引き戻す」反応を示すと中断された。このモデルでは、痛みの閾値を反応の誘発に必要とされる力（ｇ）として表す。この試験は痛覚過敏症の誘発の前（初期測定）および３時間後（最終測定）に適用した。
痛覚過敏症の誘発のために、５００μｇのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を１ｍｌのエタノール中に溶解させてＰＧＥ２のストック溶液を調製した。使用時に、このストック溶液を、滅菌した生理食塩水中に再び希釈した。使用されたプロスタグランジンの服用量は１００μｌ中に１００ｎｇであり、ｉ．ｐｌ．経路によって投与した。痛覚過敏症をＰＧＥ２注射の３時間後に評価した。
精製の各段階で、得られた物質を１１ｍｌの量の生理食塩水中に希釈した。各動物に痛覚過敏症誘発の直前にこの溶液２ｍｌを経口経路で投与した。生理食塩水を投与された動物を対照区として使用した。
（実施例５．南米ガラガラヘビ毒液から単離された自然ペプチドＥＮＰＡＫ−ｋの鎮痛効果の有効性および持続時間の評価）
未精製毒液６０ｍｇの、実施例１による精製によって単離した自然ペプチドＥＮＰＡＫ−ｋを３３ｍｌの量の生理食塩水中に希釈した。各動物は痛覚過敏症誘発の直前にこの溶液２ｍｌを受け、経口（ｐ．ｏ）で投与した。生理食塩水を経口で受けた動物を対照区として使用した。
未精製毒液６０ｍｇの、実施例１による精製によって単離した自然ペプチドＥＮＰＡＫ−ｋを３３ｍｌの量の生理食塩水中に希釈した。各動物は痛覚過敏症誘発の直前にこの溶液２ｍｌを受け、経口（ｐ．ｏ）で投与した。生理食塩水を経口で受けた動物を対照区として使用した。
疼痛感受性の評価のために、ラット足プレッシャー試験を使用した。足を引き戻させるために必要な力（グラム）で表される疼痛の閾値を、自然ペプチド（ＥＮＰＡＫ−ｋ）または生理食塩水（対照群）によるｐ．ｏ処置の前（時間０）および３時間後、７２時間後および１２０時間後（最終測定）に判定した。痛覚過敏症薬剤として使用したプロスタグランジン（１００ｎｇ／足）は毎回の最終測定の３時間前に注射した。表１に与えられたデータは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
この実施例は南米ガラガラヘビ毒液から単離された自然ペプチドＥＮＰＡＫ−ｋの有効性および長期持続性鎮痛効果を示している。
（実施例６．プロスタグランジンＥ２誘発型痛覚過敏症モデルにおける非限定的例としての合成ペプチド配列番号２の鎮痛活性の用量反応曲線）
多様な服用量で合成ペプチド配列番号２を生理食塩水中に希釈し、痛覚過敏症誘発の直前に多様な経路で投与した。同じ経路を通じて生理食塩水を投与した動物を対照区として使用した。
多様な服用量で合成ペプチド配列番号２を生理食塩水中に希釈し、痛覚過敏症誘発の直前に多様な経路で投与した。同じ経路を通じて生理食塩水を投与した動物を対照区として使用した。
痛覚過敏症の誘発のために、１００ｎｇ／足の服用量でプロスタグランジンＥ２を足底経路（ｉ．ｐｌ．）で投与した。痛覚過敏症をＰＧＥ２注射の前（初期測定、ＩＭ）および３時間後（最終測定、ＦＭ）に評価した。
疼痛感受性の評価のために、ラット足プレッシャー試験を使用した。足の引き戻しを誘発するために必要な力（グラム）で表される疼痛の閾値を、プロスタグランジンＥ２（１００ｎｇ／脚）の足底注射の前（初期測定）および３時間後（最終測定）に判定した。合成ペプチドを痛覚過敏刺激の前に以下の経路および服用量で投与した。
Ａ）２ｍｌの量で経口経路、痛覚過敏症誘発直前に服用量０．００１６、０．００８、０．０４、０．２、１、５、および２５μｇ／ｋｇ（表２）。
Ｂ）５０μｌの量で足底経路、痛覚過敏症誘発直前に服用量０．０００００２５６、０．００００１２８、０．０００３２、および０．００１６μｇ／足（表３）。
Ｃ）２００μｌの量で静脈経路、痛覚過敏症誘発直前に服用量０．００００１２８、０．００００６４、０．０００３２、０．００１６、および０．００８μｇ／ｋｇ（表４）。
Ｄ）モルヒネを使用して追加的な群が実薬対照として試験された。モルヒネは０．００４、０．２、１、および５μｇ／ｋｇの服用量で経口投与した（表５）。
Ａ）２ｍｌの量で経口経路、痛覚過敏症誘発直前に服用量０．００１６、０．００８、０．０４、０．２、１、５、および２５μｇ／ｋｇ（表２）。
Ｂ）５０μｌの量で足底経路、痛覚過敏症誘発直前に服用量０．０００００２５６、０．００００１２８、０．０００３２、および０．００１６μｇ／足（表３）。
Ｃ）２００μｌの量で静脈経路、痛覚過敏症誘発直前に服用量０．００００１２８、０．００００６４、０．０００３２、０．００１６、および０．００８μｇ／ｋｇ（表４）。
Ｄ）モルヒネを使用して追加的な群が実薬対照として試験された。モルヒネは０．００４、０．２、１、および５μｇ／ｋｇの服用量で経口投与した（表５）。
それぞれの経路で生理食塩水を投与した実験区すべてを対照区として使用した。
結果は、初期および最終の測定値の平均を比較するか、または判定されたときに異なる実験群で得られた平均を比較して解析した。ＥＤ５０、ＥＤ６０、およびＥＤ９０を判定するためにデータを使用した。
表２、３、４および５で、ＩＭ＝初期測定値、ＦＭ＝最終測定値、ｇ＝グラム重量であり、ペプチド服用量は経口または静脈内投与したときにはμｇ／ｋｇ、足底経路で投与したときにはμｇ／足で表す。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
これらの結果は、ＰＧＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおける経口経路で投与した合成ペプチド配列番号２の強力な鎮痛活性を示した。５０、６０および９０％有効量の判定のためにデータを解析し、最終と初期の測定値の比較による疼痛閾値の低下（痛覚過敏）のパーセンテージの判定、続いて処理した群（ペプチド）と対照の群（生理食塩水）の比較による痛覚過敏の逆戻りのパーセンテージ判定を行った。これらのデータはＣｕｒｖｅＥｘｐｅｒｔ １．３プログラムを使用して解析した。この実施例における結果は、このペプチドの５０、６０および９０％有効量がそれぞれ０．００４１４６、０．００６３４８、および０．０２１０６μｇ／ｋｇであることを示した。有効量の判定のために０．００１６、０．００８、０．０４、および０．２の服用量しか使用しなかったことに留意することが重要である。
これらの結果は、ＰＧＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおける足底経路で投与した合成ペプチド配列番号２の強力な鎮痛活性を示した。５０、６０および９０％有効量の判定のためにデータを解析し、最終と初期の測定値の比較による疼痛閾値の低下（痛覚過敏）のパーセンテージの判定、続いて処理した群（ペプチド）と対照の群（生理食塩水）の比較による痛覚過敏の逆戻りのパーセンテージ判定を行った。これらのデータはＣｕｒｖｅＥｘｐｅｒｔ １．３プログラムを使用して解析した。この実施例においてこのペプチドの５０、６０および９０％有効量がそれぞれ０．０００００２３２７、０．０００００４９０４、および０．００２８７５８μｇ／ｋｇであることが示された。
これらの結果は、ＰＧＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおける静脈内経路で投与した合成ペプチド配列番号２の強力な鎮痛活性を示した。５０、６０および９０％有効量の判定のためにデータを解析し、最終と初期の測定値の比較による疼痛閾値の低下（痛覚過敏）のパーセンテージの判定、続いて処理した群（ペプチド）と対照の群（生理食塩水）の比較による痛覚過敏の逆戻りのパーセンテージ判定を行った。これらのデータはＣｕｒｖｅＥｘｐｅｒｔ １．３プログラムを使用して解析した。この実施例においてこのペプチドの５０、６０および９０％有効量がそれぞれ０．００００４５８、０．０００２１４４、および０．００２７０１μｇ／ｋｇであることが示された。
これらの結果は、ＰＧＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおける経口経路で投与したモルヒネの鎮痛活性を示した。５０、６０および９０％有効量の判定のためにデータを解析し、最終と初期の測定値の比較による疼痛閾値の低下（痛覚過敏）のパーセンテージの判定、続いて処理した群（ペプチド）と対照の群（生理食塩水）の比較による痛覚過敏の逆戻りのパーセンテージ判定を行った。これらのデータはＣｕｒｖｅＥｘｐｅｒｔ １．３プログラムを使用して解析した。この実施例においてこのペプチドの５０、６０および９０％有効量がそれぞれ０．０５５１５１６、０．１００５０４、および０．３２６７２８μｇ／ｋｇであることが示された。
（実施例７．プロスタグランジンＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおける合成ペプチド配列番号２の鎮痛効果の持続時間の評価）
プロスタグランジンＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおいて合成ペプチドの鎮痛効果が明らかになった後、この効果の持続時間を調べた。痛覚感受性の評価のためにラット足プレッシャー試験を使用した。足の引き戻しの反応に必要とされる力（グラム）で表される疼痛閾値を合成ペプチド（１μｇ／ｋｇ）または生理食塩水（対照区）の経口投与の前（初期測定）および２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、および１４４時間後（最終測定）に判定した。各々の最終測定の３時間前に多様な群にＰＧＥ２が１００ｎｇ／足の服用量で投与した（表６）。
プロスタグランジンＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおいて合成ペプチドの鎮痛効果が明らかになった後、この効果の持続時間を調べた。痛覚感受性の評価のためにラット足プレッシャー試験を使用した。足の引き戻しの反応に必要とされる力（グラム）で表される疼痛閾値を合成ペプチド（１μｇ／ｋｇ）または生理食塩水（対照区）の経口投与の前（初期測定）および２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、および１４４時間後（最終測定）に判定した。各々の最終測定の３時間前に多様な群にＰＧＥ２が１００ｎｇ／足の服用量で投与した（表６）。
１回の投与の後に最長で１２０時間までこのペプチドの鎮痛効果が検出されることを結果が示した。
（実施例８．ＰＧＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおける合成ペプチド配列番号２の鎮痛効果へのオピオイド受容体の関与の評価）
痛覚感受性の評価のためにラット足プレッシャー試験を使用した。足の引き戻しを誘発するために必要とされる力（グラム）で表される疼痛閾値をプロスタグランジンＥ２の足底注射（１００ｎｇ／足）の前（初期測定、ＩＭ）および３時間後（最終測定、ＦＭ）に判定した。痛覚過敏刺激（ＰＧＥ２）の直前に合成ペプチド（１μｇ／ｋｇ）または生理食塩水（対照群）を経口投与した。δオピオイド受容体のアンタゴニストであるＩＣＩ１７４，８６４−ＩＣＩ（１０μｇ／足）、κオピオイド受容体のアンタゴニストであるノル−ビナルトルフィミン−ＢＮＩ（５０μｇ／脚）およびμオピオイド受容体のアンタゴニストであるＣＴＯＰ（２０μｇ／脚）をＰＧＥ２注射と同時に足底（ｉ．ｐｌ．）経路で投与した（表７）。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
痛覚感受性の評価のためにラット足プレッシャー試験を使用した。足の引き戻しを誘発するために必要とされる力（グラム）で表される疼痛閾値をプロスタグランジンＥ２の足底注射（１００ｎｇ／足）の前（初期測定、ＩＭ）および３時間後（最終測定、ＦＭ）に判定した。痛覚過敏刺激（ＰＧＥ２）の直前に合成ペプチド（１μｇ／ｋｇ）または生理食塩水（対照群）を経口投与した。δオピオイド受容体のアンタゴニストであるＩＣＩ１７４，８６４−ＩＣＩ（１０μｇ／足）、κオピオイド受容体のアンタゴニストであるノル−ビナルトルフィミン−ＢＮＩ（５０μｇ／脚）およびμオピオイド受容体のアンタゴニストであるＣＴＯＰ（２０μｇ／脚）をＰＧＥ２注射と同時に足底（ｉ．ｐｌ．）経路で投与した（表７）。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
加えて、κおよびδオピオイド受容体のアンタゴニストは５μｇ／ｋｇの服用量のペプチドによって誘発される鎮痛においてもやはり試験した（表８）。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
これらのデータは、ＰＧＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおいてκオピオイド受容体が合成ペプチド配列番号２（１μｇ／ｋｇ）の鎮痛効果に関係していることを示す。
これらのデータは、ＰＧＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおいてκオピオイド受容体が、合成ペプチド配列番号２をさらに高い服用量で使用する（５μｇ／ｋｇ）ときでさえもペプチドの鎮痛活性に関係していることを示す。
（実施例９．非限定的な例として、カラギーナンで誘発される痛覚過敏症モデルにおける合成ペプチド配列番号２の鎮痛効果）
カラギーナンで誘発される炎症性の痛覚過敏症において合成ペプチドの鎮痛効果を評価した。カラギーナンで誘発される炎症性の痛覚過敏症（２００μｇ／足）の前（初期測定）および３時間後（最終測定）にラット足プレッシャー試験を使用した。合成ペプチドを痛覚過敏症誘発の直前に１μｇ／ｋｇの服用量で経口経路（２ｍｌ）で投与した（表９）。同じ経路で投与した生理食塩水を対照として使用した。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
カラギーナンで誘発される炎症性の痛覚過敏症において合成ペプチドの鎮痛効果を評価した。カラギーナンで誘発される炎症性の痛覚過敏症（２００μｇ／足）の前（初期測定）および３時間後（最終測定）にラット足プレッシャー試験を使用した。合成ペプチドを痛覚過敏症誘発の直前に１μｇ／ｋｇの服用量で経口経路（２ｍｌ）で投与した（表９）。同じ経路で投与した生理食塩水を対照として使用した。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
これらの結果は、この合成ペプチドがカラギーナンによって誘発される炎症性の痛覚過敏症モデルにおいてもやはり鎮痛を誘発させることが可能であることを示す。
（実施例１０．カラギーナンで誘発される痛覚過敏症モデルにおける合成ペプチド配列番号２の鎮痛効果へのオピオイド受容体の関与の評価）
ＰＧＥ２モデルで判定されたように、カラギーナンで誘発される痛覚過敏症モデルにおけるペプチド配列番号２の鎮痛効果へのオピオイド受容体の関与を調べた（表１０）。したがって、動物はカラギーナンと同時にｉ．ｐｌ．経路で注射される特異的μ受容体アンタゴニストであるＣＴＯＰ（２０μｇ／足）、特異的κ受容体アンタゴニストであるノルＢＮＩ（５０μｇ／足）、または特異的δ受容体アンタゴニストであるＩＣＩ１７４，８６４（１０μｇ／足）で処理した。ペプチドをカラギーナンの直前に１μｇ／ｋｇの服用量で経口投与した。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
ＰＧＥ２モデルで判定されたように、カラギーナンで誘発される痛覚過敏症モデルにおけるペプチド配列番号２の鎮痛効果へのオピオイド受容体の関与を調べた（表１０）。したがって、動物はカラギーナンと同時にｉ．ｐｌ．経路で注射される特異的μ受容体アンタゴニストであるＣＴＯＰ（２０μｇ／足）、特異的κ受容体アンタゴニストであるノルＢＮＩ（５０μｇ／足）、または特異的δ受容体アンタゴニストであるＩＣＩ１７４，８６４（１０μｇ／足）で処理した。ペプチドをカラギーナンの直前に１μｇ／ｋｇの服用量で経口投与した。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
ＰＧＥ２で誘発される痛覚過敏症モデルにおいて観察されたように、κ受容体アンタゴニストだけがペプチドの鎮痛効果を妨げることが可能であった。
（実施例１１．坐骨神経の慢性的圧迫によって誘発される痛覚過敏症、すなわち持続的疼痛のモデルにおける合成ペプチド配列番号２の鎮痛活性）
神経障害性疼痛の誘発のために、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｇ．Ｊ．とＸｉｅ，Ｙ．Ｋ．（Ｐａｉｎ，３３：８７〜１０７，１９８８）によって述べられた方法に従って坐骨神経に手術を実施した。複数の動物をハロタンで麻酔した。坐骨神経を大腿部の中央領域で露出させ、大腿二頭筋を除去した。坐骨神経の三分枝付近、三分枝から７ｍｍの距離に４箇所の緩い結紮が互いに約１ｍｍの距離で周囲を取り巻いて（クロム処理したカットグート４−０で）実施した。神経に沿って始点から最大４〜５ｍｍまでに束縛を実施した。絹製縫合糸Ｎｏ．４−０を使用して層を作って切開部を縫合した。
神経障害性疼痛の誘発のために、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｇ．Ｊ．とＸｉｅ，Ｙ．Ｋ．（Ｐａｉｎ，３３：８７〜１０７，１９８８）によって述べられた方法に従って坐骨神経に手術を実施した。複数の動物をハロタンで麻酔した。坐骨神経を大腿部の中央領域で露出させ、大腿二頭筋を除去した。坐骨神経の三分枝付近、三分枝から７ｍｍの距離に４箇所の緩い結紮が互いに約１ｍｍの距離で周囲を取り巻いて（クロム処理したカットグート４−０で）実施した。神経に沿って始点から最大４〜５ｍｍまでに束縛を実施した。絹製縫合糸Ｎｏ．４−０を使用して層を作って切開部を縫合した。
（実施例１１Ａ．痛覚過敏症の評価）
痛覚過敏症の評価のために、ラット足プレッシャー試験を使用し（Ａｎａｌｇｅｓｙ−Ｍｅｔｅｒ Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ（登録商標）、Ｉｔａｌｙ）、ＲａｎｄａｌｌとＳｅｌｉｔｔｏ（１９５７）によって記述された方法に従って実施した。神経障害性疼痛の進行を特性分析するために、この試験は手術の前（ＢＭ、基底測定）および１４日後に適用した。手術の１４日後に、経口経路による服用量０．００１６、０．００８、０．０４、１、および５μｇ／ｋｇの合成ペプチド、または対照となる生理食塩水の投与の前（初期測定、ＩＭ）および１、３、２４、４８、７２および９６時間後にこの試験を適用した（表１１）。
痛覚過敏症の評価のために、ラット足プレッシャー試験を使用し（Ａｎａｌｇｅｓｙ−Ｍｅｔｅｒ Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ（登録商標）、Ｉｔａｌｙ）、ＲａｎｄａｌｌとＳｅｌｉｔｔｏ（１９５７）によって記述された方法に従って実施した。神経障害性疼痛の進行を特性分析するために、この試験は手術の前（ＢＭ、基底測定）および１４日後に適用した。手術の１４日後に、経口経路による服用量０．００１６、０．００８、０．０４、１、および５μｇ／ｋｇの合成ペプチド、または対照となる生理食塩水の投与の前（初期測定、ＩＭ）および１、３、２４、４８、７２および９６時間後にこの試験を適用した（表１１）。
これらの結果は基底および初期測定の平均値を比較することによって、または初期および最終測定の平均値を比較することによって、あるいは判定されたときに異なる実験群で得られた平均値の比較を通じて解析した。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
得られたデータは、１回の投与の後に最大で３日まで検出される抗痛覚過敏効果を神経障害性疼痛モデルにおいてこのペプチドが誘発することが可能であることを示した。
服用量０．００１６、０．００８、０．０４、および１μｇ／ｋｇで合成ペプチドによる動物の処置後１時間に得られた結果を有効量５０、６０および９０％の判定のために使用した。これらのデータを使用して基底および初期測定値の比較による疼痛閾値の低下（痛覚過敏）のパーセンテージの判定、続いて処置した（ペプチド）群および対照（生理食塩水）の群の比較による痛覚過敏症の逆戻りのパーセンテージの判定を行った。これらのデータはＣｕｒｖｅＥｘｐｅｒｔ １．３プログラムを使用して解析した。この実施例においてこのペプチドの５０、６０および９０％有効量がそれぞれ０．２０５５１７、０．２８３１７３、および０．５７４７１５８μｇ／ｋｇであることを結果が示した。
（実施例１１Ｂ．異疼痛の判定）
ラットの足に加えられる触刺激への応答で異疼痛を、Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）によって述べられた方法を修正した方法に従って定量的な試験で評価された。この試験でラットを、これらの動物の足に手を伸ばすことが可能になるように底に金網を有するプラスチックの檻に個々に収納した。簡潔に述べると、１０の対数系の較正されたＳｅｍｍｅｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ単繊維（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓ，Ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ Ｓｅｍｍｅｒ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅ．Ｕ．Ａ）を右後足に使用することで、足引き戻し応答を引き出すために必要とされる刺激強度閾値剛性を判定した。剛性はｌｏｇ １０（ｍｇ×１０）によって決定し、以下の値を有する（グラムでの値はカッコの中）、３．６１（０．４０７ｇ）、３．８４（０．６９２ｇ）、４．０８（１．２０２ｇ）、４．１７（１．４７９ｇ）、４．３１（２．０４１ｇ）、４．５６（３．６３０ｇ）、４．７４（５．４９５ｇ）、４．９３（８．５１１ｇ）、５．０７（１１．７４９ｇ）、および５．１８（１５．１３６ｇ）。異疼痛の調査では１５．１３６ｇよりも大きい加重を有する繊維を使用しなかったことを指摘することが大切である。
ラットの足に加えられる触刺激への応答で異疼痛を、Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）によって述べられた方法を修正した方法に従って定量的な試験で評価された。この試験でラットを、これらの動物の足に手を伸ばすことが可能になるように底に金網を有するプラスチックの檻に個々に収納した。簡潔に述べると、１０の対数系の較正されたＳｅｍｍｅｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ単繊維（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓ，Ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ Ｓｅｍｍｅｒ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅ．Ｕ．Ａ）を右後足に使用することで、足引き戻し応答を引き出すために必要とされる刺激強度閾値剛性を判定した。剛性はｌｏｇ １０（ｍｇ×１０）によって決定し、以下の値を有する（グラムでの値はカッコの中）、３．６１（０．４０７ｇ）、３．８４（０．６９２ｇ）、４．０８（１．２０２ｇ）、４．１７（１．４７９ｇ）、４．３１（２．０４１ｇ）、４．５６（３．６３０ｇ）、４．７４（５．４９５ｇ）、４．９３（８．５１１ｇ）、５．０７（１１．７４９ｇ）、および５．１８（１５．１３６ｇ）。異疼痛の調査では１５．１３６ｇよりも大きい加重を有する繊維を使用しなかったことを指摘することが大切である。
繊維を両後足の足底領域に１つずつ直角に当てて８秒間保持した。２回連続で足の引き戻しを引き出すことが可能であった繊維が応答（１００％の応答）を引き出すために必要とされるグラム力であるとみなされた。大きい刺激（１５．１３５ｇ）に応答が無いとき、この繊維が切断値であるとみなされた。
最尤適合法を使用してガウス積分精神測定関数を当てはめることによって５０％足引き戻し閾値（絶対閾値）を計算するために挙動応答を使用した。この適合法はパラメータ解析を可能にする。
試験および処置の適用の期間は痛覚過敏症の判定に関して使用した期間と同じであった（表１２）。
これらの結果は基底および初期測定の平均値を比較することによって、または判定されたときに異なる実験群で得られた平均値を比較することによって解析した。データは１群当たり５匹の動物の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
これらのデータは、１回の投与の後に最大で３日まで検出される抗異疼痛効果を神経障害性疼痛モデルにおいてこのペプチドが誘発することが可能であることを示した。
（実施例１１Ｃ．自発性疼痛の判定）
自発性疼痛の評価のために、坐骨神経圧迫手術の１４日後に、ペプチド（５μｇ／ｋｇ）または生理食塩水の経口投与の前および１時間後、３時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、および１４４時間後でラットを観察した（表１３および１４）。自発性疼痛を特徴とする兆候の観察のために、動物は１匹ずつ透明のプラスチックボックスに収納した。３０分の環境順応期間の後、１０分間ラットが観察されて足舐め（秒）およびリフティング時間の持続時間の判定を行った。動物の正常な身づくろい動作の一部として実行される足舐めおよびリフティング活動は認められなかった。
自発性疼痛の評価のために、坐骨神経圧迫手術の１４日後に、ペプチド（５μｇ／ｋｇ）または生理食塩水の経口投与の前および１時間後、３時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、および１４４時間後でラットを観察した（表１３および１４）。自発性疼痛を特徴とする兆候の観察のために、動物は１匹ずつ透明のプラスチックボックスに収納した。３０分の環境順応期間の後、１０分間ラットが観察されて足舐め（秒）およびリフティング時間の持続時間の判定を行った。動物の正常な身づくろい動作の一部として実行される足舐めおよびリフティング活動は認められなかった。
これらの結果は、このペプチドが足舐めおよびリフティング時間の両方を妨害することが可能であることを示し（表１３および１４）、神経障害性疼痛モデルにおける自発性疼痛へのこのペプチドの妨害効果を示す。
（実施例１２．坐骨神経圧迫モデルにおける合成ペプチド配列番号２の鎮痛効果へのオピオイド受容体の関与）
坐骨神経の慢性の圧迫によって誘発される痛覚過敏症および異疼痛においてペプチドの鎮痛効果が明らかになった後、この効果へのオピオイド受容体の関与を調べた。この目的で、動物に特異的μ受容体アンタゴニストであるＣＴＯＰ（２０μｇ／足）、特異的κ受容体アンタゴニストであるノルＢＮＩ（５０μｇ／足）、または特異的δ受容体アンタゴニストであるＩＣＩ１７４，８６４（１０μｇ／足）を処置した。これらのアンタゴニストを足底経路で注射した。ペプチドをオピオイドアンタゴニストの注射の直前に５μｇ／ｋｇの服用量で経口投与した。
坐骨神経の慢性の圧迫によって誘発される痛覚過敏症および異疼痛においてペプチドの鎮痛効果が明らかになった後、この効果へのオピオイド受容体の関与を調べた。この目的で、動物に特異的μ受容体アンタゴニストであるＣＴＯＰ（２０μｇ／足）、特異的κ受容体アンタゴニストであるノルＢＮＩ（５０μｇ／足）、または特異的δ受容体アンタゴニストであるＩＣＩ１７４，８６４（１０μｇ／足）を処置した。これらのアンタゴニストを足底経路で注射した。ペプチドをオピオイドアンタゴニストの注射の直前に５μｇ／ｋｇの服用量で経口投与した。
結果は、基底および初期の測定、または初期および最終の測定の平均値を比較するか、または判定されたときに異なる実験群で得られた平均値を比較して解析した（表１５および１６）。
これらのデータは、δオピオイド受容体アンタゴニストが坐骨神経の慢性的圧迫モデルにおけるペプチドの抗痛覚過敏効果を阻むことを示した。κオピオイド受容体アンタゴニストは部分的にこの効果を阻害した。μオピオイド受容体アンタゴニストはペプチドの効果を変えなかった。
これらのデータは、δオピオイド受容体アンタゴニストが坐骨神経の慢性的圧迫モデルにおけるペプチドの抗異疼痛効果を阻むことを示した。κオピオイド受容体アンタゴニストは部分的にこの効果を阻害した。μ受容体アンタゴニストはペプチドの効果を変えなかった。
（実施例１３．癌の痛み、持続性疼痛のモデルにおける合成ペプチド配列番号２の鎮痛効果（ＷＡＬＫＥＲ２５６腫瘍による調査））
ＷＡＬＫＥＲ２５６腫瘍細胞はＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｏ ＰａｕｌｏのＤｒ．Ｒｕｉ Ｃｕｒｉ教授の好意で提供された。癌を持った動物を実験用に屠殺し、腫瘍組織を取り出して０．９％生理食塩水を入れたペトリ皿に置いた。次いで、腫瘍をさらに小さい部分片に切断して生理食塩水を入れたビーカーの中に移した。腫瘍が全体的に寸断されるまで材料を微細切断で粉砕した。次いで、この材料をガーゼで濾過し、液体をビーカーに集めた。すべての手順は氷の上で実施した。ビーカーの材料を５０ｍｌのプラスチックチューブに移して４℃、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理した。遠心分離の後、上清が廃棄されて沈殿物を０．９％生理食塩水中に再び懸濁させた。細胞計数のために、細胞の懸濁液を生理食塩水中に希釈（１：１００）した。アリコート（２００μｌ）を取り出して１％のトリパンブルー２００μｌを含む試験管内に収納した。細胞の数はノイバウエルチャンバを使用して光学顕微鏡で求めた。細胞の生存は生存して光を屈折させる細胞を考慮して判定した。
ＷＡＬＫＥＲ２５６腫瘍細胞はＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｏ ＰａｕｌｏのＤｒ．Ｒｕｉ Ｃｕｒｉ教授の好意で提供された。癌を持った動物を実験用に屠殺し、腫瘍組織を取り出して０．９％生理食塩水を入れたペトリ皿に置いた。次いで、腫瘍をさらに小さい部分片に切断して生理食塩水を入れたビーカーの中に移した。腫瘍が全体的に寸断されるまで材料を微細切断で粉砕した。次いで、この材料をガーゼで濾過し、液体をビーカーに集めた。すべての手順は氷の上で実施した。ビーカーの材料を５０ｍｌのプラスチックチューブに移して４℃、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理した。遠心分離の後、上清が廃棄されて沈殿物を０．９％生理食塩水中に再び懸濁させた。細胞計数のために、細胞の懸濁液を生理食塩水中に希釈（１：１００）した。アリコート（２００μｌ）を取り出して１％のトリパンブルー２００μｌを含む試験管内に収納した。細胞の数はノイバウエルチャンバを使用して光学顕微鏡で求めた。細胞の生存は生存して光を屈折させる細胞を考慮して判定した。
細胞の数を求めた後、液状腫瘍（腹水）を得るために１×１０７の細胞を含む懸濁液を腹腔内経路でラットの右側部に注射した。
注射の５日後、腹水を持つラットを実験用に屠殺し、腹腔から腹水を集めてＥＤＴＡを含む試験管内に収納した。この液体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で１００倍に希釈した。上述のようにトリパンブルーによる希釈の後に細胞の計数を行った。腫瘍細胞の計数はＰＢＳによる希釈で１００μｌ中に１×１０６細胞であると確認された。この細胞数をラットへの癌疼痛の誘発のための予備試験で判定した。この最終的な細胞数の調節において、懸濁液に添加される抗生物質の量（抗生物質１５０，０００単位／懸濁液１０ｍｌ）が考慮に入れられた。抗生物質を、微生物の混入を避けるために使用した。これらを細胞は足底経路でラット後足のうちの一方に注射した。対照区の動物は同じ実験条件で反対側の足にＰＢＳを注射した。
このモデルにおける合成ペプチドの鎮痛効果の評価のために、動物を、Ｗａｌｋｅｒ腫瘍細胞注射の５日後に６μｇ／ｋｇの服用量でペプチドまたは生理食塩水（対照区）による経口投与で処置した。痛覚過敏症、異疼痛、および自発性疼痛は腫瘍細胞注射の前（ＢＭ、基底測定）と５日後、およびペプチド投与の前（ＩＭ、初期測定）ろ２時間後（ＦＭ、最終測定）に判定した。
結果は、基底および初期の測定、または初期および最終の測定の平均値を比較するか、または判定したときに異なる実験群で得られた平均値を比較して解析した（表１７、１８、１９）。
これらの結果は、このペプチドがＷａｌｋｅｒ腫瘍によって誘発される痛覚過敏症（表１７）、異疼痛（表１８）および自発性疼痛（表１９）を阻止することを実証した。これらのデータはこのペプチドが癌の痛みを抑制することが可能であることを示した。
（実施例１４．ＷＡＬＫＥＲ２５６腫瘍によって誘発される癌疼痛のモデルにおける合成ペプチド配列番号２の鎮痛効果へのオピオイド受容体の関与の評価）
ＷＡＬＫＥＲ２５６腫瘍によって誘発される痛覚過敏症および異疼痛へのペプチドの鎮痛効果が明らかになった後、この効果へのオピオイド受容体の関与を調べた。この目的で、動物を特異的μ受容体アンタゴニストであるＣＴＯＰ（２０μｇ／足）、特異的κ受容体アンタゴニストであるノルＢＮＩ（５０μｇ／足）、または特異的δ受容体アンタゴニストであるＩＣＩ１７４，８６４（１０μｇ／足）で処置した。これらのアンタゴニストを足底経路で注射した。ペプチドをオピオイドアンタゴニストの注射の直前に６μｇ／ｋｇの服用量で経口投与した。結果は、基底および初期の測定、または初期および最終の測定の平均値を比較するか、または判定したときに異なる実験群で得られた平均値を比較して解析した（表２０）。
ＷＡＬＫＥＲ２５６腫瘍によって誘発される痛覚過敏症および異疼痛へのペプチドの鎮痛効果が明らかになった後、この効果へのオピオイド受容体の関与を調べた。この目的で、動物を特異的μ受容体アンタゴニストであるＣＴＯＰ（２０μｇ／足）、特異的κ受容体アンタゴニストであるノルＢＮＩ（５０μｇ／足）、または特異的δ受容体アンタゴニストであるＩＣＩ１７４，８６４（１０μｇ／足）で処置した。これらのアンタゴニストを足底経路で注射した。ペプチドをオピオイドアンタゴニストの注射の直前に６μｇ／ｋｇの服用量で経口投与した。結果は、基底および初期の測定、または初期および最終の測定の平均値を比較するか、または判定したときに異なる実験群で得られた平均値を比較して解析した（表２０）。
これらのデータは、κオピオイド受容体アンタゴニストがこのペプチドの抗痛覚過敏効果を阻むことを示した。δオピオイド受容体アンタゴニストは部分的にこの効果を阻害した。μオピオイド受容体アンタゴニストはこのペプチドの効果を変えなかった。
これらのデータは、κオピオイド受容体アンタゴニストがこのペプチドの抗異疼痛効果を阻むことを示した。δオピオイド受容体アンタゴニストは部分的にこの効果を阻害した。μオピオイド受容体アンタゴニストはこのペプチドの効果を変えなかった。
（実施例１５．ホットプレート試験における合成ペプチド配列番号２の鎮痛効果の評価）
熱的刺激は直接的に侵害受容器を活性化させて組織の損傷とその結果生じる炎症を回避するので、この試験を中枢神経系において痛覚を妨げる薬剤（例えばモルヒネと派生生成物）の評価のために使用される。この試験で得られる結果は、化合物の鎮痛効果が主に脊柱上で統合される応答に起因することを実証する。
熱的刺激は直接的に侵害受容器を活性化させて組織の損傷とその結果生じる炎症を回避するので、この試験を中枢神経系において痛覚を妨げる薬剤（例えばモルヒネと派生生成物）の評価のために使用される。この試験で得られる結果は、化合物の鎮痛効果が主に脊柱上で統合される応答に起因することを実証する。
この試験はＪａｃｏｂ，Ｊ．Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｒａｍａｂａｄｒａｎ，Ｋ．（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６４：９１〜８，１９７８）によって述べられた方法に従って実施した。この試験のために、５０℃±１に維持した金属表面の上にマウスを置いた。結果は前足両方を舐める動作を観察する待ち時間（秒、ｓ）として表現される（反応時間）。この試験を生理食塩水（対照区）または合成ペプチド（２００μｌ中に１および３μｇ／ｋｇ）による経口での動物の処置の前（初期測定、ＩＭ）および２時間後（最終測定、ＦＭ）に適用した。各々の動物は自己の支配下にあるとみなされた。結果は、ＩＭおよびＦＭの平均値を比較して、または判定したときに異なる実験群で得られた平均値を比較することによって解析した（表２２）。
これらの結果は、この合成ペプチドが中枢神経系における作用によってもやはり鎮痛を誘発することを実証する。
（実施例１６．化学修飾した合成ペプチド配列番号３の鎮痛活性）
痛覚過敏の誘発のために、１００ｎｇ／足の服用量でプロスタグランジンＥ２を足底（ｉ．ｐｌ．）経路で注射した。痛覚過敏症をＰＧＥ２注射の前（初期測定、ＩＭ）および３時間後（最終測定、ＦＭ）に評価された。
痛覚過敏の誘発のために、１００ｎｇ／足の服用量でプロスタグランジンＥ２を足底（ｉ．ｐｌ．）経路で注射した。痛覚過敏症をＰＧＥ２注射の前（初期測定、ＩＭ）および３時間後（最終測定、ＦＭ）に評価された。
痛覚感受性の評価のためにラット足プレッシャー試験を使用した。動物に足を引き戻す反応をさせる力（グラム）で表される疼痛閾値をプロスタグランジンＥ２の足底注射（１００ｎｇ／脚）の前（初期測定）および３時間後（最終測定）に判定した。
化学修飾した合成ペプチド配列番号３を１１ｍｌの量の生理食塩水中に希釈した。各々の動物に痛覚過敏誘発の直前にこの溶液２ｍｌを経口投与（ｐ．ｏ．）した。生理食塩水を経口注入した動物を対照区として使用した。
これらの結果は、修飾した合成ペプチド配列番号３の鎮痛効果がＰＧＥ２によって誘発されることを実証した。
Claims (62)
- アミノ酸配列、
Ｘａａ−Ｒ１−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｃｙｓ−Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｒ５−Ｓｅｒ−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１）
（ここで、
Ｘａａは常にピログルタメートであり、
Ｒ１＝ＰｈｅまたはＴｒｐまたはＴｙｒまたはＬｅｕまたはＴｈｒ、
Ｒ２＝ＰｒｏまたはＡｒｇ、
Ｒ３＝ＧｌｘまたはＡｓｘまたはＧｌｙ、
Ｒ４＝ＡｓｎまたはＧｌｎまたはＬｅｕ、
Ｒ５＝ＧｌｘまたはＡｓｘ、
Ｒ６＝ＧｌｘまたはＬｙｓである。）
を示すことを特徴とする化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物［ただし、該化合物が、Ｒ１＝Ｐｈｅ、Ｒ２＝Ｐｒｏ、Ｒ３＝Ｇｌｕ、Ｒ４＝Ａｓｎ、Ｒ５＝Ｇｌｕ、およびＲ６＝Ｇｌｎのテトラデカペプチドであり、位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している（配列番号２）場合を除く。］。 - 位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している（配列番号４）ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
- アミノ酸配列Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを有するテトラデカペプチド（ここで、位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している）（配列番号２）に類似していることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
- 薬物動力学および薬力学的特性の修正のためのペプチド擬似追加、削除、または変更を特徴とする、請求項１から３に記載の化合物。
- １つ以上のＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸または従来にないアミノ酸の置換を特徴とする、請求項１から４に記載の化合物。
- 位置４のプロリン残基のヒドロキシル化、または位置５または１０のグルタミン酸残基のγカルボキシル化を示すことを特徴とする、請求項１から４に記載の化合物。
- アミノ酸配列、
Ｘａａ−Ｒ１−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｃｙｓ−Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｒ５−Ｓｅｒ−Ｒ６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１）
（ここで、
Ｘａａは常にピログルタメートであり、
Ｒ１＝ＰｈｅまたはＴｒｐまたはＴｙｒまたはＬｅｕまたはＴｈｒ、
Ｒ２＝ＰｒｏまたはＡｒｇ、
Ｒ３＝ＧｌｘまたはＡｓＰまたはＧｌｙ、
Ｒ４＝ＡｓｎまたはＧｌｎまたはＬｅｕ、
Ｒ５＝ＧｌｘまたはＡｓＰ、
Ｒ６＝ＧｌｘまたはＬｙｓである。）
を有するテトラデカペプチド、これらの塩または溶媒和物［ただし、Ｒ１＝Ｐｈｅ、Ｒ２＝Ｐｒｏ、Ｒ３＝Ｇｌｕ、Ｒ４＝Ａｓｎ、Ｒ５＝Ｇｌｕ、およびＲ６＝Ｇｌｎであり、位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している（配列番号２）場合を除く。］であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。 - 位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している（配列番号４）ことを特徴とする、請求項７に記載の化合物。
- アミノ酸配列Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを有するテトラデカペプチド（ここで、位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している）（配列番号２）であることを特徴とする、請求項８に記載の化合物。
- アミノ酸配列Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを有するテトラデカペプチド（ここで、位置７および１４にあるシステイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している）（配列番号３）であることを特徴とする、請求項８に記載の化合物。
- 精製されることを特徴とする、請求項１から１０に記載の化合物。
- １つ以上の医薬として許容可能な担体または希釈剤、および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物を有することを特徴とする医薬組成物。
- １つ以上の医薬として許容可能な担体または希釈剤、および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または精製された類似化合物を有することを特徴とする医薬組成物。
- 溶液、懸濁液、ペースト、カプセル、ゲル、錠剤、丸薬、粉末、顆粒、親液性化合物、制御された放出系、微粒子、ミクロもしくはナノスフィア、リポソームの形であるか、または有機コーティングに付随することを特徴とする、請求項１２および１３に記載の医薬組成物。
- 水を主成分とする希釈剤を含むことを特徴とする、請求項１２から１４に記載の医薬組成物。
- 経口、筋肉内、静脈内、皮下、局所、肺、鼻腔内、頬、直腸、舌下、皮内、腹腔内、またはくも膜下への使用のためであることを特徴とする、請求項１２から１５に記載の医薬組成物。
- 経口使用のためであることを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
- 鎮痛用医薬組成物の製剤で使用され、またはオピオイド受容体によって調節される状態の治療、診断または予防に有用であることを特徴とする、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の使用。
- 鎮痛用医薬組成物の製剤で使用され、またはオピオイド受容体によって調節される状態の治療、診断または予防に有用であることを特徴とする、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または精製された類似化合物の使用。
- 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物が直接的または間接的なオピオイド受容体アゴニストであることを特徴とする、請求項１８から１９に記載の使用。
- 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物が直接的または間接的なオピオイド受容体アンタゴニストであることを特徴とする、請求項１８から１９に記載の使用。
- オピオイド受容体によって調節される状態の治療、診断または予防に有用な医薬組成物の製剤で使用されることを特徴とする、請求項１８から２１に記載の使用。
- κ型オピオイド受容体によって調節される状態の治療、診断または予防に有用な医薬組成物の製剤であることを特徴とする、請求項１８から２１に記載の使用。
- 鎮痛用医薬組成物の製剤として使用されることを特徴とする、請求項１８および１９に記載の使用。
- 経口鎮痛用医薬組成物の製剤として使用されることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
- 長期持続性の鎮痛効果を有する医薬組成物の製剤で使用されることを特徴とする、請求項２４および２５に記載の使用。
- 最長で５日持続する鎮痛効果を有する医薬組成物の製剤で使用されることを特徴とする、請求項２４から２５に記載の使用。
- 急性または慢性の疼痛（癌に関係する痛み、三叉神経痛、交感神経性ジストロフィ、帯状疱疹後神経痛、幻肢痛、脳血管障害後、糖尿病性神経障害のような神経障害性疼痛、新形成に伴う痛み、線維筋痛、歯痛、月経困難症、腎臓、月経および胆道痛、関節痛、関節リウマチもしくは変形性関節症を含む関節炎、眼内高血圧、関節鏡検査後の痛み、腹腔鏡検査後婦人科の痛み、経皮的腎結石摘出によって生じる痛み、根治的恥骨後前立腺摘出後の痛み、開胸術後の痛み、小児科患者の扁桃摘出後の痛み、子宮切除後の痛み、帝王切開手術後の痛みまたは火傷を含む）、コカインまたはオピオイド依存症、細胞増殖、小細胞肺癌、鬱病および精神障害、炎症、腫瘍性血管形成に付随する状態、外傷、冠状動脈虚血疾患、パーキンソン病およびジスキネジー、肝性脳症、認知的疾患、アルツハイマー病、多嚢胞性卵巣に伴う婦人の肝性胆汁鬱滞または高インスリン血症に起因する掻痒の治療、診断または予防に有用な組成物の製剤で使用されることを特徴とする、請求項１８から２７に記載の使用。
- 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の使用を特徴とする、疼痛状態またはオピオイド受容体によって仲介される状態の治療、診断または予防のための方法。
- 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む１つ以上の化合物、これらの塩、溶媒和物、または精製された類似化合物の使用を特徴とする、疼痛状態またはオピオイド受容体によって仲介される状態の治療、診断または予防のための方法。
- 直接的または間接的なオピオイド受容体アゴニストである、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物を特徴とする、請求項３０から３１に記載の方法。
- 直接的または間接的なオピオイド受容体アンタゴニストである、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物を特徴とする、請求項３０から３１に記載の方法。
- オピオイド受容体によって調節される状態の治療、診断または予防に使用されることを特徴とする、請求項２９から３２に記載の方法。
- κ型オピオイド受容体によって調節される状態の治療、診断または予防に使用されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
- 疼痛状態の治療、診断または予防に使用されることを特徴とする、請求項２９から３０に記載の方法。
- 化合物の経口使用を特徴とする、請求項２９から３５に記載の方法。
- 長い持続時間を有することを特徴とする、請求項２９から３６に記載の方法。
- 最大で５日までの持続時間を有することを特徴とする、請求項２９から３７に記載の方法。
- 急性または慢性の疼痛（癌に関係する痛み、三叉神経痛、片頭痛、交感神経性ジストロフィ、帯状疱疹後神経痛、幻肢痛、脳血管障害後関連の痛み、糖尿病性神経障害のような神経障害性疼痛、新形成に伴う痛み、線維筋痛、歯痛、月経困難症、腎臓、月経および胆道痛、関節痛、関節リウマチもしくは変形性関節症を含む関節炎、眼内高血圧、関節鏡検査後の痛み、腹腔鏡検査後婦人科の痛み、経皮的腎結石摘出によって誘発される痛み、根治的恥骨後前立腺摘出後の痛み、開胸術後の痛み、小児科患者の扁桃摘出後の痛み、子宮切除後の痛み、帝王切開手術後の痛みまたは火傷の痛みを含む）、コカインまたはオピオイド依存症、細胞増殖、小細胞肺癌、鬱病および精神障害、炎症、腫瘍性血管形成に付随する状態、外傷、冠状動脈虚血疾患、パーキンソン病およびジスキネジー、肝性脳症、認知的疾患、アルツハイマー病、多嚢胞性卵巣に伴う婦人の肝性胆汁鬱滞または高インスリン血症に起因する掻痒の治療、診断または予防のために使用されることを特徴とする、請求項２９から３８に記載の方法。
- スルフヒドリル基の酸化の段階を含み、位置７および１４に対応するシステイン残基間の分子内ジスルフィド架橋の形成を随伴することを特徴とする、請求項２に記載の化合物の生成方法。
- 酸化剤としてのヨウ素の使用を特徴とする、請求項４０に記載の生成方法。
- 構造の中にアミノ酸配列、
Ｒ５＝ＧｌｘまたはＡｓｘ、
Ｒ６＝ＧｌｘまたはＬｙｓであり、
システイン残基が分子内ジスルフィド架橋によって連結している。）
を含む化合物の精製段階を含むことを特徴とする、請求項２に記載の化合物の生成方法。 - 固相におけるペプチド合成段階を含むことを特徴とする、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を含む化合物、これらの塩、溶媒和物、または類似化合物の生成方法。
- 固体担体としてのＨ−ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−ＣｌＴｒｔ樹脂の使用を特徴とする、請求項４３に記載の生成方法。
- 合成または半合成起源の化合物の混合物の精製を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の化合物の生成方法。
- 生物学的起源の化合物の混合物の精製を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
- 生物学的起源の化合物の混合物が南米ガラガラヘビの未精製の毒液で構成されることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
- 生物学的起源の化合物の混合物が細胞培養物または組換え微生物から得られることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
- ペプチドの選択的沈降段階を含むことを特徴とする、請求項４５から４８に記載の化合物の生成方法。
- 選択的沈降用の薬剤としての、アセトニトリルおよび水中のトリフルオロ酢酸溶液の利用を特徴とする、請求項４９に記載の方法。
- 水２部に対してアセトニトリル約１部の混合物中の約０．１％のトリフルオロ酢酸の溶液の使用を特徴とする、請求項５０に記載の方法。
- クロマトグラフィ工程による分離を含むことを特徴とする、請求項４５から４８に記載の化合物の生成方法。
- 逆相ＨＰＬＣカラムの使用を特徴とする、請求項５２に記載の方法。
- 勾配濃度を有する移動相の使用を特徴とする、請求項５２に記載の方法。
- 移動相としての水およびアセトニトリルの混合物中のトリフルオロ酢酸溶液の、使用を特徴とする、請求項５４に記載の方法。
- 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物を同定するための方法。
- 以下の段階、
ａ）鎮痛活性を判定するためにアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列を有するペプチドの生物学的活性を評価する段階、
ｂ）鎮痛活性を判定するために試験化合物（対照）の生物学的活性を評価する段階、および
ｃ）アミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列の生物学的活性について得られた結果を試験化合物（対照）で得られた結果と比較する段階、
を特徴とする、請求項５６に記載の方法。 - ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
- ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
- 以下の段階、
ａ）印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列のペプチドを試験サンプルと接触させて入れる段階、
ｂ）印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列のペプチドと接触している試験サンプルに試験化合物を添加する段階、および
ｃ）試験サンプルと印を付けたアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の配列のペプチド結合を評価する段階、
を含むことを特徴とする、請求項５６に記載の方法。 - ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６０に記載の方法。
- ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６０に記載の方法。
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