BRPI0714783A2

BRPI0714783A2 - peptÍdeo de fusço para inibir a interaÇço do receptor de nmda neuronal (nmdar) e proteÍnas que interagem com nmdar

Info

Publication number: BRPI0714783A2
Application number: BRPI0714783-0A
Authority: BR
Inventors: Thomas Meyer
Original assignee: Xigen Sa
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2013-07-30
Also published as: RU2009106710A; CN101490081A; EP2046821B1; EP1884521A1; KR20090033868A; AU2007280717A1; IL195536A0; CA2653438A1; EP2046821A1; NO20090875L; HRP20080648A2; MX2009001095A; JP2009545543A; WO2008014917A1; ATE509948T1; US20090281036A1

Abstract

Patente de Invenção: "PEPTÍDEO DE FUSçO PARA INIBIR A INTERAÇçO DO RECEPTOR DE NMDA NEURONAL (NMDAR) E PROTEÍNAS QUE INTERAGEM COM NMDAR". A presente invenção refere-se um peptídeo de fusão compreendendo pelo menos um componente (I), em que o componente (I) compreende um peptídeo transportador, e um componente (II), selecionado de um peptídeo inibidor de interação do receptor N-metil-D-aspartato neuronal (NMDAR) com proteínas de interação NMDAR, em que o componente (II) consiste inteiramente em aminoácidos D-enantioméricos. A presente invenção ainda refere-se a uma composição farmacêutica inventiva, compreendendo o peptídeo de fusão inventivo e métodos para administrar o mesmo, assim como kits e usos empregando o peptídeo de fusão inventivo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEO DE FUSÃO PARA INIBIR A INTERAÇÃO DO RECEPTOR DE NMDA NEURONAL (NMDAR) E PROTEÍNAS QUE INTERAGEM COM NMDAR".

A presente invenção refere-se ao fornecimento de um peptídeo de fusão que compreende pelo menos um componente (I), em que o com- ponente (I) compreende um peptídeo transportador, e um componente (II), selecionado entre um peptídeo que inibe a interação do receptor de N-metil- D-aspartato neuronal (NMDAR) com proteínas que interagem com NMDAR, em que o componente (II) consiste inteiramente em aminoácidos Ρ- ΙΟ enantioméricos. A presente invenção fornece adicionalmente uma composi- ção farmacêutica inventiva, que compreende o peptídeo de fusão inventivo e métodos para administrar o mesmo, assim como kits e usos empregando o peptídeo de fusão inventivo.

Injúrias isquêmicas ou traumáticas ao cérebro ou medula espi- nhal tais como apoplexia cerebral isquêmica são problemas de saúde impor- tantes já que eles ocorrem freqüentemente e muitas vezes produzem dano irreversível aos neurônios do sistema nervoso central (CNS) e aos seus pro- cessos. Já que o dano é freqüentemente severo, grandes despesas são gas- tas atualmente pelas autoridades de saúde a cada ano para o tratamento de pacientes que sofrem das conseqüências de tais injúrias. Entretanto, no pre- sente ainda não há tratamentos farmacológicos eficazes para estas injúrias agudas do CNS.

Clinicamente, injúrias isquêmicas ou traumáticas ao cérebro ou medula espinhal como, por exemplo, apoplexia cerebral isquêmica se mani- festa como deteriorações agudas na capacidade neurológica que variam desde pequenos defeitos focais até disfunção global catastrófica ou ainda podem levar à morte do paciente a ser tratado. Atualmente percebe-se que a magnitude final do déficit é ditada pela natureza e extensão do insulto físico primário, e por uma seqüência de processos de desenvolvimento de fenô- menos secundários que causam morte posterior das células neuronais en- volvidas. Já que o comprometimento destes processos não é instantâneo, há um período de tempo teórico de duração indeterminada, no qual a interven- ção poderia interromper os eventos que causam neurotoxicidade retardada. Embora muito seja conhecido sobre os mecanismos celulares que disparam e mantêm processos de morte neuronal isquêmica ou traumática, por exem- plo, reversão do transportador de glutamato, não há no presente nenhuma estratégia preventiva prática eficaz ou protocolos de tratamento eficazes. Consequentemente, não há atualmente tratamentos farmacológicos clinica- mente úteis disponíveis para as doenças acima incluindo apoplexia cerebral ou injúria à medula espinhal.

De um ponto de vista científico, uma redução local na perfusão do tecido do CNS media a morte neuronal em injúrias hipóxicas e traumáti- cas in vivo. Tal hipoperfusão local é geralmente causada por um interrompi- mento físico da vasculatura local, trombose venosa, vasoespasmo, ou oclu- são Iuminal por uma massa embólica. Independente de sua etiologia, acredi- ta-se que a isquemia resultante danifique neurônios suscetíveis por impactar adversamente uma variedade de mecanismos homeostáticos celulares. Em- bora a natureza exata dos distúrbios seja pouco conhecida, uma caracterís- tica comum a muitos modelos experimentais de injúria neuronal é um au- mento na concentração de cálcio intracelular livre ([Ca2+],). Os neurônios possuem múltiplos mecanismos para confinar [Ca2+], para níveis baixos, cer- ca de 100 nM, necessários para a função fisiológica. Acredita-se amplamen- te que um aumento prolongado em [Ca2+], desregule processos fortemente controlados dependentes de Ca2+. fazendo com que eles gerem produtos reacionais em excesso, para ativar vias enzimáticas normalmente quiescen- tes, ou inativar mecanismos citoprotetores regulatórios. Isto, por sua vez, resulta na criação de destruição celular experimentalmente observável, tal como lipólise, proteólise, quebra do citoesqueleto, alterações no pH, forma- ção de radical livre, disfunção mitocondrial, inchaço celular, perda da integri- dade plasmática e picnose nuclear.

Uma causa fundamental dos níveis perigosos de entrada de Ca+2 durante um episódio isquêmico é através da liberação excessiva de EAAs. Desta forma, a abordagem clássica de evitar a neurotoxicidade de Ca+2 tem ocorrido pelo bloqueio farmacológico da entrada de Ca2+ através de canais de Ca2+ voltagem-dependentes e/ou de canais de controlados por EAA de aminoácidos excitatórios. Variações nesta estratégia freqüentemen- te diminuem a morte celular induzida por EAA ou anóxica in vitro, dando cre- dibilidade para a hipótese de neurotoxicidade de Ca2+ Entretanto, uma vari- edade de antagonistas de EAA e de canais de Ca2+ não protege contra injú- ria neuronal in vivo, particularmente em Injúria da Medula Espinhal (SCI), injúria de cabeça e isquemia cerebral global. Não se sabe se isto é devido a concentrações de fármacos insuficientes, ao bloqueio inapropriado do influxo de Ca2+, ou a uma contribuição de processos neurotóxicos independentes de Ca2+. Entretanto, é provável que a neurotoxicidade por Ca2+ seja disparada através de diferentes vias em diferentes tipos de neurônios do CNS. Portan- to, o bloqueio de Ca2+ bem-sucedido requer tipicamente uma abordagem polifarmacêutica. Deve ser observado que muitos agonistas de NMDARs têm sido desenvolvidos. Entretanto, estes antagonistas têm sido bem- sucedidos in vivo em modelos animais na administração do fármaco logo antes do trauma e assim podem não ser traduzidos para um cenário clínico típico, em que o tratamento ocorre tipicamente subseqüentemente, por e- xemplo, a uma apoplexia. Ainda, antagonistas de NMDAR são tipicamente fracamente tolerados in vivo em seres humanos, fornecendo uma pequena ou algumas vezes inexistente janela terapêutica, a qual reflete o importante papel de NMDAR na fisiologia normal assim como na patofisiologia.

Com relação a processos neurotóxicos dependentes de Ca2+, foi observado no sistema nervoso de mamíferos, que a eficiência pela qual a atividade do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) desencadeia vias de sinalização intracelulares governa a plasticidade, o desenvolvimento, a se- nescência e doença neuronal. Estudar a sinalização de NMDAR excitotóxica por suprimir a expressão da proteína estrutural PSD-95 de NMDAR revelou uma excitotoxicidade seletivamente atenuada de NMDAR, mas, entretanto, nenhuma excitotoxicidade por outros canais de glutamato ou de Ca2+ (vide, por exemplo, US 20030050243). A função de NMDAR desta forma não foi afetada, bem como a expressão do receptor, enquanto que as correntes de NMDA e a carga de 45Ca através de NMDARs estavam inalteradas. Além disso, a supressão de PSD-95 bloqueou seletivamente a produção de oxido nítrico ativada por Ca2+ por NMDARs, mas não por outras vias, sem afetar a expressão ou função de óxido nítrico sintase neuronal (nNOS). Desta forma, PSD-95 foi considerado como sendo necessário para o acoplamento eficien- te da atividade de NMDAR à toxicidade do óxido nítrico e confere especifici- dade à sinalização excitotóxica de Ca2+.

Adicionalmente, sabe-se que o influxo de cálcio através de NM- DAR desempenha um papel-chave na mediação da transmissão sináptica, desenvolvimento neuronal, e plasticidade (vide, por exemplo, Ghosh e Gre- enberg, Science 268, 239 (1995); Bliss e Collingridge, Nature 361, 31 (1993)). Em excesso, o influxo de Ca2+ dispara excitotoxicidade (vide, por exemplo, Olney, Kainic acid as a tool in neurobiology., McGeer, Olney e Mc- Geer, Eds. (Raven Press, Nova Iorque, 1978), p. 95.; Rothman e Olney, TINS 10, 299 (1987); Choi, Ann NY Acad Sci 747, 162 (1994)), um processo que danifica os neurônios em distúrbios neurológicas que incluem apoplexia, epilepsia, e condições neurodegenerativas crônicas (vide, por exemplo, Lip- ton e Rosenberg, New Eng J Med 330, 613 (1994)). Deve ser compreendido que a rápida neurotoxicidade dependente de Ca2+ é desencadeada mais efi- cientemente quando o influxo de Ca2+ ocorrer através de NMDARs, e não pode ser reproduzida por carregar neurônios com quantidades equivalentes de Ca2+ através de canais não-NMDARs ou de Ca2+ sensíveis a voltagem (VSCCs) (vide, por exemplo, Sattler et al., J Neurochem 71, 2349 (1998).; Tymianski et al., J Neurosci 13, 2085 (1993)). Esta observação indicou que o influxo de Ca2+ através dos canais de NMDAR pode ser funcionalmente aco- piado às vias de sinalização neurotóxicas. Desta forma, sem estar limitado pela teoria, foi sugerido que a sinalização letal de Ca2+ por NMDARs pode ser determinada pelas moléculas com as quais eles interagem fisicamente. Por exemplo, as subunidades NR2 de NMDAR, através de seus domínios C- terminais intracelulares, se ligam a PSD-95/SAP90 (vide Cho et al., Neuron 9, 929 (1992)), chapsyn-110/PSD-93, e outros membros da família da guani- Iato sintase associada à membrana (MAGUK) (vide, por exemplo, Kornau et al., Science 269, 1737 (1995).; Brenman et al., J Neurosci 16, 7407 (1996); Muller et al., Neuron 17, 255 (1996)). MAGUKs ligados a NMDAR são ge- ralmente distintos daqueles associados com não-NMDARs (vide Dong et al., Nature 386, 279 (1997); Brakeman et al., Nature 386, 284 (1997)). Foi des- coberto que a ativação preferencial de sinais de Ca2+ neurotóxicos por NM- DARs é determinada pela distinção de MAGUKs ligadas à NMDAR, ou das proteínas intracelulares que elas ligam. PSD-95 é uma molécula estrutural submembrana que se liga e se une a NMDARs preferencialmente e, através de interações proteína-proteína adicionais, pode ligá-las a moléculas de si- nalização intracelular (vide, por exemplo, Craven e Bredt, Cell 93, 495 (1998); Niethammer et al., Neuron 20, 693 (1998); Kim et al., Neuron 20, 683 (1998); Tezuka et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 435(1999).). Perturbação de PSD-95 foi então sugerida como tendo impacto sobre a sinalização de Ca2+ neurotóxica através de NMDARs.

Em geral, interações proteína-proteína governam sinais envolvi- dos no crescimento, diferenciação celular, e comunicação intercelular atra- vés de associações dinâmicas entre domínios de proteína modulares e seus parceiros cognatos (vide Pawson e J. D. Scott, Science 278, 2075-2080 (1997)). Mais particularmente, os receptores de glutamato ionotrópicos são organizados em sinapses excitatórias de neurônios centrais em complexos de sinalização de múltiplas proteínas dentro da densidade pós-sináptica (PSD) (vide Sheng, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 98, 7058-7061 (2001)). Uma proeminente proteína organizadora dentro da PSD é PSD-95, um membro da família de guanilato quinase associada à membrana (MAGUK). PSD-95 contém múltiplos domínios que acoplam proteínas transmembrana tais como o subtipo de receptores de glutamato N-metil-D-aspartato (NMDAR) a uma variedade de enzimas de sinalização intracelular, através do seu segundo domínio PDZ (PDZ2), PSD-95 se liga à subunidade 2B de NMDAR (NR2B) e à oxido nítrico sintase neuronal (nNOS) (vide Brenman et al., Cell 84, 757- 767 (1996)). Esta interação acopla a atividade de NMDAR à produção de oxido nítrico (NO), uma molécula de sinalização que serve de mediadora a excitotoxicidade dependente de NMDAR (vide Dawson et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 6368-6371 (1991). NR2 pode interagir com PDZ1 ou PDZ2 de PSD-95. Entretanto, se o domínio PDZ1 de PSD-95 interagir com a termina- ção COOH do receptor de NMDA, PDZ2 fica livre para se ligar à região NH2- terminal de nNOS (Cao et al., 2005, J. Cell Biol 168, 117-126; e Christopher- son et al, 2005, J. Biol. Chem. 274:27467-27473.

Embora NMDARs desempenhem um importante papel neurató-

rico na injúria cerebral hipóxica/isquêmica (vide Simon et al., Science 226, 850-852 (1984)), o bloqueio da função de NMDAR pode ser deletério em animais e em seres humanos (vide Fix et al., Exp Neurol 123, 204-215 (1993); Davis et al., Stroke 31, 347-354 (2000); Morris et al., J. Neurosurg. 91, 737-743 (1999)). Antagonistas de NMDAR desencadeiam apoptose no cérebro em desenvolvimento. Ainda, antagonistas de NMDAR, quando ad- ministrados durante um período crítico após a injúria cerebral traumática ou durante neurodegeneração lentamente progressiva, exacerbam a perda neu- ronal no cérebro adulto (Ikonomidou et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97, 12885-12890; Olney et al., 2002, Brain Pathology 12, 488-498). Além disso, o bloqueio da função de NMDAR pelo uso de antagonistas de NMDAR pode levar a outros efeitos colaterais indesejáveis tais com prejuízo cognitivo e psicose. Atingir a proteína PSD-95, portanto representa uma abordagem te- rapêutica alternativa para doenças que envolvem excitotoxicidade a qual pode contornar as conseqüências negativas do bloqueio da função de NM- DAR. Entretanto, mutação ou repressão de PSD-95 foi mostrada impraticá- vel como uma terapia para injúria cerebral e não pode ser aplicada após uma injúria ter ocorrido. Portanto, ao invés de alterar a expressão de PSD- 95, foi questionado se interferir com a interação de NMDAR/PSD-95 poderia suprimir a excitotoxicidade in vitro e a lesão cerebral isquêmica in vivo.

Tendo em vista o exposto acima, uma abordagem foi desenvol- vida na técnica (US 20030050243) para reduzir o efeito prejudicial pelo tra- tamento de células de mamífero com compostos que reduzem ou inibem a interação de receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) e proteínas que inte- ragem com NMDAR. O método de acordo com US 20030050243 usa com- postos peptídicos capazes de afetar a interação dos receptores neuronais de N-metil-D-aspartato (NMDARs) e proteínas que interagem com NMDAR, por exemplo proteínas neuronais. Esta abordagem contorna desvantagens, as quais resultam do bloqueio da função de NMDAR. O método de acordo com US 20030050243 se baseia principalmente no achado de que a interação da proteína de densidade pós-sináptica-95 (PSD-95) a receptores de N-metil-D- aspartato neuronais (NMDARs) leva a vias que mediam excitotoxicidade e, portanto, o dano cerebral isquêmico pode ser curado usando peptídeos sele- tivos que afetam esta interação em particular. Mais particularmente, o inter- rompimento desta interação foi efetuado de acordo com US 20030050243 pela introdução de peptídeos dentro de neurônios que se ligam a domínios modulares em qualquer um dos lados do complexo de interação de PSD- 95/NMDAR. Este tratamento atenuou a sinalização de NMDAR a jusante sem bloquear a atividade de NMDAR, protegeu os neurônios corticais culti- vados dos insultos excitotóxicos e reduziu o volume de infarto cerebral em ratos submetidos à isquemia cerebral focai. O método de tratamento de a- cordo com US 20030050243 foi eficaz quando aplicado antes ou uma hora após o início da excitotoxicidade in vitro e isquemia cerebral in vivo. Esta abordagem foi então conhecida por fornecer uma boa base para evitar com- plicações negativas associadas com o bloqueio da atividade de NMDAR.

Entretanto, é bem-conhecido que compostos peptídicos adminis- trados in vivo atingindo sítios intracelulares, por exemplo, para o tratamento de uma doença específica, assim como para o tratamento celular in vitro, compreendem tipicamente baixa biodisponibilidade em células a serem tra- tadas. Esta baixa biodisponibilidade é principalmente devida ao direciona- mento subótimo destes compostos peptídicos para suas células-alvo. Isto pode ser causado, por exemplo, por falta de sistemas transportadores ade- quados ou pelo uso de sistemas transportadores inadequados, que não tra- balham de forma eficaz in vivo no local da(s) célula(s)-alvo desejada(s), por exemplo, que não atingem de forma eficiente o citoplasma da célula ou um destino celular específico. Embora este efeito possa ser superado pela ad- ministração de uma quantidade crescente de compostos peptídicos ou pela administração repetida dos mesmos, níveis aumentados de compostos pep- tídicos in vivo pode levar a efeitos colaterais indesejados na administração. Além disso, a administração repetida de compostos peptídicos tipicamente requer a presença contínua de um médico e, como uma conseqüência, na maioria dos casos hospitalização continuada. Mesmo que tais efeitos pos- sam ser irrelevantes pela administração aumentada ou repetida de compos- tos peptídicos ou pelo uso de sistemas transportadores mais adequados (vi- de, por exemplo, US 20030050243, usando TAT como um peptídeo trans- portador), eles adicionalmente podem sofrer uma degradação prematura e, como uma conseqüência, mostram novamente baixa biodisponibilidade in vivo. Este efeito é devido em parte a processos intracelulares, por exemplo, processos de degradação por enzimas de decomposição como proteases ou peptidases, ou pode ser devido à instabilidade in vivo destes peptídeos ou degradação proteolítica no soro, fluido cerebroespinhal (csf), etc. Entretanto, a instabilidade de peptídeos não é abolida pelo aumento nem pela repetição da administração dos compostos peptídicos. Partindo do exposto acima, foi então um objetivo da presente

invenção fornecer uma alternativa para reduzir o efeito prejudicial de uma injúria a células de mamífero, mais particularmente fornecer compostos que inibem a interação do receptor de N-metil-D-aspartato neuronal (NMDA) e proteínas que interagem com NMDAR, superando assim pelo menos algu- mas das restrições da técnica anterior, por exemplo, conforme exemplificado pelos compostos de acordo com 20030050243.

O objetivo é solucionado de acordo com a presente invenção por um peptídeo de fusão que compreende pelo menos um componente (I), em que o componente (I) compreende um peptídeo transportador, e um compo- nente (II), selecionado de um peptídeo que inibe a interação de N-metil-D- aspartato neuronal (NMDAR) com proteínas que interagem com NMDAR, em que o componente (II) consiste inteiramente em aminoácidos D- enantioméricos. Para o propósito da presente invenção, aminoácidos D- enantioméricos são indicados por letras minúsculas em uma seqüência con- forme indicada aqui, enquanto que aminoácidos L-enantioméricos são indi- cados por letras maiúsculas.

O peptídeo de fusão inventivo conforme definido acima compre- ende como componente (I) um peptídeo transportador. Tal peptídeo trans- portador pode ser selecionado de qualquer peptídeo transportador que dire- ciona o peptídeo de fusão inventivo para dentro do citoplasma da célula, ou ainda adicionalmente, para um destino intracelular específico. O peptídeo transportador usado como componente (I) pode por exemplo, direcionar o peptídeo de fusão inventivo para uma localização desejada dentro da célula por exemplo, o núcleo, o ribossomo, o retículo endoplasmático, lisossomo, ou peroxissomo. Consequentemente, em uma modalidade preferida o peptí- deo transportador do peptídeo de fusão inventivo direciona a molécula con- jugada para uma localidade celular definida. Em qualquer caso, o peptídeo transportador usado como componente (I) do peptídeo de fusão inventivo direciona preferivelmente o peptídeo de fusão inventivo através da membra- na plasmática para dentro do citoplasma, aumentando assim a captação ce- lular do peptídeo de fusão inventivo em particular pelo aumento da sua per- meabilidade celular ou pelo aumento do seu tempo de retenção intracelular.

Mais preferivelmente, o componente (I) do peptídeo de fusão conforme definido acima pode ser selecionado de peptídeos que penetram a membrana celular que compreendem, sem estar limitados a estes, (a) domí- nios de transdução de proteína (PTD) e CPPs derivados de proteína, tais como seqüências derivadas de Antennapedia, por exemplo, pAntp (43 a 58), que compreende as seqüências RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1) ou RQIKIWFQNRRMKWKK-amida (SEQ ID NO: 2); ou seqüências derivadas do vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), por exemplo, Tat, mais pre- ferivelmente a região 37 a 72, região 37 a 60, região 48 a 60 ou região 49 a 57 de TAT, por exemplo, que compreende as seqüências GRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 3), YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 4), CGRKKRRQRRRPPQC (SEQ ID NO: 5) ou CGRKKRRQRRRPPQCC (SEQ ID NO: 6); hCT (9 a 32), que compreende a seqüência LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2 (SEQ ID NO: 7); pVEC, que compreende a seqüência LLIILRRRIRKQAHAHSK- NH2 (SEQ ID NO: 8); pISL, que compreende a seqüência RVIRVWFQN- KRCKDKK-NH2 (SEQ ID NO: 9); PRP de camundongo (1 a 28), que com- preende a seqüência MANGLYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP-NH2 (SEQ ID NO: 10) ou seus homólogos humanos; Ems (194 a 220), que compreende a seqüência RQGAARVTSWLGLQLRIAGKRLEGRSK-NH2 (SEQ ID NO: 11); Restricocina L3 (60 a 73), que compreende a seqüência KLIKG RTPIKFG K- NH2 (SEQ ID NO: 12); etc., (b) peptídeos-modelo tais como VT5 que com- preende a seqüência DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD-NH2 (SEQ ID NO: 13), MAP que compreende a seqüência KLALKLALKALKAALKLA-NH2 (SEQ ID NO: 14), fitas de arginina que incluem RRRRRRR, isto é (Arg)7 (SEQ ID NO: 15), ou RRRRRRR-NH2, isto é, (Arg)7-NH2 (SEQ ID NO: 16), ou RRRRRRR-C, isto é, (Arg)7-C (SEQ ID NO: 17), ou RRRRRRRR, isto é, (Arg)8 (SEQ ID NO: 18), ou RRRRRRRR-NH2, isto é, (Arg)8-NH2 (SEQ ID NO: 19), RRRRRRRRR, isto é, (Arg)9 (SEQ ID NO: 20), ou RRRRRRRRR- NH2, isto é, (Arg)9-NH2, (SEQ ID NO: 21), etc., ou (c) CPPs projetadas tais como MPG que compreende a seqüência GALFLG FLGAAGSTM- GAWSQPKSKRKV (SEQ ID NO: 22) ou GALFLGFLGAAGSTM- GAWSQPKSKRKV-cisteamida (SEQ ID NO: 23), Transportan que tem a se- qüência GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 (SEQ ID NO: 24), Transportan 10 que compreende a seqüência AGYLLGKINLKALAALAKKIL- NH2 (SEQ ID NO: 25), Pep-1 que compreende a seqüência KETWWETWW- TEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 26) ou KETWWETWWTEWSQPKKKRKV- cisteamida (SEQ ID NO: 27), etc., ou pode ser selecionado a partir do peptí- deo KALA que compreende a seqüência WEAKLAKALAKALAKHLAKALA- KALKACEA (SEQ ID NO: 28), de Bulforin 2 que compreende a seqüência TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO: 29), etc. Peptídeos usados como componente (I) do peptídeo de fusão inventivo podem ainda ser sele- cionados a partir de uma seqüência de peptídeo que tem uma identidade de seqüência de cerca de 60, 70, 80, 90, 95 ou até 99 % com uma seqüência de peptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 29 conforme definidas acima, contanto que o componente (I) ainda retenha atividade bio- lógica, isto é, direcione o peptídeo de fusão inventivo através da membrana plasmática. A seleção de um peptídeo de penetração conforme definido aci- ma como componente (I) do peptídeo de fusão inventivo será tipicamente efetuada com base nas necessidades específicas do sistema celular ao qual o peptídeo de fusão inventivo for administrado, por exemplo, eficiência de transporte no sistema celular específico, membranas, etc. A atividade bioló- gica de um peptídeo transportador conforme mostrado acima ou conforme conhecido na técnica pode ser facilmente determinada por um versado na técnica pelo uso de ensaios-padrão. Por exemplo, um peptídeo transporta- dor pode ser fundido a uma proteína tal como GFP, ou pode ser facilmente determinado por um versado na técnica pelo menos de ensaios-padrão. Por exemplo, um peptídeo transportador pode ser fundido a uma proteína tal como GFP, ou pode ser marcado com um marcador radioativo, enzima ou fluoroforo, etc. que pode ser facilmente detectado em uma célula. Então, o peptídeo transportador fundido é transfectado para dentro de uma célula ou adicionado a um sobrenadante de cultura e a permeação das membranas celulares pode ser monitorada pelo uso de métodos padrão biofísicos.

O componente (I) do peptídeo de fusão acima pode ser compos- to de aminoácidos de ocorrência natural, isto é, L-aminoácidos, ou de D- aminoácidos, isto é, de uma seqüência de aminoácido que compreende D- aminoácidos em ordem retroinversa quando comparada com a seqüência nativa. O termo "retroinverso" refere-se a um isômero de um peptídeo linear no qual a direção da seqüência é reversa e a quiralidade de cada resíduo de aminoácido é invertida. Desta forma, qualquer seqüência aqui contida, es- tando presente na forma L, também é inerentemente descrita aqui como uma seqüência de peptídeo D-enantiomérica. Seqüências de peptídeo D- enantioméricas (retroinversas) de acordo com a invenção podem ser cons- truídas, por exemplo, por sintetizar um reverso da seqüência de aminoácido para a seqüência de N-aminoácido nativa correspondente. Em peptídeos D- enantioméricos retroinversos, por exemplo, um componente do peptídeo de fusão inventivo, as posições dos grupos carbonila e amino em cada ligação de amida única são trocadas, enquanto que a posição dos grupos de cadeia lateral em cada carbono alfa é preservada. Peptídeos retroinversos, se usa- dos como um componente do peptídeo de fusão inventivo, possuem uma variedade de propriedades úteis. Por exemplo, eles entram nas células mais eficazmente, são mais estáveis (especialmente in vivo) e mostram menor imunogenicidade do que L-peptídeos correspondentes. Em contraste, prote- ínas de ocorrência natural contém tipicamente L-aminoácidos. Portanto, quase todas as enzimas de decomposição, como proteases ou peptidases, clivam ligações peptídicas entre L-aminoácidos adjacentes. Consequente- mente, peptídeos de fusão inventivos compostos de aminoácidos D- enantioméricos em ordem retroinversa, particularmente para o componente (II) e, opcionalmente, o componente (I) são amplamente resistente à quebra proteolítica.

A preparação de um componente do peptídeo de fusão inventivo conforme definido acima tendo aminoácidos D-enantioméricos pode ser rea- lizada por sintetizar quimicamente uma seqüência de aminoácido reversa da seqüência de aminoácido de forma L de ocorrência natural correspondente ou por qualquer outro método adequado conhecido do versado na técnica. Esta síntese é preferivelmente efetuada por síntese em fase sólida ligando D-aminoácidos à seqüência retroinversa desejada. Sem considerar os D- aminoácidos usados e a síntese dos aminoácidos em ordem retroinversa, a síntese em fase sólida das seqüências de D-aminoácido inventivas é quimi- camente idêntica à síntese de peptídeos com base nos L-aminoácidos. Um método geral para a construção de qualquer seqüência de DNA desejada é fornecido, por exemplo, em Brown J. et al. (1979), Methods in Enzymology, 68:109; Sambrook J, Maniatis T (1989), supra.

Alternativamente, a forma D-enantiomérica retroinversa de um peptídeo de fusão inventivo ou de um componente do mesmo pode ser pre- parada usando síntese química conforme descrito acima utilizando uma for- ma L de um peptídeo de fusão inventivo ou de um componente seu como uma matriz para a síntese química da forma D-enantiomérica retroinversa.

O componente (I) do peptídeo de fusão inventivo conforme defi- nido acima é selecionado de qualquer peptídeo capaz de inibir a interação do receptor de N-metil-D-aspartato neuronal (NMDAR) com proteínas que interagem com NMDAR (tal como uma proteína associada, por exemplo, PSD-95, proteínas neuronais, etc.). Tais peptídeos tipicamente aprisionam a(s) proteína(s) que interage(m) com NMDAR e assim inibe(m) a interação do receptor de NMDA com estas proteínas ou vice-versa. Além disso, estes peptídeos não bloqueiam o receptor de NMDA e, portanto, evitam as des- vantagens associadas com o bloqueio do receptor de NMDA. Mais particu- larmente, o componente (II) do peptídeo de fusão inventivo conforme defini- do acima pode ser selecionado de qualquer peptídeo projetado para afetar as interações entre NMDAR e sua proteína associada (por exemplo, intera- ções de PSD-95-NR2), tanto por mimetizar o domínio de interação do NM- DAR (por exemplo, o domínio de interação C-terminal PDZ de NR2) ou por mimetizar o domínio de interação da proteína associada (por exemplo, o domínio PDZ1 de PSD-95). Peptídeos adequados como componente (II) do peptídeo de fusão inventivo podem ser selecionados (sem ser limitados a isso) a partir das subunidades do receptor de NMDA NR1 e NR2. As subuni- dades NR1 e NR2 do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) são codifica- das por genes distintos. No cérebro de ratos, quatro variantes C-terminais da subunidade NR1 (NR1-1 a NR1-4) são codificadas por um único gene, e são geradas por splicing alternativo dos cassetes dos éxons C1 e C2, enquanto que quatro genes diferentes codificam as subunidades NR2 (NR2 A a D). Receptores de NMDA funcionais resultam do agrupamento heteromultiméri- co de variantes de NR1 com subunidades de NR2 distintas. A subunidade NR2B interage com a proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95), SAP97, etc., e membros da família de proteínas da quinase do tipo guanilato associada à membrana (MAGUK). Esta interação ocorre através da ligação do motivo intracelular tSXnV C-terminal da subunidade NR2B aos domínios PDZ N-terminais (PSD-95, discs-large, ZO-1) das proteínas PSD-95 e SAP97. Ambas NR1-3 e NR1-4 também apresentam um motivo tSXnV con- senso C-terminal. Desta forma, os peptídeos usados como componente (II) do peptídeo de fusão inventivo podem ser selecionados de peptídeos con- tendo um motivo tSXnV, em que S é serina, Xn é qualquer aminoácido (com η sendo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, etc.), e V é valina. Particularmente preferi- dos, os peptídeos usados como componente (II) do peptídeo de fusão inven- tivo podem ser selecionados de peptídeos, derivados de NMDAR, capazes de se ligar a proteínas de densidade pós-sináptica 95, a PSD-95, a PSD-93, ou a SAP102, mais preferivelmente de peptídeos que se ligam ao domínio de ligação a PDZ tal como o polipeptídeo que contém o domínio PDZ2, pre- ferivelmente correspondendo aos resíduos 65 a 248 de PSD-95, codificando o primeiro e segundo domínios PDZ (PDZ1-2) de PSD-95. Tipicamente, tais peptídeos usados como componente (II) do peptídeo de fusão inventivo compreendem um comprimento de 5 a 40 aminoácidos, preferivelmente um comprimento de 5 a 30 ou 5 a 20 aminoácidos e mais preferivelmente um comprimento de 5 a 15 ou ainda 5 a 10 aminoácidos. Ainda mais preferivel- mente, os peptídeos adequados como componente (II) do peptídeo de fusão inventivo podem ser selecionados de uma seqüência que compreende a se- qüência de aminoácido D-enantiomérica vdseisslk (SEQ ID NO: 31) ou uma seqüência que mostra identidade de seqüência de cerca de 60, 70, 80, 90, 95, ou o mais preferivelmente 99 % com uma seqüência de acordo com SEQ ID NO: 31 (ou qualquer uma das seqüências mencionadas acima). O termo "identidade de seqüência" conforme definido aqui signi-

fica que as seqüências são comparadas como segue. Para determinar o percentual de identidade de duas seqüências de aminoácido, as seqüências podem ser alinhadas para propósitos de comparação ótima (por exemplo, podem ser introduzidas lacunas na seqüência de uma primeira seqüência de aminoácido). Os aminoácidos em posições de aminoácido correspondentes podem ser então comparados. Quando uma posição na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo aminoácido que a posição correspondente na se- gunda seqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição. O per- centual de identidade entre duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhado pelas seqüências. Por exemplo, quando um peptídeo particular é dito ter um percentual de identidade específico a um polipeptídeo de referência de um comprimento definido, o percentual de identidade é em relação ao peptídeo de referência. Desta forma, um peptí- deo que é 50% idêntico a um polipeptídeo de referência que tem 100 amino- ácidos de comprimento pode ser um polipeptídeo de 50 aminoácidos que é completamente idêntico a uma porção de 50 aminoácidos de comprimento do polipeptídeo de referência. Ele também pode ser um polipeptídeo de 100 aminoácidos de comprimento, que é 50% idêntico ao polipeptídeo de refe- rência ao longo de todo o seu comprimento. Portanto, o peptídeo particular dito ter um percentual de identidade será selecionado, por exemplo, sem ser limitado a isto, a partir de um peptídeo concreto, por exemplo, de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 29 para o componente (I) e de um peptídeo concreto por exemplo, de acordo com SEQ ID NO: 31 para o com- ponente (II) ou de peptídeos por exemplo, de acordo com SEQ ID NOs: 33 e 35, para o todo o peptídeo de fusão. Logicamente, outros polipeptídeos irão satisfazer o mesmo critério. Tal determinação de percentual de identidade de seqüência de duas seqüências pode ser realizada usando um algoritmo ma- temático. Um exemplo não Iimitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Tal algoritmo está incorporado no programa NBLAST, o qual pode ser usado para identificar seqüências que têm a identidade desejada à seqüência de aminoácido da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997), Nucleic Aeids Res, 25:3389-3402. Quando se utiliza os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros predeterminados dos respectivos programas (por exemplo, NBLAST) podem ser usados. As seqüências também podem ser alinhadas usando a Versão 9 do Genetic Computing Group1S GAP (programa de alinhamento global), usando a matriz-padrão (BLOSUM62) (valores -4 e +11) com uma penalidade para início de lacuna de -12 (para o primeiro es- paço de uma lacuna) e uma penalidade por extensão de lacuna de -4 (por espaço consecutivo adicional na lacuna). Após o alinhamento, o percentual de identidade é calculado por expressar o número de pareamentos como uma porcentagem do número de aminoácidos na seqüência reivindicada. Os métodos descritos de determinação do percentual de identidade de duas seqüências de aminoácido podem ser aplicados correspondentemente a se- quências de ácido nucléico.

O componente (II) do peptídeo de fusão inventivo conforme defi- nido acima é composto inteiramente de aminoácidos D-enantioméricos, isto é, de uma seqüência de aminoácido que compreende D-aminoácidos na or- dem retroinversa conforme definida acima, e pode ser preparada conforme descrito acima. Peptídeos retroinversos conforme usados para o componen- te (II) dos peptídeos de fusão inventivos possuem uma variedade de propri- edades úteis conforme já descritas para o componente (I) acima, por exem- plo, biodisponibilidade do componente que forma uma seção do peptídeo de fusão inventivo devido à falta de degradação proteolítica deste componente, etc.

Ambos os componentes (I) e (II) do peptídeo de fusão inventivo podem ser ligados diretamente ou através de um ligante. Um "ligante" no presente contexto é preferívelmente um oligo- ou polipeptídeo e pode ser usado para ligar os componentes (I) e (II) conforme definidos acima. Preferí- velmente, um ligante tem um comprimento de 1 a 10 aminoácidos, mais pre- ferívelmente um comprimento de 1 a 5 aminoácidos e o mais preferívelmente um comprimento de 1 a 3 aminoácidos. Vantajosamente, o ligante não tem nenhuma propriedade formadora de estrutura secundária, isto é, não tem tendência de formação de estrutura de α-hélice ou β- folha, por exemplo, se o ligante for composto de pelo menos 35% de resíduos de glicina. Um ligan- te pode ser tipicamente uma seqüência totalmente composta de glicina, por exemplo, GG, GGG, GGGG, GGGGG, etc. O uso de uma seqüência de oli- go- ou polipeptídeo clivável (intracelularmente/endogenamente) como um ligante permite que o componente (II) se separe do componente (I) após li- beração na célula-alvo. Seqüências de oligo- ou polipeptídeo cliváveis neste contexto também incluem seqüências de oligo- ou polipeptídeo cliváveis por protease, em que o sítio de clivagem por protease é selecionado tipicamente de forma dependente da protease endogenamente expressa pela célula tra- tada. O ligante conforme definido acima, se presente como uma seqüência de oligo- ou polipeptídeo, pode ser composto de D-aminoácidos ou de ami- noácidos de ocorrência natural, isto é, L-aminoácidos. Como uma alternativa ao exposto acima, o acoplamento dos componentes (I) e (II) do peptídeo de fusão inventivo pode ser realizado através de um agente de acoplamento ou de conjugação por exemplo, um reagente de reticulação. Há vários reagen- tes de reticulação intermolecular que podem ser utilizados, vide, por exem- plo, Means e Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp. 39-43. Dentre estes reagentes, estão por exemplo, 3-(2- piridi1ditio)propionato de N-succinimidila (SPDP) ou N,N'-(1,3- fenileno)bismaleimida; N,N'-etileno-bis-(iodoacetamida) ou outro reagente semelhante tendo 6 a 11 ligações de carbono metileno; e 1,5-diflúor-2,4- dinitrobenzeno. Outros reagentes de reticulação úteis para esta finalidade incluem: p,p'-diflúor-m,m'-dinitrodifenilsulfona; adipimidato de dimetila; fenol- 1,4-dissulfonilcloreto; hexametilenodiisocianato ou diisotiocianato, ou azofe- nil-p-diisocianato; glutaraldeído e disdiazobenzidina. Reagentes de reticula- ção podem ser homobifuncionais, isto é, ter dois grupos funcionais que so- frem a mesma reação. Um reagente de reticulação homobifuncional preferi- do é bismaleimidohexano (BMH). BMH contém dois grupos funcionais de maleimida, os quais reagem especificamente com compostos contendo sul- fidrila sob condições brandas (pH 6,5 a 7,7). Os dois grupos de maleimida são conectados por uma cadeia de hidrocarboneto. Portanto, BMH é útil pa- ra reticulação irreversível de proteínas (ou polipeptídeos) que contêm resí- duos de cisteína. Reagentes reticuladores também podem ser heterobifun- cionais. Reagentes reticuladores heterobifuncionais têm dois grupos funcio- nais diferentes, por exemplo, um grupo amina reativo e um grupo tiol reativo, que irão reticular duas proteínas que tenham aminas e tióis livres, respecti- vamente. Exemplos de reagentes reticuladores heterobifuncionais são ciclo- hexano-1-carboxilato de succinimidil 4-(N-maleimidometila) (SMCC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS), e 4-(p- maleimidofenil)butirato de succinimida (SMPB), um análogo de cadeia es- tendida de MBS. O grupo succinimidila destes reagentes reticuladores com uma amina primária, e a maleimida tiol-reativa forma uma ligação covalente com o tiol de um resíduo de cisteína. Pelo fato de reagentes reticuladores freqüentemente terem baixa solubilidade em água, uma porção hidrofílica, tal como um grupo sulfonato, pode ser adicionada ao reagente reticulador para melhorar sua solubilidade em água. SuIfo-MBS e sulfo-SMCC são exemplos de reagentes reticuladores modificados para solubilidade em água. Muitos reagentes reticuladores produzem um conjugado que é essencialmente não- clivável sob condições celulares. Portanto, alguns reagentes reticuladores contêm uma ligação covalente, tal como dissulfeto, que é clivável sob condi- ções celulares. Por exemplo, o reagente de Traut, ditiobis (succinimidilpropi- onato) (DSP), e 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP) são reticuladores cliváveis bem-conhecidos. O uso de um reagente reticulador clivável permite que o componente (II) se separe do componente (I) após a liberação na célula-alvo, contanto que a célula seja capaz de clivar uma se- qüência particular do reagente reticulador. Com esta finalidade, ligação de dissulfeto direta também pode ser útil. Reticulação química também pode incluir o uso de braços espaçadores. Braços espaçadores fornecem flexibili- dade intramolecular ou ajustam as distâncias intramoleculares entre porções conjugadas e assim podem ajudar a preservar a atividade biológica. Um bra- ço espaçador pode estar na forma de uma porção de proteína (ou polipeptí- deo) que inclui aminoácidos espaçadores, por exemplo, prolina. Alternativa- mente, um braço espaçador pode ser parte do reagente reticulador, tal como em "SPDP de cadeia longa" (Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., N°. cat. 21651 H). Vários reagentes reticuladores, incluindo aqueles discutidos acima, são disponíveis comercialmente. Instruções detalhadas para seu uso são facil- mente disponíveis pelos fornecedores comerciais. Uma referência geral so- bre reticulação de proteína e preparação de conjugado é: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991).

O peptídeo de fusão inventivo definido acima pode conter opcio- nalmente um componente adicional (III). Tal componente (III) é preferivel- mente um "tag" para purificação do peptídeo de fusão após a síntese. Um "tag" (sinalizador) para purificação" no contexto da presente invenção pode ser de qualquer variedade de "tag" adequados para purificação de proteínas recombinantes tais como "tag" de hexahistidina (his-"tag", "tag" de polihisti- dina), um "tag" de estreptavidina (strep-"tag"), um SBP-"tag" (um "tag" de ligação de estreptavidina) um "tag" de GST (glutationa-S-transferase), um "tag" de dansil, etc. ou por meio de um epítopo de anticorpo (um "tag" de anticorpo), por exemplo, um "tag" de myc, um epítopo de Swal 1, um "tag" de FLAG1 etc. "Tags" conforme mencionados acima estão localizados prefe- rivelmente na terminação-C do peptídeo de fusão (completo) conforme defi- nido acima composto dos componentes (I), (II), e opcionalmente o compo- nente (III). Por exemplo, "tags" conforme mencionados acima estão Iocaliza- dos preferivelmente na terminação-C do componente (I), se o componente

(I) estiver localizado na extremidade C-terminal do peptídeo de fusão, ou mais preferivelmente, na terminação-C do componente (II), se o componente

(II) estiver localizado na extremidade C-terminal do peptídeo de fusão. Além disso, um componente (III) conforme mencionado acima é selecionado pre-

ferivelmente tal que não interfira com a funcionalidade biológica nem do componente (I) nem do componente (II), por exemplo, a capacidade do componente (I) do peptídeo de fusão inventivo penetrar a membrana celular, e a capacidade do componente (I) do peptídeo de fusão inventivo de pene- trar a membrana celular, e a capacidade do componente (II) em inibir a inte- ração das proteínas de interação NMDAR e NMDAR. Desta forma, "tags" não-volumosos são preferivelmente selecionados como componente (III), tal como um "tag" de hexahistidina "tag" de estreptaridina (strep-tag), um "tag" de SBP (um "tag" de ligação de estreptavidina) ou um epítopo de anticorpo, por exemplo, um "tag" de myc, um epítopo de Swa11, um "tag" de FLAG, etc.

Além disso, o componente (III) conforme definido acima, se pre- sente como um oligo- ou polipeptídeo, pode ser composto de D-aminoácidos conforme definidos acima ou de aminoácidos de ocorrência natural, isto é, L- aminoácidos. Consequentemente, o peptídeo de fusão completo, compreen- dendo os componentes (I), (II) e, opcionalmente o componente (III), assim como ligante(s) conforme definido(s) acima, pode ser composto de D- aminoácidos conforme definidos acima. Se o peptídeo de fusão inventivo inteiro, compreendendo os componentes (I), (II) e opcionalmente o compo- nente (III), assim como o Iigante conforme definido acima, é composto de D- aminoácidos, o peptídeo de fusão como um todo pode ser preparado con- forme descrito acima para componentes D-enantioméricos do peptídeo de fusão inventivo, por exemplo, usando métodos de síntese química ou qual- quer outro método adequado.

Geralmente, os componentes (I), (II), e opcionalmente (III) do peptídeo de fusão inventivo conforme definidos acima podem estar dispostos adequadamente, isto é, em qualquer ordem que permita ao componente (I) direcionar o peptídeo de fusão inventivo através da membrana plasmática, quando dispostos no peptídeo de fusão inventivo. Além disso, o componente (II) ainda deve ser capaz de inibir a interação de receptores de N-metil-D- aspartato e proteínas que interagem com NMDAR. De acordo com uma mo- dalidade preferida, o componente (I) pode estar localizado na extremidade N-terminal do peptídeo de fusão inventivo e o componente (III) pode estar localizado na extremidade C-terminal do peptídeo de fusão inventivo. Além disso, se um componente (III) conforme definido acima estiver contido no peptídeo de fusão inventivo, o componente (II) pode estar localizado na ex- tremidade mais C-terminal do peptídeo de fusão completo. Uma disposição preferida do peptídeo de fusão inventivo desta forma pode apresentar da terminação N para C, o componente (I), componente (II) e opcionalmente, o componente (III). Entretanto, outras disposições também podem ser escolhi- das, por exemplo, da terminação N para C, componente (II), componente (I), e opcionalmente, componente (III). Se adequado, Iigantes podem ser inseri- dos entre os componentes (I) e (II) conforme definido acima.

O peptídeo de fusão inventivo também pode conter um "deriva- do" de um componente (I) e/ou um componente (II) conforme definido acima. Um derivado de um componente (I) e/ou (II) de acordo com a invenção é pretendido significar uma seqüência de um componente (I) ou (II), que é de- rivado da seqüência de ocorrência natural (L-aminoácido) de um componen- te (I) ou (II) conforme definido acima por meio de substituição(ões) de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais da seqüência de aminoácido, por meio de deleção(ões) de um ou mais aminoácidos em qualquer local da se- qüência de ocorrência natural, e/ou por meio de inserção(ões) de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais da seqüência de peptídeo de ocor- rência natural. "Derivados" devem reter sua atividade biológica se usados como componente (I) ou (II) do peptídeo de fusão inventivo, por exemplo, um derivado do componente (I) deve ser capaz de direcionar o peptídeo de fu- são inventivo para dentro do citoplasma celular ou, ainda adicionalmente, para um destino celular específico, conforme definido acima, enquanto que um derivado do componente (I) deve ser capaz de inibir a interação de re- ceptores de N-metil-D-aspartato neuronal (NMDARs) e proteínas de intera- ção com NMDAR. Derivados no contexto da presente invenção também po- dem ocorrer na forma de suas seqüências de L ou D-aminoácido conforme definidas acima, ou ambas.

Se substituição(ões) de aminoácido(s) são efetuada(s) para a preparação de um derivado de componente (I) e/ou componente (II) do pep- tídeo de fusão inventivo, substituições conservativas (de aminoácido) são preferidas. Substituições conservativas (de aminoácido) incluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina e valina; valina, isoleucina e leucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina e glutamina; serina e treonina; Iisina e arginina; e fenilalanina e tirosina. Desta forma, grupos de substituição conservativa preferidos são aspartato-glutamato; asparagina- glutamina; valina-leucina-isoleucina; alanina-valina; fenilalanina-tirosina e lisina-arginina. Portais mutações, por exemplo, a estabilidade e/ou a eficácia dos componentes (I) e (II) do peptídeo de fusão inventivo pode ser aumenta- da. Se forem introduzidas mutações nos componentes (I) e (II) do peptídeo de fusão inventivo, estes componentes (I) e (II) permanecem homólogos (funcionalmente), por exemplo, na seqüência, na função e no caráter antigê- nico ou outra função, com uma proteína que tem a seqüência parental cor- respondente. Tais componentes mutados (I) e (II) do peptídeo de fusão in- ventivo podem possuir propriedades alteradas que podem ser vantajosas sobre as seqüências alteradas dos componentes (I) e (II) para certas aplica- ções (por exemplo, pH ótimo aumentado, estabilidade em temperatura au- mentada, etc.)

Um derivado do componente (I) ou um derivado do componente (II), respectivamente, do peptídeo de fusão inventivo é definido como tendo identidade substancial com as seqüências não-modificadas do componente (I) ou componente (II), respectivamente do peptídeo de fusão inventivo con- forme definidos acima, por exemplo, com a seqüência de translocação da proteína TAT de HIV se usada como componente (I). Particularmente prefe- ridas são seqüências de aminoácido que têm pelo menos 30% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 50% de identidade de seqüencia, ainda mais preferivelmente pelo menos 60% de identidade de seqüência, ainda mais preferivelmente pelo menos 75% de identidade de seqüência, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente 90% de identidade de seqüência e o mais preferivelmente pelo menos 95% de ou ainda 99% de identidade de seqüência com o análogo de ocorrência natural. Métodos apropriados para a síntese ou isolamento de um derivado funcional de componentes (I) e (II) do peptídeo de fusão inventivo assim co- mo para determinação de percentual de identidade de duas seqüências de aminoácido são descritos acima. Adicionalmente, métodos para a produção de derivados dos componentes (I) e (II) do peptídeo de fusão inventivo con- forme descritos acima são bem-conhecidos e podem ser efetuados seguindo métodos padrões que são bem-conhecidos por um versado na técnica (vide por exemplo, Sambrook J, Maniatis T (1989) supra).

Como uma modalidade adicional, a invenção fornece composi- ções farmacêuticas que compreendem o peptídeo de fusão inventivo con- forme definido acima. Preferivelmente tais composições farmacêuticas com- preendem o peptídeo de fusão inventivo com os componentes (I) e (II) e, opcionalmente o componente (III), bem como um Iigante opcional, conforme definido acima. Adicionalmente, tal composição farmacêutica pode compre- ender um transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. Um "transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável" de acordo com a invenção refere-se a um transportador, adjuvante ou veículo não-tóxico que não destrói a atividade farmacológica do peptídeo de fusão inventivo com o qual ele é formulado. Transportadores, adjuvantes ou veícu- los farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados em composições farmacêuticas desta invenção incluem, mas não são limitados a, trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tal como albumina sérica bovina, substâncias tamponantes tais como fosfatos, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeos parciais de ácidos gra- xos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tal como sulfato de prota- mina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trisilicato de magnésio, polivinil pirrolido- na, substâncias a base de celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e gordura de foca.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas oralmente, parenteralmente, por pulverização por inalação, topicamente, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou através de um reservatório implantado.

O termo parenteral conforme usado aqui inclui técnicas de inje- ção ou infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intras- sinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana. Preferivelmente, as composições farmacêuticas são administradas oralmen- te, intraperitonealmente ou intravenosamente. Formas injetáveis estéreis das composições farmacêuticas desta invenção podem ser suspensão aquosa ou oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com téc- nicas conhecidas na técnica usando agentes dispersantes ou umectantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou sol- vente não-tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos fixos, estéreis são convencionalmente empre- gados como um solvente ou meio de suspensão.

Para esta finalidade, qualquer óleo fixo brando pode ser empre- gado incluindo mono- e diglicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, tal como o ácido oléico e seus derivados de glicerídeo são úteis na preparação de inje- táveis, já que são óleos farmaceuticamente aceitáveis naturais, tais como óleo de oliva, óleo de rícino, especialmente nas suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões de óleo também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como carboximetil celulose, ou agentes dispersantes similares que são comumente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos comumente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsificantes comumente usados na fabricação de formas de dosagem sólidas, líquidas, ou outras formas de dosagem também podem ser usados para os propósitos de formulação.

As composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser admi- nistradas oralmente em qualquer forma de dosagem aceitável incluindo, mas não limitada a, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de comprimidos para uso oral, veículos comumente usados incluem lactose, e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para administração oral numa forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose, e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são necessárias para uso oral, o ingre- diente ativo é combinado com agentes emulsificantes ou de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, flavorizantes ou corantes também po- dem ser adicionados.

Alternativamente, a composição farmacêutica inventiva conforme definida aqui pode ser administrada na forma de supositórios para adminis- tração retal. Tal supositório pode ser preparado por misturar o agente com um excipiente não-irritante adequado, que é sólido em temperatura ambiente mas líquido na temperatura retal e, portanto, derreterá no reto para liberar o fármaco. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelhas e polie- tileno glicóis.

A composição farmacêutica inventiva conforme definida aqui também pode ser administrada topicamente, especialmente quando o alvo de tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis por aplicação tópica, incluído doenças do olho, da pele, ou do trato gastrintestinal inferior. Formulações tópicas adequadas são facilmente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos.

A aplicação tópica para o trato gastrintestinal inferior pode ser efetuada em uma formulação de supositório retal (vide acima) ou em uma formulação de enema adequada. Emplastros transdérmicos tópicos também podem ser usados.

Para aplicações tópicas, a composição farmacêutica inventiva conforme definida aqui pode ser formulada em um unguento adequado con- tendo o peptídeo de fusão inventivo conforme identificado acima suspenso ou dissolvido em um ou mais veículos. Veículos para administração tópica do peptídeo de fusão inventivo incluem, mas não são limitados a, óleo mine- ral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, polioxietileno, com- posto de polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, a composição farmacêutica inventiva conforme definida aqui pode ser suspen- sa ou dissolvida em um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Veí- culos adequados incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, monoeste- arato de sorbitano, polissorabto 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearíli- co, 2-octildodecanol, álcool benzílico, e água.

Para uso oftálmico, a composição farmacêutica inventiva pode ser formulada como suspensões micronizadas em salina isotônica estéril com pH ajustado, ou preferivelmente, como uma solução em salina estéril isotônica com pH ajustado, com ou sem um conservante tal como cloreto de banzalcônio. Alternativamente, para usos oftálmicos, a composição farma- ceuticamente aceitável pode ser formulada em um unguento tal como petro- lato.

A composição farmacêutica inventiva conforme definida aqui também pode ser administrada por aerossol ou inalação nasal. Tal composi- ção pode ser preparada de acordo com técnicas bem-conhecidas na técnica de formulação farmacêutica e pode ser preparada como soluções em salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonos, e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes convencionais.

Mais preferivelmente, a composição farmaceuticamente aceitá- vel é formulada para administração oral ou parenteral, por exemplo, por inje- ção. Para propósitos de tratamento, uma quantidade eficaz redutora de dano, não-tóxica do peptídeo de fusão inventivo pode ser usada para a preparação de uma composição farmacêutica inventiva conforme definida acima. Portanto, uma quantidade do peptídeo de fusão inventivo pode ser combinada com o(s) material(is) transportador(es) para produzir uma com- posição conforme definida acima. A composição farmacêutica inventiva é tipicamente preparada em uma forma de dosagem única (ou múltipla), que variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de adminis- tração. Geralmente, a composição farmacêutica inventiva é formulada para que a faixa de dosagem por dose de entre 0,001 a 100 mg/kg de peso cor- poral/dia do peptídeo de fusão possa ser administrada a um paciente rece- bendo a composição farmacêutica inventiva. Faixas de dosagem preferidas por dose variam de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal/dia, faixas de dosa- gem por dose adicionais também preferidas variam de 0,1 a 25 mg/kg de peso corporal/dia. Entretanto, faixas de dosagem e regimes de tratamento conforme mencionados acima podem ser adaptados de forma adequada para qualquer paciente particular dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do peptídeo de fusão específico empregado, da idade, do peso corporal, da saúde geral, do sexo, dieta, momento de administra- ção, taxa de excreção, combinação de fármacos, do julgamento do médico, e da severidade da doença particular sendo tratada. Neste contexto, a admi- nistração pode ser efetuada com uma faixa de dose inicial, que pode ser al- terada ao longo do tempo de tratamento, por exemplo, por aumentar ou di- minuir a faixa de dose inicial dentro da faixa descrita acima. Alternativamen- te, a administração pode ser efetuada de forma contínua ao longo de todo o tempo de tratamento. Ambas as formas de administração podem ainda ser combinadas, por exemplo, se a faixa de dosagem tiver que ser adaptada (aumentada ou diminuída) entre várias sessões do tratamento mas mantida constante dentro da única sessão para que as faixas de dosagem das várias sessões sejam diferentes umas das outras.

A composição farmacêutica inventiva pode ser empregada para o tratamento, melhora ou prevenção de doenças relacionadas ao efeito pre- judicial de uma injúria a células de mamífero conforme descrita aqui, particu- lar para o tratamento de apoplexia ou injúrias da medula espinhal, injúrias isquêmicas ou traumáticas ao cérebro ou medula espinhal e lesões a neurô- nios do sistema nervoso central (CNS) incluindo, sem estar limitadas a, injú- rias agudas do CNS, apoplexia isquêmica ou injúrias à medula espinhal, bem como anoxia, isquemia, injúria mecânica, dor neuropática, particular- mente doe neuropática relacionada a PSD-95 e/ou interação com NMDAR, etc. Além disso, a composição farmacêutica inventiva pode ser empregada para fornecer efeito neuroprotetor contra ou tratamento de injúria excitotóxi- ca e isquêmica, excitotoxicidade, falta de suporte neurotrópico, desconexão, dano a neurônios incluindo, por exemplo, epilepsia, condições neurodegene- rativas crônicas, etc. Neste contexto, a excitotoxicidade pode estar particu- larmente envolvida em injúria cerebral traumática de apoplexia e doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (CNS) tais como esclerose múltipla, doença de Alzheimer, esclerose amiotrófica lateral (ALS), fibromial- gia, doença de Parkinson, e doença de Huntington, as quais podem ser tra- tadas aqui. Outras condições comuns que causam concentrações excessi- vas de glutamato em volta dos neurônios e que podem ser tratadas aqui são hipoglicemia e estado epilético, glaucoma/deterioração de células gangliona- res da retina etc.

O tratamento, melhora ou prevenção de doenças relacionadas ao efeito prejudicial de uma injúria a células de mamífero, conforme definido acima, bem como a doenças ou distúrbios adicionais conforme mencionadas aqui é tipicamente efetuada por administrar uma composição farmacêutica inventiva conforme definida acima em uma faixa de dosagem conforme defi- nida acima. A administração da composição farmacêutica inventiva pode ser efetuada antes do início da excitotoxicidade e/ou dano cerebral (isquêmico), isto é, do efeito prejudicial de uma injúria às células de mamífero, ou ao mesmo tempo ou após o mesmo. Por exemplo, a administração da composi- ção farmacêutica inventiva pode ser efetuada dentro de um tempo de (até) 1 hora (0 a 1 hora), até 2 horas, até 3 a 5 horas ou até 24 horas ou mais após uma apoplexia cerebral ou injúria da medula espinhal, injúrias isquêmicas ou traumáticas ao cérebro ou medula espinhal e, em geral lesões aos neurônios do sistema nervoso central (CNS).

A presente invenção ainda fornece kits que compreendem a composição farmacêutica inventiva (em um ou mais recipiente(s)) em pelo menos uma das formulações acima e um manual de instrução ou folheto informativo com relação a instruções e/ou informação com relação à aplica- ção da composição farmacêutica inventiva.

Embora esta revelação tenha descrito e ilustrado certas modali- dades preferidas da invenção, deve ser compreendido que a invenção não está restrita a estas modalidades particulares. Pelo contrário, a invenção inclui todas as modalidades que são equivalentes funcionais ou mecânicos das modalidades específicas e características que foram descritas e ilustra- das.

Descrição das figuras

As figuras a seguir são pretendidas para ilustrar adicionalmente a presente invenção sem limitar o escopo da invenção às mesmas.

Figura 1: mostra a duração da eficácia de peptídeos de fusão de acordo com SEQ ID NOs: 32 e 33 na presença de NMDA 20 μΜ, particular- mente peptídeos TAT-NR2B9c na forma L (seqüência de L-TAT-L-NR2B9c YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV (SEQ ID NO: 32), idêntica a US 20030050243) em relação a sua forma D (D-TAT-D-NR2B9c, seqüência vd- seisslk-rrrqrrkkrgy (SEQ ID NO: 33)). Neste experimento (assim como nos experimentos seguintes), a taxa de morte celular foi medida em paralelo à adição de peptídeos capazes de inibir a morte celular por interagir com o receptor de NMDA. Conforme pode ser visto na figura 1, em um experimento isolado, D-TAT-D-NR2B9c de acordo com SEQ ID NO: 33 mostra eficácia pelo menos igual, mas predominantemente significativamente aumentada em relação ao composto comparativo L-TAT-L-NR2B9c de acordo com SEQ ID NO: 32, isto é, taxas (%) de morte celular significativamente reduzidas de células neuronais; * na figura 1 indica P<0,05, @ P<0,07 (teste-t pareado, comparando neurônios tratados com peptídeo com neurônios de controle). Em particular, D-TAT-D-NR2B9c revela seu efeito positivo, se o intervalo entre a incubação do peptídeo e a adição de NMDA for > 8 h. isto revela a atividade farmacológica prolongada da forma-D. A janela terapêutica mais eficaz foi observada entre 4 e 48 horas, particularmente 8 e 24 horas.

Figura 2: mostra a duração da eficácia dos peptídeos de fusão de acordo com SEQ ID NOs: 32 e 33 na presença de NMDA 40 μΜ, particu- larmente peptídeos TAT-NR2B9c na forma L (seqüência de L-TAT-L- NR2B9c YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV (SEQ ID NO: 32), idêntica a US 20030050243) em relação a sua forma D (D-TAT-D-NR2B9c, seqüência vd- seisslk-rrrqrrkkrgyin (SEQ ID NO: 33)). Conforme pode ser visto na figura 2, em qualquer experimento isolado D-TAT-D-NR2B9c de acordo com SEQ ID NO: 33 mostra eficácia pelo menos igual, mas predominantemente significa- tivamente aumentada em relação ao composto comparativo L-TAT-L- NR2B9c de acordo com SEQ ID NO: 32, isto é, taxas (%) de morte celular significativamente reduzidas de células neuronais. * na figura 2 indica P < 0,05, @ P<0,07 (teste-t pareado, comparando neurônios tratados com peptí- deo com neurônios de controle). O efeito notavelmente positivo do peptídeo de fusão inventivo se torna aparente, se o intervalo de tempo for menor do que 24 h.

Figura 3: mostra a duração da eficácia dos peptídeos de fusão de acordo com SEQ ID NOs: 34 e 35 na presença de NMDA 20 μΜ, particu- larmente peptídeos (Arg)8-NR2B9c na forma L (seqüência de L-(Arg)8-L- NR2B9c RRRRRRRR-KLSSIESDV (SEQ ID NO: 34)) em relação a sua for- ma D (D-(Arg)8-D-NR2B9c, seqüência vdseisslk-rrrrrrrr (SEQ ID NO: 35)). Conforme pode ser visto na figura 3, em qualquer experimento isolado o peptídeo de fusão inventivo D-(Arg)8-D-NR2B9c de acordo com SEQ ID NO: mostra eficácia mostra eficácia pelo menos igual, mas predominantemen- te significativamente aumentada em relação ao composto comparativo L- (Arg)8-L-NR2B9c de acordo com SEQ ID NO: 34, isto PE, taxas (%) de mor- te celular significativamente reduzidas de células neuronais; * na figura 3 indica P < 0,05, @ P<0,07 (teste-t pareado, comparando neurônios tratados com peptídeo com neurônios de controle).

Figura 4: mostra a duração da eficácia dos peptídeos de fusão de acordo com SEQ ID NOs: 34 e 35 na presenga de NMDA 40 μΜ, particu- Iarmente peptideos (Arg)rNR2B9c na forma L (sequencia de L-(Arg)8-L- NR2B9c RRRRRRRR-KLSSIESDV (SEQ ID NO: 34)) em relagao a sua for- ma D (D-(Arg)8-D-NR2B9c, sequencia vdseisslk-rrrrrrrr (SEQ ID NO: 35)).

Conforme pode ser visto na figura 4, em qualquer experimento isolado ate ο ponto de tempo de 8 h, ο peptideo de fusao inventivo D-(Arg)8-D-NR2B9c de acordo com SEQ ID NO: 35 mostra eficacias pelo menos iguais. mas pre- dominantemente significativamente aumentada em relagao ao composto comparativo L-(Arg)8-L-NR2B9c de acordo com SEQ ID NO: 34, isto e, taxas (°b) de morte celular significativamente reduzidas de celulas neuronals; * na figura 4 indica P < 0,05. @ P<0,07 (teste-t pareado, comparando neuronios tratados com peptideo com neuronios de controle). Exemplos

Os seguintes Exemplos sao pretendidos para ilustrar adiciona卜 mente a presente invengao sem Iimitar ο escopo da invengao a estes exem- plos.

Exemplo 1 Sintese dos peptideos de fusao inventivos

Peptideos TAT-NR2B9C foram sintetizados manualmente em resina MBHA (Novabiochem, Merck) por quimica de N0-Boc SPPSj de acor- do com procedimentos padronizados. Todos os acoplamentos foram monito- rados pelo teste de cor de TNBSA. Os peptideos foram clivados e simulta- neamente desprotegidos da resina pelo tratamento com HF a 90% com re- movedores apropriados 1 h a OgC. Os peptideos brutos foram retirados em uma solugao aquosa de acido acetico a 20% diluida para solugao de acido acetico a 5% com agua duplamente destilada e os removedores remanes- centes foram extraidos por uma Iavagem com eter dietilico. As solugoes con- tendo os peptideos foram entao Iiofilizadas para remover ο acido acetico. Os peptideos L7D-NR2B9C foram purificados por RP-HPLC preparativa em uma coluna Atlantis (Waters) dCi8 (tampao B 15 a 45% por 45 min a 15 ml/min) e caracterizados por ES卜MS.

Os peptideos (Arg)y-NR2B9C foram sintetizados manualmente.

A sintese foi realizada sobre suporte solido usando uma estrategia Fmoc sobre uma resina Fmoc-VaI-NovaSyn TGA da Novabiochem, com uma carga de 0,22 mmol/g. A sintese foi feita por um robo ACT, em um ροςο corres- pondente a 145 pmol, usando 4 equivalentes de aminoacidos, 4 equivalen- tes de agentes de acoplamento HOBt e 4 equivalentes de DIPCDI. Devido as exigencias da sintese, ο acoplamento duplo foi feito a cada 3 aminoaci- dos:

-ο primeiro acoplamento com 4 equivalentes de aminoacidos, 4 equivalentes de HOBt e 4 equivalentes de DIPCDI

-ο segundo acoplamento com 4 equivalentes de aminoacidos, 4 equivalentes de HATU e 4 equivalentes de DIEA.

Apos cada acoplamento, foi realizada uma etapa de revestimen- to com anidrido acetico a 10% em DMF (por 15 minutos).

As etapas de desprotegao foram realizadas com piperidina a 20% em DMF (2 χ 20 minutos). O Fmoc em posigao "n" foi mantido ate ο final da sintese. A clivagem foi realizada em uma solugao de TFA a 86% na presenga de removedores. O peptideo foi precipitado em eter. Entao, ο pep- tideo foi purificado em uma coluna C-18 de fase re versa usando gradiente de O a 60% de acetonitrila em 60 minutos, com detecgao por UV a 220 nm (para Iigagoes peptidicas) e a 300 nm (para protegao por Fmoc). Subse- quentemente, ο peptideo foi Iiofilizado com ο grupo protetor Fmoc, que foi removido subsequentemente pelo tratamento com uma solugao de 20 equi- valentes de DEA. O peptideo foi entao purificado novamente (usando as mesmas condi<?0es descritas acima) antes de serem liofilizados，analisados e usados em experimentos subseqOentes. Exemplo 2 Teste de duragao de neuroprotegao fornecida por TAT-NR2B9c diante de injiirias excitotoxicas Protoco lo:

Neuronios corticais de rato. retirados de ratos E21, foram culti- vados por 7 a 9 dias in vitro em meio Neurobasal -A + suplemento B-27 (ambos da Invitrogen), glutamina a 1 mM, + 50 unidades/ml de penicilina, 50μς/ιτιΙ de estreptomicina.

1. Em periodos variaveis antes da exposigao ao composto, os neuronios foram removidos do meio de cultura baseado em Neurobasal-A e colocados em um "meio de transfecgao" (TM; Bading et al. (1993), Science 260，181-186): 10% (Meio Minimo Essencial, Invitrogen (21090022), conten- do sal de Earles1 mas sem L-glutamina), meio SGG Sal-Glicose-Glicina (SGG) 90%: NaCI a 114 mM，NaHCO3 0,219%, KCI a 5,292 mM, MgCI2 a 1 mM, CaCI2 a 2 mM, HEPES a 10 mM, Glicina a 1 mM, Glicose a 30 mM, pi- ruvato de sodio a 0,5 mM, Vermelho de Fenol a 0,1%, suplemento de insuli- na-transferrina-selenito (Sigma, insulina 7,5 pg/ml; transferrina 7,5 pg/ml e selenito de sodio 7,5 ng/ml); osmolaridade final de 325 mosm/l). Todas as etapas subsequentes ocorreram em TM.

2. Neuronios foram expostos entao aos peptideos de fusao in- ventivos a 10 μΜ por 1 h (particularmente os peptideos TAT-NR2B9c na for- ma L (sequencia YGRKKRRQRRRKLSS旧SDV (SEQ ID NO:32) de L-TAT- L-NR2B1C, identica a de US 2003/0050243) L na forma, sequencia vdseiss- Ik-rrrrrrrr (SEQ ID NO: 35) de D (D-TAT-D-NR2B9c) e tambem na forma L (SEQ ID NO: 34)).

3. Apos 1 h, os neuronios foram Iavados uma vez em TM para remover ο peptideo.

4. Apos um periodo de tempo variavel, os neuronios foram ex- postos a NMDA a 20 ou 40 μΜ por 1 h apos ο que os neuronios foram colo- cados em TM por 24 h.

5. Os neuronios foram fixados (paraformaldeido a 3%) e corados (DAPI, 4',6-Diamino-2-fenilindol). O nijmero de nCicleos picnoticos e contado como % do total. Os experimentos foram realizados em triplicata. Resultados

Ambas as formas D e L de TAT-NR2B9c (L- TAT-NR2B9c se- quencia YGRKKRRQRRR-KLSS旧SDV (SEQ ID NO: 32)，identica a US 20030050243)，D-TAT-NR2B9C, sequencia vdseisslk-rrrqrrkkrgyin (SEQ ID NO: 33)) ofereceram protegao por ate 4 horas apos a Iavagem do peptideo com NMDA (20 e 40 μΜ). Entretanto, a protegao pela forma D estendeu-se por ate 48 h apos a Iavagem para a menor dose de NMDA (figura 1)，indi- cando que ela e uma candidata mais promissora como um farmaco terapeu-

15

20

25

30 tico. Ela tambem forneceu uma prote^ao significativa por ate 24 h frente a NMDA a 40 μΜ, enquanto que a neuroprotegao obtida com a forma L foi sig- nificativa apenas em 1 hora (figura 2).

Exemplo 3 Teste de duragao de neuroprotegao fornecida por (Arg)8- NR2B9c diante de injijrias excitotoxicas Protocolo:

Neuronios corticais de rato, retirados de ratos E21，foram culti- vados por 7 a 9 dias in vitro em meio Neurobasal -A + suplemento B-27 (ambos da Invitrogen), glutamina a 1 mM, + 50 unidades/ml de penicilina,

50pg/ml de estreptomicina.

1. Em periodos variaveis antes da exposigao ao peptideo, os neuronios foram removidos do meio de culture baseado em Neurobasal-A e colocados em TM (vide acima) com a inclusao de suplemento de insulina- transferrina-selenito (Sigma). Todas as etapas subsequentes ocorreram em

TM (veja acima).

2. Os neuronios foram expostos entao aos peptideos de fusao inventivos a 10 μΜ por 1 h (particularmente peptideos (Arg)8-NR2B9c na forma D (D-TAT-D-NR2B9c, sequencia vdseisslk-rrrrrrrr (SEQ ID NO: 35)) e tambem na forma L (SEQ ID NO: 34)).

3. Apos 1 h, os neuronios foram Iavados uma vez em TM para

remover ο peptideo.

4. Apos um periodo de tempo variavel, os neuronios foram ex- postos a NMDA por 1 h apos ο que os neuronios foram colocados em TM por 24 h.

5. Os neuronios foram fixados (paraformaldeido a 3%) e corados

(DAPI, 4‘,6-Diamino-2-fenilindol). O niimero de nCicleos picnoticos e contado como % do total. Os experimentos foram realizados em triplicata. Resultados

A forma D de (Arg)8-NR2B9c (D-(Arg)8-D-NR2B9c (SEQ ID NO:

35) ofereceu neuroprotegao superior por ate 8 horas apos a Iavagem do pep- tideo frente a NMDA (20 μΜ) em relagao a forma D (figura 3). Na dose mais

elevada de NMDA (40 μΜ), a forma D tambem mostrou efeitos protetores de iguais a melhores (figura 4). Estes resultados sugerem que a forma D e uma candidata mais promissora como um farmaco terapeutico. De modo geral, D- (Arg)8-D-NR2B9c (SEQ ID NO: 35) age igual a D-TAT-D-NR2B9c (SEQ ID NO: 33)，embora com uma duragao mais curta de atividade neuroprotetora, ο que sugere uma capacidade de penetragao na celula mais pronunciada de D-TAT do que de D-(Arg)8. Listagem de Sequencia <110> Xigen S.Α.

<12 0> PEPTiDEO DE FUSAO PARA INIBIR A INTERACAO DO RECEPTOR DE NMDA NEURO- NAL· (NMDAR) E PROTEINAS QUE INTERAGEM COM NMDAR <130> AI02P003WO <160> 35

<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia： peptideo transportador ρAntp (43-58) de ante — na pedia <400> 1

Arg Gln lie Lys lie Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 10 15

<210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia: peptideo transportador ρAntp (43-58) de ante- na pedia <220>

<221> MOD—RES <222> (16)..(16) <223> AMIDAQAO <400> 2

Arg Gln lie Lys 工Ie Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 10 15

<210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> DescrigcLO da sequencia： peptideo transportador derivado de TAT (HIV) <400> 3

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descrigcio da sequencia： peptideo transportador derivado de TAT (HIV) <400> 4

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descrigao da sequencia： peptideo transportador derivado de TAT (HIV) <400> 5

Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys 1 5 10 15

<210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia: peptideo transportador hCT {9-32) <400> 6 Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys Cys 1 5 10 15

<210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> DescrigSo da sequencia： peptideo transportador hCT (9-32) <220>

<221> MOD-RES <222> (24)..(24) <223> AMIDACAO <400> 7

Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln 10 15

Thr Ala lie Gly Val Gly Ala Pro 20

<210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> DescrifSo da sequencia: peptideo transportador ρVEC <220>

<221> MOD—RES <222> (18)..(18) <223> AMIDAQAO <400> 8

Leu Leu lie 工Ie Leu Arg Arg Arg lie Arg Lys Gln Ala His Ala His 10 15

Ser Lys 5

10

15

20

25

30

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220>

9

16

PRT

Artificial

Descrigao da sequencia： peptideo transportador pISL

<221> MOD RES

<222> <223> <400>

(16)..(16) AMIDACAO 9

Arg Val 工Ie Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys

1

<210> <211> <212> <213> <220> <223> 28) <220> <221> <222> <223> <400>

10 15

10 28 PRT

Artificial

DescricSo da sequencia： peptideo transportador PRP de camundongo (1

MOD—RES (28) . . (28) AMIDACAO 10

Met Ala Asn Gly Leu Tyr Trp Leu Leu 1 5

Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg 25

<210> 11 <211> 27

Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 15

Pro Lys Pro

<212> PRT 5

10

15

20

25

30

<213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> <400>

Artificial

DescricSo da sequencia: peptideo transportador Ems (194-220)

M0D_RES (27) . . (27)

amidacAO 11

Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Leu Gln Leu Arg 10 15

工Ie Ala Gly Lys Arg Leu Glu Gly Arg Ser Lys 25

12 13 PRT

Artificial

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220>

DescrigSo da sequencia： peptideo transportador Restricocin L3 (60-73)

<221> MOD一RES

<222> (13) . . (13)

<223> AMIDACAO

<400> 12

Lys Leu lie Lys Gly Arg Thr Pro lie Lys Phe Gly Lys

1 5 10

<210> 13

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia： peptideo transportador VT5

<220> 5

10

15

20

25

30

<221> MOD一RES <222> (26)..(26) <223> AMIDAgAO <400> 13

Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys 1 5

Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro 20

<210> 14 18 PRT

Artificial

Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr

15

Lys Pro Asp 25

<211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> <400>

DescrigSo da sequencia： peptideo transportador MAP

M0D_RES (18) . . (18) amidaqAO

14

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 10 15

Leu Ala <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> DescrigSo da sequencia: peptideo transportador (Arg)7 <400> 15

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5

<210> 16 <211> 7

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> DescriQao da sequencia： peptideo transportador (Arg)7-NH2 <220>

<221> MOD—RES

<222> (7) . . (7)

<223> AMIDACAO

<400> 16

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> DescrigSo da sequencia： peptideo transportador (Arg)7-C

<400> 17

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia： peptideo transportador (Arg)8

<400> 18

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 19

<211> 8 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> DescriQao da sequencia： peptideo transportador (Arg)8-NH2 <220>

<221> MOD—RES

<222> (8) . . (8)

<223> AMIDACAO

<400> 19

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> DescrigSo da sequencia： peptideo transportador (Arg)9

<400> 20

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> DescrigSo da sequencia： peptideo transportador (Arg)9-NH2 <220>

<221> MOD—RES

<222> (9)..(9)

<223> AMIDAq； AO

<400> 21

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg <210> 22

<211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia： peptideo transportador MPG <400> 22

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 25

<210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia: peptideo transportador MPG

<220>

<22l> MOD一 RES <222> (27)..(27) <223> cysteamide modification <400> 23

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu 1 5

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys 20

<210> 24

Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

15

Arg Lys Val 25

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> DescrigSo da sequencia： peptideo transportador MPG-NH2 <220>

<221> MOD一RES <222> (27)..(27) <223> AMIDACAO <400> 24

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr 1 5

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys 25

<210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> DescrigSo da sequencia： peptideo transportador Transportan

<220>

<221> M0D_RES <222> (21)..(21) <223> AMIDAQAO <400> 25

Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys lie Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 10 15

Ala Lys Lys lie Leu 20

<210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia： peptideo transportador Pep-I

Leu Leu Gly Lys Tie Asn Leu 15

lie Leu

<400> 26 5

10

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 10 15

Lys Lys Arg Lys Val 20

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220>

27 21 PRT

Artificial

Descrigao da sequencia: peptideo transportador Pep-I

<221> MOD—RES <222> (21)..(21) <223> CYSTEAMIDE <400> 27

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val 20

<210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia: peptideo transportador KALA <400> 28

Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His 10 15

Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala

20 25 30

<210> 29

<211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia： peptideo transportador Bulforin 2 <400> 29

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 10 15

Arg Leu Leu Arg Lys 20

<210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia： peptideo derivado de (L-form) <400> 30

Lys Leu Ser Ser lie Glu Ser Asp Val 1 5

<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> DescrigSo da sequencia: peptideo derivado de (D-form) <400> 31

Val Asp Ser Glu lie Ser Ser Leu Lys 1 5

<210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial

<220> <223> Descrigao da sequencia: L-TAT-L-NR2B9c <400> 32

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser lie 1 5 10 15

Glu Ser Asp Val 20

<210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao da sequencia: D-TAT-D-NR2B9c <400> 33

Val Asp Ser Glu 工Ie Ser Ser Leu Lys Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys 10 15

Lys Arg Gly Tyr 20

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descrigao da sequencia: L-(Arg)8-L-NR2B9c <400> 34

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser lie Glu Ser Asp

10

Val

<210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial

<220> <223> DescrigSo da sequencia: D-(Arg)8-D-NR2B9c <400> 35

Val Asp Ser Glu lie Ser Ser Leu Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 10 15

Arg

Claims

1. Peptideo de fusao que compreende pelo menos um compo- nente (I), em que ο componente (I) compreende um peptideo transportador, e tmrOomponente (II), selecionado entre um peptideo que inibe a interagao do receptor de N-metil-D-aspartato neuronal (NMDAR) com proteinas que interagem com NMDAR, em que ο componente (II) consiste inteiramente em aminoacidos D-enantiomericos.

2. Peptideo de fusao, de acordo com a reivindicagao 1，em que ο componente (I) e selecionado entre peptideos que penetram na celula inclu- indo: (a) dominios de transdugao de proteina (PTD) e CPPs derivados de proteina, incluindo as sequencias derivadas de Antennapedia, pAntp (43- 58)，que compreendem as sequencias RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1) ou RQIKIWFQNRRMKWKK-amida (SEQ ID NO: 2), incluindo as se- quencias derivadas do virus da imunodeficiencia humana 1 (HIV-1), TAT, regiao 37 a 72, regiao 37 a 60, regiao 48 a 60 ou regiao 49 a 57 de TAT, se- quencias GRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 3)，YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 4)，CGRKKRRQRRRPPQC (SEQ ID NO: 5) ou CGRKKRRQRRRPPQCC (SEQ ID NO: 6)，incluindo hCT(9-32) que tem a sequencia LGTYTQDFNK- FHTFPQTAIGVGAP-NH2 (SEQ ID NO: 7)，pVEC que compreende a se- quencia LLIILRRRIRKQAHAHSK-NH2 (SEQ ID NO: 8), plSL que compreen- de a sequencia RVIRVWFQNKRCKDKK-NH2 (SEQ ID NO: 9)，PRP de ca- mundongo (1-28) que compreende a sequencia MANG LYWL- LALFVTMWTDVGLCKKRPKP-NH2 (SEQ ID NO: 10) e homologas a essas, incluindo homologas humanas, Ems (194-220) que compreende a sequencia RQGAARVTSWLGLQLRIAGKRLEGRSK-NH2 (SEQ ID NO: 11)，Restricoci- na L3 (60-73) que compreende a sequencia KLIKGRTPIKFGK-NH2 (SEQ ID NO: 12), ou (b) peptideos-modelo incluindo VT5 que compreende a sequen- cia DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD-NH2 (SEQ ID NO: 13), MAP que compreende a sequencia KLALKLALKALKAALKLA-NH2 (SEQ ID NO: 14), fitas de arginina incluindo RRRRRRR, isto e, (Arg)7 (SEQ ID NO: 15), ou RRRRRRR-NH2> isto e, (Arg)7-NH2 (SEQ ID NO: 16), ou RRRRRRR-C, isto e, (Arg)7-C (SEQ ID NO: 17)，ou RRRRRRRR, isto e, (Arg)8 (SEQ ID NO: 18)， ou RRRRRRRR-NH2, isto e, (Arg)8-NH2 (SEQ ID NO: 19)， RRRRRRRRR, isto e, (Arg)9 (SEQ ID NO: 20), ou RRRRRRRRR-NH2, isto e, (Arg)9-NH2, (SEQ ID NO: 21 )，ou (c) CPPs designados que incluem MPG que compreende a se- quencia GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (SEQ ID NO: 22) ou GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cisteamida (SEQ ID NO: 23), Transportan que compreende a sequencia GWTLNSAGYLLGKlNLKALAA- LAKKIL-Nh2 (SEQ ID NO: 24)，Transportan 10 que compreende a sequencia AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 (SEQ ID NO: 25), Pep-1 que compreende a sequencia KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 26) ou KETW- WETWWTEWSQPKKKRKV-cisteamida (SEQ ID NO: 27), ou pode ser selecionado entre ο peptideo KALA que compreende a sequen- cia WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (SEQ ID NO: 28) ou de Bul- forin 2 que compreende a sequencia TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO: 29)， ou um isomero retroinverso de SEQ ID Nos: 1-29 composto de aminoacidos D.

3. Peptideo de fusao, de acordo com a reivindicagao 2, em que ο componente (I) e selecionado entre peptideos que penetram na celula mos- trando identidade de sequencia de cerca de 60，70, 80，90, 95 ou ate 99% com uma sequencia de acordo com quaisquer das SEQ ID Nos: 1 a 29 como definidas na reivindicagao 2，desde que 0 componente (I) ainda retenha sua atividade biologica, isto e, conduza 0 peptideo de fusao inventivo atraves da membrana plasmatica.

4. Peptideo de fusao, de acordo com a reivindicagao 3’ em que ο componente (II) e selecionado entre as subunidades NR1 e NR2 do receptor de NMDA, peptideos que compreendem um dominio de Iigagao com PDZ, peptideos que contem ο motivo tSXnV ou entre proteinas de densidade pos- sinaptica-95, PSD-95, PSD-93, SAP102.

5. Peptideo de fusao, de acordo com a reivindicagao 4，em que ο componente (II) compreende um comprimento de 5 a 40 aminoacidos, mais preferivelmente um comprimento de 5 a 30 ou 5 a 20 aminoacidos e ainda mais preferivelmente um comprimento de 5 a 15 ou ainda de 5 a 10 aminoa- cidos.

6. Peptideo de fusao, de acordo com a reivindicagao 4 ou 5, em que ο componente (II) e selecionado a partir de uma sequencia que compre- ende uma sequencia de acordo com vdseisslk (SEQ ID NO: 31).

7. Peptideo de fusao, de acordo com qualquer uma das reivindi- cag5es 4 a 6, em que ο componente (II) e selecionado a partir de uma se- quencia que tem uma identidade de sequencia de cerca de 60，70, 80，90， 95 ou ainda 99% com uma sequencia de acordo com SEQ ID NO: 31.

8. Peptideo de fusao, de acordo com qualquer uma das reivindi- cagoes 1 a 7, em que ο componente (I) consiste inteiramente em L- aminoacidos, D-aminoacidos ou ambos.

9. Peptideo de fusao, de acordo com qualquer uma das reivindi- cag5es 1 a 8，em que os componentes (I) e (II) sao Iigados por um ligante.

10. Peptideo de fusao, de acordo com qualquer uma das reivin- dicag5es 1 a 9，compreendendo adicionalmente um componente (III), em que ο componente (III) e um "tag" para purificagao.

11. Composigao farmaceutica compreendendo um peptideo de fusao como definido em qualquer uma das reivindicag5es 1 a 10, θ opcio- nalmente um veiculo farmaceutico.

12. Uso de um peptideo de fusao como definido em qualquer uma das reivindicag5es 1 a 10，para preparar uma composigao farmaceutica para ο tratamento, melhora ou prevengao de doengas relacionadas ao efeito prejudicial de uma Iesao em celulas de mamifero selecionadas entre apople- xia ou Iesoes de medula espinhal, Iesoes isquemicas ou traumaticas do ce- rebro ou medula espinhal ou danos aos neuronios do sistema nervoso cen- tral (CNS) incluindo Iesoes agudas do CNS1 apoplexia isquemica ou Iesoes de medula espinhal, assim como anoxia, isquemia, Iesao mecanica ou para fornecer efeito neuroprotetor contra ou tratamento de Iesao excitotoxica e isquemica, excitotoxicidade, falha de suporte neurotrofico, desconexao, Ie- sao a neuronios incluindo epilepsia, condigoes neurodegenerativas cronicas e dor neuropatica incluindo dor neuropatica relacionada a PSD-95 e/ou inte- ragao com NMDAR.

13. Kit compreendendo uma composigao farmaceutica como de- finida na reivindicagao 11, e um manual de instrugao ou folheto de informa- gao com instrugoes e/ou informagao para a aplicagao da composigao farma- ceutica.