ES2605015T3 - Métodos para modular respuestas neuronales - Google Patents

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ES2605015T3 ES04789721.0T ES04789721T ES2605015T3 ES 2605015 T3 ES2605015 T3 ES 2605015T3 ES 04789721 T ES04789721 T ES 04789721T ES 2605015 T3 ES2605015 T3 ES 2605015T3
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nmda
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Yu Tian Wang
Yushan Wang
Anthony Phillips
Lidong Liu
Yitao Liu
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Abstract

Un compuesto que consiste de la fórmula I: Z1-X1-X2-E-G-X3-N-V-X4-G-Z2; (I) en donde X1 es Y, S, o T; X2 es K o R; X3 es Y, S, o T; X4 es Y, S, o T; Z1 es H2N; Z2 es -C(O)OH; en donde "-" es un enlace covalente, y en donde el compuesto es un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA; y en donde cualquiera uno o más de X1, X3, o X4 es un Y.

Description

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DESCRIPCION
Metodos para modular respuestas neuronales Campo de la invencion
La invencion, en general, esta en el campo de la neurologla, mas especlficamente, la invencion provee en parte, metodos y reactivos para modular apoptosis o plasticidad sinaptica mediadas por NMDA.
Antecedentes de la invencion
La transmision sinaptica es el proceso mediante el cual las neuronas se comunican por mecanismo de excitacion (generacion de una accion potencial) o de inhibition (inhibition de una action potencial despues de la excitacion). La transmision sinaptica de excitacion ocurre a menudo por medio del neurotransmisor L-glutamato y sus receptores de glutamato cognados, los cuales incluyen los receptores del subtipo glutamato N-metil-D-aspartato (NMDA) acido y a- amino-3-hidroxi-5-metiliisoxazol-4-propionico (AMPA). La plasticidad sinaptica se refiere a la capacidad dependiente del uso de neuronas postsinapticas para modular su respuesta a la liberation de neurotransmisores durante la transmision sinaptica, y se considera importante en los procesos de aprendizaje y memoria.
La estimulacion excesiva de las neuronas postsinapticas (un fenomeno conocido como “excitotoxicidad”), que puede llevar a la muerte o a apoptosis neuronal, ha sido implicada en una variedad de desordenes del sistema nervioso central (SNC). La activation del receptor de NMDA puede inducir la muerte celular programada (apoptosis) en neuronas cultivadas de hipocampo, y puede ser subyacente a la perdida de neuronas y funcion neuronal en trastornos del sistema nervioso central variando desde trauma cerebral agudo y apoplejla a enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedades de Huntington, de Alzheimer y de Parkinson1-5.
La activacion del receptor de NMDA tambien puede llevar a la facilitation de la endocitosis mediada por clatrina de los receptores de AMPA, los cuales median en la transmision sinaptica rapida en sinapsis de excitacion en el sistema nervioso central de mamlferos6,7. La funcion del receptor de AMPA puede ser modificada al nivel de la probabilidad de canal abierto , conductancia de canales , y cinetica de desensibilizacion . La redistribucion rapida de los receptores de AMPA hacia y desde el dominio postsinaptico tambien se considera como un medio para regular la fuerza de la transmision sinaptica mediada por el receptor de AMPA.43,45,6 Los receptores de AMPA experimentan un ciclo constitutivo funcionalmente distinto y regulado dependiente de la clatrina entre los compartimientos intracelulares y la membrana plasmatica a traves de la insertion (exocitosis) e internalization (endocitosis) en la membrana de plasma mediadas por las veslculas22,30,20,24,41,14. La regulation de estos procesos puede llevar a cambios rapidos en el numero de receptores de AMPA expresados en la membrana postsinaptica, contribuyendo con ello a la expresion de ciertas formas de plasticidad sinaptica, incluyendo la potenciacion del hipocampo a largo plazo (LTP)3 42,50 y la depresion a largo plazo (LTD) en el cerebelo y el hipocampo14,24,25,44. Los receptores de AMPA pueden ser sometidos a endocitosis estimulada por diversos estlmulos incluyendo factores de
1 1 1 1425 J 2221 20
crecimiento, tales como el enlazamiento al agonista de insulina/IGF-1 ' , enlazamiento de agonistas y
protocolos de produccion de LTD24,14,25.
Resumen de la invencion
La invencion provee, en parte, metodos y reactivos para modular la apoptosis neuronal. La invencion tambien provee, en parte, metodos y reactivos para modular la plasticidad sinaptica.
En algunos aspectos, la invencion provee un metodo para modular la apoptosis neuronal mediada por NMDA in vitro poniendo en contacto una celula neuronal con un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5. En aspectos alternativos, la invencion se relaciona con un metodo para modular la apoptosis neuronal mediada por NMDA poniendo en contacto una celula neuronal con un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina. En aspectos alternativos, la invencion se relaciona con un metodo para tratar o prevenir el dano o disfuncion neurologica en un sujeto administrando una cantidad efectiva de un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA al sujeto.
En realizaciones alternativas, el dano neurologico puede incluir apoptosis neuronal inducida por NMDA, o puede ocurrir como resultado de la activacion excesiva de los receptores de NMDA o debido a cambios en la endocitosis del receptor de AMPA, o puede ocurrir como resultado de al menos uno de un desorden seleccionado del grupo consistente de estres, ansiedad, depresion, hipoglicemia, paro cardiaco, epilepsia, isquemia cerebral, trauma cerebral, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, dolor neuropatico, esclerosis lateral amiotrofica (ALS), slndrome de Hutchinson Gilford, diabetes, ataxia, retardo mental, demencias, trastornos asociados con el tabaco o la obesidad, presion sangulnea elevada, trastornos asociados con defectos o disfuncion en el aprendizaje o memoria, trastornos psiquiatricos, autismo, esquizofrenia, slndrome X fragil o trastornos asociados con el abuso de sustancias o adiccion a un farmaco (por ejemplo, nicotina, alcohol, opiatos,
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herolna, codelna, morfina, petidina, petadona, marihuana, feniclideno, psicoestimulantes, anfetaminas, cocalna, barbituratos, pentobarbitona, quinalbarbitona, benzodiacepinas, temazepan, diazepan o flunitrazepan).
En aspectos alternativos, la invencion se relaciona con un metodo para modular la plasticidad sinaptica en un sujeto administrando una cantidad efectiva de un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA a un sujeto (por ejemplo, un sujeto normal, esto es, uno que no tiene o no ha sido diagnosticado con dano o disfuncion neurologica). En realizaciones alternativas, el metodo puede incluir adicionalmente la mejora de la plasticidad sinaptica. En aspectos alternativos, la invencion se relaciona con un metodo para tratar o prevenir el abuso de sustancias en un sujeto administrando una cantidad efectiva de un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA al sujeto.
En algunos aspectos, la invencion provee un metodo para modular la endocitosis del receptor de AMPA in vitro poniendo en contacto una celula que expresa un receptor de AMPA con un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo consistente de YKEGYNVYGIE, YREGYNVYG, o YKEGYNVYG, o con un anticuerpo que enlaza especlficamente una secuencia de aminoacido YKEGYNVYGIE.
En algunos aspectos, la invencion se relaciona con un metodo para modular la endocitosis del receptor de AMPA, poniendo en contacto una celula que expresa un receptor de AMPA con un compuesto modulador que comprende la secuencia de aminoacidos definida en la Tabla I o sustituciones conservadoras de la misma, formula I, o formula A, o secuencias homologas de las mismas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o Glur4 del receptor de AMPA o un fragmento o variante de los mismos, o que comprende un anticuerpo que enlaza especlficamente la secuencia de aminoacidos definida en la Tabla I o sustituciones conservadoras de la misma, formula I o formula A, o secuencias homologas de las mismas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o Glur4 del receptor de AMPA.
En aspectos alternativos, la invencion provee un metodo para cribar un modulador de la endocitosis del receptor de AMPA, proveyendo un sistema que incluye un polipeptido receptor de AMPA o un fragmento biologicamente activo del mismo; un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5; proveyendo un compuesto de prueba; poniendo en contacto el sistema con el compuesto de prueba; y determinando si el compuesto de prueba modula la endocitosis del receptor de AMPA.
En aspectos alternativos, la invencion provee un metodo para cribar un modulador de la endocitosis del receptor de AMPA, incluyendo el metodo proveer un polipeptido receptor de AMPA o un fragmento biologicamente activo del mismo; proveer un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5; proveer un compuesto de prueba; poner en contacto el polipeptido receptor de AMPA o un fragmento biologicamente activo del mismo con el compuesto de prueba o el inhibidor; y determinar si el compuesto de prueba modula la endocitosis del receptor de AMPA.
En aspectos alternativos, la invencion se relaciona con un metodo para cribar un modulador de la endocitosis del receptor de AMPA, proveyendo un polipeptido receptor de AMPA o un fragmento biologicamente activo del mismo; proveyendo un compuesto de prueba; poniendo en contacto el polipeptido receptor de AMPA o un fragmento biologicamente activo del mismo con el compuesto de prueba; y determinando si el compuesto de prueba modula la endocitosis del receptor de AMPA. En realizaciones alternativas, el metodo puede incluir adicionalmente proveer un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA, poner en contacto el polipeptido receptor de AMPA o un fragmento biologicamente activo del mismo con el inhibidor, y determinar si el compuesto de prueba modula la endocitosis del receptor de AMPA cuando se compara con el inhibidor.
En aspectos alternativos, la invencion provee un polipeptido que incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica a la secuencia de YKEGYNVYGIE, YREGYNVYG, o YKEGYNVYG, o una molecula de acido nucleico que codifica cualquiera de estas secuencias de aminoacidos, o un anticuerpo que enlaza especlficamente un polipeptido consistente de la secuencia de aminoacidos YKEGYNVYGIE.
En aspectos alternativos, la invencion provee un compuesto sustancialmente puro consistente de la formula I: Z1-X1- X2-E-G-X3-N-V-X4-G-Z2; en donde X1 puede ser Y, S, o T; X2 puede ser K o R; X3 es Y, S, o T; X4 puede ser Y, S, o T; Z1 es H2N-; Z2 es -C(O)OH, en donde "-" es un enlace covalente, y en donde el compuesto es un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA y en donde uno cualquiera o mas de X1, X3, o X4 es un Y.
En aspectos alternativos, se describe un compuesto sustancialmente puro que incluye la formula A: Z1-X1-X2-X3-X4- X5-X6-X7-X8-X9-Z2, donde X1 puede ser un aminoacido que tiene un Indice hidropatico de -0.3 a -4.3 o de -1.3 a -3.3 o puede ser un aminoacido neutro o acido, o puede ser Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr, Asp, Glu; X2 puede ser un aminoacido que tiene un Indice idiopatico de +1.0 a +5.0 o de +2.0 a +4.0 o puede ser un aminoacido basico o puede ser Lys, Arg, His; X3 puede ser un aminoacido que tiene un Indice idiopatico de +1.0 a +5.0 o de +2.0 a +4.0 o puede ser un aminoacido acido o puede ser Asp, Glu; X4 puede ser un aminoacido que tiene un Indice idiopatico de - 2.0 a +2.0 o de -1.0 a +1.0 o puede ser un aminoacido neutro o puede ser Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr; X5 puede ser un aminoacido que tiene un Indice idiopatico de -0.3 a -4.3 o de -1.3 to-3.3 o puede ser o puede ser aun
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aminoacido neutro o acido o puede ser Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr, Asp, Glu; X puede ser un aminoacido que tiene un Indice idiopatico de -1.8 a +2.2 o de -0.8 a +1.2 o puede ser un aminoacido neutro o puede ser Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr; X7 puede ser un aminoacido que tiene un Indice idiopatico de -3.5 a 0.5 o de -2.5 a -0.5 o puede ser un aminoacido no polar o puede ser Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; Xa puede ser un aminoacido que tiene un Indice idiopatico de -0.3 a -4.3 o de -1.3 a -3.3 o puede ser o puede ser aun aminoacido neutro o acido o puede ser Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr, Asp, Glu; Xg puede ser un aminoacido que tiene un Indice idiopatico de -2.0 a +2.0 o de -1.0 a +1.0 o puede ser un aminoacido neutro o puede ser Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr; Z1 es H2N-, RHN- o, RRN-; Z2 puede ser -C(O)OH, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -C(O)NRR; R en cada aparicion puede ser seleccionado independientemente de (C1-C6) alquilo, (C1-C6) alquenilo, (C1-C6) alquinilo, alquilo (C1-C6) sustituido, alquenilo (C1-C6) sustituido, o alquinilo (C1-C6) sustituido; en donde "-" es un enlace covalente, y en donde el compuesto puede ser un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA. En realizaciones alternativas, uno o mas de X1, X5, o Xa puede ser un Y.
En realizaciones alternativas, el compuesto de la formula I puede inhibir la endocitosis del receptor de AMPA con una afinidad que es al menos tan grande como la afinidad cuando el compuesto es un polipeptido que incluye una secuencia de YREGYNVYGIE, YKEGYNVYGIE, YREGYNVYG, o YKEGYNVYG. En realizaciones alternativas, el compuesto de la formula I puede incluir una calificacion de similitud por encima de cero con base en las matrices de similitud PAM o Blosum. En realizaciones alternativas, el compuesto de la formula I puede incluir adicionalmente la secuencia de aminoacidos YGRKKRRQRRR.
En realizaciones alternativas, la invencion provee el uso de cualquiera de los polipeptidos, moleculas de acido nucleico, anticuerpos o compuestos de acuerdo con la invencion para tratar o prevenir el dano neurologico o abuso de sustancias en un sujeto, o para modular la apoptosis neuronal mediada por NMDA, o para modular la endocitosis del receptor de AMPA, o para modular la plasticidad sinaptica en un sujeto.
En diversos aspectos descritos, el inhibidor puede incluir un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA regulada. En diversos aspectos descritos el inhibidor puede incluir un polipeptido GluR2, GluR3, o GluR4. En diversos aspectos descritos, el inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA puede incluir un peptido que incluya cualquiera de las secuencias de aminoacidos de YREGYNVYGIE, YKEGYNVYGIE, YREGYNVYG, o YKEGYNVYG o un fragmento o una variante de los mismos, o puede ser un polipeptido GluR2, GluR3, o GluR4, o puede incluir un anticuerpo que enlaza especlficamente cualquiera de las secuencias de aminoacidos de YREGYNVYGIE, YKEGYNVYGIE, YREGYNVYG, y YKEGYNVYG. En diversos aspectos descritos, el inhibidor puede incluir la secuencia de aminoacidos definida en la Tabla I o sustituciones conservadora de la misma, formula I, formula A, o secuencias homologas de las mismas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3, o GluR4 del receptor de AMPA o un fragmento o variante del mismo, o incluir un anticuerpo que enlaza especlficamente la secuencia de aminoacidos definida en la Tabla I o sustituciones conservadoras de la misma, formula I, o formula A, o secuencias homologas de las mismas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3, o GluR4 del receptor de AMPA. En diversos aspectos descritos, puede incluir adicionalmente la secuencia de aminoacido YGRKKRRQRRR.
El acido a-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propionico o receptores de "AMPA" son receptores del canal de iones regulados por glutamato que estan involucrados en la transduccion de la senal postsinaptica. Los receptores de AMPA naturales pueden ser heteromericos, por ejemplo heteropentamericos, complejos protelnicos ensamblados a partir de combinaciones de subunidades GluR 1-4. Cuando se expresan de manera transiente en celulas de mamlferos no neuronales, las subunidades GLuR individuales pueden formar canales receptores de AMPA homomericos funcionales, y los receptores de AMPA en estos sistemas de expresion heterologos pueden experimentar endocitosis dependiente de la clatrina constitutiva y regulada. En algunas realizaciones, un receptor de AMPA incluye una subunidad GLuR2. Las subunidades GluR pueden incluir sin limitation las secuencias descritas en los numeros de acceso NP_113796; NP_032191; NP_000818 para GluR1; NP_058957; NP_038568; NP_000817; P23819 para GluR2; NP_116785 para GluR3; o NP_058959 o NP_000820 para GluR4, y secuencias de nucleotidos relacionadas, por ejemplo, NM_000826. Otros polipeptidos o secuencias de nucleotidos de GluR pueden ser encontrados en bases de datos publicas, tales como en GenBank.
Un receptor de AMPA "fosforilado" incluye subunidades de polipeptidos que son modificadas postraduccion sobre cualquier residuo de aminoacidos, por ejemplo, serina, treonina o tirosina, que sea capaz de ser fosforilado in vivo. Por ejemplo, un receptor de AMPA fosforilado puede incluir una subunidad GluR2 que es fosforilada, por ejemplo, sobre uno cualquiera o mas de tirosinas 869, 873 y 876 de la secuencia descrita en el numero de acceso NP_000817, o fosforilado sobre uno cualquiera o mas de residuos de tirosina presentes en las secuencias correspondientes en subunidades GluR.
Un receptor de AMPA “no fosforilado” puede ser incapaz de ser fosforilado en un residuo de aminoacidos capaz de ser fosforilado in vivo, por ejemplo, por mutation de ese residuo a un aminoacido que no es capaz de ser fosforilado. Una mutacion de una tirosina a una alanina en una secuencia de polipeptidos, por ejemplo, da como resultado una protelna que no es capaz de ser fosforilada en una position particular en la secuencia de polipeptidos. Un polipeptido de GluR2 que posee una alanina u otro aminoacido no fosforilable en las posiciones 869, 873 y/o 876 de
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la secuencia descrita en el numero de acceso NP_000817, en vez de una tirosina, es un ejemplo de tal receptor de AMPA “no fosforilado”. Un receptor de AMPA no fosforilado tambien puede ser una protelna que es capaz de ser fosforilada in vivo pero no es fosforilada debido, por ejemplo, a la presencia de un inhibidor, por ejemplo, un inhibidor de quinasa; debido a un anticuerpo que interfiere con el sitio de fosforilacion; debido a la actividad de una fosfatasa; o se evita su fosforilacion por algunos otros medios. Un receptor de AMPA “fosforilado constitutivamente” es una protelna que posee una mutacion en un residuo de aminoacidos que es capaz de ser fosforilado in vivo, en donde la mutacion imita la fosforilacion en ese residuo, y el polipeptido resultante posee la actividad biologica de un polipeptido fosforilado. En general, la mutacion de un residuo fosforilable a un residuo de acido glutamico o acido aspartico da como resultado la fosforilacion constitutiva.
Un polipeptido de GluR CT incluye un peptido derivado de, o sustancialmente identico a, el terminal C de un polipeptido de GluR y que es capaz de inhibir la endocitosis del receptor de AMPA, o de modular la apoptosis neuronal o la plasticidad sinaptica. Los peptidos de GluR CT incluyen, sin limitacion, peptidos que incluyen las secuencias definidas en la Tabla I o sustituciones conservadoras de los mismos, formula I, o formula A, o secuencias homologas de los mismos encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o GluR4 del receptor de AMPA. En algunas realizaciones, un peptido de GluR CT puede incluir otras secuencias (por ejemplo, TAT PTD) en la forma de, por ejemplo, una protelna de fusion.
Un “fragmento biologicamente activo” de un receptor de AMPA incluye una secuencia de aminoacidos encontrada en un receptor de AMPA de origen natural que es capaz de modular la apoptosis o muerte celular o plasticidad sinaptica, o experimentar endocitosis, tal como se describe aqul o es conocido para los experimentados en el arte. Una “variante” de un receptor de AMPA incluye modificacion, por ejemplo, por eliminacion, adicion o sustitucion, de una secuencia de aminoacidos encontrada en un receptor de AMPA de origen natural que es capaz de modular la apoptosis o muerte celular o plasticidad sinaptica, experimentar endocitosis, tal como se describe aqul o es conocido para los de experiencia normal en el arte.
Una “protelna”, “peptido” o “polipeptido” es cualquier cadena de dos o mas aminoacidos, incluyendo aminoacidos o analogos de aminoacidos de origen natural o no natural, independientemente de la modificacion postraduccion (por ejemplo, glicosilacion o fosforilacion). Una “secuencia de aminoacidos”, “polipeptido”, “peptido” o “protelna” puede incluir peptidos o protelnas que tengan enlaces anormales, entrecruzamientos y cubiertas de extremo, enlaces no peptidilo o grupos modificadores alternativos. El termino “grupo modificador” pretende incluir estructuras que estan unidas directamente a la estructura peptldica (por ejemplo, por acoplamiento covalente), as! como aquellos que estan unidos indirectamente a la estructura peptldica (mediante una asociacion no covalente estable o mediante un acoplamiento covalente a residuos de aminoacidos adicionales, o imitadores, analogos o derivados de los mismos, que pueden flanquear la estructura peptldica central). Por ejemplo, el grupo modificador puede estar acoplado al terminal amino o al terminal carboxido de una estructura peptldica, o a una region peptldica o peptidomimetica que flanquea el dominio central. Alternativamente, el grupo modificador puede estar acoplado a una cadena lateral de al menos un residuo de aminoacido o una estructura peptldica, o a una region peptldica o peptidomimetica que flanquea el domino central (por ejemplo, a traves del grupo amino epsilon de un residuo lisilo (a traves del grupo carboxilo de un residuo de acido aspartico o un residuo de acido glutamico, a traves de un grupo hidroxi de un residuo de tirosilo, un residuo serina o un residuo treonina, u otro grupo reactivo adecuado sobre una cadena lateral de un aminoacido). Los grupos modificadores acoplados covalentemente a la estructura peptldica pueden ser unidos por medio de y utilizando metodos bien conocidos en el arte para el enlazamiento de estructuras qulmicas, incluyendo, por ejemplo, enlaces amida, alquilamino, carbamato o urea. Los peptidos descritos aqul pueden incluir las secuencias definidas en la Tabla I o sustituciones conservadoras de las mismas, formula I, o formula A o secuencias homologas de las mismas, encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o GluR4 del receptor de AMPA. En algunas realizaciones, los peptidos pueden incluir otras secuencias (por ejemplo, TAT PTD) en la forma de, por ejemplo, una protelna de fusion.
Una “molecula de acido nucleico” es cualquier cadena de dos o mas nucleotidos que incluyen nucleotidos o analogos de nucleotidos de origen natural o de origen no natural. Una molecula de acido nucleico es “complementaria” a otra molecula de acido nucleico si hibrida, bajo condiciones de alta restriccion, con la segunda molecula de acido nucleico. Las moleculas de acido nucleico descritas aqul incluyen aquellas moleculas que codifican las secuencias definidas en la Tabla I o sustituciones conservadoras de las mismas, formula I, o formula A, o secuencias homologas de las mismas, encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o GluR4 del receptor de AMPA. En algunas realizaciones, una molecula de acido nucleico puede incluir otras secuencias (por ejemplo, una secuencia que codifica para TAT PTD) para generar por ejemplo una protelna de fusion.
Una secuencia “sustancialmente identica” de una secuencia de aminoacidos o nucleotidos difiere de una secuencia de referencia en solo una o mas sustituciones conservadoras, tal como se discuten aqul, o en una o mas sustituciones no conservadoras, eliminacion o inserciones localizadas en posiciones de la secuencia que no destruye la funcion biologica tal como se describe aqul. Tal secuencia puede ser un entero desde 60% a 99%, o mas generalmente al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, o tanto como 96%, 97%, 98% o 99% identicas al nivel de aminoacidos o nucleotidos para la secuencia usada para comparacion. La identidad de secuencia puede ser medida facilmente utilizando un software de analisis de secuencia disponible publicamente (por ejemplo Sequence Analysis
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Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, o el software BLAST disponible de la National Library of Medicine, Estados Unidos de America). Ejemplos de software util incluye los programas Pile-up y PrettyBox. Tales software comparan secuencias similares asignando grados de homologla a las diversas sustituciones, eliminaciones, sustituciones y otras modificaciones. Secuencias sustancialmente identicas pueden ser secuencias por ejemplo que son sustancialmente identicas a las secuencias de aminoacidos definidas en la Tabla I o sustituciones conservadoras de las mismas, formula I, o formula A, o a secuencias homologas de las mismas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3, o GluR4 del receptor de AMPA. Una secuencia sustancialmente identica puede incluir adicionalmente secuencias sustancialmente identicas a otras secuencias (por ejemplo, TAT PTD).
Un anticuerpo “enlaza especlficamente” un antlgeno cuando lo reconoce y se enlaza al antlgeno, por ejemplo, peptido GluR CT, pero no reconoce sustancialmente ni se enlaza a otras moleculas en una muestra, por ejemplo, un peptido GluR CT que no incluye tales secuencias. Tal anticuerpo tiene, por ejemplo, una afinidad por el antlgeno que es 10, 100, 1000 o 10000 veces mayor que la afinidad del anticuerpo por otra molecula de referencia en una muestra.
La “muerte celular” o “apoptosis”, define una ejecucion especlfica de muerte celular programada que puede ser disparada por varios factores.55 La apoptosis neuronal mediada por NMDA es la muerte celular neuronal observada por activacion de los receptores de NMDa.
La “endocitosis” es el proceso mediante el cual la membrana del plasma de una celula se pliega hacia dentro, para internalizar componentes de la membrana as! como otros materiales. La endocitosis del receptor es mediada tlpicamente por pozos y veslculas de clatrina.
Un “inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina” incluye un compuesto que es capaz de inhibir especlficamente la endocitosis mediada por clatrina, sin inhibir sustancialmente la endocitosis en general. Un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina puede incluir, por ejemplo, myr-dyn, o inhibidores tales como los descritos en Jarousse y Kelly.62 Un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA tambien puede ser un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina.
Un “inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA” incluye un compuesto que puede ser capaz en general de inhibir especlficamente la endocitosis del receptor de AMPA, sin inhibir sustancialmente la endocitosis mediada por clatrina en general, cuando se compara con un inhibidor de endocitosis mediada por clatrina. En algunas realizaciones, un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA puede incluir compuestos que no afectan los niveles basales de endocitosis del receptor de AMPA, por ejemplo compuestos que son inhibidores de la endocitosis del receptor de AMPA “regulada”. Un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA puede incluir compuestos que son sustancialmente identicos a las secuencias de aminoacidos definidas en la Tabla I o sustituciones conservadoras de las mismas, formula I, o formula A, o a secuencias homologas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o GluR4 del receptor de AMPA. Un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA puede incluir un anticuerpo que imita las secuencias definidas en la Tabla I o sustituciones conservadoras de las mismas, formula I, o formula A, o a secuencias homologas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o GluR4 del receptor de AMPA, por ejemplo, un anticuerpo anti-idiotlpico a un anticuerpo que enlaza especlficamente un peptido GluR CT.
“Plasticidad sinaptica” se refiere a los cambios dependientes del uso (a largo plazo o a corto plazo) en la eficiencia de la transmision sinaptica entre celulas neuronales. La plasticidad sinaptica se considera subyacente al proceso tras el aprendizaje y la memoria.
Un “compuesto de prueba” es cualquier compuesto qulmico de origen natural o derivado artificialmente. Los compuestos de prueba pueden incluir, sin limitacion, peptidos, polipeptidos, moleculas organicas sintetizadas, moleculas organicas de origen natural y moleculas de acidos nucleicos. Un compuesto de prueba puede “competir” con un compuesto conocido, por ejemplo, un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina o un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA, tal como un peptido de GluR-CT o fragmento del mismo, por ejemplo, interfiriendo con la modulacion de la apoptosis neuronal o muerte celular o plasticidad sinaptica, endocitosis o fosforilacion de protelna, u otra respuesta biologica. En general un compuesto de prueba puede exhibir un valor entre 10% y 200%, o mas de 500%, de modulacion cuando se compara con un peptido o analogo de peptido de GluR-CT, u otro compuesto de referencia. Por ejemplo, un compuesto de prueba puede exhibir al menos un entero positivo o negativo de 10% a 200% de modulacion, o al menos cualquier entero positivo o negativo de 30% a 150% de modulacion, o al menos cualquier entero positivo o negativo de 60% a 100% de modulacion, o cualquier entero positivo o negativo de mas de 100% de modulacion. Un compuesto que es un modulador negativo en general hara disminuir la modulacion con respecto a un compuesto conocido, mientras que un compuesto que es un modulador positivo en general incrementara la modulacion con respecto a un compuesto conocido.
Una “muestra” puede ser cualquier organo, tejido, celula o extracto de celula aislado a partir de un sujeto, tal como una muestra aislada de un animal que tiene dano neurologico o disfuncion neuronal o un trastorno neurologico. Por
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ejemplo, una muestra puede incluir, sin limitacion, tejido o celulas del hipocampo, tejido o celulas del cerebelo, etc., u otro tejido neuronal u otro (por ejemplo, de una biopsia o autopsia), aislado de un animal con dano, disfuncion o trastorno neurologico, o de un animal normal, esto es, que no tiene dano, disfuncion o trastorno neurologico. Una muestra tambien puede incluir, sin limitacion, tejido tal como celulas neuronales, sangre periferica, sangre entera, concentrados de globulos rojos, concentrados de plaquetas, concentrados de leucocitos, protelnas de celulas sangulneas, plasma sangulneo, plasma rico en plaquetas, un concentrado de plasma, un precipitado de cualquier fraccionamiento del plasma, un sobrenadante de cualquier fraccionamiento del plasma, fracciones de protelna de plasma sangulneo, protelnas sangulneas purificadas o parcialmente purificadas u otros componentes, suero, semen, calostro de mamlferos, leche, orina, heces, saliva, extractos de placenta, llquido amniotico, o un crioprecipitado, un criosobrenadante, un lisado celular, un cultivo o medio de cultivo de celulas de mamlfero, productos de fermentacion, fluido ascltico, protelnas presentes en celulas sangulneas, tumores solidos aislados de un mamlfero con un carcinoma neuronal, o cualquier otro especimen, o cualquier extracto del mismo, obtenido de un paciente (humano o animal), sujeto de prueba o animal experimental. Una muestra tambien puede incluir, sin limitacion, productos producidos en cultivo celular por celulas normales o celulas aisladas de un sujeto con dano neurologico o disfuncion neuronal (por ejemplo, a traves de la tecnologla de ADN recombinante). Una “muestra” puede ser tambien una celula o llnea celular creada bajo condiciones experimentales, que no es aislada directamente de un sujeto. Una muestra puede ser tambien libre de celulas, derivada artificialmente o sintetizada. En algunas realizaciones, las muestras se refieren a tejidos o celulas neuronales. En algunas realizaciones, la muestra puede ser de un sujeto que tiene dano neurologico o disfuncion neuronal; o de un sujeto normal, esto es, no diagnosticado con o en riesgo de o del que se sospeche que tiene un dano neurologico o disfuncion neuronal.
Tal como se utiliza aqul, un sujeto puede ser un humano, un primate no humano, rata, raton, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato, Aplysia, etc. El sujeto puede ser un paciente cllnico, un voluntario para ensayo cllnico, un animal experimental, etc. El sujeto puede ser objeto de sospecha de tener o estar en riesgo de tener dano neurologico o disfuncion neuronal, estar diagnosticado con dano neurologico o disfuncion neuronal, o ser un sujeto de control del que se ha confirmado que no tiene dano neurologico o disfuncion neuronal. Los metodos diagnosticos para dano neurologico o disfuncion neuronal y el delineamiento cllnico para el diagnostico de dano neurologico o disfuncion neuronal son conocidos para las personas de experiencia normal en el arte.
Por “poner en contacto” se entiende someter un animal, celula, lisado, extracto, molecula derivada de una celula, o molecula sintetica a un compuesto de prueba.
Por “determinar” se entiende el analisis del efecto de un compuesto de prueba sobre el sistema de prueba. Los medios para analizar pueden incluir, sin limitacion, marcacion con anticuerpos, ensayos de apoptosis, inmunoprecipitacion, ensayos de fosforilacion in vivo e in vitro, ensayos de muerte celular, ensayos de inmunofluorescencia, ELISA, analisis ultraestructural, analisis histologico, modelos animales o cualquier otro metodo descrito aqul o conocido por los experimentados en el arte.
“Que modula” o “modula” implica cambiar, bien sea incrementar o disminuir. El incremento o disminucion puede ser un cambio de cualquier valor entre 10% y 90% o de cualquier valor entre 30% y 60%, o puede estar por encima de 100%, por encima de 200%, por encima de 300% o por encima de 500% cuando se compara con un control o muestra de referencia o compuesto.
Otras caracterlsticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion de los dibujos y la invencion y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
Figuras 1A-F. El NMDA induce la apoptosis en cultivos primarios de neuronas de hipocampo de rata. Las neuronas de hipocampo maduras fueron tratadas con NMDA (100 pM mas glicina 10 pM; 1 hora) y luego se regresaron a un medio normal durante 24 horas. En esta y en las siguientes figuras, todos los datos se expresan como media ± SEM y se analizaron utilizando una prueba t de Student no pareada. El tratamiento A, B con NMDA induce un incremento dependiente del tiempo en la actividad de caspasa-3. A: inmunoprecipitacion western de lisado celular utilizando caspasa-3 antiescindida; B: ensayo de ELISA que detecta escision de DEVD-pNA. C. electroforesis en gel de agarosa que muestra escalamiento de ADN significativo despues de tratamiento con NMDA. D, ensayo de ELISA para muerte celular por apoptosis que mide la histonabiotinilacion muestra que la apoptosis inducida por NMDA esta bloqueada por el antagonista del receptor de NMDA, APV. E,F, ensayos de ELISA para muerte celular por apoptosis muestran que los inhibidores de endocitosis bloquean especlficamente la apoptosis inducida por NMDA, pero no por STS en neuronas de hipocampo cultivadas.
Figuras 2A-D. Los inhibidores de endocitosis perturban la activacion mediada por el receptor de NMDA de la ruta de senalizacion de la muerte celular sin alterar la funcion de receptor de NMDA. A, B, la inhibicion de endocitosis tiene poco efecto sobre el influjo de Ca2+ a traves de canales receptores de NMDA activados. El trazo superior (A) muestra un registro de las fluctuaciones de [Ca2+]i inducidas por la activacion del receptor de NMDA por medicion de los cambios radiometricos en fluorescencia con Fura-2 en una neurona individual de hipocampo. La aplicacion de
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NMDA repetitiva (100 pM) en la region de la neurona bajo observacion fue lograda utilizando una pipeta de eyeccion a presion en los puntos de tiempo indicados por los cuadrados negros inferiores (500 ms cada uno). Se aplico sacarosa (400 mM) al bano tal como se indica por la barra negra superior. El histograma en la parte inferior (B) resume las respuestas de [Ca2+]i a puntos de tiempo indicados a partir de tres neuronas individuales (media ± SEM). C, un peptido derivado de dinamina miristoilada inhibe la activacion inducida por NMDA de la caspasa-3. D, la inhibicion de la endocitosis perturba especlficamente la reduccion inducida por NMDA, pero no por STS en la fosforilacion de Akt. Los lisados celulares tratados como se indica fueron sondeados primero con un anticuerpo especlfico al Akt fosforilado sobre la serina 473, la forma activa de la enzima. Las neuronas fueron entonces desprendidas y resondeadas con un anticuerpo anti-Akt. Las siembras de cuatro experimentos individuales fueron escaneadas y cuantificadas. El histograma representa la fosforilacion de Akt relativa con respecto a Akt total. **, p<0.01 en comparacion con el grupo de control respectivo.
Figuras 3A-B. El NMDA induce el receptor de AMPA pero no la endocitosis del receptor de NMDA, la cual es bloqueada por el peptido de dinamina miristoilada permeable a la membrana (Myr-Dyn) as! como un peptido derivado de la cola c de GluR2 (R2-CT). A, ensayo de receptor de superficie celular basado en ELISA para el receptor de NMDA y el receptor de AMPA. El tratamiento con NMDA indujo una reduccion significativa en el receptor de AMPA de la superficie celular pero no del receptor NMDA, y la internalizacion del receptor de AMPA fue evitada por el pretratamiento de las neuronas con el peptido inhibidor de dinamina permeable a membrana mirsitoilado (Myr- Dyr; 10 pM), pero no por el control impermeable a membrana, Dyn (** denota p<0.01 en comparacion con control; n=36-72 pozos de tres experimentos separados para cada grupo). B, la internalizacion del receptor de AMPA inducida por NMDA es bloqueada por R2-CT, un peptido que bloquea regularmente la endocitosis del receptor de AMPA regulada.
Figuras 4A-B. Bloqueo de la endocitosis del receptor de AMPA con R2-CT evita la apoptosis inducida por NMDA pero no por STS en neuronas de hipocampo cultivadas. A, ensayo de ELISA para muerte celular por apoptosis mostrando que R2-CT bloquea la apoptosis inducida por NMDA pero no por STS. B, recuento celular para apoptosis de celulas tenidas PI despues de fijacion, mostrando que R2-CT bloqueo la apoptosis inducida por NMDA.
Figuras 5A-B. Construction de mutantes de GluR2 por elimination interna o truncamiento del terminal carboxilo e identification de una senal basada en tirosina (GluR2-3Y). A. Secuencias de mutantes CT por eliminacion interna o truncamiento de la subunidad GluR2 de longitud completa marcada con HA y no marcada. B. Cuantificacion de AMPARs expresado en superficie celular que contiene el GluR2, o diversos constructos mutantes, que fueron transfectados de manera transiente en celulas HEK293 y ensayados por ELISA en celda colorimetrica (n=6). Los niveles de expresion de los constructos despues de la transfection transiente en celulas HEK293 fueron determinadas por ensayos con ELISA en celda utilizando un anticuerpo anti-HA para constructos marcados con HA, o un anticuerpo de la subunidad anti-GluR2 para el constructo no marcado con HA, bajo condiciones permeabilizadas. El nivel de expresion fue normalizado al nivel de expresion del constructo tipo silvestre correspondiente (esto es, HA-GluR2 o GluR2). Todos los mutantes fueron expresados a un nivel similar a las contrapartes tipo silvestre. Al eliminar la senal basada en tirosina se evita la disminucion inducida por insulina del AMPARs de superficie celular (barras rellenas) sin afectar el nivel del receptor basal. Al eliminar los dominios de enlazamiento a NSF se afecta la expresion del receptor basal pero no reducido por insulina, y que a diferencia de las neuronas, las senales de endocitosis tanto de AP2 como basadas en PICK1 son no funcionales en celulas HEK. * p<0.05, ** p<0.01.
Figuras 6A-B. Efectos de las mutaciones en GluR2 CT sobre la endocitosis y la expresion en superficie celular de los receptores de AMPA. A. Cuantificacion de los cambios en endocitosis constitutiva (basal) y regulada (insulina) de GluR2 y sus diversos mutantes utilizando un ensayo colorimetrico de ELISA con celulas premarcadas despues de la internalizacion de los receptores al cabo de 30 minutos (% de endocitosis de AMPAR=100%-receptores de superficie celular remanentes/numero total de receptores; n=6). Control: Internalizacion medida en celulas a 4 E C sin exposition a 37 E C (bajo estas condiciones, ambas endocitosis constitutiva y regulada se bloquean). B. Receptores de AMPA en superficie celular en celulas HEK293 que expresan de manera transiente GluR2 y sus diversos mutantes fueron cuantificados utilizando ensayos de receptor en superficie celular basados en ELISA en celda colorimetrica (n=6). Las comparaciones estadlsticas se hicieron entre las condiciones basal y tratada con insulina, excepto cuando se indica mediante llneas. * p<0.05, ** p<0.01 1.
Figura 7A-D. La insulina incrementa la fosforilacion de los residuos de tirosina dentro de la region terminal carboxilo (CT) de GluR2. A. Fosforilacion de tirosina in vitro del GluR2 CT. Protelnas de fusion GST del GluR1 CT (GST- GluR1CT), el GluR2 CT (GST-GluR2CT), residuos 869, 876 (YKEGYNVYG) del GluR2 CT (GST-GluR23Y), que contiene un aglomerado de tres residuos de tirosina (Y869, Y873, y Y876) y el mismo contenido de aminoacidos del gel GluR2 CT con sus residuos de tirosina reemplazados por alaninas (GST-GluR23A), junto con el esqueleto de GST (GST) como control, fueron incubados en la ausencia (-) o presencia (+) de pp 60 c-Src recombinante. Los productos de fosforilacion fueron sometidos a inmunoprecipitacion utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina (panel superior). La tincion con Ponceau S de la misma mancha mostro que una cantidad similar de protelna de fusion de GST fue utilizada en cada una de las reacciones (panel inferior). B. Niveles de expresion de HA-GluR2 y HA- GluR23Y-3A (donde las tirosinas 869, 873 y 876 fueron mutadas a alaninas) 48 horas despues de la transfeccion
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transiente en celulas HEK293 fueron determinados mediante un ensayo de ELISA en celda utilizando celulas permeabilizadas. C. Las celulas HEK293 transfectadas de manera transiente con HA-GluR1, HA-GluR2 o HA- GluR23Y-3A, junto con un vector vaclo (transfeccion falsa) como control. Cuarenta y ocho horas despues, las celulas fueron tratadas con o sin insulina 0.5 pM durante 10 minutos. Los lisados fueron sometidos entonces a inmunoprecipitacion con un anticuerpo anti-HA bajo condiciones de desnaturalizacion y se realizo la inmunoprecipitacion con un anticuerpo anti-fosfotirosina (mancha superior; IB:PY). La misma mancha fue desprendida y reinmunoprecipitada con el anticuerpo anti-HA para asegurar una eficiencia de inmunoprecipitacion similar en todos los experimentos individuales (mancha inferior; IB:HA). D. Mutacion de las tirosinas individuales del peptido Glu23Y-CT a alaninas.
Figuras 8A-B. El aglomerado de tirosina en el GluR2 CT es requerido para la endocitosis del receptor de AMPA regulada, pero no constitutiva, en celulas HEK293. A. Los ensayos de endocitosis del receptor por ELISA colorimetrica en celula fueron llevados a cabo con estimulacion (insulina) o sin estimulacion (control) (vease Figura 2) sobre celulas HEK293 transfectadas de manera transiente con la subunidad HA-GluR2 tipo silvestre o HA- GluR23Y-3A, en la cual los residuos de tirosina Y869, Y873 y Y876 fueron mutados en alaninas. B. Resultados del ensayo del receptor de superficie celular por ELISA colorimetrica en celulas de celulas HEK293 transfectadas y tratadas como en (A). Los resultados fueron obtenidos a partir de 6 experimentos para cada grupo individual. ** p < 0.01
Figuras 9A-D. La insulina estimula la fosforilacion de tirosina de GluR2 y la depresion de larga duracion de la transmision sinaptica mediada por el receptor de AMPA. A. Homogenizados de tejido de secciones de hipocampo tratadas con insulina (basal) o sin insulina (INS; 0.5 pM, 10 min) fueron inmunoprecipitados con anticuerpos anti- GluRI o GluR2 bajo condiciones de desnaturalizacion (IP: GluRI o GluR2). Los inmunoprecipitados fueron inmunoprecipitados entonces utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina (IB:PY). La mancha fue desprendida secuencialmente y resondeada con anticuerpos anti-GluR2 (IB: GluR2) y anti-GluR1 (IB: GluRI). B. Cuantificacion densitometrica expresada como la relacion de GluR2 fosforilado a GluR2 total de tres experimentos separados se resume en el histograma a la derecha. ** p < 0.01 C. Las EPSCs fueron registradas en neuronas CA1 de secciones de hipocampo utilizando registros para celula completa bajo el modo de voltaje-pinza a un potencial de sostenimiento de -60 mV. Las EPSCs normalizados (EPSCt/EPSC0) son representados graficamente a partir de neuronas registradas con pipetas que contenlan solucion intracelular estandar (control, n=7) o solucion intracelular suplementada con GSTY869KEGY873NVY876G (GluR23Y; n=5) o GST-A869KEGA873NVA876G (GluR3A; n=6). El tiempo cero se define como el punto del tiempo en el cual las amplitudes de EPSCs fueron estabilizadas (tlpicamente 5-10 minutos despues del inicio del registro de la celula entera), y a t = 10 minutos, se aplico insulina (0.5 pM) en el bano como se indica con la barra negra horizontal. D. A la izquierda se muestran EPSCs representativas promediadas a partir de cuatro registros individuales antes (basal) o 10 minutos despues de la aplicacion de insulina (INS).
Figuras 10A-E. La fosforilacion de tirosina de la subunidad GluR2 es requerida para la depresion a largo plazo de CA1 hipocampo inducida por LFS (LTD). A. Los homogenizados de control o las secciones de hipocampo tratadas con LFS fueron inmunoprecipitadas con anticuerpos anti-GluR1 o GluR2 y sondeadas secuencialmente con anti- fosfotirosina (PY), anti-GluR1 (GluR1) y anti-GluR2 anticuerpos (GluR2) como se describe aqul. La llnea marcada como M contiene estandares de peso molecular. B. Los resultados de tres experimentos individuales se resumen en la grafica de barras. ** p < 0.01 C. Se muestran respuestas representativas a la izquierda. D. Las graficas a la derecha, y en E representan EPSCs (EPSCt/EPSC0) normalizados a partir de neuronas registradas como se describe con pipetas que contenlan solucion intracelular estandar (control, n=7) o solucion intracelular suplementada con GluR23Y (B; n=6), GluR23A (B; n=7) o GluR2834-843 (C; n=5). El LFS fue administrado durante el perlodo de tiempo indicado por la barra negra horizontal.
Figuras 11A-B. El peptido GluR2 CT previene la endocitosis y la apoptosis neuronal del receptor de AMPA inducida por isquemia en un modelo de cultivo neuronal de apoplejla. A. Un ensayo colorimetrico (celula-ELISA) muestra que el OGD facilita la endocitosis del receptor de AMPA, haciendo disminuir por lo tanto su expresion sobre la superficie de la membrana de plasma y la preincubacion del peptido de GluR2-CT redujo el descenso inducido por OGD en la expresion del receptor de AMPA en superficie celular (n=6; * : P<0.05, prueba de Student, en comparacion con control). B. Ensayo de apoptosis cuantitativo 24 horas despues de OGD utilizando el kit Cell Death Detection ELISA plus (Roche, Cat# 1 774 425) demuestra que OGD produce muerte neuronal que se evita grandemente mediante un pretratamiento de neuronas con GluR2-CT. (n=6; **: P<0.01, prueba t de Student, en comparacion con OGD).
Figuras 12A-D. Aplicacion sistemica del peptido Tat-GlurR23Y bloquea la expresion de la sensibilizacion en comportamiento al farmaco de abuso d-anfetamina en un modelo animal de adicion a farmacos. El peptido GluR2-3Y o GluR2-3A fue fusionado a un dominio de transduccion Tat (Tat-GluR2-3Y o GluR2-3A) para facilitar la permeabilidad de la membrana. La administracion intravenosa (IV; 1.5 nM/g) o la microinyeccion directa en el nucleus accumbens (NAc) con el peptido de interferencia GluR2-3Y, pero no por el peptido de control GluR2-3A, bloquea la sensibilizacion de comportamiento inducida por D-anfetamina (D-Amph) de esterotipia. A. Las calificaciones de estereotipia establecidas a diversos puntos del tiempo muestran un bloqueo de una sensibilizacion despues de la inyeccion intravenosa de Tat-GluR2-3Y. Los puntos representan marcadores de estereotipia medios
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(+ S.E.M) para cada grupo de ratas probadas durante la sesion de 2 horas. Las ratas tratadas con solucion salina cronica sirvieron como sujetos de control. B. El resumen de los cambios en los marcadores de estereotipia a traves de las 2 horas de sesion de prueba convertidos al area bajo la curva (AUC) para grupos individuales representados en la grafica A. C. Microinyeccion intracraneana de GluR2-3Y en las NAc tambien bloquea la sensibilizacion inducida por D-Amph. D. La microinyeccion intracraneana del peptido GluR2-3Y en el area tegumental ventral (VTA) no bloquea la sensibilizacion en comportamiento inducida por D-Amph. (* =p<0.05, con respecto al grupo de anfetamina aguda).
Figura 13. El Tat-GluR2-3Y bloquea la endocitosis de AMPAR inducida por NMDA. Las neuronas corticales de Wistar in vitro en el dla 12-13 fueron pretratadas durante 60 minutos bien con solucion salina o con Tat-GluR2-3Y o Tat-GluR2-3A 1 pM seguido por un tratamiento con NMDA 50 pM durante 30 minutos. El porcentaje de expresion de AMPAR medido por ELISA celular fue definido como la cantidad de expresion en superficie (no permeabilizada) dividido por la expresion total (permeabilizada). Los datos son representativos de 1 o 4 experimentos separados, cada uno con 4 mediciones replicadas y se expresan como media ± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.05, prueba de Tukey- Kramer.
Figura 14. El Tat-GluR2-3Y atenua la apoptosis neuronal en respuesta a la privacion de oxlgeno y glucosa. Las neuronas corticales Wistar in vitro en los dlas 12-13 fueron pretratadas bien con Tat-GluR2-3Y o solucion salina durante 60 minutos, seguida por 60 minutos de OGD o incubacion a 37°C (control). A las 24 horas, la apoptosis fue cuantificada utilizando un ELISA direccionado a nucleosomas libres. Los datos fueron normalizados con respecto al control y expresados como media ± SEM de 3 experimentos repetidos. * Grupo OGD fue significativamente diferente de todos los otros grupos p < 0.05, prueba de Tukey-Kramer.
Figura 15. Curva de tolerancia a la dosis frente a dosis seriada de Tat-GluR2-3Y. Dos ratas Sprague-Dawley macho adultas recibieron dosis seriadas de Tat-GluR2-3Y y se monitorizaron los parametros vitales basicos. Dosis de hasta 6 nmoles/g evocaron poca respuesta en los parametros monitorizados; sin embargo, dosis mas altas dieron como resultado un descenso grande en la presion arterial media y un incremento concurrente en la rata de respiracion. Ambos animales no mostraron signos de comportamiento alterado despues de salir de la anestesia.
Figura 16. La oclusion arterial cerebral media transiente dio como resultado una apoptosis incrementada. Dos ratas Sprague-Dawley macho adultos fueron sometidos a 90 minutos de oclusion MCA o a cirugla sin oclusion de MCA (sham). A las 24 horas, las ratas fueron sacrificadas, y se tineron con TUNEL en secciones de cerebro de 12 pM. El numero de nucleos positivos a TUNEL fue contado para tres campos visuales y presentado como media ± SEM (B). * p < 0.01, prueba t de Student.
Figuras 17A-B. El efecto del Tat-GluR2-3Y sobre la apoptosis en un modelo de ratas de isquemia focal transiente. Ratas Sprague-Dawley macho adultas fueron pretratadas durante 1 hora bien sea con solucion salina, o 3 nmol/g de Tat-GluR2-3Y o Tat-GluR2-3A y luego sometidas a 60 minutos de oclusion MCA. Las ratas recibieron un examen neurologico antes del sacrificio a las 24 horas (A). Secciones de la corona del cerebro de 12 pm fueron tenidas con TUNEL y el numero de celulas positivas a TUNEL fue contado para cada seccion (B). Los datos son normalizados con respecto a un control de cirugla simulada se expresan como valores medios ± SEM. El peptido redujo la apoptosis en 55% con respecto al control.
Figuras 18 A-B. Experimentos de control para confirmar que GluR2-3Y no tiene efectos no especlficos sobre comportamientos aprendidos reforzados por estlmulos de recompensa con alimento o farmaco. Estos experimentos tambien demuestran que este peptido de interferencia no perturba las funciones motoras sensoriales o de memoria relacionadas con el rendimiento del comportamiento operativo en dos diferentes programaciones de refuerzo. A. Las ratas mantenidas en una programacion restringida de alimentacion fueron entrenadas para presionar una palanca para obtener pellas de alimento (45 mg) en una programacion de relacion fija 2 (FR2) durante sesiones de prueba de 2 horas. Las ratas recibieron inyecciones IV de solucion salina, GluR2-3A, o GluR2-3Y, en un orden contrabalanceado, 60 minutos antes de la sesion de prueba. No hubo diferencias significativas en el numero total de respuestas para la recompensa con alimento, entre las tres condiciones. B. Las ratas fueron entrenadas primero para autoadministracion d-anfetamina (0.2 mg/infusion) a traves de un cateter yugular en una programacion FR2 de refuerzo. Una vez que la respuesta en las sesiones de prueba de 3 horas se habla estabilizado, las ratas fueron entrenadas entonces sobre una Programacion de Proporcion Progresiva en las cuales se requirieron mas respuestas para obtener cada refuerzo sucesivo. La proporcion en la cual las ratas fallaron en ejecutar el numero apropiado de respuestas en un perlodo de 1 hora se denomina el punto de ruptura y esta prueba es una medida sensible del valor de recompensa no condicional y un estimulo de recompensa especlfico. Una vez que se establecen los valores del punto de ruptura, las ratas recibieron inyecciones IV de solucion salina, GluR2-3A, o GluR2-3Y, en un orden contrabalanceado, 60 minutos antes de la sesion de prueba. No hubo diferencias significativas en las mediciones del punto de ruptura para recompensa con farmaco, entre las tres condiciones.
Figura 19. El peptido GluR2-3Y bloqueo la ansiedad inducida por estres en un modelo de estres en rata. Las ratas (n=2) fueron inyectadas bien con GluR2-3Y 10 nM/g o un volumen igual de vehlculo ACSF (IP). Permanecieron 30 minutos en un habitaculo oscuro despues de la inyeccion. Despues de esto fueron colocadas en una plataforma
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elevada durante 30 minutos como prueba de estres. Despues de esos 30 minutos fueron colocadas en laberinto elevado plus durante 5 minutos. Las ratas inyectadas con GluR2-3Y gastaron mas tiempo en los brazos abiertos que las ratas ACSF. Las ratas ACSF gastaron mas de su tiempo en las esquinas de los brazos cerrados o retrocedieron hacia las paredes. Asl, el peptido GluR23Y bloqueo la ansiedad inducida por estres. Estos resultados sugieren fuertemente que la endocitosis de AMPAR facilitada y por lo tanto la expresion de LTD juega un papel indispensable en la expresion de comportamientos inducidos por estres y que el bloqueador de LTD tal como el GluR23Y puede ser utilizado en procedimientos terapeuticos para tratar desordenes cerebrales relacionados con el estres.
Description detallada de la invention
La invencion provee, en parte, metodos y reactivos para modular la apoptosis neuronal mediada por NMDA. La invencion tambien provee, en parte, metodos y reactivos para modular la plasticidad sinaptica. Por ejemplo, los compuestos de acuerdo con la invencion pueden ser utilizados como agentes neuroprotectores que son capaces de modular la endocitosis del receptor de AMPA. En algunas realizaciones, tales compuestos pueden modular la endocitosis del receptor de AMPA y bloquear la apoptosis neuronal sin afectar la funcion del receptor de NMDA, y por lo tanto pueden eludir los efectos negativos del bloqueo de la funcion del receptor de NMDA.
Se describen aqul realizaciones alternativas y ejemplos de la invencion.
Ensayos
Pueden llevarse a cabo diversos ensayos, tal como se describe aqul o es conocido por una persona de experiencia normal en el arte, para determinar la actividad moduladora de un compuesto de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, la modulation de la plasticidad sinaptica, la endocitosis del receptor de AMPA, la apoptosis neuronal inducida por NMDA o la fosforilacion del receptor de AMPA, pueden ser probados como se describe aqul o como es conocido para una persona de experiencia normal en el arte. En algunas realizaciones, los ensayos pueden ser llevados a cabo para probar los compuestos en cuanto a su capacidad para inhibir la endocitosis del receptor de AMPA. Tales ensayos incluyen sin limitation ensayos basados en acidos nucleicos, polipeptidos, moleculas pequenas, etc., tales como inmunoensayos, ensayos de hibridacion, ensayos de enlazamiento de moleculas pequenas, ensayos de enlazamiento de peptidos, ensayos de enlazamiento de anticuerpos, ensayos de competition, ensayos de endocitosis, ensayos de fosforilacion, ensayos de apoptosis y muerte celular, histoqulmica, ensayos en modelos animales e in vitro, etc.
Los polipeptidos del receptor de AMPA pueden ser provistos en celulas neuronales o no neuronales, o en lisados celulares. Las celulas y llneas celulares pueden ser obtenidas a partir de fuentes convencionales, por ejemplo, ATCC, Manassas, VA, Estados Unidos de America. Modelos animales adecuados para trastornos neurologicos
pueden ser obtenidos, por ejemplo, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, Estados Unidos de America o de otras
1 1 J 1 J 07 94 1 01 106 112

fuentes. Modelos animales adecuados incluyen modelos para apoplejla " , adicion a farmacos " , ,

107 111 112 115 1 1 1 J 116
esquizofrenia , enfermedad de Huntington , epilepsia , neurocomplicacion de sida , retardo mental (por

1 14 7 110 1 1 119 1201 '1

ejemplo, retardo X fragil, slndrome de Rett) , , y esclerosis multiple , .
Los ensayos pueden ser llevados a cabo utilizando moleculas detectablemente marcadas, esto es, cualquier medio para marcar e identificar la presencia de una molecula, por ejemplo, una sonda o cebador de oligonucleotidos como un gen o fragmento del mismo, un peptido, o una molecula de ADNc. Los metodos para marcar de manera detectable una molecula son bien conocidos en el arte e incluyen, sin limitacion, marcacion radioactiva (por ejemplo, con un isotopo tal como 32P o 35S) y marcacion no radioactiva tal como, por ejemplo, marcacion enzimatica (por ejemplo, utilizando peroxidasa de rabano o fosfatasa alcalina), marcacion quimioluminiscente, marcacion fluorescente (por ejemplo utilizando fluorescelna), marcacion bioluminiscente o detection de anticuerpos de un ligando unido a la sonda. Tambien se incluye en esta definition una molecula que esta marcada de manera detectable a traves de un medio indirecto, por ejemplo, una molecula que esta enlazada con una primera unidad estructural (tal como biotina) que, a su vez, esta enlazada a una segunda unidad estructural que puede ser observada o probada (tal como estreptavidina marcada con fluorescelna). Los marcadores tambien incluyen digoxigenina, luciferasas y aecuorina.
Trastornos y condiciones
Cualquier trastorno o condition que incluye disfuncion neural, por ejemplo debido a danos neurologicos o sensibilization al comportamiento debido a la activation excesiva de los receptores de NMDA o debido a cambios en la endocitosis del receptor de AMPA pueden ser tratados, prevenidos o estudiados de acuerdo con los metodos y compuestos de la invencion. Por lo tanto, los trastornos asociados con otras condiciones que varlan desde hipoglicemia, hipoxia y paro cardiaco hasta epilepsias se consideran trastornos con dano neurologico de acuerdo con la invencion. Los trastornos de acuerdo con la invencion incluyen sin limitacion isquemia cerebral, que se presenta por ejemplo despues de una apoplejla (apoplejla isquemica debida por ejemplo a una enfermedad aterotrombotica de por ejemplo, arterias extracraneanas o a embolos de infarto cardiaco o lacunar) o trauma
cerebral (por ejemplo, hemorragia intracerebral o hemorragia subaracnoide); lesiones en la cabeza; trastornos neurodegenerativos en los cuales las neuronas comprometidas se hacen sensibles a dano excitotoxico; enfermedad de Alzheimer, Parkinson o Huntington; epilepsia, dolor neuropatico; esclerosis lateral amiotrofica (ALS); slndrome de Hutchinson Gilford; diabetes; ataxia; retardo mental; o demencias. Los factores de riesgo principal para apoplejla 5 incluyen tabaco, diabetes, obesidad y presion sangulnea elevada. De acuerdo con lo anterior, los sujetos que tienen cualquiera de estas condiciones o comportamientos pueden considerarse como poseedores de un trastorno de acuerdo con la invencion.
Los trastornos de acuerdo con la invencion tambien incluyen aquellos trastornos asociados con defectos o disfuncion en el aprendizaje o la memoria; trastornos psiquiatricos, tales como autismo, esquizofrenia o slndrome X fragil; o 10 trastornos asociados con abuso de sustancias o adiccion a farmacos, incluyendo nicotina, alcohol, opiatos tales como herolna, codelna y morfina, incluyendo derivados tales como petidina y metadona, nicotina, marihuana, feniclideno, psicoestimulantes tales como anfetaminas y cocalna, barbituratos tales como pentobarbitona y quinalbarbitona, y benzodiacepinas tales como temazepam, diazepam y flunitrazepam.
Anticuerpos
15 Los compuestos de la invencion pueden ser usados para preparar anticuerpos para peptidos de GluR2-CT o analogos de los mismos, por ejemplo, las secuencias definidas en la Tabla I o sustituciones conservadoras de las mismas, formula I, o formula A, o a secuencias homologas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o GluR4 del receptor de AMPA, utilizando tecnicas estandar de preparacion como, por ejemplo, las descritas en Harlow y Lane56, o conocidas por los experimentados en el arte. Los anticuerpos pueden ser disenados para 20 minimizar la respuesta inmune adversa del huesped, por ejemplo utilizando anticuerpos quimericos que contienen un dominio de enlazamiento a una especie y la porcion Fc de otra especie, o utilizando anticuerpos hechos a partir de hibridomas de las especies apropiadas. Los anticuerpos pueden ser elevados, por ejemplo contra un peptido o GluR-CT fosforilado que esta fosforilado en una o mas tirosinas o serinas o treoninas. Los anticuerpos tambien pueden ser elevados, por ejemplo, contra un peptido GluR-CT fosforilado constitutivamente que reemplaza las 25 tirosinas o serinas o treoninas con glutamatos y aspartatos. Pueden elevarse anticuerpos anti-idiotlpicos, por ejemplo, contra un anticuerpo que se enlaza especlficamente a un peptido de GluR CT o analogo del mismo.
Polipeptidos y compuestos de prueba
En un aspecto, los compuestos descritos aqul incluyen peptidos GluR2, GluR3 o GluR4 y analogos y variantes de los mismos, incluyendo, por ejemplo, los peptidos descritos aqul que estan fosforilados o no fosforilados en una 30 cualquiera de las tres tirosinas, incluyendo polipeptidos que estan fosforilados constitutivamente, o que estan no fosforilados, as! como homologos y fragmentos de los mismos. Por ejemplo, los compuestos descritos aqul incluyen peptidos que incluyen las secuencias definidas en la Tabla I o analogos o variantes de la misma.
Tabla I
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En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la invention no tienen, o tienen en un menor grado, los efectos colaterales negativos asociados con el uso de otros agentes neuroprotectores. Por ejemplo, los compuestos de acuerdo con la invencion, pueden exhibir cualquier valor de entre 10% a 100% de reduction en psicotomimesis, depresion respiratoria, desregulacion cardiovascular, o cualquier otro efecto colateral adverso cuando se comparan con un antagonista receptor de NMDA o bloqueador de liberation de glutamato (tal como Selfotel, Gavestinel, Aptinagel, Memantina, etc.75'78,95'99).
En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la invencion son eficaces de manera similar o mas eficaces que los agentes neuroprotectores existentes tales como los antagonistas del receptor de NMDA (por ejemplo, Gavestinel o Aptinagel) u otros agentes neuroprotectores (por ejemplo, antagonista R del peptido opioide Kappa tal como Cervene; inhibidores de NOS tal como Lubelozol; bloqueadores del canal de Na+ tales como Lubeluzol; estabilizadores de la membrana celular tales como Citicolina; antagonistas del canal de Ca2+; anticuerpos anti-ICAM tales como Enlimornab; moduladores del receptor de GABAa tales como clometiazol; inhibidores de la liberacion de glutamato tales como Riluzol)79-84,100 Por ejemplo, los compuestos de acuerdo con la invencion pueden exhibir cualquier valor de entre 0% a 100% o mayor que 100% de eficacia cuando se comparan con otros agentes neuroprotectores.
En realizaciones alternativas, uno o mas de los compuestos descritos aqul pueden ser excluidos especlficamente de uno o mas aspectos de la invencion.
Los compuestos pueden ser preparados, por ejemplo, reemplazando, eliminando o insertando un residuo de aminoacido en cualquier position del peptido GluR, o analogo de peptido, por ejemplo, una secuencia de peptido de GluR2-CT tal como se define en la Tabla I, formula I, o formula A, o en secuencias homologas encontradas en el terminal C de las subunidades GluR2, GluR3 o GluR4 del receptor de AMPA, tal como se describe aqul, con otros residuos de aminoacidos conservadores, esto es, residuos que tienen propiedades flsicas, biologicas o qulmicas similares, y cribando en cuanto a la capacidad del compuesto para inhibir la endocitosis del receptor de AMPA. Se describen compuestos que incluyen anticuerpos que se enlazan especlficamente a un polipeptido de GluR, por ejemplo un peptido de GluR2-CT, el cual puede ser fosforilado, no fosforilado, no fosforilable o fosforilado constitutivamente. Tambien se describen compuestos que incluyen anticuerpos que se enlazan a anticuerpos que enlazan especlficamente peptidos GluR CT.
Es bien conocido en el arte que pueden hacerse algunas modificaciones y cambios en la estructura de un polipeptido sin alterar sustancialmente la funcion biologica de ese peptido, para obtener un polipeptido biologicamente equivalente. Por ejemplo, los compuestos de acuerdo con la invencion pueden ser adaptados o modificados para administracion oral de tal manera que son resistentes a la digestion por los acidos estomacales. Los polipeptidos de la presente invencion tambien se extienden a peptidos biologicamente equivalentes que difieren de una portion de la secuencia de los polipeptidos de la presente invencion mediante sustituciones de aminoacidos conservadores tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3. Tal como se utiliza aqul, el termino “sustituciones de aminoacidos conservadoras” o “sustituciones conservadoras” se refieren a la sustitucion de un aminoacido por otro en una localization dada en un peptido de GluR CT (por ejemplo, tal como los definidos en la Tabla I, formula I, o formula A, o en secuencias homologas encontradas en el terminal C de la subunidades GlusR2, GluR3 o GluR4, del receptor de AMPA), cuando la sustitucion puede hacerse sin perdida sustancial de la funcion relevante. Al hacer tales cambios, la sustitucion de residuos de aminoacidos similares puede hacerse sobre la base de una similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral, por ejemplo, su tamano, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad y similares, y tales sustituciones pueden ser probadas en cuanto a su efecto sobre la funcion del peptido mediante pruebas de rutina.
Tal como se utiliza aqul, el termino “aminoacidos” significa aquellos L-aminoacidos encontrados comunmente en protelnas de origen natural, D-aminoacidos tales como aminoacidos cuando han sido modificados. De acuerdo con lo anterior, los aminoacidos pueden incluir, por ejemplo: acido 2-aminoadlpico; acido 3-aminoadipico; beta-alanina; acido beta-aminopropionico; acido 2-aminobutlrico; acido 4-aminobutlrico; acido piperidlnico; acido 6-aminocaproico; acido 2-aminoheptanoico; acido 2-aminoisobutlrico; acido 3-aminoisobutlrico; acido 2-aminopimelico; acido 2,4
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diaminobutirico; desmosina; acido 2,2’-diaminopimelico; acido 2,3-diaminopropionico; N-Etilglicina; N-Etilasparagina; Hidroxilisina; alo-Hidroxilisina; 3-Hidroxiprolina; 4-Hidroxiprolina; Isodesmosina; alo-Isoleucina; N-Metilglicina; sarcosina; N-Metilisoleucina; 6-N-metil-lisina; N-Metilvalina; Normalina; Norleucina; y Ornitina.
Las sustituciones conservadas de aminoacidos pueden hacerse cuando un residuo de aminoacidos es sustituido por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar (por ejemplo, dentro de un valor de mas o menos 2.0, o mas o menos
1.5, o mas o menos 1.0, o mas o menos 0.5), donde el siguiente puede ser un aminoacido que tenga un Indice hidropatico de aproximadamente -1.6 tal como Tyr (-1.3) o Pro (-1.6) y son asignados a residuos de aminoacidos (como se detalla en la Patente de los Estados Unidos No. 4,554,101, incorporada aqul como referencia): Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); Ile (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); y Trp (-3.4).
Las sustituciones conservadoras de aminoacidos pueden hacerse cuando un residuo de aminoacido es sustituido por otro que tiene un Indice hidropatico similar (por ejemplo, dentro de un valor de mas o menos 2.0, o mas o menos
1.5, o mas o menos 1.0, o mas o menos 0.5). En tales realizaciones, cada residuo de aminoacido puede recibir la asignacion y el Indice hidropatico sobre la base de sus caracterlsticas de hidrofobicidad y carga, como sigue: Ile (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); y Arg (-4.5).
Las sustituciones conservadoras de aminoacidos pueden hacerse utilizando familias de matrices de similitud publicamente disponibles.63-69 La matriz PAM se basa en recuentos derivados de un modelo evolutivo, mientras que la matriz Blosum utiliza recuentos derivados de bloques altamente conservados dentro de un alineamiento. Un marcador de similitud por encima de cero en cualquiera de las matrices PAM o Blosum puede ser utilizado para hacer sustituciones conservadoras de aminoacidos.
Las sustituciones conservadoras de aminoacidos pueden hacerse cuando un residuo de aminoacido es sustituido por otro de la misma clase, donde los aminoacidos son divididos en clases no polar, acido, basico y neutro, como sigue: no polares: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; acidos: Asp, Glu; basicos: Lys, Arg, His; neutrales: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.
Los cambios conservadores de aminoacidos pueden incluir la sustitucion de un L-aminoacido por el correspondiente D-aminoacido, por un D-aminoacido conservador, o por una forma de aminoacido de origen natural, codificado no geneticamente, as! como una sustitucion conservadora de un L-aminoacido. Los aminoacidos codificados no geneticamente de origen natural incluyen beta-alanina, acido 3-amino-propionico, acido 2,3-diamino propionico, acido alfa-aminoisobutlrico, acido 4-aminobutlrico, N-metilglicina (sarcosina), hidroxiprolina, ornitina, citrulina, t- butilalanina, t-butilglicina, N-metilisoleucina, fenilglicina, ciclohexilalanina, norleucina, norvalina, 2-naftilalanina, piridilalanina, 3-benzotienil alanina, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, acido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxllico, beta-2-tienilalanina, sulfoxido de metionina, homoarginina, N-acetil lisina, acido 2-amino butlrico, acido 2-amino butlrico, acido 2,4,-diamino butlrico, p- aminofenilalanina, N-metilvalina, homocisteina, homoserina, acido cisteico, acido epsilon-amino hexanoico, acido delta-amino valerico, o acido 2,3-diaminobutlrico.
Los cambios conservadores de aminoacidos incluyen cambios basados en consideraciones de hidrofilicidad o hidrofobicidad, tamano o volumen, o carga. Los aminoacidos pueden ser caracterizados en general por ser hidrofobos o hidrofllicos, dependiendo primariamente de las propiedades de la cadena lateral del aminoacido. Un aminoacido hidrofobo exhibe una hidrofobicidad mayor de cero, y un aminoacido hidrofllico exhibe una hidrofilicidad de menos de cero, con base en la escala de hidrofobicidad de consenso normalizada de Eisenberg et al.57 Los aminoacidos hidrofobos codificados geneticamente incluyen Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met y Trp, y los aminoacidos hidrofllicos codificados geneticamente incluyen Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser, y Lys. Los aminoacidos hidrofobos codificados no geneticamente incluyen t-butilalanina, mientras que los aminoacidos hidrofllicos codificados no geneticamente incluyen citrulina y homocisteina.
Los aminoacidos hidrofobos o hidrofllicos pueden ser subdivididos adicionalmente con base en las caracterlsticas de sus cadenas laterales. Por ejemplo, un aminoacido aromatico es un aminoacido con una cadena lateral que contiene al menos un anillo aromatico o heteroaromatico, el cual puede contener uno o mas sustituyentes tales como -OH, - SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR,-C(O)NH2, -C(O)NHR, - C(O)NRR, etc., en donde R es independientemente (C1-C6) alquilo, (C1-C6) alquilo sustituido, (C1-C6) alquenilo sustituido, (C1-C6) alquenilo, (C1-C6) alquinilo, (C1-C6) alquinilo sustituido, (C5-C20) arilo, (C5-C20) arilo sustituido, (C6- C26) alquiarilo, (C6-C26) alcarilo sustituido, heteroarilo de 5-20 miembros, heteroarilo de 5-20 miembros sustituido, alq-heteroarilo de 6-26 miembros o alqheteroarilo sustituido de 6-26 miembros. Los aminoacidos aromaticos codificados geneticamente incluyen Phe, Tyr, y Trp, mientras que los aminoacidos aromaticos codificados no geneticamente incluyen fenilglicina, 2-naftilalanina, beta-2-tienilalanina, acido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3- carboxllico, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, y 4-fluorofenilalanina.
Un aminoacido apolar es un aminoacido hidrofobo con una cadena lateral que no esta cargada a pH fisiologico y que
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tiene enlaces en los cuales un par de electrones compartidos en comun por dos atomos se mantiene en general igualmente para cada uno de los dos atomos (esto es, la cadena lateral no polar). Los aminoacidos apolares codificados geneticamente incluyen Gly, Leu, Val, Ile, Ala, y Met, mientras que los aminoacidos apolares codificados no geneticamente incluyen ciclohexilalanina. Los aminoacidos apolares pueden ser subdivididos adicionalmente para incluir aminoacidos alifaticos, el cual es un aminoacido hidrofobo que tiene una cadena lateral hidrocarburo alifatica. Los aminoacidos alifaticos codificados geneticamente incluyen Ala, Leu, Val, e Ile, mientras que los aminoacidos alifaticos codificados no geneticamente incluyen norleucina.
Un aminoacido polar es un aminoacido hidrofllico con una cadena lateral que no esta cargada a pH fisiologico, pero que tiene un enlace en el cual el par de electrones compartidos en comun por dos atomos es mantenido mas cercanamente por uno de los atomos. Los aminoacidos polares codificados geneticamente incluyen Ser, Thr, Asn, y Gln, mientras que los aminoacidos polares codificados no geneticamente incluyen citrulina, N-acetil lisina y sulfoxido de metionina. Un aminoacido acido es un aminoacido hidrofllico con un valor pKa de cadena lateral de menos de 7. Los aminoacidos acidos tlpicamente tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiologico debido a la perdida de un ion hidrogeno. Los aminoacidos acidos codificados geneticamente incluyen Asp y Glu. Un aminoacido basico es un aminoacido hidrofllico con un valor de pKa de la cadena lateral de mas de 7. Los aminoacidos basicos tienen tlpicamente cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiologico debido a la asociacion del ion hidronio. Los aminoacidos basicos codificados geneticamente incluyen Arg, Lys, y His, mientras que los aminoacidos basicos codificados no geneticamente incluyen los aminoacidos no clclicos ornitina, acido 2,3,-diaminopropionico, acido 2,4- diaminobutlrico, y homoarginina.
Se hara evidente para una persona experimentada en el arte que las clasificaciones anteriores no son absolutas y que un aminoacido puede ser clasificado en mas de una categorla. Ademas, los aminoacidos pueden ser clasificados con base en el comportamiento conocido y o en propiedades qulmicas, flsicas o biologicas caracterlsticas con base en ensayos especificados o en comparacion con aminoacidos identificados previamente. Los aminoacidos tambien pueden incluir unidades estructurales disfuncionales que tengan cadenas laterales similares a aminoacidos.
Los cambios conservadores tambien pueden incluir la sustitucion de una unidad estructural qulmicamente derivada para un residuo no derivado, por ejemplo, la reaccion de un grupo lateral funcional de un aminoacido. Asl, estas sustituciones pueden incluir compuestos cuyos grupos amino libres hayan sido derivados a clorhidratos de amina, grupos t-tolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butilocarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. De manera similar, los grupos carboxilo libres pueden derivados para formar sales, esteres metllicos y etllicos u otros tipos de esteres o hidrazidas, y las cadenas laterales pueden ser derivadas para formar derivados O-acilo o O- alquilo para grupos hidroxilo libres o N-im-bencilhistidina para el nitrogeno imidazol de la histidina. Los analogos de peptidos tambien incluyen aminoacidos que han sido alterados qulmicamente, por ejemplo, por metilacion, por amidacion del aminoacido terminal en C mediante una alquilamina tal como etilamina, etanolamina o etilendiamina, o acilacion o metilacion de una cadena lateral de un aminoacido (tal como la acilacion del grupo amino epsilon de la lisina). Los analogos de peptido tambien pueden incluir el reemplazo del enlace amida en el peptido con una amida sustituida (por ejemplo, grupos de la formula -C(O)-NR, donde R es (C1-C6) alquilo, (C1-C6) alquenilo, (C1-C6) alquinilo, (C1-C6) alquilo sustituido, (C1-C6) alquenilo sustituido, o (C1-C6) alquinilo sustituido) o isosteros de un enlace amida (por ejemplo, -CH2NH-, -CH2S, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -C(O)CH2-, -CH(OH)CH2-, o - CH2SO-).
El compuesto puede estar enlazado covalentemente, por ejemplo, por polimerizacion o conjugacion, para formar homopollmeros o heteropollmeros. Pueden utilizarse espaciadores y enlazantes, compuestos tlpicamente de moleculas neutras pequenas, tales como aminoacidos que no estan cargados bajo condiciones fisiologicas. Los enlaces pueden ser logrados en una serie de formas. Por ejemplo, los residuos de cistelna pueden ser agregados a los terminales peptldicos, y peptidos multiples pueden ser enlazados covalentemente mediante oxidacion controlada. Alternativamente, algunos agentes heterobifuncionales, tales como agentes formadores de disulfuro/amida o agentes formadores de tioeter/amida pueden ser usados. El compuesto tambien puede ser enlazado a otro compuesto que pueda modular la apoptosis neuronal, la endocitosis del receptor de AMPA, la plasticidad sinaptica, el aprendizaje o la memoria, o el abuso o adiccion a sustancias, etc. El compuesto tambien puede ser constrenido como por ejemplo, para tener porciones clclicas.
Los peptidos o analogos de peptidos pueden ser sintetizados por tecnicas qulmicas estandar, por ejemplo, por slntesis automatizado utilizando metodologla de slntesis en fase de solucion o solida. Hay sintetizadores de peptidos automatizados comercialmente disponibles y utilizan tecnicas bien conocidas en el arte. Los peptidos y analogos de peptidos tambien pueden ser preparados utilizando tecnologla de ADN recombinante usando metodos estandar como los descritos, por ejemplo, en Sambrook, et al.58 o Ausubel et al.59 En general, los compuestos candidatos son identificados a partir de genotecas grandes de productos naturales o sinteticos (o semisinteticos) extractos o bibliotecas qulmicas de acuerdo con metodos conocidos en el arte. Los experimentados en el campo del descubrimiento y desarrollo de farmacos entenderan que la fuente precisa de extractos o compuestos de prueba no es crltica para los metodos de la invencion. De acuerdo con lo anterior, virtualmente cualquier numero de extractos o compuestos qulmicos pueden ser cribados utilizando los metodos de ejemplo descritos aqul. Ejemplos de tales
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extractos o compuestos incluyen, pero no se limitan a, extractos basados en plantas, fungicos, procariotas o animales, caldos de fermentacion y compuestos sinteticos, as! como la modificacion de compuestos existentes. Hay tambien disponibles numerosos metodos para generar slntesis aleatoria o dirigida (por ejemplo, semislntesis o slntesis total) de cualquier numero de compuestos qulmicos, incluyendo, pero no limitandose a, compuestos basados en sacaridos, llpidos, peptidos y acidos nucleicos. Hay disponibles bibliotecas de compuestos sinteticos. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fungicos, vegetales y animales son comercialmente disponibles a partir de una serie de fuentes, incluyendo Biotics (Sussex, Reino Unido), Xenova (Slough, Reino Unido), Harbor Branch Oceanographic Institute (Ft. Pierce, FL, Estados Unidos de America), y PharmaMar, MA, Estados Unidos de America. Ademas, las genotecas producidas de manera natural y sintetica, por ejemplo, de polipeptidos neuronales, se producen, si se desea, de acuerdo con metodos conocidos en el arte, por ejemplo, por metodos de extraccion y fraccionamiento estandar. Adicionalmente, si se desea, cualquier genoteca o compuesto es modificado facilmente utilizando metodos qulmicos, flsicos o bioqulmicos estandar.
Cuando se encuentra que un extracto crudo modula la apoptosis neuronal, la endocitosis del receptor de AMPA, la plasticidad sinaptica, el aprendizaje o la memoria, o el abuso o adiccion a sustancias, etc., es necesario el fraccionamiento adicional del extracto candidato positivo para aislar constituyentes qulmicos responsables del efecto observado. Asl, la meta del proceso de extraccion, fraccionamiento y purification es la caracterizacion e identification cuidadosa de una entidad qulmica dentro del extracto crudo que tenga actividades de apoptosis neuronal, endocitosis del receptor de AMPA, plasticidad sinaptica, etc. Los mismos ensayos descritos aqul para la detection de actividades en mezclas de compuestos pueden ser utilizados para purificar el componente activo y para probar los derivados del mismo. Los metodos de fraccionamiento y purificacion de tales extractos heterogeneos son conocidos en el arte. Si se desea, los compuestos que demuestran ser agentes utiles para tratamiento son modificados qulmicamente de acuerdo con metodos conocidos en el arte. Los compuestos identificados por tener valor terapeutico pueden ser analizados subsecuentemente utilizando un modelo de mamlfero, o cualquier otro modelo animal para dano neuronal, disfuncion neural, plasticidad sinaptica, aprendizaje o memoria, o abuso o adiccion a sustancias.
Composiciones farmaceuticas, dosificaciones y administration
Los compuestos de la invention pueden ser provistos solos o en combination con otros compuestos (por ejemplo, moleculas de acido nucleico, moleculas pequenas, peptidos o analogos de peptidos), en la presencia de un liposoma, un adyuvante o cualquier vehlculo farmaceuticamente aceptable, en una forma adecuada para administracion a humanos, si se desea, el tratamiento con un compuesto de acuerdo con la invencion, puede ser combinado con terapias mas tradicionales y existentes para el dano neurologico, plasticidad sinaptica, aprendizaje o memoria, o abuso de sustancias. Por ejemplo, los compuestos de acuerdo con la invencion pueden ser administrados como una terapia de combinacion con otros tratamientos tales como inhibidores de radicales libres para maximizar la supervivencia neuronal; como terapia complementaria a la profilaxis anticoagulante en sujetos que experimentan fibrilacion atrial o se consideran en riesgo de apoplejla86. Los compuestos pueden ser administrados en ventanas terapeuticas especlficas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los compuestos pueden ser administrados aproximadamente 3 horas despues de la aparicion de la isquemia.
Se describe que los compuestos de acuerdo con la invencion pueden ser provistos en fusion con un peptido heterologo para facilitar la translocation de los compuestos a traves de las membranas celulares, como por ejemplo, se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,348,185; concedida a Piwnica-Worms; la Publication de la Patente de los Estados Unidos US 2003/0229202 (Guo et al.), o la Publicacion PCT WO 00/62067 (Dowdy), Becker- Hapak et al.85, o Kabouridis114. En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la invencion pueden ser provistos en combinacion con el peptido portador PEP 1 o con un peptido portador que tiene la secuencia de aminoacidos YGRKKRRQRRR.
Los compuestos de acuerdo con la invencion pueden ser provistos en celulas madre, por ejemplo, celulas madre neuronales, modificadas para expresar el peptido. Las celulas y vectores adecuados para tal administracion incluyen vectores virales tales como adenovirus, virus adenoasociados, o virus de herpes simpex121,122.
La practica farmaceutica convencional puede ser empleada para proveer formulaciones o composiciones adecuadas para administrar los compuestos a pacientes que sufren de o son presintomaticos de dano neurologico o disfuncion neural. Los compuestos pueden ser administrados sistemicamente o pueden ser administrados directamente al sistema nervioso central u otra region de dano neurologico. Los compuestos de acuerdo con la invencion pueden ser provistos en una forma adecuada para administracion a traves de la barrera sangre-cerebro. Puede emplearse cualquier ruta apropiada de administracion, por ejemplo, administracion parenteral, intravenosa, subcutanea, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftalmica, intraventricular, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol u oral. Las formulaciones farmaceuticas pueden estar en la forma de soluciones o suspensiones llquidas; para administracion oral, las formulaciones pueden estar en la forma de tabletas o capsulas; y para formulaciones intranasales, en la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.
Los metodos bien conocidos en el arte para hacer formulaciones se encuentran, por ejemplo, en "Remington's
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Pharmaceutical Sciences" (19th edition), ed. A. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Las formulaciones para administracion parenteral, por ejemplo, pueden contener excipientes, agua esteril o solucion salina, polialquilen glicoles tales como polietilen glicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Pueden utilizarse pollmeros lactidos, copollmero lactido/glicolido o copollmeros polioxietilen-polioxipropileno biodegradables biocompatibles para controlar la liberacion de los compuestos. Otros sistemas de administracion parenteral potencialmente utiles para los compuestos moduladores incluyen partlculas de copollmeros de etileno-acetato de vinilo, bombas osmoticas, sistemas de infusion implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalacion pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas que contiene, por ejemplo, polioxietilen- 9-lauril eter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para la administracion en la forma de gotas nasales o como un gel.
Para composiciones terapeuticas o profilacticas, los compuestos se administran a un individuo en una cantidad suficiente para detener o hacer disminuir la degeneracion o apoptosis celular, o para potenciar o mantener la plasticidad sinaptica, dependiendo del trastorno. Una “cantidad efectiva” de un compuesto de acuerdo con la invention incluye una cantidad terapeuticamente efectiva o una cantidad profilacticamente efectiva. Una “cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante perlodos de tiempo necesarios, para alcanzar el efecto terapeutico deseado, tal como una reduction de la degeneracion o apoptosis celular, o para potenciar la plasticidad sinaptica. Una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los reglmenes de dosificacion pueden ser ajustados para proveer la respuesta terapeutica optima. Una cantidad terapeuticamente efectiva tambien es aquella en la cual cualquier efecto toxico o nocivo del compuesto es contrarrestado por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilacticamente efectiva” se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante perlodos de tiempo necesario para alcanzar el resultado profilactico deseado, tal como la inhibition de la degeneracion o apoptosis celular, o para potenciar la plasticidad sinaptica. Tlpicamente, se utiliza una dosis profilactica en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, de tal manera que una cantidad profilacticamente efectiva pueda ser menor que una cantidad terapeuticamente efectiva. Un rango preferido para cantidades terapeutica o profilacticamente efectiva de un compuesto puede ser 0.1 nM-0.1 M, 0.1 nM-0.05 M, 0.05 nM-15 pM o 0.01 nM-10 pM.
Hay que anotar que los valores de dosificacion pueden variar con la severidad de la condition que va a ser aliviada o con la ruta de administracion seleccionada. Por ejemplo, para administracion oral, los valores de dosificacion pueden ser mas altos que para administracion intravenosa o intraperitoneal. Para cualquier sujeto en particular, los reglmenes de dosificacion especlficos pueden ser ajustados con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones. Los rangos de dosificacion fijados aqul son solamente de ejemplo y no limitan los rangos de dosificacion que pueden ser seleccionados por practicantes medicos. La cantidad de compuesto activo en la composition puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Los reglmenes de dosificacion pueden ser ajustados para proveer la respuesta terapeutica optima. Por ejemplo, puede administrarse un bolo individual, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente segun lo indiquen las exigencias de la situation terapeutica. Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en formas unitarias de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de la dosificacion.
En el caso de formulaciones para vacuna, puede proveerse una cantidad con efecto inmunogenico de un compuesto de la invencion, solo o en combination con otros compuestos, con un adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund o hidroxido de aluminio. El compuesto puede estar enlazado con una molecula portadora, tal como albumina de suero bovino o hemocianina de lapa para potenciar la inmunogenicidad.
En general, los compuestos de la invencion deberlan ser utilizados sin causar una toxicidad sustancial. La toxicidad de los compuestos de la invencion puede ser determinado utilizando tecnicas estandar, por ejemplo, probando en cultivos de celulas o animales experimentales y determinando el Indice terapeutico, esto es, la relation entre la LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la LD100 (la dosis letal para el 100% de la poblacion). En algunas circunstancias sin embargo, como en el caso de condiciones de enfermedad severa, puede ser necesario administrar excesos sustanciales de las composiciones.
Ejemplo 1: Materiales y metodos
Cultivos primarios de neuronas de hipocampo
Los hipocampos fueron retirados rapidamente de ratas Sprague-Dawley E18 embrionarias y reunidos antes de la trituration. Las suspensiones de celulas de hipocampo fueron sembradas sobre placas de cultivo o cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina y cultivados en medio neurobasal™ (Invitrogen) durante 14 dlas in vitro (DlV). Se retiro el medio de neuronas maduras 14 DlV y se reemplazo con NMDA 100 pM mas glicina 10 pM durante 1 hora a 37°C antes de restaurar las neuronas al medio de cultivo definido. Veinticuatro horas despues de la aplicacion de
NMDA/glicina, las neuronas fueron procesadas utilizando ensayos de muerte celular. Las respuesta de entre [Ca2+]i inducido por NMDA fueron evocadas y medidas utilizando metodos descritos previamente26.
Ensayos de muerte celular
Cuantificacion de la apoptosis: La apoptosis inducida por NMDA fue cuantificada utilizando un Cell Death Detection 5 Elisa Plus Kit (Roche Applied Sciences), el cual se basa en la determination in vitro de fragmentos de ADN citoplasmatico asociados con histona, o utilizando la adicion mediada por TdT de 11-dUTP biotinilado a los extremos 3’-OH libres del ADN. Las lecturas de absorbancia para ambos ensayos fueron llevados a cabo utilizando un lector de microplacas.
Tincion con yoduro de propidio (PI) de los nucleos: Despues de la induction de la apoptosis, las celulas fueron 10 fijadas con paraformaldehldo al 4%/sacarosa al 4% durante 10 minutos seguidos por acetona enfriada en hielo durante 1 minuto, y luego se tineron con 20 mg/ml de PI en PBS de Dulbecco durante 30 minutos. Los cubreobjetos tenidos fueron montados sobre portaobjetos de vidrio y observados con un microscopio de fluorescencia Leica para identificar los nucleos condensados. Las celulas con nucleos condensados fueron contadas como apoptoticas y el porcentaje de celulas apoptoticas con respecto al numero total de celulas fue calculado para dar un analisis 15 semicuantitativo, expresado como porcentaje de apoptosis.
Tratamiento de celulas con peptidos
Un peptido corto (YKEGYNVYGIE) correspondiente a los residuos de aminoacidos 869 a 879 del terminal C de GluR2 (R2-CT) fue sintetizado e incubado con una protelna portadora (Pep-1)23 a una relation de 1:20 en medio Eagle modificado con Dulbecco (DMEM, Gibco) a 37°C en una atmosfera humidificada que contenla 5% de Co2 20 durante 30 minutos para permitir la formation del complejo R2-CT/Pep-1. Las neuronas de hipocampo (DIV 12-14) fueron superpuestas con el complejo preformado para alcanzar una concentration de R2-CT final de 1 pM y se incubaron adicionalmente durante 1 hora antes de comenzar el experimento.
Ensayos de trafico de receptor
Ensayo celular por ELISA: La cuantificacion de los receptores de AMPA o NMDA de superficie celular fue llevado a 25 cabo mediante un ensayo celular de ELISA colorimetrico esencialmente como se describio previamente14. En resumen, las neuronas de hipocampo fueron tratadas con NMDA 100 pM mas glicina 10 pM durante 1 hora y luego fijadas con paraformaldehldo al 4%/sacarosa al 4% en PBS durante 10 minutos. La mitad de las celulas en cada condition de tratamiento fue permeabilizada entonces con Triton-X 100 al 0.1% durante 5 minutos. Los receptores sobre la superficie de la membrana del plasma y el conjunto celular total fueron determinados incubando las celulas 30 con anticuerpos monoclonales contra los dominios extracelulares de GluR2 o NR1 (Chemicon, 1 pg/ml) durante la noche a 4°C, seguido por incubation con anticuerpo secundario de IgG anti-raton conjugado con HRP (1:1000, Amersham Life Sciences) durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues de un lavado extensivo con PBS, las celulas fueron incubadas con sustrato OPD (Sigma) durante aproximadamente 10 minutos. Las reacciones fueron detenidas con 0.2 volumenes de HCl 3N, y se leyo la observancia a 492 nm utilizando un lector de microplacas 35 espectrofotometrico.
Ensayo de endocitosis de receptor de transferrina: Para establecer el efecto de los inhibidores de la endocitosis sobre la endocitosis del receptor de transferrina, se incubaron neuronas de hipocampo con 2 mg/ml de transferrina conjugada con Alexa-A488 (Molecular Probes) durante 30 minutos a 37°C en la presencia o ausencia de inhibidores de endocitosis. Los receptores internalizados fueron observados entonces con un microscopio de fluorescencia 40 Leica.
Plasmidos de ADNc y transfeccion celular
Los ADNc de la subunidad del receptor de GluR1 y GluR2 etiquetadas con HA de rata han sido descritas previamente14. Los constructos de mutantes por elimination o truncamiento interno del carboxilo de HA-GluR2 fueron hechos por metodos de PCR estandar. El mutante HA-GluR23Y-3A fue hecho utilizando un Quick-Change 45 Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Las celulas HEK293 (ATCC) fueron transfectadas utilizando el metodo de precipitation con fosfato de calcio. De treinta y seis a cuarenta ocho horas despues de la transfection, las celulas fueron lavadas con solution de registro extracelular (ECS en mM: NaCl 140, glucosa al 33, HEPES 25, KCl 5.4, CaCl2 1.3; pH 7.4, 320 mOsm) y se incubaron en ECS durante al menos una hora (con privation de suero). Para tratamiento con insulina, las celulas fueron incubadas con ECS suplementado con insulina humana recombinante 50 0.5 pM (Sigma) durante 10 minutos, despues de lo cual las celulas fueron procesadas para inmunohistoqulmica y
ensayos colorimetricos o sometidas a lisis en regulador RIPA (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM y Triton X-100 al 1%) para inmunoprecipitacion como se describe mas adelante.
donation, expresion y purification de protelnas de fusion GST
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GST-GluR23Y y GST-GluR23A fueron construidas subclonando fragmentos de PCR correspondientes en vectores pGEX 4T-1. Las proteinas de fusion GST fueron expresadas en E. coli DH5a y purificadas a partir de los lisados bacterianos de acuerdo con el protocolo del fabricante (Pharmacia). Los productos fueron dializados en PBS y concentrados utilizando columnas Microcon-10 (Amicon) para la aplicacion intracelular durante los registros de la celula entera.
Microscopia confocal inmunofluorescente
Las celulas HEK293 fueron sembradas sobre cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina y puestos en placas de cultivo de 35 mm y transfectados con 2 pg del plasmido de interes. Para los ensayos de expresion del receptor de superficie celular, las celulas a las 48 horas post-transfeccion fueron fijadas con paraformaldehido al 4% en PBS durante 10 minutos. Los receptores de AMPA en superficie fueron marcados primero con anticuerpo anti-HA monoclonal (1:2000, Babco, Berkeley, CA) y visualizados con un anticuerpo de IgG anti-raton conjugado con FITC (1:500, Sigma). Para el ensayo de internalizacion del receptor de AMPA en superficie, las celulas HEK293 transfectadas con constructos de GluR2 etiquetados con HA fueron incubadas vivas a 4°C con anticuerpo anti-HA monoclonal (10:g/ml) durante 1 hora a los receptores de AMPA de superficie marcados. Las celulas fueron incubadas entonces a 37°C en ECS suplementado con o sin insulina 0.5 pM durante 10 minutos antes de una incubacion adicional de 20 minutos en eCs para permitir la internalizacion constitutiva o regulada de los receptores marcados. Despues de un periodo de fijacion de 10 minutos con paraformaldehido al 4% sin permeabilizacion, los receptores remanentes en la superficie de la membrana del plasma fueron tenidos con anticuerpos IgG anti-raton conjugados con FITC. Los receptores de superficie celular internalizados fueron marcados subsecuentemente con anticuerpos IgG anti-raton conjugados Cy3 despues de la permeabilizacion de las celulas como lo describe Man et al.14
Ensayos colorimetricos
Los ensayos colorimetricos fueron llevados a cabo esencialmente como se informo previamente.14 Inmunoprecipitacion e inmunoprecipitacion Western
La inmunoprecipitacion y la inmunoprecipitacion Western fueron llevadas a cabo esencialmente como se reporto previamente. Las proteinas del cortex cerebral, secciones de hipocampo, neuronas de hipocampo cultivadas o celulas HEK293 transfectadas fueron solubilizadas en regulador RIPA que contenia bien SDS al 1% (mas 5 minutos de ebullicion; condiciones de desnaturalizacion) o DOC al 1% (condiciones no desnaturalizantes). Para la inmunoprecipitacion, se incubaron 500 pg de proteina de estos lisados de tejido con sus respectivos anticuerpos en 500 pl de regulador RIPA durante 4 horas a 4°C. Se agrego la proteina A-sefarosa a la mezcla y se incubo durante 2 horas adicionales. El complejo fue aislado por centrifugacion y lavado tres veces. Las proteinas eluidas de las perlas de sefarosa fueron sometidas a SDS-PAGe e inmunoprecipitacion utilizando sus anticuerpos respectivos. Para el resondeo secuencial de las mismas manchas, las membranas fueron desprendidas de los anticuerpos primarios y secundarios iniciales y sometidas a inmunoprecipitacion con otro anticuerpo. Las manchas fueron desarrolladas utilizando deteccion potenciada con quimioluminiscencia (Amersham). Las intensidades de las bandas fueron cuantificadas utilizando el software Scion Image PC.
Cultivos, transfeccion y ensayos de internalizacion basados en fluorescencia de neuronas de hipocampo Como en Lee et al., 200240; Passafaro et al., 2001.49 Registro electrofisiologico
Se prepararon secciones de hipocampo (400 pm de espesor) a partir de ratas Sprague-Dawley con edades de 16-26 dias despues del nacimiento y se perfusionaron a temperatura ambiente con fluido cerebroespinal artificial que contenia (mM): NaCl 126, NaHCO3 26, glucosa 10, KCl 3, KH2PO4 1.2, MgCl2 1, y CaCl2 1, saturado con 95% 02/5% CO214. Las pipetas de registro (4-5 MO) fueron llenadas con solucion que contenia (mM): CsCl 135, HEPES 10, QX-314 5, Mg-ATP 4, MgCl2 2, EGTA 0.5, GTP 0.2 y CaCl2 0.1, pH 7.4, 310 mOsm. El registro de celulas enteras de neuronas CA1 y la induction de LFS-LTD fueron llevados a cabo como se describio previamente.14
Analisis estadistico
Las pruebas t de Student fueron utilizados siempre que se compararon muestras intraexperimento. Para comparaciones cruzadas o analisis de datos entre experimentos todos los valores fueron sometidos primero a ANOVA de una via y todos los grupos fueron comparados contra valores basales de control. Los valores no fueron significativos estadisticamente a F > 0.5. Los grupos que fueron encontrados como estadisticamente significativos fueron comparados individualmente utilizando la prueba t de Dunnett. Todos los analisis se hicieron utilizando valores normalizados en el paquete de estadistica Statistica (Statsoft).
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Cultivos neuronales primarios
El cortex fue seccionado a partir de los 18 dlas en embriones in utero Wistar y fue tratado con tripsina-EDTA durante 15 minutos a 37°C. Las celulas fueron lavadas entonces 3 veces y trituradas hasta obtener una suspension celular sencilla. Las neuronas con glia fueron entonces sembradas a una densidad de ~2.5x 105 neuronas/pozo en placas de cultivo de tejido de 12 pozos recubiertas con poli-D-lisina. Las celulas fueron cultivadas entonces durante 24-48 horas en medio de siembra (Gibco Neurobasal™, FBS al 1%, suplemento B-27 al 2%, L-glutamato 0.5 mM, y acido glutamico 25 pM), despues de lo cual las celulas fueron tratadas con medio de mantenimiento neurobasal™ (NMM: Gibco Neurobasal™ Medio + L-glutamato .5 mM, suplemento B-27 al 2%) con 5-Fluoro-2'-desoxiuridina 10 pM (FDU) para enriquecer el cultivo para las neuronas (~85%). Despues de un cultivo de 24h-48h en FDU, las celulas fueron mantenidas en NMM cambiado cada 4 dlas.
Generation de peptidos
Tat-GluR2-3Y, Tat-GluR2-3A, y Tat-GluR2-3Y conjugado con dansilo fueron todos sintetizados sobre un sintetizador de peptidos ABI 433A (NAPS).
Consumo neuronal del peptido Tat-GluR2-3Y marcado con dansilo
Neuronas corticales primarias del dla 13 in vitro (DIV) a una densidad de 2.5x105/pozo en placa de 12 pozos fueron lavadas una vez con solution extracelular (ECS: NaCl 140 mM, KCl 5.4 mM, CaCl2 1.3 mM, HEPeS 10 mM, D- glucosa 33 mM, pH 7.4) y luego se agrego 1 mL sin contenido de peptido (control) o Tat-GluR2-3Y marcado con dansilo 1 pM a los pozos. Despues de 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, o 60 minutos de incubation a 37°C los pozos fueron lavados dos veces con ECS y sometidos a generacion de imagenes utilizando microscopia de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitation de 550 nm.
Cuantificacion de endocitosis de AMPAR en respuesta al tratamiento con NMDA
Utilizando ELISA celular, la cantidad de expresion de AMPAR intracelular versus la extracelular se midio permitiendo la cuantificacion de la endocitosis de AMPAR en respuesta al ataque con NMDA. Las neuronas DIV 12-13 fueron lavadas una vez con ECS a temperatura ambiente. Se agrego 1 mL de NMM con o sin el peptido Tat-GluR2-3Y o Tat-GluR2-3A 1 pM a los pozos y las celulas fueron incubadas durante 1 hora a 37°C. El medio fue aspirado entonces y se agrego 1 mL de ECS con diferentes combinaciones del peptido (Tat-GluR2-3Y o Tat-GluR2-3A 1 pM) y de tratamiento con NMDA-glicina (NMDA 50 pM + glicina 10 pM) se agrego a los pozos y las celulas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los pozos fueron lavados entonces una vez con ECS y luego fijados inmediatamente con 0.5 mL de fijador frio (paraformaldehldo al 4%, y sacarosa al 4% en PBS) durante 10 minutos con agitation. Las celulas fueron lavadas entonces 3 veces con 1 mL de PBS. La mitad de los pozos para cada grupo de tratamiento se dejo impermeabilizado (representando una expresion de AMPAR extracelular) y la mitad fue permeabilizada (representando la expresion de AMPAR intracelular y extracelular total) con 0.5 mL de Triton X 100 al 0.2% en PBS durante 10 minutos con agitacion seguida por 3 lavados con PBS. Los pozos fueron bloqueados entonces con suero de cabra al 2% en PBS durante 1 hora. Despues de bloquear se aspiro el regulador de bloqueo y se agregaron 400 pL de anticuerpo del raton anti-rata de GluR2 en GluR2 de terminal N 1 ug/mL en suero de cabra al 2% (clon: 6C4, Chemicon) o 400 pL de regulador de bloqueo (controles sin anticuerpo primario) agregados a los pozos y las placas fueron incubadas durante la noche con agitacion a 4°C. Las placas fueron lavadas entonces 3 veces con PBS y se agregaron 400 pL de anticuerpo de IgG2a anti-raton de oveja conjugado con peroxidasa de rabano 1/1000 en suero de cabra al 2% y las placas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con agitacion. Las placas fueron lavadas entonces 3 veces con PBS, luego se agrego una solucion de 1 mL de OPD (0.4 mg/mL de o-fenilendiamina, 0.4 mg/mL de peroxido de urea hidrogeno, y regulador fosfato-citrato 50 mM, Sigma) y las placas fueron incubadas durante 5-10 minutos a temperatura ambiente con agitacion. La reaction de la peroxidasa fue terminada mediante la adicion de 200 pL de HCl 3N. La absorbancia a 492 nm fue lelda utilizando un lector de placas pQuant (Bio-Tek Instruments Inc.). Los datos fueron analizados sustrayendo primero los valores de absorbancia de los controles no primarios de las otras muestras. El porcentaje de expresion en superficie de AMPAR fue expresado entonces como una relation de las muestras no permeabilizadas a las muestras permeabilizadas. Los experimentos repetidos individuales fueron normalizados entonces y los grupos de tratamiento fueron comparados utilizando ANOVA seguidos por la prueba de Tukey- Kramer, (p = 0.05).
Cuantificacion de apoptosis neuronal en privation de oxlgeno y glucosa (OGD)
Se sometieron neuronas a 60 minutos de privacion de oxlgeno y glucosa y la apoptosis fue cuantificada utilizando un ELISA con mono- y oligonucleosoma. Las neuronas DIV 13 sembradas a una densidad de 2.5x105/pozo en placas de 12 pozos fueron lavadas una vez con ECS, y las celulas fueron pretratadas durante 60 minutos con o sin Tat- GluR2-3Y 1 pM en NMM. Las celulas fueron lavadas entonces dos veces con regulador OGD (NaCl 121 mM, KCl 5 mM, piruvato de Na 1 mM, CaCl2 1.8 mM, NaHCO3 25 mM, glicina 0.01 mM; pH 7.4) para las muestras de OGD, o
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con ECS para las muestras sin OGD. Las muestras sin OGD fueron incubadas entonces durante 25 horas a 37°C en NMM y las muestras con OGD fueron incubadas en regulador de OGD con o sin Tat-GluR2-3Y en una camara anaerobia a 37°C durante 60 minutos. Las muestras con OGD fueron incubadas entonces durante 24 horas a 37°C en NMM. La apoptosis neuronal fue cuantificada entonces utilizando un kit Cell Death Detection ELISAplus (Roche Applied Science) segun las instrucciones del fabricante. Se leyo la absorbancia a 405 nm (longitud de onda de referencia, 490 nm) utilizando un lector de placa pQuant (Bio-Tek Instruments Inc.). Los experimentos repetidos individuales fueron normalizados entonces y se compararon los grupos de tratamiento utilizando ANOVA seguido por la prueba de Tukey-Kramer (p = 0.05).
Infiltracion con Tat-GluR2-3Y de tejido cerebral
Dos ratones C57-Black/6 macho adultos con pesos de ~22 g recibieron una inyeccion intraperitoneal bien de solucion salina o de 30 nmol/g de Tat-GluR2-3Y marcado con dansilo. Los ratones fueron sacrificados a las 2 horas y los cerebros fueron retirados y congelados inmediatamente a -80°C. Se cortaron secciones de la corona de 40 micrones con un criostato y se visualizaron con microscopia de fluorescencia.
Modelo de isquemia focal transiente
El procedimiento fue llevado a cabo esencialmente como se describio previamente (70). En resumen, ratas Sprague- Dawley macho adultas entre 280 y 320 g (peso tras 20 horas de ayuno) fueron anestesiadas con una mezcla inhalada de 4% de isofluorano, en oxido nitroso balanceado con oxlgeno al 30%, y mantenidas con isofluorano al 1.5%. Las secreciones bronquiales fueron minimizadas administrando 0.5 mg/kg de atropina intraperitonealmente. Alternativamente, 3 nmoles/g de Tat-GluR2-3Y en solucion salina, 3 nmoles/g Tat-GluR2-3A en solucion salina, o solucion salina solamente fueron administrados 1 hora despues de la oclusion de la arteria cerebral media (MCA), a traves de un cateter PE-50 de la vena femoral. El experimento fue ciego en cuanto a la identidad de los grupos de tratamiento para todas las ciruglas y experimentos corriente abajo. Bajo un microscopio de diseccion, la arteria carotida comun (CCA), la arteria carotida externa (ECA), y la arteria carotida interna (ICA) fueron expuestas y diseccionadas. Las arterias lingual y maxilar terminales fueron cauterizadas y la arteria pterigopalitina fue ligada entonces con una sutura de seda 5-0. Despues de este punto la ICA fue la unica ramificacion extracraneal remanente de la CCA. La ECA fue entonces cortada parcialmente cerca a la ligadura rostral y se inserto un monofilamento de nylon 3-0 de 30 mm con una punta de cabeza redondeada en la ECA y se avanzo hasta despues de la bifurcacion cCa. La ECA fue entonces cortada completamente, movilizando el tocon de ECA que contenla la sutura de nylon. La estructura de nylon fue luego retorcida de tal manera que su punta estaba de cara a la ICA y la sutura de nylon fue avanzada entonces suavemente aproximadamente 20 mm hasta que se encontro resistencia. En este punto la sutura alcanzo el origen de la MCA y la arteria cerebral anterior bloqueando completamente el flujo de sangre al territorio de la MCA. La herida fue entonces cerrada por sutura con sutura de seda y el animal fue despertado desconectando el isofluorano. Se midio la temperatura rectal y la presion sangulnea con un manguito de cola antes del tratamiento, 15 minutos despues de la inyeccion, 50 minutos despues de la inyeccion y 15 minutos despues de la oclusion de la MCA. Se midieron el pH, O2 y CO2 en plasma con un analizador de gas sangulneo Rapidlab™ 348 (Bayer Diagnostics) en algunos animales para asegurar que las ratas de flujo de gas utilizadas eran apropiadas y produjeron gases sangulneos reproducibles. El animal recibio entonces un examen neurologico despues de 45 minutos de la oclusion de la MCA. Este examen fue utilizado para excluir cualquier animal que no hubiese experimentado oclusion significativa de la MCA. El examen consistio en 10 pruebas con un marcador de deficit maximo de 23 (71). Las pruebas individuales se resumen en la Tabla II.
Tabla II. Resumen de marcador neurologico
Prueba
Descripcion Marcador
Reflejo postural:
Grado de giro
Grado de rotacion del cuerpo hacia el lado parietico cuando se sostiene por la cola. 0-2
Grado de flexion de extremidad anterior
Grado de flexion de una extremidad anterior cuando se sostiene por la cola. 0-2
Perturbaciones en salida
Formacion de clrculos o desplazamiento hacia el lado parietico, u otras perturbaciones de salida. 0-5
Halado de cola
Movimiento desviado hacia un lado cuando se hala la cola 0-2
Prueba
Description Marcador
Resistencia al empuje
Grado de resistencia lateral al empuje 0-2
Colocation visual:
Hacia adelante
Presencia de un reflejo de colocacion de una extremidad anterior en respuesta a una pista visual hacia adelante. 0-2
Lateral
Presencia de un reflejo de colocacion de una extremidad anterior en respuesta a una pista visual lateral. 0-2
Colocacion tactil:
Hacia adelante
Presencia de un reflejo de colocacion de extremidad anterior en respuesta a un estimulo tactil sobre la superficie dorsal de la garra. 0-2
Lateral
Presencia de un reflejo de colocacion en extremidad anterior en respuesta a un estimulo tactil sobre la superficie lateral de la garra. 0-2
Colocacion propioceptiva
Presencia de un reflejo de colocacion de extremidad anterior en respuesta a ser sostenida por los cuartos traseros por encima de la superficie. 0-2
Marcador total
0-23
El animal fue inducido de nuevo despues del examen neurologico y el monofilamento de nylon fue retirado a los 60 minutos despues de la aparicion de la oclusion retornando el flujo de sangre al territorio de la MCA. El examen neurologico fue llevado a cabo de nuevo en el momento del sacrificio (~24 horas). La cirugla de simulation fue 5 llevada a cabo como oclusion de MCA, sin embargo, el monofilamento de nylon no fue insertado.
Tincion con TTC
Las ratas fueron sacrificadas 3 dlas despues de la oclusion de MCA por anestesia profunda seguida por decapitation. El cerebro fue retirado inmediatamente despues del sacrificio y colocado en una matriz de cerebro de rata acrllica (Harvard Apparatus) e incubado a -80°C durante 15 minutos. se cortaron entonces secciones de corona 10 de 1 mm con cuchillas de afeitar y se colocaron a 37°C en solution de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio al 2% (TTC, Sigma) en PBS. Las secciones fueron incubadas entonces durante aproximadamente 15 minutos hasta que se desarrollo suficiente color.
Tincion TUNEL
En el dla 1 despues de la MCAo las ratas fueron anestesiadas con 1.5 mL de uretano al 25% y fueron perfusionadas 15 con 100 mL de solucion salina al 0.9% seguida por 120 mL de paraformaldehldo al 4% en PBS. Los cerebros fueron retirados entonces y almacenados durante la noche a 4°C en paraformaldehldo al 4%. Los cerebros fueron transferidos entonces a sacarosa al 30% y azida de sodio al 0.1% en PBS y almacenados a 4°C hasta que los cerebros se hundieron completamente. Los cerebros fueron congelados entonces en hielo seco y se cortaron secciones de corona de 12 micrones con un criostato a -.8 mm con respecto al bregma utilizando un metodo de 20 flotation libre (72). Las secciones fueron montadas entonces sobre laminas de vidrio y tenidas con TMR-TUNEL (marcacion terminal del extremo de muesca dUTP mediada por desoxirribonucleotido transferasa [TdT]) (Roche Applied Science) segun las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron calificadas en cuanto al numero de celulas que se tineron en positivo para TMR-TUNEL por campo de vision a una magnification 10X. Para cada section los mismos 3 campos a lo largo de la portion lateral del cortex sobre el hemisferio afectado fueron 25 calificadas (el hemisferio afectado fue definido como el lado con la mayor cantidad de apoptosis).
Ejemplo 2: La apoptosis inducida por NMDA requiere la endocitosis del receptor de AMPA
Con el fin de inducir apoptosis en cultivos maduros de neuronas de hipocampo de rata (14 DIV+) se trataron celulas con un ataque moderado de NMDA 100 pM con glicina 10 pM durante 1 hora seguido por recuperation de las celulas en medio normal para perlodos de hasta 24 horas. Como se muestra en la figura 1A, B, el tratamiento con 30 NMDA indujo un incremento dependiente del tiempo en la actividad de la caspasa-3, un indicador bioqulmico de la apoptosis neuronal, segun se detecto por el ensayo de ELISA de escision de DEV-pNA. Este incremento en la
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actividad de caspasa-3 tuvo un pico entre 12-24 horas despues del tratamiento, momento en el cual la mayorla de las neuronas estaban o muriendo o muertas, exhibiendo los hitos de la muerte celular apoptotica, incluyendo el escalamiento de ADN demostrado por electroforesis en gel de ADN extraldo (Figura 1C), y la condensacion nuclear con procesos de desintegracion mostrados por la tincion de nucleos con yoduro de propidio o la intercalacion de colorante de ADN, Hoechst 33258 (bisbenzimida). El grado de apoptosis neuronal tambien fue cuantificado por la medicion de la escision internucleosomica de ADN con 11-DUTP (Figura IE) y ensayos de biotinilacion con histona (Figura 1F). En contraste, en los cultivos no tratados hubo poca apoptosis detectable bien sea bioqulmica o morfologicamente (Figura 1A-F). Adicionalmente, la apoptosis inducida por NMDA fue el resultado de la activacion especlfica de los receptores de NMDA, puesto que fue bloqueada completamente por el antagonista del receptor de NMDA, APV (50 pM; Figura 1D). Por lo tanto, el tratamiento con NMDA produjo apoptosis neuronal.
Con el fin de determinar el papel de la endocitosis inducida por NMDA en la mediation de la apoptosis neuronal, se examino primero el efecto de la sacarosa hipertonica, un inhibidor de la endocitosis dependiente de clatrina bien caracterizado que inhibe el ensamblaje de los pozos recubiertos con clatrina1314. Como se muestra en la Figura 1E, cuando se trataron celulas con sacarosa hipertonica (0.4 M), antes de la aplicacion de NMDA y en su presencia durante 1 hora, se encontro que la apoptosis se reducla dramaticamente. A la vez que la sacarosa hipertonica ha sido utilizada ampliamente como un inhibidor efectivo de la endocitosis mediada por clatrina, puede tener muchas acciones diferentes a la inhibition de la endocitosis. Para establecer adicionalmente un papel esencial de la endocitosis estimulada y la apoptosis inducida por NMDA, tambien se examino el efecto de otro inhibidor especlfico para la endocitosis dependiente de clatrina. El inhibidor es un peptido miristoilado corto derivado de la dinamina que es permeable a la membrana (myr-Dyn). Bloquea el reclutamiento de dinamina a los pozos recubiertos con clatrina por anfifisina, inhibiendo por lo tanto la endocitosis mediada por clatrina15. En efecto, la incubation de neuronas con myr-Dyn (100 pM) se encontro efectivo como la sacarosa hipertonica en la reduction de la apoptosis inducida por NMDA (Figura 1E y F). En contraste, los peptidos Dyn de control, ambos no miristoilados (no permeantes a la membrana) Dyn (Dyn; Figura 1E) y myr-Dyn mezclados (s-myr-Dyn; Figura 1F) no miristoilados (no permeables en membrana), tuvieron poco efecto. Asl, la endocitosis dependiente de clatrina facilitada es necesaria para la apoptosis mediada por el receptor de NMDA. Con el fin de probar si los efectos de la inhibicion de la endocitosis eran especlficos para la apoptosis inducida por NMDA, se probo a continuation el efecto de estos inhibidores sobre un modelo de apoptosis neuronal bien caracterizado que es inducida por el tratamiento de neuronas con el inhibidor de quinasa estaurosporina (STS; 100 nM, 1 h)12. Como se muestra en la Figura 1E, se encontro que ambos inhibidores de la endocitosis fallaron en alterar significativamente la apoptosis neuronal inducida por STS. Por lo tanto, la endocitosis mediada por clatrina se requiere especlficamente para la apoptosis neuronal inducida por la activacion del receptor de NMDA.
Para discernir la posibilidad de que los inhibidores de endocitosis puedan haber evitado la apoptosis neuronal interfiriendo con la funcion del canal receptor de NMDA, y por lo tanto con el influjo de Ca2+ a traves del canal activado, se cargaron neuronas de hipocampo con el colorante Ca2+ intracelular, Fura-2, y luego se monitoreo el influjo de calcio evocado por la aplicacion “en rafaga” local repetitiva de NMDA (100 pM; 500 ms) a neuronas antes y durante el tratamiento con sacarosa hipertonica. Como se resume en la Figura 2A, B, la sacarosa en concentraciones que inhiblan la endocitosis y la apoptosis no altero significativamente las respuestas de [Ca2+]i evocadas por NMDA. El hecho de que la inhibicion de la endocitosis bloqueo la apoptosis inducida por NMDa sin afectar las respuestas de [Ca2+]i indica que los incrementos intracelulares en las concentraciones de [Ca2+]i, aunque necesarios, pueden no ser suficiente para producir apoptosis inducida por NMDA.
La activacion de ciertas formas de caspasas, tales como la caspasa-3 y -716 (tambien Figura 1A, B) ha estado implicada en la apoptosis neuronal inducida por NMDA. Por lo tanto investigamos los efectos de inhibir la endocitosis sobre la activacion dependiente de NMDA de la caspasa-3. El tratamiento con NMDA incremento dramaticamente el nivel de la forma activada de caspasa-3 como lo demostraron las inmunoprecipitaciones Western utilizando un anticuerpo que reconoce especlficamente solamente la caspasa-3 activada/escindida (Figura 2C). El myr-Dyn permeable a membrana, en la concentration que inhibe la apoptosis mediada por el receptor de NMDA, inhibe eficientemente la activacion de caspasa mediada por NMDA (Figura 2C).
La serina/treonina quinasa Akt/PKB ha sido implicada en la protection de neuronas frente a la muerte celular apoptotica17 y se ha sospechado que la inhibicion de esta actividad de quinasa esta involucrada en la apoptosis mediada por el receptor de NMDA18. Investigamos si el proceso de endocitosis juega un papel crltico en la inhibicion de la actividad de Akt determinando el nivel de fosforilacion de Akt en serina 473, un residuo cuya fosforilacion es
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requerida para la activacion completa de Akt . Como se muestra en la Figura 2D, el tratamiento de neuronas con NMDA dio como resultado una reduccion significativa en el Akt S473 fosforilado y por lo tanto en la actividad de Akt, sin alterar los niveles de Akt total. Esta reduccion de la actividad de Akt fue evitada largamente por la inhibicion de la endocitosis con sacarosa hipertonica. En contraste, el tratamiento con sacarosa no tuvo efecto sobre la reduccion de la fosforilacion de Akt despues del tratamiento con STS, soportando adicionalmente la involucracion especlfica de la endocitosis en la apoptosis inducida por NMDA (Figura 2D). Asl, la endocitosis estimulada parece ser una etapa obligatoria corriente abajo de la elevation en [Ca2+]i y corriente arriba de la activacion de caspasa y la inhibicion de Akt en apoptosis neuronal inducida por NMDA.
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Se observo una reduccion significativa de los receptores de AMPA en la superficie celular, pero no de NMDA, despues del tratamiento con NMDA y esta reduccion fue el resultado de una endocitosis del receptor facilitada puesto que bloqueo el inhibidor de la endocitosis myr-Dyn, pero no el peptido de control, Dyn (Figura 3A). Para investigar si habla un enlace directo entre la endocitosis y apoptosis del receptor de AMPA inducidas por NMDA, se administro un peptido derivado de la secuencia de aminoacidos corta entre los residuos de tirosina 869 y acido glutamico 879 dentro de la region del terminal carboxilo (CT) de la subunidad GluR2 del receptor AMPA (YKEGYNVYGIE; denominado R2-CT) en neuronas cultivadas mezclandolo con un peptido portador (Pep-1)23 una hora antes y durante el tratamiento con NMDA. Los resultados indicaron que la reduccion inducida por NMDA de los receptores de AMPA de la superficie celular fue evitada (Figura 3B).
Con el fin de asegurar que el bloqueo por parte de este peptido no era debido a efectos no especlficos del proceso endocitotico, se examino su efecto sobre la endocitosis del receptor de transferrina, una endocitosis de receptor mediada por clatrina bien caracterizada13. La incubacion de neuronas de hipocampo con transferrina marcada con fluorescencia durante 30 minutos dio como resultado una acumulacion de la transferrina marcada con fluorescencia en el compartimiento intracelular. Esto fue un resultado de endocitosis de receptor de transferrina mediada por clatrina puesto que fue eliminada cuando estaba presente tambien sacarosa 0.4 M durante el perlodo de incubacion de la transferrina. En contraste, el R2-CT + Pep-1, aplicados a estas neuronas una hora antes y durante la incubacion de transferrina, no logro prevenir la endocitosis del receptor de transferrina. Asl, el peptido de R2-CT es un inhibidor dominante que puede bloquear especlficamente la endocitosis de receptor de AMPA inducida por NMDA, pero no afecta no especlficamente el proceso de endocitosis mediada por clatrina.
Adicionalmente, el pretratamiento de la neuronas con R2-CT + Pep-1 redujo significativamente la endocitosis inducida por NMDA cuantificada por el ensayo de biotinilacion con histona (Figura 4A), y por tincion nuclear PI (Figura 4B). La tincion con PI despues de la fijacion demostro que el R2-CT bloqueaba la apoptosis inducida por NMDA. En este ejemplo particular, ni el R2-CT ni el Pep-1 solos tuvieron efecto detectable alguno sobre la apoptosis inducida por NMDA. De manera similar al bloqueo general del proceso endocitotico mediado por clatrina con sacarosa o myr-Dyn, interfiriendo con la endocitosis del receptor de AMPA por R2-CT no altero la apoptosis neuronal inducida por STS (Figura 4A). Tomados en conjunto, estos resultados han demostrado una evidencia fuerte de un requerimiento obligatorio para la endocitosis del receptor de AMPA en la apoptosis neuronal inducida por NMDA.
Por lo tanto, una endocitosis del receptor de AMPA dependiente de clatrina se requiere especlficamente para la apoptosis inducida por NMDA, pero no por STS, de neuronas de hipocampo mantenidas en cultivo primario. La endocitosis de bloqueo no tuvo efecto sobre las respuestas en Ca2+ inducidas por NMDA, pero evita la activacion inducida por NMDA y de caspasa-3 y la inhibicion de la fosforilacion de Akt. Asl, la endocitosis del receptor de AMPA puede ser un enlace crltico entre la sobrecarga de [Ca2+]i inducida por NMDA y las cascadas intracelulares que llevan a la apoptosis.
Asl, la estimulacion del receptor de NMDA activa las cascadas de senalizacion intracelulares que llevan a la apoptosis, y facilitan la internalizacion dependiente de la dinamina de los receptores de glutamato subtipo AMPA. El bloqueo de la internalizacion dependiente de la dinamina mejoro especlficamente las cascadas apoptoticas activadas por NMDA (pero no por estaurosporina), sin afectar las elevaciones inducidas por NMDA en [Ca2+]i. la inhibicion especlfica de la endocitosis del receptor de AMPA inducida por NMDA por un peptido derivado de GluR2 evita la apoptosis inducida por NMDA, sin afectar la producida por la estaurosporina. Estos resultados demuestran que la endocitosis del receptor de AMPA puede requerirse en el enlazamiento de la activacion del receptor de NMDA para la apoptosis neuronal, y por lo tanto sugiere que la endocitosis de receptor de AMPA juega un papel esencial en la reduccion de la fuerza sinaptica, y asl tambien activamente media en otras rutas intracelulares importantes, incluyendo la muerte celular apoptotica.
Ejemplo 3: Secuencias distintivas dentro del terminal carboxilo de GluR2 son requeridas para la endocitosis del receptor de AMPA constitutiva y regulada
Para identificar determinantes de secuencia para la endocitosis del receptor de AMPA constitutiva y estimulada por insulina, se hicieron seis mutantes de GluR2 que contenlan diversas eliminaciones de GluR2 CT (Figura 5B). Todos los constructos, excepto GluR2A854, fueron marcados con HA en la region amino terminal extracelular. Despues de la transfeccion transiente en celulas HEK293, estos constructos fueron expresados a un nivel comparable a sus contrapartes tipo silvestre, HA-GluR2 o GluR2, segun se determino mediante un ensayo de ELlSA en celulas colorimetrico bajo o condiciones de celulas permeabilizadas (Figura 5C).
La capacidad de estos mutantes para experimentar endocitosis tanto constitutiva como regulada se probo tal como se describio previamente14. Los receptores de superficie en celulas vivas fueron premarcados con un anticuerpo anti-HA (o un anticuerpo contra el dominio N-terminal extracelular de GluR2 en el caso de GluR2A854) a 4°C (el cual bloquea la endocitosis). Las celulas marcadas en superficie fueron incubadas entonces a 37°C durante 30 minutos para permitir que la endocitosis se reiniciara tanto en la ausencia como en la presencia de insulina (0.5 pM) para determinar cambios en la endocitosis del receptor de AMPA constitutiva (basal) y regulada (estimulada por insulina), respectivamente (Figura 6A, B). Los receptores internalizados fueron visualizados entonces por microscopla
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confocal y cuantificados por ensayos de internalizacion del receptor basados en ELISA de celulas (Figura 6A). Las imageries confocales representativas de celulas HEK293 transfectadas de manera transiente con mutantes de GluR2 o GluR2 marcados con HA se obtuvieron. Las celulas transfectadas fueron premarcadas con anticuerpo antiHA y luego se evaluo la endocitosis del receptor bajo condiciones basales (endocitosis constitutiva) o despues de estimulacion con insulina (0.5 pM, 10 minutos; endocitosis regulada). Los receptores de superficie celular fueron tenidos con FITC bajo condiciones de no permeacion y los receptores no internalizados fueron tenidos subsecuentemente con Cy3 despues de la permeabilizacion celular. Con el fin de determinar si los cambios en la internalizacion reducidos por estas mutaciones eran capaces de alterar los numeros de los receptores de superficie, tambien se midio el nivel del estado de equilibrio de los receptores de AMPA en superficie celular utilizando ensayos de receptor de superficie celular basados en ELISA de celulas (Figura 6C).
Como se muestra en la Figura 6A, los receptores de GluR2 tipo silvestre experimentaron endocitosis tanto constitutiva como estimulada por insulina. Asl, en la ausencia de insulina, aproximadamente el 25% de los receptores de superficie celular sufrieron endocitosis al cabo de 30 minutos y esta proporcion se incremento a 48% despues de una breve estimulacion con insulina (0.5:M, 10 min). Esta endocitosis facilitada estaba asociada con una reduccion significativa en el nivel de receptores de AMPA expresados sobre la superficie celular (Figura 6B). El truncamiento de los ultimos cuatro aminoacidos (GluRA880), que forman el motivo de enlazamiento PDZ no tuvieron ningun efecto observable sobre la endocitosis constitutiva o regulada. Sin embargo, el truncamiento de los ultimos 30 (GluR2A854) o 15 residuos (GluR2A869) abolio completamente la endocitosis del receptor de AMPA inducida por insulina, y la reduccion en su expresion en la superficie celular (Figuras 6A-B). Ni el truncamiento altero el grado de endocitosis del receptor de AMPA constitutivo (Figura 6A) ni el nivel basal de la expresion del receptor en la superficie celular (Figura 6B). Se observo un descenso significativo en la rata de internalizacion constitutiva de GluR2A834-843, en la cual los primeros 10 aminoacidos del GluR2 CT fueron eliminados (Figura 6A). Sin embargo, esta elimination interna no altero el numero de estado de equilibrio de los receptores de AMPA expresados en la superficie celular (Figura 6B). Ni alteraron la respuesta a la insulina, puesto que el GluR2A834-843 mostro una internalizacion potenciada similar en magnitud al GluR2 tipo silvestre (Figuras 6A y 6B). Por otro lado, el mutante de eliminacion interna GluR2A844-853 no mostro cambios significativos en el grado de endocitosis constitutiva (Figura 6A), pero exhibio un pequeno descenso en la endocitosis estimulada por insulina (Figura 6A) y una reduccion en el nivel del receptor en estado de equilibrio de la superficie celular (Figura 6B).
Ejemplo 4: La fosforilacion de la tirosina de GluR2 CT es requerida para la endocitosis del receptor de AMPA estimulada por insulina
La secuencia de R2-CT contiene tres residuos de tirosina. Para determinar si estos residuos de tirosina son sustratos de ciertas tirosina quinasas, se llevaron a cabo ensayos de quinasa in vitro utilizando Src recombinante activo y protelnas de fusion de glutationa S-transferasa (GST) de las colas carboxilo de GluR1 (GST-GluR1CT) y GluR2 (GST-GluR2CT) (Figura 7A). GST-GluR2CT, pero no GST-GluR1CT o GST solo, es fosforilado especlficamente por la Src quinasa. En consistencia con la hipotesis de que uno o mas de los residuos de tirosina es el sustrato para la fosforilacion por Src, se encontro que la Src quinasa recombinante fosforilaba una protelna de fusion GST que contenla la portion de nueve aminoacidos que inclula todos los tres residuos de tirosina unicos de GluR2 (GST-Y869KEGY873NVY876G). La fosforilacion mediada por Src fue abolida cuando estos residuos de tirosina fueron mutados en alaninas (GST-A869KEGA873NVA876G).
Para determinar si los residuos de tirosina de GluR2 CT son fosforilados in situ por la actividad de tirosina quinasa endogena en respuesta a la estimulacion con insulina, se genero un mutante de la subunidad GluR2 en el cual los residuos de tirosina Y869, Y873 y Y876 fueron mutados en alaninas (HA-GluR23Y-3A). Cuando se expreso de manera transiente en celulas HEK293, el mutante fue expresado al mismo tiempo que su contraparte GluR2 tipo silvestre (Figura 7B). Se examino primero la fosforilacion potencial de estos residuos de tirosina in situ en celulas que expresaban de manera transiente HA-GluR2, HA-GluR23Y-3A, o HA-GluR1. Las celulas fueron tratadas con o sin insulina (0.5 pM, 10 min) y luego homogenizadas como se detalla en la section de metodos. Los complejos de receptor de AMPA expresados fueron inmunoprecipitados utilizando un anticuerpo anti-HA bajo condiciones de desnaturalizacion, y luego inmunoprecipitados en cuanto a su nivel de fosforilacion de tirosina utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina. Los resultados demostraron que habla un nivel detectable de fosforilacion de tirosina basal del GluR2 tipo silvestre y que el nivel de fosforilacion se incremento despues de un breve tratamiento con insulina (Figura 7C). La triple mutation Y a A hizo disminuir fuertemente la fosforilacion de tirosina tanto basal como inducida por insulina de HA-GluR2. En contraste, casi no hubo fosforilacion de tirosina detectable de GluR1 bajo condiciones basales o estimuladas por insulina (Figura 7C). Estos resultados sugieren que la fosforilacion de tirosina de GluR2 CT ocurre en un contexto celular bajo condiciones basales y es potenciada por la insulina.
La mutacion de los residuos de tirosina de GluR2-CT evita la reduccion inducida por insulina de los receptores de AMPA de la superficie celular. Las celulas HEK que expresan los mutantes GluR2 o GluR2 Y-A tipo silvestre fueron tratadas con insulina (0.5 pM) durante 10 minutos y con un perlodo de incubation adicional de 20 minutos en ECS. El nivel de receptores en la superficie celular fue probado utilizando un ensayo colorimetrico. La mutacion de uno cualquiera de los residuos de tirosina fue suficiente para evitar la reduccion inducida por insulina de la expresion del receptor de AMPA en la superficie celular (Figura 7D). Sin querer estar limitados por ninguna hipotesis, estos
resultados pueden sugerir que todos los tres residuos de tirosina son sustratos de la fosforilacion de tirosina, o que estan todos involucrados en el reconocimiento del sustrato por parte de la quinasa, o algun otro aspecto de la fosforilacion catalizada de tal manera que la mutacion de una tirosina en particular podrla evitar la fosforilacion incluso si no es la diana directa de la fosforilacion. Asl, en este ultimo caso, la mutacion de cualquiera de los 5 residuos de tirosina fuera de sustrato afectarla la interaccion sustrato-quinasa y por lo tanto serla capaz de evitar la fosforilacion del sustrato de residuo de tirosina, reduciendo por lo tanto la endocitosis del receptor estimulada.
El significado funcional de la fosforilacion de tirosina de GluR2 CT con respecto a la endocitosis estimulada por insulina se probo ensayando la internalizacion de HA-GluR2 y HA-GluR23Y-3A en celulas HEK293 (Figura 8A, B). Mientras que la mutacion de estos residuos de tirosina no altero el nivel de estado de equilibrio de GluR2 expresado 10 sobre la superficie celular (Figura 8B), bloqueo la endocitosis inducida por insulina (Figura 8A) y la reduction inducida por insulina en el nivel de los receptores de AMPA de la superficie celular (Figura 8B).
Ejemplo 5: La insulina incrementa la fosforilacion de tirosina de GluR2 y deprime la transmision sinaptica mediada por el receptor de AMPA en secciones de hipocampo
Se examino a continuation si la estimulacion con insulina podrla cambiar el nivel de fosforilacion de tirosina de los 15 receptores de AMPA en hipocampo intacto, como lo hace en las celulas HEK293 que expresan subunidades de GluR2 (Figura 7A-D), y si esto podrla ser importante para la depresion mediada por insulina de la transmision sinaptica mediada por el receptor de AMPA. Se trataron secciones de hipocampo con insulina (0.5 pM; 10 min) y las subunidades GluRI y GluR2 fueron inmunoprecipitadas entonces bajo condiciones de desnaturalizacion (como se detalla aqul) e inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-fosfotirosina (Figura 9A, B). Consistente con los resultados 20 a partir de cultivos celulares, la subunidad GluR2 exhibio un nivel claramente apreciable de fosforilacion de tirosina bajo condiciones basales; ademas, el nivel de fosforilacion se incremento despues de la estimulacion con insulina (Figura 9A, B). En contraste, los niveles de fosforilacion de tirosina de GluRI fueron apenas detectables bajo condiciones tanto basales como tratados con insulina. Estos resultados sustentan adicionalmente la fosforilacion de tirosina de GluR2 en el hipocampo y demuestra que la fosforilacion de tirosina en GluR2 puede ser estimulada por la 25 insulina.
El efecto de la aplicacion postsinaptica de GST-GluR23Y (GST-YKEGYNVYG), y su contraparte mutante, GSTGluR23A (GST-AKEGANVAG), como control, durante los registros en celula entera de neuronas CA1 en secciones de hipocampo fue investigado para determinar la correlation, si la hay, de la fosforilacion de la tirosina estimulada por insulina de los receptores de AMPA con la depresion persistente de las corrientes postsinapticas 30 excitadoras mediadas por el receptor (EPSCs). Como se muestra en la Figura 7A, GSTGluR23Y, pero no GST- GluR23A, es un buen sustrato para la fosforilacion de tirosina. La aplicacion en bano de insulina dio como resultado un descenso persistente en el componente AMPA de EPSCs (Figura 9C, D). La depresion de EPSC inducida por insulina fue evitada cuando el peptido GST-GluR23Y tipo silvestre (100 pg/ml) fue incluido en la pipeta de registro, mientras que en la misma cantidad de peptido mutante, GST-GluR23A, no tuvo efecto (Figura 9C, D). Asl, el peptido 35 que contenla tirosina tipo silvestre, pero no su contraparte mutante, es suficiente para bloquear la depresion persistente inducida por insulina de EPSCs mediado por el receptor de AMPA.
Ejemplo 6: residuos de tirosina en el LTD mediado por GluR2 CT
El nivel de fosforilacion de tirosina de GluR2 fue establecido utilizando la siguiente estimulacion de baja frecuencia (LFS) de secciones de hipocampo (1 Hz durante 15 minutos, lo cual induce confiablemente LTD bajo estas 40 condiciones experimentales), para determinar si la fosforilacion de tirosina de GluR2 CT puede ser requerida para la depresion a largo plazo inducida por LFS (LTD). Las secciones fueron homogenizadas en regulador de desnaturalizacion 10 minutos despues de la estimulacion y las subunidades de GluR fueron inmunoprecipitadas y sondeadas con fosfotirosina. Como se muestra en la Figura 10A, hubo una fosforilacion de tirosina basal de GluR2, pero no GluR1, y la estimulacion de induction de LTD incremento el nivel de fosforilacion de tirosina de GluR2 sin 45 afectar la de GluR1 (Figura 10A). La induccion de LTD por LFS fue bloqueada por la aplicacion postsinaptica de GST-GluR23Y (100 pg/ml), pero no por el peptido mutante GST-GluR23A (100 pg/ml; Figura 10B) o por GST- GluR2834-843 (Figura 10C).
Ejemplo 7: El peptido de GluR2 CT evita la endocitosis del receptor de AMPA inducida por isquemia y la apoptosis neuronal en un cultivo neuronal modelo de apoplejla
50 Un ataque similar a isquemia fue imitado por privation de oxlgeno y glucosa (OGD) durante una hora en neuronas corticales cultivadas (DIV 12-14). El OGD es un modelo de cultivo celular bien caracterizado de isquemia. El peptido GluR2CT (1 mM) fue administrado a las neuronas mezclandolo con el peptido portador PEP-1 e incubando las neuronas con la mezcla durante una hora antes del ataque con OGD. La Figura 11A muestra un ensayo colorimetrico (celula-ELISA) que indica que OGD facilita la endocitosis del receptor de AMPA, haciendo disminuir por 55 lo tanto su expresion sobre la superficie de la membrana de plasma y la preincubacion del peptido de GluR2-CT reduce el descenso inducido por OGD en la expresion de receptor de AMPA en la superficie celular (n=6; *: P<0.05, prueba de Student), en comparacion con control. La Figura 11B es un ensayo de apoptosis cuantitativo 24 horas
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despues de OGD utilizando el kit Cell Death Detection Plus (Roche, Cat# 1 774 425), demostrando que OGD produce muerte neuronal que es evitada grandemente por el pretratamiento de las neuronas con GluR2-CT. (n=6; **: P<0.01, prueba t de Student), comparada con OGD. Juntos, estos resultados indican que al igual que la sobreactivacion del receptor de NMDA, los ataques similares a isquemia producen tambien muerte celular facilitando la endocitosis del receptor de AMPA y como tales, los peptidos que bloquean la endocitosis del receptor de AMPA, tales como el peptido GluR2-CT, pueden ser utilizados en el tratamiento de apoplejla para reducir el dano neuronal.
Ejemplo 8: La aplicacion sistemica del peptido Tat-GluR23Y bloquea la expresion de la sensibilizacion de comportamiento del farmaco de abuso d-anfetamina en un modelo animal de adiccion a farmacos
La sensibilizacion en comportamiento esta definida como un incremento en la respuesta psicomotora al tratamiento con mucha clase de farmacos adictivos (esto es, anfetamina, cocalna, nicotina, herolna) y puede ser dividido en fases de induccion y expresion. La sensibilizacion en comportamiento es un modelo bien aceptado de adaptaciones neurales y de comportamiento que constituyen la hipotesis para formar las bases de adiccion, especlficamente cambios inducidos por farmacos en el sistema de dopamina mesocorticollmbica que subyace a la motivacion para engancharse en un comportamiento de busqueda de farmacos60,61.
Para inducir la sensibilizacion en comportamiento a farmacos adictivos que llevan al abuso de sustancias, cuatro grupos separados de ratas recibieron inyecciones repetitivas de d-anfetamina (2 mg/kg, intraperitonealmente (IP)) o solucion salina, cada tercer dla durante un total de 10 inyecciones. En los dlas 1, 5 y 10 del regimen de inyeccion, las ratas fueron colocadas en dos cajas de locomocion de nivel 2 durante 30 minutos antes de la inyeccion de anfetamina para habituarlas a las cajas, y durante 2 horas adicionales despues de la inyeccion, y se establecieron los marcadores de estereotipia (comportamientos inducidos por farmaco) a intervalos de 1 minuto cada 10 minutos durante la duracion de la sesion de 2 horas. Despues de la 10a inyeccion de d-anfetamina, las ratas recibieron 21 dlas de descanso, y se implantaron de manera cronica cateteres permanentes en la vena yugular bajo anestesia.
Con el fin de suministrar el peptido GluR2-CT en las neuronas en el cerebro despues de inyeccion intravenosa (IV), el peptido silvestre GluR2-CT que contenla residuos 3Y o la secuencia de peptidos correspondiente en la cual las tres tirosinas fueron reemplazadas con alanina se fusiono al dominio de transduccion de la membrana celular del virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1) protelna Tat (YGRKKRRQRRR), el cual es capaz de cruzar la barrera sangre cerebro (BBB)85, para obtener los peptidos Tat-GluR2-3Y (YGRKKRRQRRR-YKEGYNVYGIE) o Tat- GluR2-3A (YGRKKRRQRRR-AKEGANVAGIE).
En el dla 21, las ratas fueron pretratadas con Tat-GluR2-3Y, o Tat-GluR2-3A 1.5 nM/gr o solucion salina bien por inyeccion IV, o por microinyeccion intracraneana en el nucleus accumbens (Nac), y fueron regresados a sus jaulas de alojamiento por 60 minutos. Las ratas fueron colocadas entonces en las cajas de locomocion (camaras de observacion) durante 30 minutos y fueron tratadas luego con una dosis de ataque de d-anfetamina (2 mg/kg, IP). Los marcadores de estereotipia fueron establecidos tal como se describio (Figura 12A). Los puntos representan marcadores de estereotipia medios (± S.E.M) para grupos de ratas durante las 2 horas de la sesion de prueba. El pretratamiento con Tat-GluR2-3Y bloqueo completamente la expresion aguda de la estereotipia inducida por d- anfetamina, mientras que el Tat-GluR2-3A fue inefectivo en este aspecto (F(2,31)= 4.22, p<0.01). La Figura 12B muestra el efecto pico de la estereotipia, el cual ocurrio a aproximadamente 50 minutos despues del pretratamiento con d-anfetamina, el cual esta representado para cada grupo. * indica que p< 0.05 en comparacion con el grupo tratado con solucion salina. Un pretratamiento intravenoso de 1 hora con el peptido GluR23Y, pero no el control GluR23A, abolio la expresion de la sensibilizacion en comportamiento a una dosis de ataque de anfetamina, sin ningun efecto colateral notable en las ratas (Figura 12A, B). El bloqueo de la sensibilizacion es debido a la accion especlfica en el NAc, en un experimento subsecuente, como microinfusion directa de GluR23Y en el NAc, pero no la administracion IV imitada, de VTA, evita la expresion de la sensibilizacion de comportamiento (Figura 12c, D). El tratamiento sistemico con el peptido tipo silvestre efectivo fallo en perturbar una respuesta operativa aprendida para recompensa en alimento suministrado en una programacion FR-2 (Figura 18A). Evidencia adicional para el alto grado de especificidad del peptido es su carencia de efecto sobre el efecto de recompensa incondicional de D-amp (Figura 18B). Estos datos proveen la primera evidencia de que el LTD en el NAc es requerido para la expresion de la sensibilizacion de comportamiento, una correlacion de comportamiento compulsivo, y lo que es mas significativo, que un “peptido de interferencia” corto que es permeable a la membrana que bloquea LTD puede evitar la expresion de esta sensibilizacion de comportamiento sin efectos colaterales necesarios. Asl, la capacidad del tratamiento con el peptido Tat-GluR2-3Y para bloquear la expresion de la sensibilizacion de comportamiento es consistente con el uso de tales peptidos en el tratamiento de abuso de sustancias y adiccion a clases de farmacos que inducen la sensibilizacion de comportamiento.
Ejemplo 9: Tratamiento de dano cerebral isquemico por bloqueo de la endocitosis del receptor de AMPA
Se investigo si un peptido que puede bloquear la endocitosis de AMPAR puede funcionar como un agente neuroprotector evitando la apoptosis neuronal inducida por glutamato. Primero, con el fin de asegurar de que el peptido era capaz de permear las neuronas, se expusieron cultivos de neuronas corticales Wistar primarios al peptido Tat-GluR2-3Y marcado con dansilo y las celulas fueron visualizadas por microscopla de fluorescencia. Las
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neuronas DIV 13 fueron tratadas con solucion salina (control) o con el peptido GluR23Y marcado con dansilo 1 pM durante 10, 20, 30, o 60 minutos. El peptido fue capaz de permear las celulas en una forma dependiente del tiempo. Las neuronas consumieron el Tat-GluR2-3Y dansilado en una forma dependiente del tiempo con fluorescencia visible significativamente a los 10 minutos con un maximo a aproximadamente 30 minutos.
Una vez que se supo que el peptido podrla entrar a las neuronas corticales, se examino la capacidad de Tat-GluR2- 3Y para bloquear la endocitosis de AMPAR inducida por NMDA. Las neuronas corticales Wistar primarias pretratadas con o sin Tat-GluR2-3Y fueron sometidas a ataque con NMDA y la expresion en superficie de AMPARs fue cuantificada utilizando un ensayo de ELISA celular. Los niveles de llnea base de la expresion en superficie de AMPAR fueron aproximadamente 70%, con una reserva intracelular correspondiente al 30%. El tratamiento con NMDA-glicina dio como resultado un descenso significativo en la expresion en superficie de AMPAR con referencia al control de 69% a 55% (p < 0.05, prueba de Tukey-Kramer), que fue bloqueado completamente por tratamiento con Tat-GluR2-3Y (73% de expresion en superficie, p < 0.05 en comparacion con el grupo de NMDA, prueba de Tukey- Kramer) (Figura 13). Adicionalmente, el Tat-GluR2-3A, una version mutada de Tat-GluR2-3Y fue incapaz de bloquear la endocitosis de AMPAR inducida por NMDA. Tambien debe anotarse que en este ejemplo, cada peptido solo no tuvo efecto sobre la expresion en superficie de AMPAR.
Puesto que el Tat-GluR2-3Y fue capaz de bloquear la endocitosis de AMPAR inducida por NMDA, se investigo la capacidad del peptido para proteger las neuronas cultivadas contra la apoptosis inducida por privacion de oxlgeno y glucosa (OGD). Las neuronas DIV 12-13 fueron pretratadas bien sea con solucion salina o con Tat-GluR2-3Y durante 60 minutos, seguido por 60 minutos de OGD a 37°C o incubacion a 37°C en medio (control). La cantidad de apoptosis fue cuantificada utilizando un ensayo de ELISA direccionado a nucleosomas libres que son caracterlsticos de la apoptosis. La OGD indujo apoptosis significativa en comparacion con el control que fue bloqueado sustancialmente por pretratamiento con Tat-GluR2-3Y (p < 0.05) (Figura 14).
Para el estudio de peptido in vivo se investigo primero si el peptido podrla pasar la barrera sangre cerebro (BBB) e infiltrar el tejido neuronal. Se administraron Tat-GluR2-3Y marcada con dansilo o solucion salina a ratones C57- Black/6 macho y se cortaron secciones cerebrales de corona de 40 pm con un criostato y se visualizaron con microscopla de fluorescencia. Mas especlficamente, dos ratones c57-Black/6 machos adultos recibieron una inyeccion intraperitoneal de 30 nmoles/g de Tat-GluR2-3Y marcado con dansilo o solucion salina. Los ratones fueron sacrificados 2 horas despues de la inyeccion, y se cortaron secciones de corona de 40 micrones con un criostato y se visualizaron con microscopla de fluorescencia. Los resultados indicaron que las secciones de cerebro con peptido marcado con dansilo exhibieron una intensidad de fluorescencia mayor que el control, confirmando la entrada del peptido en el cerebro, y que el Tat-GluR2-3Y marcado con dansilo cruza la barrear sangre cerebro y entra al tejido neural.
Con el fin de describir cualitativamente la localizacion y tamano del infarto producido por el metodo de sutura intraluminal de oclusion en MCA, se sometieron 4 ratas Sprague-Dawley macho al procedimiento, se sacrificaron el dla 3 despues de la oclusion de MCA, y se tineron secciones de cerebro de 1 mm con cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (TTC). Mas especlficamente, ratas Sprague-Dawley macho adultas de ~300 g de peso corporal fueron sometidas a 60 minutos de oclusion MCA utilizando un monofilamento de nylon 3-0 intraluminal. Las ratas fueron sacrificadas entonces 3 dlas despues de la oclusion de MCA y los cerebros fueron cortados en secciones de 1 mm y tenidos con TTC. El metodo de isquemia transiente dio como resultado un volumen de infarto significativo en la involucion de seccion transversal coronaria maxima a ~-1.5 mm con respecto al bregma. El volumen del infarto fue reproducible con involucramiento cortical significativa en cada rata. A partir de la tincion con TTC, se escogieron -0.8 mm con respecto al bregma para la tincion de apoptosis utilizando marcacion final en muescas dUTP mediada por desoxirribonucleotido transferasa [TdT] (TUNEL).
Con el fin de determinar la dosis maxima que podrla ser administrada sin reaccion adversa, dos ratas Sprague- Dawley macho fueron inyectadas con dosis seriadas de Tat-GluR2-3Y variando desde 0.5 nmoles/g a 30 nmoles/g y se monitorizaron los parametros vitales basicos. Se encontro que el farmaco fue tolerado hasta una dosis de ~12 nmoles/g despues de lo cual hubo una gran declinacion en presion sangulnea concurrente con un incremento en la rata de respiracion (Figura 15) y cambios correspondiente en pO2, y pCO2. Ambos animales fueron revividos despues de la respuesta a la curva y no mostraron signos de depresion mental u otros cambios en comportamiento. Con base en estos resultados la dosis de 3 nmoles/g fue escogida para los experimentos in vivo subsecuentes. Asumiendo una dispersion completa del peptido en el animal, esta dosis corresponde aproximadamente a una concentracion de 3 pM.
Puesto que el mecanismo propuesto de neuroproteccion para Tat-GluR2-3Y es la prevencion de la apoptosis, fue necesario primero demostrar y cuantificar la apoptosis en el modelo de isquemia focal transiente. Dos ratas Sprague-Dawley macho fueron sometidas a 90 minutos de oclusion de MCA, o a cirugla simulada sin oclusion. Utilizando la tincion TUNEL de las secciones de cerebro obtenidas 24 horas despues de la cirugla, la oclusion de MCA demostro causar apoptosis significativa (Figura 16).
Dada la evidencia de que el pretratamiento con Tat-GluR2-3Y era capaz de bloquear la endocitosis del receptor de
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AMPAR y reducir la apoptosis inducida por OGD in vitro, se investigo la capacidad de pretratamiento con el peptido para evitar el deficit neurologico y apoptosis penumbra en isquemia focal transiente. Se pretrataron 15 ratas Sprague-Dawley macho con o 3 nmoles/g de Tat-GluR2-3Y o de Tat-GluR2-3A o solucion salina durante 60 minutos, despues de lo cual, se ocluyo la MCA derecha durante 60 minutos. Las ratas se sometieron a un examen neurologico 45 minutos durante la oclusion de MCA y en el sacrificio (~24 horas). No se noto diferencia significativa en los marcadores neurologicos a las 24 horas (Figura 17A) o durante la oclusion. Despues del sacrificio, se tineron secciones de corona de 12 pm con TUNEL y el numero de celulas positivas a TUNEL en el cortex del hemisferio afectado fue registrado (Figura 17B). El pretratamiento con Tat-GluR2-3Y dio como resultado un descenso de ~55% en apoptosis con respecto al control con solucion salina, mientras que el pretratamiento con Tat-GluR2-3A dio como resultado un incremento de ~22% en la apoptosis, sin embargo, debido al tamano de muestra y a la alta variabilidad, estas diferencias no alcanzaron significado estadlstico. Se noto durante la cirugla que el pretratamiento con Tat- GluR2-3Y y Tat-GluR2-3A versus solucion salina dio como resultado una presion sangulnea arterial media significativamente inferior (MABP) 10 minutos antes de la oclusion de MCA; p < 0.05 prueba de Tukey-Kramer.
Ejemplo 10: Tratamiento de trastornos relacionados con el estres utilizando el peptido GluR2-CT
El estres es conocido por iniciar la induccion de LTD123 y para dar como resultado trastornos relacionados con el estres tales como incapacidad de la memoria, ansiedad124 y depresion125. Asl, el peptido GluR2-3Y, al bloquear la endocitosis regulada y por lo tanto el LTD, puede tener efectos terapeuticos para estos trastornos relacionados con el estres. Como ejemplo, hemos probado por lo tanto el efecto del peptido contra la ansiedad inducida por estres utilizando un modelo de ansiedad animal bien establecido126. Se inyectaron ratas (n=4) tanto con GluR2-3Y 10 nM/g o un volumen igual de vehlculo ACSF (IP). Se les dio 30 minutos en un cuarto oscuro despues de la inyeccion. Despues de eso fueron colocadas en una plataforma elevada durante 30 minutos como medio de estres y luego colocadas sobre el laberinto elevado durante 5 minutos74. Las ratas inyectadas con GluR2-3Y gastaron mas tiempo sobre los brazos abiertos que las ratas con ACSF. Las ratas con ACSF gastaron la mayor parte de su tiempo en las esquinas de los brazos cerrados o retrocediendo buscando las paredes. Asl, el peptido GluR23Y bloqueo la ansiedad inducida por estres (Figura 19). Estos resultados sugieren fuertemente que la endocitosis de AMPAR facilitada y por lo tanto la expresion de LTD juegan un papel indispensable en la expresion de comportamientos inducidos por estres y que los bloqueadores de LTD tales como el peptido GluR23Y puede ser utilizado como agente terapeutico para tratar trastornos cerebrales relacionados con el estres, incluyendo ansiedad, slndrome postraumatico y depresion.
Ejemplo 11: Prevencion de recalda en adiccion a farmacos y tratamiento de trastornos psicoticos utilizando los peptidos GluR2-CT
La recalda inducida por la presentacion de una dosis de inicio de farmaco o estlmulos condicionales apareados previamente con infusiones de anfetamina o herolna son una fase crltica del comportamiento adictivo. Se utilizo un modelo de rata de autoadministracion de farmaco intravenosa, acoplado con la extincion de comportamiento de busqueda de farmaco antes de las pruebas de recalda73. El peptido Tat-GluR23Y, el peptido de control mutado GluR23A, y el vehlculo se inyectaron intravenosamente antes de las pruebas de recalda. Despues de la demostracion del exito en la prevencion de la recalda, se llevo a cabo una baterla de experimentos para control de comportamiento para asegurar que el tratamiento con los peptidos Tat-GluR2 no produclan deficit generalizados en el aprendizaje y la memoria. El protocolo utiliza pruebas de reconocimiento y memoria espacial y de orden temporal utilizado rutinariamente, junto con una baterla de pruebas neurologicas estandar para asegurar una funcion sensorial y motora normal (Figura 18A-B). Tambien se examinaron los efectos del peptido GluR23Y sobre las pruebas especlficas en ratas que modelan slntomas psicoticos en humanos incluyendo inhibicion prepulso, hiperactividad inducida por PCP e interaction social. Ocurre un bloqueo de la sensibilization sin afectar la funcion de AMPAR y la transmision sinaptica basal, y las consecuencias adversas de bloquear los receptores trasmisores, frecuentemente asociadas con otros farmacos antipsicoticos disponibles actualmente, no ocurren.
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Otras realizaciones
Los numeros de Acceso, tal como se utilizan aqul se refieren a los numeros de Acceso para multiples bases de datos, incluyendo GenBank, el European Molecular Biology Laboratory (EMBL), la DNA Database of Japan (DDBJ), o el Genome Sequence Data Base (GSDB), para secuencias de nucleotidos, e incluyendo el Protein Information Resource (PIR), SwISSPROT, Protein Research Foundation (PRF), y el Protein Data Bank (PDB) (secuencias a partir de estructuras resueltas), as! como a partir de traducciones de regiones codificadas anotadas de secuencias de nucleotidos en GenBank, EMBL, DDBJ, o RefSeq, para secuencias de polipeptidos. Los rangos numericos son incluyentes de los numeros que definen el rango. En la especificacion, la palabra “que comprende” se utiliza como un termino abierto, equivalente sustancialmente a la expresion “que incluye, pero no se limita a”, y la palabra “comprende” tiene un significado correspondiente. La citacion de referencias aqul no debe considerarse como una admision de que tales referencias son arte previo a la presente invencion.

Claims (15)

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    30
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que consiste de la formula I:
    Z1-X1-X2-E-G-X3-N-V-X4-G-Z2; (I)
    en donde X1 es Y, S, o T;
    X2 es K o R;
    X3 es Y, S, o T;
    X4 es Y, S, o T;
    Z1 es H2N;
    Z2 es -C(O)OH;
    en donde "-" es un enlace covalente, y en donde el compuesto es un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA; y en donde cualquiera uno o mas de Xi, X3, o X4 es un Y.
  2. 2. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde el compuesto inhibe la endocitosis del receptor de AMPA con una afinidad que es al menos tan grande como la afinidad de un polipeptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente de YREGYNVYGIE, YKEGYNVYGIE, YREGYNVYG, y YKEGYNVYG.
  3. 3. Un compuesto consistente de la formula I:
    Z1-X1-X2-E-G-X3-N-V-X4-G-Z2; (I)
    fusionado a o combinado con el peptido portador PEP-1 o un peptido portador que tiene la secuencia de aminoacidos YGRKKRRQRRR;
    en donde en la formula I:
    X1 es Y, S, o T;
    X2 es K o R;
    X3 es Y, S, o T;
    X4 es Y, S, o T;
    Z1 es H2N;
    Z2 es -C(O)OH;
    en donde "-" es un enlace covalente, y en donde el compuesto es un inhibidor de la endocitosis del receptor de AMPA; y en donde uno cualquiera o mas de X1, X3, o X4 es una Y.
  4. 4. Un polipeptido que consiste de la secuencia de aminoacidos YKEGYNVYGIE.
  5. 5. Un polipeptido que consiste de la secuencia de aminoacidos YKEGYNVYGIE fusionado o combinado con un peptido portador PEP-1 o un peptido portador que tiene la secuencia de aminoacidos YGRKKRRQRRR.
  6. 6. Una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido de la reivindicacion 4 o 5.
  7. 7. Un anticuerpo que enlaza especlficamente el polipeptido de la reivindicacion 4.
  8. 8. Uso de un polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 6,
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    el anticuerpo de la reivindicacion 7, o del compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la manufactura de un medicamento para tratar o prevenir dano o disfuncion neurologica o abuso de sustancias en un sujeto.
  9. 9. El uso de la reivindicacion 8, en donde el dano neurologico ocurre como resultado de activacion excesiva de los receptores de NMDA o debido a cambios en la endocitosis del receptor de AMPA.
  10. 10. El uso de la reivindicacion 8 o 9, en donde el dano o disfuncion neurologico ocurre como resultado de al menos uno de un trastorno seleccionado del grupo consistente de estres, ansiedad, depresion, hipoglicemia, paro cardiaco, epilepsia, isquemia cerebral, trauma cerebral, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington; dolor neuropatico; esclerosis lateral amiotrofica (ALS); slndrome de Hutchinson Gilford; diabetes; ataxia; retardo mental; demencias, trastornos asociados con tabaco u obesidad, presion sangulnea elevada, trastornos asociados con defectos o disfuncion en aprendizaje o memoria, trastornos psiquiatricos, autismo, esquizofrenia, slndrome X fragil, y trastornos asociados con abusos de sustancias o adicion a un farmaco.
  11. 11. Uso de polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 6, el anticuerpo de la reivindicacion 7 o del compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la manufactura de un medicamento para modular la apoptosis neuronal mediada por NMDA o para modular la endocitosis del receptor de AMPA, o para modular la plasticidad sinaptica en un sujeto.
  12. 12. Un metodo para modular la apoptosis neuronal mediada por NMDA in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto una celula neuronal con el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5.
  13. 13. Un metodo para modular la endocitosis del receptor de AMPA in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto una celula que expresa un receptor de AMPA con el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el polipeptido de la reivindicacion 4 o 5.
  14. 14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 o el metodo de la reivindicacion 12 o 13, en donde el compuesto o polipeptido es fusionado a o combinado con el peptido portador PEP-1 o un peptido portador que tiene la secuencia de aminoacido YGRKKRRQRRR.
  15. 15. Un metodo para cribar un modulador de la endocitosis del receptor de AMPA, comprendiendo el metodo:
    (a) proveer un sistema que comprende
    (i) un polipeptido receptor de AMPA o un fragmento biologicamente activo del mismo;
    (ii) un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el polipeptido de la reivindicacion 4 o 5;
    (b) proveer un compuesto de prueba;
    (c) poner en contacto el sistema con el compuesto de prueba; y
    (d) determinar si el compuesto de prueba modula la endocitosis del receptor de AMPA.
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