JPS6333334A - 細胞毒性薬剤としてのクロトキシン錯体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、治療剤として、薬理学的に受容可使な賦形剤
中にクロタルス　−Ｅシ一旦二と２ノ　立ユ１イクス（
ＣｒｏｔａＩｕｓ　Ｄｕｒｉｓｓｕｓ　Ｔｅｒｒｉｆｉ
ｃｕｓ）の粗製毒液から得たクロトキシン錯体のサブユ
ニットＡ及びＢを含む、癌腫、血管性、感染性、及び、
内分泌性の諸疾病の治療に有用であるとともに、鎮痛薬
としても応用可能な医薬組成物に関するものである０本
発明は、また、前記粗製毒液から前記錯体のユニッ）Ａ
及びＢを得る方法、及び、前記医薬組成物の調整方法、
並びに、前記組成物の薬理学的に有効な量を投与するこ
とによる癌腫及びその他の疾病の＃１８２方法、更に、
上記組成物を調整するための手順に関する。

本発明者らは、本発明の方法によって得たクロトキシン
のサブユニットＡ及びＢを４年間、特に、癌の治療に用
いてきた。現在までのところ、結果は非常に良好で、の
ちほど詳述するように、高度の客観的動源と生存率を得
ている。

蛇の毒液が鎮痛効果を有することは古くから知られてお
り、多くの著者が、三叉神経症、を髄痘症、及び、腫瘍
の治療にコブラやガラガラ蛇の粗製毒液を投与すること
の有効性について指摘してきている。１１４瘍の場合、
患者の７０％はモルヒネ投与を行なわなくても痛みから
解放される。

しかしながら、これらの、Ｉ！！者について追跡調査を
行なった著者はほとんどいない、新しい鎮痛薬の登場に
よって、この分野での研究が取りやめになったうえ、化
学療法の進歩によって、毒液の抗新生物（抗腫瘍）薬の
宥する作用の回部性についての研究が放棄されることと
なった。その当時、なまの毒液を適切な分類もせずに使
用したことは明白である６時折、インド又は南アフリカ
から来たコブラの毒液を無差別に使用したため予測不可
能な結果が生じることもあった。

これとは別に、蛇の毒液から単離され、且つ、均質に精
製される最初の細胞毒性成分はブラガンサら（Ｂｒａｇ
ａｎｓａ　ｅｔ　ａｌ）が１９６７年に、ナＣナジャ（
１匡Ｊｂ）ＩｊＪ液から得たシトトキシン（細胞毒素）
であった、後日、タケウチら（Ｔａｋｅｕｃｈｉ　ｅｔ
　ａｌ、　）が１９７１年に、同一の毒液から、Ｉｌ！
瘍細胞に対して高度の細胞病原活性（ウィルス効果）を
もった２種類のシトトキシンを単離した。ジル口（Ｇｉ
ｌｌｏ　）が１９６６年に、ウイルトハイナー及びグリ
ル口（Ｗｉｒｔｈｅｉｎｅｒ　＆Ｇｒｉ１１ｏ）が同じ
＜１９６６年に、また、ブリスポワ（Ｂｒ１ｓｂｏｉｓ
）が１９６８年に、ナジャ　ナジャ毒液が腫瘍細胞を破
壊しないでその増殖を不能にし、動物体（ハッカネヅミ
）にできた＠瘍の成長を抑制する効果のあることを証明
した。

しかしながら、毒液の組成が複雑で、適切な制御方法も
見当らなかったことから、研究者達は、シトトキシンが
腫瘍細胞に遭遇した場合、その細胞毒性作用は選択的な
ものではないと考えるようになった。

コブラ科の蛇（例えば、コブラ）の毒液から得た５９〜
６２の強塩基性アミノ酸のペプチドであるシトトキシン
に対して、ガラガラ蛇類の毒液は塩基性ペプチドを含ん
でおらず、その細胞毒性作用は他の成分と同類である。

Ｃｒｏｔａｌｕｓ　Ｄｕｒｊｓｓｕｓ　Ｔ＠ｒｒｉｆｉ
ｃｕｓ　　の毒液から得たクロトキシンと同定される留
分は、１９３８年にスロッタ及びフレンケルーコンラー
ト（５ｌｏｔｔａ＆　Ｅｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ
　）が該毒液を熱処理し、次いでアルコール沈殿させる
ことによって最初に単離したものである。この留分はピ
リジンとｐＨ４，５の酢酸の混合溶液を用いて晶出でき
、自由電気泳動（り一及びフレンケルーコンラート（Ｌ
ｉ＆　Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ　）　）並びに
超遠心分子ａ（グラＬ／７及びスベドベルク（Ｇｒａｌ
ｅｎ　＆　Ｓｖｅｄｂｅｒｇ　）１９３８）による検討
の結果、顕著な不均質性は示されず、従って、この留分
は均質な化学物質と見なすことができた。

１９７１年、２の研究グループが、「クロトキシン」は
、事実、２種の主要成分によって形成された錯体である
ことを証明した（ルプザーメンら（Ｒｕｂｓａｍｅｒ＋
　ｅｔ　ａｌ、　）　１９７１　；　ヘンチン及び７Ｌ
／ンケルーコンラート（）Ｉｅｎｄｅｎ　＆　Ｆｒａｅ
ｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ）　１９７１　）　、上記主要
成分の一方は、分子ｔが１６，３００、等電点が９．７
のホスホリパーゼＡ２で、またの名をクロトキシンＢ　
１ｍ塩基性という。上記主要成分の他方は、分子量が８
．５００、等電点が３．５のペプチドで、酵素活性を欠
いている。またの名をクロトキシンＡ（酸性）という。

１９８１年３月以降１本発明者らは、実験室でクロトキ
シン錯体の２のサブユニットＡ及びＢを得るための異な
る方法に着手した。

以下の手順で、Ｃｒｏｔａｌｕｇ　Ｄｕｒｉｓｓｕｓ　
Ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ毒液から塩基性ホスホリパーゼＡ
２　（クロトキシンＢ）と酸性サブユニット（クロトキ
シンＡ）を分離した。

（１）「セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−
７５Ｊコラムを使用し、ｐＨ４，５でクロマトグラフ処
理を行なう。

（２）　　ｒｃＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　Ｃ−５０４コ
ラムに交換してクロマトグラフ処理を行ない、０．１乃
至１．０Ｍ　（ｐＨ３，５）の蟻酸アンモニウムの容積
モル濃度を有する凹状勾配で溶出を行なったのち、同一
吸収剤の直線状勾配（１，０乃至３．０Ｍ）で溶出を行
なった。この工程により、下記の成分を分離した。

（１）クロトキシンＡ： （２）等電点４．１のホスホリパーゼＡ２；（３）クロ
タミン（汚染物質）と称する第三成分、及び、 （４）最後に取り除く塩基性ホスホリパーゼＡ２　（ク
ロトキシンＢ）。

クロトキシンＡは、後刻、リン酸カリ（ｐＨ６，５）を
吸収剤として使用し、ＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｄｅｘ　　
Ａ　−５０コラム中でクロマトグラフ処理して精製する
。塩基性ホスホリパーゼＡ２（クロトキシンＢ）は、ｒ
　ＣＭ　−５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｃ−５０Ｊコラム（ｐ
Ｈ３，５）中でクロマトグラフ処理して精製する。

精製留分は薄膜（アメリカ合衆国、マサチューセッツ州
、ブルーミントン所在のアミコン　カンパニー（ＡＭＩ
ＣＯＮ　ＧＯ，）製、ダイア７　ａ　−（Ｄｉａ−ｆｌ
ｏ　）　ＵＭ　−１０）を使用し、限外濾過によって濃
縮したのち、広範囲の透析によりＮａＣ１０，１５Ｍ溶
液で均衡させる。精製した成分は、ドデシルスルフアー
トソーダ、高圧クロマトグラフ、並びに、アミノ酸組成
物の存在下で、ポリアクリルアミド・ゲル内を電気泳動
して、均質な物質として振る舞う、説明の明確のために
、「サブユニットＡ及びＢ」を指す場合、それらは分離
ＣＱｉ離）した、或は、複合形態の「クロトキシンＡ（
相補的ペプチド）」及び「クロトキシンＢ（ホスホリパ
ーゼＡ２）」に対応する。

本発明の目的は、治療剤としてＣｒｏｔａｌｕｓＤｕｒ
ｉ−ｓｓｕｓ　Ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓの粗製毒液から得
たクロトキシン錯体のサブユニッ）Ａ及びＢと、薬理学
的に受容可艶な賦形剤とを含む、癌腫や、感染性、内分
泌性、及び、炎症性の疾病の治療に、また鎮痛剤として
有用な医薬組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、前記毒液中に存在するクロトキシ
ン錯体をクロマトグラフによって分離し、吸着したクロ
トキシン錯体を溶出する際に得られる留分を濃縮し、前
記濃縮工程で沈殿させた不溶生成物を水性媒体中に分散
し、クロマトグラフによってサブユニットＡ及びＢを分
別し、前記分散物を吸着コラム中でクロマトグラフ処理
するとともにｐＨ約３．５の蟻酸アンモニウムの緩衝液
を用いてサブユニットＡ及びＢを溶出し、前記サブユニ
ットＡ及びＢを含む、分離した溶出留分を精製し、且つ
、必要に応じて、前記サブユニットを混合してクロトキ
シン錯体を生成することを特徴とする、前記粗製毒液か
ら前記サブユニットＡ及びＢを得る方法を提供すること
にある。

本発明の他の目的は、薬理学的に受容可濠な賦形剤中に
入れたクロトキシン錯体のサブユニットＡ及びＢを含む
医薬組成物の治療的に有効な呈を患者に投与することか
らなる、癌腫や、感染性、血管性、及び、内分泌性疾病
の治療方法、並びに、鎮痛全般の治療にも有用な方法を
提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記医薬、ｌｌＩ成物を調整
する方法を提供することにある。

本発明の以上の目的及びその他の目的、並びに、長所及
び新規な面は、本発明に関する以下の詳細な記載から明
らかとなろう。

本発明は、発明者らによって発見されたクロトキシンの
サブユニットＡ及びＢ（即ち、クロトキシンＡ及びクロ
トキシンＢ）の酵素特性、薬理学（薬物の作用機構）お
よび薬物動態学に基づいている。

ｌ　、酢ＪＪＬ社 Ａ）クロトキシンＢの クロトキシンＢはホスホリパーゼＡ２であって、下記の
反応パターンに従って、脂肪酸と１．２−デアシル（１
−アルケニル−２−アシル、又は、ｌ−アリキル−２−
アシル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセリド（ホ
スホリパーゼ）のグリセロールの２位置のアルコール　
ヒドロキシルとの間にあるエステル結合を加水分解する
際に触媒として働く。

（ホスホリパーゼ）　　　　　　　　　　　　　（リソ
誘導体）　　　　　　。□４゜〔但し、Ｒ及びＲ２は脂
肪酸残基；Ｒ３はＨ（ホスファチン酸）、ポリアルコー
ル（ホスファチジルグリセロール中のグリセロール、ホ
スファチジルイノシトール中のイノシトール）、或は、
ｗｉｇ加アシアルコールスファチジルエタノールアミン
中のエタノールアミン、ホスファチジルセリン中のセリ
ン）である、〕 反応生成物は遊離脂肪酸（ｍ）及び一般にリン誘導体（
リソホスファチンニルコリン、リソホスファチジルエタ
ノールアミン）と定義される１−アシル誘導体（Ｈ）で
ある、加水分解反応は立体特異性をもち、グリセロール
のＣ−２のエステル結合による位ｌ特異性を示し、共同
因子としてＣａ２′″イオンを特定的に必要とする。

塩基性ホスホリパーゼＡ２　（クロトキシンＢ）は、化
学合成によって得られ非常に良く水に溶け、ミセルとし
て添加される短鎖レシチンのようなホスポリピッド、並
びに、小胞として又はリポソームとして添加される長鎖
脂肪酸（Ｃ１５゜Ｃ２２）を有するか或はリポ蛋白質や
生物学的Ｅ１膜のような生物学的に重要な構造のホスポ
リピッドを、異なる集合段階において加水分解−する、
該クロトキシンＢが卵黄リボ蛋白質（４０℃においてｐ
Ｈ８，０）に対してもつ特定の活性は、蛋白質１ｍｇ当
り、毎分、７００　ｍ　ｌの加水分解基質を生成するこ
とである。

他の脂質分解酵素と共通の重要な機能的性質は、水溶性
ホスポリピッドの存在下で、該基質が活性を有する位置
に結合し、且つ、Ｃａ２＋の存在下で生産的な第三級錯
体を生成することである。

触媒反応が生じて、加水分解生成物が遊離する。

ホスポリピッドが集合（ミセルは小胞）すると、酵素は
その活性を有する位置を基質分子の順序型てられた配列
に向かって配向させ、ホスポリピッドと水の界面に吸着
して七ツマー分子を結着させ、且つ、Ｃａ２＋イオンの
存在下で、界面第三級錯体が形成される。触媒作用は同
一の反応機構で生じるが、加水分解速度は極度に増大す
る（１０．０００倍乃至ｔｏｏ、ｏｏｏ倍）。

集合した基質と酵素との相互作用から生ずる加水分解速
度のこのような増加は「界面の活性化」と称せられ、そ
の機構は完全には解明されていない。

クロトキシンＢはクロトキシン錯体の非常に重要な薬理
剤であり、該錯体のあらゆる効果を再現することができ
るが、特異性に欠ける。同じことが毒性についても発生
する（以下参照のこと）。

Ｂ）クロ　キシンＡ（クロトキシン錯体に関する同物質
の特性） クロトキシンＡは検出可能な酵素活性或は毒性を示さな
いが、クロトキシン錯体の作用機構に関する事項におい
て２の重要な性質を示す、即ち＝（ａ）クロトキシンＡ
を塩基性ホスホリパーゼＡ２　（クロトキシンＢ）の溶
液に加えると、自然の錯体と同程度の減少した等電点（
４〜４．５）及び分子量を有する非常に安定した錯体（
Ｋｂ＝８．８Ｘ１０　　　Ｍ）が自然に生成する。

（ｂ）クロトキシンＡ錯体においては、ホスホリパーゼ
Ａ２の酵素活性は抑制されているが、基質が集合状態に
ある場合にのみ、この活性が現われる。

？、　　−′−− 集合体或は生物学的ｉ＝Ｍ　ＰＡの形をしたホスポリピ
ッドを加水分解するには、塩基性ホスホリパーゼＡ２を
ホスポリピッドと水との界面に結合させることが必要で
、この結合はクロトキシン錯体が解離した後でしか生じ
ない。本発明溝らは、ジメチルスベリミダートと等価で
結合した錯体が、ホスホリパーゼ活性を依然維持してい
るとはうものの、イ）漠と結合する能力がないことを見
出した。

このことから、本発明者らは、クロトキシン錯体中での
クロトキシンＢの触媒位置がモノマー基質に到達自在で
あり、且つ、その機老的な済力をそのま＼維持すること
を証明した。

しかしながら、中離したホスホリパーゼＡ２はホスポリ
ピッドと水の界面と確実に相互作用できるのに対して、
クロトキシンＡとの錯体はこの界面と相互作用ができな
いように思える。

上記のことから、又、その他の結果から、次のような結
論に到達できる。

（ａ）塩基性ホスホリパーゼＡ２とクロトキシンＡとに
よる錯体の形成はクロトキシンＢの活性位置の構造と特
性には影響を与えないが、酵素がホスポリピッドと水の
界面に結合するのを妨げ、その結果、生物学的薄膜の集
合体の形をとる基質の酵素加水分解を抑制する。

（ｂ）塩ノ、（性ホスホリパーゼＡ２　（クロトキシン
Ｂ）と集合体としての基質の相互作用は、機催的酵素の
表面における、又、活性位置とは位相的に異なる特定領
域の露出によって異なる。そのような露出面を有する自
由酵素のみが該ホスホリパーゼと水の界面に結合して薄
膜のホスホリパーゼを加水分解するとともに「界面活性
」として知られる現象を呈することができる。

（Ｃ）酵素表面のこの特定領域は、ｉロトキシンＡによ
る錯体の形成によって生ずる領域である。このことは、
界面を有するホスホリパーゼＡ２とクロトキシンＡとの
相互作用が互に排他的である、つまり、クロトキシンＡ
による錯体の形成は酵素と薄膜との相互作用を妨害し、
又、塩基性ホスホリパーゼＡ２と薄膜との相互作用はク
ロトキシンＡによる錯体の形成を妨害するということを
意味する。

クロトキシン錯体の細胞病理学的効果、即ち、エールリ
ッヒ原木Ｍ瘍細胞に対する効果の観察は−Ｉ＋ 思いがけないものであったが、１０　　　Ｍの範囲の濃
度の錯体を用いると、６０分で培養物の完全溶解が生じ
ることが確認された。培養ラインの予備選別及び本選別
を行なって評価分析を実施した（医学アカデミ−Ａ、マ
イヤー博士）、同じ効果がｉｌｌ察された。しかしなが
ら、最も驚くべき発見は肝細胞、繊維組織増殖、及び、
Ｈ膜培養細胞に対して細胞病理学的作用が僅かしかない
ということであった。

作用機構に関する事項については、以下の観察が不可欠
である。

（ａ）クロトキシンＢは、ｌｌｌ！瘍及び正常の細胞に
対しても細胞病理学的作用を有するクロトキシン錯体の
唯一の成分である９両方の場合に、単離したクロトキシ
ンＢを添加すると、細胞損傷の証拠が得られた。

（ｂ）細胞病理学的作用は、クロトキシンＢの酵素活性
と関連がある。ｐ−ブロモフェナシルプロミド（カンチ
アー二他（Ｃａｎｚｉａｎｉ　ｅｔ　ａｍ　）１９８２
）を用いて治療を行なうことによる活性位置の選択的ブ
ロッキングが細胞溶解活性の無効を決定する。明確な変
化が観察されたが、この変化は酵素がＥ／！ｊ膜に結合
することに関連があるように思われる。しかしながら、
この変化は、明らかに、細胞の溶解を引き起こすには不
充分である。

（Ｃ）しかしながら、クロトキシン錯体（クロトキシン
Ａ及びクロトキシンＢ）は腫県細胞に対して極めて選択
的な細胞毒性作用を呈する。

（ｄ）本出願人らの研究によれば、クロトキシンＡとク
ロトキシンＢの錯体は薄膜同志を結合することができる
ので、該クロトキシン錯体の作用のために限定的な工程
はサブユニットＡ及びＢを解離させることである。該ク
ロトキシン錯体がその細胞毒性作用を発揮するのに必要
な條件は、目標とするＬ［の近くでサブユニッ）Ａ及び
Ｂを解離させることである。該クロトキシン錯体のこの
ような異なった作用に関するもつともらしい説明は、該
錯体の解離を促進させるＩＮ！瘍細脳細胞薄膜ベルに局
部的な物理化学的條件が存在するということにある。腫
瘍細胞内で優勢なこの條件は、正常な細胞の近くで、ク
ロトキシン錯体の解離を生じさせるのには充分でない。

（ｅ）腫瘍細胞の原形質膜が変化することは１９５８年
以来知られており、発癌性物質が原形質膜のもつ機能の
多くを変化させ、その結果、前記細胞膜に見られる多形
態性の変化を創り出すことを示唆する充分な証拠がある
。１９６７年にストッカー（５ｔｏｃｋｅｒ　）は、付
着性の変化と接触抑制の欠如について述べたが、これら
のことは悪性腫瘍における不変の性質ではないように思
われる（ワラツク（Ｗａｌｌａｃｈ　）　ｌ　９７３　
）　、類似の現象が電気的分離においても発生する（Ｗ
ａｌｌｃｈ。

１９７３）。＠瘍細胞において余り顕著ではない接触成
長の抑制（ストッカー（５ｔｏｃｋｅｒ　）　＋１９６
７）及び紡錘菌生成能力（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ　ｃａ−
ｐａｃｉｔｙ）　　（オカダ（Ｏｋａｄａ　）　　、　
１９６９　；ポスト（Ｐａｓｔｅ　）　　、　１９７０
）が大きくなるのと平行して悪性度が高くなるように思
われる。新生物（腫瘍）細胞の外面的な潜在能力の変化
を、内部コントロールを行なって、実験的に観察した（
Ｗａｌｌａ−ｃｈ、１９７３）、同じく、浸透性の変化
（シルベン、他（Ｓｙｌｖｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　　
、　ｌ　９６２）及び免疫の変化をも観察した。新しい
抗原や胚芽抗原の出現、及び臓器中での成る選択的抗原
の欠失が数多くの実験的腫瘍及び自然の腫瘍に観察され
た。選択性の特定原因となるものを確定することは困難
である。可清な原因としては、諸成長嬰因の１によって
誘発されるプロトン　ポンム（ｐｒｏｔｏｎ　ｂｏ−ｉ
＋ｂ−活発にＮａ′を細胞中に搬び込み、Ｈを搬び出す
“ＡＴＰ−ａｓａ”）があげられる０選択性は１本出願
人らが行なった各種研究のうち最も興味ある点の１であ
る。クロトキシン錯体の解離は、クロトキシンＡの各種
カルボン酸塩を共同的に滴定することにより促進するこ
とができる。該クロトキシン錯体を解離させるためには
約４のｐＨ価が必要であるが、これら諸結果はｍユＣ状
態で得られるものであることを銘記しておかなければな
らない、細胞内での有功な條件は静り且３である。従っ
て、均衡状態で計算した解離度は、特に、拡散バリヤー
で制約された容積内で勾配が生ずると、可成り修正され
ることになる。

（ｆ）腫瘍細胞の原形質膜付近においてクロトキシン錯
体が解離すると、クロトキシンＢが原形質薄膜に結合し
て、該薄膜を構成するホスホリピツドが加水分解すると
いう結果を生ずる。ホスホリパーゼＡ２による加水分解
生成物、特に、リソホスファチド（前掲の構造式■）は
洗浄作用を有する（この点に関して、リソ誘導体という
名称はこの物質の細胞溶解性情に由来する）、熱力学及
び幾何学的理由から、前記生成物を安定した薄層構造で
束ねることが妨げられる。モデル系（リポソーム）にお
いて、リン誘導体（ホスポリビット１００ミ９ 加すると、例えば、浸透性における著しい乱れを生じさ
せ、又、蔗糖とカプセル化した陽イオン（通常、不浸透
性）のアウトレット及びリン誘導体の高い濃度が薄層構
造の破壊とミセル状集合体の形成を決定する．生物学的
薄膜を構成するホスホリピツドが長鎖脂肪酸（炭素数１
６乃至２４）を含むことを念頭に置けば，加水分解生成
物（前掲の構造式■及び■）は該薄膜を放棄せず、又、
これら生成物の相対濃度の増加は変化をもたらして、ミ
トコンドリア並びに細胞原形質をマーキングする酵素の
アウトレットを培養地内に移し、且つ、形態的変化（ミ
トコンドリアと細胞原形質の網状組織の膨張と破壊）を
生じさせて、細胞の溶解に導く。

現在の所、上述の変化が酵素のインターナチゼーション
から生ずるものか、或は、組成物内の急激な変化及び浸
透性の変化によるイオン力から生ずるものかは不明であ
る。

級−１ １１！１ｉｆｆｌ細胞の溶解を生ずる機構はクロトキシ
ンＢの酵素活性の結果であると説明することができる．
しかしながら、更に興味を呼び起こす点はクロトキシン
錯体の攻撃目標（ターゲット）選定機構である．クロト
キシン錯体が不活性クロトキシンＢの循環析出物として
作用し、クロトキシン錯体の解離から生ずる物理化学的
條件を有する細胞に対してのみその活性を現わし、この
ようにして自動的に脆弱化してクロトキシンＢにより攻
撃を受けるものと考えられる．このような状況により、
腫瘍細胞はクロトキシンＢを捕獲するためのより有効な
代替ターゲットとなる。

更に、ホスファチジルイノシトールが酵素により攻撃さ
れやすいホスホリピツドに屈するものであることを重要
事項として指摘しておく。現在、細胞増殖を誘発する決
定的な徴候は、Ｃ−ホスホリパーゼのｄｉ　ＩＱによる
トリホスホイノシチドの加水分解である．加水分解生成
物はイノシトールートリーホルファートで、この化合物
は第二のメツセンジャーとして、又、蛋白質のホスホリ
ル化で触媒として作用するキナーゼ蛋白（Ｃ−プロティ
ンキナーゼ）を活性化する役目をもつジグリセリドとし
て作用することができる．ホスファチジルイノシトール
に作用する場合、ホスホリパーゼＡ２の加水分解生成物
は、対応するリン誘導体であり、この物質は細胞膜内で
生長するホスホリパーゼにとって適切な２！ｉｍとはな
らず、それゆえ、細胞増殖機構の妨げとなる。

ナショナル・キャンサーｅインスチチュート（Ｎａｔｉ
ｏｎａｉ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ
）　、υ．Ｓ．Ａ　）の定式化した実験計画案に従って
、抗腫瘍活性を評価するために、ハツカネズミの黒色Ｉ
ｎ瘍Ｂ　ｔ　６、結腸腫瘍２６、リッジウェイ骨肉腫、
及び、ルイス癌腫を用いた。これら全ての場合、未処理
制御と比較した活性を示すために、２０％を超える平均
生存時間の増加、及び／又は、５０％以上の局部成長の
抑制を必要とした。この要件は、後程わかるように、こ
の毒素（トキシン）の作用に対してハツカネズミが独特
の感応性を有するので、通常必要とされる要件（２５％
を超える平均生存時間、６０％を超える成長抑制）より
も幾分低いものである。

平均生存時間は、黒色腫Ｂ１６を使用して９０日経過後
、５５乃至８０％の生存検体が１５０％乃至３００％の
増加を示した。また、結腸腫瘍２６については、６０乃
至８０％の生存検体が約２００％の増加、更に、骨肉腫
およびルイス癌腫については、１７０乃至２００％の増
加を示した。

クロトキシン錯体を４日置きに筋肉注射で投与した。結
果は疾病の段階により異なった。腫瘍の移植直後に治療
を施した動物体は病状が進んでから治療を施した動物体
に比べてはるかに良好な反応を示した。経口投与は効果
がないことがわかつた、クロトキシンＢにＩ　　でマー
キングを施し、クロトキシンＡを用いて錯体を形成した
のち、該錯体をスフィンゴミエリン・リポソームでカプ
セル化した。このような状況下で、プラズマ内のクロト
キシンの測定可使なレベルは、経口投与後に検出できた
が、吸着量は著しく変った。

従って、経口投与を取りやめた。

３．１止ｌ旦］ ■　　でマークを施した塩基性ホスホリパーゼＡ２　（
クロトキシンＢ）を用いて、薬物動態の検討を行った。

成る場合には、無水酢酸と反応させることにより、クロ
トキシンＡのＨ又はＣＩ４を用いて該錯体を二重にマー
クした。

−ｊ 経口投与は効果がないことがわかった。■１２５でクロ
トキシンＢにマーキングを施し、クロトキシンＡで錯体
を形成したのち、該錯体をスフィンゴミエリン令リポソ
ームでカプセル化した。このような状況下で、プラズマ
内のクロトキシンの測定可濠なレベルは、経口投与後に
検出できたが、吸着量は著しく変化した。従って、経口
投与は取りやめた。

ハツカネズミとウサギに静脈注射による投与を行なった
のち原形質（プラズマ）の濃度は急激に減少し、約３０
分以内で最初の量の２％に達した。約３０％は尿中で回
収された。

筋肉注射による投与の後、原形質の濃度は注射後約３０
分でピークに達したことが観察された。１時間以内で、
原形質の濃度は最初の量の約１０％にまで減少し、その
痕跡のみが尿中で検出された。

公−一血 クロトキシンＡ及びＢの錯体は有機溶媒又は無機溶媒に
可溶である。

濃度に関しては、塩基性ホスホリパーゼＡ２は主として
肝臓に集中しくバーベルマン（Ｈａｂｅｒ−諺ａｎｎ）
、１９７２；フレンケル−コンラート他（Ｆｒａｅ＋＋
ｋｅｌ−Ｃｏｒａｔ　ｅｔ　ａｌ、　）　　、　１９７
６　）　、肝臓内でＭ成し、アミノ酸のプールへと移動
する。接種後６乃至８時間経過すると、先に付したマー
キングはほぼ完全に消失する。　Ｈａｂｅｒｍａｎｎ他
の研究（１９７２）の結果によれば、塩基性ホスホリパ
ーゼＡ２或はクロトキシンＡを用いた錯体は、静脈注射
により接種を行なったハツカネズミの大脳又はを髄で測
定可使なマーキングの量が無視し得る程度のものである
ので、ヘマトエンセファリック障壁を通過しないａ　Ｈ
ａｂｅｒｙｓａｎｎ及びＲａｕｄｅは大脳室に注射をす
ると発作を起こすことを明らかにした。

上記のデータはクロトキシンが広範に分布することを示
唆するが、その平均寿命は短かく、又、持続性のある組
織集中も現れない。

生物体が該錯体を代謝作用で分解する速度が早いため、
マーキングを施したクロトキシン錯体（クロトキシンＢ
−１）をフルビカン種ハツカネズミに多量投与して、そ
の分布をしらべた。

２２０、ｇのクロトキシン錯体を静脈注射により役ゲし
てから３０乃至６０分経過後、２グループの動物を犠牲
にして、異なる器官及び組織における濃度又はマーキン
グを調べた。濃度はフエント−１２、 モル（１０ミリモル）で表わす。

組織又は　　　　　　　接種後の経過時間Ｌｆｉ　　　
　　　　　　　−腫±−」」Ｌ牌　　臓　　　　　　　
　　　　　　　　１７５ＱＯ２８００大脳及びを髄　　
　　　　ＮＤ　　　　ＮＤａ心　　臓　　　　　　　　
　　　　　　　　３２ｉｏ　　　　　　　１１ｇ”１　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
１８　　　　　　ＮＤ　ａリンパΦガングリオン　　　
２３０　　　ＮＤ”Ｇ　間Ｎ　ｔｌｔｉ　肪２８０　　
　Ｎ　Ｄ　ａ肝　　臓　　　　　　　　　　　　　　　
２２０８００　　　１５８０２００下垂体　　　　　　
　　　ＮＤ　　　　ＮＤａ小　　１ｉ　　　　　　　　
　　　　　　　　　３８６　　　　　ＮＤａ大１１ｉ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５４　　　　
　ＮＤａ骨　　髄　　　　　　　　　　　　　　　　７
７０　　　　　ＮＤ”骨格筋肉　　　　　　　　１７８
０００　　７１０００尿　　　　　　　　　　　　　　
　　　３５４０００ｃ　　　　２０００ｃ膵　　臓　　
　　　　　　　　　　　　　１８２０　　　　　　１２
４肺　　　　　　　　　　　　　　　　　　８８０００
　　　　　　７８０腎　　ｌ＆１　　　　　　　　　　
　　　　７１００００　　　２８８２００副　　腎　　
　　　　　　　　　　　　　　　　８６　　　　　ＮＤ
ａ甲状１１１ｉ１　　　　　　　　　　Ｎ　Ｄ　ａＮ　
Ｄ　ａ胆のう　　　　　　　　　ＮＤ　　　　ＮＤａ回
収ｙ　Ｍ　　　　　　　　３ｓ＋ｓ＜３２１９０３０５
２総量比　　　　　８４．５＄　　４５．４Ｘ註：犠牲
に供した動物は極度の呼吸障害を示し、人口呼吸により
維持した。

ＮＤａ：検出不能（＜７０） ’ＤＥ：平均予測データ Ｃ：投与量を多くしたために尿に現われる。該錯体の分
子量は３００００であるので、この錯体は腎臓で癌過さ
れ る。

生」Ｌ丙」し逸 生体内変換は肝ａｔ！！内で起った。

°ＩＳび 生体内変換生成物は、生物体によって用いられる代謝プ
ールに貢献するアミノ酸である。該錯体は投与後６乃至
８時間でプラズマ（原形質）から消失した。実質的な最
終代謝産物の排出はなかつた。

Ｍ１悴　につい　′−なった 腫瘍細胞の溶解を生ずる機構は、クロトキシンＢの酵素
活性の結果として説明できる。しかしながら、最も興味
ある点はクロトキシン錯体によるターゲット省（悪性細
胞）である。

該クロトキシン錯体は不活性クロトキシンＢの循環析出
物として作用し、明確に規定された物理化学的状況を有
する細胞に対してのみ活性を現わし、この活性がクロト
キシン錯体の解離を生ずるとともに、グロトシキンＢの
攻撃に＠露される細胞を生ずるものと考えられる。この
ような状況下で、新生組繊細胞はクロトキシンＢを捕獲
するためのより有効な代替「ターゲット」となる。

濫立及１： Ｉ１４瘍細胞に対するクロトキシン錯体の細胞溶解作用
を実地検証するために、モデル（この場合は、「ヨシダ
肉腫」）を下記のものを使用して培養した。

ｌ）クロトキシンＡで６０分 ２）クロトキシンＢで６０分 ３）クロトキシン錯体で６０分 ４）抑制グループが観察された。

虹−］ 第一の場合、クロトキシンＡでヨシダ肉Ｍ細胞を６０分
間培養した後、期待するような抗新生物効果はなかった
。

第二の場合（クロトキシンＢによる培養）、２０分以内
で悪性細胞及び正常細胞の溶解が観察され、クロトキシ
ンＢがどのような細胞に対しても抗新生物効果を示すこ
とが明らかとなった。

第三の場合、クロトキシン錯体で実験用肉腫細胞を２０
分間培養した後、悪性細胞片にのみ、選択差別的細胞溶
解が１［５１察され、この細胞溶解は６Ｘ　１０−６ｍ
ｇ／ｍｌのクロトキシン錯体を用いて６０分間培養した
後最高に達した。

同様の効力検定を、ポリオーマウィルスを用いてハムス
ターの繊維芽細胞について行ない、同様の結果を得た。

蕊笠ヱｊにすして′−なった勺究 ナショナル番キャンサー・インスチチュート（Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ＭＣ
Ｉ）、Ｕ、Ｓ、Ａ　）の定式化した実験計画案に従って
、下記のＩ！４瘍を用いて抗腫瘍活性を評価した：ハツ
カネズミの黒色Ｉｌ！瘍Ｂ１６．結腸腫瘍２６；リッジ
ウェイ骨肉腫；及び、ルイス癌腫、これら全ての場合、
未処理制御と比較した活性を示すために、２０％を超え
る平均生存時間の増加、及び／又は、５０％を超える局
部Ｊ＆長の抑制を必要とした。

黒色腫Ｂ１６：９０日経過後、５５乃至８０％の生存検
体が、１５０乃至３００％の平均生存時間の増加を示し
た。

結腸腫瘍２６：６０乃至８０％の生存検体が２００％の
平均生存時間の増加を示した。

リッジウェイの骨肉腫及びルイス癌腫＝１７０乃至２０
０％の平均生存時間の増加を示した。

クロトキシン錯体を４日置きに筋肉注射で投与した。結
果は疾イ４の段階により異っていた。腫瘍の移植直後に
治療を施した動物体は病状が進んでから治療を施した動
物体に比べて良好な反応を示した。

１」辷灰ユＬＩＩＥ 異なる部位に進行した新生組織を有する患者１２７人を
１グループとして４年間治療を行ない、以下の結果を得
た。

Ｎｏｌ　　１１２２５人の患者を治療した。そのうち１
４人は完全治ゆ（ＲＣ）Ｌ、７人は部分的に効き目があ
り、３人は病状の安定を示し、１人は良くならなかった
。

Ｎｏ２　１互Ｚ　、１者１７人中、７人は完全治ゆ（Ｒ
Ｃ）Ｌ、、７人は部分治ゆ（ＲＰ）Ｌ、３人は良くなら
なかった。

ＮＯ３ｕ　　治療した６人の患者中、３人は完全な効き
目を現わし、残る３人も部分的な効き目を示した。

！’ｂ４　１亘１　治療した９人の患者中、６人は完全
治ゆ（ＲＣ）Ｌ、２人は部分治ゆ（ＲＣ）し、１人は効
き目がなかった。

陽５　　　＼　　　　　　　Ａ　　１６人の患者を治療
し、そのうちの４人は完全な効き目を現わし、１０人は
部分的な効き目を示した。残る２名は効き目を現わさな
かったと考えられる。

！り６　　ｍ　　１８人の患者を治療した。そのうちの
７人は完全治ゆ（ＲＣ）Ｌ、８人は部分治ゆ（ＲＰ）Ｌ
、３人は効き目を現わさなかった。

Ｆｋｒ７　１１！　６人の患者を治療した。３人は完全
治ゆ（ＲＣ）Ｌ、２人は部分治ゆ（ＲＰ）し、１人は効
き目を現わさなかった。

ＮＯＢ　　Ｌｌｌｌ団　１２人の患者を治療した。

３人は完全治ゆ（ＲＣ）　し、６人は部分治ゆ（ＲＰ）
し、３人は効き目を現わさなかった。

Ｎｏ９　　ＬＪＩ巨　治療した６人の患者のうち、５人
は完全な効き目を現わし、１人は効き目を示さなかった
。

Ｎ０ＩＯ１＋１！　　治療した７゛大の患者のうち、５
人は完全な効き目を現わし、２人は効き目を示さなかっ
た。

上記の治療にあたっての処方は、筋肉注射、又は、皮下
注射、或は、浸潤により治療投薬量を使用した。

調剤は下記の商業化されている技法により行うことがで
きる：通常の添加剤（即ち、生理学的溶液）を含む水性
賦形剤などを用いて調合した液状薬剤；局部鎮痛薬のよ
うな他の薬剤を必要に応じて含む溶液又はエマルジョン
；その他。

本発明の目的ならびに利点を以下の実施例において示す
が、これらの実施例で詳述する反応生成物及びその量、
並びに、諸條件及びその他効果の詳細は単なる例示であ
り、本発明の範囲を限定するものではない。

！−−−施一一−１ ■　粗製錯体の製造 ５００ｍｇの凍結乾爆した材料を５　ｍ　ｌの０．２Ｍ
塩化ナトリウム溶液、１ｍＭのビソジウム　エチレンジ
アミン　テトラアセタート、及び、２０ｍＭ、ｐＨ４，
０の蟻酸アンモニウムの緩衝液中に懸濁させた。この溶
液を、４℃で冷凍した“Ｓｏｒ＋ｒａ！Ｉ　ＲＣ２−Ｂ
”遠心分離機で２０分間、１０．０００Ｇで遠心分離し
、黄味がかつて僅かに濁った上澄液を、テフロン製チュ
ブに連結したプラスチック製スポイトで吸引して、出発
物質を作った。

その後の手順は、２℃乃至４℃の冷却室内で行なった。

０１ユニ出発物質を、上昇流に適合させ、且つ、ビソジ
ウム　エチレンジアミン　テトラアセタートＯ，１ｍＭ
を含む蟻酸アンモニウム緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ４，５と
予め均衡させた、大きさが８５Ｘ２．５ｃｍ（２１７ｍ
ＪＬ）のｒ　５ｅｐｈａ−ｄ＠ｘＧ−７５４コラム（ス
エーチン、ウプサラ所在のファルマシア社製）内に分散
させた。同一の緩衝液を用いて溶出を行ない、流速０．
８〜１−ＯｍｆＬ／ｃゴ／ｈｏｕｒ−’で３．０〜３．
２ｍ文の留分を回収した。該粗製錯体をＫ　　（Ｋａｖ
　　　　　　ａマ ＝　（Ｖ　＠Ｖ　）／（Ｖ　　−Ｖｔ））の価が０．４
４で溶出した。

粗製錯体を含む留分を結合させてから、（ａ）凍結乾燥
と（ｂ）冷凍によって濃縮し、解凍すれば該錯体が不溶
状態で沈殿し、テフロン製乳棒を備えたボッター／エー
ルベイエン　ホモジエナイザ−（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｈｌ
ｖｅｊｅｎ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ　）　テ均質化す
ることにより再懸濁できるようにするか、又は、ダイヤ
フロー（ＤｉａＦＩｏ）　Ｕ　Ｍ　−１０薄膜（アメリ
カ合衆国、マサチューセッツ州、ブルーミントン所在の
Ａｍ１ｃｏｎ　Ｇｏ、製）を備えたチェンバー内で窒素
圧下で限外濾過を行なって最終容積が約１０ｍ文となる
ようにすることにより再懸濁できるようにした。

■　粗製錯体からのサブユニットＡ及びＢの分離［：工
程ｌで得た試料を酢酸によりｐＨ３，５に調整し、寸法
が８Ｘ２ｃｍで蟻酸アンモニウム０．１Ｍ、Ｐ）１３．
５の緩衝液と予め均衡させたｒ（：Ｎ−３ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ　−５０」：Ｉラム（スエーチン、ウプサラ所在
のファルマシア社製）中に分散させた。蟻酸アンモニウ
ム０．１Ｍ、ｐＨ３，５（２ＳＯｍｓＬ）の緩衝液を用
いて溶出を開始し、サブユニットＡを溶離した。このサ
ブユニットＡは、これらの諸條件では交換器により保持
できない、更に、溶離剤（３５０ｍ文の蟻酸アンモニウ
ム１．０Ｍ、Ｐ）１３−５）の凹状容積モル濃度勾配を
用い、最後に溶離剤（ｌｉｏｎ見の蟻酸７ンモニウム１
．ＯＭ、ｐＨ３，５及び１１０ｍ１の蟻酸アンモニウム
３．０Ｍ、ＰＩ（３，５）の直線状容量モル濃度勾配を
用いて溶出を皇統し、流速３４　ｍ　ｌ　／　ｃゴ／　
ｈ　Ｏｕ　ｒ−”で５ｍＭの留分を回収した。溶出線図
を描き、溶出留分の吸Ｒ７；Ｌが２８０　ｎｍと測定し
た。上記の條件で溶離した蛋白の最終ピークはサブユニ
ットＢに対応する。

■　サブユニットの精製 二車」：サブユニットＡの精製、工程２で最初に溶出し
た留分はサブユニットＡを含んでいた。これらの留分を
結合して、ｌ　、０００ｍ文（×３倍）のリン酸カリ（
１０ｍＭ、ｐＨ６，９）ＩＮＮ液液透析した。別に、こ
の結合した留分を、Ｄｉａ−ｆｌｏ　Ｕ　Ｍ　−０５Ｑ
１％ｉ　（Ａｍ１ｃｏｎ　Ｇｏ、ｆｉ）上で、且つ、リ
ン酸カリ（１０ｍＭ、ｐＨ６＋　９）ｌｉ衝液で均衡さ
せ、ＱＪ圧下テ５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−２５コラＡ
　（Ｐｈａｒ■ａｃｉａ　Ｌｔｄ　製）のクロマトグラ
フにより限外濾過して濃縮した。

試料を、リン酸カリ（１０ｍＭ、ｐＨ６，９）緩衝液で
予め均衡させた「ＤＥＡＥ−セフアダツクスＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ａ　−５０」コラム（ｌＯＸｌ、５ｃｍ
）に充填し、サブユニットＡを直線状容積モル濃度勾配
に従って溶出した（溶離剤：１００ｍ文のリン酸カリ（
１０ｍＭ、ｐＨ６，９）及びｌｏＯｍＭのリン酸カリ（
０，１ｍＭ、ｐＨ６，９）、精製したサブユニットＡを
含む留分を１００ｍ文（×３倍）のＮａ０文０．１５Ｍ
で透析し、上述と同−條件の限外濾過によって濃縮した
。

回収されたサブユニットＡは３７．５ｍｇの蛋白質であ
った。上記の條件下で得られたサブユニッ）Ａは、寒天
ゲル上で免疫電気泳動によりただ１つの沈殿アークしか
示さなかった。

エム」：サブユニットＢの精製、サブユニットＢを含む
留分（工８！２の最終段階で溶出したもの）を結合して
、得られた試料を凍結乾燥するか、或は、ｌ　、０００
ｍ文（×２倍）の蟻酸アンモニウム（０，１Ｍ、ｐＨ３
，５）緩衝液で透析したのち、工程２で述べたｉ酸アン
モニウム（０，１Ｍ、ｐＨ３，５）緩衝液で予め均衡さ
せたｒＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　Ｃ−５０Ｊコラムで
再度クロマトグラフ処理した（但し、この場合には、０
．１モル迄の蟻酸アンモニウムの凹状容植モル濃度勾配
が一旦完結すると、蟻酸アンモニウム緩衝液（０，２Ｍ
、ｐＨ３，５）で直接溶出を継続し、活性留分を濃縮し
た）。

精製、濃縮したサブユニットＢを含む留分を１．０００
ｍＪ１　（Ｘ６倍）のＮａＣｆｆ１溶液（０，１５Ｍ）
で広範に透析した０回収されたサブユニットＢは７５　
ｍ　ｇの蛋白質であった。

上記の條件で得られ、且つ、ソジウム　ドデシルスルフ
アートを含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行な
ったサブユニットＢは、分子量ｔｏ、ｏｏｏ　（単層体
）及び２０，０００（二量体）に対応する移動度をもっ
た２條の帯部を呈した。

精製したサブユニットの殺菌処理： ＮａＣ文溶液（０，１５Ｍ）で精製したサブユニッ）Ａ
及びＢの剤を紫外線チェンバー内でｒミリポア（ＭＩＬ
ＬＩＰＯＲＥ　）膜」を通して痘過することにより殺菌
処理した。

精製したサブユニットから出発する錯体の再構成： サブユニットＡ及びＢは、１０−１０Ｍ程度の解離定数
を有する錯体を自然に、生成し、この錯体はユニットを
混合してから最初の１分以内に完成される。

進行した癌の治療にクロトキシン錯体を使用して得られ
た結果から見て１次のような結論に到達する。

１．７　　　　　　　から： （ａ）細胞毒性作用に関して、この作用はクロトキシン
が腫瘍細胞膜と選択的に結合し、正常な細胞膜とは結合
しないということと関連があることが既に示されている
。

（ｂ）クロトキシン錯体の最終代謝産物はアミノ酸のプ
ールを統合し、該プールは究極的に栄養不良によって発
育不全をわずらっている患者によって用いられる。

（Ｃ）クロトキシン錯体の使用にあたっては、動物にも
人間にも抗原活性は検出されていない。

２、　　　　　　　占か　： （ａ）癌の種類或いはその転移に関して、特定の活性は
ない。

（ｂ）急性、亜急性、或いは、慢性的蓄積症状のいずれ
に対しても毒性効果は生じない。

（Ｃ）ナイフ／オルガニック依存症は発見されていない
。

（ｄ）該錯体は、新生物細胞が見出される生物体のどの
部分にも浸透、拡散することができる。

例えば、トリウムで追跡したクロトキシン錯体はへマド
エンセファリック障壁を通過しないが、もしこの障壁に
腫瘍細胞が局在する場合には、何らの不都合も生ぜずに
、該障壁に浸透する。

（ｅ）治療的投与場であれば、二次的又は付帯的効果は
ほとんどなく、また、あったとしても、投与後２〜３時
間で消失する。

（ｆ）該錯体は、数回の治療を受けている患者について
上述の臨床経験によれば、他の薬物と影響し合うことは
ない。

（ｇ）反適応症はない、静脈注射を行った実験動物は急
性腎障害を起こし、死んでしまう場合もある。薬物動態
中によれば、クロトキシンのサブユニットは低分子量の
蛋白質（Ｐ−Ｍ、）であるので、腎臓細管内に沈積して
不可逆性の腎臓細管前症の原因となる。このような結果
は人間に対する静脈接種を非実用的なものにしてしまう
。

（ｈ）現在まで、以下のような投与経路が試みられ、有
効且つ安全であることが判明している二筋肉内投与、腫
瘍内投与、腫瘍周辺投与、腔内投与、フイステル経由投
与、皮肉投与、外科的投与、及び、粘膜内投与。

（ｉ）代ａ前又は代ａ後、いずれの器官内にも蓄積しな
い。

（ｊ）顕著な鎮痛効果を示す。

（ｋ）高尿酸症、高カルシウム症などのような、！瘍細
胞の溶解に帰すことができるような１性は観察されてい
ない。

（１）治療効果は原形質のレベルに依存しない。

（ｍ）投与は毎日行なうが、特別の投与技術とか適用手
順といったものは要らない。

（ｎ）投与は巡回状況でも行える。

（０）運搬中でも、該薬物は原形質の蛋白質には結合し
ない。

（ｐ）該薬物の使用による溶血現象又は凝固障害は観察
されていない。

（ｇ）心電図検査における変化又は血行力学上の機部不
全は記録されていない。

３　、　　　　の　　い　　れた軒　　　　−：患者が
、転移局部及び／又は薬物投与後の最初の腫瘍において
、しばしば痛みを感するということを指摘しておく必要
がある。場合により、この事実を隠れた転移の診断に用
いることができた。

４、へ声　　に゛け　　　　　占から：製造コストが低
源なこと、及び、患者の住居でも投与できることにより
、腫瘍を治療する患者にとって入院看護に関連した費用
が削減するという利点がある。

特許出願人　ギレルモ　ホセ　エルナンデスプラタ　（
ほか２名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、投与可能な形態で、適宜な担体に担持させたクロト
   キシン錯体のサブユニットＡ及びＢの有効量を含むこと
   を特徴とする、癌腫、感染性及び炎症性疾患、並びに、
   内分泌障害の治療において薬理学的活性と治療的効果を
   有する組成物。 ２、注射可能な形態で、鎮痛成分としてコブラム又はメ
   リチンをも含むことを特徴とする、特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 ３、前記錯体の構造及びサブユニットＢの活性座を維持
   し、その毒性を抑制することを特徴とする、特許請求の
   範囲第１項記載の組成物。 ４、クロマトグラフによつて、クロトキシン錯体を￥ク
   ロタルス￥￥ドウリツスス￥￥テリフイクス￥（Ｃｒｏ
   ｔａｌｕｓ　Ｄｕｒｉｓｓｕｓ　Ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ
   ）の粗製毒液から分離し、吸着したクロトキシン錯体を
   溶出することによつて生成した再結合留分を濃縮し、前
   記濃縮段階で沈殿した不溶生成物を水性手段に分散し、
   吸着コラム内で前記分散物のクロマトグラフによりクロ
   トキシン錯体のサブユニットＡ及びＢを分別してｐＨ約
   ３．５の蟻酸アンモニウムの緩衝液で前記クロトキン錯
   体のサブユニットＡ及びＢを溶出し、前記サブユニット
   Ａ及びＢを含む溶出分離した留分を精製し、且つ、必要
   に応じて、前記サブユニツトＡ及びＢを混合してクロト
   キシン錯体を形成することを特徴とする、クロトキシン
   錯体のサブユニットＡ及びＢを得るための手順。 ５、前記毒液のクロマトグラフ処理を「セフアデツクス
   （Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｃ−７５」コラムで行ない、且つ
   、物質Ａ及びＢの分別クロマトグラフを「ＣＭ−セフア
   デツクスＣ−５０」コラムで行なうことを特徴とする、
   特許請求の範囲第４項記載の手順。 ６、サブユニットＡの溶離剤が約０．１Ｍで、且つ、約
   ３．５のｐＨ値を有する蟻酸アンモニウムのミリリット
   ル溶液であり、また、サブユニットＢの分離を、０．１
   Ｍで、約３．５のｐＨ値を有する蟻酸アンモニウムと約
   １Ｍで、ｐＨ値が約３．５の蟻酸アンモニウムとを３．
   ５対１の容積比で混合した溶液で前記サブユニットＡを
   溶出した後、前記溶離剤の凹状容積モル濃度勾配で進行
   させ、その後、約１．０Ｍで、ｐＨ値が約３．５の蟻酸
   アンモニウムと、約３．０Ｍで、ｐＨ値が約３．５の蟻
   酸アンモニウムとを約１対１の容積比で混合し、直線状
   容積モル濃度勾配で進行させ、２８０ｎｍの吸着溶出留
   分をサブユニットＢ含有留分として回収することを特徴
   とする、特許請求の範囲第４項又は第５項記載の手順。 ７、前記サブユニットＡの精製を、前記サブユニット含
   有の溶出留分の透析により遂行し、前記サブユニットＡ
   は、一旦透析によつて濃縮されると、「ＤＥＡＥ−セフ
   アダツクスＡ−５０」コラム内でクロマトグラフ処理に
   よつて濃縮され、続いて、燐酸アンモニウムとｐＨ値が
   約６．９の蟻酸アンモニウムとの緩慢溶液で溶出してか
   ら、精製されたサブユニットＡを含む溶出留分を透析と
   それに続く限外濾過によつて濃縮することを特徴とする
   、特許請求の範囲第４項記載の手順。 ８、前記サブユニットＢの精製は、溶出留分を透析又は
   凍結乾燥によつて濃縮し、「ＣＭ−セフアデツクスＣ−
   ５０」コラムで再度クロマトグラフ処理を行つて前記凹
   状容積モル濃度勾配で溶出し、約２．２Ｍで、ｐＨ値が
   ３．５の蟻酸アンモニウムの緩慢溶液で溶出を継続し、
   且つ、再結合した留分を透析して精製サブユニットＢを
   含む留分を生成することを特徴とする特許請求の範囲第
   ２項記載の手順。 ９、￥クロタルス￥￥ドウリツスス￥￥テリフイクス（
   Ｃｒｏｔａｌｕｓ　Ｄｕｒｉｓｓｕｓ　Ｔｅｒｒｉｆｉ
   ｃｕｓ）の粗製毒液から調整したサブユニットＡ及びＢ
   の治療的投薬量を患者に投与することを特徴とする、癌
   腫の治療、感染性疾病の治療、糖尿病のような内分泌性
   疾病の治療、及び、痛み全般の治療をする方法。 １０、治療的に有効な量のクロトキシン錯体のサブユニ
   ットＡ及びＢを薬理学的に受容可能な賦形剤と混合する
   ことを特徴とする、医薬組成物の製造方法。