CN102586243A - 一种预防电磁辐射致脑损伤的标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于脑损伤防治技术领域的一种预防电磁辐射致脑损伤的标志物-NMDA受体SNP。该标志物NR2B基因启动子区-217位C/T单核苷酸多态，能准确预测不同基因型大鼠电磁辐射致脑损伤的可能性，为N-甲基-D-天门冬氨酸受体基因及其相关基因的单核苷酸多态性应用于人类电磁辐射致脑损伤的防治奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于脑损伤防治技术领域，具体涉及一种预防电磁辐射致脑损伤的标志物-NMDA受体SNP。
背景技术
随着电子电气设备的广泛应用，人们对电磁的生物效应问题愈发重视，中枢神经系统是电磁辐射敏感的靶器官之一，流行病学调查显示，电磁辐射可引起疲劳、头痛、激动、多梦、记忆力下降等症状。因此，寻找电磁辐射损伤敏感的预测和监测指标对于电磁辐射接触人群的预防诊治极其重要。电磁辐射参数以及影响的环境复杂多样，电磁暴露人群个体敏感性各有差异，电磁辐射人群脑结构和功能异常的发生风险及其与机体的遗传因素之间的关系需要关注。
本发明拟着眼于电磁辐射对脑结构和功能的损伤，通过基因多态性研究来寻找预测电磁辐射致脑损伤的重要指标。NMDA受体是中枢神经系统最重要的兴奋性氨基酸受体之一，电磁辐射可引起其重要受体NR1、NR2B活性、数量及其基因和蛋白表达的改变，进而影响学习记忆等脑的重要功能。因此，研究NR1及NR2B基因是否存在多态性，及其与辐射致脑组织结构和功能改变是否存在相关性，对于寻找与电磁辐射致脑损伤发生密切相关的敏感预测和监测指标，具有极其重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防电磁辐射致脑损伤的标志物-NMDA受体SNP。
本发明的目的还在于提供一种预防电磁辐射致脑损伤的方法。
一种预防电磁辐射致脑损伤的标志物，该标志物为N-甲基-D-天门冬氨酸受体单核苷酸多态性。
所述N-甲基-D-天门冬氨酸受体的基因为NR2B基因。
所述N-甲基-D-天门冬氨酸受体单核苷酸多态性为NR2B基因启动子区-217位C/T单核苷酸多态。
一种预防电磁辐射致脑损伤的方法，按照如下步骤进行：
(1)抽取大鼠尾静脉血100-500μl，提取基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以如序列表所述的核苷酸序列SEQ ID NO：1(5’-CTGCCTTCCTCCTTGCTTCCCACTTC-3’)和SEQID NO：2(5’-CTCTTCTCGCTTGCATATCCACATAA-3’)为引物，做PCR；
(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行测序，测序结果与标准NR2B基因比对，若其启动子区-217位基因型为CC型，则为抗电磁辐射致脑损伤大鼠；若其启动子区-217位基因型为CT型或TT型，则为电磁辐射致脑损伤敏感型大鼠。
所述CC型是指在同源染色体上NR2B基因启动子区-217位点均为C，即野生纯合型；CT型是指在同源染色体上NR2B基因启动子区-217位点一个为C，另一个为T，即突变杂合型；TT型是指在同源染色体上NR2B基因启动子区-217位点均为T，即突变纯合型。
所述标准NR2B基因为genebank上公布的NR2B基因序列，其genebank登录号为-NC_005103-。
本发明的有益效果：本发明发现的N-甲基-D-天门冬氨酸受体单核苷酸多态性，能准确预测不同基因型大鼠电磁辐射致脑损伤的可能性，为N-甲基-D-天门冬氨酸受体基因及其相关基因的单核苷酸多态性应用于人类电磁辐射致脑损伤的防治奠定了基础。
附图说明
图1为大鼠NR2B基因核心启动子区单核苷酸多态性位点。
图2为大鼠NR2B基因SNP位点酶切分型图。
图3为Wistar大鼠(编号1-16)NR2B基因-217C/T分型结果。
图4为Wistar大鼠(编号17-32)NR2B基因-217C/T分型结果。
图5为SD大鼠(编号33-48)NR2B基因-217C/T分型结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1NR2B基因单核苷酸多态性的发现
1、实验动物
二级雄性大鼠96只，体重160-200g，其中Wistar大鼠38只(编号1-8购自北京动物所，编号9-16、73-78购自维通利华，编号17-24取自军事医学科学院动物中心，编号25-32购自维通利华为非同窝大鼠)，SD大鼠22只(编号33-40取自军事医学科学院动物中心，编号41-48、74-80购自维通利华)，f-344大鼠22只(编号49-56取自军事医学科学院动物中心，编号57-64、85-90购自维通利华)，Wistar Han IGS大鼠14只(65-72、91-96购自维通利华)。
2、大鼠尾静脉血基因组DNA的提取
(1)用苦味酸在大鼠背部标记好记号后，将其固定于头部固定器上，用酒精棉球反复擦拭尾部至可见蓝色静脉，于尾部1cm处切口，血滴入EDTA抗凝管后快速晃动，防止凝血，每只大鼠采集尾静脉血500μl。
(2)在1.5ml EP管中先加入30μl蛋白酶K，再加入大鼠尾静脉血200μl，最后加入250μl细胞裂解液；
(3)将振荡器速度调到最大，将EP管放上震荡15s；
(4)5000rpm快速离心；
(5)56℃孵育2min；
(6)加入250μl无水乙醇；
(7)放在振荡器上震荡15s；
(8)5000rpm快速离心；
(9)将裂解液转入QG-810的套管并固定；
(10)整个装置放回QG-810的相应位置，关闭前盖；
(11)按MODE键选择抽提模式，按START自动运行；
(12)听到2声鸣叫，抽提结束；
(13)去1μl制备的大鼠全血基因组DNA采用紫外分光光度法测定其紫外吸收峰，并计算DNA浓度和纯度。
3、大鼠N-甲基-D-天门冬氨酸受体单核苷酸多态性的发据
(1)大鼠NR1、NR2B基因候选区域序列克隆
引物设计及合成：根据Genebank上提供的NR1(Genebank登录号为NC_005102)、NR2B(Genebank登录号为NC_005103)序列，设计PCR引物(见表1)。
表1 PCR引物序列及扩增片段长度
PCR反应体系为：
PCR扩增条件为：
随机选择20个样品进行电泳监测，取5μl PCR产物，与上样缓冲液1μl混匀后，1％琼脂糖凝胶7V/cm电压条件下电泳30min，紫外透射仪观察并照像。
(2)序列测序及结果分析
将PCR产物送华大基因公司回收、测序(测序引物见表2)，测序结果采用Chromas和Sequencher软件进行分析。
表2 PCR产物测序引物
结果，在96只大鼠NR2B核心启动子区705bp中，60只Wistar大鼠和SD大鼠中共发现1个SNP位点，为：-217位C/T多态(见图1)，f-344和Wistar-han大鼠中未发现SNP位点，在96只大鼠NR1核心启动子区和NR2B-rs8169392所在序列中也未发现SNP位点。
(3)PCR-RFLP酶切分型
根据Genbank已有的注释对NR2B基因序列编辑注释，采用DNAstar软件分析待分型的含SNP位点及附近的限制性内切酶位点情况，设计针对该位点的限制性内切酶Mspl(如图2)，并对PCR产物进行酶切分型。
取PCR产物10μl，回收纯化后，酶切16h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分型，酶切体系如下：
10×Buffer 2μl
PCR产物 8-10μl
限制性内切酶 0.5μl
ddH2O 补充至20μl
分型结果由两人分别录入，校对一致后确认个体基因型。每个位点与测序结果进行验证，最终分型结果以测序结果为准。
酶切结果如图3-5所示，将酶切分型结果与测序结果进行验证，结果显示，酶切的分型和测序结果一致，相符率为100％。
实施例2 SNP等位基因频率统计
不同动物中心Wistar和SD大鼠中发据的1个SNP位点经Excel统计处理，结果见表3-4。在军科院、北京动物所和维通利华非同窝的Wistar以及维通利华SD大鼠中均发现了SNP，且上述动物中心的大鼠中SNP有且只有两种基因型，即军科院为TT、CT型，北京动物所和维通利华非同窝为CT、CC型，维通利华同窝的Wistar大鼠只有CC型。在军科院SD大鼠中发现了SNP，为CT、TT型，而维通利华SD大鼠只有CC型。
表3 Wistar大鼠NR2B-217C/T位点等位基因频率统计
表4 SD大鼠NR2B-217C/T位点等位基因频率统计表
实施例3 NR2B基因核心启动子区多态性与微波辐射致脑损伤相关性实验
1、实验动物：3个动物中心两种品系大鼠60只(京：北京动物所；维：维通利华；军：军事医学科学院动物中心；维不同窝：维通利华非同窝大鼠)，由军事医学科学院实验动物中心提供并统一饲养，室内温度21～23℃，相对湿度60％。
2、实验分组：辐射组48只，其中二级雄性Wistar大鼠32只，SD大鼠16只，假辐射组12只，其中二级雄性Wistar大鼠6只，SD大鼠6只(见表5)。
表5 不同品系不同动物中心大鼠分组表
3、辐射方法
采用电磁波模拟辐射源对不同来源不同品系大鼠进行全身均匀辐射。动物辐照在反射近似零的电磁波辐照暗室进行，大鼠放置于可透射电磁波的专用辐照盒内，在场强均匀分布、匀速旋转的平台上接受6min全身辐照，保证大鼠受到均匀辐射。辐射的平均功率密度为30mW/cm2；假辐射组仅将装有大鼠的辐射盒放于辐射台上，不进行辐射。
4、大鼠海马组织神经递质的检测
(1)主要试剂及来源
Glu、Asp、Tau、GABA、Gly、邻苯二甲醛和二巯基乙醇购自sigma公司，甲醇为进口色谱纯，其余试剂为国产分析纯。
(2)试剂配制
流动相：取甲醇300ml以及过滤后的0.1mol/l磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)700ml均匀混合，超声10min后放置使用；
10％磺基水杨酸溶液：100ml ddH2O中加入10g磺基水杨酸并充分溶解；
衍生试剂：50mg OPA中加入1ml甲醇溶解充分，后加入9ml硼酸
缓冲液(0.4M，pH：9.5)，最后加入40μl二巯基乙醇并混匀充分，加入棕色瓶中避光并放置于4℃冰箱保存。
标准品：Glu、Asp、GABA、Tau和Gly 5种氨基酸分别取0.01mg用盐酸(0.1mol/l)充分溶解后，加甲醇(50％)至1ml，将5种氨基酸溶液混合，配成终浓度为2.5μg/ml的混合标准品；根据峰图后进行调整，取Asp12.5μl、Glu25μl、Gly25μl、Tau20μl和GABA25μl配制成混合标准品，其中Asp、Glu、Gly、Tau和GABA浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml、5μg/ml、4μg/ml和5μg/ml。
(3)实验步骤
a、取两种品系各组大鼠脑组织快速分离大鼠海马组织，天平称重；
b、剪刀剪碎海马组织后，按1ml/100mg组织的比例加入磺基水杨酸(10％)，放置于高速分散器内进行充分匀浆(以上步骤均在冰浴中进行)，4℃低温离心机高速(15000rpm)离心20min，取上清置于4℃冰箱保存。
c、用高效液相色谱仪检测神经递质，自动进样针取5μl衍生试剂和样品1μl，振荡2min后进样。
d、测得的值＝A样(检测的氨基酸递质含量的峰面积)，然后用A标(标准品的峰面积)和C标(标准浓度)的比值，即可计算出C样(待测氨基酸递质的浓度)：
公式为C标×A样/A标＝C样(mg/ml)
然后根据匀浆后海马组织的浓度，计算出神经递质含量在海马中所占据的比重：海马中神经递质含量＝1000×(C标×A样/A标)，单位(μg×10-2/mg)。
公式换算测得数据，得出样品中神经递质的量。
(4)实验结果
a、Wistar大鼠不同基因型氨基酸神经递质含量的改变
经高效液相色谱仪检测，得到各样品的峰面积，分析结果见表6。30mW/cm2辐射Wistar大鼠后7d，与假辐射组相比，辐射组CC型海马Asp、GABA含量增加(p＜0.05)，辐射组TT型海马Asp含量明显增加(p＜0.01)；与辐射组CC型相比较，辐射组TT型含量Asp含量增加(p＜0.05)。由上可见，微波辐射后不同基因型氨基酸递质含量改变不同，且同一氨基酸递质含量(Asp、GABA)在不同基因型也存在差异。
表6 30mW/cm2微波辐射后7d Wistar大鼠海马不同基因型氨基酸递质含量改变
与假辐射组相比：*示P＜0.05；**示P＜0.01；与辐射组CC型相比：#示P＜0.05
b、SD大鼠不同基因型氨基酸神经递质含量的改变
经高效液相色谱仪检测，得到各样品的峰面积，分析结果见表7。30mW/cm2辐射SD大鼠后7d，与假辐射组相比，辐射组CC型海马Gly含量增加(p＜0.05)，Asp、GABA含量明显增加(p＜0.01)，辐射组CT型Glu含量增加(p＜0.05)，Asp、Gly和GABA含量明显增加(p＜0.01)，辐射组TT型Glu和GABA含量增加(p＜0.05)，Asp和Gly含量明显增加(p＜0.01)；与辐射组CC型相比较，辐射组TT型GABA含量增加(p＜0.05)。由上可见，30mW/cm2辐射后不同基因型组氨基酸递质含量改变不同，且同一氨基酸递质(Asp、Gly、GABA)在不同的基因型也存在差异。
表7 30mW/cm2辐射后7d SD大鼠海马内氨基酸递质含量变化表
与假辐射组相比：*示P＜0.05；**示P＜0.01；与辐射组CC型相比：#示P＜0.05
5、免疫印迹法检测大鼠海马组织NR2B蛋白表达变化
A、大鼠海马组织蛋白的提取：
(1)准备好盒子放入碎冰，准备好镊子、剪刀、刀片，消毒过的EP管，枪头，冰盒、锡纸(用于包裹冰盒和称重用)，匀浆管(内磁珠无悬浮)；
(2)取两种品系各组大鼠脑组织出冻存的脑组织，分离大脑海马组织并放于冰上，尽快放于锡纸上分别称重后(皮层脑组织约100mg)，迅速剪碎，将各动物中心各品系的样品分别混匀，置于匀浆管中，记录重量(减去锡纸上剩余的重量)；
(3)加入适当比例的细胞裂解液(600μl/80mg组织，裂解液至于冰上，5mlRIPA混合50μlPMSF)；
(4)3000rpm高速离心30s，如果没有完全裂解再离30s；
(5)转移入EP管中，后震荡8次，每次30～40s，间隔5min；
(6)4℃离心，12000rpm×15min；
(7)取上清分装，100μl/管，-80oC保存；取其中一管测蛋白浓度。
B、BCA法测定蛋白浓度
(1)计算所需工作液量：
(2)平行对照孔数×(标准孔+待测孔)×加入工作液量/孔(50份A液，1份B液)；
(3)配制标准液及样品液，见表8
表8 BCA法测定蛋白浓度中标准液及样品液配制
(4)96孔板加样
1)每孔加入200μl工作液；
2)每孔依次再加入10μl标准液(或待测品)，如A，A，I，I，待测品需30s振荡；
3)37℃孵育30min，冷至室温；
4)酶标仪(OD560)检测蛋白浓度；
5)数据处理：利用Excel和Origin工作簿计算出该样品的蛋白浓度。
(5)SDS-PAGE电泳和Western Blot
1)制胶：配制4％积层胶及10％分离胶；
2)算出蛋白的上样量＝所需蛋白体积×样品浓度(μl/μg)/100μl
W1：Wistar大鼠CC型，W2：Wistar大鼠CT型
W3：Wistar大鼠TT型，W4：Wistar大鼠假辐射组
S1：SD大鼠CC型，S2：SD大鼠CT型
S3：SD大鼠TT型，S4：SD大鼠假辐射组
3)上样：PCR仪95℃变性10min，待冷却后用加样器取10μl按顺序加入点样孔，蛋白Marker(7-175kDa)加入邻加样孔内；
4)电泳：1×电泳缓冲液中行80V电泳(恒压)，至溴酚兰条带到达积层胶，将电压变为120V，直到溴酚蓝到达玻板下沿；
5)转膜：轻开玻璃板，按Whatman滤纸-PVDF膜-凝胶-三层Whatman滤纸即三层的顺序各层重叠放置，将转膜缓冲液倒入夹板内，26mA恒流转膜3h；
6)封闭：采用PBST分3次清洗PVDF膜(10min/次)，用PBS-T将脱脂奶粉稀释(5％)，最后常温封闭3h；
7)一抗：加兔抗NR2B多抗(PBST稀释1∶1000)摇床常温震荡1h，4℃过夜，次日摇床常温摇震2h，PBST清洗3次，每次10min；
8)二抗：加入生物素标记的山羊抗兔IgG(PBST液1∶10000稀释)和兔抗GAPDH(PBST稀释1∶10000)，摇床常温震荡1h，PBST清洗3次，每次10min；
9)显影：将清晰的条带扫描后输入图像分析系统，进行统计分析。
(6)免疫印迹结果分析
将目的条带扫描后，应用图像分析仪(Image Pro 5.0软件)检测NR2B和GAPDH的IOD值。
(7)定量计算
将扫描值与GAPDH扫描值相比，然后以样本/内参照的比值表示NR2B蛋白表达水平。
(8)统计学分析
实验数据均以均数和标准差
表示，采用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析(LSD或Dunnett t检验)、秩和检验。与假辐射组比，*示p＜0.05，**示p＜0.01，与辐射组CC型相比，#示P＜0.05，##示p＜0.01。
(9)实验结果
由表9可见，30mW/cm2辐射后7d，相对于假辐射组，辐射组CC型Wistar大鼠海马NR2B蛋白表达明显上调(p＜0.01)，辐射组CT型和TT型Wistar大鼠海马NR2B蛋白表达下调(p＜0.05)；相对于假辐射组，辐射组CC型SD大鼠海马NR2B蛋白表达明显上调(p＜0.01)，辐射组CT型SD大鼠海马NR2B蛋白表达明显下调(p＜0.01)。
表9 30mW/cm2微波辐射后7d Wistar和SD大鼠海马NR2B蛋白表达改变
与假辐射组相比：*示P＜0.05，**示p＜0.01
本实施例的结果表明，电磁波辐射后CC型NR2B蛋白表达和氨基酸神经递质的改变参与了辐射后脑损伤和修复的过程，且以保护作用为主；CT型和TT型主要参与辐射损伤的过程，提示遗传因素与电磁波辐射致脑功能异常的敏感性密切相关。
Claims (6)
1.一种预防电磁辐射致脑损伤的标志物，其特征在于，该标志物为N-甲基-D-天门冬氨酸受体单核苷酸多态性。
2.根据权利要求1所述一种预防电磁辐射致脑损伤的标志物，其特征在于，所述N-甲基-D-天门冬氨酸受体的基因为NR2B基因。
3.根据权利要求1所述一种预防电磁辐射致脑损伤的标志物，其特征在于，所述N-甲基-D-天门冬氨酸受体单核苷酸多态性为NR2B基因启动子区-217位C/T单核苷酸多态。
4.一种预防电磁辐射致脑损伤的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)抽取静脉血100-500μl，提取基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以如序列表所述的核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，做PCR；
(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行测序，测序结果与标准NR2B基因比对，若其启动子区-217位基因型为CC型，则为抗电磁辐射致脑损伤大鼠；若其启动子区-217位基因型为CT型或TT型，则为电磁辐射致脑损伤敏感型大鼠。
5.根据权利要求4所述一种预防电磁辐射致脑损伤的方法，其特征在于，所述CC型是指在同源染色体上NR2B基因启动子区-217位点均为C，即野生纯合型；CT型是指在同源染色体上NR2B基因启动子区-217位点一个为C，另一个为T，即突变杂合型；TT型是指在同源染色体上NR2B基因启动子区-217位点均为T，即突变纯合型。
6.根据权利要求4所述一种预防电磁辐射致脑损伤的方法，其特征在于，所述标准NR2B基因为genebank上公布的NR2B基因序列，其genebank登录号为NC_005103。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120718 |