EA023025B1

EA023025B1 - Фармацевтическая композиция, обладающая нейропротекторным действием, её применение и способы повышения жизнеспособности и профилактики и/или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний

Info

Publication number: EA023025B1
Application number: EA201301340A
Authority: EA
Inventors: Петр Александрович Белый; Евгений Александрович ЧЕРТОРИЖСКИЙ; Михаил Владимирович ОВЧИННИКОВ
Original assignee: Замертон Холдингс Лимитед
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2016-04-29
Also published as: EA201301340A1

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается фармацевтической композиции, содержащей пептиды Asp-Glu-Gly, Lys-Asp-Glu и Ala-Asp-Glu-Leu. Композиция обладает выраженным нейропротекторным действием, что позволяет использовать фармацевтическую композицию, содержащую пептиды Ala-Asp-Glu, Lys-Asp-Glu и Ala-Asp-Glu-Leu для профилактики и/или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний, а также для повышения жизнеспособности.

Description

Изобретение относится к медицине и касается фармацевтической композиции, содержащей пептиды Акр-С1и-С1у, Ьук-Акр-С1и, А1а-Акр-С1и-Ееи и её применению для профилактики или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний и повышения жизнеспособности.

Уровень техники

Известно, что мелатонин, основной гормон шишковидной железы (эпифиза), оказывает антиоксидантное, адаптогенное и снотворное действие, тормозит секрецию гонадотропинов, нормализует циркадные ритмы, регулирует цикл сон-бодрствование, суточные изменения локомоторной активности и температуры тела, положительно влияет на интеллектуально-мнестические функции мозга, эмоциональноличностную сферу, не вызывает ощущения вялости, разбитости и усталости при пробуждении, адаптирует организм к быстрой смене часовых поясов, снижает стрессовые реакции, регулирует нейроэндокринные функции, проявляет иммуностимулирующие свойства, предупреждает развитие атеросклероза и новообразований и др. (Арушанян Э.Б. Мелатонин - универсальный стабилизатор психической деятельности. Журнал высшей нервной деятельности, 2011, 61, № 6, с. 645-659; Апбегкоп С., Маек М. Ме1а!ошп: ап оуебоокеб йасФт ίη ксЫ/орНгеша апб ίη (Не шЫЬйюп οί апП-ркусНо11с ыбе ейсс(к. Ме(аЬ Вташ Όίκ. 2012, 27(2), 113-119).

Мелатонин вырабатывается не только в эпифизе, экстрапинеальными источниками мелатонина являются энтерохромаффинные клетки желудочно-кишечного тракта, нейроэндокринные клетки воздухоносных путей, корковый слой почек и др. На основе мелатонина созданы лекарственные препараты, например мелаксен, а также его синтетический аналог - антидепрессант агомелатин (агонист мелатониновых рецепторов 1 и 2 типа).

В последнее время возрос интерес к пептидам биорегуляторам, которые оказывают влияние на различные функции организма. В серии исследований было установлено, что длительное введение пептидного препарата эпифиза эпиталамина увеличивает продолжительность жизни самок крыс и снижает частоту развития опухолей. Сконструированный на основании аминокислотного анализа эпиталамина пептид эпиталон (А1а-С1и-Акр-С1у) оказывал более эффективное воздействие на скорость старения и продолжительность жизни по сравнению с эпиталамином (КНауткоп ν.Κ. Рер11бе Ыогеди1а(огк аге (Не ГШиге ой шебюше. №игоепбосгшо1оду Ьейетк. 8реша1 1ккие, 2002, р. 144).

Одним из широкоиспользуемых в настоящее время лекарственных средств пептидной природы, оказывающим ноотропное, психостимулирующее, нейрозащитное, антиоксидантное и антигипоксическое действие, является семакс (гептапептид метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицилпролин, Е.И. Гусев, В.И. Скворцова. Ишемия головного мозга. М: Медицина 2001; 249-251; Инсульт: диагностика, лечение, профилактика (под ред. 3.А. Суслиной, М.А. Пирадова). М: Медпресс-информ. 2008; Федеральное руководство по использованию лекарственных средств, 2012).

Тетрапептид А1а-Акр-С1и-Ееи (бронхоген) является одним из используемых в настоящее время лекарственных средств пептидной природы, применяемым в качестве бронхорегулятора (МопакеПб/е ТК., КНаушкоп ν.Κ. с соавт. ЕГГес( ой (Не Рерйбе ВгопсНодеп (А1а-Акр-С1и-Ееи) оп ΌΝΑ ТНегток1аЬПНу. Ви11е1еп ой Ехрептеп1а1 Вю1оду апб Мебюше, 2011, 150 (3), р. 375).

Известен пептид Акр-С1и-С1у (К Кап Сио е(.а1. 1ко1айоп апб рипПсайоп ой а кепек ой рерИбек йгот Рапах поЮдткепд. Рерйбе: Вю1оду апб СНетМгу. Ртосеебшдк ой СНтеке Рерйбек Бутрокшт, 5* Ьап/Нои. СЫпа, 1998, 1и1у 14-17, 102-103). Описано применение пептидов Акр-С1и-С1у и Ьук-Акр-С1и для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (патент ЕА018614). Однако даже не предполагалось использование пептидов Акр-С1и-С1у, Ьук-Акр-С1и или А1а-Акр-С1и-Ееи в качестве лекарственного средства, обладающего нейропротекторным, антиамнестическим и противогипоксическим действием.

Поиск новых безопасных и эффективных лекарственных средств пептидной природы, обладающих противогипоксической, нейропротекторной, антиамнестической активностью и другими ценными свойствами, на основе пептидов, имеющих, в частности, эпифизарное происхождение, является актуальной проблемой современной фармакологии.

Сущность изобретения

Авторами настоящего изобретения впервые предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активных компонентов пептиды Акр-С1и-С1у, Ьук-Акр-С1и, А1а-Акр-С1и-Ееи в терапевтически эффективных количествах. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в соответствии с настоящим изобретением, оказывает выраженное противогипоксическое, нейропротекторное и антиамнестическое действие.

В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция согласно предложенному изобретению содержит активные компоненты в соотношении Акр-С1и-С1у:Еук-Акр-С1и:А1а-Акр-С1и-Ееи (0,110): (0,1-10): (0,1-10). Наиболее предпочтительными являются весовые соотношения от 1:1:1 до 1:3:1.

Другим аспектом изобретения является применение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активных компонентов пептиды Акр-С1и-С1у, Ьук-Акр-С1и, А1а-Акр-С1и-Ееи в терапевтически эффективных количествах для профилактики или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний, а также для повышения жизнеспособности.

Ещё одним аспектом изобретения является способ профилактики и/или лечения цереброваскуляр- 1 023025 ных и нейродегенеративных заболеваний и способ повышения жизнеспособности, предусматривающие введение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активных компонентов пептиды АзрС1и-С1у, Ьуз-Азр-О1и, А1а-Азр-О1и-Ьеи в терапевтически эффективных количествах, пациенту.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, повышающую жизнеспособность и обладающую противогипоксическим, нейропротекторным, антиамнестическим действием и содержащую в качестве активных компонентов пептиды Азр-С1и-С1у, Ьуз-Азр-С1и, А1а-Азр-С1и-Ьеи в терапевтически эффективных количествах. Обнаруженный эффект позволяет использовать фармацевтическую композицию, содержащую пептиды Азр-О1ц-О1у, Ьуз-Азр-О1и и А1а-Азр-О1ц-Ьеи для профилактики или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний, а также для повышения жизнеспособности.

Список основных сокращений

ЫаС1 - натрия хлорид,

АЛТ - аланинаминотрансфераза,

АСТ - аспартатаминотрансфераза, в/б - внутрибрюшинно,

ДК - диеновые конъюгаты,

ОП - острый панкреатит,

ПЖ - поджелудочная железа,

ПОЛ - перекисное (пероксидного) окисление липидов,

СОД - супероксиддисмутаза,

УРПИ - условный реакция (рефлекс) пассивного избегания,

ЩФ - щелочная фосфатаза.

Все пептиды получают классическим методом пептидного синтеза в растворе (Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985, стр. 456).

Эффективность фармацевтической композиции согласно предложенному изобретению оценивали на животных.

В работе использованы модели и методы, рекомендованные Фармакологическим комитетом для проведения подобных исследований, утвержденные Министерством здравоохранения и социального развития РФ и соответствующие рекомендациям, опубликованным в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под редакцией Р.У. Хабриева. М., Минздрав РФ, 2005).

Статистическую обработку результатов исследований проводили параметрическими (критерий Стьюдента) и непараметрическими (точный метод Фишера) методами с использованием программы Βίο81а1 2009 РгоГеззюпаБ

Противогипоксические свойства фармацевтической композиции согласно изобретению продемонстрированы на модели острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией (пример 1).

На модели ишемического инсульта показано, что фармацевтическая композиция согласно изобретению оказывает отчетливое нейропротекторное действие (пример 2).

Фармацевтическая композиция согласно изобретению оказывает отчетливое антиамнестическое действие на различных моделях амнезии у мышей, вызванной электросудорожным шоком, скополамином и острой нормобарической гипоксией с гиперкапнией (пример 3).

Эффективное действие композиции согласно изобретению на жизнеспособность возрастных крыс (24 мес.) подтверждается исследованиями состояния шерстного покрова, когтей и зубов, содержания глюкозы в крови, репродуктивного поведения, обонятельной реакции на пищевой раздражитель и восстановлением рефлекса переворачивания (пример 4). По совокупности исследованных показателей под влиянием композиции происходит восстановление функций организма у возрастных животных до уровня, соответствующего молодому возрасту. Композиция согласно изобретению также оказывает благотоворное влияние на продолжительность жизни (пример 4).

Возможность использования композиции для лечения нейродегеративных заболеваний подтверждена на одной из экспериментальных моделей, наиболее близкой по механизму развития болезни Альцгеймера и отражающей симптомы нарушения памяти - крысам вводят нейротоксичный ундекапептид βамилоид (25-35) в базальные гигантоклеточные ядра Мейнерта (Уап Ноезеп СЛУ. Согйса1 Гееб Гоптагб апб согйса1 ГеебЬаск пеига1 зуз!ет ίη А1/Беипег Фзеазе. 1п: Соппесйоп, содпБюп апб А1/Беипег 'з Фзеазе. КезегсБ апб Регзресйуез ш А1/Беипег б1зеазе. Ебз: Нутап В.Т., Эиускаейз С, СБпз1еп Υ. ВегБп: §ргшдегУег1апб, 1998, рр. 17-31; Островская Р.У., Бельник А.П., Сторожева З.И. 2008. Эффективность препарата Ноопепт при экспериментальной модели болезни Альцгеймера (когнитивный дефицит, вызванный введением β-амилоида 25-35 в базальные ядра Мейнерта крыс). Бюл. экспер. биол., 146, 84-88). Введение пептида приводит к токсическим нарушениям пространственной памяти и способности к обучению уменьшается степень запоминания при выполнении условного рефлекса пассивного избегания.

Результаты исследований продемонстрировали способность композиции согласно изобретению

- 2 023025 улучшать нарушенную экпериментальной болезнью Альцгеймера (ЭБА) память у крыс (пример 5).

Токсичность композиции согласно изобретению оценивалась в отдельной серии экспериментов путём в/б введения композиции в дозе 6 мг/кг ( в 10 раз превышающей максимально эффективную) 10 белым нелинейным самцам мышей массой 200-230 г. Было обнаружено, что в течение 14 суток после однократного в/б введения композиция не вызывает ни гибели животных, ни существенных токсических реакций.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнена в виде таблеток, капсул с использованием фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и процедур, традиционных для данной области техники, а также в виде раствора для инъекций. Кроме того, композиция может быть выполнена в виде капель или раствора для приема внутрь, или в виде спрея назального или капель назальных, аэрозоля подъязычного или перорального, или в виде порошка, или в виде лиофилизата для приготовления готового раствора.

Перечисленые формы фармацевтической композиции получают известными методами. В соответствии с настоящим изобретением пациентам, нуждающимся в профилактике и/или лечении, композицию назначают предпочтительно для перорального и/или парентерального применения (например, внутривенно, внутримышечно, подкожно).

Для получения фармацевтической композиции согласно изобретению используют любые фармацевтически приемлемые носители или растворители. Для перорального введения фармацевтическая композиция может принимать форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков. Таблетки, содержащие различные наполнители, например цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция или любые другие фармацевтически приемлемые наполнители, могут также включать различные дезинтеграторы, например крахмал, предпочтительно картофельный крахмал или тапиоку, сложные силикаты или любые другие фармацевтически приемлемые дезинтеграторы, вместе со связывающими веществами, например поливинилпирролидоном, сахарозой, желатином, аравийской камедью и любыми другими фармацевтически приемлемыми связывающими веществами. Кроме того, часто применяются скользящие вещества, например стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк для таблетирования или любые другие фармацевтически приемлемые скользящие вещества.

Композиции согласно изобретению также могут представлять собой желатиновые капсулы; предпочтительные в этом случае капсулы включают, например, лактозу или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли с высоким молекулярным весом. Если для перорального введения желательны водные суспензии и/или эликсиры, заявленные композиции могут сочетаться с различными подслащивающими средствами, улучшающими вкус и запах, подкрашивающими веществами, эмульгирующими веществами и/или суспендирующими средствами, а также растворителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и различными их комбинациями. Для парентерального введения могут использоваться растворы в кунжутном или арахисовом масле или в водном пропиленгликоле, так же как и стерильные водные растворы соответствующих водорастворимых солей. Такие водные растворы могут быть соответственно буферными, если необходимо, и водный растворитель сначала изотонируют с помощью достаточного количества раствора соли или глюкозы. Эти водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения.

Способ профилактики и/или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний предусматривает введение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активных компонентов пептиды А8р-О1и-О1у, Ьук-Акр-ОШ, Ак-Акр-ОШ-Ьеи в терапевтически эффективных количествах, пациенту. В предпочтительном воплощении способа назначают композицию, содержащую пептиды в соотношении от 1:1:1 до 1:3:1.

Режим и дозы введения фармацевтической композиции согласно изобретению, а также длительность применения зависят от стадии заболевания и состояния пациента. В соответствии с изобретением фармацевтическую композицию назначают предпочтительно в дозах 100-600 мкг, наиболее предпочтительно в дозе 150 мкг, хотя могут быть использованы и более низкие (высокие) дозы в зависимости от характера течения патологического процесса, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Исследование влияния композиции согласно изобретению на продолжительность жизни животных при различных видах острой гипоксии.

Острую нормобарическую гипоксию с гиперкапнией воспроизводили путем помещения мышей массой 200-250 г поодиночке в термокамеру - стеклянные банки одинакового объема (250 см³), которые герметично закрывали. По мере потребления кислорода концентрация его в воздухе сосуда и в организме снижалась, а количество углекислого газа [оксид углерода (IV)], наоборот, возрастало. В результате у животных развивалась гипоксическая гипоксия с гиперкапнией. Регистрировали с помощью секундомера продолжительность жизни животных (до остановки дыхания) в термокамере в минутах (с точностью до 0,1 мин) и по ее увеличению судили об эффективности испытанных фармакологических веществ. Композицию согласно избретению вводили однократно внутрибрюшинно (в/б) за 60 мин до опыта. Животным контрольных групп вводили в/б 0,9% раствор натрия хлорида (ИаС1) в том же объеме.

- 3 023025

Описанную выше модель острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией также использовали для вызывания у мышей ретроградной амнезии навыка пассивного избегания (УРПИ) (Н.Д. Авсеенко. Ноотропы с антигипоксическим эффектом в эксперименте и клинике. Автореф. дис. д-ра мед. наук. М., 1997, стр. 44). Для этого мышей сразу после обучения УРПИ помещали поодиночке в термокамеру на 1618 мин в зависимости от выраженности симптомов кислородной недостаточности и массы (чем больше масса, тем обычно меньше время их пребывания в термокамере). В контрольной группе животных подвергали ложной гипоксии - сажали мышей в стеклянные банки одинакового объема, которые не закрывали. Проверку сохранения УРПИ проводили через 24 ч после окончания воздействия гипоксии с гиперкапнией. Композицию согласно изобретению вводили в/б за 60 мин до обучения мышей.

Исследование влияния фармацевтический композиции, содержащей пептиды А8р-С1и-С1у, Ьук-АкрО1и и А1а-А8р-О1и-Ьеи, на продолжительность жизни животных на модели острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией представлены в табл. 1а, б, с.

Из представленных данных видно, что фармацевтическая композиция согласно изобретению в дозе 100 мкг/кг существенно не изменяла продолжительность жизни мышей, а в дозах 300 и 600 мкг/кг значимо (р<0,01) увеличивала этот показатель на 29 и 32% соответственно.

Таблица 1а

Влияние фармацевтической композиции согласно изобретению и мелатонина на продолжительность жизни мышей в термокамере (М±т) А8р-С1и-С1у:Ьу8-А8р-С1и:А1а-А8р-С1и-Ьеи (1:1:1)

Вещество (доза, мкг/кг)

Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) Фармацевтическая композиция согласно изобретению (100) Фармацевтическая композиция согласно изобретению (300) Фармацевтическая композиция согласно изобретению (600)

Число мышей

Тродолжительность жизни, минуты 25,9+0,6

28,8+1,0

33,3+2,1

34,1+2,6

Таблица 1б

Влияние фармацевтической композиции согласно изобретению и мелатонина на продолжительность жизни мышей в термокамере (М±т) А8р-С1и-С1у:Ьу8-А8р-С1и:А1а-А8р-С1и-Ьеи (1:3:1)

Вещество (доза, мкг/кг)	Число мышей	Зродолжительность жизни, минуты
Изотонический раствор натрия хлорида (контроль)	12	25,9+0,6
Фармацевтическая композиция (100)	12	27,6+1,0
Фармацевтическая композиция (300)	12	33,4+2,0
Фармацевтическая композиция (600)	12	34,2+2,3

- 4 023025

Таблица 1с

Влияние фармацевтической композиции согласно изобретению и мелатонина на продолжительность жизни мышей в термокамере (М±т) А§р-С1и-С1у, Ьу8-А8р-С1и, А1а-А8р-С1и-Ьеи (0,1:10:1)

Вещество (доза, мкг/кг)	Число мышей	Продолжительность жизни, минуты
Изотонический раствор натрия хлорида (контроль)	14	25,9+0,6
Фармацевтическая композиция (100)	14	23,7+2,0
Фармацевтическая композиция согласно изобретению (300)	14	26,8+1,5
Фармацевтическая композиция согласно изобретению (600)	14	29,2+0,8

Таким образом, фармацевтическая композиция согласно изобретению обладает противогипоксическими свойствами на модели острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией (в термокамере).

Пример 2. Нейропротекторное действие.

Нейропротекторное действие композиции согласно изобретению оценивали на животных с экспериментальной ишемией головного мозга - модель ишемического инсульта. Ишемию головного мозга у белых беспородных крыс-самцов массой 200-240 г воспроизводили путем одномоментной перевязки (под общей анестезией эфиром) обеих общих сонных артерий. У ложнооперированных животных (контрольная группа № 1) операция была ограничена доступом к общим сонным артериям без их перевязки. В контрольной группе № 2 крысы получали только изотонический раствор натрия хлорида (ЯаС1). В подопытных группах животным вводили внутрибрюшинно (в/б) композицию в разных дозах 1 раз в сутки в течение 7 дней; в первые сутки - через 1 и 3 ч после операции. Животных после операции наблюдали в течение 2 недель с учетом выживаемости крыс. Неврологический дефицит у животных определяли слепым методом по шкале МсСгате в баллах каждый час в течение 24 ч, а затем 1 раз в сутки. Тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов.

Результаты исследования нейропротекторного действия фармацевтической композиции согласно изобретению и мелатонина представлены в табл. 2а, б, с. Из представленных данных видно, что у крыс контрольной группы № 2 неврологический дефицит был наиболее выражен (8,9±0,1 балла) через 2-ые сутки после двусторонней перевязки общих сонных артерий; при этом в контроле погибло 32% (14 крыс из 44) животных.

Таблица 2а

Изменение неврологического дефицита (в баллах, М±т) у крыс после двусторонней перевязки общих сонных артерий (модель ишемического инсульта) под влиянием фармацевтической композиции

А8р-С1и-С1у:Ьу8-А8р-С1и:А1а-А8р-С1и-Ьеи (1:1:1)

Вещество (доза, мкг/ кг/сут)	Срок после операции (часы /ч/, сутки /сут/)
12ч	24 ч	2 сут	3 сут	5 сут	7 сут	10 сут	14 сут
Изотонический раст вор натрия хлорида (контроль) погибло 14 из 44	8,5+0,1	8,7+0,1	8,9+0,1	8,8+0,1	8,7+0,1	8,6+0,1	8,6+0,1	8,6+0,1
Фармацевтическая композиция согласно изобретению (300) /погибло 4 из 44/	5,3+0,1	5,6+0,1	6,0+0,1	5,9+0,1	5,8+0,1	5,7+0,1	5,6+0,1	5,5+0,1
Фарм ацевти ч еская композиция согласно изобретению (600) /погибло 2 из 44/	5,1+0,1	5,4+0,1	5,7+0,1	5,6+0,1	5,5+0,1	5,5+0,1	5,4+0,1	5,2+0,1

- 5 023025

Таблица 2б

Изменение неврологического дефицита (в баллах, М±т) у крыс после двусторонней перевязки общих сонных артерий (модель ишемического инсульта) под влиянием фармацевтической композиции согласно изобретению А8р-С1и-С1у:Ьу8-А8р-С1и:А1а-А8р-С1и-Ьеи (1:3:1)

Вещество (доза, мкг/ кг/сут)	Срок после операции (часы /ч/, сутки /сут/)
12ч	24 ч	2 сут	3 сут	5 сут	7 сут	10 сут	14 сут
Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) /погибло 14 из 44/	8,5±0,1	8,7+0,1	8,9+0,1	8,8+0,1	8,7+0,1	8,6+0,1	8,6+0,1	8,6+0,1
Фармацевтичес кая композиция согласно изобретению (300) /погибло 6 из 44/	5,6±0,1	5,7+0,1	6,3+0,1	6,6+0,1	6,6+0,1	6,2+0,1	5,9+0,1	5,7+0,1

Фармацевтическая композиция согласно изобретению (600) /погибло 3 из 44/

5,8+0,1

6,1+0,1

6,4+0,1

6,3+0.1

6,2+0,1

5,9+0,1

5,7+0,1

Таблица 2с

Изменение неврологического дефицита (в баллах, М±т) у крыс после двусторонней перевязки общих сонных артерий (модель ишемического инсульта) под влиянием фармацевтической композиции Л8р-С1иО1у:Ту8-А8р-О1и:А1а-А8р-О1и-Ьеи (0,1:10:1) и мелатонина

тальность крыс с 32% (контроль) до около 8 и 5% соответственно (р<0,01).

Кроме того, достоверно под влиянием фармацевтической композиции в обеих дозах уменьшался неврологический дефицит. Так, фармацевтическая композиция в дозах 300 и 600 мкг/кг/сут. значимо (р<0,05) уменьшала неврологический дефицит в разные сроки наблюдения в 1,5-1,6 раза и 1,6-1,7 раза соответственно.

Таким образом, на модели ишемического инсульта фармацевтическая композиция согласно изобретению оказывает отчетливое нейропротекторное действие.

- 6 023025

Пример 3. Антиамнестическое действие.

Антиамнестическое действие композиции согласно изобретению на различных моделях амнезии исследовали на белых нелинейных мышах-самцах (массой 200-240 г), используя условную реакцию (рефлекс) пассивного избегания (УРПИ) электрокожного раздражения (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон П.Д. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения: пер. с англ. под. ред. Батуева А.С. М., Высш. шк., 1991, стр. 399; Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М.: Изд. Института биомедицинской химии РАМН, 1995, стр. 272). В настоящее время тест УРПИ является базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения (амнезия), а также наиболее информативным из применяемых сегодня методов оценки эффективности веществ с ноотропной активностью (Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под редакцией Р.У. Хабриева, М., 2005, стр. 308-320). Выработку УРПИ у мышей производили на основе электрокожного подкрепления по методу Ситт е! а1. (ЕГГсс! оГ 1йе поус1 сотроииб аийгасеГат ироп ипрагеб 1еагтид аиб тетогу ίη гобспК Ркусйорйагтасок 1982, ν. 78, рр. 104-111) с учетом рекомендаций Моибабоп е! а1. (1п\'окетеп1 оГ а к1его1ба1 сотроиеи! ίη 1йе тесйаи18т оГ асбои оГ рбасе1ат-Пке иооборкк. Вгат Ке8. 1990, ν. 506, рр. 101-108). Установка для мышей представляет собой экспериментальную камеру черного цвета размером 30x40x30 см с электродным полом и белой пластиковой платформой 7,5х7,5х0,5 см, которую располагали на полу в центре камеры. Мышей поодиночке помещали на пластиковую платформу.

Обычно животные спускаются или спрыгивают с платформы на электродный пол, где они получают наказание - удар электрическим током (в это время на пол камеры подавали постоянный электрический ток силой 0,5 мА). Электрический ток включали только тогда, когда мышь касалась пола всеми четырьмя конечностями. Обычной реакцией животных бывает возвращение на безопасную платформу. После 5 мин обучения у мышей вырабатывается УРПИ - они остаются на платформе. Тестирование на сохранность УРПИ проводили через 24 ч после амнезирующего воздействия. При этом, если животное покидало платформу в течение 1 мин, у него отмечали ретроградную амнезию навыка пассивного избегания.

В качестве амнезирующего воздействия использовали электросудорожный шок (ЭСШ; параметры электрического тока: 50 Гц, 50 мА, 0,3 с), который наносили мышам с помощью электродов в виде клипс, фиксируемых на ушных раковинах (транспиннеально), сразу после обучения УРПИ (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под редакцией Р.У. Хабриева. М., 2005, стр. 277-294; Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под редакцией Р.У. Хабриева, М., 2005, стр. 308-320). У животных контрольной группы вызывали псевдоЭСШ.

Композицию вводили в/б в период генерализованных судорог, вызванных ЭСШ, т.е. непосредственно после ЭСШ. Тестирование мышей на сохранение УРПИ производили через 24 ч после ЭСШ.

Для воспроизведения модели скополаминовой амнезии м-холиноблокатор вводили мышам в/б в дозе 1 мг/кг сразу после обучения УРПИ (Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под редакцией Р.У.Хабриева, М, 2005, стр. 308-320). Животные контрольной группы получали в том же объеме 0,9% раствор №С1 (в/б). Композицию согласно изобретению вводили в/б за 30 мин до обучения мышей. Проверку сохранения УРПИ производили через 24 ч после в/б инъекции.

Моделирование амнезии, вызванной у мышей острой нормобарической гипоксией с гиперкапнией (в термокамере) подробно описано выше.

При использовании электросудорожного шока в качестве амнезирующего воздействия было обнаружено, что через 24 ч после воздействия ЭСШ у большинства (83%; р<0,001) мышей наблюдалась ретроградная амнезия УРПИ (табл. 3). Фармацевтическая композиция согласно изобретению в дозах 100 и 300 мкг/кг уменьшала выраженность амнезии в 1,9-2,4 раза (р<0,01).

- 7 023025

Таблица 3

Влияние фармацевтической композиции Л8р-С1и-С1у:Ьу8-Л8р-С1и:Л1а-Л8р-С1и-Ьеи (1:2:1) согласно изобретению на амнезию у мышей, вызванную электросудорожным шоком (ЭСШ)

Условия опытов и вещество (доза, мкг/кг)	Общее число мышей	Число мышей, обучившихся УРПИ (%)	Число мышей с амнезией УРПИ через 24 ч после ЭСШ (%)
0,9% раствор ИаС1 + псевдо ЭСШ (контроль 1)	25	90	15
0,9% раствор ЧаС1 + ЭСШ (контроль 2)	25	91	83
Фармацевтическая композиция (100) +ЭСШ	25	92	35
Фармацевтическая композиция (300) + ЭСШ	25	90	44

Было обнаружено, что через 24 ч после введения скополамина у большинства (72%; р<0,001) мышей наблюдалась ретроградная амнезия УРПИ (табл. 4).

Фармацевтическая композиция в дозах 100 и 300 мкг/кг уменьшала выраженность амнезии в 1,8-2,5 раза (р<0,01).

Таблица 4

Влияние фармацевтической композиции Л8р-С1и-С1у:Ьу8-Л8р-С1и:Л1а-Л8р-С1и-Ьеи (1:3:1) на амнезию у мышей, вызванную скополамином

Условия опытов и вещество (доза, мкг/кг)	Общее Число мышей	Число мышей, обучившихся УРПИ (%)	Число мышей с амнезией УРПИ через 24 ч после введения скополамина (%)
0,9% раствор ГчаС1 + 0,9% раствор №С1 (контроль 1)	30	90	15
0,9% раствор ИаС1 + скополамин (контроль 2)	30	90	72
Фарм ацевтическая композиция (100) + скополамин	30	93	29
Фармацевтическая композиция (300) + скополамин	25	92	39

Было обнаружено, что через 24 ч после 16-18-минутного пребывания мышей в термокамере у большей части из них наблюдалась ретроградная амнезия: у 64% животных (р<0,001) (табл. 5). Фармацевтическая композиция в дозах 100 и 300 мкг/кг уменьшала выраженность амнезии в 2,2-2,6 раза (р<0,01).

- 8 023025

Таблица 5

Влияние фармацевтической композиции Л5р-С1и-С1у:Ьу5-Л5р-С1и:Л1а-Л5р-С1и-Ьеи (1:1:1) на амнезию у мышей, вызванную острой нормобарической гипоксией с гиперкапнией

Условия опытов и вещество (доза, мг/кг)	Общее Число мышей	Число мышей, обучившихся УРПИ (%)	Число мышей с амнезией УРПИ через 24 ч после амнезиругощего воздействия (%)
0,9% раствор №С1 + ложная гипоксия(контроль 1)	30	92	18
0,9% раствор Х'аС! + гипоксия (контроль 2)	30	91	64
Фармацевтическая композиция (100) + гипоксия	30	90	25
Фармацевтическая композиция (300) + гипоксия	30	93	29

Таким образом, фармацевтическая композиция согласно изобретению оказывает отчетливое антиамнестическое действие на различных моделях амнезии у мышей (вызванной электросудорожным шоком, скополамином и острой нормобарической гипоксией с гиперкапнией).

Пример 4. Повышение жизнеспособности.

Композиция согласно изобретению приводит к значительному повышению жизнеспособности. Все исследования проводились на нелинейных крысах-самцах, возраст 24 месяца (группы 1 и 2).

группа (возраст 24 месяца) включала 14 животных, получавших композицию согласно изобретению Л5р-С1и-С1у:Ьу5-Л5р-С1и:Л1а-Л5р-С1и-Ьеи (1:1:1) подкожно 1 раз в сутки в течение 6 месяцев, после двухмесячного перерыва введение препарата возобновилось и осуществлялось в течение месяца перед тестированием.

группа (возраст 24 месяца) состояла из 14 животных, получавших физ. раствор подкожно 1 раз в сутки в течение 6 месяцев, после двухмесячного перерыва введение физраствора возобновилось и осуществлялось в течение месяца перед тестированием.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что композиция согласно изобретению оказывает значительное действие на состояние шерсти: у всех 14 животных группы 1 пролысины исчезли, шерсть стала гладкой и приобрела специфический естественный блеск и перламутровость. Внешний вид животных в возрасте 24 месяцев стал соответствовать внешнему виду животных в возрасте 3 месяцев.

Результаты исследований также продемонстрировали благоприятное действие композиции на состояние когтей и зубов. Так, у 12 животных (85,7%) в группе № 1 когти утратили чешуйчатость и ломкость, кровоток в когте стал виден невооруженным глазом. Состояние когтей и зубов у животных в возрасте 24 месяцев стало соответствовать состоянию когтей и зубов животных в возрасте 3 месяцев.

С целью исследования влияния композиции на репродуктивную функцию поочередно в клетку с самцом каждой группы животных подсаживали самку с эструс. Реакция животных-самцов после введения композиции Л5р-С1и-С1у:Ьу5-Л5р-С1и:Л1а-Л5р-С1и-Ьеи (1:1:1) представлена в табл. 6.

Таблица 6

Общее число крыс	Число крыс, проявивших активный интерес	Число крыс с отсутствием интереса
Группа №1 (п=14)	12	2
Группа №2 (п= 14)	6	8

Результаты исследований, представленные в табл. 6, свидетельствуют, что поведение возрастных животных в результате действия композиции стало соответствовать более молодому возрасту.

Композиция согласно изобретению оказывает действие на реакцию возрастных животных относительно обонятельного (пищевого) раздражителя.

Реакция на обонятельный (пищевой) раздражитель у животных каждой группы оценивалась по 5бальной шкале:

баллов - активное животное с точным движением к раздражителю;

балла - активное животное с неточным (до 2-х ошибок) движением к раздражителю;

балла - животное с неточным (до 5-ти ошибок) движением к раздражителю;

- 9 023025 балла - ослабленная реакция, животное без движения, с поворотом головы к раздражителю;

балл - отсутствие реакции.

В качестве пищевого раздражителя использовали сыр.

Результаты исследования реакции животных после введения композиции согласно изобретению (группа № 1) на обонятельный (пищевой) раздражитель представлены в табл. 7.

Таблица 7

Общее число крыс	Число крыс с реакцией 5 баллов	Число крыс с реакцией 4 балла	Число крыс с реакцией 3 балла	Число крыс с реакцией 2 балла	Число крыс с реакцией 1 балл
Г руппа № 1 (п=14)	9	4	1	0	0
Г руппа №2 (п=14)	4	3	2	3	2

Данные, представленные в табл. 7, демонстрируют, что реакция возрастных животных на пищевой раздражитель в результате действия композиции стала соответствовать реакции животных более молодого возраста.

Композиция согласно изобретению также нормализует содержание глюкозы в крови у первой группы крыс-самцов в возрасте 24 мес. Данные исследований влияния композиции на содержание глюкозы в крови после введения композиции представлены в табл. 8.

Таблица 8

Общее число животных	Число животных с содержанием люкозы 4,0-6,5 ммоль/л	Число животных с содержанием глюкозы 6,6-9,0 ммоль/л	Число животных с содержанием глюкозы свыше 9,0 ммоль/л
Группа №1 (п=14)	10	4	0
Группа N»2 (п-14)	5	6	3

В результате действия композиции содержание глюкозы в крови у возрастных животных стало соответствовать норме, наблюдаемой у молодых животных (4,0-9,0 ммоль/л).

Влияние композиции на рефлекс переворачивания изучалось путём помещения животных на плоскую поверхность спиной вниз, нормальная реакция характеризовалась быстрым переворачиванием (крыса становилась на четыре лапы). Реакция животных после введения композиции согласно изобретению (группа № 1) оценивалась по 4-бальной шкале:

балла - рефлекс переворачивания сохранен;

балла - рефлекс переворачивания замедлен;

балла - животное производит попытки, но не переворачивается;

балл - отсутствие рефлекса переворачивания.

Результаты исследования влияния композиции на рефлекс переворачивания представлены в табл. 9.

Таблица 9

Общее число крыс	Число крыс с реакцией 4 балла	Число крыс с реакцией 3 балла	Число крыс с реакцией 2 балла	Число крыс с реакцией 1 балл
Группа №1 (п=14)	10	2	2	0
Группа №2 (п=14)	3	3	2	4

Данные, представленные в табл. 9, свидетельствуют, что под действием композиции согласно изобретению рефлекс переворачивания у возрастных крыс восстанавливается от заторможенного состояния до состояния, свойственного молодым животным.

Влияние композиции на продолжительность жизни была исследована на группе из 14 животных (1 группа), получавших композицию, начиная с 12 мес., подкожно в дозе 150мкг/кг массы тела крысы 1 раз в сутки курсами по 5 раз в неделю до естественной смерти. Контрольные животные (2-я группа) получали по такой же схеме физ.раствор. Максимальная продолжительность жизни животных увеличилась почти на 6 месяцев. Данные о продолжительности жизни животных представлены в табл. 10.

- 10 023025

Таблица 10

Продолжительность жизни	12 мес.	18 мес.	24 мес.	54 мес.	72 мес.	80 мес.
Группа №1 (п=14)	14	13	13	11	8	7
Группа №2 (п=14)	14	12	10	5	1	-

Таким образом, эффективное действие композиции согласно изобретению на жизнеспособность животных подтверждается исследованиями состояния шерстного покрова, когтей и зубов, содержания глюкозы в крови, репродуктивного поведения, обонятельной реакции на пищевой раздражитель, восстановлением рефлекса переворачивания и увеличением продолжительности жизни. По совокупности исследованных показателей под влиянием композиции происходит восстановление функций организма у возрастных животных до уровня, соответствующего молодому возрасту.

Пример 5. Влияние композиции согласно изобретению на нарушенную экпериментальной болезнью Альцгеймера (ЭБА) память у крыс.

Способность композиции согласно изобретению улучшать нарушенную экпериментальной болезнью Альцгеймера память исследовали на белых нелинейных мышах-самцах (массой 200-240 г), используя условную реакцию (рефлекс) пассивного избегания (УРПИ) электрокожного раздражения (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон П.Д. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения; пер. с англ. под. ред. Батуева А.С. М., Высш. шк., 1991, стр. 399; Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М.: Изд. Института биомедицинской химии РАМН, 1995, стр. 272), как описано в примере 3.

Экспериментальную болезнь Альцгеймера индуцировали путём билатерального введения в базальные гигантоклеточные ядра Мейнерта крыс 0,4 нмоль пептидного препарата, представляющего нейротоксичный ундекапептид β-амилоида (25-35) в 2 мкл водного раствора.

Таблица 11

Влияние фармацевтической композиции А8р-С1и-С1у:Ьу8-А8р-С1и:А1а-А8р-С1и-Ьеи на нарушения памяти у крыс, вызванные экпериментальной болезнью Альцгеймера

Г руппа животных	Количество крыс, помнящих обучение и не заходящих в опасную темную камеру (%)
1 сут	3 сут	7 сут	14 сут
ЭБА + изотонический раствор натрия хлорида в/м (контроль)	6,67	3,33	3,33
ЭБА+ смесь пептидов при соотношении (1:1:1) 50 мкг/кг/сутки, в/м	20,00	30,00	35,00	40,00
ЭБА+ смесь пептидов при соотношении (1:1:1) 150 мкг/кг/сутки, в/м	30,00	70,00	75,00	85,00
ЭБА + смесь пептидов при соотношении (1:1:1), 600 мкг/кг/сугки, в/м	35,00	55,00	65,00	70,00
ЭБА+ смесь пептидов при соотношении (1:2:1) 50 мкг/кг/сутки, в/м	26,67	40,00	46,67	53,34

- 11 023025

ЭБА+ смесь пептидов при соотношении (1:2:1) 150 мкг/кг/сутки, в/м	40,00	73,33	80,00	86,67
ЭБА + смесь пептидов при соотношении (1:2:1) 600 мкг/кг/сутки, в/м	33,34	46,67	66,67	80,00
ЭБА+ смесь пептидов при соотношении (1:3:1) 50 мкг/кг/сутки, в/м	23,53	35,30	47,05	52,94
ЭБА+ смесь пептидов при соотношении (1:3:1) 150 мкг/кг/сутки, в/м	35,30	52,94	70,59	76,47
ЭБА + смесь пептидов при соотношении (1:3:1) 600 мкг/кг/сутки, в/м	35,30	58,82	64,70	70,58

Данные, представленные в табл. 11, свидетельствуют, что введение композиции согласно изобретению приводит к восстановлению пространственной памяти и способности к обучению - востанавливается степень запоминания при выполнении условного рефлекса пассивного избегания.

Таким образом, результаты исследований продемонстрировали способность композиции согласно изобретению улучшать нарушенную экпериментальной болезнью Альцгеймера память у крыс, что позволяет использовать заявленную композицию для профилактики или лечения нейродегенеративных заболеваний.

Пример 6. Получение лекарственной формы.

Пептиды А8р-С1и-С1у:Ьу8-А8р-С1и:А1а-А8р-С1и-Ьеи, взятые в весовом отношении 1:1:1 по 5 г каждого, растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Проверяют рН раствора и при необходимости доводят до 6. Раствор перемешивают 20 мин при 20-22°С и подвергают стерильной фильтрации последовательно через мембраны 0,45 и 0,22 мкм. Замораживают и лиофилизируют. Полученную субстанцию далее используют для приготовления лекарственных форм.

Для этого 2 г субстанции растворяют при перемешивании и барботаже азотом в 0,8 л воды для инъекций, добавляют воду для инъекций до общего объема 1,0 л. Проводят стерилизующую фильтрацию полученного раствора и в асептических условиях осуществляют его розлив в ампулы емкостью 2 мл по 1 мл в ампулу. Заполненные ампулы запаивают под азотом.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция, обладающая нейропротекторным действием, содержащая пептиды А8р-О1и-О1у:Еу8-А8р-О1и:А1а-А8р-О1и-Ееи в массовом отношении (0,1-10):(0,1-10):(0,1-10).
2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что предпочтительно содержит пептиды А8р-О1и-О1у, Ьук-Акр-ОЬ, А1а-А5р-С1и-йеи в соотношении от 1:1:1 до 1:3:1.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что выполнена в виде таблеток, капсул, спрея назального или капель назальных, аэрозоля подъязычного или орального, капель для приема внутрь, порошка, или в виде раствора для инъекций, или в виде лиофилизата для приготовления раствора.
4. Способ профилактики и/или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний, отличающийся тем, что пациенту вводят фармацевтическую композицию по п.1 в терапевтически эффективном количестве.
5. Способ повышения жизнеспособности, отличающийся тем, что пациенту вводят фармацевтическую композицию по п.1 в терапевтически эффективном количестве.
6. Применение фармацевтической композиции по п.1 для повышения жизнеспособности и профилактики и/или лечения цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний.