CN101134780A - 阻断nr2b信号通路的多肽类似物及其制备方法和药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用基因工程方法生产的重组NMDA受体NR2B亚型C-末端的融合蛋白,编码该融合蛋白的多核苷酸以及制备和纯化该融合蛋白的方法,其中该融合蛋白由NMDA受体NR2B亚基的PSD95结合域片段和HIV编码的Tat蛋白转导域片段组成。同时,在两个片段中间插入了一个流感病毒的血凝素标记片段。该融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达,且纯化工艺简单,利于进一步的大规模制备。本发明所获得的Tat-HA-NR2B9C多肽,能够阻断细胞内NMDA受体和PSD95的相互作用,抑制了NMDA受体介导的兴奋性神经毒性作用,对神经具有保护作用。可用于治疗脑卒中等神经相关疾病。
Description
(一)技术领域
在医学的神经生物学领域,通常可以使用针对受体的肽类阻断剂治疗神经性疾病。本发明涉及一种多肽类似物的方法,特别是一种阻断NMDA受体和PSD-95蛋白质之间信号转导的多肽类似物的分子设计和制备方法。
(二)技术背景
N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体是一种门控离子通道复合物,作为兴奋性氨基酸受体之一,主要分布于大脑皮层、海马、纹状体等部位,是兴奋性氨基酸递质传递的重要基础,同时是维持中枢神经系统功能正常的关键因素。在生理状态下,NMDA受体不仅介导了突触可塑性,神经元生长和分化,还通过突触后的信号调控突触的去极化以维持一定的生理功能。尽管兴奋性氨基酸信号对于维持大脑的生理功能非常重要,但是同时也是引起神经障碍性疾病的关键因素。在脑卒中的发病机制中,NMDA受体参与很多病理变化和生化过程。通过对脑缺血模型的病理研究发现,NMDA受体过度激活引起大量的Ca2+内流,细胞内Ca2+的瞬间变化会触发兴奋性毒性,并导致蛋白酶、核酸内切酶的激活、一氧化氮(NO)的生成、自由基的产生以及线粒体膜渗透性的改变,从而导致神经元的损伤和死亡,显然,NMDA受体在缺血性脑损伤中起关键作用。因此,NMDA受体已经成为防治脑卒中等神经性疾病药物研制的重要靶点之一。
大量的临床前理论研究认为NMDA受体拮抗剂可以治疗缺血性脑损伤,如:selfotel、eliprodil、licostinel、lanicemine、UK2240455、SM231900等。但是,所有临床研究使用的NMDA受体拮抗剂均因疗效不确切或严重不良反应而被停用。NMDA受体属配基和电压双门控的Ca2+离子通道,现已发现并克隆出的NMDA受体亚单位有NR1、NR2(包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D4种)、NR3和NR4亚单位。NR1在中枢神经系统内广泛分布,是NMDA受体必需的亚单位;NR2、NR3和NR4则呈特异性分布。NMDA受体在不同脑区可以由不同的亚单位组成,并产生不同的电生理学及药理学特性。NMDA受体两种不同的亚单位NR2A和NR2B介导细胞内不同信号通路,对脑源性神经营养因子(BDNF)的表达和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化的激活有不同的作用。NR2B与PSD95蛋白结合产生一系列神经毒性反应,引起了神经元的死亡或凋亡。PSD-95通过第二个PDZ结构域与NMDA受体的NR2B羧基端的tSXV基序结合,同时也可以与神经元型一氧化氮合酶(nNOS,neuronal nitric oxidesynthase)结合,过度激活nNOS,NO的大量释放,从而引起神经兴奋毒性,导致脑卒中等疾病发生。选择性的NR2B拮抗剂是目前抗脑卒中药物研究的热点。有实验表明,体内基因突变或者体外抑制PSD-95的表达并不影响NMDA受体的活性,PSD-95缺失可以引起NO生成减少,降低NMDA受体过度激活导致的神经兴奋毒性。本实验室的研究还发现,NMDAR/PSD-95/nNOS偶联通路对神经元再生起抑制作用。因此阻断该通路的信号传导可能有利于减轻缺血性损伤,促进脑卒中后神经元的再生,从而改善脑缺血诱导的记忆功能损伤。从治疗的角度看,抑制或者突变NMDA受体是不可行的,因为NMDA受体具有广泛的生理效应,NMDA受体水平的改变将严重干扰机体功能。临床数据也说明NMDA受体拮抗剂是无效,甚至是有害的。但我们可以通过引入药物解除PSD-95与NMDA受体的偶联,阻断该通路的信号传导,避免不利因素,同时并不影响NMDA受体的其他生理功能。由此,探索NMDA受体/PSD-95解偶联剂成为我们寻找抗脑卒中等神经疾病药物的新策略。
NMDA受体介导缺血性脑损伤同时也介导生理状态下必需的神经兴奋,通常的NMDA受体的拮抗在阻断NMDA受体下游信号传导的同时,也影响NMDA受体介导的生理状态下的Ca2+内流。近年来,出现了一些针对蛋白相互作用的结合域而设计的小干扰肽,已经解决了这个问题。比如,为了治疗缺血性脑损伤的同时不影响的正常生理功能,可以参照NMDA受体与PSD95相互作用的结合域序列,人工合成一段小肽,这些合成的小肽能够干扰NMDA受体与PSD95相互结合,阻止了NMDA受体介导的一系列神经毒性生理反应。这种针对靶点的干扰肽进一步与跨膜片段如Tat等相连形成的杂合肽,能够穿透细胞膜,而发挥药效作用。因此,针对NMDA受体的PSD95结合域的多肽有可能成为一种用于治疗脑卒中的重要手段。
(三)发明内容
本发明的目的之一是提供一种干扰细胞膜NMDA受体与PSD95分子偶联的方法。
本发明的目的之二是提供一种可跨过细胞膜的选择性阻断NMDA受体NR2B亚型的多肽类似物。
本发明的目的之三是提供制备该多肽类似物的方法。
本发明的目的之四是提供该多肽类似物的治疗用途。
本发明的目的之五是提供该多肽类似物的药用组成形式,即与适当药物载体制成药物组合物。
在本发明的第一方面,提供了一种干扰细胞膜NMDA受体与PSD95分子偶联的方法。其主要设计是:跨膜片段(Tat)、标记片段、膜受体的下游分子结合域的线性连接形成一个杂合蛋白质分子,其分子构成为:“跨膜片段-标记片段-结合域片段”。这种选择性阻断方法的原理是::(1).细胞膜受体的下游分子结合域肽进入细胞以后,能够主动与膜受体下游分子结合,干扰了细胞内正常的膜受体与其下游分子的结合;(2).引入的Tat蛋白,能够携带融合多肽片段跨过细胞膜发挥作用,而Tat本身不产生细胞毒性;(3).标记片段如HA等,为药物的临床前研究和神经生物学的实验研究提供了一种分析的标签,对细胞不产生影响。
在本发明的第二方面,提供了一种阻断NMDA受体NR2B亚型与PSD95反应的多肽类似物。该多肽采用本发明的第一方面所述的方法进行设计。在多肽分子中,跨膜片段(Tat)等于Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg,是HIV-1编码的调控蛋白中第47~57位具有转导作用的氨基酸残基序列;为了叙述方便,在实施例中,本发明含跨膜片段用“Tat”表示。标记片段是指来源于流感病毒的血凝素(但不限于)的9个氨基酸组成肽表位,其氨基酸排序是Tyr-Phe-Tyr-Asp-Val-Phe-Asp-Val-Ala;为了叙述方便,在实施例中,本发明所采用的标记肽段用“HA”表示。在本发明中,膜受体的下游分子结构域片段是来源于NMDA受体NR2B亚单位羧基端的9个氨基酸的多肽,氨基酸排列顺序是Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val;为了叙述方便,以下将本发明采用的NMDA受体NR2B亚单位羧基端的Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val肽序列用“NR2B9C”表示。重组跨膜NMDA受体C-端多肽类似物的氨基酸序列是Pro-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val-Gly-Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val;该肽段N端的Pro有利于重组多肽从融合蛋白中的释放,Tat与HA,HA与NR2B9C之间存在的Gly,有利于Tat和NR2B9C肽片段形成正确的空间结构。为了叙述方便,以下将该多肽用“Tat-HA-NR2B9C”表示。Tat能够携带有功能的NR2B9C多肽片断进入细胞内并有效的干扰NMDA受体NR2B亚型和PSD95的结合,阻断引起神经毒性的下游信号,能够降低大鼠缺血后脑损伤的面积并能够促进神经功能的恢复。
在本发明的第三方面,是提供生产重组跨膜NMDA受体NR2B亚型C-端多肽类似物的方法,其技术路线详述如下:
1.Tat-HA-NR2B9C基因的设计
为了增加Tat-HA-NR2B9C基因在大肠杆菌中的表达效率,在不改变多肽氨基酸序列的前提下,选用大肠杆菌偏爱的密码子,借助于计算机设计Tat-HA-NR2B9C基因的核苷酸序列,5’端添加酸水解位点Asp-Pro相应的核苷酸序列及BamHI的识别位点,3’端添加终止密码子和EcoR T的识别位点。
2.融合伙伴基因的获得
由于Tat-HA-NR2B9C多肽由32个氨基酸残基构成,直接在大肠杆菌中表达易发生降解,因此采用融合表达方案。融合伙伴基因采用高效表达的大肠杆菌L-天冬酰胺酶基因C-末端127肽序列(命名为L-ansB-C),其中L-天冬酰胺酶近C-端的一个酸水解位点(Asp-Pro)已被突变成Asp-Ala;该融合伙伴基因被克隆在市售的表达质粒pET28a中,在L-ansB-C基因的5’端有限制性内切酶NcoI的识别位点,3’端终止密码子上游有限制性内切酶EcoR I的识别位点。
3.重组基因工程菌的构建
AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C基因经Nco T和EcoR I切割插入经Nco I、EcoR I切割的pET28a中,组成融合表达的重组质粒pED-Tat-HA-NR2B9C,重组质粒转化大肠杆菌BL21,获得重组基因工程菌。
4.氨基酸富集-LB培养基的优化
融合蛋白AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C的诱导表达的方法,将菌种按2%的比例分别接种于含Kan(50μg/ml)的LB培养基中,LB培养基分别加入不同量的精氨酸。37℃培养4小时后,加入诱导剂乳糖,诱导4小时后,以获得最大量的Tat-HA-NR2B9C多肽的表达。5.工程菌发酵及重组Tat-HA-NR2B9C多肽的获得
以LB为培养基,在37℃条件下,大量培养细菌,离心收集工程菌,反复冻融裂解菌体,离心获得包含体,去离子水洗涤后,8mol/L尿素溶解包含体,1倍体积酒精沉淀,离心去沉淀,2倍体积酒精沉淀,离心后,去上清,沉淀即是含AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C的融合蛋白。融合蛋白用80mmol/L的盐酸水解,用NaOH调节pH值至中性,通过阳离子交换柱,用pH5.4的醋酸钠缓冲液梯度洗脱获得目的多肽Tat-HA-NR2B9C,采用Sephadex G-25层析柱脱盐处理,得到纯品Tat-HA-NR2B9C重组多肽。
6.Tat-HA-NR2B9C多肽的理化性质鉴定
纯化的重组多肽Tat-HA-NR2B9C用质谱仪进行氨基酸序列和分子量的分析鉴定。
7.动物脑损伤模型的建立
在神经医学研究领域,人们常常用大脑中动脉闭塞(MCAO)来制造脑缺血动物模型,进行神经损伤方面的研究。
8.Tat-HA-NR2B9C多肽减低缺血性脑损伤的效应
大鼠用MCAO方法造成脑损伤后,体内注入Tat-HA-NR2B9C多肽。处死动物,取出脑组织立即固定,常规方法进行切片,苏木精和曙红染色,观察脑梗死的面积,可以评价Tat-HA-NR2B9C多肽减低脑损伤、保护脑神经的功能。
9.Tat-HA-NR2B9C促进神经元再生的鉴定
MCAO方法造模后,动物体内注射BrdU两次,然后,处死动物,进行免疫组化,鉴定神经细胞增殖的数量及细胞的分型。
在本发明的第四方面是跨膜阻断NMDA受体与PSD95反应多肽类似物的功能,如上所述,在药学上,用本发明所述的多肽类似物能够干扰NMDA受体和PSD-95的结合,降低缺血后脑梗死的面积,刺激神经元再生并促进神经功能的恢复,是一种用于治疗脑卒中的药物。在实验研究中,该多肽能用涉及的NMDA受体和PSD95反应的神经生物学的研究,提供一种有效的阻断NMDA受体和PSD95反应的工具。
在本发明的第五方面是Tat-HA-NR2B9C多肽类似物药用的组成形式,如上所述,该多肽能够与多种载体形成剂制形式,这些载体包括:多元醇类,糖类,无机盐类。它们能辅助药物在体内发挥作用。
在本发明中,术语“标记片段”指来源于流感病毒的血凝素的氨基酸片段,也包括了其他形式的氨基酸片段,通常它具有两个目的:一是避免了Tat肽段和NR2B9C肽段在整个Tat-HA-NR2B9C分子中的空间阻碍;二是提供一种检测的手段。
在本发明中,术语“结合域片段”指具有靶向分子的肽段。在本发明中,采用源于NMDA受体NR2B亚单位羧基端的9个氨基酸的多肽,包含NR2B羧基端与PSD-95特异性结合的tSXV基序;该术语也包括源于其他受体、各种相互作用的信号分子和其他生物体受体分子的肽段,在本领域内,应用各种来源的针对分子间结合反应蛋白质结构域都能够起到靶肽序列的作用。
在本发明中,术语“跨膜片段”指富含碱性氨基酸的类似信号肽具有跨膜作用的肽段。跨膜片段可以位于标记片段的N端,也可以位于靶肽序列的N端,甚至可以位于靶肽序列的C端,同样也能携带靶肽序列进入细胞而发挥功能。
(四)附图说明
图1,用PCR方法扩增出Tat-HA-NR2B9C多肽基因的过程。
图2.重组质粒pED-Tat-HA-NR2B9C。(A)重组质粒的结构框架图;(B)目的基因的氨基酸序列。
图3.重组Tat-HA-NR2B9C多肽基因的测序结果。
图4.SDS-PAGE电泳显示Tat-HA-NR2B9C多肽基因的融合表达.(A)1.大肠杆菌BL21细胞全蛋白;2-4.载荷pED-Tat-HA-NR2B9C质粒的大肠杆菌BL21细胞分别生长在含有0.1%、0.5%、1%精氨酸的培养基中;5.载荷pED-Tat-HA-NR2B9C质粒的大肠杆菌BL21细胞生长在正常LB培养基中,箭头显示融合蛋白L-ansB-C-Tat-HA-NR2B9C的位置。(B)1.大肠杆菌BL21细胞全蛋白,不加乳糖诱导;2-5.乳糖诱导后,分别在1、2、3、4小时时间点取样,显示融合蛋白表达量;箭头显示融合蛋白的位置。
图5.SDS-PAGE电泳显示Tat-HA-NR2B9C多肽融合蛋白的乙醇沉淀.1.细菌的包含体;2.一倍乙醇沉淀;3.二倍乙醇沉淀;箭头显示Tat-HA-NR2B9C多肽融合蛋白的位置。图6.SDS-PAGE电泳显示Tat-HA-NR2B9C融合蛋白经盐酸水解断裂成为两个片段(右方箭头)。1.纯化的AnsB-C-Tat-NR2B9C融合蛋白;2-3.融合蛋白分别酸水解24、48、72小时后的蛋白质裂解片段。
图7.阳离子交换层析柱纯化Tat-HA-NR2B9C多肽的色谱图。
图8.SDS-PAGE电泳显示脱盐后Tat-HA-NR2B9C多肽样品。箭头显示Tat-HA-NR2B9C多肽位置。
图9.质谱分析显示Tat-HA-NR2B9C多肽的分子量为3802.8.
图10.脑切片观察结果显示Tat-HA-NR2B9C多肽能降低模型鼠的脑梗死面积。(A)Tat-HA-NR2B9C多肽给药组(中剂量);(B)假手术组;(C)溶剂对照组。
图11.免疫组化显示Tat-HA-NR2B9C多肽能引起海马齿状回区域的神经增殖。(A)柱状图显示给药后细胞增殖升高;(B)和(C)免疫组化结果,分别代表Tat-HA-NR2B9C给药组和对照组
(五)具体实施方式
材料:
(1)菌株与质粒:
大肠杆菌(Escherichia coliAS1.357)该菌种从中国菌种保藏中心获得。
宿主菌E.coli BL21是基因工程常用工具菌种,在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
质粒pET28a购自Novagen公司。
(2)酶和试剂:
分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品;
(3)培养基:
LB培养基,配方见参考文献Sambrook J,Fristsh E F,Maniatis T.Molecular Cloning;ALaboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989。该书是基因工程技术的经典著作,在许多高校图书馆都有收藏。
方法
分子生物学操作方法
质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌:在基因工程研究领域,这些都是常规操作方法,参见Sambrook J,Fristsh E F,Maniatis T.MolecularCloning;A Laboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,pp.16-340。
重组蛋白表达量的测定:参见Sambrook J,Fristsh E F,Maniatis T.MolecularCloning;ALaboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,方法进行。
实施例1:
Tat-HA-NR2B9C多肽基因的设计、合成和克隆
根据Tat-HA-NR2B9C多肽基因的氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱的密码子,在计算机的辅助下设计出Tat-HA-NR2B9CP多肽基因的全序列。依据该序列设计出4条寡核苷酸片段,进行化学合成。以pED的L-ansB-C基因的C端为模板,通过加端PCR的方法获得含靶肽序列的基因片段,即Tat-HA-NR2B9C多肽基因,转化大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3),从转化子中抽提的质粒命名为pED-Tat-HA-NR2B9C。具体方法如下:
4条寡核苷酸如下:
P1:5′-TACCATGGATACGCCATTCG-3′
P2:5′-CGGCGGCGCTGGCGGCGTTTTTTACGACCGTAACCCGGATCCGCGTACTGGTT-3′
P3:5′-TACCAGCAACGTCCGGAACGTCGTACGGGTAACCGCGGCGGCGCTGGCGGCGT-3′
P4:5′-TTGAATTCTAAACGTCAGATTCGATAGAAGACAGTTTACCAGCAACGTCCGGAA-3′
通过PCR获得Tat-HA-NR2B9C多肽基因:其中P1作为上游引物,P2作为下游引物,以pED质粒为模板,将pED质粒上AnsB-C基因扩增出来,再以P3、P4为下游引物,经三次加尾PCR扩增合成目的基因片断AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C。
第一步,以pED质粒为模板,P1,P2为引物进行PCR,同时在P1引入酶切位点Ncol,PCR扩增得到AnsB-C基因,并在P2的5’端引入目的基因的部分片段。PCR扩增的反应条件:预变性:94℃5min,扩增20-25个循环:94℃30s,55℃30s,72℃1min,最后一个循环结束后,72℃延伸10min。第二步,以上一次PCR产物为模板,P1,P3为引物,进行加尾PCR,进一步引入目的基因的部分片段。PCR扩增的反应条件:预变性:94℃5min,扩增20-25个循环:94℃30s,58℃30s,72℃1min,最后一个循环结束后,72℃延伸10min。第三步,以上一次PCR产物为模板,P1,P4为引物,进行加尾PCR,在P4引物上引入EcoR I的酶切位点,获得全长的目的基因,见图1所示。将扩增获得的PCR产物用限制性内切酶NcoI和EcoR I消化,与用相同限制性内切酶消化的pET28a质粒连接,连接产物转化大肠杆菌BL21,所获得的转化子中含Tat-HA-NR2B9C多肽融合蛋白基因的重组质粒pED-Tat-HA-NR2B9C,其结构框架见图2。进行核酸的序列分析,进一步验证ORF基因及其读码框的正确性.测序结果见下面序列表。从测序结果可以看出,三段Tat序列、HA序列和NR2B9C序列已经串联、并与L-ansB-C基因融合。检测的核苷酸序列图谱见图3。
实施例2
LB培养基的改良及精氨酸富集LB培养基的配方
将重组质粒pED-Tat-HA-NR2B9C转化大肠杆菌BL21。在普通的LB培养基中进行融合蛋白的诱导表达时,融合蛋白的表达量很低,见图4A,Lane5。为了诱导融合蛋白AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C的大量表达,在LB培养基中补加一定量的Arg盐酸盐作为特殊氨基酸的来源。将菌种按2%的比例分别接种于含Kan(50μg/ml)的LB培养基中,LB培养基分别按照0,0.1%,0.5%,1%(W/V)的量补加精氨酸,37℃培养4小时后,加入诱导剂乳糖,诱导4小时后,分别取样进行SDS-PAGE分析。结果显示,当LB培养基中精氨酸含量为0.1%(W/V)时,融合蛋白表达的量最高,可达菌体总蛋白量的30%左右,见图4A,Lane2。表明这一新的融合表达载体,不仅能够让活性肽基因插入,而且能以较高水平表达活性肽融合蛋白。
精氨酸盐酸盐在LB培养基中的含量(0.5%Arg,1%Arg)过高,细菌的生长变得缓慢,融合蛋白的表达量降低,见图4A,Lane3,4。这是由于碱性氨基酸的存在影响了LB培养基的pH值,使得细菌的生长受到了一定的抑制,影响了融合蛋白表达量。
精氨酸富集-LB培养基的配方如下:
蛋白胨(Trypton) 1%
酵母提取物(Yeast extract) 0.5%
NaCl 1%
精氨酸 0.1%
实施例3
Tat-HA-NR2B9C多肽基因在大肠杆菌中的表达
从平板上挑取单菌落种入精氨酸富集-LB液体培养基中,在37℃振荡培养过夜,按2%比例转种入新鲜的液体培养基中,37℃培养4小时,加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶,从而表达融合蛋白。在诱导剂加入后的第1、2、3、4小时取样,通过SDS-PAGE电泳结果发现,诱导剂加入3小时后,融合蛋白的表达达到高峰并处于稳定水平,随着诱导时间的增加没有明显变化,故在诱导3.5小时左右开始收集菌体,结果见图4B。
实施例4
融合蛋白分离纯化及酸水解释放Tat-HA-NR2B9C多肽
诱导表达后的工程菌经离心回收菌体,将菌体悬浮在破壁液(PBS,pH8.0,含2%TritonX100,10mmol EDTA,0.02%溶菌酶)中,在30℃搅拌90分钟,加入DNase将DNA消化至溶液不黏稠为止,离心回收沉淀,用4mol/L的尿素洗涤两次,得到包涵体。将洗涤后的沉淀重新溶解在8mol/L尿素中,裂解包涵体,先加入一倍体积的乙醇沉淀杂蛋白,再加入二倍原体积的乙醇沉淀融合蛋白,结果见图5。将融合蛋白溶解在80mmol/L盐酸中,50℃保温72小时,融合蛋白被裂解成一大一小两个片段(图6)。
实施例5
Tat-HA-NR2B9C多肽的纯化
将溶液用NaOH调pH4.6,再用NaAc调至中性。样品通过阳离子交换层析柱,用NaAc缓冲液洗脱,收集Tat-HA-NR2B9C多肽峰,再用Sephadex G-25凝胶柱脱盐,得到目的多肽,见图7。用聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,可以判断所获得的多肽的纯度和二聚化程度,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示获得了高纯度的Tat-HA-NR2B9C(图8)。
实施例6
Tat-HA-NR2B9C多肽序列和分子量的鉴定
纯化的Tat-HA-NR2B9C多肽利用MALDI-TOF质谱仪鉴定,结果显示分子量为3802.8kDa,见图9。与推测的理论值一致,并经过氨基酸的数据分析表明,Tat-HA-NR2B9C多肽的两端的氨基酸序列是正确的。
实施例7
脑损伤模型的制备
成年雄性Sprague-Dawley大鼠用5%水合三氯乙醛麻醉后,仰卧固定于手术台上,颈部正中切口,分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,轻轻剥离迷走神经,结扎并剪断颈外动脉,循颈内动脉向前,结扎翼腭动脉。结扎颈总动脉近心端,从结扎线的远端作一切口,插入外径为0.104mm的尼龙线,经过颈总动脉分叉进入颈内动脉,然后慢慢插入至有轻微阻力为止,阻断大脑中动脉的所有供血。在实验过程中保持动物体温(37±0.5)℃。
实施例8
Tat-HA-NR2B9C多肽抑制脑损伤的药效检测
局灶性脑缺血模型建立后,分成假手术组、溶剂对照组和3个给药组,分别给动物体内注入Tat-HA-NR2B9C多肽和生理盐水,按照体重15μg/g、7.5μg/g和3.5μg/g的剂量用药。24小时后,动物处死,取出完整的脑组织,-20℃冰箱中速冻20分钟左右,取出切片,每隔2mm切一片,将切片置于TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)中,常规浓度为2%,用锡箔纸盖住后,放入37℃温箱15~30min,不时翻动脑片,使均匀接触到染色液,TTC染料与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色,而缺血组织内脱氢酶活性下降,不能反应,故不会产生变化呈苍白。结果显示,给予Tat-HA-NR2B9C多肽组的动物脑梗死的面积明显地小于生理盐水对照组(见图10)。
实施例9
Tat-HA-NR2B9C多肽促进海马区域神经元增殖
局灶性脑缺血模型建立后,为了确定Tat-HA-NR2B9C多肽给药组能否促进神经细胞增殖,手术5-7天,动物经腹腔注射BrdU(50mg/kg),各两次,末次注射后24小时处死动物,取出脑组织,用4%多聚甲醛固定,于海马部位做冠状连续震荡切片进行BrdU免疫组化染色:切片放在抗原暴露溶液中85℃加热5min,盐酸37℃孵育30mi n,硼酸漂洗10min,BSA室温封闭1h,加入小鼠抗BrdU抗体(1∶200),4℃孵育过夜,显色按照ABC试剂盒和DBA试剂盒说明书进行。本底对照切片操作同上,但省略一抗孵育步骤。ABC染色的连续切片每六张取出一张,由不知道实验分组的实验者沿海马齿状回对BrdU+阳性细胞进行记数并分析。结果见图11,与假手术组和对照侧相比较,给药组的缺血侧的新生神经细胞明显增多(P<0.05),具有显著的统计学意义。
Claims (8)
1.一种制作能跨过细胞膜的干扰膜受体与下游分子结合的多肽类似物的方法,其特征在于将跨膜片段置于标记片段的一端,将膜受体的下游分子结合域片段置于标记片段的另一端,形成跨膜片段、标记片段和结合域片段的线性串联重复多肽分子。
2.一种选择性阻断NMDA受体NR2B亚型与下游PSD95分子结合的多肤类似物,该多肤按照权利要求1所述方法制作,将NMDA受体NR2B亚基的羧基端的PSD95结合域多肽置于HIV-1的跨膜片段Tat多肽的一端,中间插入HA标记多肽形成一条串连多肽。其特征在于该多肽类似物能跨过神经细胞摸,选择性地干扰了NMDA受体NR2B亚型与PSD95分子结合,抑制了NR2B与PSD95结合引起的神经细胞毒性。
3.按照权利要求2所述的多肽,其特征在于NMDA受体的多肽阻断剂全长氨基酸排列顺序是Pro-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val-Gly-Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val,其中Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg是HIV调控蛋白的跨膜片段,能携带与其共价结合的异源蛋白转移到细胞内。Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val是源于流感病毒的血凝素的9个氨基酸组成标记片段,Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val是NMDA受体NR2B亚单位羰基端的9个氨基酸的多肽,包含NR2B羧基端与PSD-95特异性结合片段。
4.按照权利要求2所述的多肽,其特征在于使用Tat蛋白提高了多肽阻断剂的细胞通透性。由于Tat蛋白没有位置的限制性,故Tat连接NR2B9C肽的N-或C-端,都能发挥跨膜功能。
5.一种选择性阻断NMDA受体NR2B亚型与PSD95结合的多肽类似物的制备方法,包括用化学合成法和PCR法合成该多肽的编码序列DNA,将该DNA插入融合表达载体,转化大肠杆菌,大肠杆菌在精氨酸富集培养基中表达出融合蛋白包含体;包含体经洗涤、溶解、乙醇分级沉淀纯化;提纯的融合蛋白溶于80mmol/L的盐酸中进行酸水解释放NMDA受体NR2B亚型多肽类似物,释放出的多肽调至pH中性,通过阳离子交换层析柱获得目的多肽。
6.根据权利要求5所述的精氨酸富集培养基,其特征在于是一种生产NMDA受体NR2B亚型多肽类似物的高效培养基。精氨酸富集培养基的组成成分为:
蛋白胨(Trypton) 0.5%-1.5%
酵母提取物(Yeast extract) 0.1%-1%
NaCl 0.5%-1.5%
精氨酸 0.05-0.5%
7.根据权利要求5所述NMDA受体NR2B亚型多肽类似物,其特征在于能特异性的与PSD-95的结合,使得NR2B与PSD-95解偶联,阻断引起神经兴奋性毒性的下游信号的传导。能够治疗缺血性脑损伤及其它以神经元死亡或凋亡为特征的神经系统疾病。
8.根据权利要求5所述NMDA受体NR2B亚型多肽类似物,其特征在于既能以冻干粉针剂、注射剂的制剂形式单独使用,也能与药物载体组合制成药物组合物,这些药物载体包括:多元醇类、糖类和无机盐类。
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