CN106916210A - 一种具有抗脑缺血作用的多肽及其应用 - Google Patents

一种具有抗脑缺血作用的多肽及其应用 Download PDF

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孙勇军
程晓昆
高子彬
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Abstract

一种具有抗脑缺血作用的多肽及其应用，所述多肽具有的肽链片段序列为：YGRKKRRQRRRQELGDSLDDEIAV。本发明提供的多肽可以高速高效地进入细胞，通过干扰CAPON的信号转导，显著抑制谷氨酸诱导的神经元兴奋性毒性损伤损伤，有效对抗MCAO模型大鼠的脑缺血损伤，上述多肽在制备治疗脑血管病药物中具有良好的应用前景。

Description

一种具有抗脑缺血作用的多肽及其应用
技术领域
本发明属于脑血管病的药物技术领域，本发明涉及一种具有抗脑缺血作用的多肽及其应用。
背景技术
脑缺血是一种死亡率高、致残率高的常见病、多发病。迄今为止，唯一有效的治疗方法就是溶栓疗法，但此疗法不仅有效率低，而且必须得在脑缺血发生后的短时间内给药才有效。因此，进一步研究脑缺血损伤的分子机制，发现新靶点，研制抗脑缺血新药意义重大。
N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体是一个重要的抗脑缺血靶点，研究人员已开发了多种NMDA受体拮抗剂，但由于疗效不确切或不良反应严重而被停用。近年来，研究人员将重点聚焦于NMDA受体亚型的研究。研究发现，脑缺血时，含GluN2A的NMDA受体主要介导促存活作用，而含GluN2B的NMDA受体则主要介导促死亡作用。因此，选择性地阻断GluN2B或激活GluN2A都可对抗脑缺血损伤。目前，主要基于GluN2B设计治疗策略，共有3条途径：选择性GluN2B拮抗剂、GluN2B/PSD-95解偶联剂和GluN2B/DAPK1解偶联剂。
虽然通过上述三种方法选择性阻断GluN2B介导的促死亡信号都可对抗脑缺血损伤，但把着眼点放在比NMDA受体更下游的促死亡信号分子上，可能会进一步提高选择性，减小由药物引起的精神异常、运动功能恶化、幻觉等副作用。神经元型一氧化氮合酶（nNOS）是NMDA受体下游的促死亡信号分子，脑缺血后，由NMDA受体所介导的nNOS过度激活是神经元损伤的重要原因，但通过直接抑制nNOS活性来治疗脑缺血会严重损伤动物的学习记忆功能。2010年，《Nature Medicine》上刊登了 Zhou L等的研究论文，他们根据PSD-95与nNOS结合的构效关系，设计合成了小分子化合物ZL006，该化合物可通过抑制nNOS与PSD-95的结合来有效对抗脑缺血损伤。神经元型一氧化氮合酶羧基末端PDZ配体（CAPON）是体内nNOS的特异性配体，脑缺血时可通过特异性介导nNOS-CAPON-p38MAPK信号，引起神经元兴奋性毒性损伤，通过干扰CAPON的功能可有效治疗缺血损伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗脑缺血作用的多肽及其应用，其特征在于所述多肽具有的肽链片段序列为：YGRKKRRQRRRQELGDSLDDEIAV。
本发明提供的多肽可以高速高效地进入细胞，可显著抑制谷氨酸诱导的皮层神经元兴奋性毒性损伤，也可明显降低MCAO模型大鼠的神经行为评分和相对脑梗死面积。由上述结果可知，无论是对体外神经元，还是对脑缺血模型大鼠，该多肽均表现出良好的治疗作用，可以用于治疗缺血性脑血管病或脑梗塞。该多肽的作用机制为干扰CAPON的功能，拮抗nNOS下游信号转导。
本发明提供的多肽具有较好的穿越血脑屏障作用，可以按常规药剂学制备成粉针剂注射给药。
本发明提供的多肽具有在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中良好的应用前景。
附图说明
图1：YV-24对Glu兴奋性毒性损伤的影响（n=6）
注：*P＜0.05与Glu组相比；YV-24为Tat-CAPON13C；YA-24为Tat-CAPON13C∆AA。
结论：0.5和2 μmol/L的多肽产生显著的抑制谷氨酸兴奋性毒性损伤作用。
图2：各组动物的神经评分情况（n=6）
注：* P＜0.05与溶剂组相比。
结论：多肽给药组的神经评分明显比溶剂组低，并且具有统计学意义。这表明，该多肽可抑制脑缺血损伤造成的神经行为障碍。
图3：各组动物的死亡情况（n=12）
结论：假手术组没有死亡，溶剂组和给药组的死亡数分别为4和3（每组共12只动物），给药组动物死亡数低于溶剂组。
图4：各组动物的相对梗死面积（n=6）
注：* P＜0.05与溶剂组相比。
结论：给药组的相对梗死面积明显小于溶剂组，并具有显著差异。这表明，该多肽可有效对抗脑缺血导致的脑组织梗死。
图5：多肽的作用机制图
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
实施例1.多肽（YGRKKRRQRRRQELGDSLDDEIAV）的制备
1、多肽合成过程：首先用DCM浸泡树脂(Fmoc-Val-Wang Resin)5-10分钟，用DMF清洗5次，用20%的六氢吡啶脱保护10-20分钟，用DMF清洗5次，然后加保护氨基酸原料、缩合剂等缩合30分钟，用DMF清洗5次，再脱保护—清洗—缩合—清洗，最后脱保护，清洗，抽干，用TFA切割，切割液用乙醚沉淀，用乙醚清洗2-3次，抽干，这是整个多肽合成一个大概过程。
2、多肽合成是从C端开始，也就是从右到左的合成，先是用常规的氨基酸原料合成这段序列YGRKKRRQRRRQELGDSLDDEIAV，所用的氨基酸原料分别为Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Ser(Tbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH 、Fmoc-Arg(pbf)-OH 、Fmoc-Lys(Boc)-OH 、Fmoc-Gly-OH Fmoc-Tyr(tBu)-OH。缩合完这条序列，通过MS判断是否正确。最后将粗品多肽通过HPLC进行纯化，冻干后就得到精品多肽（＞98%）。
实施例2.多肽对谷氨酸兴奋性毒性作用的影响
体外培养至11天的胎鼠皮层神经元细胞，用HBSS洗板3次，给予50 μM 谷氨酸孵育20min，谷氨酸孵育的同时分别给予蒸馏水、YV-24或YA-24，多肽使用浓度为0.05、0.5和2 μmol/L，孵育结束后，撤掉所有药物，用HBSS洗板3次，加入维持培养基，放入37℃、含5% CO2的培养箱中继续培养24 h，用MTT法检测细胞的损伤情况。
实施例3.多肽对脑缺血后动物神经行为评分和死亡率的影响
1、大鼠MCAO模型的建立及给药：Sprague Dawley (SD) 大鼠, 雄性,体重(300±20)g。采用颈内动脉栓线法制备大脑中动脉阻塞(MCAO)脑缺血模型。大鼠用10%水合三氯乙醛(300 mg·kg - 1 , i. p. ) 麻醉后，仰卧位固定于手术台上，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,轻轻剥离迷走神经，结扎颈外动脉和颈内动脉上的所有分支。颈外动脉切口,插入外径为0.28 mm 的尼龙钓鱼线(头端用硅有机树脂处理使光滑)，转过颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后徐徐插入，至有轻微阻力为止(自分叉处约20 mm)，阻断大脑中动脉的所有血供。缺血1.5 h 后，轻轻拔出尼龙线,恢复血供进行再灌注。在实验过程中保持体温(37±0.5) ℃。从右侧大脑缺血时开始计时，缺血后1.5 h，按照3 nmol/g的浓度尾静脉注射给予YV-24，溶剂组按照同体积给予生理盐水，假手术组不做处理。实验结束后，分别测定各组的神经评分、死亡率和相对脑梗死面积。
2、大鼠MCAO模型的检测指标，主要通过以下三个方面对模型进行评价：
1）统计各组大鼠死亡率
2）神经功能缺失评分
采用5分制法在动物建模成功7天后进行评分：
0分：无神经损伤症状
1分：不能伸展对侧前爪
2分：不能完全伸展对侧前肢
3分：悬尾时向同侧抬头
4分：向对侧转圈
分值越高，说明动物行为障碍越严重。
3）相对脑梗死面积测定
动物断头取脑，去嗅球、小脑和脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血污，吸干后于-20℃冷冻5～10 min使变硬，沿冠状面切成约2 mm厚的脑片，置2% TTC染液中37℃温育15 min。正常组织呈鲜红色，梗死组织呈灰白色。将显色后的脑片置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定24 h，细心将梗死区挖下，烘干至恒重，称重。以梗死组织的重量占缺血侧脑组织重量的百分比作为相对梗死面积。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北科技大学
<120> 一种具有抗脑缺血作用的多肽及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合多肽
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Glu Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Asp Asp Glu Ile Ala Val
20

Claims (6)

1.一种具有抗脑缺血作用的多肽及其应用，其特征在于所述多肽具有的的肽链片段序列为：YGRKKRRQRRRQELGDSLDDEIAV。
2.权利要求1所述多肽在制备治疗脑血管病药物中的应用。
3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于所述脑血管病为缺血性脑血管病或脑梗塞。
4.一种药物，其特征在于它的活性成分为权利要求1所述的多肽，所述药物为如下1）、2）和/或3）的药物：1）缺血性脑血管病；2）脑梗塞。
5.权利要求1所述多肽在治疗脑血管病中的应用。
6.根据权利要求1所述的多肽在制备治疗脑血管病药物中的应用，其中的多肽按常规药剂学制备成注射剂、粉针剂、片剂或胶囊剂。
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