RU2537560C2

RU2537560C2 - Тетрапептид и средство, обладающее церебропротекторной и антиамнестической активностями (варианты)

Info

Publication number: RU2537560C2
Application number: RU2013119051/04A
Authority: RU
Inventors: Роман Данилович ДЕЙКО; Елена Артуровна КАМПЕ-НЕММ; Александр Александрович Колобов; Владимир Михайлович Шпень; Сергей Юрьевич Штрыголь
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ВЕРТА"
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2015-01-10
Also published as: RU2013119051A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новым тетрапептидам, представляющим собой Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-Arg-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Lys)-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(NMe-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(NMe-Arg)-Arg-amide; Acetyl-(D-Lys)-(D-Lys)-(D-Arg)-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Arg)-(D-Arg)-(D-Lys)-(D-Lys)-amide, которые обладают церебропротекторной и антиамнестической активностью. Предложенные пептиды оказывают стимулирующее влияние на холинергические процессы в головном мозге, обладают малой токсичностью и перспективны для использования в медицинской практике в качестве активного начала лекарственных средств. 11 н.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новым пептидам общей формулы: Ацетил-А₁-А₂-В₁-В₂-амид, где A₁- лизин, D - лизин или D - аргинин; А₂- лизин, D - лизин, N - метил-лизин или D - аргинин; В₁- аргинин, D - аргинин, N - метил-аргинин или D - лизин; В₂- аргинин, D - аргинин или D - лизин, и препаратам на основе указанных пептидов, обладающих церебропротекторной и антиамнестической активностью. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии, косметологии, пищевой и молочной промышленности, а также смежных отраслях производства.

В современных условиях острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) принадлежат к числу заболеваний, лидирующих среди причин смертности и инвалидизации больных, что обусловливает большое значение этой проблемы в медицинском и социально-экономическом аспектах [RU 2386439, 2010; Гусев Е.И. и др. Терапия ишемического инсульта // Consilium Medicum. - 2003, - т.5, №8, - с.21-29; Agyeman О. et al. Time to admission in acute ischemic stroke and transient ischemic attack // Stroke. - 2006. - Vol.37, - p.963-966; C.J. Murray, A.D. Lopez. The global burden of disease: a comprehensive assessment of mortality and disability from diseases, injuries and risk factor sin 1990 projected to 2020 // Harvard University Press. - 2000. - №3, - p.105]. Ежегодно в мире инсульт переносят около 6 миллионов человек и умирают от этого заболевания 4,7 миллионов человек. Инвалидизация вследствие сосудистых заболеваний головного мозга занимает ведущее место среди всех заболеваний, при этом после перенесенного инсульта трудоспособно только 20% пациентов. В России инсульт занимает второе место в структуре общей смертности населения, уступая лишь кардиоваскулярной патологии. По данным ВОЗ в России заболеваемость острыми сосудистыми заболеваниями головного мозга (ОСЗМ) составляет 400 человек на 100 тысяч населения. При этом наблюдается увеличение распространенности инсульта у лиц трудоспособного возраста; частота инсультов у работоспособных лиц в возрасте 25-65 лет в настоящее время составляет 2,5-3 для городского населения, а для сельского 1,9 на 1000. Таким образом, решение проблемы предупреждения и лечения ОСЗМ, в частности создание новых высокоэффективных и безопасных средств, обладающих церебропротекторными и противоишемическими свойствами, является проблемой чрезвычайной медицинской и социальной значимости.

В настоящее время для лечения больных с признаками недостаточности кровообращения мозга применяют такие лекарственные средства, как диазепам, феназепам, пирацетам, аминалон, пиридитол, пантогам, натрия оксибутират и другие, стимулирующие окислительно-восстановительные процессы, усиливающие утилизацию глюкозы, улучшающие регионарный кровоток в тканях мозга [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие по фармакотерапии для врачей. В 2 ч. - Вильнюс, 1993, - ч.1, - с.101-110]. Такие препараты, как диазепам, феназепам, обладают выраженными негативными побочными эффектами - вызывают миорелаксацию, снижение мышечного тонуса, общее седативное действие, дневную сонливость, нарушение памяти, а при длительном применении - привыкание, лекарственную зависимость. Наиболее известным церебропротекторным средством является пирацетам, применяемый в виде 20% раствора [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: 2002. - T.1, - с.111], который оказывает положительное влияние на обменные процессы, кровоснабжение и биоэнергетические процессы мозга, однако не обладает антиоксидантным действием и имеет негативные побочные действия - обострение коронарной недостаточности и возникновение диспептических явлений, может вызвать нарушение сна, повышение судорожной готовности, неспецифическое общее возбуждение. В связи с этим рекомендуют применять комбинированные препараты на его основе, улучшающие мозговой кровоток и церебральный энергетический метаболизм, например фезам (пирацетам и циннаризин), тиотриазолин и пирацетам [RU2386439, 2010; RU2248203, 2005]. Недостатком этих препаратов является то, что они только стимулируют синтез нейротрофических факторов, а сами не обладают нейротрофической активностью [Korsching S. The neurotrophic factor concept: a reexamination // Neuroscience. - 1993. - Vol.13, N 7. - p.2739]. Кроме этого, эти препараты не лишены побочных эффектов и противопоказаний.

Наряду с химико-фармацевтическими препаратами для лечения данной группы заболеваний широко используют биопрепараты, в частности препараты на основе природных белков и пептидов. Так, известен биологически активный белково-полипептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа, с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, с общей концентрацией белка 0,8-4,2 мг/мл в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, получаемый из быстроразмороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных [RU2445106, 2012].

Широко известен препарат церебролизин, представляющий собой безбелковый гидролизат мозга, состоящий из аминокислот, низкомолекулярных пептидов и микроэлементов, сырьем для получения которых служит головной мозг свиней [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие по фармакотерапии для врачей. В 2 ч. - Вильнюс, 1993, - ч.2, - с.84-88]. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот молекулярной массы не выше 10000 дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, крайне низкий регенеративный, в том числе и репаративный, потенциал для нервной ткани. Использование препарата не позволяет достигнуть существенного восстановления анатомической структуры и функциональной активности нейронов головного и спинного мозга после их повреждения [Кривицкая Г.Н., Гельфанд В.Б., Попова Э.Н. Деструктивные и репаративные процессы при очаговых поражениях головного мозга. - М.: Медицина, 1980. - 214 с.; Несмеянова Т.Н. Стимуляция восстановительных процессов при травме спинного мозга. - М.: Наука, 1971. - 255 с.; Крыжановский Г.Н., Карабань И.Н., Магаева С.В. и др. Компенсаторные и восстановительные процессы при паркинсонизме. - Киев: АМН Украины, 1995. - 186 с.]

Известны низкомолекулярные белки (15-30 кД), синтезируемые клеточными элементами центральной нервной системы: фактор роста нейронов, производный из мозга нейротрофический фактор, нейротрофины -3, -4, -5, основной и кислый факторы роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, астроцитарный фактор S-100; протеин, липопротеин [Ernfors P., Ivanez C.F., Ebendal T. Molecular cloning and neurotrophic activities of a protein with structural similarities to nerve growth factor; developmental and topographical expression in the brain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - Vol.87, N 9. - p.5454-5458; Elde R., Cao Y., Cintra A. Prominent expression of acidic fibroblast growth factor in motor and sensor neurons // Neuron. - 1991. - Vol.7, N 8. - p.349-364]. Добавление малых доз этих веществ в культуры нейронов обеспечивает жизнедеятельность клеток, возможность образования и роста нейритов через стимуляцию биосинтеза РНК, ДНК, белка. Однако экспериментально установлено, что эффективность их применения ограничена нейро- протективным действием, а нейротрофические эффекты проявляются в поздние сроки.

Наиболее перспективным направлением создания новых препаратов, обладающих церебропротекторным действием является синтез аналогов эндогенных пептидных субстанций - нейропептидов, которые служат средством интегрального модулирования функций центральной нервной системы, репаративных процессов, памяти, двигательной активности, ощущения боли и удовольствия и др. и могут функционировать как нейрогормоны, нейротрансмиттеры или нейромодуляторы [Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. - М.: Мир, 1985. - 456 с.; Теппермен Дж., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы: Пер. с англ. - М.: Мир, 1989. - 656 с.; Бахарев В.Д. Клиническая нейрофизиология регуляторных пептидов. - Свердловск: Изд-во Урал. ун-та, 1989. - 136 с.].

Известен препарат семакс (метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин) - лекарственное средство, относящееся к классу регуляторных пептидов и оказывающее ноотропное, психостимулирующее, нейрозащитное, антиоксидантное и антигипоксическое действие, который представляет собой модифицированный фрагмент белкового адренокортикотропного гормона (АКТГ), содержащий семь аминокислотных остатков [ru.wikipedia.org/wiki/Семакс]; известен тетрапептид L-аланил-L-глутамил-L-аспарагил-L-пролин общей формулы L-Ala-L-Glu-L-Asp-L-Pro [RU2155063, 2000], стимулирующий функциональную активность нейронов центральной и периферической нервной системы за счет нормализации метаболических процессов, стимуляции показателей системы антиоксидантной защиты, улучшения электрофизиологических характеристик. Недостатками этих соединений является недостаточно высокая церебропротекторная и антиамнестическая активность.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по структуре и достигаемому эффекту является ранее полученный авторами тетрапептидный препарат NP-4 ацетил-Lys-Lys-Arg-Arg-амид, гомологичный по первичной последовательности фрагменту адрено- кортикотропного гормона (АКТГ) [RU 2356573, 2009].

Тетрапептид обладает сочетанными антиишемической и антигипоксической активностями и перспективен для лечения ОСЗМ, однако его активность, как показали проведенные эксперименты, недостаточно высока.

Технической задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание новых пептидных соединений и расширение круга лекарственных средств, сочетающих высокую церебропротекторную и антиамнестическую активности с минимальным негативным воздействием на организм.

1. Техническая задача была решена в ходе исследования пептидов, входящих в состав природных гормонов, регулирующих жизнедеятельность высших организмов. Основой для создания новых церебропротекторов явилась структура типа Lys-Lys-Arg-Arg, гомологичная по первичной последовательности фрагменту адренокортикотропного гормона (АКТГ) и характеризующаяся наличием четырех положительных зарядов. В результате этих исследований была создана группа конформационно ограниченных пептидов, содержащих N-метилированные и D-аминокислотные остатки, обладающих сочетанной церебропротекторной и антиамнестической активностями, в которую входили следующие варианты соединений этой группы: Асе-tyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-Arg-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Lys)-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(NMe-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(NMe-Arg)-Arg-amide; Acetyl-(D-Lys)-(D-Lys)-(D-Arg)-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Arg)-(D-Arg)-(D-Lys)-(D-Lys)-amide.

При этом средство, обладающее церебропротекторной и антиамнестической активностями, содержит в качестве активного начала не менее одного тетрапептида, выбранного из группы, в которую входят: Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-Arg-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Lys)-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(NMe-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(NMe-Arg)-Arg-amide; Acetyl-(D-Lys)-(D-Lys)-(D-Arg)-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Arg)-(D-Arg)-(D-Lys)-(D-Lys)-amide.

Пептиды получают по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе или в растворе, при котором первая аминокислота присоединяется к нерастворимому полимеру, наращивание полипептидной цепи производится последовательно или на стадии конденсации используются защищенные фрагменты, удаление избытков реагентов осуществляется фильтрованием с последующей промывкой пептидил-полимера [J.M. Steward and J.D. Young, ″Solid Phase Peptide Synthesis″, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969]. Синтез может быть проведен с использованием Boc/Bzl или Fmoc/tBu технологии или любой другой системы ортогональных защитных групп. По завершении сборки целевой последовательности проводят отщепление пептида от полимера, сопровождающееся, как правило, удалением постоянных защитных групп. Очистку конечного продукта проводят, как правило, хроматографическими методами, например с помощью обращенно-фазовой или ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученные соединения характеризуются данными аналитической ОФ ВЭЖХ, аминокислотного и масс-спектрального анализов. Структура и шифры пептидов, полученных в ходе выполнения проведенных исследований, приведены в таблице 1.

Таблица 1
Структура синтезированных пептидов
N п/п	Шифр	Структура пептида
1	КК-1	Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide
2	КК-2	Acetyl-Lys-(D-Lys)-Arg-Arg-amide
3	КК-3	Acetyl-Lys-Lys-(D-Arg)-Arg-amide
4	КК-4	Acetyl-Lys-Lys-Arg-(D-Arg)-amide
5	КК-5	Acetyl-(D-Lys)-Lys-(D-Arg)-Arg-amide
6	КК-6	Acetyl-Lys-(D-Lys)-(D-Arg)-Arg-amide
7	КК-7	Acetyl-Lys-(NMe-Lys)-Arg-Arg-amide
8	КК-8	Acetyl-Lys-Lys-(NMe-Arg)-Arg-amide
9	КК-9	Acetyl-(D-Lys)-(D-Lys)-(D-Arg)-(D-Arg)-amide
10	КК-10	Acetyl-(D-Arg)-(D-Arg)-(D-Lys)-(D-Lys)-amide

Проведенные исследования показали, что все полученные соединения за счет включения в их структуру N-метилированных и D-аминокислотных остатков обладают повышенной устойчивостью по отношению к протеазам сыворотки крови по сравнению с известными аналогами.

Исследование цитотоксичности полученных соединений в модельной системе in vitro показало, что все полученные соединения нетоксичны и не влияют на жизнеспособность тимоцитов мыши в широком диапазоне концентраций - от 0.01 до 100 мкг/мл.

Для оценки церебропротекторного действия пептиды исследованы в модели острой церебральной ишемии у крыс (билатеральная каротидная окклюзия, наркоз - пропофол). Пептиды КК-1, КК-2, КК-3, КК-4, КК-9 и КК-10 проявили высокую церебропротекторную активность в дозе 20 мкг/кг при интраназальном введении. По эффективности КК-10 на 1-е сутки церебральной ишемии, в отличие от семакса, было достоверно эффективнее активности пирацетама. Пептиды КК-2, КК-4 и КК-9 показали одинаковый результат, снижая летальность начиная с 1-х суток до 16.7%, что статистически значимо превосходит показатели групп контроля патологии и пирацетама. Лидером оказался пептид КК-3, при лечении которым в течение первых 3 суток все крысы выжили. По отсутствию смертности в этот период пептид КК-3 достоверно превосходит мексидол, пирацетам, семакс и NP-4. На 4-е сутки и далее летальность составила 16.7%. Летальность в группе, получавшей NP-4, составила 50%.

Антиамнестическое действие пептидов оценивали на модели антероградной амнезии (скополамин) в тесте условной реакции пассивного избегания. В группах, получавших пептиды КК-1, КК-2, КК-5, КК-8 и КК-10 в дозе 20 мкг/кг интраназально, обученность составила 100% против 90% в группе интактного контроля. В группах, получавших аналогичные дозы пептидов КК-3, КК-7 и КК-9, этот показатель составил 80% против 30%, 50% и 56% в группах, получавших семакс, пирацетам и NP-4, соответственно.

Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Синтез пептидов

Синтез пептидов твердофазным методом с использованием Boc/Bzl стратегии был проведен на синтезаторе пептидов ABI 430A (Applied Biosystems, США). Для временной защиты α-аминофункции использовали трет-бутилоксикарбонильную группу. Для блокирования боковых радикалов аргинина и лизина использовали мезитиленсульфонильную и 2-хлорбензилоксикарбонильную группировки, соответственно. В качестве нерастворимой матрицы был использован 4-метил-бензгидриламинополимер (1% сополимер стирола и дивинилбензола) с начальной емкостью 0.8 мМоль/г. Наращивание полипептидной цепи вели методом in situ. Деблокирование проводили неразбавленной трифторуксусной кислотой (TFA) два раза по 1 минуте. Нейтрализацию при первой конденсации осуществляли путем добавления 3^х-кратного избытка диизопропилэтиламина (DIPEA) непосредственно в реакционную смесь на стадии присоединения аминокислотного остатка; повторную конденсацию проводили после дополнительной промывки пептидил-полимера 10% раствором DIPEA в диметилформамиде (DMF). Присоединение аминокислотных остатков проводили методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, используя 3 кратные избытки реагентов.

После присоединения аминокислотных остатков, соответствующих последовательности синтезируемых пептидов, проводили ацетилирование N-концевой аминогруппы, используя 40 эквивалентов уксусного ангидрида в DMF. Удаление постоянных защитных групп и отщепление пептидов от нерастворимой матрицы проводили безводным жидким фтористым водородом в присутствии скавенджеров. В сосуд с пептидил-полимером переносили 9.5 мл фтористого водорода и 0.3 мл м- крезола и 0.2 мл этандитиола и перемешивали при 0°С в течение 1 часа. Затем фтористый водород упаривали и пептид высаживали эфиром из трифторуксусной кислоты.

Выделенные грубые продукты подвергались очистке методом полупрепаративной обращено-фазовой ВЭЖХ на колонке Waters Prep Nova-Pak HR С-18, 6µ, 60Å,19×300mm в градиенте ацетонитрила 5-75% за 30 минут. Детекция при 220 нм. Фракцию, соответствующую пику основного продукта, собирали и лиофилизировали.

Полученные целевые соединения были охарактеризованы данными масс-спектрометрии, аминокислотного и ВЭЖХ анализов. Условия ВЭЖХ анализа: аналитический хроматограф Gilson, Франция, колонка DeltaPak С-18, 5µm, 100A°, 3,9×150 mm; градиент (1-20)% ацетонитрила в 0,1% TFA за 25 минут;

Условия аминокислотного анализа: аминокислотный анализатор LKB Alpha Plus 4151, Швеция; гидролиз:

- 4М метансульфокислота, содержащая 0.2% триптамина, 110°С, 22 часа;

- 12N соляная кислота, пропионовая кислота (1:1), 110°С, 22 часа. Условия масс-спектрального анализа: масс-спектрометр Voyager-DE BioSpec-trometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США.

Все синтезированные пептиды имели аминокислотный состав и молекулярную массу, соответствующие теоретическим значениям. Чистота соединений по данным аналитической ОФ-ВЭЖХ составляла не менее 95%.

Структуры пептидов, молекулярные веса и времена выхода в условиях аналитической ОФ ВЭЖХ приведены в таблице 2.

Таблица 2
Структуры и физико-химические характеристики пептидов
Шифр	Структура пептида	Молекулярный вес		Время выхода, мин
Шифр	Структура пептида	Теор.	Эксп.	Время выхода, мин
КК-1	Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide	627.80	628.44	8.83
КК-2	Acetyl-Lys-(D-Lys)-Arg-Arg-amide	627.80	628.44	7.36
КК-3	Acetyl-Lys-Lys-(D-Arg)-Arg-amide	627.80	628.44	8.92
КК-4	Acetyl-Lys-Lys-Arg-(D-Arg)-amide	627.80	628.44	8.36
КК-5	Acetyl-(D-Lys)-Lys-(D-Arg)-Arg-amide	627.80	628.45	7.44
КК-6	Acetyl-Lys-(D-Lys)-(D-Arg)-Arg-amide	627.80	628.45	7.14
КК-7	Acetyl-Lys-(NMe-Lys)-Arg-Arg-amide	641.80	642.46	8.60
КК-8	Acetyl-Lys-Lys-(NMe-Arg)-Arg-amide	641.80	642.46	9.51
КК-9	Acetyl-(D-Lys)-(D-Lys)-(D-Arg)-(D-Arg)-amide	627.80	628.45	7.12
КК-10	Acetyl-(D-Arg)-(D-Arg)-(D-Lys)-(D-Lys)-amide	627.80	628.44	7.49

Пример 2. Исследование устойчивости пептидов по отношению к сывороточным протеазам

Лиофильно высушенные пептиды растворяли в ДМСО в концентрации 10 мг/мл (в пересчете на содержание пептида). Использована пулированная сыворотка от 6-8 здоровых доноров.

К 1 мл культуральной среды RPMI-1640, содержащей 25% сыворотки крови человека, прогретой до +37±1°С в течение 15 минут, добавили 5 мкл раствора пептида, тщательно перемешали и поместили в термостат на 37°С. Через определенный промежуток времени отобрали 100 мкл реакционной смеси, к ним добавили 20 мкл 15% водной трихлоруксусной кислоты и интенсивно перемешали. Затем добавили 5 мкл 0.5М NaOH, образец охладили до 0- +4°С и центрифугировали при 16000 g в течение 3 минут для осаждения преципитировавших белков. Образцы реакционной смеси отбирали в следующие временные интервалы: 0, 0.25, 1, 2, 4, 24 часа. В период между отборами проб реакционная смесь находилась в термостате на 37°С. Образцы анализировали с помощью ОФ ВЭЖХ. Условия хроматографического анализа: аналитический хроматограф Gilson, Франция, колонка DeltaPak С-18, 5µm, 100А°, 3,9×150 mm; градиент (1-25)% ацетонитрила в 0,1% TFA за 25 минут. Результаты представлены в процентах, как отношение количества сохранившегося пептида к количеству внесенного в реакционную среду. Количество пептида рассчитывалось как площадь под кривой соответствующего пика, полученного при ВЭЖХ анализе образца.

Результаты исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3
Пептид	Время инкубации, ч
Пептид	0	0.25	1	2	4	24
NP-4	100	23±9	10±7	-	-	-
КК-1	100	85=12	78±19	62±16	45±11	15±14
КК-4	100	98±3	96±4	92±5	85±4	25±2
КК-7	100	92±10	83±7	75±14	56±17	8±6
КК-9	100	98±3	96±4	97±5	95±10	85±13
КК-10	100	99±4	98±5	98±6	96±14	82±12

Согласно приведенным данным пептиды, содержащие D-аминокислоты, обладают большей устойчивостью по отношению к протеазам сыворотки крови человека, чем пептид NP-4. Максимальная стабильность отмечена у соединений, имеющих все аминокислотные остатки в D-конфигурации (КК-9 и КК-10).

Пример 3. Исследование цитотоксичности пептидов

Токсичность синтезированных пептидов была оценена в системе in vitro по отношению к тимоцитам мыши. Тимоциты выделяли, дважды отмывали культуральной средой RPMI 1640 и ресуспендированы в той же среде, содержащей 2% фетальной сыворотки теленка. Клеточная суспензия была помещена в ячейки 96-луночного планшета (1×10⁶ клеток на ячейку), в которые затем добавили исследуемые пептиды, растворенные в культуральной среде, таким образом, что конечные концентрации пептидов составили 0.01, 0.1, 1, 10 и 100 мкг/мл. После инкубации в СО₂ инкубаторе в течение 4 часов при 37°С жизнеспособность клеток оценивали по окрашиванию эозином Б. В контрольные ячейки была добавлена только культуральная среда.

Результаты эксперимента показали, что пептиды КК-1, КК-2, КК-3, КК-4, КК-5, КК-6, КК-7, КК-8, КК-9 и КК-10 в диапазоне концентраций от 0.01 до 100 мкг/мл цитотоксической активностью по отношению к тимоцитам мыши не обладают.

Пример 4. Изучение церебропротекторного действия пептидов

Эксперимент выполнен на 92 белых беспородных крысах самцах массой 180-220 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Церебропротекторную активность оценивали на модели необратимой билатеральной каротидной окклюзии [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.].

Общие сонные артерии перевязывали под пропофоловым наркозом (диприван, «Fresenius Kabi», Австрия, 60 мг/кг внутрибрюшинно), затягивая лигатуры в момент начала выхода животных их наркоза. В течение 3-5 мин после выхода из наркоза крысам вводили препараты сравнения: 3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат (мексидол, НВК «Фармасофт», Россия) в дозе 100 мг/кг, 2-оксо-1-пирролидин-ацетамид (пирацетам, «Дарниця», Украина) в дозе 400 мг/кг - внутривенно в хвостовую вену, гептапептид семакс (Инновационный НПЦ «Пептоген», Россия) - интраназально в дозе 20 мкг/кг, тетрапептид NP-4 - интраназально в дозах 2 и 20 мкг/кг. Пептиды КК-1, КК-2, КК-3, КК-4, КК-9, КК-10 вводили интраназально в дозе 20 мкг/кг. Животным группы контроля патологии вводили в вену изотонический раствор NaCl. Введение препаратов продолжали в течение 4 дней 1 раз в сутки. Регистрировали летальность, оценивая статистическую значимость межгрупповых различий с использованием углового преобразования Фишера. Наблюдение за животными продолжали в течение 10 дней.

Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4
Сравнительное влияние препаратов на летальность крыс в модели острого нарушения мозгового кровообращения (необратимая билатеральная каротидная окклюзия)
Группа, препарат, доза, число животных	Период наблюдения, ч
Группа, препарат, доза, число животных	24	48	72	96 и далее
Контрольная патология (БКО), n=10	7/70%	7/70%	8/80%	9/90%
БКО+мексидол 100 мг/кг в/в, n=10	4/40%	5/50%	5/50%	6/60%
БКО+пирацетам 400 мг/кг в/в, n=10	6/60%	7/70%	7/70%	7/70%
БКО+семакс 20 мкг/кг и/н, n=6	2/33,3%	2/33,3%	2/33,3%∗	2/33,3%∗
БКО+NP-4, 2 мкг/кг и/н, n=10	7/70%	7/70%	7/70%	7/70%
БКО+NP-4, 20 мкг/кг и/н, n=10	3/30%∗	4/40%	4/40%∗	5/50%∗
БКО+КК-1 20 мкг/кг и/н, n=6	2/33,3%	2/33,3%	2/33,3%∗	2/33,3%∗
БКО+КК-2 20 мкг/кг и/н, n=6	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^#^
БКО+КК-3 20 мкг/кг и/н, n=6	0/0%∗^#^^&$	0/0%∗^#^^&$	0/0%∗^#^^&$	1/16,7%∗^#^
БКО+КК-4 20 мкг/кг и/н, n=6	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^#^
БКО+КК-9 20 мкг/кг и/н, n=6	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^	1/16,7%∗^#^
БКО+КК-10 20 мкг/кг и/н, n=6	1/16,7%∗^	2/33,3%∗	2/33,3%∗	2/33,3%∗
Примечания: 1. БКО - билатеральная каротидная окклюзия; 2. в/в - внутривенно, и/н - интраназально; 3. В числителе - абсолютное количество животных, в знаменателе - %. 4. Статистически значимые различия (p<0,05): ∗ - с показателем группы контрольной патологии, ^# - с показателем группы мексидола, ^ - с показателем группы пирацетама, ^&- с показателем группы семакса, ^$- с показателем группы NP-4 (20 мкг/кг).

Как видно из данных, представленных в таблице 4, в группе контрольной патологии уже за 1-е сутки погибло 70% животных, на 3-и сутки летальность составила 80%, начиная с 4-х суток - 90%, оставаясь далее неизменной, что соответствует данным литературы [Штрыголь С.Ю. Модуляция фармакологических эффектов при различных солевых режимах / С.Ю. Штрыголь. - X.: Ависта-ВЛТ, 2007. - 360 с.].

Эффективность известных церебропротекторов мексидола и пирацетама в данной модели ОНМК оказалась низкой: мексидол снижал летальность на 30%, пирацетам - на 20%, что не достигало статистически значимого уровня. Семакс оказался значительно эффективнее мексидола и пирацетама. Начиная с 3-х суток он достоверно (с 80% до 33.3%) снижал смертность животных, однако этот результат не имел статистически значимых различий с эффектами мексидола и пирацетама. Тетрапептид NP-4 в дозе 2 мкг/кг оказался столь же малоэффективным, как и пирацетам. В дозе 20 мкг/кг NP-4 проявил церебропротекторную активность, близкую к таковой семакса в такой же дозе, но статистически значимо снижал смертность животных уже с 1-х суток. Конечная летальность под влиянием NP-4 в дозе 20 мкг/кг составила 50%, что достоверно (на 40%) ниже, чем в группе контрольной патологии, и недостоверно (на 1,0-20%) ниже, чем в группах мексидола и пирацетама.

Пептиды КК-1, КК-2, КК-3, КК-4, КК-9 и КК-10 проявили высокую церебропротекторную активность в дозе 20 мкг/кг. Пептиды КК-2, КК-4 и КК-9 показали одинаковый результат, снизив летальность начиная с 1-х суток до 16.7%, что статистически значимо превосходит показатель группы контрольной патологии и эффекты пирацетама и NP-4.

Наиболее эффективным церебропротектором оказался пептид КК-3, на фоне применения которого в течение первых трех суток экспериментального ОНМК 100% животных оставались живыми. По отсутствию летальности в этот период пептид КК-3 в дозе 20 мкг/кг статистически значимо превосходит все препараты сравнения, включая NP-4. На 4-е сутки погибло 1 животное из 6 (16.7%). Таким образом, по снижению конечной летальности пептид КК-3 достоверно эффективнее, чем пирацетам и мексидол.

Пример 5. Изучение антиамнестического действия пептидов

Для выявления ноотропного (антиамнестического) действия пептидов КК-1, КК-2, КК-3, КК-4, КК-5, КК-6, КК-7, КК-8, КК-9, КК-10 использовали тест условной реакции пассивного избегания (УРПИ) [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р. У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.].

Для этого использовали 105 белых нелинейных мышей обоего пола массой 18-24 г. Всего методом случайного выбора было сформировано 15 групп животных, в каждую из которых входило примерно одинаковое количество самок и самцов. Группа интактного контроля обучаемости внутрибрюшинно получала 0,25 мл 0,9% раствора NaCl, группа контроля амнезии - только скополамин в дозе 1.5 мг/кг за 20-30 мин до формирования УРПИ. В остальных группах через 20-30 мин после внутрибрюшинного введения скополамина мышам интраназально вводили растворы исследуемых пептидов в дозе 20 мкг/кг и через 5 мин помещали их в освещенную камеру прибора для формирования УРПИ. Препаратами сравнения служили 2-оксо-1-пирролидин-ацетамид (пирацетам, «Дарниця», Украина) в дозах 200 мг/кг и 400 мг/кг врутрибрюшинно, гептапептид семакс (Инновационный НПЦ «Пептоген», Россия) - интраназально в дозе 20 мкг/кг и тетрапептид NP-4 -интраназально в дозе 20 мкг/кг. Определяли латентный период входа в темную камеру, где животные получали электроболевое раздражение. Через 24 ч проводили проверку воспроизводимости УРПИ по латентентному времени входа в темную камеру. Достигшими критерия обученности считали мышей, не входивших в темную камеру в течение 3 минут.

Для статистической оценки межгрупповых различий латентного периода входа в темную камеру использовали критерий t Стьюдента, количества животных, достигших критерия обученности - угловое преобразование Фишера.

Количественные данные исследования антиамнестических свойств приведены в таблице 5.

Таблица 5
Влияние препаратов на память мышей на модели антероградной амнезии в тесте УРПИ
Группа, Вещество	Доза, мг/кг, путь введения	n	УРПИ
Группа, Вещество	Доза, мг/кг, путь введения	n	ЛП исходный, с	ЛП через 24 ч, с	% мышей, достигших критерия обученности
Контроль обучаемости (интактный)	-	10	16,7±1,85	168,4±П,9∗	90∗
Контроль амнезии (скополамин)	-	14	22,6±6,04	33,2±5,67^#	0^#
Пирацетам	200 в/б	6	15,8±5,50	89,0±30,0^#	16,7∗^#
Пирацетам	400 в/б	6	33,3±4,83	124,4±26,0∗	50,0∗^#
Семакс	0,02 и/н	10	28,1±3,49	128,3±14,0∗^#	30∗^#
NP-4	0,02 и/н	9	28,7±7,85	126,7±17,9∗	55,6∗^#
КК-1	0,02 и/н	5	33,8±4,79	180,0±0,00∗^^&$	100∗^^^&$
КК-2	0,02 и/н	5	22,8±4,02	180,0±0,00∗^^&$	100∗^^^&$
КК-3	0,02 и/н	5	23,2±4,41	164,8±14,6∗^	80∗^^&
КК-4	0,02 и/н	5	29,4±6,51	116,0±20,5∗^#	20∗^#
КК-5	0,02 и/н	5	15,6±2,11	180,0±0,00∗^^&$	100∗^^^&$
КК-6	0,02 и/н	5	22,6±5,75	154,2±23,9∗	60∗
КК-7	0,02 и/н	5	27,6±3,64	154,0±26,8∗	80∗^^&
КК-8	0,02 и/н	5	15,0±4,21	180,0±0,00∗^^&$	100∗^^^&$
КК-9	0,02 и/н	5	31,8±12,6	150,0±26,8∗	80∗^^&
КК-10	0,02 и/н	5	13,0±1,34	180,0±0,00∗^^&$	100∗^^^&$
Примечания: 1. ЛП - латентный период входа в темную камеру; 2. в/б - внутрибрюшинно, и/н - интраназально; 3. Статистически значимые различия (p<0,05): ∗ - с показателем группы контроля амнезии, ^# - с показателем обучаемости контроля (интактного), ^ - с показателем группы пирацетама (200 мг/кг), ^^ - с показателем группы пирацетама (400 мг/кг), ^& - с показателем группы семакса, ^$- с показателем группы NP-4.

Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 5, все мыши группы интактного контроля обучаемости сформировали УРПИ: латентный период входа в опасную темную камеру через 24 ч возрос в среднем в 10 раз, при этом критерия обученности достигли 90% животных. Скополамин оказал типичный амнестический эффект: латентный период недостоверно повысился в среднем лишь в 1.5 раза, ни одна мышь не достигла критерия обученности.

Пирацетам проявил дозозависимые антиамнестические свойства, увеличив латентный период входа в темную камеру через 24 ч в среднем в 3.8-5.6 раза и повысив количество животных, достигших критерия обученности, до 16.7% (200 мг/кг) и до 50% (400 мг/кг, p<0.05 относительно контроля амнезии).

Семакс оказал аналогичный эффект, близкий к таковому у пирацетама в высокой дозе (увеличение латентного периода в 4.6 раза и повышение до 30% количества мышей, достигших критерия обученности, p<0.05 к контролю амнезии).

Антиамнестическое действие пептида NP-4 в дозе 20 мг/кг было близким к таковому пирацетама в дозе 400 мг/кг (увеличение латентного периода входа в темную камеру в 4.4 раза и повышение количества животных, достигших критерия обученности, до 55.6%, p<0.05 к контролю амнезии). По количеству мышей, достигших критерия обученности, эффект всех контрольных препаратов статистически значимо уступал показателю интактного контроля обучаемости (p<0.05).

Пептиды КК-1, КК-2, КК-5, КК-8 и КК-10 в дозе 20 мкг/кг и/н обладали ярко выраженной антиамнестической активностью: латентный период входа в темную камеру через 24 ч возрос в 5.5-13.8 раза и составил 180 с, т.е. 100% животных достигли критерия обученности. Это на 10% выше, чем в группе интактного контроля обучаемости, и статистически значимо выше показателей в группах, получавших пирацетам и семакс (p<0.05).

На фоне пептидов КК-3, КК-7, КК-9 латентный период входа в темную камеру возрос в 4.5-7.1 раза; число мышей, достигших критерия обученности, составило 80%, что статистически значимо превзошло эффект пирацетама (200 мг/кг) и семакса (p<0.05), практически не уступая показателю интактного контроля обучаемости (90%).

У животных, получавших пептид КК-6, антиамнестический эффект незначительно превысил таковой в группах семакса, пирацетама (400 мг/кг) и NP-4: латентный период в темную камеру увеличился в 6.8 раза, количество мышей, достигших критерия обученности, составило 60% (p<0.05 относительно контроля амнезии).

Результаты исследования дают основания считать, что все изученные пептиды оказывают стимулирующее влияние на холинергические процессы в головном мозге, поскольку механизм использованной модели амнезии обусловлен антихолинергическим действием скополамина.

Приведенные в примерах данные свидетельствуют, что заявляемое средство обладает выраженным церебропротекторным и антиамнестическим воздействием на организм и перспективно для использования в медицинской практике.

Claims

1. Тетрапептид общей формулы Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide.

2. Тетрапептид общей формулы Acetyl-Lys-(D-Lys)-Arg-Arg-amide.

3. Тетрапептид общей формулы Acetyl-Lys-Lys-(D-Arg)-Arg-amide.

4. Тетрапептид общей формулы Acetyl-Lys-Lys-Arg-(D-Arg)-amide.

5. Тетрапептид общей формулы Acetyl-(D-Lys)-Lys-(D-Arg)-Arg-amide.

6. Тетрапептид общей формулы Acetyl-Lys-(D-Lys)-(D-Arg)-Arg-amide.

7. Тетрапептид общей формулы Acetyl-Lys-(NMe-Lys)-Arg-Arg-amide.

8. Тетрапептид общей формулы Acetyl-Lys-Lys-(NMe-Arg)-Arg-amide.

9. Тетрапептид общей формулы Acetyl-(D-Lys)-(D-Lys)-(D-Arg)-(D-Arg)-amide.

10. Тетрапептид общей формулы Acetyl-(D-Arg)-(D-Arg)-(D-Lys)-(D-Lys)-amide

11. Средство, обладающее церебропротекторной и антиамнестической активностями, содержащее в качестве активного начала не менее одного тетрапептида, выбранного из группы, в которую входят: Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-Arg-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Lys)-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(NMe-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(NMe-Arg)-Arg-amide; Acetyl-(D-Lys)-(D-Lys)-(D-Arg)-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Arg)-(D-Arg)-(D-Lys)-(D-Lys)-amide.