CN102241745A - 多肽类似物Tat-HA-NR2B9C及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

多肽类似物Tat-HA-NR2B9C及其制备方法和应用，它的氨基酸序列如SEQIDNO.1所述，本发明所获得的Tat-HA-NR2B9C多肽，可抑制NMDA受体介导的兴奋性神经毒性，具有明显的神经保护作用，可作为治疗脑卒中等神经相关疾病药物开发的候选分子。

Description

多肽类似物Tat-HA-NR2B9C及其制备方法和应用

 

技术领域

本发明属于生物制药领域，尤其涉及多肽类似物Tat-HA-NR2B9C及其制备方法和应用，该多肽类似物能特异性解除NMDA受体和PSD-95蛋白之间耦联，阻断兴奋毒性的信号转导，发挥保护脑缺血损伤。

 

背景技术

N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体是一种门控离子通道复合物，主要分布于大脑皮层、海马、纹状体等部位，是兴奋性氨基酸神经递质传递的重要基础，也是维持正常中枢神经系统功能的关键因素。在生理条件下，NMDA受体不仅介导了突触可塑性，神经元生长和分化，还通过突触后的信号调控突触的去极化以维持一定的生理功能。尽管兴奋性氨基酸信号对于维持大脑的生理功能非常重要，但同时也是引起神经障碍性疾病的关键因素。在脑卒中的发病机制中，通过参与众多病理变化和生化过程，NMDA受体在缺血性脑损伤中起关键作用。通过对脑缺血模型的病理研究发现，NMDA受体过度激活引起大量的Ca²⁺内流，细胞内Ca²⁺的瞬息变化会触发兴奋性毒性，并导致蛋白酶、核酸内切酶的激活、一氧化氮（NO）的生成、自由基的产生以及线粒体膜渗透性的改变，从而导致神经元的损伤和死亡。因此，NMDA受体已经成为防治脑卒中等神经系统疾病药物研制的重要靶点之一。

尽管大量的临床前理论研究表明NMDA受体拮抗剂，如：selfotel、eliprodil、licostinel、lanicemine、UK2240455、SM231900等对缺血性脑损伤具有治疗作用，但因疗效不确切或不良反应严重，所有临床研究使用的NMDA受体拮抗剂均被停用。NMDA受体属配基和电压双门控的Ca²⁺通道，现已发现并克隆出的NMDA受体亚单位有NR1、NR2（包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D）、NR3和NR4亚单位。NR1在中枢神经系统内广泛分布，是NMDA受体必需的亚单位；NR2、NR3和NR4则呈特异性分布。NMDA受体在不同脑区可以由不同的亚单位组成，并产生不同的电生理学及药理学特性。NR2B与PSD95蛋白结合产生一系列神经毒性反应，导致神经元的死亡或凋亡。PSD-95通过第二个PDZ结构域与NMDA受体的NR2B羧基端的tSXV基序结合，同时也可以与神经元型一氧化氮合酶（nNOS，neuronal nitric oxide synthase）结合，过度激活nNOS使NO大量释放，从而引起神经兴奋毒性，导致脑卒中等疾病发生。从治疗的角度看，抑制或者突变NMDA受体是不可行的，因为NMDA受体具有广泛的生理效应，NMDA受体水平的改变将严重干扰机体功能。临床数据也表明NMDA受体拮抗剂是无效的，甚至是有害的。选择性的NR2B拮抗剂是目前抗脑卒中药物研究的热点。有实验表明，体内基因突变或者体外抑制PSD95的表达并不影响NMDA受体的活性，PSD-95缺失可以引起NO生成减少，减低NMDA受体过度激活导致的神经兴奋毒性。本实验室的研究还发现，NMDA/PSD-95/nNOS偶联通路对神经元再生起抑制作用。因此阻断该通路的信号传导可能有利于减轻缺血性损伤，促进脑卒中后神经元的再生，从而改变脑缺血诱导的记忆功能损伤。由此，探索NMDA受体/PSD-95解耦联剂成为我们寻找抗脑卒中等神经疾病药物的新策略。

 

发明内容

技术问题：本发明旨在提供多肽类似物Tat-HA-NR2B9C及其制备方法和应用。

技术方案：多肽类似物Tat-HA-NR2B9C，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

多肽类似物Tat-HA-NR2B9C，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

包含SEQ ID NO.2所述核苷酸序列的重组质粒。

包含SEQ ID NO.2所述核苷酸序列的重组质粒pED-Tat-HA-NR2B9C。

制备多肽类似物Tat-HA-NR2B9C的方法，以pED的L-ansB-C基因的C端为模板，通过加端PCR的方法获得Tat-HA-NR2B9C多肽核酸序列，并转化宿主细胞进行培养，获得重组的pED-Tat-HA-NR2B9C。

所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或昆虫细胞。

所述多肽类似物Tat-HA-NR2B9C在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用。

有益效果：在本发明的第一方面，提供一种能够干扰细胞膜NMDA受体与PSD-95分子耦联的重组多肽基因Tat-HA-NR2B9C的构建方法：跨膜片段（Tat）、标记片段（HA）、膜受体的下游分子结合域片段（NR2B9C）的线性连接形成一个杂合多肽分子，其分子构成为：“跨膜片段-标记片段-结合域片段”。根据Tat、HA及NMDA受体的NR2B羧基端9个氨基酸的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，在计算机辅助下设计出Tat-HA-NR2B9C多肽基因的全序列。根据该序列设计并合成出4条寡核苷酸引物片断。首先以pED质粒为模版，通过三次加尾PCR将原pED质粒的L-ansB-C基因加尾合成Ans-B-C-Tat-HA-NR2B9C，将该基因克隆到pET-28a的限制性内切酶位点上，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，从转化子中抽提的质粒命名为pED-Tat-HA-NR2B9C。在多肽分子中，跨膜片段（Tat）氨基酸序列为Tyr-Gly -Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，是HIV-1编码的调控蛋白中第47-57位具有转导作用的氨基酸残基序列；为了叙述方便，在实施例中，本发明含跨膜片段用“Tat”表示。标记片段其氨基酸排序是Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Val-Ala，是指来源于流感病毒的血凝素（但不限于）的9个氨基酸组成肽表位，为了叙述方便，在实施例中，本发明所采用的标记肽段用“HA”表示。在本发明中，膜受体的下游分子结构域片段是来源于NMDA受体NR2B亚单位羧基端的9个氨基酸的多肽，氨基酸排列顺序是Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val；为了叙述方便，以下将本发明采用的NMDA受体NR2B亚单位羧基端的Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val肽序列用“NR2B9C”表示。这种干扰细胞膜NMDA受体与PSD95分子耦联的重组多肽的氨基酸序列是Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Val-Ala-Gly-Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val。Tat与HA，HA与NR2B之间存在的Gly，有利于Tat和NR2B9C肽片段形成正确的空间结构。为了叙述方便，以下将该多肽类似物用“Tat-HA-NR2B9C”表示。在本发明中，术语“跨膜片段”指富含碱性氨基酸的类似信号肽具有跨膜作用的肽段。跨膜片段可以位于标记片段的N端，也可以位于靶肽序列的N端，甚至可以位于靶肽序列的C端，这几种形式都能携带靶肽序列进入细胞而发挥功能。术语“结合域片段”指具有靶向分子的肽段。在本发明中，采用源于NMDA受体NR2B亚单位羧基端的9个氨基酸的多肽，包含NR2B羧基端与PSD-95特异性结合的tSXV基序；该术语也包括源于其他受体、各种相互作用的信号分子和其他生物体受体分子的肽段，在本领域内，应用各种来源的针对分子间结合反应蛋白质结构域都能够起到靶序列的作用。

在本发明的第二方面，选择一种恰当的融合伙伴基因提供一种融合表达方案。由于Tat-HA-NR2B9C多肽由31个氨基酸残基构成，直接在大肠杆菌中表达易发生降解，因此采用融合表达方案。融合伙伴基因采用高效表达的大肠杆菌L-天冬酰胺酶基因C-末端127肽序列（命名为L-ansB-C），其中L-天冬酰胺酶近C-端的一个酸水解位点（Asp-Pro）已被突变成Asp-Ala；该融合伙伴基因被克隆在市售的表达质粒pET28a中，在L-ansB-C基因的5’端有限制性内切酶NcoI的识别位点，3’端终止密码子上游有限制性内切酶EcoRI的识别位点。该融合伙伴优点在于：一、它来自于大肠杆菌本身，可以优势表达，减少酶对融合蛋白的攻击作用；二、Tat-HA-NR2B9C多肽分子量小、降解快，而与L-AnsB-C融合后不仅分子量增加（17.599KD），而且以包涵体形式表达，即提高了融合蛋白的产量和纯度，也减少了宿主蛋白酶对表达产物的降解；三、Tat-HA-NR2B9C多肽长度相对较短，空间构象简单，在破包涵体后去除融合伙伴L-AnsB-C即有生物学活性，不需要复性；四、在融合伙伴L-AnsB-C和Tat-HA-NR2B9C之间预留酸水解位点，通过稀盐酸水解包涵体的裂解产物即可将二者分开，不需要额外加入水解酶，避免带入杂质；五、融合伙伴L-AnsB-C和Tat-HA-NR2B9C的等电点（前者是4.68，后者是10.32）和分子量（前者13.745KD，后者3.808KD）都相差较大，通过等电点沉淀后的离心超滤即可获得高纯度的目的多肽，既简化了分离纯化步骤也避免了因纯化过程过于繁琐导致的目的多肽损失。

在本发明第三方面中，选择了一个恰当的标签，术语“标记片段”指来源于流感病毒的血凝素的氨基酸片段，也包括了其他形式的氨基酸片段，它既能避免Tat肽段和NR2B9C肽段在整个Tat-HA-NR2B9C分子中的空间阻碍；也能成为检测该多肽表达，定量，药代动力学研究的标签。

在本发明的第四方面是多肽类似物Tat-HA-NR2B9C的功能，如上所述，在药学上，用本发明所述的多肽类似物能够干扰NMDA受体和PSD-95的结合，降低缺血后脑梗死的面积，刺激神经元再生并促进神经功能的恢复，和文献报道的化学合成的Tat-NR2B9C多肽有同样的效果。在实验研究中，该多肽能用于涉及到NMDA受体和PSD-95反应的神经生物学的研究，提供一种有效的阻断NMDA受体和PSD-95耦联的工具。

在本发明的第五方面是Tat-HA-NR2B9C多肽类似物药用的组成形式，如上所述，它不仅能以冻干粉形式保存，还能够与多种载体形成制剂形式，这些载体包括：多元醇类，糖类，无机盐类。它们能辅助药物在体内发挥作用。 

 

附图说明

图1. 三次连续加尾PCR获得目的基因片段示意图。

图2. 重组质粒pED-Tat-HA-NR2B9C构建策略。（A）重组质粒构建示意图；（B）目的基因的氨基酸序列。

图3. 重组Tat-HA-NR2B9C多肽基因的测序结果。

图4. SDS-PAGE电泳显示Tat-HA-NR2B9C多肽基因的融合表达。1. 大肠杆菌BL21细胞全蛋白，不加IPTG诱导；2-9.IPTG诱导后，分别在1、2、3、4、5、6、7、8小时时间点取样，显示融合蛋白表达量；箭头显示融合蛋白的位置。

图5. AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C融合蛋白酸水解结果。小肽胶电泳后经银染显示融合蛋白经盐酸水解为两个片段（右方箭头）。1-4. 两倍乙醇沉淀的的AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C融合蛋白分别用100mM盐酸按6g/100ml水解0h、24h、48h、72h蛋白质裂解片段；5-8. 融合蛋白分别用80mM盐酸按6g/100ml水解0h、24h、48h、72h蛋白质裂解片段。

图6. Tat-HA-NR2B9C多肽的质谱图。

图7. 超滤纯化获得的Tat-HA-NR2B9C多肽。小肽胶电泳后经银染显示Tat-HA-NR2B9C多肽样品。箭头所指为Tat-HA-NR2B9C多肽。

图8. Tat-HA-NR2B9C工程菌经传代培养后的生长曲线。原代、10代、20代、50代菌落接种到到SB-Kan+液体培养基中，37℃培养12h，用空白SB培养基作为对照，测定OD600。

图9. Tat-HA-NR2B9C工程菌遗传稳定性试验。图A为酶切鉴定结果。原代、10代、20代、50代单菌落培养后提取的质粒进行酶切鉴定，1-4分别是原代、10代、20代、50代质粒，5-8分别是对应的酶切后的产物。图B为工程菌原代，10，20，50代细菌经诱导后的蛋白表达情况。

图10. Tat-HA-NR2B9C预处理对于缺血性脑损伤的保护作用：小鼠脑梗死面积及统计结果。

图11. Tat-HA-NR2B9C对SD大鼠缺血后脑损伤的保护作用：（A）神经缺陷症状评分，（B）脑梗死面积统计结果。

图12. Tat-HA-NR2B9C对SD大鼠缺血后脑损伤保护作用的量效关系：SD大鼠（A）神经缺陷症状评分，（B）脑梗死面积统计结果。

图13.Tat-HA-NR2B9C对SD大鼠缺血后脑损伤保护作用的时效关系：SD大鼠（A）神经缺陷症状评分，（B）脑梗死面积统计结果。

 

具体实施方式

材料：

（1）      菌株与质粒：

 大肠杆菌（Escherichia coli AS1.357）该菌种从中国菌种保藏中心获得。

 宿主菌E.coli BL21是基因工程常用工具菌种，在于基因工程研究有关的实验室一般都有保存。

 质粒pED28a购自Novagen公司。

（2）      酶和试剂

分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格（Promega）公司产品；

方法

分子生物学操作方法

质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接及大肠杆菌转化均为基因工程研究领域常规操作方法，参见Sambrook J,Fristsh E F,Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed.NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989。

 

实施例1  Tat-HA-NR2B9C多肽基因的设计、合成和克隆

1.方法

根据Tat-HA-NR2B9C多肽基因的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，在计算机的辅助下设计出Tat-HA-NR2B9C多肽基因的全序列。依据该序列设计合成出4条寡核苷酸片段。以pED的L-ansB-C基因的C端为模板，通过如图1所示的三次加尾PCR的方法获得含靶肽序列AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C的基因片段，即Tat-HA-NR2B9C多肽基因，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，从转化子中抽提的质粒命名为pED-Tat-HA-NR2B9C。具体方法如下：

4条寡核苷酸如下：

P1: 5’-TACCATGGATACGCCATTCG-3’

P2:5’-CGGCGGCGCTGGCGGCGTTTTTTACGACCGTAACCCGGATCCGCGTACTGGTT-3’

P3:5’-TACCAGCAACGTCCGGAACGTCGTACGGGTAACCGCGGCGGCGCTGGCGGCGT-3’

P4:5’-TTGAATTCTAAACGTCAGATTCGATAGAAGACAGTTTACCAGCAACGTCCGGAA-3’

通过PCR获得Tat-HA-NR2B9C多肽基因：其中P1作为上游引物，P2作为下游引物，以pED质粒为模板，将pED质粒上AnsB-C基因扩增出来，再以P3、P4为下游引物，经三次加尾PCR扩增合成目的片段AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C。

第一步，以pED质粒为模板，P1、P2为引物进行PCR，同时在P1引入酶切位点NcoI，PCR扩增得到AnsB-C基因，并在P2的5’端引入目的基因的部分片段。PCR扩增的反应条件：94℃ 5min预变性，94℃ 30s；55℃ 30s ；72℃ 1min，扩增20-25个循环后, 72℃延伸10min。第二步，以上一次PCR产物为模板，P1、P3为引物，进行加尾PCR，进一步引入目的基因的部分片段。PCR扩增的反应条件：预变性：94℃ 5min，扩增20-25个循环；94℃ 30s；58℃ 30s ；72℃ 1min，最后一个循环结束后，72℃延伸10min。第三步，以上一次PCR产物为模板，P1、P4为引物，进行加尾PCR，在P4引物上引入EcoRI的酶切位点，获得全长的目的基因（图1）。将扩增获得的PCR产物用限制性内切酶NcoI和EcoRI消化，与用相同限制性内切酶消化的pED28a质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含Tat-HA-NR2B9C多肽融合蛋白基因的重组质粒pED-Tat-HA-NR2B9C，其结构框架见图2。通过核酸的序列分析验证基因及其读码框的正确性。

2.结果与结论

从测序结果（图3）可以看出，Tat序列、HA序列和NR2B9C序列已经串联、并与L-ans-B-C基因融合。

 

实施例2  AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C融合蛋白的诱导表达

1.方法

SB培养基的配方：3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)为常见的生物缓冲剂之一，最佳缓冲范围pH6.5-7.9， 能够给细菌生长提供一个稳定的环境，有利于融合蛋白的表达。

SB培养基的配方如下：1L培养液中含有

蛋白胨（Trypton）             30g

酵母提取物（yeast extract）     20g

3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)     10g

NaOH                        调PH至7

Tat-HA-NR2B9C融合蛋白在大肠杆菌中的表达：

从平板上挑取单菌落种入SB液体培养基中，在37℃振荡培养过夜，按1%比例种入新鲜的液体培养基中，37℃培养3小时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导表达融合蛋白。在诱导剂加入后的第1、2、3、4、5、6、7、8小时取样，通过SDS-PAGE电泳后用考马斯亮兰染色观察融合蛋白的表达情况。

2.结果与结论

加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，37℃诱导7小时后，可获得融合蛋白稳定高水平的表达（图4）。

 

实施例3  融合蛋白的酸水解及Tat-HA-NR2B9C多肽的释放与鉴定

诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在裂解液中，反复冻融裂解菌体，再进一步超声裂解，离心获得包涵体，先用菌体裂解液洗涤两遍，再用包涵体洗涤液洗涤两遍，洗涤第一遍时发现包涵体开始裂解，所以最多只用包涵体洗涤液洗一次。最后用4mol/L尿素溶解包涵体，离心后上清先用0.5倍体积酒精沉淀，离心去沉淀，上清再用2倍体积酒精沉淀AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C融合蛋白。融合蛋白经100mmol/L的盐酸50℃水解72h，水解产物进行小肽胶电泳后银染检测目的多肽Tat-HA-NR2B9C释放情况并采用MALDI-TOF质谱仪对其序列进行鉴定。

2.结果与结论

重组AnsB-C-Tat-HA-NR2B9C蛋白酸水解后产物经小肽胶电泳后银染结果显示融合蛋白在100mmol/L的盐酸50℃、72h条件下被完全水解（图5）。对约5KD条带进行的MALDI-TOF质谱分析结果证明该条带分子量为3802.8Da，与推测的理论值一致，其氨基酸组成与我们最初设计目的多肽Tat-HA-NR2B9C相符（图6）。其在小肽胶上条带的大小与理论计算分子量稍有差异可能与其含有大量的精氨酸有关。

 

实施例4  Tat-HA-NR2B9C多肽的分离纯化

1.方法

用生物信息分析软件计算预测融合伙伴的分子量为13.745KD，等电点为4.68，目的多肽的分子量为3.808KD，等电点为10.32，所以我们采用等电点沉淀法用NaOH调节酸水解的样品pH至4.68，离心留上清，再用截留量为10KD的超滤管去除未水解完全的融合蛋白及未沉淀完全的融合伙伴，然后用透析袋将滤液脱盐处理后冷冻干燥。冻干得到Tat-HA-NR2B9C重组多肽经小肽胶电泳后用银染法染色进行纯度鉴定。

2.结果与结论

冻干得到Tat-HA-NR2B9C重组多肽经小肽胶电泳后银染后仅显示出一条Tat-HA-NR2B9C多肽条带（图7），采用计算机对该条带进行灰度分析后其纯度至少在95%以上。因此，酸水解后的产物经过等电点沉淀和超滤离心可以有效地分离纯化出高纯度的目的多肽。

 

实施例5  重组Tat-HA-NR2B9C质粒在工程菌株中的遗传稳定性实验

将负载有重组质粒的原始工程菌涂布于卡那平板上，过夜培养后，挑取4-5个克隆，接种于SB培养基中震荡培养，提取质粒进行酶切、测序及表达分析。选取经酶切和序列分析完全正确且重组蛋白表达量最高的克隆进行遗传稳定性实验（种子库的建立）。

1. 方法

（1）菌株传代培养

在Kan+的LB平板上划线接种受试菌株，37℃培养16h后，挑取单菌落继续划线培养，每传1次记为1代。

同时取不含Kan的LB平板，接种受试菌，按上述方法进行传代培养，分别挑取原代、10代、50代的单菌落100个，分别点种于kan+平板和kan-平板上，37℃培养过夜，记数这两种平板上的菌落数，计算工程菌在没有Kan选择压力下传代时质粒的丢失率。

（2）菌落形态和生长观察

用接种环挑取菌落，涂布于kan+平板，37℃培养24h，与从原代种子接出的培养物对比，观察菌落形态变化。

接种单菌落到SB-Kan+液体培养基中，37℃培养12h，用空白SB培养基作为对照，测定OD600，确定生长速度变化。

（3）质粒酶切鉴定

传代过程中，挑取原代、10代、20代、50代单菌落培养后提取质粒进行酶切鉴定，用以确定其酶切位点是否有突变。

（4）插入片段的DNA序列分析

将酶切鉴定正确的第50代质粒或菌株，进行测序分析。

（5）重组蛋白表达分析

分别挑取原代、10、20、50代工程菌株的单菌落到5ml SB-Kan+液体培养基中，37℃培养过夜，次日进行转接、诱导，观察连续传代后工程菌表达能力是否会变化。

2.结果与结论

工程菌经传代50代后未见质粒丢失；生长速度各代之间没有明显变化（图8）。原代、10代、20代、50代质粒酶切后的产物、DNA测序分析显示目的基因序列及酶切位点均无突变（图9A）。SDS-PAGE分析显示各代工程菌之间蛋白表达量没有明显变化（图9B）。上述结果说明我们建立的工程菌具有良好的遗传稳定性，可以作为未来大量生产使用的种子库。

 

实施例6   Tat-HA-NR2B9C多肽对缺血性脑损伤的保护作用

1.方法

（1）脑损伤模型的制备

成年雄性Sprague-Dawley大鼠用10%水合三氯乙醛麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，轻轻剥离迷走神经，结扎颈总动脉近心端，结扎并剪断颈外动脉，循颈内动脉向前，结扎翼腭动脉。从颈外动脉作一切口，插入外径为0.285mm的尼龙线，经过颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后慢慢插入至有轻微阻力为止，阻断大脑中动脉的所有血供，两小时后进行再灌注。在实验过程中保持动物体温（37±0.5）℃。

（2）Tat-HA-NR2B9C多肽明显减轻缺血性脑损伤

Ⅰ、给予Tat-HA-NR2B9C多肽预处理对于缺血性脑损伤的保护作用：选用C57BL/6小鼠，分给药组和溶剂对照组，造模前1h分别给动物尾静脉注入Tat-HA-NR2B9C多肽和生理盐水，给药组按照体重4.33nmol/g的剂量用药，给药体积3ml/kg，对照组给相同体积的生理盐水。24小时后处死动物，取出完整的脑组织，-80℃冰箱中速冻8分钟左右取出，冠状切片，每隔2mm切一片，将切片放入含有10ml 2%TTC（2、3、5—氯化三苯基四氮唑）的棕色瓶中， 37℃轻微振荡2h后，拍照，计算梗死面积。

Ⅱ、Tat-HA-NR2B9C多肽对缺血后脑损伤的保护作用：选用SD大鼠，给药组分三个剂量组1.5nmol/g，3 nmol/g ，6 nmol/g给予Tat-HA-NR2B9C，对照组按3nmol/g给予阴性对照药Tat-HA-NR2BAA，溶剂都用生理盐水，于造模后1h给药，24小时后采用Bederson 5分法对实验动物进行神经学评分，按Ⅰ中方法处死动物、染色、拍照，计算梗死面积。

量效关系实验：选用SD大鼠，给药组分三个剂量组0.012nmol/g，0.06 nmol/g ，0.3 nmol/g给予Tat-HA-NR2B9C，对照组按0.3nmol/g给予阴性对照药Tat-HA-NR2BAA，溶剂都用生理盐水，于造模后1h给药，神经学评分、脑片染色、拍照及脑梗死面积统计分析同上。

时效关系实验：选用SD大鼠，给药组分三组，按0.3 nmol/g于造模后1h、3h、5h分别给予Tat-HA-NR2B9C，对照组按0.3nmol/g于造模后1h给予阴性对照药Tat-HA-NR2BAA，溶剂都用生理盐水，神经学评分、脑片染色、拍照及脑梗死面积统计分析同上。

2.结果与结论

Tat-HA-NR2B9C多肽预处理实验的统计学分析结果显示，给予Tat-HA-NR2B9C多肽预处理组动物的脑梗死面积明显小于生理盐水对照组（图10）。在脑损伤造模1h后静脉注射Tat-HA-NR2B9C多肽，大鼠的神经学评分和脑梗死面积明显小于给予Tat-HA-NR2BAA的阴性对照组（图11）。上述结果说明无论是预先还是缺血后给予Tat-HA-NR2B9C多肽，对缺血性脑损伤均具有明显的保护作用。进一步的量效实验表明Tat-HA-NR2B9C多肽在极低的剂量下（0.06 nmol/g）即可发挥脑保护作用，其最佳剂量为0.3 nmol/g（图12）。时效关系实验则显示Tat-HA-NR2B9C多肽的最佳作用时间窗为脑缺血1～3h之内（图13）。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京医科大学

 

<120>  多肽类似物Tat-HA-NR2B9C及其制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  31

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Tyr Pro Tyr Asp

1               5                   10                  15     

 

 

Val Pro Asp Val Ala Gly Lys Leu Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val

            20                  25                  30     

 

 

<210>  2

<211>  100

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

acggtcgtaa aaaacgccgc cagcgccgcc gcggttaccc gtacgacgtt ccggacgttg     60

 

ctggtaaact gtcttctatc gaatctgacg tttagaattc                          100

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

taccatggat acgccattcg                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  53

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cggcggcgct ggcggcgttt tttacgaccg taacccggat ccgcgtactg gtt            53

 

 

<210>  5

<211>  53

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

taccagcaac gtccggaacg tcgtacgggt aaccgcggcg gcgctggcgg cgt            53

 

 

<210>  6

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ttgaattcta aacgtcagat tcgatagaag acagtttacc agcaacgtcc ggaa           54

 

Claims (7)

1.多肽类似物Tat-HA-NR2B9C，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

2.多肽类似物Tat-HA-NR2B9C，其特征在于它的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

3.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒。

4.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒pED-Tat-HA-NR2B9C。

5.制备多肽类似物Tat-HA-NR2B9C的方法，其特征在于以pED的L-ansB-C基因的C端为模板，通过加端PCR的方法获得Tat-HA-NR2B9C多肽核酸序列，并转化宿主细胞进行培养，获得重组的pED-Tat-HA-NR2B9C。

6.根据权利要求5所述的制备多肽类似物Tat-HA-NR2B9C的方法，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或昆虫细胞。

7.权利要求1所述多肽类似物Tat-HA-NR2B9C在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用。

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