WO2018199803A1 - Пептид с антидепрессантной активностью и лечебным действием против болезни альцгеймера - Google Patents

Пептид с антидепрессантной активностью и лечебным действием против болезни альцгеймера Download PDF

Info

Publication number
WO2018199803A1
WO2018199803A1 PCT/RU2018/000038 RU2018000038W WO2018199803A1 WO 2018199803 A1 WO2018199803 A1 WO 2018199803A1 RU 2018000038 W RU2018000038 W RU 2018000038W WO 2018199803 A1 WO2018199803 A1 WO 2018199803A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tetrapeptide
lys
disease
animals
activity
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000038
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Роман Данилович ДЕЙКО
Александр Александрович КОЛОБОВ
Елена Артуровна КАМПЕ-НЕММ
Владимир Михайлович ШПЕНЬ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ВЕРТА"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ВЕРТА" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ВЕРТА"
Priority to EP18789923.2A priority Critical patent/EP3639839A4/en
Priority to US16/643,711 priority patent/US10844091B2/en
Publication of WO2018199803A1 publication Critical patent/WO2018199803A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the invention relates to the field of biochemistry, and specifically to a new biologically active compound - a peptide having a therapeutic effect against brain disorders, such as Alzheimer's disease, and can be used to create a drug for the treatment of such diseases.
  • Antidepressants are understood as psychotropic drugs used to treat depression, affecting the level of neurotransmitters, in particular, serotonin, norepinephrine and dopalin, improving the patient’s mood, reducing melancholy, lethargy, tension, etc. [wikpen-dia.org/wik/ antidepressants]. At the same time, while maintaining the level of serotonin, some antidepressants are able, by slowing the formation of plaques in the brain, to improve the condition of patients with Alzheimer's disease, especially those who have suffered a stroke
  • AD Alzheimer's disease
  • cerebral cortex described further below, develop in the weakly myelinated transentorhinal region of the medial temporal lobe. Then, the destructive process develops according to the predicted type as it spreads to other areas of the cortex.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of the brain.
  • the localization of the plexus-forming neurons and the severity of the changes make it possible to differentiate the six stages in the progression of the disease from the 1st stage, which are not clinically manifested, to the V-VI stages, which indicate the complete development of AD.
  • a relatively small number of patients show especially early changes, indicating that advanced age is not a necessary condition for the development of lesions. Accordingly, AD is thus an age-related, but age-independent disease.
  • drugs are used for the symptomatic treatment of asthma with methods of compensatory therapy.
  • the use of these drugs can to some extent delay the progression of the disease, but not cure it.
  • cholinesterase inhibitors [Watkins, R. B. et all. J. Am. Med. Assoc. 1994. V. 271. P. 992-998], which increase the action time of the neurotransmitter acetylcholine on postsynaptic receptors, which leads to an increase in cholinergic innervation.
  • IChE cholinesterase inhibitors
  • the effectiveness of the use of IChE is significantly reduced in the late stages of AD.
  • their use is characterized by a sufficiently high toxicity and a number of other negative side effects.
  • AD memantine a modulator of the glutamatergic system [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008.V. 148 (5). P. 379-397].
  • the best results are obtained by its use in patients with mild to moderate dementia of the Alzheimer's type.
  • the drug does not provide a complete cure for AD.
  • the disadvantages of compensatory therapy are related to the fact that the methods developed within this area do not affect the mechanism of AD development. Therefore, intensive research is underway to find drugs for the radical treatment of AD that can not only compensate for symptomatic disorders, but also cure the disease.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) eleven].
  • a major component of the most common amyloid neuritic plaques is a 40-42 amino acid peptide called the ⁇ 4 amyloid peptide (Price, DL andall, Drug Development Research (1985) 5: 59-68).
  • amyloid peptide ⁇ 4 is a polypeptide that is formed as a result of proteolysis of membrane glycoproteins designated by the precursor proteins of the amyloid peptide ⁇ 4 ( ⁇ ). These amyloid peptide precursor proteins consist of from 695 to 770 amino acids, all of which are encoded by the same gene.
  • a 42-amino acid variant is the predominant form in amyloid plaques located in the brain of patients with BA.
  • WO9927944onncaHo treats AD by administering the ⁇ réelle ⁇ facility ⁇ 42 peptide, however, clinical trials in 360 patients with a diagnosis of moderate to moderate AD using ieriaus peptide - it is called as an antigen, were discontinued after reports of encephalitis in some patients [Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Engineer 16 [7]: 22, April 1, 2002].
  • peptides developed by the IBCh RAS consisting of the amino acid sequence Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg -Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu [RU2372355, 2009] nAla-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-
  • the latter can be considered as the closest analogue in relation to the claimed tool.
  • the drug showed efficacy in influencing the behavior of experimental animals, but its effect is not effective enough.
  • the claimed invention solves the problem of expanding the range of drugs having a therapeutic effect against Alzheimer's disease.
  • the problem is solved by creating and using a peptide of the general formula acetyl-X-A1Sh-A1Sh-amide, where the X-sequence of D- and L- amino acid residues, such as ARG, MET, LYS.
  • Tetrapeptides were prepared using standard solid phase peptide synthesis technology [J.M. Stewardand, J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. FreemanCo., San Francisco, 1969] followed by cleavage of the protecting groups and purification of the final product.
  • tetrapeptide (LYS) was carried out as follows.
  • a reaction vessel was charged with 0.2 g of ⁇ -tert-butyloxycarbonyl-N V-arginyl--mezitilensulfonil metilbenzgidril aminopo- Limeray in 10 ml of dimethylformamide.
  • the peptide chain was further expanded from the C-terminus according to the program shown in table 1.
  • the resulting coarse products were purified by reverse-phase high-performance chromatography on a C18 Nova Pack column, 19x300mm, 300A 0 in a gradient of 2-50% acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid. According to the optical density, the peptide content was 99.5%.
  • the amino acid composition of the peptide and its molecular weight corresponded to the theoretical ones.
  • FIG. Figure 1 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and the comparison drug dopezil on the activity of acetylcholinesterase in rat brain synaptosomes with a model of Alzheimer's disease.
  • the antiamnesic activity of tetrapeptide and donepezil is shown on the 1st and 10th day after a course of therapy of rats with a model of Alzheimer's disease (test “conditioned reflex of passive avoidance”).
  • 2-tetrapeptide at a dose of 0.1 mg / kg
  • FIG. Figure 2 shows the effect of tetrapeptide (LYS) and comparison drug on dopezil in the number of rats with a model of Alzheimer's disease who reached the criterion of learning the conditioned reflex of passive avoidance on the 1st and 10th day after therapy.
  • tetrapeptide LYS
  • comparison drug on dopezil in the number of rats with a model of Alzheimer's disease who reached the criterion of learning the conditioned reflex of passive avoidance on the 1st and 10th day after therapy.
  • FIG. Figure 3 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and comparison drug dopezil on rat brain mass coefficient with model of Alzheimer's disease.
  • 3-control 4- pathology
  • FIG. Figure 4 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and comparison drug dopezil on the arteriovenous difference in rat blood cerebral blood glucose with the Alzheimer's disease model.
  • 2-tetrapeptide at a dose of 0.1 mg / kg 3-control, 4-pathology
  • FIG. Figure 5 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and the comparison drug dopezil on the level of ATP in rat brain with an Alzheimer's model.
  • Statistically significant differences (p> 0.05): * - with the control group, A - with the group pathology, ® - with the donepezil group.
  • FIG. Figure 6 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and comparison drug dopezil on serotonin levels in rat brain with a model of Alzheimer's disease.
  • Statistically significant differences (p> 0.05): * - with the control group, ⁇ - with the pathology group, ® - with the donepezil group.
  • FIG. Figure 7 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and comparison drug dopezil on the content of malondialdehyde in rat brain with an Alzheimer's model.
  • 1-donepezil at a dose of 1 mg / kg 2-tetrapeptide at a dose of 0.1 mg / kg, 3-control, 4-pathology
  • Statistically significant differences p> 0.05: * - with the control group, A - with the pathology group , ® - with donepezil group.
  • FIG. Figure 8 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and comparison drug dopezil on the content of reduced glutathione in rat brain with an Alzheimer's disease model.
  • Statistically significant differences p> 0.05: * - with the control group, A - with the group pathology, ® - with the donepezil group.
  • FIG. Figure 9 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and the comparison drug dopezil on the activity of superoxide dismutase in rat brain with an Alzheimer's disease model.
  • 1-donepezil at a dose of 1 mg / kg 2-tetrapeptide at a dose of 0.1 mg / kg, 3-control, 4-pathology.
  • Statistically significant differences p> 0.05: * - with the control group, ⁇ - with the group pathology, ® - with the donepezil group.
  • Figure 10 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and comparison drug dopezil on catalase activity in rat brain with a model of Alzheimer's disease.
  • Statistically significant differences (p> 0.05): * - with the control group, A - with the pathology group, ® - with the donepezil group.
  • FIG. Figure 11 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and the comparison drug dopezil on the content of acetylcholine in rat brain homogenate with a model of Alzheimer's disease.
  • 1-donepezil at a dose of 1 mg / kg 2-tetrapeptide at a dose of 0.1 mg / kg, 3-control, 4-pathology
  • Statistically significant differences p> 0.05: * - with the control group, ⁇ - with the pathology group , ® - with donepezil group.
  • FIG. Figure 12 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and comparison drug dopezil on the activity of acetylcholinesterase in rat brain synaptosomes with a model of Alzheimer's disease.
  • Statistically significant differences p> 0.05: * - with the control group, A - with the pathology group, ® - with a group of donepezil.
  • FIG. Figure 13 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and the comparison drug dopezil on the activity of acetylcholinesterase in the rat brain homogenate with a model of Alzheimer's disease.
  • Statistically significant differences (p> 0.05): * - with the control group, A - with the pathology group , ® - with donepezil group.
  • FIG. Figure 14 shows the effects of tetrapeptide (LYS) and the comparison drug dopezil on the activity of butyrylcholinesterase in the rat brain whole homogenate with a model of Alzheimer's disease.
  • 1-donepezil in a dose of 1 mg / kg 2-tetrapeptide in a dose of 0.1 mg / kg, 3-control, 4-pathology.
  • Statistically significant differences (p> 0.05): * - with the control group, ⁇ - with the pathology group, ® - with the donepezil group.
  • Example 1 Modeling of scopolamine-induced Alzheimer's disease.
  • Scopolamine was administered to animals of all groups except the control group in a dose of 1 mg / kg daily once a day for 27 days. From day 28 for 10 days, the animals of groups 2 and 3 were administered, respectively, the comparison drug and the study drug. Drugs were administered daily 1 time per day.
  • the ACE inhibitor included in the protocols for the provision of medical care to patients with BA in Russia, the USA and EU countries, donepezil, which was administered intravenously at a dose of 1 mg / kg, was used as a comparison drug. Tetrapeptides were administered and / n at a dose of 0.1 mg / kg. Animals of the pathology group and / n and / f received a 0.9% solution of sodium chloride as a placebo.
  • Porsolt RD Depression A new animal model sensitive to antidepressant treatments / RD Porsolt, M. LePichon, M. Oalfre // Nature. - 1977. - Vol. 266. - P. 730-732.].
  • the tests of OP and EI were performed on day 1, PTP - on the second day, passive avoidance reaction - on the first and tenth day after drug therapy.
  • the criterion for learning animals passive avoidance reaction is to stay in the bright compartment of the passive avoidance reaction device for at least 180 s.
  • Antiamnestic activity (AA) in the passive avoidance reaction test was calculated using the Butler formula [K. Radionova
  • the original nootropic drug “Noopept” eliminates memory deficiency caused by the blockade of M- and H-cholinergic receptors in rats / K.S. Radionova, A.P. Belnik, R.U. Ostrovskaya // Bull. an experiment. biology and medicine. - 2008. - T. 146., ⁇ ° 1. - S.
  • GM was extracted and weighed, and the brain mass coefficient (CMM) was calculated.
  • CCM brain mass coefficient
  • the GMs were frozen in liquid nitrogen and used for further biochemical and histochemical studies.
  • whole arterial (common carotid artery) and venous (venous sinus of the dura mater GM) blood the glucose level was determined by the glucose oxidase method, and the arteriovenous difference in its content was calculated (marker of glucose consumption).
  • MSM medium-weight molecules
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Standard biochemical methods determined the content and activity of antioxidant enzymes and lipid peroxidation products - malondialdehyde (MDA) [Modern methods in biochemistry / [ed. V.N. Orekhovich]. - M .: Medicine, 1977. - 392 s], superoxide dismutase (SOD) [Makarevich O. P. Activity of superoxide dismutase in the acute period of various diseases / O. P. Makarevich, P. P. Golikov // Lab. a business. -1983. - N ° 6. - S. 24-27], catalase [Method for determining the activity of catalase / M.A.
  • the content of acetylcholine in GM tissue was determined by the method [Acetylcholine determination method: RU2256920, 2005], cholinesterase (synaptic and total acetylcholinesterase, total butyrylcholinesterase) - by the methods [Panyukov A.I. On the application of the Hestrin method for separate measurement of cholinesterase activity / A.I. Panyukov // Questions honey. chemistry. - 1966. - T. 12. - Issue 1. - S. 88-95; HajosE. An improved method for thepreparation of synaptosomal fractions in high purity / E. Hajos // Brain Res. - 1975 .-- Vol. 93.
  • the conclusion about the neuroprotective activity of the tetrapeptide was made by an integrated assessment of the results of functional, biochemical and histological tests.
  • the studied peptides restore the orientational research activity of rats with the AD model. This is manifested by a statistically significant increase in the number of holes examined in the OD test (up to 52%, p ⁇ 0.05). Better results were obtained for tetrapeptide (LYS).
  • the data indicates its ability to normalize the behavioral responses of animals with the AD model.
  • the studied pharmacological preparation normalizes the emotional reactions of rats in OP: it reduces by 44.7% the number of grooming acts (p ⁇ 0.05), which characterizes its activity as stress-protective.
  • the EI test established the ability of the tetrapeptide (LYS) to improve the cognitive functions of rats with the AD model (Table 4).
  • the tetrapeptide (LYS) statistically significantly compared with the pathology group reduces by 3.8 times the time (p ⁇ 0.05) required for animals to dive under the edge of the cylinder (disposal) in the EI test. In this indicator, it is 41.7% higher than donepezil (p ⁇ 0.05). There are no differences between the number of coped (diving) animals in each group.
  • the ability of the tetrapeptide (LYS) to stimulate the cognitive function of animals with a model of neurodegenerative disease is one of the manifestations of its nootropic activity.
  • the tetrapeptide (LYS) increases the latent time of entry of rats with the BA model into the dark compartment of passive avoidance reaction both 24 hours after its formation (by 79.5% compared with the pathology group) and 10 days (by 130.9% in comparison with the pathology group, p ⁇ 0.05).
  • An increase in this indicator against the background of the tetrapeptide preparation (LYS) indicates its positive effect on the formation of conditioned reflex memorial trail in animals (positive mnemotropic effect).
  • the studied tetrapeptide preparation (LYS) is superior to donepezil.
  • AA peptide tetrapeptide (LYS) cocTaBmia on the first day of 56.5% (Fig. 1), and on the tenth - increased to 81.5%.
  • Similar indicators of donepezil group are less than those of tetrapeptide group (LYS) B 2.9 and 1.9 times, respectively.
  • the studied tetrapeptide (LYS) in a model of cognitive impairment due to a decrease in cholinergic transmission demonstrates pronounced cholinopositive properties.
  • the effect of the tetrapeptide on central cholinergic neurons directly involved in the releasing of pro- and anti-inflammatory cytokines may be its cytokine-mediated anti-inflammatory properties.
  • the positive mnemotropic properties of the oligopeptide neuroprotective tetrapeptide were revealed, which are manifested in rats with the AD model with high antiamnestic activity and an increase in the number of animals in the group that have reached the criterion for learning the conditioned reflex.
  • the tetrapeptide (LYS) tends to decrease the level of depressive symptoms in rats with the AD model (Table 6).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) the duration of acts of immobilization.
  • the tetrapeptide reduces the total duration and number of immobilized rat freezes (immobilization), and also increases the latent period of the first immobilization in the form of a tendency, which characterizes its activity as antidepressant.
  • BA has established the complex nootropic effect of the peptide (LYS), which consists in normalizing the orienting-research activity of animals in OP, stimulating their cognitive functions, and positive mnemotropic effect.
  • Nootropic activity revealed in the AD model is accompanied by its tendency to decrease depressive symptoms of animals, arising against the background of model pathology.
  • tetrapeptides The positive effects of tetrapeptides on the antioxidant defense system of rat brain in model Alzheimer's disease have been established.
  • the tetrapeptide reduces the content of the secondary product of peroxidation - malondialdehyde (MDA) in the brain (Fig. 7).
  • MDA peroxidation - malondialdehyde
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) donepezil, on the contrary, is characterized by a 15.9% increase in comparison with the pathology group.
  • the decrease in this indicator under the influence of tetrapeptide is 39.8% in relation to the pathology group.
  • the tetrapeptide significantly increases the level of reduced glutathione, statistically significantly decreasing by 34.3% (p ⁇ 0.05 with the control group) in model Alzheimer's disease (Fig. 8).
  • the increase in this indicator on the background of the tetrapeptide is 36.6%.
  • the tetrapeptide exerts a pronounced effect on the activity of SOD in the brain of rats with the AD model (Fig. 9). It increases this indicator by 22% compared with that in the pathology group, which also contributes to an increase in the antioxidant protection of the brain in the conditions of the AD model.
  • the tetrapeptide (LYS) significantly reduces 1.1 times the increased activity of catalase that occurs compensatory against the background of model AD.
  • the tetrapeptide effectively affects the antioxidant defense system of rat brain in model AD. It increases the level of reduced glutathione and SOD activity in pathology and reduces the need for GM to overexpress catalase, an enzyme that destroys peroxides and the end products of peroxide modification of protein and lipid substrates. A consequence of this activity is a marked decrease in the level of MDA, an intermediate product of peroxide modification of lipids, which are a significant part of the composition of neuron biomembranes. This is an indirect confirmation of the membrane-stabilizing action of the tetrapeptide, which occurs both in cerebrovascular and neurodegenerative diseases.
  • the tetrapeptide is statistically significant compared with the control, pathology and donepezil groups (p ⁇ 0.05) reduces the acetylcholinesterase content in the brain of rats with the AD model.
  • the tetrapeptide preparation like donepezil, decreases AChE activity (Figs. 12 and 13) both in synaptosomes and in the homogenate of the whole brain, which is accompanied by the formation of an average negative relationship between the activity of this enzyme and the content of acetylcholinesterase in the brain tissue.
  • Example 3 The study of the depressant properties of the tetrapeptide (LYS) on the model of reserpine depression.
  • the experiment was performed on 16 white, adult, randomly bred male rats weighing 180-220 g.
  • the antidepressant activity of the neuroprotector tetrapeptide (LYS) at a dose of 0.02 mg / kg intranasally (i / n) was evaluated.
  • the classic tricyclic antidepressant imipramine at a dose of 15 mg / kg (melipramine, EGIS, Hungary) intraperitoneally (ip) was used as a comparison drug.
  • the experiment was carried out in 2 stages.
  • the animals of the control group were injected with a / b and i / n 0.9% NaCl solution in a volume equivalent to the volume of drugs.
  • results were statistically processed.
  • the Student t-test was used; in the absence of data, the nonparametric Mann-Whitney T-test was used.
  • the Fisher angular transformation ⁇ was used.
  • the paired Wilcoxon T-test was used for intragroup statistical evaluation of changes in the performance of animal tests before and after modeling depression. The results were considered statistically significant at p ⁇ 0.05.
  • the results of the test OP are given in table. 7.
  • the tetrapeptide (LYS) reduces all types of activity in the OP, as well as emotional reactions. Imipramine also tends to decrease locomotor and orientational research activity of intact animals. The level of emotional reactions under his influence, on the contrary, increases (2.9 times, p ⁇ 0.05 compared with the control group). Thus, under conditions of OP in animals without depression, the tetrapeptide (LYS) exhibits sedative properties that are more pronounced than that of the imipramine comparison drug.
  • Reserpine causes a pronounced model depression in animals (Table 7), characterized by a decrease in motor (by 70%, p ⁇ 0.05 versus intact animals), tentative research activity (by 93.2%, p ⁇ 0, 05 versus intact animals), as well as a tendency to increase the level of emotional reactions by 1.9 times. The sum of all types of activity is reduced by 97% (p ⁇ 0.05). Against the background of imipramine, the degree of these disorders slightly decreases. Locomotor activity is reduced by 79.2% (p ⁇ 0.05 versus intact animals), and tentative research - by 76.5% (p ⁇ 0.05 versus intact animals). Level of emotional reactions
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) it decreases insignificantly 1.6 times (p> 0.05 versus intact animals), but the sum of all types of activity decreases significantly (by 69.2%, p ⁇ 0.05), although not as pronounced as in control.
  • the decrease in locomotor and orientational research activity in animals with reserpine depression treated with tetrapeptide (LYS) is the least pronounced. It reduces the number of crossed squares only in the form of a trend by 15%, and tentative research activity - by 20.7% (p> 0.05 against the rate of intact animals).
  • the sum of all types of activity against the background of tetrapeptide (LYS) decreases statistically insignificantly by 29.3% (p> 0.05 versus intact animals).
  • Table 8 shows that, according to the results of PTP of the tetrapeptide (LYS), it exhibits antidepressant properties both in intact animals and in animals with reserpine depression.
  • the antidepressant properties of the tetrapeptide (LYS) of intact animals are its ability to statistically significantly increase the latent time of immobilization (3.5 times compared with the control, p ⁇ 0.05), reduce the number of episodes of immobility and their total duration ( 11.5 and 16.1 times, respectively, p ⁇ 0.05 with control).
  • the tetrapeptide (LYS) Against the background of reserpine depression, the tetrapeptide (LYS) also exhibits a statistically significant antidepressant effect relative to the control group. As in the case of intact animals, the tetrapeptide (LYS) increases the latent time of immobilization by 4.5 times (p ⁇ 0.05 relative to the control), reduces the number of episodes of immobilization by 2.6 times (p ⁇ 0.05 relative to the control) and its total duration is 3.6 times (p ⁇ 0.05 relative to control). According to these indicators, the oligopeptide activity exceeds that of imipramine.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) monoaminergic transmission in the brain, both normal and with model pathology caused by reserpine.
  • tetrapeptide administered intranasally at a dose of OD mg / kg for 10 days once a day, demonstrates a stable nootropic effect of the scopolamine-induced model of Alzheimer's disease.
  • the latter is manifested by the high antiamnestic activity of the tetrapeptide (LYS) in the test of the conditioned passive avoidance reflex, which persists for at least 10 days, its ability to stimulate the cognitive functions of animals in the extrapolation disposal test, to normalize behavioral activity in the open field test (to improve tentatively research activity and reduce the response of animals to stress).
  • a tendency was found to decrease the manifestations of depressive symptoms of rats during treatment with tetrapeptide (LYS).
  • Neuroprotective properties under the conditions of the AD model are manifested by a tendency to a decrease in the brain mass coefficient, an increase in the level of cerebral serotonin, an optimization of the carbohydrate metabolism in the brain (an improvement in glucose utilization and an increase in ATP level).
  • the pronounced antioxidant properties of the tetrapeptide (LYS) are demonstrated, which are manifested by a decrease in the amount of lipid peroxidation products in the brain, an increase in the activity of antioxidant defense enzymes (superoxide dismutase), or a decrease in their compensatory hyperactivity (catalase).
  • tetrapeptide is promising for further clinical use as a nootropic, neuroprotective and antidepressant drug.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и может быть использовано при лечении болезни Альцгемера и депрессии. Предложен пептид общей формулы ацетил-X-ARG- ARG-амид, где X=-(D-ARG)-ARG-; -(D-LYS)-LYS- или -(D-MET)-MET-. По комплексу выявленных фармакологических свойств препарат может быть перспективен для дальнейшего клинического применения в качестве ноотропного, нейропротекторного и антидепрессантного средства.

Description

ПЕПТИД С АНТИДЕПРЕССАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ЛЕЧЕБНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
Область техники
Изобретение относится к области биохимии, конкретно к новому биоло- гически активному соединению - пептиду, обладающему лечебным действием против нарушений деятельности головного мозга, таких как бо- лезнь Альцгеймера,и может быть использовано для создания препарата для те- рапии подобных заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Под антидепрессантами понимаются психотропные лекарственные сред- ства, применяемые для лечения депрессии, оказывая влияние на уровень ней- ромедиаторов, в частности серотонина, норадреналина и дофалина, улучшая настроение пациента, уменьшая тоску, вялость, напряжение и т.п. [wikpen- dia.org/wik/антидепрессанты]. При этом, поддерживая уровень серотонина, не- которые антидепрессанты способны за счет замедления процессов образования бляшек в головном мозге способствовать улучшению состояния больных бо- лезнью Альцгеймера, особенно перенесших инсульт
[http:www.patronage.ru/news].
Болезнь Альцгейметра (БА) представляет собой тяжелое нейродегенера- тивное заболевание, приводящее к потере памяти, психическим расстройствам и неизбежной смерти. Ее главным отличительным патологическим признаком является развитие изменений цитоскелета в некоторых восприимчивых нейро- нах. Данные изменения не происходят неизбежно в процессе старения, но если заболевание началось, то спонтанное выздоровление или ремиссии не наблю- даются. Первоначальные изменения коры головного мозга, описанные далее ниже, развиваются в слабо миелинизированной трансэнторинальной области медиальной височной доли. Затем деструктивный процесс развивается по про- гнозируемому типу по мере его распространения на другие области коры го-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ловного мозга. Локализация образующих сплетение нейронов и тяжесть изме- нений позволяют дифференцировать шесть стадий в прогрессировании заболе- вания от 1-Й стадий, которые клинически не проявляются, до V-VI стадий, ко- торые обозначают полное развитие БА. У относительно небольшого числа па- циентов проявляются особенно ранние изменения, указывающие на то, что по- жилой возраст не является необходимым условием развития поражений. Соот- ветственно БА является, таким образом, связанным с возрастом, но не зависи- мым от возраста заболеванием. Относительно причины и механизма развития БА в настоящее время существует ряд теорий, многие из которых связаны с ге- нетическими дефектами.
В настоящее время в медицинской практике применяют препараты для симптоматического лечения БА методами компенсаторной терапии. Использо- вание этих препаратов позволяет в некоторой мере задержать процесс прогрес- сирования болезни, но не излечить ее.
Наиболее широко применяемым классом препаратов являются ингибито- ры холинэстераз (ИХЭ) [Watkins, Р. В. et all. J. Am. Med. Assoc. 1994. V. 271. P. 992-998], которые увеличивают время действия нейромедиатора ацетилхолина на постсинаптические рецепторы, что ведет к увеличению холинергической иннервации. Однако, эффективность применения ИХЭ существенно снижается на поздних стадиях БА. Кроме того их применение характеризуются достаточ- но высокой токсичностью и рядом других негативных побочных эффектов.
Известно применение для симптоматического лечения БА мемантина, модулятора глутаматэргической системы [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008. V. 148 (5). P. 379-397]. Наилучшие результаты дает его использование у больных с мягкой и умеренной деменцией альцгеймеровского типа. Однако препарат не обеспечивает полного излечивания БА. В частности, недостатки компенсаторной терапии связаны стем то, что разрабатываемые внутри данно- го направления методы не воздействуют на механизм развития БА. Поэтому интенсивные исследования ведутся по поиску лекарств для радикальной тера- пии БА, способные не только компенсировать симптоматические нарушения, но и излечивать заболевание.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Одна из современных гипотез предполагает, что пептиды β-амилоидного ряда, в частности βΑ-(1-42) в результате нарушения обменных процессов спо- собны образовывать скопления в центральной нервной системе в виде амило- идных бляшек, что приводит к разрушению мозговой ткани [Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 2002. V. 297 (5580). P. 353-356].B связи с этим, в последние годы активно разрабатываются иммунотерапевтические методы предотвращения развития БА, направленные на коррекцию содержания βΑ в организме. Инъекции препаратами на основе βΑ вызывают образование специ- фических антител, которые способствуют удалению βΑ из мозга [Shenk D., Barbour R., Dunn W. Immunization with amyloid- β attenuates Alzheimer-disease- like pathology in the PDAPP mouse. // Nature. 1999. V. 400( 6740). P. 173-177]. Ведущими западными фирмами разработан ряд препаратов [www.affi- ris.com/press_releases/press_release_mimoVAX_dec_l l_06.pdf; www.clini-cal-tri- als.gov /ct2/show/NCT0041 1580], однако, ни один из них не прошел успешно клинические испытания. Исследования были приостановлены в связи с тем, что у 6% пациентов, которые получали инъекцию бета-амилоида, обнаружился асептический менингоэнцефалит [Shenk D. Amyloid-β immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of the beginning. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V. 3 (10). P. 824-828; Senior K. Dosing in Phasell trial of Alzheimer's vaccine sus- pended. Lancet. Neurol. 2002. V. 1 (1). P. 3]. Данные результаты ставят под со- мнение безопасность использования препаратов на основе βΑ в качестве имму- нотерапевтических средств.
Вместе с тем, установлено, что структурные и гистопатологические из- менения, наблюдаемых в мозге заболевших БА, представляют собой нейро- фибриллярные пучки и отложения амилоида. Предполагают, что связывание рецептора конечных продуктов гликозилирования с амилоидом способствует проникновению последнего через гематоэнцефалический барьер центральной нервной системы и накоплению в виде амилоидных бляшек - основной причи- ныболезни Альцгеймера [Leclerc Е., Sturchler Е., Vetter S. The S 100B/RAGE Axis in Alzheimer's Disease. Cardiovasc. Psychi-atry Neurol. 2010. V. 2010. P. 1-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 1 1]. Главным компонентом наиболее распространенных амилоидных нейритных бляшек является пептид из 40-42 аминокислот, называемый амилоид- ным пептидом Αβ4 (Price, D.L. andall, Drug Development Research (1985) 5:59- 68).
Амилоидный пептид Αβ4 представляет собой полипептид, который обра- зуется в результате протеолиза мембранных гликопротеинов, обозначаемых белками-предшественниками амилоидного пептида Αβ4 (βΑΡΡ). Данные белки- предшественники амилоидного пептида, состоят из от 695 до 770 аминокислот, причем все они кодируются одним и тем же геном.
Идентифицировано два главных варианта амилоидного пептида Αβ4 - πεπτΗΛΗΑβ40 и Αβ42, содержащие 40 и 42 аминокислоты, соответственно, ко- торые характеризуются различным тканевым распределением как в физиологи- ческих, так и в патологических условиях. Вариант из 42 аминокислот является преобладающей формой в амилоидных бляшках, локализованных в мозге боль- ных БА.В заявке WO9927944onncaHo лечение БА путем введения больному пептида Αβ42, однако клинические испытания у 360 больных с диагнозом средней и умеренной БА, при которых амилоидный пептид Αβ42 был исполь- зован в качестве антигена, были прекращены после сообщения об энцефалите у некоторых больных [Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Scientist 16[7]: 22, April 1, 2002].
Среди других пептидов, предлагаемых для лечения БА, следует отметить пептиды, разработанные ИБХ РАН и состоящие из последовательности амино- кислот Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu- Cys-Cys-Lys-Glu [RU2372355, 2009] nAla-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-
Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala [RU2558242, 2015].
Последний может рассматриваться как ближайший аналог по отношению к заявляемому средству. Препарат показал эффективность при воздействии на поведение экспериментальных животных, однако его действие недостаточно эффективно.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Сущность изобретения
Заявляемое изобретение решает задачу расширения ассортимента препа- ратов, обладающих лечебным действием против болезни Альцгеймера.
Поставленная задача решается за счет создания и применения пептида общей формулы ацетил-Х-А1Ш-А1Ш-амид, где Х-последовательность D- и L- аминокислотных остатков, таких как ARG, MET, LYS.
Далее в тексте при характеристике тетрапептидов используемая группа D-L аминокислот (X) дана в скобках.
Проведенные исследования показали (пример 1, таблица 3), что все выше- указанные пептиды проявляют нормализующую активность на модели БА у крыс, что обусловлено их уникальными первичной структурой и пространственным строением вследствие присутствия аминокислотных остатков в различных стерео- конфигурациях. Лучшие результаты достигаются при использовании тетрапептида на основе D- и L- аминокислотных остатков лизина (LYS).
Тетрапептиды получали стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе [J.M. Stewardand, J.D.Young, "Solid Phase Peptide Synthesis",W.H. FreemanCo., San Francisco, 1969] с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта.
В частности, синтез тетрапептида (LYS) проводили следующим образом. Для синтеза пептида в реакционный сосуд загружали 0.2 г Ν-трет- бутилоксикарбонил-НВ-мезитиленсульфонил-аргинил-метилбензгидрил аминопо- лимера в 10 мл диметилформамида. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в таблице 1.
Таблица 1
Программа присоединения одного аминокислотного остатка
Figure imgf000007_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) б
Figure imgf000008_0001
При положительном нингидриновом тесте, повторяли конденсацию, начи- ная с п.З. Полученный пептидил-полимер обрабатывали безводным фтористым водородом и выделяли грубый продукт в соответствии с программой, приведенной в таблице 2.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 2
Программа деблокирования пептидил-полимера и отщепления пептида от поли- мерной матрицы
Figure imgf000009_0001
Полученные грубые продукты подвергали очистке обращенно-фазовой вы- сокоэффективной хроматографией на колонке С18 Nova Pack, 19x300мм, 300А0 в градиенте 2-50% ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте. Содержание пеп- тида - по данным оптической плотности - составляло 99,5%.Аминокислотный со- став пептида и его молекулярная масса соответствовали теоретическим.
»
Другие пептиды получали аналогичным образом при соответствующей кор- ректировке состава исходных компонентов. Структура и гомогенность полученных
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) пептидов была подтверждена данными высокоэффективной жидкостной хромато- графии, аминокислотного и масс-спектрального анализов.
Краткое описание фигур чертежа
Свойства тетрапептидов иллюстрируются следующими графическими мате- риалами.
На фиг. 1 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на активность ацетилхолинэстеразы в синаптосомах головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. Антиамнестическая активность тетрапепти- да и донепезила показана на 1-е и 10-е сутки после курса терапии крыс с моделью болезни Альцгеймера (тест «условный рефлекс пассивного избегания»).1- донепе- зил в дозе 1мг/кг; 2-тетрапептида в дозе 0,1 мг/кг.
На фиг. 2 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на количество крыс с моделью болезни Альцгеймера, достигших крите- рия обученности условному рефлексу пассивного избегания на 1-е и 10-е сутки по- еле терапии. (Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, А - с группой патологии.) 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2-тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3- контроль, 4-патология,
На фиг. 3 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на коэффициент массы головного мозга крыс с моделью болезни Альц- геймера.1-донепезил в дозе 1мг/кг, 2-тетрапептида в дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4- патология,
На фиг. 4 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на артерио-венозную разницу содержания глюкозы в крови церебрально- го бассейна крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2- тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4-патология,
На фиг. 5 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на уровень АТФ в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1мг/кг, 2-тетрапептид в дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4- патология.Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, А - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) На фиг. 6 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на уровень серотонина в головном мозге крыс с моделью болезни Альц- геймера. 1-донепезил в дозе 1мг/кг, 2-К -1 в дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4- патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, Λ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
На фиг. 7 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на содержание малонового диальдегида в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1мг/кг, 2-тетрапептид в дозе 0,1 мг/кг, 3- контроль, 4-патология Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, А - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
На фиг. 8 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на содержание восстановленного глутатиона в головном мозге крыс с мо- делью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1мг/кг, 2-тетрапептид в дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4-патология.Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, А - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
На фиг. 9 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на активность супероксиддисмутазы в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2-тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3- контроль, 4-патология.Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, Λ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
На фиг.10 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на активность каталазы в головном мозге крыс с моделью болезни Альц- геймера. 1-донепезил в дозе 1мг/кг, 2-тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4- патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, А - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
На фиг. 11 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на содержание ацетилхолина в гомогенате головного мозга крыс с моде- лью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2-тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4-патология Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, Λ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) На фиг. 12 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на активность ацетилхолинэстеразы в синаптосомах головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 -тетрапептидв дозе ОД мг/кг, 3-контроль, 4-патология Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, А - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
На фиг. 13 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на активность ацетилхолинэстеразы в гомогенате целого головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 -тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4-патология Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, А - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
На фиг. 14 показано влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения до- непезила на активность бутирилхолинэстеразы в гомогенате целого головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2- тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4-патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, Λ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.
Промышленная применимость
Промышленная применимость иллюстрируется следующими примерами. Пример1. Моделирование скополамин-индуцированной болезни Альцгеймера.
Использовали белых рандомбредных половозрелых крыс-самцов массой 200-
240 г. Формировали группы животных по 7 особей в каждой. 1-я группа - «Кон- троль», 2-я - «Патология», 3-я - «Препарат сравнения», 4-6-я - «Нейропептиды».
Скополамин вводили животным всех групп кроме группы контроля в/б в до- зе 1 мг/кг ежедневно один раз в сутки на протяжении 27 дней . С 28 дня в течение 10 суток животным групп 2 и 3 вводили, соответственно, препарат сравнения и ис- следуемый препарат. Препараты вводили ежедневно 1 раз в сутки.
В качестве препарата сравнения использован ингибитор АХЭ, внесенный в протоколы оказания медицинской помощи больным с БА России, США и стран ЕС - донепезил, который вводили в/ж в дозе 1 мг/кг. Тетрапептиды вводили и/н в дозе 0,1 мг/кг. Животные группы патологии и/н и в/ж получали 0,9% раствор натрия хлорида в качестве плацебо.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) После курсовой терапии препаратами оценивали функциональное состояние ЦНС животных по тестам открытого поля (ОП), экстраполяционного избавления (ЭИ) и условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [Руководство по прове- дению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. докт. мед. наук А.Н. Миронова. - Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с; Methods of be- havior analysis in neuroscience - London, New York, Washington: CRCPress, 2001. - 329 c.],a также плавательного теста Порсолта (ПТП) [Methods of behavior analysis in neuroscience - London, New York, Washington: CRCPress, 2001. - 329 c; Porsolt R.D. Depression: A new animal model sensitive to antidepressant treatments / R.D. Porsolt, M. LePichon, M. Oalfre // Nature. - 1977. - Vol. 266. - P. 730-732.].
Тесты ОП и ЭИ выполняли на 1 день, ПТП - на второй день, УРПИ - на пер- вый и десятый день после терапии препаратами. Критерий обученности животных УРПИ - пребывание в светлом отсеке прибора УРПИ на протяжении не менее 180 с. Антиамнестическую активность (АА) в тесте УРПИ рассчитывали по формуле Баттлера [Радионова К.С. Оригинальный ноотропный препарат «Ноопепт» устра- няет дефицит памяти, вызванный блокадой М- и Н- холинорецепторов у крыс / К.С. Радионова, А.П. Бельник, Р.У. Островская // Бюл. эксперим. биологии и ме- дицины. - 2008. - Т. 146., Ν° 1. - С. 65-68]. После этого животных выводили из экс- перимента введением наркозного препарата с последующей декапитацией. ГМ из- влекали и взвешивали, рассчитывали коэффициент массы мозга (КММ). Немед- ленно после извлечения ГМ замораживали в среде жидкого азота и использовали для дальнейших биохимических и гистохимических исследований. В цельной арте- риальной (общая сонная артерия) и венозной (венозный синус твёрдой мозговой оболочки ГМ) крови глюкозо-оксидазным методом определяли уровень глюкозы, рассчитывали артерио-венозную разницу её содержания (маркер потребления глю- козы). В сыворотке крови определяли уровень молекул средней массы (МСМ) - токсических продуктов биодеградации клеток, повреждающихся при заболевании (дериваты нуклеозидов, пептоиды, соли глюкуроновой кислоты и проч.) [Ковалев- ский А.Н. Замечания по скрининговому методу определения молекул средней мас- сы / А.Н. Ковалевский, О.Е. Нифантьев // Лаб. дело. - 1989. -J ° 5. - С. 35-39].
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Стандартными биохимическими методами определяли содержание и актив- ность ферментов антиоксидантной защиты и продуктов пероксидного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) [Современные методы в биохимии / [ под ред. В.Н. Ореховича]. - М.: Медицина, 1977. - 392 с], супероксиддисмутазы (СОД) [Макаревич О. П. Активность супероксиддисмутазы крови в острый период различных заболеваний / О. П.Макаревич, П.П.Голиков // Лаб. дело. -1983. - N°6. - С. 24-27], каталазы [Метод определения активности каталазы / М.А.Королюк, Л. И. Иванова, И.Г. Майорова и др. // Лаб. дело. - 1988. - N 1. - С. 16-19], восстановлен- ного глутатиона [Кочетов Т. А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Наука, 1980. - 280 с].
Содержание ацетилхолина в ткани ГМ определяли по методу [Способ опре- деления ацетилхолина: RU2256920, 2005],холинэстераз (синаптической и общей ацетилхолинэстеразы, общей бутирилхолинэстеразы) - по методам [Панюков А.И. О применении метода Хестрина для раздельного измерения активности холинэсте- раз / А.И. Панюков // Вопросы мед. химии. - 1966. - Т.12. - Выпуск 1. - С. 88-95; HajosE. An improved method for thepreparation of synaptosomal fractions in high purity / E. Hajos // Brain Res. - 1975. - Vol. 93. - N° 3. - P. 485-489.], серотонина - методом [Atack С. A procedure for the isolation of noradrenaline (together with adrenaline), do- pamine, 5 -hydroxy tryptamine and histamine from the same tissue sample using as ingle column of strongly acidic cati on exchangeresin 1С. Atack, T. Magnusson // ActaPharma- colToxicol (Copenh). - 1978. - Vol. 42 (1). - P. 35-57], аденозинтрифосфорной ки- слоты (АТФ) - [Ещенко Н.Д. Определение содержания АТФ в тканях // Методы биохимических исследований / Под ред. проф. М.И. Прохоровой. - Ленинград: Из- во ЛГУ, 1982. - с. 256-258].
Количественные данные обрабатывали статистически. Результаты представ- лены в виде средней и её стандартной ошибки (М±т). Для оценки статистической значимости межгрупповых различий в зависимости от характера распределения в вариационном ряду использованы t-критерий Стьюдента либо Т-критерий Манна- Уитни. Различия показателей, учитываемых в альтернативной форме, оценивали с использованием углового преобразования Фишера φ. Оценка статистической зна- чимости внутригрупповых различий выполнена с использованием парного Т-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) критерия Уилкоксона. Корреляционный анализ проводили, рассчитывая коэффи- циент ранговой корреляции Спирмена р.
Вывод о нейропротекторной активности тетрапептида делали по интеграль- ной оценке результатов функциональных, биохимических и гистологических тес- тов.
Результаты влияния препаратов на двигательную, ориентировочно- исследовательскую активность, эмоциональные реакции крыс и их вегетативное сопровождение в тесте ОП приведены в таблице 3.
Как видно из данных табл. 3, исследуемые пептиды восстанавливают ориен- тировочно-исследовательскую активность крыс с моделью БА. Это проявляется статистически значимым увеличением числа обследованных отверстий в тесте ОП (до 52%, р<0,05). Лучшие результаты были получены для тетрапептида (LYS). Данные свидетельствует о его способности нормализовать поведенческие реакции животных с моделью БА. Также исследуемый фармакологический препарат норма- лизует эмоциональные реакции крыс в ОП: снижает на 44,7% количество актов груминга (р<0,05), что характеризует его активность как стресс-протекторную.
В тесте ЭИ установлена способность тетрапептида (LYS) улучшать когни- тивные функции крыс с моделью БА (табл. 4).
Таблица 4 Влияние тетрапептида (LYS) и препарата сравнения донепезила на когни- тивные функции крыс с моделью болезни Альцгеймера в тесте экстраполяционного избавления
Figure imgf000015_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) % животных,
справившихся 100% 100% 100% 100% с заданием
Примечание. Статистически значимые различия (р<0,05): * - с группой троля, А - с группой патологии.
Тетрапептид (LYS) статистически значимо по сравнению с группой патоло- гии уменьшает в 3,8 раза время (р<0,05), необходимое животным для поднырива- ния под край цилиндра (избавления) в тесте ЭИ. По этому показателю он на 41,7% превосходит донепезил (р<0,05). Различия между количеством справившихся с за- данием (поднырнувших) животных в каждой группе отсутствуют. Способность тетрапептида (LYS) стимулировать когнитивные функции животных с моделью нейродегенеративного заболевания является одним из проявлений его ноотропной активности.
Другим звеном ноотропного действия тетрапептида (LYS), проявляющегося у животных с моделью БА, является его антиамнестическая активность. Результаты теста УРПИ приведены в таблице 5 и на фиг. 1 и 2.
Таблица 5
Латентное время входа крыс с моделью болезни Альцгеймера в тёмный от- сек прибора УРПИ
Figure imgf000016_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) рапептид (LYS)
0,1 мг/кг и/н
(n=7)
Примечание. Статистически значимые различия (р<0,05): * - с группой троля, Λ - с группой патологии.
В группе патологии наблюдается типичное для блокады холинергической нейротрансмиссии снижение времени входа в темный отсек прибора, свидетельст- вующее об амнестическом действии.
Из анализа табл. 5 следует, что тетрапептид (LYS) увеличивает латентное время входа крыс с моделью БА в тёмный отсек УРПИ как через 24 часа после его формирования (на 79,5% сравнительно с группой патологии), так и через 10 дней (на 130,9% в сравнении с группой патологии, р<0,05). Увеличение этого показателя на фоне препарата тетрапептида (LYS) свидетельствует о его положительном влиянии на формирование условно-рефлекторного памятного следа у животных (положительное мнемотропное действие). По этому показателю исследуемый пре- парат тетрапептида (LYS) превосходит донепезил. АА пептида тетрапептида (LYS)cocTaBmia на первые сутки 56,5% (фиг. 1), а на десятые - возросла до 81,5%. Аналогичные показатели группы донепезила меньше показателей группы тетра- пептида (LYS)B 2,9 и 1,9 раза соответственно.
Таким образом, исследуемый тетрапептид (LYS) на модели когнитивного нарушения, обусловленного снижением холинергической трансмиссии, демонст- рирует выраженные холинопозитивные свойства. Следствием влияния тетрапепти- да на центральные холинергические нейроны, принимающие непосредственное участие в рилизинге про- и противовоспалительных цитокинов, могут быть его ци- токин-опосредованные противовоспалительные свойства.
На первые и десятые сутки после обучения УРПИ в группе патологии все крысы входили в тёмный отсек прибора в течение менее 3 мин (фиг. 2). Это свиде- тельствует о гипомнезии, развивающейся вследствие модельной патологии. Доне- пезил на первые сутки статистически значимо увеличивает число животных, дос- тигших критерия обученное™ УРПИ до 28,6% (р<0,05 с группой патологии). Од-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) нако через десять дней его активность уменьшается до уровня группы патологии. В отличие от донепезила, тетрапептид (ЬУ8)увеличивает этот показатель как на пер- вые, так и на десятые сутки, до 42,9% (р<0,05 с группой патологии) и 14,3% соот- ветственно. Такой результат является проявлением положительного влияния тетра- пептида (LYS) на мнестические функции крыс с моделью БА.
Таким образом, в тесте УРПИ выявлены положительные мнемотропные свойства олигопептидного нейропротектора тетрапептида (LYS), проявляющихся у крыс с моделью БА высокой антиамнестической активностью и увеличением числа животных в группе, достигших критерия обученности условному рефлексу.
Тетрапептид (LYS) проявляет тенденцию к снижению уровня депрессивной симптоматики крыс с моделью БА (табл. 6).
Таблица 6
Влияние тетрапептида (LYS)H препарата сравнения донепезила на показатели крыс с моделью болезни Альцгеймера в плавательном тесте Порсолта
Figure imgf000018_0001
Как следует из анализа данных табл. 6, в группе патологии наблюдается тен- денция к развитию депрессивной симптоматики у крыс. Она проявляется снижени- ем латентного времени первой иммобилизации, повышением количества и общей
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) продолжительности актов иммобилизации. Тетрапептид (LYS) снижает общую продолжительность и количество неподвижных зависаний (иммобилизаций) крыс, а также увеличивает латентный период первой иммобилизации в форме тенденции, что характеризует его активность как антидепрессантную.
Таким образом, по комплексу функциональных тестов ЦНС крыс с моделью
БА установлено комплексное ноотропное действие пептида (LYS), заключающееся в нормализации ориентировочно-исследовательской деятельности животных в ОП, стимуляции их когнитивных функций, положительном мнемотропном эффекте. Ноотропная активность, выявленная на модели БА, сопровождается его тенденцией к снижению депрессивной симптоматики животных, возникающей на фоне мо- дельной патологии.
Установлена тенденция к нормализации КММ на фоне тетрапептида (LYS) (фиг. 3). В группе патологии этот показатель статистически незначимо возрастает на 16,7% в сравнении с контролем. Донепезил и тетрапептид (LYS)TaroKe статисти- чески незначимо снижают КММ на 8,0% и 14,3% соответственно (на фоне тетра- пептида (LYS)nponcxoflHT полная нормализация показателя). Нормализация КММ может происходить также за счет мембраностабилизирующего эффекта тетрапеп- тида (LYS) [Дейко Р. Д. Влияние потенциального нейропротектора acetyl-D-Lys- Lys-Arg-Arg-amide на нейродеструкцию и нейроапоптоз у крыс при остром нару- шении мозгового кровообращения / Р.Д. Дейко, СЮ. Штрыголь и др. // Вестник фармации. - 2016. - Ν° 1(71). - С. 96-102], проявляющегося в случае модельной БА снижением альтерации холинергических нейронов.
Влияние тетрапептида (LYS) и донепезила на реактивно возникающую овер- экспрессию серотонина является также положительным (фиг. 6). Они снижают уровень этого нейротрансмиттера на 23,8% и 43,2% соответственно. Снижение это- го показателя тетрапептидом (Ь ^приводит к его нормализации, о чем свидетель- ствует отсутствие статистически значимых различий с группой контроля.
Было установлено положительное влияние тетрапептидов на систему анти- оксидантной защиты головного мозга крыс при модельной болезни Альцгеймера. Тетрапептид снижает содержание вторичного продукта пероксидного окисления - малонового альдегида (МДА) в головном мозге (фиг. 7). Для препарата сравнения
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) донепезила, напротив, характерно его повышение на 15,9% по сравнению с груп- пой патологии. Снижение этого показателя под влиянием тетрапептида составляет 39,8%по отношению к группе патологии.
Тетрапептид (LYS) значительно повышает уровень восстановленного глута- тиона, статистически значимо снижающийся на 34,3% (р<0,05 с группой контроля) при модельной болезни Альцгеймера (фиг. 8). Увеличение этого показателя на фо- не тетрапептида составляет 36,6%.
Выраженное влияние тетрапептид оказывает на активность СОД в головном мозге крыс с моделью БА (фиг. 9). Он повышает этот показатель на 22% в сравне- нии с таковым в группе патологии , что также способствует повышению антиокси- дантной защиты мозга в условиях модели БА.
Как показано на фиг. 10, тетрапептид (LYS) достоверно в 1,1 раза снижает повышенную активность каталазы, компенсаторно возникающую на фоне модель- ной БА.
Таким образом, тетрапептид (LYS) эффективно влияет на систему антиокси- дантной защиты головного мозга крыс при модельной БА. Он повышает уровень восстановленного глутатиона и активность СОД при патологии и снижает потреб- ность ГМ в оверэкспрессии каталазы - фермента, разрушающего перекиси, конеч- ные продукты пероксидной модификации белкового и липидного субстрата. След- ствием такой его активности является выраженное снижение уровня МДА - про- межуточного продукта пероксидной модификации липидов, входящих в значи- тельном количестве в состав биомембраны нейронов. Это является косвенным под- тверждением мембраностабилизирующего действия тетрапептида, имеющего ме- сто как при цереброваскулярных, так и нейродегенеративных заболеваниях.
Как следует из анализа данных фиг.П, тетрапептид (LYS) статистически значимо по сравнению с группами контроля, патологии и донепезила (р<0,05) сни- жает содержание ацетилхолинэстеразы в головном мозге крыс с моделью БА.
Препарат тетрапептида (LYS), как и донепезил, уменьшает активность АХЭ (фиг. 12 и 13) как в синаптосомах, так и в гомогенате целого головного мозга, что сопровождается формированием средней отрицательной связи между активностью этого фермента и содержанием ацетилхолинэстеразы в ткани головного мозга. При
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) этом тетрапептид значительно повышает сниженную в мозге животных с моделью БА активность бутирилхолинэстеразы, которая, однако, не участвует в инактива- ции ацетилхолина (фиг. 14).
Таким образом, установлено влияние исследуемого пептида на активность ацетилхолинэстеразы и содержание ацетилхолина в головном мозге. Он снижает как количество АХ, так и активность ацетилхолинэстеразы, инактивирующей аце- тилхолин. Это сопровождается повышением когнитивных и мнестических функций крыс с моделью БА. Пример 3. Исследование андидепрессантных свойств тетрапептида (LYS) на модели резерпиновой депрессии.
Эксперимент был выполнен на 16 белых половозрелых рандомбредных кры- сах-самцах массой 180-220 г.Оценивали антидепрессантную активность нейропро- тектора тетрапептида (LYS)B дозе 0,02 мг/кг интраназально (и/н). В качестве пре- парата сравнения использовали классический трициклический антидепрессант имипрамин в дозе 15 мг/кг (мелипрамин, EGIS, Венгрия) внутрибрюшинно (в/б). Эксперимент выполняли в 2 этапа. На 1 этапе интактных животных распределяли по группам: 1 - группа контроля (п=5), 2 - группа «имипрамин» (15 мг/кг в/б, п=6), 3 - группа «тетрапептида (LYS)» (0,02 мг/кг и/н, п=5). За 25-30 мин до начала экс- перимента животным вводили соответствующий препарат. Животным группы кон- троля в/б и и/н вводили 0,9% раствор NaCl в объеме, эквивалентном объему лекар- ственных средств. После этого у животных всех групп в тесте открытое поле (ОП) в течение 3 мин оценивали локомоторную (количество пересеченных квадратов), ориентировочно-исследовательскую (количество вертикальных стоек и обследо- ванных отверстий) активность, а также эмоциональные реакции (фекальные болю- сы, уринации, груминг). Показатели депрессивности у животных (латентное время иммоблизации, количество её эпизодов, а также их совокупная продолжитель- ность) оценивали в плавательном тесте Порсолта (ПТП) в течение 6 мин. В после- дующие 2 суток все препараты вводили в тех же дозах 1 раз в день, последний раз - за 30 мин до депрессогенного симпатолитика резерпина. Резерпин вводили на 3 сутки (2 этап эксперимента) в дозе 4 мг/кг в/б (в виде стабилизированной твином-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 80 суспензии). Через 6-7 ч оценивали показатели животных всех 3 групп в ОП и ПТП.
Результаты обрабатывали статистически. В случае нормального распределе- ния данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента, в случае его от- сутствия - непараметрический Т-критерий Манна-Уитни. При учете результатов в альтернативной форме (наличие/отсутствие признака) применяли угловое преобра- зование Фишера φ. Парный Т-критерий Вилкоксона использовали для внутригруп- повой статистической оценки изменений показателей тестов животных до и после моделирования депрессии. Результаты считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты теста ОП приведены в табл. 7.
Таблица 7
Влияние тетрапептида (LYS)H препарата сравнения имипрамина на показатели ин- тактных животных, а также животных с резерпиновой депрессией в тесте открыто- " го поля, М±т
Figure imgf000022_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) гетативное co- (+ 87,5%) (- 39,12%) (- 88,9%)® провождение
(сумма актов
груминга, фе- кальных болюсов
и уринаций)
И 33,2±8,43 20,8±2,68 11,6±2,49*л
Сумма всех пока-
10,0±1,30 6,4±1,6* 8,2±4,98 зателей Р
(- 97,0%)® (- 69,23%)® (- 29,3%)
Примечание. И - интактные животные, Р - резерпиновая депрессия; р<0,05: * - с группой контроля, Л - с группой имипрамина, ® -между показателем до и по- сле моделирования депрессии; в скобках - % изменения показателя животных с ре- зерпиновой депрессией против соответствующего показателя интактных живот- ных.
Как следует из данных табл. 7, у интактных животных тетрапептид (LYS) снижает все виды активности в ОП, а также эмоциональные реакции. Имипрамин также проявляет тенденцию к снижению локомоторной и ориентировочно- исследовательской активности интактных животных. Уровень эмоциональных ре- акций под его влиянием, наоборот, возрастает (в 2,9 раза, р<0,05 по сравнению с группой контроля). Таким образом, в условиях ОП у животных без депрессии тет- рапептида (LYS) проявляет седативные свойства, более выраженные, чем у препа- рата сравнения имипрамина.
Резерпин вызывает у животных ярко выраженную модельную депрессию (табл. 7), характеризующуюся снижением двигательной (на 70%, р<0,05 против по- казателя интактных животных), ориентировочно-исследовательской активности (на 93,2%, р<0,05 против показателя интактных животных ), а также тенденцией к по- вышению уровня эмоциональных реакций в 1,9 раза. Сумма всех видов активности снижается на 97% (р<0,05). На фоне имипрамина степень этих нарушений незначи- тельно уменьшается. Локомоторная активность снижается на 79,2% (р<0,05 против показателя интактных животных), а ориентировочно-исследовательская - на 76,5% (р<0,05 против показателя интактных животных). Уровень эмоциональных реакций
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) снижается недостоверно в 1,6 раза (р>0,05 против показателя интактных живот- ных), но сумма всех видов активности уменьшается достоверно (на 69,2%, р<0,05), хотя и не так выражено, как в контроле. Снижение показателей локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности у животных с резерпиновой де- прессией, получавших лечение тетрапептидом (LYS), является наименее выражен- ным. Он уменьшает количество пересеченных квадратов лишь в виде тенденции на 15%, а ориентировочно-исследовательскую активность - на 20,7% (р>0,05 против показателя интактных животных). Сумма всех видов активности на фоне тетрапеп- тида (LYS) снижается статистически незначимо на 29,3% (р>0,05 против показате- ля интактных животных). Наименее выраженное снижение всех видов активности по сравнению с группой контроля и имипрамина свидетельствует об антагонизме тетрапептида (LYS) с депрессогенным действием резерпина. Статистически значи- мо снижается только сумма показателей эмоциональных реакций и ее вегетативно- го сопровождения в 9 раз (р<0,05 против показателя интактных животных), в то время как у животных без лечения, наоборот, повышается.
В таблице8 показано, что по результатам ПТП тетрапептида (LYS) проявляет антидепрессантные свойства как у интактных животных, так и у животных с резер- пиновой депрессией. Антидепрессантные свойства тетрапептида (LYS)y интактных животных заключаются в его способности статистически значимо повышать ла- тентное время иммобилизации (в 3,5 раза по сравнению с контролем, р<0,05), сни- жать количество эпизодов неподвижности и их общую продолжительность (в 11,5 и 16,1 раза соответственно, р<0,05 с контролем).
Таблица8
Влияние тетрапептида (LYS) и имипрамина на показатели интактных крыс и жи- вотных с резерпиновой депрессией в плавательном тесте Порсолта, М±ш
Figure imgf000024_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) иммобилизации, с 38,2±17,2 128,8±44,5 170,8±34,1*
Р
(- 39,2%) (+ 20,6) (- 20,4)
Количество эпизо- И 13,8±3,08 5,8±1,6* 1,2±0,6* дов иммобилиза- 7,8±0,96 5,2±1,13 3,0±0,38*
Р
ции (- 43,5%) (- 10,3%) (+ 150,0%)
Совокупная про- и 64,4±32,5 18,0±6,9 4,0±2,7* должительность 28,2±8,81 17,7±5,8 7,8±2,3*
Р
иммобилизации, с (- 56,2%) (- 1,7%) (+ 95,0%)
Примечание. И - интактные животные, Р -резерпиновая депрессия; * - ста- тистически значимые различия с группой контроля (р<0,05), в скобках - % измене- ния показателя животных с резерпиновой депрессией против соответствующего показателя интактных животных.
У животных, получавших имипрамин, статистически значимо снижается только количество эпизодов неподвижности (р<0,05 относительно контроля), а её латентное время и общая продолжительность изменяются лишь в виде тенденции. Это соответствует хорошо известному факту постепенного развития специфиче- ского эффекта классических антидепрессантов, в том числе трициклиических, к ко- торым относится имипрамин. Таким образом, исследуемый пептид характеризует- ся не только ярко выраженным по силе, но и быстро развивающимся антидепрес- сантным эффектом.
На фоне резерпиновой депрессии тетрапептид (LYS) также проявляет стати- стически значимый антидепрессантный эффект относительно группы контроля. Как и в случае с интактными животными, тетрапептид (LYS) повышает латентное время иммобилизации в 4,5 раза (р<0,05 относительно контроля), снижет количест- во эпизодов иммобилизациив 2,6 раза (р<0,05 относительно контроля) и её общую продолжительность в 3,6 раза(р<0,05 относительно контроля). По этим показате- лям активность олигопептида превосходит таковую имипрамина.
Таким образом, установлено, что тетрапептид (LYS) проявляет выраженные антидепрессантные свойства как у интактных животных, так и при резерпиновой депрессии. Это даёт основания предположить, что он благоприятно модулирует
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) моноаминергическую трансмиссию в головном мозге, как в норме, так и при мо- дельной патологии, вызванной резерпином.
Анализ полученных результатов показал, что тетрапептид (LYS), вводимый интраназально в дозе ОД мг/кг в течение 10 дней 1 раз в сутки, демонстрирует ус- тойчивый ноотропный эффектна скополамин-индуцированной модели болезни Альцгеймера. Последний проявляется высокой антиамнестической активностью тетрапептида (LYS)B тесте условного рефлекса пассивного избегания, сохраняю- щейся в течение не менее 10 суток, его способностью стимулировать когнитивные функции животных в тесте экстраполяционного избавления, нормализовать пове- денческую активность в тесте открытого поля (улучшать ориентировочно- исследовательскую активность и уменьшать реакцию животных на стресс). При этом установлена тенденция к уменьшению проявлений депрессивной симптома- тики крыс на фоне лечения тетрапептидом (LYS).
Нейропротекторные свойства в условиях модели БА проявляются тенденци- ей к снижению коэффициента массы головного мозга, повышением уровня цереб- рального серотонина, оптимизацией углеводного обмена в головном мозге (улуч- шением утилизации глюкозы и увеличением уровня АТФ). Продемонстрированы выраженные антиоксидантные свойства тетрапептида (LYS), проявляющиеся уменьшением количества продуктов пероксидного окисления липидов в головном мозге, повышением активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксид- дисмутаза) или снижением их компенсаторной гиперактивности (каталаза).
Установлены выраженные антидепрессантные свойства тетрапептида (LYS), проявляющиеся как у интактных животных, так и у животных с моделью резерпин- индуцированной депрессии. У последних они проявляются статистически досто- верной редукцией депрессивной симптоматики (иммобилизации).
По комплексу выявленных фармакологических свойств тетрапептид (LYS) перспективен для дальнейшего клинического примененияв качестве ноотропного, нейропротекторного и антидепрессантного средства.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пептид общей формулы ацетил-Х-АК.О-А1 -амид, где
X = -(D-ARG)-ARG-; -(D-LYS)-LYS-ran-(D-MET)-MET-, с антидепрессантной активностью и лечебным действием против болезни Альцгеймера.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2018/000038 2017-04-28 2018-01-29 Пептид с антидепрессантной активностью и лечебным действием против болезни альцгеймера WO2018199803A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18789923.2A EP3639839A4 (en) 2017-04-28 2018-01-29 PEPTIDE WITH ANTIDEPRESSIVE EFFECT AND THERAPEUTIC EFFECT AGAINST ALZHEIMER'S MORBUS
US16/643,711 US10844091B2 (en) 2017-04-28 2018-01-29 Peptide with antidepressant activity and therapeutic effect against Alzheimer's disease

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017115294A RU2678987C2 (ru) 2017-04-28 2017-04-28 Пептид для лечения болезни альцгеймера
RU2017115294 2017-04-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018199803A1 true WO2018199803A1 (ru) 2018-11-01

Family

ID=63918637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000038 WO2018199803A1 (ru) 2017-04-28 2018-01-29 Пептид с антидепрессантной активностью и лечебным действием против болезни альцгеймера

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10844091B2 (ru)
EP (1) EP3639839A4 (ru)
RU (1) RU2678987C2 (ru)
WO (1) WO2018199803A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113573723A (zh) * 2019-03-14 2021-10-29 拉托科公司 合成的神经调节肽

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU24626B1 (es) 2019-12-26 2022-11-07 Centro Nac De Biopreparados Composición farmacéutica a base de proteínas con actividad neuroprotectora, inmunomoduladora, antiinflamatoria y antimicrobiana
RU2763136C1 (ru) * 2021-03-17 2021-12-27 Общество с ограниченной ответственностью «Научно-Производственная Фирма Верта» Фармацевтически приемлемые соли пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида
CN116813694B (zh) * 2023-06-21 2024-03-29 广东医科大学 一种方格星虫肽及其制备方法与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999027944A1 (en) 1997-12-02 1999-06-10 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
RU2256920C2 (ru) 2003-09-15 2005-07-20 Трубицына Ирина Евгеньевна Способ определения ацетилхолина
RU2372355C1 (ru) 2008-06-27 2009-11-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Пептид, обладающий защитным действием против болезни альцгеймера
WO2011128455A1 (en) * 2010-04-16 2011-10-20 Ac Immune S.A. Novel compounds for the treatment of diseases associated with amyloid or amyloid-like proteins
RU2537560C2 (ru) * 2013-04-25 2015-01-10 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ВЕРТА" Тетрапептид и средство, обладающее церебропротекторной и антиамнестической активностями (варианты)
RU2558242C1 (ru) 2014-06-30 2015-07-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Пептид, обладающий лечебным действием против болезни альцгеймера
RU2559880C1 (ru) * 2014-06-18 2015-08-20 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Замещенный бисдипептид с нейропротективным и антидепрессивным эффектом

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4966848A (en) * 1988-02-08 1990-10-30 The General Hospital Corporation Isolation, purification, characterization, cloning and sequencing of N α-acetyltransferase
US5223421A (en) * 1989-10-25 1993-06-29 The General Hospital Corporation Identification of methionine Nα-acetyltransferase
US5688489A (en) * 1995-09-15 1997-11-18 Resolution Pharmaceuticals, Inc. Non-receptor mediated imaging agents
PL363153A1 (en) * 2000-06-16 2004-11-15 Hercules Incorporated Chemically-modified antimicrobial peptides, compositions and methods of production and use
RU2356573C1 (ru) * 2007-10-17 2009-05-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Средство, обладающее антиишемической и антигипоксической активностью
EA023025B1 (ru) * 2013-12-26 2016-04-29 Замертон Холдингс Лимитед Фармацевтическая композиция, обладающая нейропротекторным действием, её применение и способы повышения жизнеспособности и профилактики и/или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний
BR112016024494B1 (pt) * 2014-04-22 2024-02-06 Txp Pharma Gmbh Análogo de peptídeo e seu uso

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999027944A1 (en) 1997-12-02 1999-06-10 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
RU2256920C2 (ru) 2003-09-15 2005-07-20 Трубицына Ирина Евгеньевна Способ определения ацетилхолина
RU2372355C1 (ru) 2008-06-27 2009-11-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Пептид, обладающий защитным действием против болезни альцгеймера
WO2011128455A1 (en) * 2010-04-16 2011-10-20 Ac Immune S.A. Novel compounds for the treatment of diseases associated with amyloid or amyloid-like proteins
RU2537560C2 (ru) * 2013-04-25 2015-01-10 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ВЕРТА" Тетрапептид и средство, обладающее церебропротекторной и антиамнестической активностями (варианты)
RU2559880C1 (ru) * 2014-06-18 2015-08-20 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Замещенный бисдипептид с нейропротективным и антидепрессивным эффектом
RU2558242C1 (ru) 2014-06-30 2015-07-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Пептид, обладающий лечебным действием против болезни альцгеймера

Non-Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"M. Medicine", 1977, article "Modern Biochemistry Methods", pages: 392
"M.: Grief and K", 2012, article "Guidelines for conducting nonclini-cal studies of pharmaceuticals", pages: 944
"Methods of behavior analysis in neuroscience", 2001, CRCPRESS, pages: 329
A.I. PANYUKOV: "Issues of Med. Chemistry", vol. 12, 1966, article "On the Use of the Hestrin Method for Separate Measurement of Cholinesterase Activity", pages: 88 - 95
ATACK C: "Acta-Pharma-colToxicol (Copenh", vol. 42, 1978, article "A procedure for the isolation of noradrenaline (together with adrenaline), dopamine, 5 - hydroxy tryptamine and histamine from the same tissue sample using a single col umn of strongly acidic cation exchange resin 1C", pages: 35 - 57
DEIKO R. D ET AL.: "Vliyaniye potentsial'nogo neyroprotektora Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide (KK-1) na neyrodestruktsiyu i neyroapoptoz u krys pri ostrom narushenii mozgovogo [The effect of the potential neuroprotector Acetyl- (D-Lys) -Lys-Arg-Arg-amide (KK-1) on neurodestruction and neuroapoptosis in rats with acute", VESTNIK FARMATSII, vol. 71, no. 1, 30 November 2015 (2015-11-30), pages 96 - 102, XP009519008, ISSN: 2074-9457 *
HAJOS E: "Brain Res.", vol. 93, 1975, article "An Improved Method for the Preparation of Synaptosomal ractions in high purity", pages: 485 - 489
HARDY J.SELKOE D.J: "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics", SCIENCE, vol. 297, no. 5580, 2002, pages 353 - 356
J.M. STEWARDJ.D. YOUNG: "Solid Phase Peptide Synthesis", 1969, W.H. FREEMAN CO.
K.S. RADIONOVA: "Bul experim. Biology and Medicine", vol. 146, 2008, article "Original nootropic preparation Noopept ameliorates memory loss caused by the M-and N- choline receptor blockade in rats", pages: 65 - 68
LECLERC E.STURCHLER E.VETTER S.: "The S 100B/RAGE Axis in Alzheimer's Disease", CARDIOVASC. PSYCHIATRY NEUROL., vol. 2010, 2010, pages 1 - 11
M.A. KOROLYUKL.I. IVANOVAI.G. MAYOROVA ET AL.: "Lab. Science", vol. 1, 1988, article "Activity of superoxide dismutase in blood in the acute period of various diseases", pages: 16 - 19
N.D. YESCHENKO: "Methods for biochemical research", 1982, LENINGRAD, PUB., article "Determination of ATP content in tissue", pages: 256 - 258
PORSOLT R.D.: "Nature", vol. 266, 1977, article "Depression: A new animal model sensitive to antidepressant treatments", pages: 730 - 732
PRICE, D.L., DRUG DEVELOPMENT RESEARCH, vol. 5, 1985, pages 59 - 68
R.D. DEYKO ET AL.: "Pharmaceutical Herald", vol. 71, 2016, article "The effect of the potential neuroprotector acetyl-D-Lys-Lys-Arg-Arg-amide on neurodestruction and neuroapop-tosis in rats during a cerebrovascular accident", pages: 96 - 102
RAINA P., ANN. INTERN. MED., vol. 148, no. 5, 2008, pages 379 - 397
SCRIP DAILY ONLINE, 25 February 2002 (2002-02-25), pages S007455320
See also references of EP3639839A4
SENIOR K: "Dosing in Phasell trial of Alzheimer's vaccine suspended", LANCET. NEUROL., vol. 1, no. 1, 2002, pages 3, XP004814198, DOI: 10.1016/S1474-4422(02)00023-6
SHENK D.: "Amyloid-13 immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of the beginning", NAT. REV. NEUROSCI., vol. 3, no. 10, 2002, pages 824 - 828
SHENK D.BARBOUR R.DUNN W.: "Immunization with amyioid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse", NATURE, vol. 400, no. 6740, 1999, pages 173 - 177
T.A. KOCHETOV: "A Practical Guide to Enzymology", 1980, pages: 280
THE SCIENTIST, vol. 16, no. 7, 1 April 2002 (2002-04-01), pages 22
WAT-KINS, P. B. ET AL., J. AM. MED. ASSOC., vol. 271, 1994, pages 992 - 998

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113573723A (zh) * 2019-03-14 2021-10-29 拉托科公司 合成的神经调节肽

Also Published As

Publication number Publication date
EP3639839A1 (en) 2020-04-22
RU2678987C2 (ru) 2019-02-05
US20200231625A1 (en) 2020-07-23
EP3639839A4 (en) 2021-03-24
RU2017115294A (ru) 2018-10-29
RU2017115294A3 (ru) 2018-10-29
US10844091B2 (en) 2020-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Autophagy in Alzheimer’s disease pathogenesis: Therapeutic potential and future perspectives
WO2018199803A1 (ru) Пептид с антидепрессантной активностью и лечебным действием против болезни альцгеймера
JP3064013B2 (ja) 斑形成疾患の治療のための方法及び材料
Liu et al. Sodium hydrosulfide attenuates beta-amyloid-induced cognitive deficits and neuroinflammation via modulation of MAPK/NF-κB pathway in rats
US10925858B2 (en) S-nitrosoglutathione (GSNO) and GSNO reductase inhibitors for use in therapy
US20220072019A1 (en) Inhibitors of sarm1 in combination with nad+ or a nad+ precursor
JP2007535498A (ja) グラチラマー・アセテートおよびリルゾールでの併用療法
US20210261540A1 (en) Inhibitors of sarm1
US11090355B2 (en) Compositions and methods for the treatment of neurodamage
US20240091227A1 (en) Use Of 2-Phenyl-6-(1H-Imidazol-1-YL) Quinazoline For Treating Neurodegenerative Diseases, Preferably Alzheimer&#39;s Disease
Shulginova et al. Disorders of the immune status in patients with chronic cerebral ischemia; differentiated pharmacological correction
US8106019B2 (en) CHEC-7 a novel sPLA2 inhibitor
RU2741938C2 (ru) Антидепрессантное средство
Chen et al. LncRNA NR_030777 promotes mitophagy by targeting CDK1-related mitochondrial fission and ATG12 to attenuate paraquat-induced Parkinson's disease
Brenner et al. Aluminum toxicity in rat hippocampal neurons
US20220378866A1 (en) Combination therapy methods, compositions and kits
WO2018038973A1 (en) Neuroprotective beta amyloid core peptides and peptidomimetic derivatives
US20230172877A1 (en) Metabolites released from apoptotic cells act as novel tissue messengers
US20200016145A1 (en) Treatment of chronic traumatic encephalopathy
Itoh et al. Effects of metrifonate on impairment of learning and dysfunction of cholinergic neuronal system in basal forebrain-lesioned rats
Levine et al. Behavioral and histological assessment of a novel treatment of neuroHIV in humanized mice
CN117957003A (zh) 治疗神经退行性疾病的方法
Gupta Reactive Oxygen species: The main culprit of Alzheimer Disease.
Roy Switching microglial activation from neurodestructive to neuroprotective mode
Richard et al. Intensive vascular care as secondary prevention in Alzheimer—A clinical trial

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18789923

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018789923

Country of ref document: EP

Effective date: 20191128