JP2002508945A - ガンマ−コノペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、イモガイの毒液中に微量で天然に入手可能である、約２５−４０残基長の比較的短いペプチド、または該天然に入手可能なペプチドに対するアナログに関し、それらは３つの環化ジスルフィド結合および１またはそれを超えるγ−カルボキシグルタミン酸残基を含む。より詳細には、本発明は、本明細書に記載する一般式（Ｉ）：Xaa₁−Cys−Xaa₂−Cys−Xaa₃−Xaa₄−Cys−Cys−Xaa₅−Cys−Xaa₆−Cys−Xaa₇（配列番号：１）を有する；または、本明細書に記載する一般式（II）：Xaa₁−Cys−Xaa₂−Cys−Xaa₃−Xaa₄−Cys−Cys−Xaa₅−Xaa₆−Cys−Xaa₇−Cys−Xaa₈（配列番号：２）を有する；または、本明細書中に記載する一般式（III）：Xaa₁−Cys−Xaa₂−Cys−Xaa₃−Xaa₄−Xaa₅−Cys−Cys−Ser−Asn−Ser−Cys−Asp−Xaa₆−Cys−Xaa₇（配列番号：３）を有する；または、本明細書中に記載する一般式（IV)：Xaa₁−Cys−Xaa₂−Cys−Xaa₃−Xaa₄−Xaa ₅−Cys−Cys−Ser−Asn−Ser−Cys−Asp−Xaa₆−Cys−Xaa₇（配列番号：４）；または、本明細書中に記載する一般式（V）：Xaa₁−Xaa₂−Cys−Xaa₃−Xaa₄−Phe−Xaa₅−Cys−Thr−Xaa₆−Ser−Xaa₇−Cys−Cys−Ser−Asn−Ser−Cys−Asp−Gln−Thr−Tyr−Cys−Xaa₈−Leu−Xaa₉（配列番号：５）を有するγ−コノペプチドに指向される。さらに、本発明は、特異的γ−コノペプチド、特異的プロ−γ−コノペプチドおよびプロ−γ−コノペプチドをコードする核酸に関する。また、本発明は、コノペプチドの医薬上許容される塩をも包含する。これらのコノペプチドは、ニューロンペースメーカー・カルシウムチャンネルのアゴニストとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願に対する相互参照 本願は、出典明示して本明細書の一部とみなす、1997年12月16日に出願された
米国仮特許出願番号60／069,706号に関係している。 本発明は、一部、National Institutes of Health (Bethesda, Maryland)に授
与された助成金番号RR01614およびGM48677ならびにNational Science Foundatio
n (Washington, D.C.)に授与された助成金番号DIR8700766の下の政府助成金でな
されたものである。合衆国政府は、本発明においてある種の権利を有する。

【０００２】 発明の背景 本発明は、イモガイ（cone snail）の毒液中に微量で天然に入手可能である、
約２５−４０残基長の比較的短いペプチド、または該天然に入手可能なペプチド
に対するアナログに関し、それらは３つの環化ジスルフィド結合および１または
それを超えるγ−カルボキシグルタミン酸残基を含んでいる。 本明細書中で用いる刊行物および他の材料は、本発明の背景を説明するため、
特に実施に関するさらなる詳細を提供するためのものであり、出典明示して本明
細書の一部とみなし、簡便なように以下の明細書中では著者および発行年により
参照し、添付した「参考文献のリスト」では著者によりアルファベット順に掲載
する。

【０００３】 コナス（Conus）属の軟体動物は毒液を生成し、それによってそのユニークな 捕食生活様式を行うことができる。餌生物は、非常に分化した毒液装置、銛およ
び皮下注射針の双方の様式で機能する使い捨ての陥凹歯によって注射される毒液
によって不動化される。 毒液分泌動物とその毒液を注入された犠牲者との間の相互作用よりも印象的な
生物間の相互作用はほとんど存在しない。毒液は、餌生物を捕らえるための主た
る武器および防御機構として用い得る。これらの毒液の多くは、神経筋系の受容
体およびイオンチャンネルに指向される分子を含んでいる。 捕食性イモガイ（Conus）はユニークな生物学的戦略を発達させてきた。その 毒液には、種々の神経筋の受容体に標的化され、その薬理学的多様性においては
植物のアルカロイドまたは微生物の二次代謝物と同等とし得る比較的小さなペプ
チドが含まれている。これらのペプチドの多くは、決まったコンホメーションを
有する最小の核酸コード翻訳産物の中に入り、そのこと自体が幾分通常とは異な
る。このサイズ範囲におけるペプチドは、通常、多くのコンホメーションの中で
平衡している。固定したコンホメーションを有するタンパク質は一般的により大
きい。

【０００４】 これらの毒性ペプチド、一般的にはコノトキシンまたはコノトキシン・ペプチ
ドといわれている、を産生するイモガイは、ほぼ５００種からなる毒性腹足類の
大きな属である。すべてのイモガイ種は捕捉餌生物に毒液を注射する捕食者であ
って、全体として当該属が毒液注入し得る動物のスペクトルは広い。広範な種々
のハント戦略が用いられるが、すべてのConus種は同一の基本パターンの毒液注 入を基本的に用いる。 Conus毒液から単離された幾つかのペプチドが特徴付けされている。これらに は、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋肉ナトリウムチャンネルおよびニュー
ロン・カルシウムチャンネルを各々標的化するα−、μ−およびω−コノトキシ
ンが含まれる（Oliveraら，1985）。γ−カルボキシグルタミン酸残基と３つの ジスルフィド結合を含むコノトキシン、TxVIIAが単離されている（Fainzilberら
，1991）。バソプレッシン・アナログであるコノプレッシンも同定されている（
Cruzら，1987）。加えて、コナントキンと命名されたペプチドがコナス・ゲオグ
ラファス（Conus geographus）およびコナス・チュリパ（Conus tulipa）から単
離されている（Menaら，1990；Haackら，1990）。これらのペプチドは通常でな い年齢−依存的な生理学的効果を有する：それは、２週齢未満のマウスにおいて
は睡眠−様状態を誘導し、３週齢よりも高齢のマウスには活動亢進挙動を誘導す
る（Haackら，1990）。最近、コントリファンス（contryphans）と命名された、
Ｄ−トリプトファンまたはＤ−ロイシン残基を含有するペプチドがコナス・ラジ
アタス（Conus radiatus）から単離され（米国特許出願番号09／061,026号）、 ブロモ−トリプトファン・コノペプチドがコナス・インペリアリス（Conus impe
rialis）およびコナス・ラジアタス（Conus radiatus）から単離された（米国特
許出願番号08／785,534号）。

【０００５】 イオンチャンネルは、興奮性組織における電気的活性に寄与する全体原形質膜
タンパク質である。遅延型内向電流（slow inward current）が細胞膜の長時間 一定の脱分極を介してニューロン興奮性に影響し得ることが認識されている（Ll
inas，1988）。内因性のバースト（bursting）挙動を生成することにおける遅延
型内向電流の役割は、軟体動物のニューロンで認識されており（WilsonおよびWa
chtel，1974；EckertおよびLux，1976；Partridgeら，1979）、より最近では、 幾つかのタイプの哺乳動物ニューロンにおいて認識されている（Lanthornら，19
84；Stafstromら，1985；Llinas，1988；AlonsoおよびLlinas，1989）。かかる 非特異的なカチオンチャンネルによって運ばれた遅延型内向電流における変化は
、哺乳動物心筋から軟体動物ニューロンの範囲の種々の興奮性系におけるバース
トおよびペースメーカー活性において非常に重要な役割を演じているのかもしれ
ない（PartridgeおよびSwandulla，1988；Hoehnら，1993；KitsおよびMansvelde
r，1966；van SoestおよびKits，1997）。遅延型内向電流は、海馬のごとき脳の
領域における癲癇様のバーストを発生することにおいて重要であるとも考えられ
ている。 海馬における癲癇活性（epileptic activity）（Hoehnら，1993）および心筋 におけるペースメーカー電位(pacemaker potential)（Reuter，1984）のごとき 、臨床的に関連する症候群に関与する脊椎動物における遅延型内向カチオンチャ
ンネルを調節するのに有用である薬物を同定することが望まれている。

【０００６】 発明の概要 本発明は、イモガイの毒液中に微量で天然に入手可能である約２５−４０残基
長の比較的短いペプチドまたは該天然に入手可能なペプチドに対するアナログに
関し、それには３つの環化ジスルフィド結合および１またはそれを超えるγ−カ
ルボキシグルタミン酸残基が含まれる。 より詳細には、本発明は、一般式I： Xaa₁-Cys-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Cys-Xaa₅-Cys-Xaa₆-Cys-Xaa₇ （配列番号：１） [式中、Xaa₁はdes-Xaa₁または１-６個のアミノ酸を有するペプチドであり； Xaa₂は５-６個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₃は４個のアミノ酸を有 するペプチドであり；Xaa₄はGlu、γ-Glu（γ-カルボキシグルタミン酸；Glaと もいわれる）またはGlnであり；Xaa₅は３-４個のアミノ酸を有するペプチドであ
り；Xaa₆は３-６個のアミノ酸を有するペプチドであって；Xaa₇はdes-Xaa₇また は２-９個のアミノ酸を有するペプチドであり、但し、Xaa₁がdes-Xaa₁である場 合には、Xaa₅がトリペプチドSer-Asp-Asnとなることはない]；

【０００７】 一般式II： Xaa₁-Cys-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Cys-Xaa₅-Xaa₆-Cys-Xaa₇-Cys-Xaa₈ （配列番号：２） [式中、Xaa₁はdes-Xaa₁または１-６個のアミノ酸を有するペプチドであり； Xaa₂は５-６個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₃は４個のアミノ酸を有 するペプチドであり；Xaa₄はGlu、γ-GluまたはGlnであり；Xaa₅はSerまたはThr
であり；Xaa₆は２-３個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₇は３-６個のア
ミノ酸を有するペプチドであって；Xaa₈はdes-Xaa₈または２-９個のアミノ酸を 有するペプチドであり、但し、Xaa₁がdes-Xaa₁であってXaa₅がSerである場合に は、Xaa₆がジペプチドAsp-Asnとなることはない]；

【０００８】 一般式III： Xaa₁-Cys-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Cys-Ser-Asn-Ser-Cys-Asp-Xaa₅-Cys-Xaa₆ （配列番号：３） [式中、Xaa₁は１-６個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₂はヘキサペプチ
ドであり；Xaa₃は４個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₄はGluまたはγ-
Gluであり；Xaa₅はトリペプチドであって；Xaa₆は７-９個のアミノ酸を有するペ
プチドである]；

【０００９】 一般式IV： Xaa₁-Cys-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Cys-Cys-Ser-Asn-Ser-Cys-Asp-Xaa₆-Cys-Xa
a₇（配列番号：４） [式中、Xaa₁は１-６個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₂はヘキサペプチ
ドであり；Xaa₃はSerまたはThrであり；Xaa₄はトリペプチドであり；Xaa₅はGlu またはγ-Gluであり；Xaa₆はトリペプチドであって；Xaa₇は７-９個のアミノ酸 を有するペプチドである]；または

【００１０】 一般式V： Xaa₁-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Phe-Xaa₅-Cys-Thr-Xaa₆-Ser-Xaa₇-Cys-Cys-Ser-Asn-S
er-Cys-Asp-Gln-Thr-Tyr-Cys-Xaa₈-Leu-Xaa₉（配列番号：５） [式中、Xaa₁はdes-Xaa₁またはジペプチドであり；Xaa₂はAsp、Gluまたはγ-Glu であり；Xaa₃はジペプチドであり；Xaa₄はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₅ はジペプチドであり；Xaa₆はジペプチドであり；Xaa₇はGluまたはγ-Gluであり ；Xaa₈はいずれかのアミノ酸であって；Xaa₉はペンタペプチドである] を有するコノペプチドに指向される。

【００１１】 ペプチドのアミノ酸またはアミノ酸残基は、天然、修飾または非天然のアミノ
酸よりなる群から選択されるアミノ酸である。一般式I-Vで示されるコノペプチ ド（ならびに本明細書中に記載する特異的コノペプチド）中のジスルフィド架橋
は、１番目および４番目のシステイン残基の間、２番目および５番目のシステイ
ン残基の間、ならびに３番目および６番目のシステイン残基の間に存在する。Ｃ
−末端はカルボキシル基またはアミド基を含み得る。本発明は、該コノペプチド
の医薬上許容される塩をも含む。これらのコノペプチドは、海馬における癲癇活
性（Hoehnら，1993）および心筋におけるペースメーカー電位（Reuter，1984） のごとき、臨床的に関連する症候群に関与する脊椎動物における遅延型内向カチ
オンチャンネルを調節するのに有用である。かくして、該コノペプチドは、ニュ
ーロンペースメーカー・カチオンチャンネルのアゴニストとして有用である。

【００１２】 さらに、本発明は、特異的ペプチド： Asp-Cys-Thr-Ser-Xaa₁-Phe-Gly-Arg-Cys-Thr-Val-Asn-Ser-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-As
n-Ser-Cys-Asp-Gln-Thr-Tyr-Cys-Xaa₂-Leu-Tyr-Ala-Phe-Xaa₃-Ser（配列番号： ６）（PnVIIA） [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好まし
くはγ-Gluであり；Xaa₃はProまたはヒドロキシ-Pro（Hyp）、好ましくはHypで あって；Ｃ-末端は遊離カルボキシル基であるか、またはアミド化されており、 好ましくは遊離カルボキシル基である]；

【００１３】 Xaa₁-Leu-Xaa₂-Cys-Ser-Val-Xaa₁-Phe-Ser-His-Cys-Thr-Lys-Asp-Ser-Xaa₂-Cys-
Cys-Ser-Asn-Ser-Cys-Asp-Gln-Thr-Tyr-Cys-Thr-Leu-Met-Xaa₃-Xaa₃-Asp-Xaa₁（
配列番号：７）(Tx6.4) [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好まし
くはγ-Gluであり；Xaa₃はProまたはHyp、好ましくはHypであって；Ｃ-末端は遊
離カルボキシル基であるか、またはアミド化されており、好ましくは遊離カルボ
キシル基である]；

【００１４】 Xaa₁-Xaa₁-Arg-Xaa₁-Gly-Gly-Cys-Met-Ala-Xaa₁-Phe-Gly-Leu-Cys-Ser-Arg-Asp-
Ser-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Asn-Ser-Cys-Asp-Val-Thr-Arg-Cys-Xaa₂-Leu-Met-Xaa₃-P
he-Xaa₃-Xaa₃-Asp-Xaa₁（配列番号：８）(Tx6.9) [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好まし
くはγ-Gluであり；Xaa₃はProまたはHyp、好ましくはHypであって；Ｃ-末端は遊
離カルボキシル基であるか、またはアミド化されており、好ましくは遊離カルボ
キシル基である]；

【００１５】 Cys-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Xaa₂-Ala-Asp-Ser-Xaa₂-Cys-Cys-Thr-Xaa₂-G
ln-Cys-Val-Arg-Ser-Tyr-Cys-Thr-Leu-Phe（配列番号：９）(J010) [式中、Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好ましくはγ-Gluであって；Ｃ-末端は遊離カ ルボキシル基であるか、またはアミド化されており、好ましくはアミド化されて
いる]；

【００１６】 Asp-Xaa₁-Xaa₁-Asp-Asp-Gly-Cys-Ser-Val-Xaa₁-Gly-Xaa₃-Cys-Thr-Val-Asn-Ala-
Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Gly-Asp-Cys-Asp-Cys-His-Xaa₂-Thr-Cys-Ile-Phe-Gly-Xaa₁-X
aa₂-Val（配列番号：１０）(Tx6.6) [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好まし
くはγ-Gluであり；Xaa₃はProまたはHyp、好ましくはHypであって；Ｃ-末端は遊
離カルボキシル基であるか、またはアミド化されており、好ましくは遊離カルボ
キシル基である]；

【００１７】 Gly-Met-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys-Lys-Asp-Gly-Leu-Thr-Thr-Cys-Leu-Ala-Xaa₃-Ser-X
aa₂-Cys-Cys-Ser-Xaa₂-Asp-Cys-Xaa₂-Gly-Ser-Cys-Thr-Met-Xaa₁（配列番号：１
１）(Tx6.5) [式中、Xaa₁はTrpまたは６−ブロモ−Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ−Glu、好 ましくはγ−Gluであり；Xaa₃はProまたはHyp、好ましくはHypであって；Ｃ−末
端は遊離カルボキシル基であるか、またはアミド化されており、好ましくは遊離
カルボキシル基である]；

【００１８】 Xaa₂-Cys-Arg-Ala-Xaa₁-Tyr-Ala-Xaa₃-Cys-Ser-Xaa₃-Gly-Ala-Gln-Cys-Cys-Ser-
Leu-Leu-Met-Cys-Ser-Lys-Ala-Thr-Ser-Arg-Cys-Ile-Leu-Ala-Leu（配列番号： １２）（Gm6.7） [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好まし
くはγ-Gluであり；Xaa₃はProまたはHyp、好ましくはHypであって；Ｃ-末端は遊
離カルボキシル基であるか、またはアミド化されており、好ましくは遊離カルボ
キシル基である]

【００１９】 Asn-Gly-Gln-Cys-Xaa₂-Asp-Val-Xaa₁-Met-Xaa₃-Cys-Thr-Ser-Asn-Xaa₁-Xaa₂-Cys
-Cys-Ser-Leu-Asp-Cys-Xaa₂-Met-Tyr-Cys-Thr-Gln-Ile（配列番号：１３）（Mr6
.1） [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好まし
くはγ-Gluであり；Xaa₃はProまたはHyp、好ましくはHypであって；Ｃ-末端は遊
離カルボキシル基であるか、またはアミド化されており、好ましくはアミド化さ
れている]

【００２０】 Cys-Gly-Gly-Xaa₁-Ser-Thr-Tyr-Cys-Xaa₂-Val-Asp-Xaa₂-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Xaa₂ -Ser-Cys-Val-Arg-Ser-Tyr-Cys-Thr-Leu-Phe（配列番号：１４）(Mr6.2) [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好まし
くはγ-Gluであって；Ｃ-末端は遊離カルボキシル基であるか、またはアミド化 されており、好ましくはアミド化されている]；

【００２１】 Asn-Gly-Gly-Cys-Lys-Ala-Thr-Xaa₁-Met-Ser-Cys-Ser-Ser-Gly-Xaa₁-Xaa₂-Cys-C
ys-Ser-Met-Ser-Cys-Asp-Met-Try-Cys（配列番号：１５）(Mr6.3) [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-Glu、好まし
くはγ-Gluであって；Ｃ-末端は遊離カルボキシル基であるか、またはアミド化 されており、好ましくはアミド化されている] にも関する。 最後に、さらに本発明は、本明細書中でもさらに詳細に説明するように、前記
ペプチドのプロペプチド配列およびこれらのプロペプチド配列をコードするＤＮ
Ａ配列にも関する。

【００２２】 配列の概要 配列番号：１＝一般式Ｉで示されるγ-コノペプチド；配列番号：２＝一般式I
Iで示されるγ-コノペプチド；配列番号：３＝一般式IIIで示されるγ-コノペプ
チド；配列番号：４＝一般式IVで示されるγ-コノペプチド；配列番号：５＝一 般式Vで示されるγ-コノペプチド；配列番号：６＝PnVIIAに対応するγ-コノペ プチド；配列番号：７＝Tx6.4に対応するγ-コノペプチド；配列番号：８＝Tx6.
9に対応するγ-コノペプチド；配列番号：９＝J010に対応するγ-コノペプチド ；配列番号：１０＝Tx6.6に対応するγ-コノペプチド；配列番号：１１＝Tx6.5 に対応するγ-コノペプチド；配列番号：１２＝Gm6.7に対応するγ-コノペプチ ド；配列番号：１３＝Mr6.1に対応するγ-コノペプチド；配列番号：１４＝Mr6.
2に対応するγ-コノペプチド；配列番号：１５＝Mr6.3に対応するγ-コノペプチ
ド；配列番号：１６＝Tx6.4のプロペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号：１ ７＝Tx6.4のプロペプチド；配列番号：１８＝Tx6.9のプロペプチドをコードする
ＤＮＡ；配列番号：１９＝Tx6.9のプロペプチド；配列番号：２０＝J010のプロ ペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号：２１＝J010のプロペプチド；配列番号
：２２＝Tx6.6のプロペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号：２３＝Tx6.6のプ
ロペプチド；配列番号：２４＝Tx6.5のプロペプチドをコードするＤＮＡ；配列 番号：２５＝Tx6.5のプロペプチド；配列番号：２６＝Gm6.7のプロペプチドをコ
ードするＤＮＡ；配列番号：２７＝Gm6.7のプロペプチド；配列番号：２８＝Mr6
.1のプロペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号：２９＝Mr6.1のプロペプチド ；配列番号：３０＝Mr6.2のプロペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号：３１ ＝Mr6.2のプロペプチド；配列番号：３２＝Mr6.3のプロペプチドをコードするＤ
ＮＡ；配列番号：３３＝Mr6.3のプロペプチド；配列番号：３４＝Tx6.1のプロペ
プチドをコードするＤＮＡ；配列番号：３５＝Tx6.1のプロペプチド；配列番号 ：３６＝Tx6.1に対応するγ−コノペプチド；配列番号：３７＝γ−コノペプチ ドPnVIIAとTx6.4との共通配列；配列番号：３８＝γ−コノペプチドの共通配列 に対する縮重プローブ；配列番号：３９＝γ−コノペプチドの共通配列に対する
縮重プローブ；配列番号：４０＝プロ−γ−コノペプチドの共通配列；配列番号
：４１＝プロ−γ−コノペプチドの共通配列に対する縮重プローブ；配列番号：
４２＝γ−コノペプチドPnVIIA；配列番号：４３＝γ−コノペプチドTxVIIA；配
列番号：４４＝γ−コノペプチドPnVIIAのＮ−末端のトリプシン処理によってで
きたペプチド；配列番号：４５＝γ−コノペプチドPnVIIAのＣ−末端のトリプシ
ン処理によってできたペプチド；配列番号：４６＝コナス・テキスタイル（Conu
s textile）のｃＤＮＡライブラリーからコノペプチドを単離するためのプライ マー；配列番号：４７＝コナス・テキスタイル(Conus textile)のｃＤＮＡライ ブラリーからコノペプチドを単離するためのプライマー。

【００２３】 好ましい具体例の詳細な説明 本発明は、イモガイの毒液中に微量で天然に入手可能である、約２５−４０残
基長の比較的短いペプチド、または該天然に入手可能なペプチドに対するアナロ
グに関し、それらは３つの環化ジスルフィド結合および１またはそれを超えるγ
−カルボキシグルタミン酸残基を含んでいる。 より詳細には、本発明は、前記一般式Ｉ−Ｖを有するコノペプチドに指向され
る。また、本発明は、それらの配列を前記した特異的γ−コノペプチド、PnVIIA
、Tx6.4、Tx6.9、J010、Tx6.6、Tx6.5、Gm6.7、Mr6.1、Mr6.2およびMr6.3にも指
向される。 さらに、本発明は、前記のものおよびγ−コノペプチドTx6.1を含むγ−コノ ペプチドをコードする単離核酸、ならびに該核酸によってコードされる単離プロ
ペプチドにも指向される。本発明のこの態様を表１に掲載する。

【００２４】

【表１】

【００２５】 本発明のコノペプチドは、海馬における癲癇活性（Hoehnら，1993）および心 筋におけるペースメーカー電位(Reuter，1984)のごとき、臨床的に関連する症候
群に関与する脊椎動物における遅延型内向カチオンチャンネルを調節するのに有
用である。したがって、該コノペプチドはニューロンペースメーカー・カチオン
チャンネルのアゴニストとして有用である。 本発明のγ−コノペプチドはコナスの毒液から単離することにより同定する。
別法として、本発明のγ−コノペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いても同定す
る。この方法の同定に従って、種々のコナス種のｃＤＮＡライブラリーを、ペプ
チド共通配列Xaa−Cys−Cys−Ser（配列番号：３７）[式中、XaaはGluまたはGln
である]に対する縮重プローブと慣用技術を用いてスクリーニングする。好適な プローブは、5’SARTGYTGYAGY 3'（配列番号：３８）または5' SARTGYTGYTCN 3'
（配列番号：３９）である。別法として、ｃＤＮＡライブラリーは、プロペプチ
ド共通配列Ile-Leu-Leu-Val-Ala-Ala-Val-Leu（配列番号：４０）に対する縮重 プローブを用いてスクリーニングする。この配列に対して好適なプローブは、5'
ATHYTNYTNGTNGCNGCNGTNYTN 3'（配列番号：４１）である。これらのプローブに
ハイブリダイズするクローンを分析して、最小サイズ要件に合致するもの、すな
わち調べる特異的ｃＤＮＡライブラリーに対するｃＤＮＡクローニングサイトを
フランクするＰＣＲプライマーを用いて決定した（プロペプチドにつき）ほぼ３
００ヌクレオチドを有するクローン、を同定する。ついで、これらの最小−サイ
ズ化されたクローンを配列決定する。ついで、γ−Gluに修飾し得るGlu残基およ
び６個のシステイン残基の存在のごとき、γ−コノペプチドについて前記した特
徴を有するペプチドの存在について該配列を調べる。この方法によって同定した
ペプチドの生物活性を、本明細書中で説明するごとく試験する。

【００２６】 これらのペプチドは、化学合成するのに十分に小さい。前記のコノペプチド・
ペプチドを調製するための一般的な化学合成を、コノペプチドの特異的な化学合
成およびこれらの合成生成物の生物活性の表示と共に本明細書中にて後記する。
これらのコノペプチドの種々のものは、出典明示して本明細書の一部とみなす、
米国特許第4,447,356号（Oliveraら，1984）、第5,514,774号（Oliveraら，1996
）および第5,591,821号（Oliveraら，1997）に記載されている技術を用いて特異
的なコナス種から単離および精製することによって得ることもできる。 本発明のコノペプチドはイモガイから精製することによって得ることができる
が、個々のカイから得ることができるコノペプチドの量は非常に少ないため、目
的の実質的に純粋なコノペプチドは固相戦略を用いる化学合成によって商業的価
値がある量で実際には最良に得る。例えば、単一のイモガイからの収量は、約１
０μｇ以下のコノペプチドとなり得る。“実質的に純粋な”とは、同タイプの他
の生物分子が実質的に存在しないで当該ペプチドが存在し；好ましくは少なくと
も約８５％純粋の量で、好ましくは少なくとも約９５％純粋の量で存在する。生
物活性コノペプチドの化学合成は、もちろん、アミノ酸配列の正確な決定に依存
する。したがって、本発明のコノペプチドは、単離、合成することができ、およ
び／または実質的に純粋とし得る。 該コノペプチドは、当該技術分野でよく知られている組換えＤＮＡ技術によっ
て生成することもできる。かかる技術はSambrookら（1979）によって記載されて
いる。このようにして生成したペプチドを単離し、必要なら還元し、最終分子で
存在させるなら、酸化させて正確なジスルフィド結合を形成させる。

【００２７】 本発明のコノペプチド中にジスルフィド結合を形成させる１つの方法は、冷室
温または室温下にて長期間の直鎖状ペプチドの空気酸化である。この手法により
、実質量の生物活性のジスルフィド結合ペプチドが生成する。酸化したペプチド
は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いて分画して、異な
る結合立体配置を有するペプチドを分離する。その後、これらの画分と天然材料
の溶出とを比較することによってか、または単純アッセイを用いることによって
かのいずれかで、最大生物効力につき正確な結合を有する特定の画分を簡単に決
定する。また、直鎖状ペプチド、または１を超える画分を有する酸化生成物を時
としてイン・ビボ（in vivo)投与に用い得ることも見出す。なぜならば、イン・
ビボで発生する架橋および／または再配列が生物学的に効力のあるコノペプチド
分子を創製することが見出されたからである。しかしながら、より生物効力の低
い他の画分が存在することにより希釈が生じるため、幾分より高用量が必要とな
り得る。 該ペプチドは、完全固相技術、部分固相技術、フラグメント縮合または古典的
な溶液カップリングによるごとく、好適な方法によって合成する。

【００２８】 慣用的な溶液相ペプチド合成においては、構成アミノ酸を目的の配列で伸長す
るペプチド鎖に付加する一連のカップリング反応によってペプチド鎖を調製する
ことができる。種々のカップリング試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミ
ドまたはジイソプロピルカルボニルジイミダゾール、種々の活性エステル、例え
ばＮ−ヒドロキシフタルイミドまたはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのエステ
ルならびに種々の切断試薬を用いて溶液中で反応を行い、つづいて中間体を単離
し精製することは、よく知られた古典的なペプチド法である。古典的な溶液合成
は、文献“Methoden der Organischen Chemie（Houben−Weyl）：Synthese von
Peptiden”（1974）に詳細に記載されている。完全固相合成の技術は、テキスト
ブック“Solid−Phase Peptide Synthesis”（StewartおよびYoung, 1969）に記
載されており、米国特許第4,105,603号（Valeら，1978）の開示によって例示さ れている。合成のフラグメント縮合方法は米国特許第3,972,859号（1976）に例 示されている。他の利用可能な合成は、米国特許第3,842,067号（1974）および 第3,862,925号（1975）によって例示されている。γ-カルボキシグルタミン酸残
基を含有するペプチドの合成は、Rivierら（1987）、Nishiuchiら（1993）およ びZhouら（1996）によって例示されている。コノペプチドの合成は、米国特許第
4,447,356号（Oliveraら，1984）、第5,514,774号（Oliveraら，1996）および第
5,591,821号（Oliveraら，1997）に記載されている。

【００２９】 かかる化学合成の共通点は、種々のアミノ酸基のラービル側鎖基の好適な保護
基での保護であり、それは該基を最終的に除去するまでそのサイトで化学反応が
起こるのを予防するであろう。通常、基がカルボキシル基で反応する間はアミノ
酸またはフラグメント上のα-アミノ基を保護し、つづいてα-アミノ保護基を選
択的に除去してその部分で二次反応を起こさせることも共通点である。したがっ
て、かかる合成における工程として、ラービル側鎖を有する残基の種々のものに
結合した適当な側鎖保護基を有するペプチド鎖中にその目的の配列で位置する各
アミノ酸残基を含む中間化合物が生成することは共通点である。

【００３０】 側鎖アミノ保護基の選択に関する限り、一般的には、合成の間のα-アミノ基 の脱保護の間に除去されないものを選択する。しかしながら、あるアミノ酸、例
えばHisについては、保護は一般的に必要でない。ペプチドの合成に用いるべき 特定の側鎖保護基を選択することにおいては、以下の一般ルールに従う：（ａ）
好ましくは保護基はその保護特性を保持し、カップリング条件下で切り離されな
いこと、（ｂ）合成の各工程でα-アミノ保護基を除去するために選択した反応 条件下で保護基が安定でなければならないこと、および（ｃ）ペプチド鎖を望ま
しくないように変化させない反応条件下で、目的のアミノ酸配列を含む合成の完
了の際に、側鎖保護基が除去可能でなければならないこと。

【００３１】 これらのペプチドの多く、またはその全てでさえ組換えＤＮＡ技術を用いて調
製することが可能であるにちがいない。しかしながら、ペプチドをそのようにし
て調製しない場合には、当該技術分野で知られている他の等価の化学合成も以前
に言及したごとく用い得るが、好ましくはメリフィールドの固相合成を用いてそ
れを調製する。固相合成は、保護α-アミノ酸を好適な樹脂にカップリングさせ ることによってペプチドのＣ−末端から開始する。かかる出発材料は、クロロメ
チル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂に対するエステル結合によってか、ある
いはベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂またはパラメチルベンズヒドリルアミ
ン（ＭＢＨＡ）樹脂に対するアミド結合によって、α−アミノ−保護アミノ酸を
結合させることによって調製することができる。ヒドロキシメチル樹脂の調製は
Bondanskyら（1966）によって記載されている。クロロメチル化樹脂は、Bio Rad
Laboratories社（Rochmond，CA）およびLab.Systems，Inc.社から市販されてい
る。かかる樹脂の調製は、StewartおよびYoung（1969）によって記載されている
。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂支持体は市販されており、一般的には、合成する目
的のポリペプチドがそのＣ−末端に非置換アミドを有する場合に用いられる。し
たがって、固形樹脂支持体は、式：−Ｏ−ＣＨ₂−樹脂支持体、−ＮＨ ＢＨＡ 樹脂支持体、または−ＮＨ−ＭＢＨＡ樹脂支持体を有するもののごとき当該技術
分野で知られているいずれかのものとし得る。非置換アミドが望ましい場合には
、切断によりアミドが直接得られるため、ＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂を使用する
のが好ましい。Ｎ−メチルアミドが望ましい場合には、Ｎ−メチルＢＨＡ樹脂か
らそれを創製することができる。他の置換アミドが望ましい場合には、米国特許
第4,569,967号（Kornreichら，1986）の教示を用いるか、または遊離酸以外の他
の基がＣ−末端に望まれる場合には、Houben−Weylのテキスト（1974）に記載さ
れているごとき古典的方法を用いて該ペプチドを合成することが好ましいかもし
れない。

【００３２】 ＢｏｃまたはＦｍｏｃおよび側鎖保護基によって保護されたＣ−末端アミノ酸
は、適当には、まずHorikiら（1978）に記載の手法に従ってクロロメチル化樹脂
にカップリングすることができ、Ｃ−末端に遊離酸を有するペプチドを合成べき
場合には、約６０℃にて２４時間、攪拌させつつＤＭＦ中のＫＦを用いる。樹脂
支持体に対してＢＯＣ−保護アミノ酸をカップリングさせた後に、塩化メチレン
中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＴＦＡ単独を用いるごときによって、該
α−アミノ保護基を除去する。脱保護は、約０℃と室温との間の温度で行う。ジ
オキサン中のＨＣｌのごとき他の標準的な切断試薬および特異的α−アミノ保護
基を除去するための条件は、SchroderおよびLubke（1965）に記載されているご とく用いることができる。

【００３３】 α−アミノ保護基を除去した後に、残りのα−アミノ−および側鎖−保護アミ
ノ酸を、目的の順序でステップ−ワイズでカップリングさせて本明細書中にて前
記に定義した中間化合物を得るか、あるいは別法として、各アミノ酸を合成中に
別々に付加し、それらのうちの幾つかは固相リアクターに添加する前に互いにカ
ップリングさせ得る。適当なカップリング試薬の選択は、当業者の範囲内にある
。カップリング試薬として特に好適なのは、Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＨｏＢｔまたはＨｏＡｔ存在下のＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ
、ＴＢＴＵ）である。

【００３４】 ペプチドの固相合成に用いる活性化試薬はペプチドの技術分野でよく知られて
いる。好適な活性化試薬の例は、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミドおよび
Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのごときカ ルボジイミドである。他の活性化試薬およびペプチドカップリングにおけるそれ
らの使用は、SchroderおよびLubke（1965）ならびにKapoor（1970）によって記 載されている。

【００３５】 各保護アミノ酸またはアミノ酸配列を約２倍以上の過剰量で固相リアクターに
入れ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：１）の媒質中、また
はＤＭＦもしくはＣＨ₂Ｃｌ₂単独中でカップリングを行うことができる。中間カ
ップリングが生じる場合には、次のアミノ酸のカップリングの前のα−アミノ保
護基を除去する前に、該カップリング手法を反復する。合成の各ステージにおけ
るカップリング反応の成功は、手動で行う場合には、好ましくは、Kaiser（1970
）によって記載されているごとく、ニンヒドリン反応によってモニターする。カ
ップリング反応は、Rivierら（1978）中に報告されているごときプログラムを用
いて、Beckman 990自動合成機のごとき上で自動的に行うことができる。

【００３６】 目的のアミノ酸配列が完成した後に、樹脂からペプチドを切断するのみならず
、すべての残っている側鎖保護基および以前に除去されていなかった場合にはＮ
−末端のα−アミノ保護基をもすべて切断する液体フッ化水素または（Fmoc化学
を用いる場合には）ＴＦＡのごとき試薬を用いた処理によって樹脂支持体から中
間体ペプチドを除去して、遊離酸形態のペプチドを得ることができる。配列中に
Metが存在する場合には、ＨＦを用いて樹脂からペプチドを切断する前に、好ま しくはまずトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／エタンジチオールを用いてＢｏｃ保護
基を除去して、潜在的なＳ−アルキル化を排除する。切断にフッ化水素またはＴ
ＦＡを用いる場合には、アニソール、クレゾール、ジメチルスルフィドおよびメ
チルエチルスルフィドのごとき１またはそれを超えるスカベンジャーを反応容器
に含ませる。

【００３７】 直鎖状ペプチドの環化は、ペプチド−樹脂の一部分の間にペプチドを環化させ
るのとは対照的に、好ましくはCys残基間に結合を創製するように作用する。か かるジスルフィド環化結合に作用させるためには、当該技術分野でよく知られて
いるごとく、アンモノリシスによってヒドロキシルメチル化樹脂またはクロロメ
チル化樹脂支持体から完全に保護されたペプチドを切断して、完全に保護された
アミド中間体を得、その後にこれを適当に環化させ脱保護させることができる。
別法として、脱保護、ならびに前記樹脂またはベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）
樹脂もしくはメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）からのペプチドの切断は
、フッ化水素酸（ＨＦ）またはＴＦＡを用いて０℃にて起こすことができ、つづ
いて前記したごとく酸化する。環化に好適な方法はCartier（1996）によって記 載されている方法である。 本発明のγ-コノトキシンは、海馬における癲癇活性（Hoehnら，1993）および
心筋におけるペースメーカー電位（Reuter，1984）のごとき、臨床的に関連する
症候群に関与する脊椎動物における遅延型内向カチオンチャンネルを調節するの
に有用である、。したがって、該コノペプチドは、ニューロンペースメーカー・
カチオンチャンネルのアゴニストとして有用である。

【００３８】 有効成分として本発明の化合物を含有する医薬組成物は、慣用的な医薬混合技
術に従って調製することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Scien
ces,第１８版（1990，Mack Publishing Co．社，Easton，PA）を参照されたし。
典型的には、アンタゴニスト量の有効成分を医薬上許容される担体と混合する。
該担体は、投与、例えば静脈内、経口または非経口に望ましい形態の調製物に依
存して広範な種々の形態をとることができる。さらに、該組成物は、抗酸化剤、
安定化剤、保存剤なども含み得る。

【００３９】 蛍光投与については、該化合物は、カプセル剤、丸薬、錠剤、トローチ剤、融
剤、粉末剤、懸濁剤または乳剤のごとき固形または液体の調製物に処方化し得る
。経口投与量形態に組成物の調製においては、（例えば、懸濁剤、エリクシル剤
および溶液剤のごとき）経口液体調製物の場合には、例えば水、グリコール、油
剤、アルコール、賦香剤、保存剤、着色剤、懸濁化剤などのごときいずれの通常
の医薬媒質をも用いることができ；あるいは（例えば、粉末剤、カプセル剤およ
び錠剤のごとき）経口固形調製物の場合には、デンプン、砂糖、希釈剤、顆粒化
剤、潤沢剤、結合剤、崩壊剤などのごとき担体を用いることができる。投与にお
けるそれらの簡便性のため、錠剤およびカプセル剤は最も有利な経口投与量ユニ
ット形態を示し、この場合においては固形医薬担体を明らかに用いる。望なら、
錠剤は標準的な技術によって糖衣または腸溶性コートとし得る。有効剤をカプセ
ル化して胃腸管を通過するようにそれを安定にし、同時に血液脳関門を通過させ
ることができる。例えばＷＯ96／11698号を参照されたし。

【００４０】 経口投与については、該化合物を医薬担体に溶解し、溶液または懸濁液のいず
れかとして投与することができる。好適な担体の例示は、水、塩類溶液、デキス
トロース溶液、フラクトース溶液、エタノール、または動物油、植物油もしくは
合成油である。該担体には、他の成分、例えば保存剤、懸濁化剤、可溶化剤、緩
衝液なども含ませることができる。化合物を包膜内投与する場合には、それを髄
液に溶解することもできる。 コノペプチドは、ニューロンペースメーカー・カルシウムチャンネルを作動す
るのに十分な量で投与する。コノペプチドがこのアゴニスト作用を発揮する投与
量範囲は、治療する特定の症状、患者の症状の重度、患者、投与する特異的コノ
ペプチド、投与経路ならびに患者における他の存在する疾病状態の存在に依存し
て、広く変動し得る。典型的には、本発明のコノペプチドは約０.０５ｍｇ／ｋ ｇないし約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０.１ｍｇ/ｋｇないし約１００ｍｇ
／ｋｇの有効成分の投与量範囲でその治療効果を発揮する。好適な投与量は、一
日当たり複数の準用量で投与することができる。典型的には、用量または準用量
は、ユニット投与量形当たりに約０.１ｍｇないし約５００ｍｇの有効成分を含 み得る。より好ましい投与量は、ユニット投与量形当たり、約０.５ｍｇないし 約１００ｍｇの有効成分を含有するであろう。一般的に、投与量はより低いレベ
ルで開始し、目的の効果が達成されるまで増加させる。

【００４１】 実施例 本発明を以下の実施例に参照して説明するが、これは説明目的で供されるもの
であって、如何なる場合においても本発明を限定することを意図するものではな
い。当該技術分野でよく知られた標準技術または特異的に後記する技術を用いた
。 実施例１ 実験手法 トキシンおよびバイオアッセイ コナス・ペナセウス（Conus pennaceus）の毒 液は、Northern Red Seaで収集された標本から得た。コノトキシン−TxVIIAは毒
液−精製アリコットからのものであった（Fainzilberら，1991）。カサガイ（Pe
tella caerulea）、二枚貝（Mytilus edulis）および魚（Gambusia affinis）に
おける麻痺に関するアッセイは、以前に記載されているごとく行った（Fainzilb
erら，1995）。

【００４２】 カラムクロマトグラフィー コナス・ペナセウス（Conus pennaceus）の毒液は 、以前に記載されているごとく（Fainzilberら，1994）抽出し、セファデックス
（Sephadex）Ｇ−５０（Pharmacia社製）および半分取型Ｃ１８（Vydac社製）カ
ラム上で分画した。有効ペプチドの最終精製は、HP 300 Chemstation Software に結合したHewlett−Packard 1040Aダイオードアレイディテクターを用いたピー
ク純度のオン−ライン・スペクトル分析で、図１に説明するごとくワイド−ポア
（wide-pore）逆相フェニル（Vydac社製，25×0.46cm，0.5μｍ粒子サイズ）上 で行った。 アミノ酸分析 酸加水分解および９−フルオレニルメチル−オキシカルボニル−
クロリド（ＦＭＯＣ）誘導化後のアミノ酸組成の分析は、BetnerおよびFoldi（1
988）に従って、Merck−Hitachi逆相ＨＰＬＣシステム上で行った。当該システ ムは、各分析の前にＦＭＯＣ−アミノ酸標準で較正した。

【００４３】 還元およびアルキル化の還元 乾燥した精製ペプチドを６Ｍのグアニジン−ＨＣ
ｌおよび１０μＭのＥＤＴＡを含有する０.１ＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃（ｐＨ８）５０ μｌに溶解し、アルゴン下、２００μｇのＤ１ｌで３７℃にて２時間還元した。
４−ビニルピリジンまたはヨード酢酸またはヨードアセトアミドを添加し、その
混合物をアルゴン下、３７℃にて１.５時間インキュベートした。アルキル化ペ プチド試料は、誘導化した直後に、逆相ＨＰＬＣ上で精製した。 エドマン分解分析 逆相精製したペプチドを、ＰＶＤＦまたはガラスファイバー
フィルターに適用し、Applied Biosystems 475A気相タンパク質配列決定系で自 動化エドマン分解によって配列決定した。 タンパク質加水分解消化 還元しアルキル化したペプチドのＨＰＬＣ精製した試
料を、ＴＰＣＫ−トリプシン（Pierce社製，Rockford，IL）を用いて３７℃にて
２０時間消化した。一部分の消化物をＬＣＩＥＳＩ／ＭＳによって直接分析し、
残りを逆相ＨＰＬＣによって精製した。極度の酸性条件下におけるγ−カルボキ
シグルタミン酸分解の可能性を最小限化するために、ＨＰＬＣ上に負荷する前に
消化物のｐＨを３.０に調整した。精製Ｃ−末端ペプチドフラグメントをエンド プロテイナーゼAsp−N（Boehringer−Mannheim社製，Indianapolis，IN）によっ
て３７℃にて２０時間さらに消化し、直ちに逆相ＨＰＬＣ上で精製した。ついで
、精製したAsp−Nペプチドの一部分をLSI CID質量分析用にメチル化した。

【００４４】 質量分析 マイクロボア（microbore）ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ実験は、６０分間の ０.１％ＴＦＡ中の２−６２％のアセトニトリルの線形グラジエントを用いてＣ １８カラム（マクロスフェアＣ１８、５μｍ粒子サイズ、１×２５０ｍｍ、Allt
ech社製，Deerfield，IL）を用いてVG／Fisons（Manchester，U．K.）プラット フォーム・質量分析機上で行った。メイクアップ溶媒のポストカラム添加、２−
プロパノール／２−メトキシエタノール（１：１）を用いて、スプレーおよびイ
オン化性能を最適化した（Medzihradszkyら，1994）。高エネルギーＣＩＤ質量 スペクトルは、連続流動液体二次イオン化源および走査電荷結合デバイスアレイ
ディテクター（Burlingame，1994）を備えたKratos（Manchester，U.K.）Concep
t IIHHタンデム質量分析機で得た。

【００４５】 電気生理学 単離したリムナエ（Lymnaea）の後背神経節ニューロンをペトリ皿 （Costar社製）中に維持し、Hepes緩衝化塩類溶液（ｍＭで：ＮａＣｌ ３０、 ＮａＣＨ₃ＳＯ₄ １０、ＮａＨＣＯ₃ ５、ＫＣｌ １.７、ＣａＣｌ₂ ４、Ｍ ｇＣｌ₂ １.５、ＨＥＰＥＳ １０；ＮａＯＨでｐＨ７.８に設定した）中に浸 した（bath）。カルシウム、ナトリウムまたはカリウムの電流を記録するために
、適当な塩類溶液によって連続灌流下でＨＢＳを置換えた。特異的電流を選択的
に記録するために用いた細胞外およびピペット溶液の組成は、以下のごとくであ
った（ｍＭで）：細胞外Ｉ_Ca塩類溶液：ＴＥＡＣｌ ４０、ＣａＣｌ₂ ４、Ｈ ＥＰＥＳ １０、４−アミノピリジン ２、ＴＥＡＯＨでｐＨ７.８に設定；細 胞外Ｉ_Na塩類溶液：ＮａＣｌ ４７.５、ＣａＣｌ ４、ＭｇＣｌ １、ＨＥＰ ＥＳ １０、ＣｄＣｌ ０.１、４−アミノピリジン １、ＮａＯＨでｐＨ７.８
に設定；ピペット塩類溶液（Ｉ_CaおよびＩ_Na）：ＣｓＣｌ ２９、ＣａＣｌ₂ ２.３、ＨＥＰＥＳ １０、ＥＧＴＡ １１、ＡＴＰＭｇ ２、ＧＴＰトリス ０
.１、ＣｓＯＨでｐＨ７.４に調整；ピペット塩類溶液（非−選択的）：ＫＣｌ
２９、ＣａＣｌ₂ ２.３、ＨＥＰＥＳ １０、ＥＧＴＡ １１、ＡＴＰＭｇ ２
、ＧＴＰトリス ０.１、ＫＯＨでｐＨ７.４に調整。トキシンは、記録したセル
から〜１００μＭで設置した小ガラスピペット（チップ径２０μＭ）を通した研
究室作製圧力放出系によって投与した。これにより、ボルテージランプの間また
は一連の脱分極ボルテージ工程の間に連続して適用するトキシンの迅速な適用が
可能となった。

【００４６】 膜電位測定は、ブリッジ・バランスモードでAxoclamp 2A（Axon Instr.社製 ，Foster City，IA）増幅器を用いて０.５ＭのＫＣｌ（４０ＭΩ）を満たした鋭
利な微小電極を用いて行った。全細胞ボルテージクランプ実験は、連続単一電極
ボルテージクランプモードでAxoclamp 2A増幅器を用いて行った。ピペット（２-
６ＭΩ）は、Clark GC-150T glass（Clark ElectromedicalInstruments社製，U.
K.）（シール抵抗＞１ＧΩ）からのFlaming／Brown P-87（Sutter Instruments 社製，CO）水平微小電極プラー上にはめた。パッチ膜シリーズの破壊後に、抵抗
（＜１０ＭΩ）を--８０％に補償した。＜５ｎＡの電流の大きさでは、最大ボル
テージ誤差は＜１０ｍＶであると概算される。細胞キャパシタンス（〜１００ｐ
Ｆ）は補償しなかった。カルシウムまたはナトリウム電流の測定は、ピペット溶
液で平衡化させるために、細胞にアクセスして２０分後に開始した。データ収集
は、本発明者らの研究室で開発したボルテージクランプ・ソフトウェアではしる
、Intel 80486-ベースのコンピュータに接続したＣＥＤ ＡＤ／ＤＡコンバータ （Cambridge Electronics Design社製，Cambridge，U.K.）によって制御した。 電流記録は１−５ｋＨｚで濾過し、１ｋＨｚ（カルシウム電流およびＫ＋電流）
または３ｋＨｚ（Ｎａ＋電流）でサンプリングし、オン−ラインで保存した。こ
のシステムにより、ボルテージ−工程、最新記録の収集およびトキシンの一定時
間の適用を同時に適用することが可能となった。

【００４７】 実施例２ γ−コノトキシンPnVIIAの精製 コナス・ペナセウス（Conus pennaceus）の毒液を方法で説明したごとく分画 し、画分を含有する逆相ペプチドをMALDI質量分析の陽イオン−対−陰イオンモ ードの比較を用いてγGlu含量につきアッセイした（Nakamuraら，1996）。Fainz
ilberら（1994）の図１ＢにPnVIIとして示す陽性画分を逆相フェニルクロマトグ
ラフィーによって再精製し、コノトキシン−PnVIIAを主成分として得た。最終ク
ロマトグラフィー工程のオン−ライン・スペクトル分析は、精製したトキシンの
均一性を示唆した。精製したペプチドのＥＳＩ／ＭＳ測定は3718.4の単一の質量
を明らかにし、PnVIIAの均一性をさらに確認した。

【００４８】 実施例３ γ−コノトキシンPnVIIAの化学的特徴付け ４−ビニルピリジンを用いたアルキル化後のPnVIIAの自動化エドマン配列決定
により、３０残基の明瞭でない割当てを許容する３２のアミノ酸配列が明かとな
った（Table 2）。工程１４および２６におけるGluの極めて低い収率は、これら
のポジションにγ−カルボキシグルタミン酸残基が存在することをさらに示唆し
た。アミノ酸組成分析（表３）は提唱した配列（表４）と一致し、ＥＳＩ／ＭＳ
測定は２つのγ−カルボキシグルタミン酸残基、３つのジスルフィド架橋および
遊離カルボキシ末端を想定する配列（測定質量3718.4、予想質量3719.0）から予
想されたものに合致する。

【００４９】

【表２】

【００５０】

【表３】

【００５１】

【表４】

【００５２】 γ−カルボキシグルタミン酸の存在を確かめ、Ｃ−末端を決定するために、ペ
プチドを質量分析によってさらに分析した。還元およびカルボキシメチル化した
PnVIIAのトリプシン消化により、２種類のペプチド、Ｔ１およびＴ２を得、ＥＳ
Ｉ／ＭＳによるそれらの平均分子量は、各々１０２９.０および３０６２.６であ
った。これらの質量は、２種のPnVIIAトリプシン処理ペプチドについて予想され
たもの、すなわち配列DXTSWFGR（配列番号：４４）[式中、Xはカルボキシメチル
Cysである]についての１０２９.１、配列XTVNSX₁XXSNSXDQTYXX₁LYAFX₂S（配列番
号：４５）[式中、X₁はγ−カルボキシグルタミン酸であって、X₂は４−トラン ス−ヒドロキシプロリンである]についての３０６２.２に適合した。Ｃ−末端ト
リプシン処理ペプチドＴ２のAsp−N消化により２つの生成物、ＡＮ１およびＡＮ
２が得られた。ＡＮ１についてのＥＳＩ／ＭＳ平均質量は１５２５.４であり、A
sp−NフラグメントXTVNSX₁XXSNSX（配列番号：４５の残基１−１２；予想１５２
５.６）の予想質量に適合した。Ｃ−末端フラグメントＡＮ２についてのモノア イソトープＬＳＩ／ＭＳ測定した質量は１５５３.７であり、Ｃ−末端が遊離酸 であると想定した計算値と一致した。ＬＳＩタンデムＭＳによりPnVIIAのＣ−末
端配列をさらに確認する試行は失敗した。おそらくはＡＮ２の低いイオン化効率
に起因する。したがって、カルボキシメチル化ペプチドよりも良好なＣＩＤスペ
クトルを有する誘導体を創製すると予想される手法である、PnVIIAを還元し、ヨ
ードアセトアミドでアルキル化した。トリプシンにつづくAsp−N消化の後に、Ｃ
−末端カルバモイルメチル化ペプチドＡＮ２ｕを単離した。ＨＣｌ／ＭｅＯＨを
用いたメチル化により、１６０８.９のモノアイソトープＬＳＩ／ＭＳ質量を有 するテトラエステルを得た。この質量は、４つのメチル基--Aspの側鎖に存在す る１つ、γ-カルボキシグルタミン酸のカルボキシル基に存在する２つ、および 予想Ｃ-末端遊離カルボキシル（予想モノアイソトープ質量１６０８.７）に存在
する４番目のもの、を取込んだペプチドに適合する。プロトン化テトラ−メチル
化ＡＮ２ｕをＣＩＤ質量分析によってさらに分析し、Ｃ−末端配列のすべての詳
細を確認するスペクトルを得た。γ−カルボキシグルタミン酸残基は、ｍ／ｚ１
７４のインモニウム・イオンによって明らかに示され、ｂ５およびｂ６分子イオ
ンによってそのポジションが明かとなった。ｙ２イオンにより、PnVIIAの遊離カ
ルボキシ末端由来の−Hyp−Ser−OMeのＣ−末端構造が確認された。したがって 、修飾残基γ−カルボキシグルタミン酸およびHypを含有するペプチドの配列が 確認され；遊離カルボキシ末端が質量分析によって確立された。 PnVIIAは、ωおよびδコノトキシンのシステイン・フレームワークを有する大
きな群のコノトキシンに属するが、配列はコノトキシン−TxVIIAに最も相同性が
高い（表４）。これらのホモロジーは、最も疎水性および幾分かの荷電残基のポ
ジションならびに１つのγ−カルボキシグルタミン酸を含む、ほぼ４８％のアミ
ノ酸同一性および６３％の類似性を含む。

【００５３】 実施例４ γ−コノトキシンPnVIIAの生物活性 PnVIIAの麻痺活性 カサガイ（Patella）に対するPnVIIAの最初の注射はこのバ イオアッセイでTxVIIAおよび他のコノトキシンにつき以前に認められた収縮性麻
痺（Fainzilberら，1991）は表れなかったが、５０ピコモル／１００ｍｇ体重を
超える用量では、脚部筋肉組織の幾分かの弛緩を認めることができた。弛緩また
は緩和麻痺効果は、二枚貝軟体動物に対するバイオアッセイでより容易に見出さ
れ、したがって、PnVIIAの毒性は、コノトキシンPnIVAおよびPnIVBについて以前
に行われたごとく（Fainzilberら，1995）、淡水性イシガイ（Mytilus）におけ るバイオアッセイで定量化した。Mytilus麻痺についてのＥＤ₅₀は６３.２ピコモ
ル／１００ｍｇ体重であった。カダヤシ（Gambusia fish）またはハエ（Sarcoph
aga）の幼虫において、１ナノモル（MytilusのＥＤ₅₀よりも１５倍高い）／１０
０ｍｇ体重のPnVEAを注射した際には毒性または他の効果を全く認めることがで きなかった。興味深いことには、脱カルボキシル化PnVIIAは天然ペプチドのＥＤ ₅₀ の５倍にのぼる用量でミチルス（Mytilus）に対して何ら認識できる効果を有 していなかった。

【００５４】 リムナエ（Lymnaea）神経内分泌細胞に対するPnVIIAの電気生理学的効果 PnVII
Aの効果は、まず多くの軟体動物または脊椎動物の電気生理学的調製物でスクリ ーニングした。巻貝リムナエ・スタグナリス（Lymnaea stagnalis）からの後背 神経節ニューロン上で一致した効果が認められ、したがって、この系をトキシン
活性に対する詳細な研究に用いた。後背神経節ニューロンは産卵ホルモンの産生
に寄与する典型的な律動性バースト細胞であり、そのイオン電流は広範に特徴付
けされている（Brussaardら，1991；DreijerおよびKits，1995；KitsおよびMans
velder，1996）。第１の一連の実験においては、電流クランプ下で記録した後背
神経節ニューロンにPnVIIAを適用し、膜電位および活動電位の発火（firing）に
対する効果を調べた。PnVIIAは用量依存性でこれらの細胞の興奮性を高めること
が見出された。したがって、マイクロモル用量のPnVIIAを適用した際の脱分極お
よび反復スパイク（repetitive spiking）を含む、後背神経節細胞（ＣＤＣ）の
興奮性における用量依存性の上昇が認められた。脱分極によって低用量（＜１μ
Ｍ）のトキシンにサイレントに応答した細胞は、一方で１０μＭ以上の用量では
一続きの活動電位を誘導した。活動電位の数は用量が増加するにしたがって増加
した。PnVIIA適用の期間も、応答に顕著に影響した。活動電位のバーストで応答
するサイレントな細胞においては、活動電位の数およびバーストの期間がPnVIIA
パルスの期間が増すにつれて増加した。したがって、適用の期間が増加するに従
ってスパイクの期間が増大することを示す、サイレントなCDCにおけるPnVIIAの 興奮性効果の時間依存性が認められた。細胞は、発火頻度における一時的な増大
、つづくその間は当該細胞が短時間発火を停止するバースト後過分極によって自
発的に活性に応答した。これらの状況下でPnVIIA適用の期間を増大させると、バ
ーストの期間における増加に通じるが、バースト後サイレント不応期の期間にお
いてはいっそうそのようになる。したがって、スパイクが増加するのみならず、
適用が長くなるにつれてバースト後の後のサイレント期の期間も増大することも
示す、自発性の活性ＣＤＣにおけるPnVIIAの興奮性効果の時間依存性が認められ
た。後者の効果は、トキシンによって誘導された発火頻度の増大からの自然な結
果であるので、おそらくは間接的である。

【００５５】 該効果がイオンチャンネルの閉孔（遮断）によるものかまたは開口（活性化）
によるものかは、過分極電流パルス（３０μＡ）を注入した際の細胞膜の入力抵
抗を測定することによって調べた。得られた過分極の増幅は、膜抵抗の直接的な
測定である。この実験においては、過分極電流のパルスをＣＤＣに注入して、膜
電位の過分極を生じさせた。注入電流は一定であったが、過分極応答はPnVIIA適
用の際に低下し、膜抵抗が低下する、言い換えると、膜コンダクタンスが増大す
ることを示した。PnVIIA適用の間は過分極増幅が強く低下する（〜５０％減衰）
ことが示され、したがって、これは、膜抵抗における顕著な低下を明らかにして
いる。したがって、PnVIIAは伝導における上昇を誘導し、すなわちイオンチャン
ネルの開口に通じ、したがってチャンネルブロッカーというよりもむしろ、チャ
ンネル・アゴニストまたはアクチベーターとして主に作用する。

【００５６】 さらなる一連の実験においては、PnVIIAによって活性化されたチャンネル（群
）の同一性を調べた。このために、全細胞ボルテージ・クランプ実験を後背神経
節ニューロンに対して行ったが、標準的なボルテージ工程プロトコールで活性化
した即時型のボルテージ・ゲートナトリウムまたはカルシウム電流に対しても、
カルシウム電流に対してもトキシンの一貫した効果は何ら認めることができなか
った。ついで、遅延型ランプ・プロトコールを適用して、自発的発火の基礎をな
すと考えられている遅延型ボルテージゲート電流（ペースメーカー電流とも命名
されている）に対する可能な効果を調べた。この実験においては、電流は標準Ｈ
ＢＳでボルテージランプ・プロトコールに応答し、その間に、膜電位がｍＶ／ｓ
（対照）の速度で-８０から＋２０ｍＶになることが測定された。このプロトコ ールは、遅延型ボルテージランプの間に即時型電流が不活性化されるので、遅延
型のボルテージゲート電流のみを明らかにしているであろう。内向電流は〜−３
０ｍＶおよびよりプラスで活性化される。もっともらしくは、これがペースメー
カー電流を表している。１０μＭのPnVIIA（１０μＭ）では、ボルテージ依存性
は左側にシフトする（すなわち、電流は、より過分極した電位ですでに活性化し
ている）。さらに、＞〜０ｍＶの内向電流における上昇が発生する。したがって
、該実験は、非活性化内向電流が〜３０ｍＶを超えるボルテージでボルテージラ
ンプ・プロトコールに活性化されることを示した。予備的な実験は、この内向電
流がＮａ⁺フリーの選択塩類溶液で低下し、１ｍＭのＮｉ²⁺で完全に遮断される 非特異的カチオン電流であることを示している。したがって、もっともらしくは
、Ｎａ⁺およびＣａ²⁺が内向電流を運搬する。ボルテージ依存性およびイオン選 択性において、この電流は、van SoestおよびKits（1997）によって詳しく記載 された他のリムナエ（Lymnaea）ニューロンにおけるペースメーカー電流に酷似 している。１０μＭのPnVIIAの存在下では、二重の効果が認められた。１番目に
、遅延型内向電流の活性化範囲はよりマイナスの電位に〜１０ｍＶシフトし、し
たがって、細胞の興奮性の上昇を説明した。２番目に、本発明者らは〜０ｍＶよ
りも高い電位における非不活性内向電流における上昇を知見した。後者がPnVIIA
の直接的な効果なのか、または上昇した内向電流による間接的な効果なのかは決
定すべきままである。しかしながら、それは電流クランプ条件下におけるバース
ト後過分極の以前に認められた延長と一致する。これらのデータは、リムナエ（
Lymnaea）後背神経節ニューロンに対するPnVIIAの興奮効果を媒介する主たる事 象が遅延型のボルテージ活性化内向カチオンチャンネルの上昇であることを示し
ている。

【００５７】 実施例５ コナス・テキスタイル（Conus textile）からのγ−コノトキシンTx6.4の単離 コナス・テキスタイルｃＤＮＡライブラリーは、従来の技術を用いて毒液管か
ら調製した。単一クローンからのＤＮＡは、Ｍ１３ユニバーサル・プライミング
サイトおよびＭ１３リバース・ユニバーサル・プライミングサイトにほぼ対応す
るプライマーを用いて従来の技術によって増幅させた。用いたプライマーは： 5'-TTTCCCAGTCACGACGTT-3'（配列番号：４６）および 5'-CACACAGGAAACAGCTATG-3'（配列番号：４７）であった。 ほぼ３００ヌクレオチドのサイズを有するクローンを配列決定し、PnVIIAおよび
TxVIIAに対する配列における類似性についてスクリーニングした。単離したＤＮ
Ａは配列番号：１６に記載する配列を有し、これは配列番号：１７に記載するプ
ロペプチド配列をコードしていた。この新たなγ−コノトキシンは前記し、配列
番号：７に記載の配列を有する。好ましくは、Xaa₁はTrpであり、Xaa₂はγ−Glu
であってXaa₃はHypである。Ｃ−末端は、好ましくは遊離ヒドロキシル基を含む 。

【００５８】 実施例６ γ−コノペプチドの単離 実施例５の手法に従って、γ−コノペプチドをコードするさらなる核酸を単離
した。単離した核酸は、配列番号：１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０
、３２および３４に記載のヌクレオチド配列を有していた。これらの核酸は、各
々、配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５に
記載のアミノ酸配列を有するプロペプチドをコードしていた。成熟ペプチド配列
を配列番号：８−１５および３６に記載する。

【００５９】 実施例７ γ−コノトキシンTxVIIAの生物活性 アプリシア・オクリフェラ（Aplysia oculifera）のプレウロペダル（pleurop
edal）神経節からの単離内側（Kehoe，1972）を、以前に記載されているごとく 培養した（SchacherおよびProshansky，1983）。該ニューロンは、非常に低密度
で培養して、それらの中のいずれの可能なシナプス相互作用も予防した。培養ニ
ューロンの受動的および能動的な膜特性は、従来の細胞内の記録および刺激技術
を用いて実験した。簡単には、培養ニューロンの細胞体を２ＭのＫＣｌ（５−１
０ＭΩ抵抗）で満たした２つの微小電極（１つは電流注入用であってもう１つは
ボルテージ記録用である）によって突き刺した。静止電位、入力抵抗、および活
動電位の増幅および形状の分析は、４６０ｎＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、
１１ｍＭのＣａＣｌ₂、５５ｍＭのＭｇＣｌ₂および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ
７.６よりなる人工海水中で行った。電気生理学的実験用の毒液画分を、１０ｍ ｇ／ｍｌ牛血清アルブミンを含有する人工海水に溶解した。セファデックス（Se
phadex^TM）Ｇ−５０の画分を１００−２００μｇ／ｍｌであって０.２５−０.５
μＭの最終濃度の精製トキシンで適用した。

【００６０】 毒液画分および精製トキシンの単離アプリシア（Aplysia）のニューロンに対 する効果は、静止電位、入力抵抗および活動電位の増幅および形状を測定するこ
とによって特徴付けた。セファデックスＧ−５０カラムからのＶｔ画分（Ｇ−５
０−Ｖｔ）（Fainzilberら，1991）および精製トキシンは、各々、１００μｇ／
ｍｌおよび０.２５−０.５μＭの濃度で顕著な効果を表した。Ｇ−５０−Ｖｔ、
ＴｘＩＡおよびＴｘＩＢの効果は、Fainzilberら（1991）と本質的に同様であっ
た。これらの画分は５−１２ｍＶの一過性の膜脱分極を４０−１２０秒の間誘導
した。トキシンを浸漬適用した後３−３０秒以内に、静止ニューロンが自発的に
発火した。付随的に、活動電位期間が１から２桁増大し、多くの実験で１秒を超
えるまで延長した。延長した活動電位は、典型的には延長したショルダーを有す
る初期スパイクからなる。浸漬溶液中にトキシンが連続して存在する場合には、
該活動電位期間は徐々に回復する。トキシン適用後２０−３０分には、該活動電
位期間は対照におけるよりも５０−１００％しか長くなかった。この期間全体を
通して、活動電位開始の閾値は低下した。トキシンによって誘導された膜興奮性
および活動電位期間における変化は、ニューロンを人工海水で洗浄すると完全に
可逆性であった。活動電位期間のTxI−誘導した延長は、Ｃａ²⁺およびＫ⁺のコン
ダクタンスを遮断した場合にも認められた（Ｃａ²⁺フリーの人工海水、１６ｍＭ
のＣａ²⁺および５０ｍＭのテトラエチルアンモニウム、１５０μＭの３，４−ジ
アミノピリジンおよび１０ｎＭのＣｓ⁺）。これらの条件下でテトロドトキシン （１０μＭ）を添加すると、TxI−誘導スパイク延長が低下した。TxVIIAは、膜 脱分極および反復発火を含む、単離ニューロンの膜特性に対して同様の効果を誘
導した。しかしながら、TxVIIAは活動電位期間におけるいずれの上昇も引き起こ
さなかった。

【００６１】 PnVIIAのアミノ酸配列は６個のシステイン、ωおよびδコノトキシンの典型的
な４個のループフレームワークC...C...CC...C...Cを保存しており、表４に示す
ごとく、コナス・テキスタイル（Conus textile）の毒液からの興奮性トキシン であるコノトキシン−TxVIIAの配列（Fainziberら，1991；Nakamuraら，1996） に最も相同性が高かった。これらのトキシンの双方は、同一で極めて酸性の正味
荷電（−５）を有し、逆相クロマトグラフィーにおける比較回避（elusion）特 性によって明らかとなったように、それらの表面の疎水性／親水性相互作用特性
において同様であった。さらに、それらのそれぞれの感受性系（アプリシア（Ap
lysia）対リムナエ（Lymnaea）のニューロン）におけるこれらのトキシンの増殖
効果は非常に酷似し、興奮性の低下した膜抵抗の上昇および上昇した反復発火を
含む。したがって、PnVIIAおよびTxVIIAは同一ファミリーの密接に関連するメン
バー、または密接に関連した受容体／チャンネル標的への収斂進化を表している
のかもしれない。

【００６２】 TxVIIAおよびPnVIIAの各々のバイオアッセイにおけるそれら双方の癲癇活性は
、γGlu残基を脱カルボキシル化した際に顕著に低下した。哺乳動物のビタミン Ｋ−依存性血液凝固タンパク質および軟体動物コナントキンにおけるγGlu−金 属錯体の一次構造の重要性はよく確立されているが（Freedmanら，1995；Skjaer
baekら，1997）、例えば膜結合性における個々のγGlu残基の機能的役割のプロ トロンビンにおいても証拠が存在する（Ratcliffeら，1993）。コノトキンTxVII
AおよびγPnVIIAの３次元構造は３つのジスルフィド結合によっておそらくは指 向化され安定化されているが、一般的にコノトキシンにおいては、本発明者らは
γGlu残基の二次微小構造の役割をこのステージで除外することができなかった 。しかしながら、魅力的な仮説は、これらのペプチド中のγGlu残基が他の可変 残基（表４）と膜または受容体認識パッチの一部分を形成して、チャンネルのイ
ソ型またはサブタイプに対する特異的な認識を供しているということである。構
造的に関係するコノトキシンにおける超可変性は、受容体サブタイプに対するこ
れらのペプチドの精妙な選択性のよく確立されたメディエーターである（Myers ら，1993；Nielsenら，1996）。

【００６３】 本発明の方法および組成物を種々の具体例の形態で取込めることができ、その
うちのほんのわずかを開示したにすぎないことは理解されるであろう。他の具体
例が存在し、本発明の趣旨から逸脱しないことは当業者に明らかであろう。した
がって、記載する具体例は例示であって、限定を意図するものでは断じてない。

【００６４】 参考文献のリスト Betner, I.およびFoldi, P. (1986). Chromatographia 22:38l−387. Bodanskyら，(1966). Chem. Ind. 38:1597-98. Brussaard, A.B.ら，(1991). J. Physiol. 441:385−404. Burlingame, A.L. (1994). In Biological Mass Spectrometry, Present and Future (Matquo, T.ら編）pp.147-164, Wiley, Chichester. Cartier, G.E.ら,（1996). J. Biol. Chem. 271:7522-7528. Cruz, L.J.ら, (1976). Verliger l8:302-308. Cruz, L.J.ら, (1987). Conus geographus toxins that discriminate between neuronal and muscle sodium channels. J. Biol. Chem. 260:9280-9288. Dreijer, A.M.およびKits, K.S. (1995). Neuroscience 64:787-800. Fainzilber, M.ら，(1991). Eur. J. Biochem. 202:589-596. Fainzilber, M. ら，(1994). J. Biol. Chem. 269:2574-2580. Fainzilber, M.ら, (1994). Biochemistry 33:9523-9529. Fainzilber M.ら, (1995). J. Biol. Chem. 270:1123-1129. Fainzilber M.ら, (1995). Biochemistry 34:8649-8656. Freedman, S.J., Furie, B.C,, Furie, B.およびBaleja J.D. (1995). Biochemisty 35:12126-12137. Haack, J.A.ら, (1990). Contryphan‐T：a gamma-carboxyglutamate containing peptide with N-methyl-d-aspartate antagonist activity. J. Biol. Chem. 265:6025-6029. Hoehn, K., Watson, T.W.J.および MacVicar, B.A. (1993). Neuron 10: 543-552. Horiki, K.ら, (1978). Chemistry Letters 165-68. Kaiserら, (1970). Anal. Biochem. 34:595. Kapoor (1970). J. Pharm. Sci. 59:1-27. Kits, K.S.およびMansvelder H.D. (1996). Invertebrate Neuroscience 2:9-34. Kornreich, W,D.ら, (1986). 米国特許第4,569,967号 Madzihradszky, K.F.ら, (1994). J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5:350-358. Mena, E.E.ら, (1990). Contryphan-G: a novel peptide antagonist to the N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) receptor. Neurosci. Lett. 118:241-244.
Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden, E. Wunsch(編), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Ger. (1974). Myers, R.A., Ctuz, L.J., Rivier, J.およびOlivera, B.M. (1993). Chem, Rev. 93, 1923-36. Nakamura, T.ら, (1996). Protein Science 5:524-530. Nielsen, K,J., Thomas, L., Lewis, R.J., Alewood, P.F., Craik, D.J. (1996). J. Mol. Biol. 263:297-310. Nishiuchi, Y.ら, (1993). Synthesis of gamma-carboxyglutamic acid-containing peptides by the Boc strategy. lnt. J. Pept. Protein Res. 42:533-538. O1ivera, B.M.ら，(1984). 米国特許第4,447,356号 Olivera, B.M.ら, (1985). Peptide neurotoxins from fish-hunting cone snails. Science 230:1338-1343. Olivera, B.M.ら,(1996). 米国特許第5,514,774号 Olivera, B.M.ら,(1997). 米国特許第5,591,821号 Partridge, L.D.およびSwandulla, D. (1988). Trends Neurosci. 11;69-72. Ratcliffe, J.V., Furie, B., Furie, B.C. (1993). J. Biol. Chem. 268: 24339-24345. Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1985). Rivier, J.R. ら, (1978). Biopolymers 17:1927-38. Rivier, J.R, ら, (1987). Total synthesis and further characterization of the gamma-carboxyglutamate-containing `sleeper` peptide from Conus geographus. Biochem. 26:8508-8512. Robertsら, (1983). The Peptids 5:342-429. Reuter, H. (1984). Annual Rev. Physiol. 46:473-484. Sambrook, J. ら, (1979). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. SchroderおよびLubke (1965). The Peptides 1:72-75, Academic Press, NY. Skjaerbaek, N., Nielsen, K.J., Lewis, R.J., Alewood, P., Craik, D.J. (1997). J. Biol. Chem. 272:291-2299. StewartおよびYoung, Solid-Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco, CA (1969). Valeら, (1978). 米国特許第4,105,603号 van Soest, P.F.およびKits, K.S. (1997). J. Neurophysiol. Wilson, G.F.およびKaczmarek, L.K. (1993). Nature 366:433-448. Zhou L.M.ら, (l996a). Synthetic Analogues of Contryphan-G: NMDA Antagonists Acting Through a Novel Polyamine-Coupled Site. J. Neurochem. 66:620-628. 米国特許第3,972,859号 (1976). 米国特許第3,842,067号 (1974). 米国特許第3,862,925号 (1975). PCT国際公開番号 WO 96/11698号

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 5/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシ ティー・オブ・カリフォルニア ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦ ＯＲＮＩＡ アメリカ合衆国、カリフォルニア州94607 −5200、オークランド、フランクリン・ス トリート1111、トゥエルブス・フロア (72)発明者 マイケル・ファインジルバー イスラエル76100レホボート、ワイズマ ン・インスティテュート・オブ・サイエン ス、デパートメント・バイオロジカル・ケ ミストリー (72)発明者 カレル・エス・キッツ オランダ、エヌエル−1081ハーヴェー・ア ムステルダム、デ・バーレラーン1087番、 フレイエ・ユニフェルジテイト、インステ ィテュート・オブ・ニューロサイエンス (72)発明者 アルマ・エル・バーリンゲイム アメリカ合衆国カリフォルニア州サンフラ ンシスコ、ユニバーシティ・オブ・カリフ ォルニア、サンフランシスコ、スクール・ オブ・ファーマシー、デパートメント・オ ブ・ファーマシューティカル・ケミストリ ー (72)発明者 バルドメロ・エメ・オリベラ アメリカ合衆国84108ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、ブライアン・アベニュー1370 番 (72)発明者 クレイグ・ウォーカー アメリカ合衆国84112ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、サウス・バイオロジー・ビル ディング114番、ユニバーシティ・オブ・ ユタ、デパートメント・オブ・バイオロジ ー (72)発明者 マレン・ウォーキンズ アメリカ合衆国84105ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、イースト・ガーフィールド・ アベニュー845番 (72)発明者 レシュマ・シェッティ アメリカ合衆国84103ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、ノースビュー・サークル744 番 (72)発明者 ロウルデス・ホタ・クルス アメリカ合衆国84114ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、エム・ストリート・ナンバー 403、31番 (72)発明者 ジュリタ・インペリアル アメリカ合衆国84116ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、サージェント・ドライブ1933 番 (72)発明者 クラーク・カレッジ アメリカ合衆国63110ミズーリ州セント・ ルイス、ボックス8232、スコット・アベニ ュー4566番、ワシントン・ユニバーシテ ィ・スクール・オブ・メディシン、デパー トメント・オブ・ジェネティックス Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 HA01 4C084 AA07 BA01 BA02 BA19 BA20 BA26 CA47 CA53 CA59 NA14 ZA022 ZA202 4H045 AA10 BA18 BA19 CA50 DA83 EA20 EA21 FA34 FA44 FA58 GA25 HA02

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式Ｉ：Xaa₁−Cys−Xaa₂−Cys−Xaa₃−Xaa₄−Cys−Cys−
   Xaa₅−Cys−Xaa₆−Cys−Xaa₇（配列番号：１） [式中、Xaa₁はdes-Xaa₁または１-６個のアミノ酸を有するペプチドであり； Xaa₂は５-６個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₃は４個のアミノ酸を有 するペプチドであり；Xaa₄はGlu、γ-カルボキシグルタミン酸（γ-Glu）または
   Glnであり；Xaa₅は３-４個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₆は３-６個 のアミノ酸を有するペプチドであって；Xaa₇はdes-Xaa₇または２-９個のアミノ 酸を有するペプチドであり、但し、Xaa₁がdes-Xaa₁である場合には、Xaa₅がトリ
   ペプチドSer-Asp-Asnとなることはない] を有する実質的に純粋なコノペプチドまたはその医薬上許容される塩。
2. 【請求項２】 Xaa₄がγ−Gluであることを特徴とする請求項１記載のコノ ペプチド。
3. 【請求項３】 Xaa₁がdes−Xaa₁であることを特徴とする請求項１記載のコ ノペプチド。
4. 【請求項４】 Xaa₁が１−６個のアミノ酸を有することを特徴とする請求項
   １記載のコノペプチド。
5. 【請求項５】 Xaa₇がdes−Xaa₇であることを特徴とする請求項１記載のコ ノペプチド。
6. 【請求項６】 Xaa₇が２−９個のアミノ酸を有するペプチドであることを特
   徴とする請求項１記載のコノペプチド。
7. 【請求項７】 一般式II：Xaa₁-Cys-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Cys-Xaa₅-Xaa ₆ -Cys-Xaa₇-Cys-Xaa₈（配列番号：２） [式中、Xaa₁はdes-Xaa₁または１-６個のアミノ酸を有するペプチドであり； Xaa₂は５-６個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₃は４個のアミノ酸を有 するペプチドであり；Xaa₄はGlu、γ-カルボキシグルタミン酸（γ-Glu）または
   Glnであり；Xaa₅はSerまたはThrであり；Xaa₆は２-３個のアミノ酸を有するペプ
   チドであり；Xaa₇は３-６個のアミノ酸を有するペプチドであって；Xaa₈はdes-X
   aa₈または２-９個のアミノ酸を有するペプチドであり、但し、Xaa₁がdes-Xaa₁で
   あってXaa₅がSerである場合には、Xaa₆がジペプチドAsp-Asnとなることはない] を有する実質的に純粋なコノペプチドまたはその医薬上許容される塩。
8. 【請求項８】 Xaa₄がγ−Gluであることを特徴とする請求項７記載のコノ ペプチド。
9. 【請求項９】 Xaa₁がdes−Xaa₁であることを特徴とする請求項７記載のコ ノペプチド。
10. 【請求項１０】 Xaa₁が１−６個のアミノ酸を有するペプチドであることを
    特徴とする請求項７記載のコノペプチド。
11. 【請求項１１】 Xaa₅がSerまたはThrであることを特徴とする請求項７記載
    のコノペプチド。
12. 【請求項１２】 Xaa₈がdes−Xaa₈であることを特徴とする請求項７記載の コノペプチド。
13. 【請求項１３】 Xaa₈が２−９個のアミノ酸を有するペプチドであることを
    特徴とする請求項１記載のコノペプチド。
14. 【請求項１４】 一般式III：Xaa₁-Cys-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Cys-Ser-A
    sn-Ser-Cys-Asp-Xaa₅-Cys-Xaa₆（配列番号：３） [式中、Xaa₁は１-６個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₂はヘキサペプチ
    ドであり；Xaa₃は４個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₄はGluまたはγ-
    カルボキシグルタミン酸（γ-Glu）であり；Xaa₅はトリペプチドであって；Xaa₆ は７-９個のアミノ酸を有するペプチドである] を有する実質的に純粋なコノペプチドまたはその医薬上許容される塩。
15. 【請求項１５】 Xaa₄がγ−Gluであることを特徴とする請求項１４記載の コノペプチド。
16. 【請求項１６】 一般式IV：Xaa₁-Cys-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Cys-Cys-S
    er-Asn-Ser-Cys-Asp-Xaa₆-Cys-Xaa₇（配列番号：４） [式中、Xaa₁は１-６個のアミノ酸を有するペプチドであり；Xaa₂はヘキサペプチ
    ドであり；Xaa₃はSerまたはThrであり；Xaa₄はトリペプチドであり；Xaa₅はGlu またはγ-カルボキシグルタミン酸（γ-Glu）であり；Xaa₆はトリペプチドであ って；Xaa₇は７-９個のアミノ酸を有するペプチドである] を有する実質的に純粋なコノペプチドまたはその医薬上許容される塩。
17. 【請求項１７】 Xaa₅がγ−Gluであることを特徴とする請求項１６記載の コノペプチド。
18. 【請求項１８】 一般式V：Xaa₁-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Phe-Xaa₅-Cys-Thr-Xa
    a₆-Ser-Xaa₇-Cys-Cys-Ser-Asn-Ser-Cys-Asp-Gln-Thr-Tyr-Cys-Xaa₈-Leu-Xaa₉（ 配列番号：５） [式中、Xaa₁はdes-Xaa₁またはジペプチドであり；Xaa₂はAsp、Gluまたはγ-カル
    ボキシグルタミン酸（γ-Glu）であり；Xaa₃はジペプチドであり；Xaa₄はTrpま たは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₅はジペプチドであり；Xaa₆はジペプチドであり ；Xaa₇はGluまたはγ-Gluであり；Xaa₈はいずれかのアミノ酸であって；Xaa₉は ペンタペプチドである]を有する実質的に純粋なコノペプチドまたはその医薬上 許容される塩。
19. 【請求項１９】 Xaa₇がγ−Gluであることを特徴とする請求項１８記載の コノペプチド。
20. 【請求項２０】 （ａ）PnVIIA：Asp-Cys-Thr-Ser-Xaa₁-Phe-Gly-Arg-Cys-T
    hr-Val-Asn-Ser-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Asn-Ser-Cys-Asp-Gln-Thr-Tyr-Cys-Xaa₂-Leu
    -Tyr-Ala-Phe-Xaa₃-Ser（配列番号：６）； （ｂ）Tx6.4：Xaa₁-Leu-Xaa₂-Cys-Ser-Val-Xaa₁-Phe-Ser-His-Cys-Thr-Lys-As
    p-Ser-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Asn-Ser-Cys-Asp-Gln-Thr-Tyr-Cys-Thr-Leu-Met-Xaa₃-
    Xaa₃-Asp-Xaa₁（配列番号：７）； （ｃ）Tx6.9：Xaa₁-Xaa₁-Arg-Xaa₁-Gly-Gly-Cys-Met-Ala-Xaa₁-Phe-Gly-Leu-C
    ys-Ser-Arg-Asp-Ser-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Asn-Ser-Cys-Asp-Val-Thr-Arg-Cys-Xaa₂ -Leu-Met-Xaa₃-Phe-Xaa₃-Xaa₃-Asp-Xaa₁（配列番号：８）； （ｄ）J010：Cys-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Xaa₂-Ala-Asp-Ser-Xaa₂-Cys-
    Cys-Thr-Xaa₂-Gln-Cys-Val-Arg-Ser-Tyr-Cys-Thr-Leu-Phe（配列番号：９）； （ｅ）Tx6.6：Asp-Xaa₁-Xaa₁-Asp-Asp-Gly-Cys-Ser-Val-Xaa₁-Gly-Xaa₃-Cys-
    Thr-Val-Asn-Ala-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Gly-Asp-Cys-His-Xaa₂-Thr-Cys-Ile-Phe-Gl
    y-Xaa₁-Xaa₂-Val（配列番号：１０）； （ｆ）Tx6.5：Gly-Met-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys-Lys-Asp-Gly-Leu-Thr-Thr-Cys-Leu
    -Ala-Xaa₃-Ser-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Xaa₂-Asp-Cys-Xaa₂-Gly-Ser-Cys-Thr-Met-Xaa ₁ （配列番号：１１）； （ｇ）Gm6.7：Xaa₂-Cys-Arg-Ala-Xaa₁-Tyr-Ala-Xaa₃-Cys-Ser-Xaa₃-Gly-Ala-G
    ln-Cys-Cys-Ser-Leu-Leu-Met-Cys-Ser-Lys-Ala-Thr-Ser-Arg-Cys-Ile-Leu-Ala-L
    eu（配列番号：１２）； （ｈ）Mr6.1：Asn-Gly-Gln-Cys-Xaa₂-Asp-Val-Xaa₁-Met-Xaa₃-Cys-Thr-Ser-As
    n-Xaa₁-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Leu-Asp-Cys-Xaa₂-Met-Tyr-Cys-Thr-Gln-Ile（配列番
    号：１３）； （ｉ）Mr6.2：Cys-Gly-Gly-Xaa₁-Ser-Thr-Tyr-Cys-Xaa₂-Val-Asp-Xaa₂-Xaa₂-C
    ys-Cys-Ser-Xaa₂-Ser-Cys-Val-Arg-Ser-Tyr-Cys-Thr-Leu-Phe（配列番号：１４ ）；および （ｊ）Mr6.3：Asn-Gly-Gly-Cys-Lys-Ala-Thr-Xaa₁-Met-Ser-Cys-Ser-Ser-Gly-
    Xaa₁-Xaa₂-Cys-Cys-Ser-Met-Ser-Cys-Asp-Met-Tyr-Cys（配列番号：１５） [式中、Xaa₁はTrpまたは６-ブロモ-Trpであり；Xaa₂はGluまたはγ-カルボキシ グルタミン酸（γ-Glu）であって；Xaa₃はProまたはヒドロキシ-Pro（Hyp）であ
    る]よりなる群から選択される実質的に純粋なコノペプチド。
21. 【請求項２１】 Xaa₂がγ-Gluであることを特徴とする請求項２０記載のコ
    ノペプチド。
22. 【請求項２２】 Xaa₂がGluであることを特徴とする請求項２０記載のコノ ペプチド。
23. 【請求項２３】 Xaa₃がHypであることを特徴とする請求項２０記載のコノ ペプチド。
24. 【請求項２４】 Xaa₃がProであることを特徴とする請求項２０記載のコノ ペプチド。
25. 【請求項２５】 Xaa₁がTrpであることを特徴とする請求項２０記載のコノ ペプチド。
26. 【請求項２６】 Xaa₁が６−ブロモ−Trpであることを特徴とする請求項２ ０記載のコノペプチド。
27. 【請求項２７】 当該コノペプチドがPnVIIAであって、Xaa₁がTrpであり、X
    aa₂がγ−Gluであり、Xaa₃がHypであってＣ−末端が遊離カルボキシル基を有す ることを特徴とする請求項２０記載のコノペプチド。
28. 【請求項２８】 当該コノペプチドがTx6.4であって、Xaa₁がTrpであり、Xa
    a₂がγ−Gluであり、Xaa₃がHypであってＣ−末端が遊離カルボキシル基を有する
    ことを特徴とする請求項２０記載のコノペプチド。
29. 【請求項２９】 当該コノペプチドがTx6.9であって、Xaa₁がTrpであり、Xa
    a₂がγ−Gluであり、Xaa₃がHypであってＣ−末端が遊離カルボキシル基を有する
    ことを特徴とする請求項２０記載のコノペプチド。
30. 【請求項３０】 当該コノペプチドがTx6.6であって、Xaa₁がTrpであり、Xa
    a₂がγ−Gluであり、Xaa₃がHypであってＣ−末端が遊離カルボキシル基を有する
    ことを特徴とする請求項２０記載のコノペプチド。
31. 【請求項３１】 当該コノペプチドがTx6.5であって、Xaa₁がTrpであり、Xa
    a₂がγ−Gluであり、Xaa₃がHypであってＣ−末端が遊離カルボキシル基を有する
    ことを特徴とする請求項２０記載のコノペプチド。
32. 【請求項３２】 当該コノペプチドがＪ010であって、Xaa₂がγ−Gluであっ
    てＣ−末端がアミド化されていることを特徴とする請求項２０記載のコノペプチ
    ド。
33. 【請求項３３】 当該コノペプチドがGm6.7であって、Xaa₁がTrpであり、Xa
    a₂がγ−Gluであり、Xaa₃がHypであってＣ−末端が遊離カルボキシル基を有する
    ことを特徴とする請求項２０記載のコノペプチド。
34. 【請求項３４】 当該コノペプチドがMr6.1であって、Xaa₁がTrpであり、Xa
    a₂がγ−Gluであり、Xaa₃がHypであってＣ−末端がアミド化されていることを特
    徴とする請求項２０記載のコノペプチド。
35. 【請求項３５】 当該コノペプチドがMr6.2であって、Xaa₁がTrpであり、Xa
    a₂がγ−GluであってＣ−末端がアミド化されていることを特徴とする請求項２ ０記載のコノペプチド。
36. 【請求項３６】 当該コノペプチドがMr6.3であって、Xaa₁がTrpであり、Xa
    a₂がγ−GluであってＣ−末端がアミド化されていることを特徴とする請求項２ ０記載のコノペプチド。
37. 【請求項３７】 （ａ）配列番号：１７記載のアミノ酸配列を有するTx6.4 プロペプチドをコードする核酸； （ｂ）配列番号：１９記載のアミノ酸配列を有するTx6.9プロペプチドをコー ドする核酸； （ｃ）配列番号：２１記載のアミノ酸配列を有するJ0104プロペプチドをコー ドする核酸； （ｄ）配列番号：２３記載のアミノ酸配列を有するTx6.6プロペプチドをコー ドする核酸； （ｅ）配列番号：２５記載のアミノ酸配列を有するTx6.5プロペプチドをコー ドする核酸； （ｆ）配列番号：２７記載のアミノ酸配列を有するGm6.7プロペプチドをコー ドする核酸； （ｇ）配列番号：２９記載のアミノ酸配列を有するMr6.1プロペプチドをコー ドする核酸； （ｈ）配列番号：３１記載のアミノ酸配列を有するMr6.2プロペプチドをコー ドする核酸； （ｉ）配列番号：３３記載のアミノ酸配列を有するMr6.3プロペプチドをコー ドする核酸；および （ｊ）配列番号：３５記載のアミノ酸配列を有するTx6.1プロペプチドをコー ドする核酸 よりなる群から選択される単離核酸。
38. 【請求項３８】 Tx6.4プロペプチドをコードし、配列番号：１６記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
39. 【請求項３９】 Tx6.9プロペプチドをコードし、配列番号：１８記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
40. 【請求項４０】 J010プロペプチドをコードし、配列番号：２０記載の配列
    を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
41. 【請求項４１】 Tx6.6プロペプチドをコードし、配列番号：２２記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
42. 【請求項４２】 Tx6.5プロペプチドをコードし、配列番号：２４記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
43. 【請求項４３】 Gm6.7プロペプチドをコードし、配列番号：２６記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
44. 【請求項４４】 Mr6.1プロペプチドをコードし、配列番号：２８記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
45. 【請求項４５】 Mr6.2プロペプチドをコードし、配列番号：３０記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
46. 【請求項４６】 Mr6.3プロペプチドをコードし、配列番号：３２記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。
47. 【請求項４７】 Tx6.1プロペプチドをコードし、配列番号：３４記載の配 列を有する請求項３７記載の核酸、またはその相補体。