ES2869300T3 - Péptido terapéutico para las lesiones relacionadas con la neurotoxicidad excitadora - Google Patents

Abstract

Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) o una variante funcional de la misma, en donde la variante funcional se obtiene realizando una o más sustituciones conservativas en YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1), en donde el péptido es capaz de unirse al dominio PDZ1/2 de la PSD-95 e inhibe la interacción entre el NMDAR y la PSD-95.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido terapéutico para las lesiones relacionadas con la neurotoxicidad excitadora

Campo técnico

La presente solicitud se refiere en general al campo médico. En particular, en la presente solicitud se proporcionan péptidos, composiciones y métodos para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central.

Antecedentes de la invención

El ictus es una enfermedad cerebrovascular aguda frecuente en personas de mediana edad y ancianos, y tiende a atacar a los más jóvenes. Es una de las tres principales enfermedades (cánceres, enfermedades cardiovasculares y diabetes) perjudiciales para el ser humano en el mundo actual. Casi tres millones de personas mueren por enfermedades cerebrovasculares cada año en China. Esta cifra es entre 4 y 5 veces superior a la de Estados Unidos y los países europeos, 3,5 veces superior a la de Japón, e incluso superior a la de países en desarrollo como Tailandia e India. La tasa de incidencia aumenta a un ritmo del 8,7 % anual. La tasa de recaída supera el 30 %, y la tasa de recaída en cinco años alcanza el 54 %. El 75 % de los supervivientes de un ictus pierden su capacidad laboral y el 40 % quedan gravemente discapacitados.

Los ictus se pueden dividir aproximadamente en dos categorías, a saber, el ictus isquémico y el ictus hemorrágico, de los cuales el ictus isquémico representa el 85 % del total de pacientes con ictus. En la actualidad, los fármacos terapéuticos para el ictus isquémico incluyen principalmente los siguientes tipos: vasodilatadores (tales como la persantina), fármacos que mejoran la microcirculación y aumentan el volumen sanguíneo (tales como el dextrano de bajo peso molecular), fármacos trombolíticos (tales como la urocinasa), fármacos anticoagulantes, fármacos que impiden la agregación plaquetaria (tales como el ácido acetilsalicílico), la medicina china, agentes neuroprotectores, etc. Sin embargo, debido a que la mayoría de estos fármacos tienen problemas como efectos secundarios importantes, riesgos potenciales o una eficacia terapéutica insuficiente, el estudio de la patogenia del ictus y el desarrollo de fármacos dirigidos a la patogenia tienen un importante significado social para la prevención y el tratamiento de la aparición y el desarrollo de enfermedades cerebrovasculares.

El ictus se caracteriza por la muerte de neuronas en las regiones de isquemia local, hemorragia cerebral y/o traumatismo. La muerte de las neuronas o las lesiones causadas por la isquemia cerebral experimentan un proceso de lesiones en cascada, es decir, tras producirse la isquemia cerebral, el riego sanguíneo a los tejidos disminuye, los neurotransmisores excitadores aumentan, lo que a su vez activa los receptores NMDA y AMPA, provoca la apertura de canales iónicos y la entrada de iones de calcio, y además activa un gran número de enzimas para desencadenar una cascada de señales, lo que provoca daños en las células nerviosas a través de múltiples vías. La proteína de densidad postsináptica anterógrada 95 (PSD-95) desencadena una serie de lesiones isquémicas a través de la interacción con varias proteínas, y por lo tanto es un factor crítico para las lesiones causadas por la isquemia cerebral, y también un objetivo potencial para la terapia farmacológica. Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores de la PSD-95 tiene una gran importancia médica para las lesiones del sistema nervioso causadas por diversas neurotoxicidades excitadoras, incluyendo el ictus.

Además, los estudios han demostrado que el neurotransmisor excitador NMDA desempeña un papel importante en la ansiedad, la epilepsia y varias enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson o la corea de Huntington. Por ejemplo, los estudios han demostrado que la excitación excesiva del sistema glutamatérgico central puede provocar ansiedad, mientras que el receptor del NMDA (NMDAR) es uno de los principales responsables de la neurotoxicidad excitadora del ácido glutámico. La aparición de la epilepsia incluye tres procesos fisiopatológicos diferentes pero continuos, que incluyen el inicio, el mantenimiento y la expansión de la descarga convulsiva, y la inhibición de la descarga convulsiva. Durante este proceso, los neurotransmisores excitadores, tales como el ácido glutámico y el ácido aspártico, desempeñan un papel importante. En la enfermedad de Alzheimer, La PSD-95 está implicada en el mecanismo neurotóxico de la enfermedad a través de la vía GluR6-PSD-95-MLK3. Adicionalmente, en la corea de Huntington, la PSD-95 es un mediador de la neurotoxicidad causada por los receptores del NMDA y los mutantes de la huntingtina. Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores de la PSD-95 también es importante para el tratamiento, la mejora y la prevención de las enfermedades anteriores.

Sumario de la invención

La invención del presente documento es como se define en las reivindicaciones.

En un primer aspecto, en la presente solicitud se proporciona un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos YEKLLDTEI (s Eq ID NO: 1) o una variante funcional de la misma.

La variante funcional es una variante generada por una o más sustituciones conservativas en el segmento LDTEI de la SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, la sustitución conservativa se selecciona del grupo que consiste en una sustitución entre D y E, una sustitución entre L, V e I, y una sustitución entre T y S.

En algunas realizaciones, la variante funcional es una variante generada mediante la sustitución del segmento LDTEI (SEQ ID NO: 6) de la SEQ ID NO: 1 por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en LDTEL (SEQ ID NO: 7), LDTEV (SEQ ID NO: 8), LDTDI (SEQ ID NO: 9), LDTDL (SEQ ID NO: 10), LDTDV (SEQ ID NO: 11), LDSEI (SEQ ID NO: 12), LDSEL (SEQ ID NO: 13), LDSEV (SEQ ID NO: 14), LDSDI (SEQ ID NO: 15), LDSDL (SEQ ID NO: 16), LDSDV (SEQ ID NO: 17), LETEI (SEQ ID NO: 18), LETEL (SEQ ID NO: 19), LETEV (SEQ ID NO: 20), LETDI (SEQ ID NO: 21), LETDL (SEQ ID NO: 22), LETDV (SEQ ID NO: 23), VDTEI (SEQ ID NO: 24), VDTEL (SEQ ID NO: 25), VDTEV (SEQ ID NO: 26), VDTDI (SEQ ID NO: 27), VDTDL (SEQ ID NO: 28), VDTDV (SEQ ID NO: 29), IDTEI (SEQ ID NO: 30), IDTEL (SEQ ID NO: 31), IDTEV (SEQ ID NO: 32), IDTDI (SEQ ID NO: 33), IDTDL (SEQ ID NO: 34), IDTDV (SEQ ID NO: 35), IETEI (SEQ

En un segundo aspecto, en la presente solicitud se proporciona un péptido quimérico que comprende un péptido activo y un péptido de internalización, en donde el péptido activo es un péptido como se describe en el primer aspecto, y el péptido de internalización es capaz de facilitar la captación del péptido quimérico por parte de una célula.

En algunas realizaciones, el péptido de internalización comprende la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2).

En algunas realizaciones, el péptido quimérico comprende la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (SEQ ID NO: 3).

En un tercer aspecto, en la presente solicitud se proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido como se describe en el primer aspecto o un péptido quimérico como se describe en el segundo aspecto, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se usa para tratar una lesión del sistema nervioso central o se usa como agente neuroprotector.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se usa para tratar una lesión del sistema nervioso causada por un ictus isquémico.

En un cuarto aspecto, en la presente solicitud se proporciona un método para tratar una lesión del sistema nervioso central que comprende la administración de un péptido como se describe en el primer aspecto, o de un péptido quimérico como se describe en el segundo aspecto, o de una composición farmacéutica como se describe en el tercer aspecto, a un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto que padece un ictus isquémico.

En un quinto aspecto, en la presente solicitud se proporciona el uso de un péptido como se describe en el primer aspecto, o de un péptido quimérico como se describe en el segundo aspecto, o de una composición farmacéutica como se describe en el tercer aspecto, en la preparación de un medicamento para tratar una lesión del sistema nervioso central o un agente neuroprotector.

En algunas realizaciones, el medicamento se usa para tratar una lesión del sistema nervioso causada por un ictus isquémico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el resultado de un ensayo de precipitación con centrifugación para detectar la interacción entre el P5 y el dominio PDZ1/2. M representa un marcador de peso molecular de la proteína; el carril 1 muestra Hís+p Dz 1/2+P5; el carril 2 muestra el P5 solo; el carril 3 muestra His+P5; y el carril 4 muestra His+PDZ1/2. La banda eluida mostrada en el carril 1 contiene tanto P5 como PDZ1/2, confirmando que P5 es capaz de unirse al dominio PDZ1/2.

La figura 2 muestra imágenes de la tinción con TTC de secciones cerebrales de ratas del modelo de MCAO tratadas con el polipéptido P5. a. grupo normal; b. grupo de referencia; c. grupo de modelo; d. grupo de control positivo del fármaco (solución inyectable de Enbipu); e. NA-1 a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal; f. YE-NA-1 a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal; g. P5 a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal; h. P5 a una dosis de 3 mg/kg de peso corporal; i. p 5 a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal; j. administración profiláctica de P5 a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal; k. administración profiláctica de P5 a una dosis de 3 mg/kg de peso corporal; l. administración profiláctica de P5 a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal.

La figura 3 es un gráfico que muestra los datos estadísticos del volumen de infarto cerebral tras la administración terapéutica y profiláctica del polipéptido P5 a varias dosis a ratas del modelo de MCAO. **p<0,01.

La figura 4 muestra la distribución del polipéptido P5 en los cerebros de las ratas.

La figura 5 muestra imágenes de la tinción con TTC de los cerebros de las ratas.

La figura 6 muestra imágenes de la tinción con HE de cortes en parafina de cerebros de rata. A: grupo normal, B: grupo de referencia, C: grupo de modelo, D: grupo de administración de control positivo, E: NA-1, F: grupo de YE-NA-1, G: grupo de P5, H: grupo de administración profiláctica de P5.

Descripción detallada de la invención

Los inventores de la presente solicitud han estudiado péptidos de los que se ha informado en la técnica que reducen los efectos dañinos de los trastornos neurológicos mediados, al menos en parte, por la neurotoxicidad excitadora de los NMDAR. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que dichos péptidos funcionan, al menos en parte, mediante la inhibición de la interacción entre el NMDAR y la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) (es decir, inhibidores de la PSD-95). Sobre la base de lo anterior, los inventores de la presente solicitud han considerado intensamente varios objetivos para el tratamiento del ictus isquémico, han diseñado y cribado agentes neuroprotectores polipeptídicos mediante experimentos farmacológicos y farmacodinámicos in vivo e in vitro, y han obtenido péptidos con unas propiedades deseables.

Definiciones

Salvo que se indique lo contrario, los términos usados en la presente solicitud tienen el significado comprendido normalmente por el experto habitual en la materia.

Las abreviaturas de una letra o de tres letras para los aminoácidos usadas en la presente solicitud son coherentes con las convenciones internacionales.

La expresión "péptido quimérico" significa un péptido que tiene dos componentes peptídicos que no están asociados entre sí de forma natural. Los dos componentes peptídicos pueden formar una proteína de fusión o pueden estar unidos por un enlace químico.

La expresión "dominio PDZ" se refiere a un dominio proteico modular de aproximadamente 90 aminoácidos caracterizado por una alta identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 60 %) con la proteína sináptica PSD-95, una conexina separadora Discs-Large de Drosophila (d Lg ) y una proteína de unión estrecha epitelial Z01. El dominio PDZ también se conoce como repeticiones homólogas Discs-Large ("DHR") y repeticiones GLGF. El dominio PDZ normalmente ha conservado una secuencia consenso central (Doyle, D. A., 1996, Cell 85: 1067-76). En la Solicitud de EE.UU. n.° 10/714.537 se divulgan ejemplos de proteínas que contienen dominios PDZ y secuencias de dominios PDZ.

La expresión "receptor del NMDA" o "NMDAR" se refiere a una proteína asociada a la membrana que se sabe que interactúa con el NMDA. Estos receptores pueden ser humanos o no humanos (por ejemplo, de ratones, ratas, conejos o monos).

La expresión "unión específica" se refiere a la unión entre dos moléculas (por ejemplo, un ligando y un receptor) caracterizada porque una molécula (por ejemplo, un ligando) es capaz de unirse a otra molécula específica (por ejemplo, un receptor) incluso en presencia de otras muchas moléculas diferentes, es decir, la capacidad de una molécula de unirse preferentemente a otra molécula en una mezcla de moléculas heterogéneas. La unión específica de un ligando a un receptor también puede confirmarse cuando la unión de un ligando marcado detectablemente a un receptor se reduce cuando hay presente un exceso de ligandos no marcados (es decir, un ensayo de competencia de unión).

La expresión "estadísticamente significativo" significa un valor de p<0,05, preferentemente <0,01, lo más preferentemente <0,001.

La expresión "variante funcional" se refiere a una variante que tiene una función y una propiedad biológica igual o similar a la del original. Como ejemplo no limitante, se puede obtener una "variante funcional" realizando una o más sustituciones conservativas en el original.

Un "péptido de internalización", también conocido como péptido de penetración celular, se usa ampliamente en el campo de los fármacos proteicos y funciona para facilitar la captación y absorción de un péptido activo unido al mismo por parte de las células. Como ejemplo no limitante, un péptido de internalización puede ser un péptido Tat. Un ejemplo no limitante de péptidos Tat es YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2).

En un primer aspecto, en la presente solicitud se proporciona un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) o una variante funcional de la misma. El péptido también se denomina en el presente documento "péptido activo", que actúa como un resto activo en los péptidos quiméricos de la presente solicitud para el tratamiento de una lesión del sistema nervioso central o su uso como agente neuroprotector.

De acuerdo con los estudios existentes, algunos péptidos activos que inhiben la interacción entre el NMDAR y la PSD-95 se basan en la estructura del NMDAR. Por ejemplo, NMDAR2B (GenBank ID 4099612) tiene 20 aminoácidos FNGSSNGHVYEKLSSLESDV (SEQ ID NO: 42) en su extremo carboxílico y el motivo ESDV de PL (SEQ ID NO: 43). Algunos péptidos activos conocidos contienen una parte de la secuencia de aminoácidos en el extremo carboxílico del NMDAR2B, inhibiendo así la PSD-95 competitivamente con el NMDAR2B. Los estudios han sugerido que el segmento ESDV o LESDV (SEQ ID NO: 44) de los péptidos anteriores desempeña un papel importante en la inhibición de la interacción entre el NMDAR y la PSD-95. Sin quedar ligado a teoría alguna, los inventores de la presente solicitud han descubierto sorprendentemente que las alteraciones del péptido activo YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) divulgado en el presente documento en comparación con la composición de aminoácidos en el extremo carboxílico del NMDAR2B anterior (que carece de dos residuos SS que siguen a KL mientras que tiene la secuencia de aminoácidos YEKL (SEQ ID NO: 45) que se extiende desde el extremo amínico del motivo PL) mejoran la interacción de un péptido activo con el dominio PDZ1/2. Al mismo tiempo, el segmento LDTEI en el extremo carboxílico del péptido en relación con el motivo YEKL puede ser modificado, y se espera que dicha modificación no afecte a la actividad del péptido activo o incluso que pueda aumentar su actividad. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la variante funcional proporcionada en el presente documento es una variante generada por una o más sustituciones conservativas en el segmento LDTEI de la SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, la sustitución conservativa se selecciona del grupo que consiste en una sustitución entre D y E, una sustitución entre L, V e I, y una sustitución entre T y S.

En algunas realizaciones más particulares, la variante funcional es una variante generada mediante la sustitución del segmento LDTEI de la SEQ ID NO: 1 por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en LDTEL, LDTEV, LDTDI, LDTDL, LDTDV, LDSEI, LDSEL, LDSEV, LDSDI, LDSDL, LDSDV, LETEI, LETEL, LETEV, LETDI, LETDL, LETDV, VDTEI, VDTEL, VDTEV, VDTDI, VDTDL, VDTDV, IDTEI, IDTEL, IDTEV, IDTDI, IDTDL, IDTDV, IETEI, IETEL, IETEV, IETDI, IETDL e IETDV.

En algunas realizaciones, las variantes funcionales divulgadas en el presente documento también comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o incluso más de identidad con los péptidos mencionados anteriormente. Es conocido en la técnica que la "identidad" entre dos proteínas puede determinarse alineando la secuencia de aminoácidos de una primera proteína con la secuencia de una segunda proteína que comprende una sustitución de aminoácidos conservativa con respecto a la primera proteína. El grado de identidad entre dos proteínas puede determinarse mediante algoritmos informáticos y métodos bien conocidos por los expertos en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferentemente usando el algoritmo BLASTP.

En algunas realizaciones, las variantes funcionales divulgadas en el presente documento incluyen las que tienen sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de residuos de aminoácidos en 1, 2, 3, 4, 5 o más posiciones en comparación con los péptidos mencionados anteriormente, difiriendo así de los péptidos particulares divulgados anteriormente.

Como se ha descrito anteriormente, una variante funcional puede diferir de un péptido particular divulgado anteriormente en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ser naturales o producidas sintéticamente. Por ejemplo, una o más de las secuencias peptídicas descritas anteriormente divulgadas en el presente documento pueden ser modificadas y sus actividades biológicas pueden ser evaluadas siguiendo cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe en el presente documento.

En un segundo aspecto, en la presente solicitud se proporciona un péptido quimérico que comprende un péptido activo y un péptido de internalización, en donde el péptido activo es un péptido como se describe en el primer aspecto, y el péptido de internalización es capaz de facilitar la captación del péptido quimérico por parte de una célula.

Los expertos en la materia deben entender que el objetivo principal de incorporar un péptido activo y un péptido de internalización en un péptido quimérico es suministrar mejor el péptido activo al objetivo de acción. Por lo tanto, los péptidos de internalización adecuados para la presente solicitud no se limitan a tipos específicos, siempre que se pueda lograr el propósito de penetrar en las células. Los expertos en la materia deben entender también que, dado que los objetivos de acción del péptido activo se localizan principalmente en el interior de las neuronas, se prefiere que el péptido de internalización sea específicamente apropiado para las neuronas. En algunas realizaciones, el péptido de internalización puede ser un péptido Tat. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de un péptido A Tat es YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el péptido quimérico comprende la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (SEQ ID NO: 3).

Debe apreciarse que un péptido de internalización puede estar unido a un péptido activo a través de un enlace amida para formar un péptido de fusión, pero también pueden estar unidos a través de otros medios adecuados, tales como un enlace químico. El acoplamiento de dos componentes puede lograrse con un agente de acoplamiento o un agente de conjugación. Un gran número de dichos reactivos están disponibles comercialmente y se pueden encontrar en S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991). Algunos ejemplos de reactivos de reticulación incluyen J-succinimida-3-(2-piridinditio)propionato (SPOP) o N,N'-(1,3-fenilen) bismaleimida; N,N'-etilidenbis-(yodoacetamida) u otros reactivos de este tipo con puentes de metileno de 6 a 11 carbonos (que son relativamente específicos para los grupos tiol); y 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (que forma un enlace irreversible con un grupo amino y un grupo tirosina). Otros reactivos de reticulación incluyen P,P'-difluoro-m,m'-dinitrodifenil sulfona (que forma una reticulación irreversible con un grupo amino y un grupo fenol); hexanoato de dimetil dietilamina (que es específico de un grupo amino); cloruro de fenol-1,4-disulfonilo (que reacciona principalmente con un grupo amino); 1,6-hexametilén diisocianato o diisocianato, o fenilazo-p-diisocianato (que reacciona principalmente con un grupo amino; glutaraldehído (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y bencidina bis-diazotada (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).

Adicionalmente, los péptidos descritos anteriormente pueden opcionalmente derivatizarse (por ejemplo, acetilarse, fosforilarse y/o glicosilarse) para favorecer su afinidad por los inhibidores, favorecer la capacidad de transporte de los inhibidores a través de las membranas celulares o favorecer su estabilidad.

El péptido activo y el péptido de fusión en el que el péptido activo se fusiona con un péptido de internalización de la presente solicitud pueden sintetizarse mediante métodos de síntesis en fase sólida o métodos recombinantes. Los peptidomiméticos pueden sintetizarse usando una variedad de protocolos y métodos descritos en la bibliografía científica y bibliografías de patentes, tales com Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (ed.) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9: 205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3: 17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267: 220-234.

En un tercer aspecto, en la presente solicitud se proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido como se describe en el primer aspecto o un péptido quimérico como se describe en el segundo aspecto, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, los péptidos activos o los péptidos quiméricos divulgados en el presente documento pueden administrarse en forma de composición farmacéutica. La composición farmacéutica se puede preparar mediante métodos convencionales, por ejemplo, mezcla, disolución, granulación, compresión, molienda, emulsificación, encapsulación, captura o liofilización.

La composición farmacéutica se puede formular de una forma convencional usando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o ingredientes fisiológicamente aceptables adecuados para preparar el péptido activo o el péptido quimérico en una formulación farmacéuticamente aceptable. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

En algunas realizaciones, la administración puede ser una administración parenteral, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal o intramuscular. Se prefiere la administración intravenosa.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para la administración parenteral es preferentemente estéril y sustancialmente isotónica. Para inyección, el péptido activo o el péptido quimérico se pueden formular en una solución acuosa, preferentemente en un tampón fisiológicamente compatible tal como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica o tampón de acetato (para reducir las molestias en el sitio de inyección). La solución puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Alternativamente, el péptido activo o el péptido quimérico puede estar en forma de un polvo para la reconstitución con un portador adecuado, tal como agua apirógena estéril, antes de su uso.

Para la administración transmucosa, en la formulación se usan penetrantes apropiados para atravesar la barrera de interés. Esta vía de administración puede usarse para administrar un compuesto en la cavidad nasal o para la administración sublingual.

En algunas realizaciones, para la administración oral, el péptido activo o el péptido quimérico puede formularse con un portador farmacéuticamente aceptable en forma de comprimidos, píldoras, pastillas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones acuosas, suspensiones o similares, para su ingestión oral por un paciente que se vaya a tratar. Para las formulaciones sólidas orales tales como polvos, cápsulas y comprimidos, algunos excipientes adecuados incluyen cargas tales como azúcares tales como lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o povidona (PVP); agentes de granulación y aglutinantes. Si fuera necesario, puede añadirse un agente disgregante, tal como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo (tal como alginato sódico). Si fuera necesario, las formulaciones sólidas pueden recubrirse con azúcar o con un recubrimiento entérico mediante técnicas convencionales. Para las preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, elixires y soluciones, los portadores, excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, glicerol, aceite y alcohol. Adicionalmente, puede añadirse un agente aromatizante, un conservante, un agente colorante, o similares.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, el péptido activo o el péptido quimérico también puede formularse en una preparación de depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante un implante (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular) o mediante una inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, el compuesto puede formularse con un material polimérico o hidrófobo adecuado (por ejemplo, formulado como una emulsión en un aceite aceptable) o una resina de intercambio iónico, o formulado como un derivado bastante soluble, por ejemplo, una sal bastante soluble.

Alternativamente, se pueden usar otros sistemas de administración de fármacos. El péptido quimérico puede administrarse usando liposomas y emulsiones. También pueden usarse ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido. Adicionalmente, un compuesto puede administrarse usando un sistema de liberación sostenida, tal como un sustrato semipermeable de polímeros sólidos que contienen un agente terapéutico.

Las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar el péptido quimérico durante varias semanas hasta más de 100 días, dependiendo de sus propiedades químicas. Se pueden usar otras estrategias para la estabilización de una proteína, dependiendo de la propiedad química y la bioestabilidad de un agente terapéutico.

En algunas realizaciones, dado que los péptidos activos o los péptidos quiméricos divulgados en el presente documento pueden contener cadenas laterales o extremos con carga, pueden incluirse en cualquiera de las formulaciones anteriores como un ácido o una base libre o como una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser aquellas que conservan sustancialmente la actividad biológica de una base libre y se preparan por reacción con un ácido inorgánico. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en agua y en otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.

El péptido activo o el péptido quimérico se usa en una cantidad eficaz para lograr el propósito previsto (por ejemplo, para reducir el efecto dañino de las lesiones por ictus y las afecciones relacionadas). Una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad del péptido activo o del péptido quimérico suficiente para reducir significativamente las lesiones causadas por el ictus en los pacientes (o en una población animal de modelo) tratados con el péptido activo 0 el péptido quimérico divulgado en el presente documento, en comparación con la lesión del sistema nervioso central en una población de pacientes de control (o animales de modelo) no tratados con el péptido activo o el péptido quimérico divulgado en el presente documento. Si un paciente tratado logra un mejor resultado en comparación con un resultado medio (determinado por el volumen de infarto o el índice de discapacidad) en una población de pacientes de control comparable no tratados mediante los métodos divulgados en el presente documento, la cantidad también se considera terapéuticamente eficaz. La cantidad también se considera una cantidad terapéuticamente eficaz. Si un paciente tratado muestra 2 o menos puntuaciones de discapacidad en la escala de Rankin y 75 o más puntuaciones en la escala de Barthel, la cantidad también se considera una cantidad terapéuticamente eficaz. Si una población de pacientes tratados muestra una distribución de la puntuación significativamente mejorada (es decir, menos discapacidad) en la escala de discapacidad en comparación con poblaciones comparables no tratadas, la dosis también se considera terapéuticamente eficaz, véase Lees et al. N Engl J Med 2006; 354: 588-600. Un régimen terapéuticamente eficaz representa una combinación de una dosis terapéuticamente eficaz y una frecuencia de administración necesaria para lograr el propósito previsto anteriormente. Por lo general, una sola administración puede ser suficiente.

En algunas realizaciones, un intervalo de dosis preferido comprende de 0,001 a 20 mmol del péptido activo o del péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente en un plazo de las 6 horas posteriores al ictus, opcionalmente de 0,03 a 3 mmol del péptido activo o del péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente. En algunos métodos, se administran de 0,1 a 20 mmol del péptido activo o del péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente en un plazo de 6 horas. En algunos métodos, se administran 0,1-10 mmol del péptido activo o del péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente en un plazo de 6 horas, más preferentemente, se administran aproximadamente 0,3 mmol del péptido activo o del péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente en un plazo de 6 horas. En otros casos, el intervalo de dosis es de 0,005 a 0,5 mmol del péptido activo o del péptido quimérico por kg de peso corporal del paciente. La dosis por kg de peso corporal puede convertirse desde las ratas a los seres humanos dividiendo por 6,2 para compensar la diferente área superficial: relaciones en masa. En gramos, la dosis adecuada del péptido activo o del péptido quimérico para uso humano puede incluir de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal del paciente, o más preferentemente de 0,01 a 30 mg/kg de peso corporal del paciente o de 0,01 a 10 mg/kg, o de 0,01 a 1 mg/kg.

En algunas realizaciones, la cantidad administrada del péptido activo o del péptido quimérico depende del sujeto que se esté tratando, del peso corporal del sujeto, de la gravedad del dolor, del modo de administración y de los ajustes por parte del médico prescriptor. El tratamiento puede repetirse cuando los síntomas sean detectables o incluso indetectables. El tratamiento puede proporcionarse solo o en combinación con otros fármacos.

En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del péptido activo o del péptido quimérico divulgado en el presente documento es capaz de proporcionar un beneficio terapéutico sin causar una toxicidad significativa. La toxicidad del péptido quimérico puede determinarse en cultivos celulares o en animales de experimentación mediante procedimientos farmacéuticos convencionales, por ejemplo, determinando la DL⁵⁰ (dosis que mata al 50 % de la población) o la DL¹⁰⁰ (dosis que mata al 100 % de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y el efecto terapéutico es el índice terapéutico. Se prefieren los péptidos quiméricos o los peptidomiméticos que presentan altos índices terapéuticos (véase, por ejemplo, Fingl et al, 1975, En: The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, página 1).

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se usa para tratar, mejorar o prevenir una lesión del sistema nervioso o una enfermedad o un dolor causado por la lesión, o usarse como agente neuroprotector. En algunas realizaciones, la lesión del sistema nervioso es la causada por la neurotoxicidad excitadora, en donde la lesión se localiza en el sistema nervioso periférico o en el sistema nervioso central.

En algunas realizaciones, la lesión del sistema nervioso causada por la neurotoxicidad excitadora comprende una lesión seleccionada del grupo que consiste en un ictus o una lesión de la médula espinal, una lesión isquémica o traumática en el cerebro o la médula espinal, una lesión de una neurona del sistema nervioso central (SNC), incluyendo una lesión aguda del SNC, un ictus isquémico o una lesión de la médula espinal, una hipoxia, una isquemia o una lesión mecánica, y una lesión causada por una enfermedad neurodegenerativa, ansiedad, epilepsia o ictus. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se usa para tratar, mejorar o prevenir una lesión del sistema nervioso causada por un ictus isquémico.

El ictus es una afección causada por la alteración del flujo sanguíneo en el SNC. Las posibles causas incluyen embolia, hemorragias y trombosis. Algunas neuronas mueren inmediatamente debido al deterioro del flujo sanguíneo. Estas células liberan las moléculas que las componen (incluyendo ácido glutámico), que a su vez activan el receptor del NMDA, lo que aumenta los niveles de calcio intracelular y los niveles de enzimas intracelulares, provocando la muerte de más neuronas (amplificación de la cascada de neurotoxicidad excitadora). La muerte de los tejidos del SNC se denomina infarto. El volumen de infarto (es decir, el volumen de neuronas muertas en el cerebro causado por el ictus) puede usarse como indicador de la magnitud de las lesiones patológicas causadas por el ictus. Los efectos sintomáticos dependen tanto del volumen del infarto como de la localización del infarto en el cerebro. El índice de discapacidad puede usarse como medida de las lesiones sintomáticas, tal como la escala de resultados de ictus de Rankin (Rankin, Scott MedJ; 2: 200-15 (1957) y el índice de Barthel. La Escala de Rankin se basa en una evaluación directa del estado sistémico del paciente de la siguiente manera.

0: absolutamente ningún síntoma.

1: con síntomas, pero ninguna discapacidad significativa; capaz de realizar todo el trabajo y actividades diarias.

2: discapacidad leve; no puede realizar todas las actividades anteriores, pero es capaz de ocuparse de sí mismo sin ayuda.

3: discapacidad moderada que requiere cierta ayuda, pero capaz de caminar sin ayuda.

4: discapacidad de moderada a grave, incapaz de caminar sin ayuda e incapaz de atender sus propias necesidades corporales sin ayuda.

5: discapacidad grave; postrado en cama, incontinencia, y que requiere cuidados y atención de larga duración.

El índice de Barthel se basa en una serie de preguntas sobre la capacidad del paciente para realizar 10 actividades básicas de la vida diaria, que se puntúan entre 0 y 100, las puntuaciones más bajas indican más discapacidad (Mahoney et al., Maryland State Medical Journal) 14: 56-61 (1965).

Alternativamente, la gravedad/resultado del ictus puede medirse usando la escala de ictus del NIH, que está disponible en Internet en ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf. La Escala se basa en la capacidad del paciente para realizar 11 conjuntos de funciones, incluyendo la evaluación de la consciencia del paciente, el movimiento, los sentimientos y los niveles de función del lenguaje.

El ictus isquémico especifica más claramente un tipo de ictus causado por la obstrucción del flujo sanguíneo al cerebro. La patología potencial de dichas obstrucciones se asocia más comúnmente con la aparición de depósitos grasos a lo largo de las paredes de los vasos sanguíneos. Esta afección se denomina aterosclerosis. Estos depósitos grasos pueden causar dos tipos de obstrucción. La trombosis cerebral se refiere a un trombo (coágulo de sangre) formado en una parte bloqueada de un vaso sanguíneo. La "embolia cerebral" suele significar que varios émbolos de la sangre (tales como un trombo en la pared del corazón, una placa aterosclerótica, grasa, células tumorales, fibrocartílago o aire) entran en la arteria cerebral junto con el flujo sanguíneo para bloquear los vasos sanguíneos. Cuando la circulación colateral no es suficiente para la compensación, provoca una necrosis isquémica del tejido cerebral al que suministra sangre la arteria, y un deterioro neurológico focal. La segunda causa importante de embolia es un latido cardíaco irregular denominado fibrilación arterial. Provoca una afección en la que se puede formar un coágulo de sangre en el corazón, que luego se desplaza y se traslada al cerebro. Otras causas potenciales del ictus isquémico son hemorragias, trombosis, corte arterial o venoso, paro cardíaco, choque por cualquier causa (incluyendo una hemorragia), y causas yatrógenas, tales como lesiones quirúrgicas directas en los vasos sanguíneos cerebrales o en los vasos sanguíneos que van al cerebro o una cirugía cardíaca. El ictus isquémico representa aproximadamente el 83 % de todos los casos de ictus.

Otros diversos trastornos neurológicos también pueden causar la muerte de neuronas a través de la neurotoxicidad excitadora mediada por el NDMAR. Estos trastornos incluyen enfermedades neurodegenerativas, ansiedad, epilepsia, hipoxia, daños en el SNC no relacionados con el ictus, tales como lesiones traumáticas cerebrales y lesiones de la médula espinal. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la composición farmacéutica se usa para tratar, mejorar o prevenir las enfermedades neurodegenerativas, la ansiedad o la epilepsia, en donde las enfermedades neurodegenerativas pueden comprender la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson o la corea de Huntington.

En un cuarto aspecto, en la presente solicitud se proporciona un método para tratar, mejorar o prevenir una lesión del sistema nervioso y una enfermedad o dolor asociado a la lesión, una enfermedad neurodegenerativa, la ansiedad o la epilepsia, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un péptido como se describe en el primer aspecto o un péptido quimérico como se describe en el segundo aspecto, o una composición farmacéutica como se describe en el tercer aspecto.

En algunas realizaciones, la lesión del sistema nervioso causada por la neurotoxicidad excitadora comprende una lesión seleccionada del grupo que consiste en un ictus o una lesión de la médula espinal, una lesión isquémica o traumática en el cerebro o la médula espinal, una lesión de una neurona del sistema nervioso central (SNC), incluyendo una lesión aguda del SNC, un ictus isquémico o una lesión de la médula espinal, una hipoxia, una isquemia o una lesión mecánica, y una lesión causada por una enfermedad neurodegenerativa, ansiedad, epilepsia o ictus.

En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa incluye la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson o la corea de Huntington.

En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto que padece un ictus isquémico. En algunas realizaciones, la administración de un péptido como se describe en el primer aspecto de la presente solicitud, o de un péptido quimérico como se describe en el segundo aspecto, o de una composición farmacéutica como se describe en el tercer aspecto, puede reducir el volumen de la porción de infarto cerebral causado por la isquemia cerebral.

En un quinto aspecto, en la presente solicitud se proporciona el uso de un péptido como se describe en el primer aspecto, o de un péptido quimérico como se describe en el segundo aspecto, o de una composición farmacéutica como se describe en el tercer aspecto, en la preparación de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir una lesión del sistema nervioso y una enfermedad o dolor asociado a la lesión, una enfermedad neurodegenerativa, ansiedad o epilepsia, o en la preparación de un agente neuroprotector.

En algunas realizaciones, la lesión del sistema nervioso causada por la neurotoxicidad excitadora comprende una lesión seleccionada del grupo que consiste en un ictus o una lesión de la médula espinal, una lesión isquémica o traumática en el cerebro o la médula espinal, una lesión de una neurona del sistema nervioso central (SNC), incluyendo una lesión aguda del SNC, un ictus isquémico o una lesión de la médula espinal, una hipoxia, una isquemia o una lesión mecánica, y una lesión causada por una enfermedad neurodegenerativa, ansiedad, epilepsia o ictus.

En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa incluye la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson o la corea de Huntington.

En algunas realizaciones, el fármaco se usa para tratar, mejorar o prevenir una lesión del sistema nervioso causada por un ictus isquémico.

Debe entenderse que la descripción detallada anterior sólo pretende ayudar a los expertos en la materia a comprender más claramente la presente solicitud, pero no pretende limitar en modo alguno la presente solicitud. Los expertos en la materia pueden hacer modificaciones y cambios en las realizaciones descritas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar algunas realizaciones de la presente solicitud, sin ningún propósito o naturaleza limitante.

Ejemplo 1: Cribado de moléculas peptídicas activas

Tomando como base los resultados del estudio, se seleccionó el péptido transmembranario Tat YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2) y se ligó a varios números de aminoácidos para formar una biblioteca de péptidos. Se ensayó la interacción de las moléculas de péptidos quiméricos de la biblioteca de péptidos con el dominio PDZ1/2 expresado y purificado in vitro, y los polipéptidos se sometieron a un cribado preliminar de la fortaleza de la fuerza de interacción. La molécula de fase inmóvil (ligando) era la proteína PDZ1/2 con un peso molecular de aproximadamente 20 kD a una concentración de 2 mg/ml. La molécula de la fase móvil (analito) era un polipéptido que había que cribar con un peso molecular de aproximadamente 2 kD a una concentración de 10 mg/ml. Para la fijación se usó el chip CM5 mediante un instrumento Biacore 3000. El tampón de electroforesis era PBS más Tween 20 al 0,005 %. La fijación se llevó a cabo mediante un método de acoplamiento con amino. La concentración del ligando era de 10 mg/ml. El tampón de fijación era acetato sódico 10 mM, a pH 4,0. La cantidad fija era de 1400 UR, que se fijó en la celda de flujo 2. El caudal usado fue de 10 pl/ml y el ligando se cargó durante 1 minuto. Se utilizó Gly 10 mM a pH 2,0 2,5 como regenerante. La regeneración se llevó a cabo a un caudal de 30 pl/min. El tiempo de carga fue de 30 s.

El análisis cinético se llevó a cabo en las siguientes condiciones.

canal de control: celda de flujo 1:

tampón de electroforesis: PBS;

modo: Asistente de análisis cinético;

gradientes de concentración: 6.25n, 12.5n, 25n, 50n, 100n, 200n, 400 nM;

tiempo de carga: 1 minuto;

tiempo de disociación: 2 min; y

caudal: 30 pl/min.

Los datos se ajustaron usando el programa informático de ajuste Biaevaluation 4.1. El modelo de ajuste era un modelo de unión 1:1. El valor de la constante de disociación KD era inversamente proporcional a la fuerza de interacción. Mediante el cribado se obtuvo un péptido quimérico con capacidad de interacción fuerte con el dominio PDZ1/2, y se denominó P5. La secuencia del péptido quimérico se mostró a continuación.

P5: YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (SEQ ID NO: 3)

Para poder comparar directamente con un péptido quimérico similar en los estudios notificados, se introdujo un péptido quimérico de control NA-1 con la siguiente secuencia.

NA-1: YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 4)

Adicionalmente, comparando P5 con NA-1 según sus diferencias estructurales, se introdujo adicionalmente un péptido quimérico YE-NA-1 que tenía dos residuos de YE añadidos en el extremo amínico del péptido activo del péptido quimérico NA-1, y su secuencia se muestra a continuación.

YE-NA-1: YGRKKRRQRRRYEKLSSIESDV (SEQ ID NO: 5)

Los péptidos quiméricos NA-1, YE-NA-1 y P5 se sometieron simultáneamente a ensayos de interacción con el dominio PDZ1/2, como se ha mencionado anteriormente, y los resultados se mostraron en la siguiente Tabla 1.

T a l 1. D i n l f rz in r i n nr r i im ri l mini PDZ1/2

Como se muestra en la Tabla 1, los péptidos quiméricos YE-NA-1 y P5 interactuaron más fuertemente con el dominio PDZ1/2 en comparación con el péptido quimérico de control NA-1, y el rendimiento de P5 era incluso mejor. Por lo tanto, sobre la base de la especulación de los inventores, los dos residuos de aminoácidos adicionales YE en el extremo amínico del péptido activo causaron cierto efecto mejorado en la interacción del polipéptido con el dominio PDZ1/2. Adicionalmente, el P5 carecía de dos serinas débilmente hidrófobas (SS) con respecto al extremo carboxílico de YE-NA-1. Sobre la base de la especulación de los inventores, esto puede aumentar aún más la interacción del polipéptido con el dominio PDZ1/2.

El péptido quimérico P5 se seleccionó para ensayos adicionales en los siguientes experimentos, y en algunos experimentos, se usaron NA-1 y YE-NA-1 como controles.

Ejemplo 2: Ensayo de precipitación con centrifugación para verificar la interacción de P5 con el dominio PDZ1/2 Para confirmar que P5 puede interactuar con el dominio PDZ1/2, se realizó un ensayo de precipitación con centrifugación.

La columna se equilibró con 100 |jl de perlas de His y 1 ml de tampón MCAC-0 durante 5 minutos, y se agitó a 4 °C. La mezcla se centrifugó a 5000 g durante 1 minuto a 4 °C, y el sobrenadante se desechó. Se añadió 1 mg de proteína PDZ1/2 a la mezcla, y se añadió un tampón para alcanzar el volumen de 1 ml. La mezcla se centrifugó para su unión durante 1 hora a 4 °C. La mezcla se centrifugó a 5000 g durante 1 minuto a 4 °C, y el sobrenadante se desechó. La mezcla se lavó tres veces con 1 ml de tampón MCAC-0 durante 5 minutos cada vez (a 4 °C, lavado con agitación). Se añadió 1 mg de proteína P5 a la mezcla, y se añadió un tampón para alcanzar el volumen de 1 ml. La mezcla se centrifugó para su unión durante 2 horas a 4 °C. La mezcla se centrifugó a 5000 g durante 1 minuto a 4 °C, y el sobrenadante se desechó. La mezcla se lavó tres veces con 1 ml de tampón de lisis durante 5 minutos cada vez (a 4 °C, lavado con agitación). Se añadieron 20 j l de MCAC-300 después del lavado. Después de la centrifugación, el eluido se tomó para un ensayo de SDS-PAGE. En la figura 1 se mostraron los resultados experimentales.

Como se muestra en la figura 1, tanto el P5 como el dominio PDZ1/2 estaban contenidos en la banda eluida del péptido quimérico P5, confirmando así que el péptido quimérico P5 puede unirse al dominio PDZ1/2.

Ejemplo 3: Efecto terapéutico del péptido quimérico en ratas del modelo de MCAO

Método de preparación y norma de puntuación de la MCAO

El modelo de isquemia-reperfusión cerebral focal se preparó según el método de sutura de oclusión reversible de la arteria cerebral media (MCAO) propuesto por Longa con modificaciones en vista de la estructura anatómica del cerebro de rata. Las ratas se anestesiaron mediante la administración intraperitoneal de hidrato de cloral al 10 % a una dosis de 0,3 ml/kg. Después de la anestesia, se creó un corte en la línea media cervical y se expusieron la arteria carótida común (CCA), la arteria carótida externa (ECA) y la arteria pterigopalatina. La parte de la cabeza (0,5 cm) de un sedal de nailon monofilamento (0,26 mm) se recubrió con parafina y se hizo una marca a 20 mm. Se introdujeron a través de la incisión de la CCA derecha de todas las ratas, y la arteria pterigopalatina se pinzó temporalmente para evitar una mala inserción. La longitud de la línea de oclusión era de aproximadamente 18-20 mm desde la bifurcación de la CCA, dependiendo del peso del animal, ocluyendo así la arteria cerebral media del lado derecho. A continuación se cosió la piel y se fijó parcialmente el extremo de la línea de oclusión a la piel. Tras un periodo de isquemia de 2 horas, la línea de oclusión se retiró cuidadosamente para formar una reperfusión. Las etapas del procedimiento para el control de referencia fueron las mismas que para el grupo de cirugía, excepto por la inserción de un sedal de nailon. La temperatura corporal se mantuvo a 37 ± 0,5 °C durante el periodo de isquemia y 2 h después de la reperfusión. El marcador de éxito del modelo es que las ratas, después de despertar de la anestesia, mostraban la pata izquierda paralizada, eran inestables de pie y giraban hacia un lado cuando se levantaban sus colas.

Los signos de defectos neurológicos se puntuaron según el método de 5 puntuaciones de Longa y Bederson a 24 horas después de que los animales despertaran de la anestesia.

0: ningún síntoma de daño nervioso;

1: incapaz de extender completamente la pata delantera contralateral;

2: gira hacia el lado opuesto;

3: cae hacia el lado opuesto;

4: incapaz de caminar espontáneamente y pérdida de consciencia.

Cuanto más alta era la puntuación, más grave era el trastorno de comportamiento del animal.

Animales y materiales de experimentación

Los animales usados eran ratas SD macho adultas (Vittalia) de grado SPF con un peso corporal de 220-250 g.

Los instrumentos usados incluían unas tijeras rectas, dos tijeras de cirugía ocular, cuatro pinzas curvas, suturas quirúrgicas del 4 #, 5#, 6317 agujas triangulares, una línea de oclusión (0,26 mm de diámetro) y un portaagujas. Los agentes usados incluían solución inyectable de cloruro sódico de Enbipu (Shijiazhuang Group NBP Pharmaceutical Co., Ltd.), hidrato de cloral, furosemida (20 mg/vial), sulfato de gentamicina (80 mg/vial), hisopos de algodón y bandejas médicas. Los péptidos del ensayo fueron sintetizados por Kingsray Biotech Inc.

Agrupaciones del experimento

Los animales experimentales se dividieron en grupo de control negativo, grupo de referencia, grupo de modelo, grupo de Enbipu de fármacos positivos, grupo de NA-1, grupo de YE-NA-1 y grupo de P5. Se administraron, respectivamente, una solución salina de fármaco positivo de Enbipu, NA-1 (10 mg/kg), YE-NA-1 (10 mg/kg) y P5 (10 mg/kg, 3 mg/kg y 1 mg/kg) a cada grupo individual de ratas mediante una inyección en la vena de la cola 1 hora después de la isquemia. No se administró ningún fármaco al grupo normal ni al grupo de referencia.

Cálculo del volumen del infarto

Las ratas fueron sacrificadas por decapitación después de la puntuación. Los tejidos cerebrales se extrajeron rápidamente y se colocaron en un refrigerador a -20 °C. Después de 10 minutos, los tejidos se colocaron en un entorno a la temperatura ambiente. Los cerebros se colocaron en un molde de sección de cerebro de rata. Después del bulbo olfativo, se extirparon el cerebelo y el tronco encefálico inferior, los cerebros se cortaron en corona cinco veces con un espesor de 2 mm, como se muestra en el perfil, para obtener seis cortes en corona continuos en bruto. Después, las secciones cerebrales se colocaron rápidamente en 5 ml de una solución de que contenía un 2 % de TTC, y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad, durante lo cual las secciones cerebrales fueron volteadas una vez cada 5 minutos. Con la tinción de TTC, el tejido normal sería de color rojo rosado, y el tejido infartado no se teñiría y se mantendría de color blanco. Cada grupo de secciones cerebrales se dispuso ordenadamente y se fotografió. Las fotos se procesaron con un programa informático de sistema de análisis de imágenes y se analizaron estadísticamente. Se calculó el área de infarto de cada sección cerebral y se multiplicó por el espesor de cada sección cerebral (2 mm). Los productos del área de infarto de cada sección cerebral individual multiplicados por el espesor se sumaron entre sí para obtener el volumen de infarto cerebral de cada animal. Los volúmenes se expresaron en porcentajes teniendo en cuenta el hemisferio cerebral para eliminar los efectos del edema cerebral.

Resultados experimentales

En la figura 2 se mostraron los resultados experimentales. Se trazó un histograma estadístico de los datos del volumen de infarto cerebral, como se muestra en la fig. 3, basado en el análisis estadístico de los datos del volumen de infarto cerebral de la fig. 2, y los datos estadísticos específicos del volumen de infarto cerebral se proporcionaron en la siguiente Tabla 2. Los resultados mostraron que la administración terapéutica y la administración profiláctica de la dosis más alta (10 mg/kg) de P5 podían reducir significativamente el volumen de infarto cerebral de las ratas sometidas a isquemia cerebral en aproximadamente un 50 % (p<0,01), mientras que en el grupo de inyección de fármaco positivo de Enbipu, sólo se observó una reducción de aproximadamente el 16 % (p<0,01), en el grupo de NA-1 se observó una reducción de aproximadamente el 16 % (p<0,01), y en el grupo de YE-NA-1 se observó una reducción de aproximadamente el 26 % (p<0,01). La administración terapéutica y la administración profiláctica de la segunda dosis más alta (3 mg/kg) de P5 también redujeron deseablemente el volumen de infarto cerebral. Además, los datos mostraron que el valor del volumen del infarto disminuyó al aumentar la dosis de P5, lo que indicaba que el efecto terapéutico estaba positivamente correlacionado con la dosis del fármaco. El efecto terapéutico del polipéptido YE-NA-1 fue significativamente mejor que el observado para el NA-1. Sobre la base de la especulación de los inventores, la adición de dos aminoácidos Ye puede dar lugar a un mejor efecto terapéutico que el NA-1, al mejorar la interacción del polipéptido con el dominio PDZ1/2.

T l 2. Ef r i l li i P n r l m l M A

continuación

Ejemplo 4: Distribución de P5 en el cerebro de rata

A las ratas normales de control y a las ratas del modelo de MCAO se les inyectó, respectivamente, a través de la vena de la cola, una solución salina que contenía el polipéptido marcado fluorescentemente FITC-P5 (10 mg/kg) 1 hora después de la modelización. Las ratas se sacrificaron 12 horas después de la administración. Los tejidos cerebrales se extrajeron rápidamente y se colocaron en un sistema de obtención de imágenes de cuerpo vivo para animales pequeños para la detección de la fluorescencia. Una vez completada la detección de fluorescencia, los tejidos cerebrales se colocaron en la solución de colorante de TTC para su tinción, con el fin de determinar la correlación entre el área isquémica y la distribución del fármaco. Como se muestra en las figuras 4 y 5, el cerebro normal de la rata pudo teñirse completamente con TTC y no hubo distribución del polipéptido marcado fluorescentemente, mientras que la región isquémica del cerebro de la rata isquémica no pudo teñirse con TTC, y el polipéptido marcado fluorescentemente se distribuyó en la región isquémica, siendo la región de la arteria media la región isquémica central, lo que sugiere que el polipéptido P5 podría dirigirse a la región isquémica y ejercer un efecto terapéutico, y su cantidad de distribución estaba positivamente correlacionada con el grado de isquemia.

Ejemplo 5: Tinción con HE para la observación de los cambios histológicos

Las ratas de cada grupo fueron decapitadas 24 horas después de la isquemia, y el cerebro resultante se seccionó en coronas cerca del quiasma óptico con un espesor de aproximadamente 4 pm. Las secciones se fijaron con una solución de formalina al 10 % y se deshidrataron con alcohol con un gradiente de concentración del 70 % al 100 %. Las secciones se permeabilizaron dos veces en xileno y se incrustaron en parafina. El bloque de parafina se recortó cuidadosamente y se inmovilizó en una máquina de corte de parafina, y se cortó en secciones con un espesor de 4 mm. Las secciones de parafina se desplegaron completamente, se adhirieron a un portaobjetos de vidrio limpio y seco, y se almacenaron en un refrigerador a 4 °C. Se realizó la tinción con HE convencional y los resultados de la tinción se observaron mediante microscopia óptica.

En la fig. 6 se mostraron los resultados experimentales. Las células nerviosas del tejido cerebral normal mostraban un núcleo claro, un núcleo redondo y una membrana nuclear intacta. Los tejidos cerebrales del lado isquémico de las ratas del grupo del modelo isquémico mostraron una grave necrosis de las neuronas, hinchazón de las células, condensación nuclear, citoplasma suelto y teñido ligeramente, y vacuolización. Para el grupo de administración terapéutica y el grupo de administración profiláctica de P5 a 10 mg/kg, los cambios patológicos anteriores habían mejorado significativamente, y los resultados fueron mejores que los grupos de administración de la solución inyectable del fármaco positivo de Enbipu, NA-1 y YE-NA-1 (10 mg/kg).

Ejemplo 6: Evaluación de la toxicidad aguda

En la fig. 6 se mostraron los resultados experimentales. Las células nerviosas del tejido cerebral normal mostraban un núcleo claro, un núcleo redondo y una membrana nuclear intacta. Los tejidos cerebrales del lado isquémico de las ratas del grupo del modelo isquémico mostraron una grave necrosis de las neuronas, hinchazón de las células, condensación nuclear, citoplasma suelto y teñido ligeramente, y vacuolización. Para el grupo de administración terapéutica y el grupo de administración profiláctica de P5 a 10 mg/kg, los cambios patológicos anteriores habían mejorado significativamente, y los resultados fueron mejores que los grupos de administración de la solución inyectable del fármaco positivo de Enbipu, NA-1 y YE-NA-1 (10 mg/kg).

Ejemplo 6: Evaluación de la toxicidad aguda

Se realizaron ensayos de toxicidad aguda en ratas. Los resultados mostraron que el P5 no tenía ningún efecto mortal

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) o una variante funcional de la misma, en donde la variante funcional se obtiene realizando una o más sustituciones conservativas en YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1), en donde el péptido es capaz de unirse al dominio PDZ1/2 de la PSD-95 e inhibe la interacción entre el NMDAR y la PSD-95.

2. El péptido de la reivindicación 1, en donde la variante funcional es una variante generada por una o más sustituciones conservativas en el segmento LDTEI de la SEQ ID NO: 1, preferentemente la sustitución conservativa se selecciona del grupo que consiste en una sustitución entre D y E, una sustitución entre L, V e I, y una sustitución entre T y S.

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la variante funcional es una variante generada por la sustitución del segmento LDTEI de la SEQ ID NO: 1 por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en LDTEL, LDTEV, LDTDI, LDTDL, LDTDV, LDSEI, LDSEL, LDSEV, LDSDI, LDSDL, LDSDV, LETEI, LETEL, LETEV, LETDI, LETDL, LETDV, VDTEI, VDTEL, VDTEV, VDTDI, VDTDL, VDTDV, IDTEI, IDTEL, IDTEV, IDTDI, IDTDL, IDTDV, IETEI, IETEL, IETEV, IETDI, IETDL e IETDV.

4. Un péptido quimérico que comprende un péptido activo y un péptido de internalización, en donde el péptido activo es un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y el péptido de internalización facilita la captación del péptido quimérico por parte de una célula.

5. El péptido quimérico de la reivindicación 4, en donde el péptido de internalización comprende la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2).

6. El péptido quimérico de la reivindicación 5, que comprende la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (SEQ ID NO: 3).

7. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un péptido quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para usar en el tratamiento, la mejora o la prevención de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una lesión del sistema nervioso o el dolor causado por la lesión, una enfermedad neurodegenerativa, ansiedad y epilepsia en un mamífero, o para usar como agente neuroprotector.

9. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad es un ictus o una lesión del sistema nervioso causada por un ictus.

10. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el ictus comprende un ictus isquémico, un ictus hemorrágico y un ictus hemorrágico convertido desde ictus isquémico.

11. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el ictus es un ictus isquémico.

12. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la lesión del sistema nervioso es una lesión del sistema nervioso causada por neurotoxicidad excitadora.

13. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la lesión o el dolor se localiza en el sistema nervioso periférico o en el sistema nervioso central.

14. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la lesión del sistema nervioso causada por la neurotoxicidad excitadora comprende una lesión seleccionada del grupo que consiste en un ictus o una lesión de la médula espinal, una lesión isquémica o traumática en el cerebro o la médula espinal, una lesión de una neurona del sistema nervioso central (SNC), incluyendo una lesión aguda del SNC, un ictus isquémico o una lesión de la médula espinal, una hipoxia, una isquemia o una lesión mecánica, y una lesión causada por una enfermedad neurodegenerativa, ansiedad, epilepsia o ictus.

15. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad neurodegenerativa comprende la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson o la corea de Huntington.