CN113573723A - 合成的神经调节肽 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了包含合成神经调节肽的药物组合物。本发明公开了权利要求中所定义的神经调节肽，以及使用此类分子用于治疗应用的方法。发现了组合物中包含的神经调节肽可有效治疗抑郁症和其他情绪疾病，包括焦虑症。

Description

合成的神经调节肽
优先权
本申请要求2019年3月14日提交的美国临时专利申请号62/818,458的优先权，其内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本公开涉及包含蛋白，例如肽治疗剂的组合物，以治疗抑郁症和其他精神疾病(psychiatric disorder)。
电子提交的文本文件的描述
电子提交的文本文件的内容通过引用以其全文并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：LACT-001PC_ST25.txt；记录日期：2020年3月 13日；文件大小：5,862字节)。
背景技术
抑郁症，在多种影响受试者情绪的病况中出现，影响全世界数百万人并且其治疗仍整体不足。尽管已经开发出多种治疗抑郁症和相关病况的药物，但这些药物通常不够特异，并且对约40％的患者无效。同时，通常需要数周时间才能使患者受益于药物的治疗作用。此外，许多已知药物都具有多种副作用。焦虑症虽然不同于抑郁症，但常常伴随着抑郁症。许多抗焦虑药具有与抗抑郁药相似的问题。抑郁症和焦虑症的有效治疗的发现中的一个挑战是鉴定出合适的用以上调或下调的靶标。另一个挑战是，设计出对这些靶标特异且能够在相对短的时间段内缓解抑郁和焦虑症状的安全、低成本的疗法。
因此，仍然需要开发用于治疗抑郁症和相关病症的有效且安全的疗法。
发明内容
在多个方面，本发明提供了可用于治疗多种精神性、行为性、情感性、神经性和情绪性疾病，包括抑郁症、焦虑和应激相关疾病的组合物和方法。在一些方面，药物组合物形式的合成神经调节肽，例如四肽(tetrapeptide)，可用于治疗抑郁症和其他情绪疾病。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含由通式I定义的合成神经调节肽：R1R2R3R4(I)，其中R1选自氨基酸 W、F和D，R2是亲水性氨基酸，R3是亲水性氨基酸，R4选自氨基酸V和E。在一些实施方案中，合成神经调节肽由氨基酸F、Q、S和E组成。在一些实施方案中，合成神经调节肽由氨基酸D、K、T和E组成。在一些实施方案中，合成神经调节肽由氨基酸W、D、Q和V组成。根据所述实施方案，合成神经调节肽或其类似物不包含脯氨酸。在一些实施方案中，R1不同于Y并且R2不同于L。
开发本文所述的神经调节肽及其类似物以调节GABA-A受体。此外，在一些实施方案中，本文所述的神经调节肽及其类似物能调节电压门控钙通道 (voltage-gatedcalcium channel，VGCC)。鉴于GABA-A受体与精神疾病(包括焦虑和抑郁)之间的已知联系，本公开的神经调节肽可有效预防或治疗多种抑郁-焦虑谱系疾病以及神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病和帕金森病。可使用所述神经调节肽治疗的病况的非限制性示例包括焦虑症，例如分离焦虑症(separation anxiety disorder)、选择性缄默症(selectivemutism)、特定恐惧症(specific phobia，SP)、社交焦虑症(social anxiety disorder，SAD)、恐慌症(panic disorder)、广场恐惧症(agoraphobia)、物质/药物诱发的焦虑症和归因于另一种药物情况的焦虑症、广泛性焦虑症(generalized anxiety disorder，GAD)、创伤后应激疾病(post-traumatic stress disorder，PTSD)、重度抑郁症(major depressivedisorder，MDD)、难治性抑郁症 (treatment-resistant depression，TRD)、产后抑郁症(postpartum depression， PPD)、双相障碍(bipolar disorder)或双相抑郁症(bipolardepression)、强迫症(obsessive-compulsive disorder，OCD)、注意力缺陷多动症(attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)、社交恐惧症(socialphobia)、阿尔茨海默病中的躁动(agitation)、阿尔茨海默病中的攻击性和强迫症。
在一些方面，四肽可以任选地经过化学修饰。化学修饰可以选自一个或多个氨基酸的酰胺化、甲基化和乙酰化。其他化学修饰可包括添加甲酰基、焦谷氨酰基(pGlu)、一个或多个脂肪酸、尿素、氨基甲酸酯、磺胺、烷基胺或其任意组合。组合物可以包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物可进一步包含递送载体，其可以是例如脂质体、纳米颗粒或多糖。组合物可以通过各种途径施用给确定需要治疗的受试者，并且在一些方面，组合物配制为鼻内施用。
附图简要说明
图1A、1B和1C示出了1.25mg/kg(图1A)和5mg/kg(图1B和图 1C)剂量的地西泮(diazepam)对斑马鱼(Daniorerio)行为参数的影响。图1A：在和不在社交或“鱼群(shoal)”区度过的时间。图1B：在和不在社交或“鱼群(shoal)”区度过的时间。图1C：在光室(lightchamber) 中度过的时间。纵坐标代表以秒表示的时间(图1A和1B)或对照组的百分比(图1C)。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，根据 Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，且“****”表示p<0.0001。
图2是旷场试验(Open FieldTest)中采用的鱼行为试验用系统的透视图。
图3是明暗偏好试验(Light/Dark preference test)中采用的鱼行为试验用系统的透视图。
图4是群聚行为试验(shoaling behavior test)中采用的鱼行为试验用系统的透视图。
图5A、5B和5C示出了10mg/kg剂量的地西泮对斑马鱼行为参数的影响。图5A：实验明暗箱的明和暗区室之间的转换次数。纵坐标表示转换次数。图5B：从暗区室(darkcompartment)退回明区室(light compartment) 的潜伏期。纵坐标表示以秒表示的时间。图5C：旷场试验中覆盖的平均距离。纵坐标表示以厘米表示的长度。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05，“**”表示 p<0.01。
图6A和6B示出了5mg/kg(图6A)和10mg/kg(图6B)剂量的氟伏沙明(fluvoxamine)对旷场试验中受试动物在水族箱表面度过的时间的影响。纵坐标表示以秒表示的时间。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U-检验，“**”表示p<0.01。
图7A和7B示出了0.6mg/kg剂量的α-Casozepine-10(ACZ-10)对斑马鱼的行为参数的影响。图7A：在社交区附近度过的时间。图7B：在旷场试验中在表面度过的时间。纵坐标表示以秒表示的时间。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，根据Mann-WhitneyU-检验，“*”表示p <0.05，且“**”表示p<0.01。
图8A和8B示出了5mg/kg剂量的β-酪啡肽-7(Beta-Casomorphin-7， BCM-7)对斑马鱼行为参数的影响。图8A：在“社交区”中度过的时间。纵坐标表示以秒表示的时间。图8B：旷场试验中覆盖的平均长度。纵坐标表示以厘米表示的长度。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差；且根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05。
图9示出了暴露于1.25mg/kg(“Diaz 1.25”)、5mg/kg(“Diaz 5”) 和10mg/kg(“Diaz 10”)剂量的地西泮的鱼组和相应对照组(“对照-diaz 1.25”、“对照-diaz 5”和“对照-diaz 10”)，以及暴露于5mg/kg(“Fluv 5”)和10mg/kg(“Fluv 10”)剂量的氟伏沙明的鱼组和相应对照组(“对照-fluv5”)和(“对照-fluv 10”)在旷场试验中覆盖的平均长度。在施用了ACZ-10(0.6mg/kg)和BCM-7(5mg/kg)的鱼中，相应对照分别是对照-ACZ10和对照-BCM-7。纵坐标表示以厘米表示的长度。数据显示为平均值，且误差条表示平均值的标准误差。根据Mann-Whitney U-检验，p＝0,1 和p＝0,07——归为具有统计学显著性。
图10A和10B示出了神经调节肽FQSE(SEQ ID NO：10)在旷场试验中对斑马鱼行为的影响。图10A：在水族箱上部度过的时间。图10B：离开底部的潜伏期。纵坐标表示以秒表示的时间。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05。
图11A和11B示出了ACZ10、FQSE(SEQ ID NO：10)和氟伏沙明在旷场试验中对斑马鱼行为的影响的比较。图11A：在水族箱上部度过的时间，以相对于对照组的％表示。图11B：离开底部的潜伏期，以相对于对照组的％表示。纵坐标表示相对于对照组的％值。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05。
图12A和12B示出了FQSE(SEQ ID NO：10)在明/暗箱(light/dark box，LDB)试验中对斑马鱼行为的影响。图12A：在LDB的明区室中度过的时间。图12B：在LDB的暗区室中度过的时间。纵坐标表示以秒表示的时间。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U- 检验，“*”表示p<0.05。
图13A和13B示出了测试物质在明/暗箱试验中对斑马鱼行为的影响的比较。图13A：在LDB的明区室中度过的时间，以相对于对照组的％表示。图13B：在LDB的暗区室中度过的时间，以相对于对照组的％表示。纵坐标表示相对于对照组的％值。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05，且“**”表示p<0.01。
图14A和14B示出了FQSE(SEQ ID NO：10)在群聚试验(shoaling test) 中对斑马鱼行为的影响。图14A：在群聚区室(shoaling compartment)外度过的时间。图14B：离开群聚区室的潜伏期。纵坐标表示以秒表示的时间。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据 Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05。
图15A和15B示出了测试物质在群聚试验中对斑马鱼行为的影响的比较。图15A：在群聚区室外度过的时间，以相对于对照组的％表示。图15B：离开群聚区室的延迟期，以相对于对照组的％表示。纵坐标表示相对于对照组的％值。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据 Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05，且“**”表示p<0.01。
图16A和16B示出了测试物质在旷场试验中对斑马鱼行为的影响的比较。图16A：在水表面附近度过的时间。图16B：FQSE(SEQ ID NO：10) (1mg/kg)和氟伏沙明(10mg/kg)的影响的比较，在水表面附近度过的时间，以相对于对照组的％表示。纵坐标表示相对于对照组的％值。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05。
图17A和17B示出了测试物质在旷场试验中对斑马鱼行为的影响的比较。图。17A：来到水表面的潜伏期。图17B：FQSE(SEQ ID NO：10)(1 mg/kg)和氟伏沙明(10mg/kg)的影响的比较，来到水表面的潜伏期，以相对于对照组的％表示。纵坐标表示相对于对照组的％值。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05，且“**”表示p<0.01。
图18示出了施用1.25mg/kg(“地西泮1,25”)、5mg/kg(“地西泮 5”)和10mg/kg(“地西泮10”)剂量的地西泮的鱼组以及相应对照组 (“Contr-diaz1 ,25”、“Contr-diaz 5”和“Contr-diaz 10”)，以及用5mg/kg (“氟伏沙明5”)和10mg/kg(“氟伏沙明10”)处理的鱼组以及相应对照组(“对照-fluv 5”和“对照-fluv 10”)在旷场试验中的平均轨迹长度(track length)。对于施用了0.6mg/kg的ACZ-10(“ACZ-10 0,6”)的鱼组，对照组相应地命名为“对照-ACZ,-10 0,6”；BCM-7 5mg/kg相应地为“BCM-7 5”和“对照-BCM-7 5”；四肽FQSE(SEQ ID NO：10)剂量1mg/kg 和10mg/kg(“FQSE 1”和“FQSE 10”)-“对照-FQSE 1”和“对照-FQSE 10”。纵坐标表示以厘米表示的长度。数据显示为平均值，且误差条表示平均值的标准误差。
图19A、19B和19C示出了注射了1mg/kg剂量的FLPY(SEQ ID NO： 36)后的斑马鱼的行为参数。图19A：在表面附近度过的时间(旷场)。图 19B：在LDB的明区室中度过的时间。图19C：在群聚区室外度过的时间。纵坐标表示以秒表示的时间。数据显示为平均值，且误差条表示平均值的标准误差。
图20A、20B和20C示出了注射了10mg/kg剂量的FLPY(SEQ ID NO： 36)后的斑马鱼的行为参数。图20A：在表面附近度过的时间(旷场)。图 20B：在LDB的明区室中度过的时间。图20C：在群聚区室外度过的时间。纵坐标表示以秒表示的时间。数据显示为平均值，且误差条表示平均值的标准误差。
图21A、21B和21C示出了注射了1mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO： 26)后的斑马鱼在群聚试验中的行为参数。图21A：在群聚区室外度过的时间。图21B：探访群聚区室的潜伏期。图21C：在群聚区室附近度过的时间。纵坐标表示以秒表示的时间。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05，且“**”表示p<0.01。
图22示出了对对照组(“对照”)和施用了1mg/kg DKTE(SEQ ID NO： 26)(“DKTE1”)的组，在旷场试验中探访底部的潜伏期的测量值。纵坐标表示以秒表示的时间。
图23示出了测试物质在群聚试验中对斑马鱼行为的影响的比较。在群聚区室外度过的时间显示为相对于对照组的％。示出了以下组：1.25mg/kg 地西泮(“地西泮1,25”)、1.25mg/kg对照地西泮(“对照-diaz 1,25”)、 10mg/kg FQSE(SEQ ID NO：10)(“FQSE 10”)、10mg/kg对照FQSE (SEQ ID NO：10)(“对照-FQSE”)、1mg/kg DKTE(SEQ ID NO：26)(“DKTE1”)和1mg/kg对照DKTE(SEQ ID NO：26)(“对照-DKTE 1”)。纵坐标表示时间变化，以相对于对照组的％表示。数据显示为平均值，误差条表示平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01。
图24A和24B示出了1mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO：26)在旷场试验中的自主活动(locomotor activity)参数。图24A：沿纵坐标轴的轨迹长度，单位为cm。图24B：平均速度，纵轴显示以cm/sec表示的速度。数据显示为平均值，且误差条表示平均值的标准误差。
图25A、25B和25C示出了注射了10mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO： 26)后的斑马鱼的行为参数。图25A：在表面附近度过的时间(旷场)。图 25B：在LDB的明区室中度过的时间。图25C：在群聚区室外度过的时间。纵坐标表示以秒表示的时间。
图26A、26B和26C示出了注射了1mg/kg剂量的WDQV(SEQ ID NO： 14)后的斑马鱼的行为参数。图26A：在表面附近度过的时间(旷场)。图 26B：在LDB的明区室中度过的时间。图26C：在群聚区室外度过的时间。纵坐标表示以秒表示的时间。数据表示为平均值，且误差条表示平均值的标准误差。
图27A、27B、27C和27D示出了注射了10mg/kg剂量的WDQV(SEQ ID NO：14)后的斑马鱼在明/暗箱试验中的行为参数。图27A：在LDB的明区室中度过的时间(总计)，以秒表示。图27B：在LDB的明区室中度过的时间(在试验数分钟之内处于动态)，以秒表示。图27C：在LDB的暗区室中度过的时间(总计)，以秒表示。图27D：在LDB的暗区室中度过的时间(在试验数分钟之内处于动态)，以秒表示。轴坐标表示以秒表示的时间。数据表示为平均值，误差条定义平均值的标准误差，且根据 Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05。
图28A和28B示出了10mg/kg剂量的WDQV(SEQ ID NO：14)在明 /暗箱试验中的影响与地西泮(5mg/kg)和FQSE(SEQ ID NO：10)(10mg/kg) 以及相应对照的影响的比较。图28A：在LDB的明区室中度过的时间，以秒表示。图28B：在LDB的暗区室中度过的时间，以秒表示。数据表示为平均值，误差条定义平均值的标准误差，且根据Mann-Whitney U-检验，“*”表示p<0.05。
图29示出了施用了1.25mg/kg(“地西泮1,25”)、5mg/kg(“地西泮5”)和10mg/kg(“地西泮10”)剂量的地西泮的鱼组以及相应对照组(“Contr-diaz 1,25”、“Control-diaz5”和“Control-diaz 10”)，以及施用了5mg/kg(“氟伏沙明5”)和10mg/kg(“氟伏沙明10”)剂量的氟伏沙明的鱼组以及相应对照组(“对照-fluv 5”和“对照-fluv 10”)的在旷场试验中的平均轨迹长度。对于施用了0.6mg/kg ACZ-10的鱼组 (“ACZ-10 0,6”)，相应的对照组为“对照-ACZ-10”；对于施用了5mg/kg BCM-7的鱼组(“BCM-75”)，相应的对照组为“对照-BCM-7”；且对于施用了10mg/kg剂量的四肽WDQV(SEQ ID NO：14)的鱼组(“WDQV 10”)，相应的对照组为“对照-WDQV 10”。
图30示出了在小鼠中进行的旷场试验中，对于1mg/kg、5mg/kg、10 mg/kg、20mg/kg浓度的FQSE(SEQ ID NO：10)肽的总距离，以cm表示。每个柱代表平均总距离±SEM。显著差异由“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图31示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在小鼠中进行的旷场试验中用后肢直立(rearing) 的次数。每个柱代表每组的平均用后肢直立次数±SEM。显著差异由“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图32示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在小鼠中进行的旷场试验中中央进入(center entry) 的次数。每个柱代表每组的平均中央进入次数±SEM。显著差异由“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图33示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在小鼠中进行的高架十字迷宫(Elevated Plus Maze) 试验中的总距离，以cm表示。每个柱代表平均总距离±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示，与地西泮组的显著差异用“#”符号表示(单向 ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图34示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，对于在小鼠中进行的高架十字迷宫试验的不动，以 s表示。每个柱代表每组的平均不动时间±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图35示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在小鼠中进行的高架十字迷宫试验中的开臂时间 (time on open arms)，以s表示。每个柱代表每组的平均开臂时间±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD 检验；p<0.05)。
图36示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在高架十字迷宫试验中的开臂进入次数。每个柱代表每组的平均开臂进入次数±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示 (单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图37示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在高架十字迷宫试验中风险行为的发生次数。每个柱代表每组的平均风险行为次数±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图38示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在高架十字迷宫试验中的焦虑指数。每个柱代表每组的平均焦虑指数±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示(单向 ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图39示出了关于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，埋珠试验(Marble Buryingtest)的结果(埋珠数)。每个柱代表每组的平均埋珠数±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD检验；p<0.05)。
图40示出了关于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在Porsolt游泳试验(两日修正(two-day modification)) 中的不动，以s表示。每个柱代表每组的平均不动总持续时间±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD 检验；p<0.05)。
图41示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在Porsolt游泳试验(两日修正)中的被动游泳持续时间，以s表示。每个柱代表每组的平均被动游泳持续时间±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD 检验；p<0.05)。
图42示出了对于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg浓度的FQSE (SEQ ID NO：10)肽，在Porsolt游泳试验(两日修正)中的主动游泳持续时间，以s表示。每个柱代表每组的平均被动游泳持续时间±SEM。与对照组的显著差异用“*”符号表示(单向ANOVA，其后进行Fisher's LSD 检验；p<0.05)。
图43A、43B和43C示出了大鼠在OF试验中的行为。图43A：不同剂量的FQSE(SEQ IDNO：10)和地西泮(DZ)对中央区时间(以秒表示) 的影响。图43B：不同剂量的FQSE(SEQ IDNO：10)和地西泮(DZ)对中心区进入次数的影响。图43C：不同剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)和地西泮(DZ)对总行进距离(厘米，cm)的影响。每个柱代表平均值±SEM。 *-与媒介物(0)相比的p<0.05，#-与地西泮(DZ)相比的p<0.05。使用单向ANOVA与Fisher最小显著差异(LeastSignificant Difference，LSD) 事后检验。
图44示出了不同剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)和地西泮(DZ)在 EPM中对开臂度过的时间百分比(％)的影响。*-与媒介物(0)相比的 p<0.05。使用单向ANOVA与Fisher最小显著差异(LSD)事后检验。
图45A和45B示出了大鼠在FST中的行为。图45A：不同剂量的FQSE (SEQ ID NO：10)和克他命(10mg/kg，K10)对不动时间(以秒表示) 的影响。45B：不同剂量的FQSE(SEQ IDNO：10)和克他命(10mg/kg， K10)对活动时间(以秒表示)的影响。每个柱代表平均值±SEM。*-与媒介物(0)相比的p<0.05。使用单向ANOVA与Fisher最小显著差异(LSD) 事后检验。
图46示出了实验的时间表。SPT-Sucrose Preference Test，蔗糖偏好试验(蔗糖溶液偏好试验，Sucrose Solution Preference Test)、CUMS-Chronic Mild Stress test，慢性轻度应激试验(慢性不可预见性轻度应激，Chronic Unpredictable Mild Stress)、EPM-Elevated Plus Maze，高架十字迷宫(高架十字迷宫试验，Elevated Plus Mazetest)、SI-Social Interaction，社交互动(社交互动试验，Social Interaction test)、FUST-Female Urine Sniffing Test，雌性尿液嗅探试验(性动机和快感缺乏试验，SexualMotivation and Anhedonia Test)、NSFT–Novelty Suppressed Feeding Test，新奇抑制摄食试验(新环境中食物消耗的抑制，Suppression of Food Consumption in a NewEnvironment)、FST–Forced Swim Test，强迫游泳试验(Forced Swimming Test)。
图47A和47B示出了在CUMS和一次药物注射后的大鼠在EPM实验中的行为。图47A：在开臂度过的时间，以秒表示。图47B：冻结(freezing) 度过的时间，以秒表示。每个柱代表平均值±SEM。*p<0.05代表与对照组有显著差异，且#-p<0.05-与CUMS+veh组有显著差异，$-与地西泮组相比的p<0.05。使用Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图48示出了在CUMS和四次注射药物后在SI试验中的社交互动持续持续时间(以秒表示)。每个柱代表平均值±SEM。*-p<0.05代表与对照组有显著差异，且#-p<0.05-与CUMS+veh组有显著差异。使用单向 ANOVA与Fisher LSD检验。
图49示出了在CUMS和8次药物注射后在FUST中的雌性尿液偏好指数(以％表示)。每个柱代表平均值±SEM。*-p<0.05代表与对照组有显著差异，且#-p<0.05-与CUMS+veh组有显著差异。使用单向ANOVA与 Fisher LSD检验。
图50示出了Kaplan-Mayer生存曲线。在x轴上-开始进食的潜伏期 (以秒表示)，Y-未开始进食的动物比例。物质的引入进行了十一天。*- p<0.05代表与对照组有显著差异，且#-p<0.05-与CUMS+veh组有显著差异。使用卡方标准(Chi-square criterion)与Cox-Mantel检验。
图51示出了在CUMS和16次注射研究物质后的蔗糖偏好指数(以％表示)。每个柱代表平均值±SEM。*-p<0.05-与对照组有显著差异。使用Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图52示出了在CUMS和18次注射研究物质之后在FST中的不动时间 (以秒表示)。每个柱代表平均值±SEM。*-p<0.05代表与对照组有显著差异，且#-p<0.05-与CUMS+veh组有显著差异。使用Kruskal-Wallis与 Dunn多重比较检验。
图53A、53B和53C示出了大鼠在捕食者气味应激暴露(predator odor stressexposure)和条件性位置厌恶范式(conditioned place aversion paradigm) 中的行为。图53A：在暴露于捕食者气味或无气味后表现出条件性位置厌恶。试验在调节后(post-conditioning)24小时进行。图53B：在无气味暴露后且在处理后24小时进行的试验前进行预处理的组中，暴露于无气味后的条件性位置厌恶。图53C：在气味暴露后且在处理后24小时进行的试验前进行预处理的组中，暴露于捕食者气味后的条件性位置厌恶。每个柱代表平均值±SEM。*-组之间p<0.05。使用单向ANOVA与Student Newman-Keuls 检验。
图54示出了LH范式(LH paradigm)中的OF试验中的潜伏期持续时间，以秒表示。结果显示为具有最大值和最小值的箱线图。*-与对照组有显著差异，#-与LH组有显著差异，p≤0.05。使用Kruskal-Wallis与Dunn 多重比较检验。
图55A和55B示出了大鼠在LH范式中的OF试验中的行为。图55A：动物(用后肢直立)垂直运动活动(motor acitvity)的持续时间，以秒表示。图55B：水平运动活动(里程)，扇区(sector)数。结果显示为具有最大值和最小值的箱线图。*-与对照组有显著差异。使用单向ANOVA与Tukey 检验。
图56A和56B示出了大鼠在LH范式中的EPM试验中的行为。图56A：在开臂度过的时间，以秒表示。图56B：在迷宫闭臂处的伸展姿势 (stretch-attended posture)数，N。结果显示为具有最大值和最小值的箱线图。
图57A和57B示出了大鼠在LH范式中的FST中的行为。图57A：不动持续时间，以秒表示。图57B：主动游泳持续时间，以秒表示。每个柱代表平均值±SEM。*-与对照组有显著差异；&-在趋势水平上与对照组有差异(p<0.1)；#-与LH组有显著差异，p≤0.05。使用单向ANOVA与 Fisher LSD事后检验。
图58示出了大鼠血浆中的基础皮质酮水平，nmol/L。每个柱代表平均值±SEM。*-p<0.1-与对照组相比具有统计学显著性的趋势，#p<0.05-与 LH组相比具有显著差异。使用单向ANOVA与Fisher LSD事后检验。
图59示出了在急性应激和施用盐水/地塞米松(dexamethasone，DXM) 后大鼠血浆皮质酮的应激诱导的变化，nmol/L。每个柱代表平均值±SEM。 *-p<0.05-与相应的“应激+veh”组有显著差异。使用单向ANOVA与Fisher LSD事后检验。
图60示出了CRS和药物治疗后的动物在OFT中的总行进距离(方格数)。每个柱代表平均值±SEM。
图61A和61B示出了CRS和药物治疗后的大鼠在FST中的表现。图 61A：主动(主动游泳+攀爬)度过的时间，以秒表示。图61B：不主动游泳(被动游泳+不动)度过的时间，以秒表示。每个柱代表平均值±SEM。* -p≤0.05时的统计学显著差异；#-与“CRS+Veh”组相比的p<0.05。使用单向ANOVA与Fisher LSD事后检验。
图62示出了CRS和治疗后的Sprague-Dawley大鼠的皮质和海马体匀浆样品中的蛋白质印迹结果的示例。
图63A和63B示出了与对照组相比通过蛋白质印迹获得的GAPDH积分面积(相对总蛋白标准化)，表示为％。图63A：大脑皮层中的GAPDH 含量。图63B：海马体中的GAPDH含量。每个柱代表平均值±SEM。
图64A和64B示出了与对照组相比通过蛋白质印迹获得的BDNF积分面积(相对总蛋白标准化)，表示为％。图64A：大脑皮层中的BDNF含量。图64B：海马体中的BDNF含量。每个柱代表平均值±SEM。*-与对照组相比的p<0.05，且#-与“CRS+veh”组相比的p<0.05。使用单向ANOVA 与Fisher LSD事后检验。
图65A和65B示出了与对照组相比通过蛋白质印迹获得的p70s6k (Thr421/Ser424)积分面积(相对总蛋白标准化)，表示为％。图65A：大脑皮层中的p70s6k(Thr421/Ser424)含量。图65B：海马体中的p70s6k (Thr421/Ser424)含量。每个柱代表平均值±SEM。*-与对照组相比的p<0.05，且#-与“CRS+veh”组相比的p<0.05。使用单向ANOVA与Fisher LSD事后检验。
图66A和66B示出了与对照组相比通过蛋白质印迹获得的p-ERK1 (Thr202)积分面积(相对总蛋白标准化)，表示为％。图66A：大脑皮层中的p-ERK1(Thr202)含量。图66B：海马体中的p-ERK1(Thr202)含量。每个柱代表平均值±SEM。*-与对照组相比的p<0.05，且#-与“CRS+veh”组相比的p<0.05。使用单向ANOVA与Fisher LSD事后检验。
图67A和67B示出了与对照组相比通过蛋白质印迹获得的p-ERK 2 (Tyr204)积分面积(相对总蛋白标准化)，表示为％。图67A：大脑皮层中的p-ERK 2(Tyr204)含量。图67B：海马体中的p-ERK 2(Tyr204)含量。每个柱代表平均值±SEM。*-与对照组相比的p<0.05，且#-与“CRS+veh”组相比的p<0.05。使用单向ANOVA与Fisher LSD事后检验。
图68A和68B示出了与对照组相比通过蛋白质印迹获得的p-PKC(PKC γThr514)积分面积(相对总蛋白标准化)，表示为％。图68A：大脑皮层中的p-PKC(PKCγThr514)含量。图68B：海马体中的p-PKC(PKCγThr514) 含量。每个柱代表平均值±SEM。*-与对照组相比的p<0.05，且#-与“CRS+veh”组相比的p<0.05。使用单向ANOVA与Fisher LSD事后检验。
图69A和69B示出了与对照组相比通过蛋白质印迹获得的p-GSK3β (Ser9)积分面积(相对总蛋白标准化)，表示为％。图69A：大脑皮层中的p-GSK3β(Ser9)含量。图69B：海马体中的p-GSK3β(Ser9)含量。每个柱代表平均值±SEM。*-与对照组相比的p<0.05。使用单向ANOVA与 Fisher LSD事后检验。
图70示出了SR 95531和FQSE(SEQ ID NO：10)体外对[3H]-SR 95531 与大鼠脑皮质的GABA受体结合的影响。
图71示出了FQSE(SEQ ID NO：10)和酮色林(Ketanserin)体外对 [3H]-FQSE(SEQID NO：10)与结合FQSE(SEQ ID NO：10)的皮质位点结合的影响。使用酮色林曲线作为示例，相似地，所有选定配体都具有IC50> 100μmol/L。
图72示出了FQSE(SEQ ID NO：10)和GABA体外对[3H]-FQSE与大鼠皮层中FQSE(SEQID NO：10)特异性位点结合的影响。使用GABA 曲线作为示例，相似地，所有选定配体都具有IC50>100μmol/L。
图73示出了FQSE(SEQ ID NO：10)、地西泮和孕烯醇酮(Pregnenolone) 体外对[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)与大鼠中皮层中FQSE(SEQ ID NO： 10)特异性结合位点结合的影响。
图74示出了FQSE(SEQ ID NO：10)和异四氢烟酸(Isoguvacine)体外对[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)与皮层FQSE(SEQ ID NO：10)结合位点结合的影响。使用异四氢烟酸曲线作为示例，相似地，所有选定配体都具有IC50>100μmol/L。
图75A、75B、75C示出了FQSE(SEQ ID NO：10)、荷包牡丹碱 (bicuculine)和荷包牡丹碱+FQSE(SEQ ID NO：10)处理后的小鼠在高架十字迷宫试验中的行为。图75A：在开臂度过的时间，s。图75B：开臂进入次数。图75C：焦虑指数(AI)，％。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05 表示与对照组相比有显著差异，#p<0.05–与“荷包牡丹碱”组相比， $p<0.05–与“荷包牡丹碱+FQSE(SEQ ID NO:10)”组相比。使用单向 ANOVA与Fisher LSD事后检验。
图76示出了FQSE(SEQ ID NO:10)、荷包牡丹碱和荷包牡丹碱+FQSE (SEQ ID NO:10)处理后，在Porsolt强迫游泳试验(两日修正)中主动游泳度过的时间，s。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05表示与对照组相比有显著差异，#p<0.05–与“荷包牡丹碱”组相比，$p<0.05–与“荷包牡丹碱+FQSE(SEQ ID NO:10)”组相比。使用单向ANOVA与Fisher LSD 事后检验。
图77示出了FQSE(SEQ ID NO:10)抑制鼠原代神经胶质细胞中LPS 诱导的TNFa、Il-1b和IL-6mRNA表达水平。结果表示为平均值±SEM。所有LPS组与没有LPS的对照相比表现出显著差异。#-与LPS对照相比的 p<0.05。*-与对照相比的p<0.05。使用非配对t检验进行统计学分析。
图78示出了在鼠原代神经胶质细胞中，IKKb mRNA表达水平既不依赖于LPS也不依赖于FQSE(SEQ ID NO:10)。结果表示为平均值±SEM。
具体实施方式
本文提供了肽组合物，其可用于例如治疗抑郁症、焦虑症、相关情绪病况和应激相关疾病。在一些方面，开发了用于各种抑郁症和焦虑症病况的多种精神病况的基于肽的神经调节治疗组合物。选择中枢神经系统(CNS)靶标以实现神经调节肽组合物的高特异性和功效。结合肽的预期安全性特征，本公开所述的组合物提供了安全且有效的治疗。
在本公开所述的实施方案中，选择作为亲离子型受体的GABA-A受体作为所述组的神经调节肽的靶标。GABA-A的内源性配体是γ-氨基丁酸 (GABA)，其是中枢神经系统中的主要抑制性神经递质。GABA-A受体是脑中GABA受体的主要类型。GABA-A受体包含5个亚基。分成α、β、γ、δ、ε和σ亚基(其中对α、β和γ的研究较为充分)且由不同基因编码的亚基至少有 19种不同的同工型。参见Nutt(2006).GABA-A Receptors:Subtypes,RegionalDistribution,and Function.Journal of clinical sleep medicine,2:S7-11。GABA-A受体的活性位点是GABA与几种药物的结合位点，且GABA结合在亚基α和β之间的连接处。GABA-A受体可以通过多种治疗剂进行调节，包括苯二氮卓类(benzodiazepines)、巴比妥类(barbiturates)、麻醉剂(anesthetics)、乙醇、锌和神经类固醇(neurosteroid)。苯二氮卓类(BDZ)与位于含有α- 和γ-亚基的GABA-A受体的α-和γ-亚基之间的界面处的所谓的苯二氮卓结合位点结合。Barnard(1998)Subtypes of gamma-aminobutyric acid Areceptors: classification on the basis of subunit structure and receptorfunction.Pharmacol. Rev.50(2):291–313。因此，苯二氮卓类与GABA-A受体蛋白复合物上的受体位点结合，这不同于GABA结合位点。一旦苯二氮卓与GABA-A受体上的位点结合，苯二氮卓会在变构上改变GABA-A受体的构象，增加GABA-A 受体对GABA的亲和力。同时，神经类固醇在不同于GABA、苯二氮卓类和巴比妥类识别位点的位点与GABA-A受体结合。这导致GABA结合或通道门控的变构调节。缺乏亚基选择性的神经类固醇调节表明，神经类固醇与在 GABA-A受体家族大多数成员中保守的位点结合。神经类固醇对GABA-A- 受体的作用取决于类固醇的类型(激动剂或拮抗剂)、受体的类型(突触的或突触外的)、亚基组成和类固醇的内在结构。Wang,M.(2011).Neurosteroids andGABA-A receptorfunction.Front.Endocrinol.2,44。
本公开的发明人已发现具有新结构并且具有与α-和γ-亚基之间的变构 BDZ位点，和/或GABA-A受体的另一变构调节位点，例如α-和β-亚基之间的结合位点结合，和/或与GABA-AR的神经类固醇位点结合的能力的神经调节肽。已发现这些肽的抗焦虑和抗抑郁活性与地西泮和氟伏沙明相当。这通过斑马鱼(Danio rerio)和啮齿动物的实验得以证实，如下文实施例中的更详细的讨论。
在一些实施方案中，本公开的多个实施方案所述的神经调节肽可以调节电压门控钙通道(voltage-gated calcium channel，VGCC)，也称为电压依赖性钙通道(voltage-dependent calcium channel，VDCC)，其是发现于可兴奋细胞(例如肌肉、神经胶质细胞、神经元等)的膜中并且对钙离子Ca2+具有渗透性的一组电压门控钙通道。参见Yamakage etal.Calcium channels--basic aspects of their structure,function and geneencoding；anesthetic action on the channels--a review.Canadian Journal ofAnaesthesia.2002.49(2):151–64。在生理或静息膜电位下，VGCC通常是关闭的；且它们在去极化膜电位下被激活 (即打开)。细胞外Ca2+离子的浓度通常比细胞内高数千倍，且VGCC的激活允许Ca2+流入细胞，这根据细胞类型会导致钙敏感钾通道的激活、肌肉收缩、神经元的兴奋、基因表达的上调或激素或神经递质的释放。Wilson et al. Thromboxane A2-induced contraction of rat caudal arterial smooth muscle involves activationof Ca2+entry and Ca2+sensitization:Rho-associated kinase-mediatedphosphorylation of MYPT1 at Thr-855,but not Thr-697.The BiochemicalJournal.2005.389(Pt3):763–74。
显示THDOC(四氢脱氧皮质酮(tetrahydrodeoxycorticosterone)；3α,21- 二羟基-5α-孕烷-20-酮)、DHEA(脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone)) 和孕烯醇酮(pregnenolone)通过可逆地阻断成年哺乳动物海马体神经元中的 VGCC而作为VGCC拮抗剂。Reddy&Kulkarni,Development of neurosteroid-based novel psychotropicdrugs.Prog Med Chem.2000；37:135-75。 THDOC是GABAA受体的正性变构调节剂(positiveallosteric modulator)，并且具有镇静、抗焦虑和抗惊厥作用。Reddy&Rogawski.Stress-induced deoxycorticosterone-derived neurosteroids modulateGABA(A)receptorfunction and seizure susceptibility.The Journal of Neuroscience.200.22(9):3795–805。显示苯二氮卓类，例如地西泮、氟西泮(flurazepam)和去烷基氟西泮(desalkylflurazepam)，以及其他正性GABAAR调节剂能直接抑制L型VGCC(L-VGCC)的活性。Earl&Tietz.Inhibition of recombinant L-type voltage-gated calcium channels bypositive allosteric modulators of GABAA receptors.JPharmacol ExpTher.2011Apr；337(1):301-311。加巴喷丁类 (gabapentinoid)药物(例如加巴喷丁(gabapentin)和普瑞巴林(pregabalin)) 是GABA的类似物，其可通过直接抑制VGCC发挥作用。Pateletal. Mechanisms of the gabapentinoids and α2δ-1calcium channelsubunit in neuropathic pain.Pharmacol Res Perspect.2016.Feb27；4(2)。
本公开的发明人通过计算机产生了一组肽，其中假设该组中的肽是具有对GABA-A的BDZ和神经类固醇(NS)结合位点的亲和力的GABA-A变构调节肽。另一组实验评估了α-和β-亚基之间的另一结合位点(称为alpha-beta 或α-β结合位点)。使用三维对接算法从肽组中选择更多相关肽。由此，鉴定出具有新序列的四肽家族。在一些方面，通过计算机产生了多个四肽作为潜在药物，并且测试了四肽的一个亚组。在一些方面，体内行为试验已证实，三种示例性肽FQSE(SEQ ID NO：10)、DKTE(SEQ ID NO：26)和WDQV (SEQ ID NO：14)同时具有与地西泮和氟伏沙明相当的抗焦虑和抗抑郁活性，如下文的更详细的讨论。
本公开的发明人设计并评估了预估具有与BDZ(α-γ)位点和/或与 GABA-AR的α-β位点和/或神经类固醇位点的结合能力的神经调节肽。在一些方面，本公开的发明人在本文所述的动物模型中进行了计算机分析和实验，并由此鉴定出由以下通式定义的一组四肽：R1R2R3R4(I)。
在一些方面，Rl是位于BDZ位点或GABA-AR的α-β结合位点或神经类固醇位点的氨基酸。肽的N末端可位于BDZ位点或GABA-AR的α-β结合位点或神经类固醇位点，或紧邻BDZ位点或GABA-AR的α-β结合位点或神经类固醇位点。或者，肽的C末端可位于BDZ位点或GABA-AR的α-β结合位点或神经类固醇位点。在本文的以下描述中，肽定义为从N末端延伸至C末端的序列。在一些方面，本公开所述的四肽不包括脯氨酸。
在一些实施方案中，肽定义为使得Rl是不同于Y的氨基酸，R2是不同于L的氨基酸，且肽的等电点小于6。
本发明人使用体内和体外模型评估了三种示例性肽FQSE(SEQ ID NO： 10)、DKTE(SEQ ID NO：26)和WDQV(SEQ ID NO：14)以及所测的其他(已知)测试物质的功效，如下文实施例部分中更详细的讨论。
先前已经观察到，斑马鱼的焦虑增加与在明/暗箱的暗区室中度过的时间增加相关(scototaxis——待在黑暗的庇护所的愿望增加)，以及与表现为与其他斑马鱼密切接触的愿望的群聚反射(shoaling reflex)的加剧相关。在新水族箱试验中在顶部度过的时间增加(或在底部度过的时间减少)也与鱼的抗焦虑相关：先前已经描述了抗抑郁药氟西汀(fluoxetine)(SSRI)影响下的斑马鱼行为的此类变化。参见Egan,R.J.(2009).Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxietyin zebrafish.Behav.Brain. Res.,205(1):38-44。scototaxis的增加显示由探索-隐藏动机平衡向隐藏的转移引起，且群聚反射是群聚鱼对捕食者的基本保护性应答。Maximino(2011) Pharmacological analysis of zebrafish(Danio rerio)scototaxis.ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry 35:624–631；Nguyen(2014)Aquatic blues:Modeling depression and antidepressant action in zebrafish.Prog. Neuro-Psychopharmacology Biol.Psychiatry 55:26–39。因此，斑马鱼是评估潜在抗焦虑物质的合适模型。
本公开发明人的发现与该主题的公开数据相一致，据此，在旷场、明/ 暗箱和评估群聚反射的装置的情况下的斑马鱼行为是用于评估焦虑样行为 (anxiety-likebehavior)以及评估抗抑郁药和抗焦虑药作用的合适模型 (Maximino(2014).Fingerprinting of Psychoactive Drugs in Zebrafish Anxiety-LikeBehaviors.PLoS One.9.P.e103943)。FQSE(SEQ ID NO：10) 在斑马鱼试验中作为一种前导肽出现，其具有稳健的抗焦虑样活性且未显示出镇静作用。
根据在旷场试验(OFT)、高架十字迷宫(EPM)试验和埋珠(MB)试验中获得的结果，向小鼠施用FQSE(SEQ ID NO：10)(通过腹腔注射) 导致明显的抗焦虑样作用。在强迫游泳试验(FST)中，肽的施用导致抗抑郁样作用(antidepressant-like effect)。
本发明人观察了不同剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)在鼻内施用后在旷场、高架十字迷宫和强迫游泳试验中对Sprague-Dawley大鼠行为的影响。 FQSE(SEQ ID NO：10)施用后的行为变化部分重演了地西泮处理的大鼠在 OF和EPM试验中和克他命处理的大鼠在FST中观察到的那些。根据行为范式(behavioral paradigm)，在0.5mg/kg和0.01mg/kg剂量下可见肽的最显著的抗焦虑样和抗抑郁样作用。结果显示了FQSE(SEQ ID NO：10)的剂量依赖性活性，其中在鼻内剂量为0.5mg/kg时具有最大功效。
0.05和0.5mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)在慢性轻度不可预测应激(CUMS)模型的多种行为试验中显示出抗抑郁样作用。同时，0.05mg/kg 剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)在新奇抑制摄食试验(NSFT)中显示出抗焦虑作用，并在EPM中显示出轻微的抗焦虑样作用(anxiolytic-like effect) 且无镇静迹象。
本发明人的发现表明，与多沙唑嗪(Doxazosin，DOX)相比，0.5mg/kg 剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)在更大程度上显著减弱了捕食者气味诱导的位置厌恶。
对习得性无助(Learned-Helplessness，LH)范式中的作用的研究显示， FQSE(SEQID NO：10)在OF和EPM试验中具有剂量依赖的抗焦虑样作用，并且在FST和地塞米松试验(dexamethasone test，DXMT)中具有抗抑郁样作用。FQSE(SEQ ID NO：10)施用阻止了下丘脑-脑垂体-肾上腺 (hypothalamic–pituitary–adrenal，HPA)轴的过度激活及其失调，这表现在对应激响应动物中。
发现FQSE(SEQ ID NO：10)施用在慢性约束缚应激(Chronic Restraint Stress，CRS)模型中慢性施用(chronic administration)后具有正向亲神经 (positiveneurotropic)作用。本发明人将获得的FQSE(SEQ ID NO：10) 分子作用机制结果与所述GABAA调节剂的活性进行比较。
未标记的FQSE(SEQ ID NO：10)在低浓度下特异性替换[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)：发现大鼠皮质膜中[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)的特异性结合位点的IC50＝2*10-6M。还发现地西泮和孕烯醇酮(均为GABAAR的配体) 对大鼠皮质膜中的[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)结合位点具有一定程度的亲和力(IC50～10-4M)。
已显示FQSE(SEQ ID NO：10)抑制鼠原代神经胶质细胞中的LPS诱导的促炎细胞因子TNF-α、IL-1b和IL-6的表达，这可显示了其调节神经炎症的作用。获得的数据与之前显示的蛋白质印迹结果高度一致，其中显示了 FQSE(SEQ ID NO：10)能够使应激诱导的ERK1/2(MAPK途径参与者) 磷酸化水平正常化。在本研究中观察到的促炎细胞因子的受抑制的表达也可以认为是GABAA触发的MAPK抑制的结果(Lee(2013).Neurotransmitters andmicroglial-mediated neuroinflammation.Curr.Prot.Pept.Sci.,14(1),21-32)。
发明人的发现揭示出，FQSE(SEQ ID NO：10)能够穿过血脑屏障。在嗅球中发现了对肽FQSE(SEQ ID NO：10)的最大亲和力，嗅球中其含量显著高于其他脑区域。还发现与其他脑区域相比，在前额叶皮层、海马体和下丘脑中存在更高水平的肽FQSE(SEQ ID NO：10)。
在一些方面，提供了一种组合物，其包含由通式I：R1R2R3R4(I)定义的合成神经调节肽，其中R1选自氨基酸W、F和D；R2是亲水性氨基酸；R3是亲水性氨基酸；且R4选自氨基酸V和E。
在一些实施方案中，Rl是W。在其他实施方案中，Rl是F。在进一步的实施方案中，Rl是D。
在一些实施方案中，R2是亲水性氨基酸，所述亲水性氨基酸选自极性且带正电荷的亲水性氨基酸、极性且电荷中性的亲水性氨基酸以及极性且带负电荷的亲水性氨基酸。在一些实施方案中，极性且电荷中性的亲水性氨基酸是不同于L的氨基酸，带正电荷的亲水性氨基酸选自R和K、H。在一些实施方案中，极性且电荷中性的亲水性氨基酸选自N、Q、S、T和C。在一些实施方案中，极性且带负电荷的亲水性氨基酸选自D和E、C、Y。
在一些实施方案中，R2可以选自D、Q和K，使得R2可以是D、Q和K 中任一个。
在一些实施方案中，R3是亲水性氨基酸，所述亲水性氨基酸选自极性且带正电荷的亲水性氨基酸、极性且电荷中性的亲水性氨基酸以及极性且带负电荷的亲水性氨基酸。在一些实施方案中，极性且带正电荷的亲水性氨基酸选自R和K。在一些实施方案中，极性且电荷中性的亲水性氨基酸选自N、 Q、S、T和C。在一些实施方案中，极性且带负电荷的亲水性氨基酸选自D 和E。在一些实施方案中，R3选自Q、S和T。
在一些实施方案中，R4选自V和E。
在一些实施方案中，R1选自W、F和D，R2选自D、Q和K，R3选自Q、 S和T，且R4选自V和E。在这样的实施方案中，合成神经调节肽可以包括上述任意氨基酸。因此，在一些实施方案中，R1是W，R2是D，R3是Q，且R4是V。在这样的实施方案中，组合物能够与GABA-A受体的苯二氮卓和神经类固醇结合位点结合。此外，组合物能够与GABA-A受体的α-β结合位点结合。
在一些实施方案中，R1是F，R2是Q，R3是S，且R4是E。在这样的实施方案中，组合物能够与GABA-A受体的苯二氮卓和神经类固醇结合位点结合。此外，在这样的实施方案中，组合物能够与GABA-A受体的α-β结合位点结合。
在一些实施方案中，R1是D，R2是K，R3是T，且R4是E。在这样的实施方案中，组合物能够与GABA-A受体的苯二氮卓和神经类固醇结合位点结合。此外，在这样的实施方案中，组合物能够与GABA-A受体的α-β结合位点结合。
本文所述的任意实施方案中的神经调节肽的等电点(pI)值小于约6。在一些实施方案中，神经调节肽的等电点(pI)值在约3.5至约4.5之间。在进一步的实施方案中，神经调节肽的等电点(pI)值在约3.3至约4.2之间。
在一些方面，提供了一种组合物，其包含由通式Ia定义的合成神经调节肽：
R1R2R3R4 (Ia)，
其中R1选自氨基酸W、F和D，R2选自氨基酸D、Q和K，R3是极性且电荷中性的亲水性氨基酸，且R4选自氨基酸V和E。在一些实施方案中，R3是选自N、Q、S、T、P和C的极性且电荷中性的亲水性氨基酸。
在至少一些实施方案中，R1是F，R2是Q，R3是S且R4是E。在至少一些实施方案中，R1是D，R2是K，R3是T，且R4是E。在至少一些实施方案中，R1是W，R2是D，R3是Q，且R4是V。
本公开所述的神经调节肽可以是药物组合物的形式。所述组合物可以施用给需要治疗的受试者，例如被诊断为患有表现为抑郁和/或焦虑的病症的受试者。
在一些实施方案中，本公开所述的一种或多种肽可以作为活性成分包含在食品中。在这些实施方案中，肽可以包含在作为食物制品的组合物中。食物组合物可包括任何非活性成分。此外，除了本公开所述的肽之外，食品组合物还可以包括不影响肽有效性的其他活性成分。
在一些实施方案中，本公开所述的肽是组合物的活性成分。在其他实施方案中，组合物的活性成分是肽的类似物，其可以是N末端修饰的类似物或 C末端修饰的类似物。本公开所述的肽任选地被化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰选自R1、R2、R3和R4中一个或多个的酰胺化、甲基化和乙酰化，如本文中针对式I或Ia所述。在其他实施方案中，可以进行其他各种类型的肽主链和/或侧链修饰。在一些实施方案中，化学修饰可包括添加甲酰基、焦谷酰氨基(pGlu)、一个或多个脂肪酸、尿素、氨基甲酸酯、磺酰胺、烷基胺或其任意组合。
例如，在一些实施方案中，肽可以是“伪肽(pseudo-peptide)”，其中常规肽键(CO-NH)被等排(isosteric)或等电子(isoelectronic)类似物之一替换。例如，还原的酰胺(CH2-NH)可以等排地引入肽中。在一些实施方案中，肽可以以氮杂肽(azapeptide)的形式制备，其中肽主链的α-碳被氮替换(不改变氨基酸残基)。作为化学修饰的进一步示例，本公开所述的合成神经调节肽可以是反向-翻转肽(retro-inverso peptide)，其中以反向顺序使用D-氨基酸。作为另一个示例，在一些实施方案中，本公开所述的合成神经调节肽可以是肽模拟物，其侧链连接至肽主链的氮原子上，而不是α-碳上。如此，在一些实施方案中，合成神经调节肽可以是类肽(peptoid)或聚N取代的甘氨酸(poly-N-substituted glycine)。
在一些实施方案中，可以通过将非天然氨基酸引入肽中的某些位置来任选地修饰合成神经调节肽。非天然氨基酸的非限制性示例包括D-氨基酸、 N-甲基化(或N-烷基化)的氨基酸、α-取代的α-氨基酸、β-取代的α-氨基酸、β-氨基酸和γ-氨基酸。
在一些实施方案中，可以通过肽的环化来修饰合成神经调节肽。在一些实施方案中，合成神经调节肽可以被修饰，使得肽是β-转角模拟肽(beta-turn mimetics peptide)。在一些实施方案中，肽中的苯丙氨酸(F)(如果存在) 可以被硝基-、氨基-、氟-苯丙氨酸或其他蛋白酶抑制剂替换。
在一些实施方案中，本公开所述的组合物包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本公开所述的组合物包含递送媒介物。递送媒介物可以选自脂质体、纳米颗粒和多糖。在一些实施方案中，多糖可选自环糊精、壳聚糖、纤维素和藻酸盐。
本公开所述的组合物可以配制为用于多种施用途径。施用途径的非限制性示例包括吸入、鼻内、口服、静脉内、肌内和皮下。
在一些实施方案中，组合物配制为用于鼻内施用。配制为鼻内施用的组合物可包含至少一种鼻粘膜蛋白酶的抑制剂。抑制剂的非限制性示例包括选自以下的一种或多种化合物：bestatine、comostate淀粉酶、亮抑酶肽 (leupeptin)、抑肽酶(aprotinin)、杆菌肽(bacitracin)、amastatine、硼亮氨酸(boroleucine)、嘌呤霉素(puromycin)、胆汁盐(bilesalt)和夫西地酸(例如乙二胺四乙酸二钠(disodium ethylene-diaminetetraacetate))。鼻内递送是治疗性肽的非侵入性施用途径，并提供了静脉或皮下注射的替代方法。
在一些实施方案中，组合物配制为用于通过吸入施用。在一些实施方案中，配制为通过吸入施用的组合物可以使用干粉鼻内装置进行施用。
在一些实施方案中，组合物配制为用于静脉内施用。
在一些实施方案中，组合物调节γ-氨基丁酸A(GABA-A)受体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任意实施方案或任意实施方案的组合提供药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的组合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。生理盐水、碳酸盐或碳酸氢盐缓冲液，以及其他可能的稀释剂，可用于溶解组合物。
在一些实施方案中，提供了一种调节细胞中γ-氨基丁酸A(GABA-A) 受体的方法。所述方法包括使细胞与根据本文所述的任意实施方案或任意实施方案的组合的组合物接触。
在一些实施方案中，提供了一种治疗有此需要的患者的情绪疾病的方法。所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的根据本文所述的任意实施方案或任意实施方案的组合的组合物。情绪疾病可以是抑郁症。在一些实施方案中，抑郁症可以是小儿抑郁症或青少年抑郁症。在一些实施方案中，抑郁症选自重度抑郁症(major depressivedisorder)、心境恶劣(dysthymia)、爆发性抑郁症(breakthrough depression)、难治性抑郁症(treatment-refractory depression)和与帕金森病相关的抑郁症(depressionassociated with Parkinson's disease)、与创伤后应激疾病相关的抑郁症(depressionassociated with post-traumatic stress disorder)、产后抑郁症(post-partumdepression)、双相抑郁症(bipolar depression)。在一些实施方案中，情绪疾病可以是应激相关疾病。
在一些实施方案中，情绪疾病是焦虑症。在一些实施方案中，焦虑症是小儿焦虑症或青少年焦虑症。焦虑症可以选自分离焦虑症(separation anxiety disorder)、选择性缄默症(selective mutism)、特定恐惧症(specific phobia， SP)、社交焦虑症(socialanxiety disorder，SAD)、恐慌症(panic disorder)、广场恐惧症(agoraphobia)、物质/药物诱发的焦虑症 (substance/medication-induced anxiety disorder)和归因于另一种药物情况的焦虑症(anxiety disorder due to another medication condition)、广泛性焦虑症 (generalized anxiety disorder，GAD)、创伤后应激疾病(post-traumaticstress disorder，PTSD)、重度抑郁症(major depressive disorder，MDD)、治疗抗性抑郁症(treatment-resistant depression，TRD)、产后抑郁症(postpartum depression，PPD)、双相障碍(bipolar disorder)或双相抑郁症(bipolar depression)、强迫症(obsessive-compulsive disorder，OCD)、以及注意力缺陷多动症(attention deficit hyperactivitydisorder，ADHD)、社交恐惧症 (social phobia)、阿尔茨海默病中的躁动(agitation inAlzheimer’s disease)、阿尔茨海默病中的攻击性(aggression in Alzheimer’sdisease)和强迫症 (obsessive-compulsive disorder)。在一些实施方案中，情绪疾病是精神分裂症(schizophrenia)。在一些实施方案中，情绪疾病是创伤后应激疾病。
在一些实施方案中，提供了根据本文所述的任意实施方案或任意实施方案的组合的治疗情绪疾病的方法，所述方法进一步包括施用抗抑郁药。抗抑郁药任选选自由以下组成的组：血清素再摄取抑制剂(serotonin reuptake inhibitor)、选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂(selective norepinephrine reuptake inhibitor)、联合作用SSRI/SNRI(combined action SSRI/SNRI)、血清素-2拮抗剂/再摄取抑制剂、具有α-2拮抗作用加上血清素-2和血清素-3 拮抗作用的抗抑郁药、具有血清素/去甲肾上腺素/多巴胺再摄取抑制作用的抗抑郁药、具有去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制作用的抗抑郁药、 5-HT-1alpha拮抗剂、5-HT-1beta拮抗剂、5-HT1A受体激动剂、5-HT1A受体激动剂和拮抗剂、5-HT2受体拮抗剂、盐酸维洛沙嗪(viloxazine hydrochloride)、脱氢表雄酮(dehydroepiandosterone)、NMDA受体拮抗剂、AMPA受体增强剂(AMPA receptorpotentiator)、P物质拮抗剂(substance P antagonist)/神经激肽-1受体拮抗剂(neurokinin-1 receptor antagonist)、非肽P物质拮抗剂(nonpeptide Substance Pantagonist)、神经激肽2拮抗剂、神经激肽3拮抗剂、促肾上腺皮质激素释放因子受体拮抗剂(corticotropin-releasing factor receptor antagonist)、抗糖皮质激素药物(antiglucocorticoid medication)、糖皮质激素受体拮抗剂、皮质醇阻断剂、一氧化氮合成抑制剂、磷酸二酯酶(phosphodiesterase)抑制剂、脑啡肽酶 (enkephalinase)抑制剂、GABA-A受体激动剂、自由基捕获剂(free radical trapping agent)、非典型MAOI(atypical MAOI's)、选择性MAOI抑制剂、激素、亚叶酸、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、曲马多(tramadol)以及色氨酸与抗精神病药物组合，其中所述抗精神病药物选自由非典型抗精神病药物和多巴胺系统稳定剂(dopamine system stabilizer)组成的组。
在一些实施方案中，提供了一种本文所述的任意实施方案或任意实施方案的组合的治疗情绪疾病的方法，所述方法进一步包括施用任选选自一种或多种其他药剂的额外抑郁症治疗。
在一些实施方案中，本发明提供了进一步包含额外药剂的本发明组合物和方法以及向受试者施用额外药剂的方法。在一些实施方案中，本发明涉及共同施用和/或共同配制。可以共同配制和/或共同施用本文所述的任意组合物。
在多个实施方案中，额外药剂是以下一种或多种：CYMBALTA口服、 LEXAPRO口服、EFFEXOR XR口服、ZOLOFT口服、CELEXA口服、 TRAZODONE口服、PROZAC口服、WELLBUTRIN XL口服、CITALOPRAM 口服、PRISTIQ口服、AMITRIPTYLINE口服、SAVELLA口服、VIIBRYD 口服、PAXIL CR口服、WELLBUTRIN口服、PAXIL口服、SERTRALINE 口服、REMERON口服、NORTRIPTYLINE口服、VENLAFAXINE口服、 FLUOXETINE口服、BUPROPION HCL口服、MIRTAZAPINE口服、RITALIN 口服、PAROXETINE口服、WELLBUTRIN SR口服、DOXEPIN口服、METHYLPHENIDATE口服、SYMBYAX口服、ESCITALOPRAM OXALATE 口服、PAMELOR口服、IMIPRAMINE口服、BRINTELLIX口服、 DULOXETINE口服、NARDIL口服、FETZIMA口服、EMSAMTRANSDERMAL、PARNATE口服、PEXEVA口服、BRISDELLE口服、 CLOMIPRAMINE口服、ANAFRANIL口服、TOFRANIL口服、 FLUVOXAMINE口服、ZYBAN口服、DESIPRAMINE口服、SARAFEM口服、PROZAC WEEKLY口服、APLENZIN口服、METHYLIN口服、 NEFAZODONE口服、QUILLIVANT XR口服、TOFRANIL-PM口服、 NORPRAMIN口服、REMERON SOLTAB口服、BUPROPION HBR口服、OLEPTRO ER口服、DESVENLAFAXINE SUCCINATE口服、BUPROBAN 口服、IMIPRAMINE PAMOATE口服、VILAZODONE口服、MILNACIPRAN 口服、PAROXETINE MESYLATE口服、SURMONTIL口服、MAPROTILINE 口服、PROTRIPTYLINE口服、PHENELZINE口服、MARPLAN口服、 OLANZAPINE-FLUOXETINE口服、TRANYLCYPROMINE口服、 SELEGILINE TRANSDERMAL、AMOXAPINE口服、FORFIVO XL口服、 ISOCARBOXAZID口服、DESVENLAFAXINE口服、KHEDEZLA口服、LEVOMILNACIPRAN口服、VORTIOXETINE口服和DESVENLAFAXINE FUMARATE口服。
在一些实施方案中，提供了一种根据本文所述的任意实施方案或任意实施方案的组合的治疗情绪疾病的方法，所述方法进一步包括施用任选选自以下一种或多种药剂的额外焦虑治疗剂：苯二氮卓类(benzodiazepines)，选自阿普唑仑(alprazolam，XANAX)、氯硝西泮(clonazepam，KLONOPIN)、地西泮(VALIUM)、劳拉西泮(lorazepam，ATIVAN)、奥沙西泮(oxazepam， SERAX)和氯氮卓(chlordiazepoxide，librium)；β阻断剂，选自普萘洛尔(propranolol，INDERAL)和阿替洛尔(atenolol，TENORMIN)；三环抗抑郁药，选自丙咪嗪(imipramine，TOFRANIL)、地昔帕明(desipramine， NORPRAMIN、PERTOFRANE)、去甲替林(nortriptyline，AVENTYL或 PAMELOR)、阿米替林(amitriptyline，ELAVIL)、多塞平(doxepin，SINEQUAN 或ADAPIN)、氯米帕明(clomipramine，ANAFRANIL)；单胺氧化酶抑制剂(monoamine oxidase inhibitor，MAOI)，选自苯乙肼(phenelzine，NARDIL)、反苯环丙胺(tranylcypromine，PARNATE)；选择性血清素再摄取抑制剂 (SSRI)，选自氟西汀(fluoxetine，PROZAC)、氟伏沙明(fluvoxamine， LUVOX)、舍曲林(sertraline，ZOLOFT)、帕罗西汀(paroxetine，PAXIL)、草酸艾司西酞普兰(escitalopram oxalate，LEXAPRO)、西酞普兰(citalopram， CELEXA)；血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，选自文拉法辛(venlafaxine，EFFEXOR)、文拉法辛缓释剂(venlafaxine extended release， EFFEXORXR)和度洛西汀(duloxetine，CYMBALTA)；温和的镇静剂(mild tranquilizer)，例如丁螺环酮(buspirone，BUSPAR)；以及抗惊厥药 (anticonvulsant)，选自丙戊酸盐(valproate，DEPAKOTE)、普瑞巴林 (pregabalin，LYRICA)和加巴喷丁(gabapentin，NEURONTIN)。
在多个实施方案中，额外药剂可以与本公开所述的肽结合。
在多个实施方案中，本发明的组合物可以与其他部分例如额外药剂或一个部分融合，以延长体内半衰期。除了增加稳定性之外，此类部分还可以增加与其融合的分子的溶解度。增加溶解度(例如，防止聚集)的部分可以使组合物更容易操作，且尤其提高稳定性和保质期。此类部分的一个公知示例是PEG(聚乙二醇)。尤其涉及这个部分，因为它可以用作接头以及增溶部分。其他示例包括肽和蛋白或蛋白结构域，或甚至完整蛋白(例如，GFP)。在这个方面，应该注意的是，与PEG一样，一个部分可以具有不同的功能或作用。例如，flag标签(DYKDDDDK)是可用作标签的肽部分，但由于其电荷密度，其也增强溶解性。聚乙二醇化已经常被证明可增加生物药物的溶解度(例如，Veronese and Mero(2008)The impact ofPEGylation on biological therapies,BioDrugs；22(5)315-29)。向目的分子添加肽、多肽、蛋白或蛋白结构域标签在本领域中已有广泛描述。示例包括但不限于衍生自以下的肽：突触核蛋白(synuclein)(例如，Parketal.,ProteinEng.Des.Sel.2004； 17:251-260)、SET(溶解度增强标签，Zhang et al.,Protein Expr Purif 2004； 36:207-216)、硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)、谷胱甘肽-S-转移酶 (Glutathione-S-transferase，GST)、麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding protein， MBP)、N-利用物质(N-Utilization substance，NusA)、小泛素样修饰剂(small ubiquitin-like modifier，SUMO)、泛素(Ub)、二硫键C(DsbC)、十七千道尔顿蛋白(Seventeen kilodalton protein，Skp)、噬菌体T7蛋白激酶片段(T7PK)、蛋白GB1结构域、A蛋白IgGZZ重复结构域(Protein A IgG ZZ repeat domain)和细菌免疫球蛋白结合结构域(Hutt et al.,J Biol Chem； 287(7):4462-9,2012)。标签的性质将取决于应用，这可由技术人员确定。例如，对于本文所述分子的转基因表达，可以将分子与更大的结构域融合以防止细胞机器过早降解。其他应用可以涉及与更小的增溶标签(例如，少于30 个氨基酸，或少于20个氨基酸，或甚至少于10个氨基酸)融合，以不过多改变分子的特性。其他化学修饰可包括添加甲酰基、焦谷氨酰基(pGlu)、一个或多个脂肪酸、尿素、氨基甲酸酯、磺酰胺、烷基胺或其任意组合。
除了延长半衰期之外，本发明的组合物可以与改变其他或另外的药代动力学和药效学特性的部分融合。例如，已知与白蛋白(例如人血清白蛋白)、白蛋白结合结构域或合成的白蛋白结合肽融合能改善不同治疗蛋白的药代动力学和药效学(Langenheim&Chen(2009).Improving the pharmacokinetics/pharmacodynamics of prolactin,GH,andtheir antagonists by fusion to a synthetic albumin-bindingpeptide.J.Endocrinol.,203(3):375)。另一个经常使用的部分是抗体的片段可结晶区(Fc)。这些部分的性质可由本领域技术人员根据应用确定。
在一些实施方案中，本公开的肽可以作为唯一的药剂施用或与一种或多种其他药剂组合施用，其中所述组合不引起不可接受的副作用。
在一种或多种病况的治疗中要施用的活性成分的量可以根据例如以下考虑而变化：所采用的具体肽和剂量单位、施用方式、治疗时间、所治疗患者的年龄、体重和性别，以及所治疗病况的性质和程度。本公开所述的组合物可以通过特定途径以合适的剂量施用给受试者。
在一些实施方案中，要施用的肽的剂量通常在以下范围内：约0.001 mg/kg至约200mg/kg体重、约0.01mg/kg至约100mg/kg体重、约0.01mg/kg 至约50mg/kg体重、约0.01mg/kg至约40mg/kg体重、约0.01mg/kg至约 30mg/kg体重、约0.01mg/kg至约20mg/kg体重、约0.01mg/kg至约5mg/kg 体重、约0.01mg/kg至约10mg/kg体重、约0.1mg/kg至约10mg/kg体重、约0.1mg/kg至约20mg/kg体重、约0.1mg/kg至约30mg/kg体重、约0.1mg/kg 至约40mg/kg体重，约0.1mg/kg至约50mg/kg体重。临床上有用的给药计划是每天给药一至三次。含有本文所述的神经调节肽的药物组合物也可以以单剂量施用。由于组合物的安全性和有效性，单剂量的组合物可有效减轻抑郁或焦虑相关症状。还可以为更长时间的治疗进程制定治疗计划。例如，在一些实施方案中，本公开实施方案所述的药物组合物可以在多于一天，例如2天至60天，或2天至50天，或2天至40天，或2天至30天的时间内施用，且每日剂量可以在上述任意范围内。多于一天的施用可用于治疗慢性症状或疾病，其可以是多种精神性、行为性、情感性、神经性和情绪性疾病，包括抑郁症、焦虑和应激相关疾病(stress-relateddisorder)的任一种。
“受试者”是哺乳动物，例如人类(例如女性或男性人类)、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人类灵长类动物，例如猴子、黑猩猩、狒狒或恒河猴，且术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
本文所述的肽可以以喷雾剂，例如鼻内喷雾剂的形式施用。
本发明进一步提供了能够简化本文所述的任意药剂的施用的试剂盒。本发明的说明性试剂盒包含单位剂型的本文所述的任意组合物。在一个实施方案中，单位剂型是容器，例如预装注射器，其可以是无菌的，含有本文所述的任意药剂和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物。试剂盒可进一步包含指示本文所述的任意药剂的使用的标签或印刷说明书。试剂盒还可以包含用于施用部位的盖式窥器(lidspeculum)、局部麻醉剂和清洁剂。试剂盒还可进一步包含一种或多种本文所述的额外药剂。在一个实施方案中，试剂盒包含含有有效量的本发明的组合物和有效量的另一种组合物，例如本文所述的那些组合物的容器。
通过以下非限制性实施例进一步说明本公开。
实施例
实施例1：肽的计算机设计
将来自牛乳水解物的一组肽分为5个类型，并通过将窗口滑动1个氨基酸的步长将其通过计算机转换为一组所有可能的四肽。总共生成了341个独特的四肽。对于每个肽，使用3D对接算法将肽拟合到GABA-A受体的BDZ 位点以及GABA-A受体的α和β亚基之间的界面，这导致每个肽多达20个可能构象。总共生成了5650个独特的肽位置。组合所有位置并计算特定类型的原子(芳碳、氢键供体/受体等)位于给定区域的频率。根据空间密度图谱对每个构象进行权重，并相对于原子和残基的数量标准化。选择大于BDZ位点的对接位点，且因此为了便于评估结果，指定大于BDZ位点的肽分数为0.0。所有常见的相互作用(例如静电、氢键等)都在对接/拟合阶段进行了考虑。此外，基于其分数预选了100个四肽。
实施例2：用于试验的四个肽(fourpeptides)的选择
2.1研究目的
使用计算机方法鉴定出给定肽中对GABA-A受体的苯二氮卓位点具有最大亲和力的四肽。
2.2结果
将分为5个类型的来自牛乳水解物的一组给定肽转换成一组四肽。通过以1个氨基酸的步长滑动窗口，从每个肽生成所有可能的四肽。总共生成了 341个不同的四肽。
每个肽以下列方式修饰：将乙酰基“塞(plug)”添加到N-末端，而将甲基塞添加到C-末端。
对于每个肽，进行与GABA-A受体的BZD位点的对接，产生多达20 个构象。总共获得了5650个不同的肽位置。随后，将所有结果合并，并分析这种类型的原子(芳碳、氢键供体/受体等)进入给定区域的频率。根据这个空间密度图对每个构象进行权重，并相对原子和残基的数量标准化。因此，进行了一种统计学分析。由于对接单元(dockingcell)肯定大于BZD位点，为了便于评估结果，使用评估打分0.0分配给处于BZD位点之外的肽。对明确形式的常见相互作用(例如静电、氢键等)的描述发生在对接阶段。
如此，约有100个评估函数值≥0.7的发现：
简称 Pose名 能量 序列ID
YLQY YLQY_out_model16.pdb 1.00 SEQ ID NO:1
YQLY YQLY_out_model9.pdb 0.99 SEQ ID NO:2
YQLY YQLY_out_model11.pdb 0.94 SEQ ID NO:2
YLQY YLQY_out_model5.pdb 0.93 SEQ ID NO:1
YLEQ YLEQ_out_model10.pdb 0.92 SEQ ID NO:3
QYLY QYLY_out_model10.pdb 0.92 SEQ ID NO:4
YLKY YLKY_out_model9.pdb 0.90 SEQ ID NO:5
YLKY YLKY_out_model19.pdb 0.89 SEQ ID NO:5
YLKT YLKT_out_model4.pdb 0.89 SEQ ID NO:6
YQLY YQLY_out_model3.pdb 0.86 SEQ ID NO:2
FLLY FLLY_out_model10.pdb 0.86 SEQ ID NO:7
YQLY YQLY_out_model20.pdb 0.86 SEQ ID NO:2
YQKF YQKF_out_model2.pdb 0.86 SEQ ID NO:8
YLQY YLQY_out_model4.pdb 0.85 SEQ ID NO:1
YLKY YLKY_out_model6.pdb 0.84 SEQ ID NO:5
LYQE LYQE_out_model8.pdb 0.84 SEQ ID NO:9
FQSE FQSE_out_model5.pdb 0.84 SEQ ID NO:10
FLLY FLLY_out_model7.pdb 0.83 SEQ ID NO:7
QYLY QYLY_out_model11.pdb 0.82 SEQ ID NO:4
FYQK FYQK_out_model5.pdb 0.82 SEQ ID NO:11
LYQE LYQE_out_model2.pdb 0.82 SEQ ID NO:9
FLLY FLLY_out_model11.pdb 0.81 SEQ ID NO:7
YLGY YLGY_out_model15.pdb 0.81 SEQ ID NO:12
YLQY YLQY_out_model12.pdb 0.80 SEQ ID NO:1
PFTE PFTE_out_model11.pdb 0.80 SEQ ID NO:13
WDQV WDQV_out_model11.pdb 0.80 SEQ ID NO:14
PEVF PEVF_out_model16.pdb 0.80 SEQ ID NO:15
FLLY FLLY_out_model13.pdb 0.80 SEQ ID NO:7
YLQY YLQY_out_model13.pdb 0.79 SEQ ID NO:1
LSRY LSRY_out_model12.pdb 0.79 SEQ ID NO:16
LLRF LLRF_out_model2.pdb 0.79 SEQ ID NO:17
WDQV WDQV_out_model15.pdb 0.79 SEQ ID NO:14
MPLW MPLW_out_model17.pdb 0.79 SEQ ID NO:18
KYQF KYQF_out_model10.pdb 0.79 SEQ ID NO:19
YLKY YLKY_out_model7.pdb 0.78 SEQ ID NO:5
YLKT YLKT_out_model5.pdb 0.78 SEQ ID NO:6
FYQK FYQK_out_model13.pdb 0.78 SEQ ID NO:11
YQLY YQLY_out_model7.pdb 0.78 SEQ ID NO:2
YQKF YQKF_out_model14.pdb 0.78 SEQ ID NO:8
LLRF LLRF_out_model5.pdb 0.78 SEQ ID NO:17
KYQF KYQF_out_model16.pdb 0.78 SEQ ID NO:19
YQKF YQKF_out_model3.pdb 0.77 SEQ ID NO:8
YLQY YLQY_out_model18.pdb 0.77 SEQ ID NO:1
QYLY QYLY_out_model17.pdb 0.77 SEQ ID NO:4
YQLY YQLY_out_model8.pdb 0.77 SEQ ID NO:2
YQFL YQFL_out_model8.pdb 0.77 SEQ ID NO:20
FFVA FFVA_out_model6.pdb 0.77 SEQ ID NO:21
KTVY KTVY_out_model18.pdb 0.77 SEQ ID NO:22
YQLY YQLY_out_model13.pdb 0.76 SEQ ID NO:2
KYQF KYQF_out_model11.pdb 0.76 SEQ ID NO:19
FSDI FSDI_out_model14.pdb 0.76 SEQ ID NO:23
FFVA FFVA_out_model5.pdb 0.76 SEQ ID NO:21
YLKY YLKY_out_model13.pdb 0.75 SEQ ID NO:5
FFVA FFVA_out_model7.pdb 0.75 SEQ ID NO:21
SFSD SFSD_out_model14.pdb 0.75 SEQ ID NO:24
FLLY FLLY_out_model8.pdb 0.75 SEQ ID NO:7
FFVA FFVA_out_model12.pdb 0.75 SEQ ID NO:21
LLYQ LLYQ_out_model5.pdb 0.75 SEQ ID NO:25
DKTE DKTE_out_model20.pdb 0.74 SEQ ID NO:26
LLYQ LLYQ_out_model6.pdb 0.74 SEQ ID NO:25
QYLY QYLY_out_model8.pdb 0.74 SEQ ID NO:4
YYVP YYVP_out_model13.pdb 0.73 SEQ ID NO:27
YQKF YQKF_out_model13.pdb 0.73 SEQ ID NO:8
LSRY LSRY_out_model9.pdb 0.73 SEQ ID NO:16
YQLY YQLY_out_model19.pdb 0.73 SEQ ID NO:2
YLKT YLKT_out_model14.pdb 0.73 SEQ ID NO:6
FTES FTES_out_model15.pdb 0.73 SEQ ID NO:28
LSRY LSRY_out_model4.pdb 0.73 SEQ ID NO:16
GTQY GTQY_out_model13.pdb 0.73 SEQ ID NO:29
PEVF PEVF_out_model7.pdb 0.72 SEQ ID NO:15
FLGA FLGA_out_model7.pdb 0.71 SEQ ID NO:30
YTDA YTDA_out_model10.pdb 0.71 SEQ ID NO:31
YPSY YPSY_out_model18.pdb 0.71 SEQ ID NO:32
KTVY KTVY_out_model2.pdb 0.71 SEQ ID NO:22
YPSY YPSY_out_model19.pdb 0.71 SEQ ID NO:32
FTES FTES_out_model12.pdb 0.71 SEQ ID NO:28
FPKY FPKY_out_model9.pdb 0.71 SEQ ID NO:33
QYLY QYLY_out_model18.pdb 0.70 SEQ ID NO:4
可以估算单独四肽在最佳结果列表中的出现。由于大多数肽线性地位于蛋白表面，可以确定相对于BZD位点的方向。下文中，F代表正向(Forward) –肽的N末端位于BZD位点中或与其紧邻。R代表反向(Reverse)–肽的C末端位于BZD位点中–在这些情况下，肽序列应从C末端至N末端。仅具有构象R(conformer R)的肽不是所提供的列表中的肽：
YQLY 8F/R(SEQ ID NO:2)
YLQY 6F/R(SEQ ID NO:1)
YLKY 5F/R(SEQ ID NO:5)
QYLY 5F/R(SEQ ID NO:4)
FLLY 5F/R(SEQ ID NO:7)
YQKF 4F(SEQ ID NO:8)
FFVA 4F(SEQ ID NO:21)
YLKT 3F(SEQ ID NO:6)
KYQF 3R(SEQ ID NO:19)
LSRY 3R(SEQ ID NO:16)
FTES 2F(SEQ ID NO:28)
PEVF 2R(SEQ ID NO:15)
YPSY 2F/R(SEQ ID NO:32)
LYQE 2F(SEQ ID NO:9)
LLRF 2R(SEQ ID NO:17)
KTVY 2R(SEQ ID NO:22)
FYQK 2F(SEQ ID NO:11)
WDQV 2F(SEQ ID NO:14)
LLYQ 2F(SEQ ID NO:25)
DKTE 1F(SEQ ID NO:26)
YTDA 1F(SEQ ID NO:31)
FQSE 1F(SEQ ID NO:10)
FSDI 1F(SEQ ID NO:23)
PFTE 1F(SEQ ID NO:13)
MPLW 1R(SEQ ID NO:18)
GTQY 1R(SEQ ID NO:29)
SFSD 1F(SEQ ID NO:24)
YQFL 1F(SEQ ID NO:20)
FLGA 1F(SEQ ID NO:30)
YLEQ 1F(SEQ ID NO:3)
YLGY 1R(SEQ ID NO:12)
YYVP 1F(SEQ ID NO:27)
FPKY 1R(SEQ ID NO:33)
最好的发现十分一致地位于BZD位点中。
2.3结论
通过查看最合适的选择，发现了已知肽YLGYLEQLLR的四肽。然而，也发现了序列与之显著不同而在评估函数的值上没有显著不同的其他肽。为了进行进一步的实验验证，选择了以下原始肽：FQSE(SEQ ID NO：10)、 WDQV(SEQ ID NO：14)、DKTE(SEQ ID NO：26)，以及阴性对照-FLPY (SEQ ID NO：36)。
此外，使用计算机方法以检查FQSE(SEQ ID NO：10)肽是否可能对 GABA-A的神经类固醇位点具有亲和力。
通过将所有可能的四肽高通量组合对接至GABA-A受体的细胞外结构域中，来初步鉴定FQSE(SEQ ID NO：10)四肽。发现这个肽的优先结合口袋(preferential bindingpocket)是BZD位点。然后在对照对接运行至包含其膜埋藏α-螺旋结构域的完整GABA-A受体模型期间，独立检查FQSE(SEQ ID NO：10)的结合模式。这个运行证明了FQSE(SEQ ID NO：10)对GABA-A 的神经类固醇结合位点具有高度偏好，来自20个独立复制物(replica)的所有最佳命中均位于其中。
这些实验证明，FQSE(SEQ ID NO：10)肽在两个区域内结合GABA-A 受体：主要结合模式对应于神经类固醇位点，次要结合模式对应于BZD位点。
实施例3：所选肽和其他测试物质对斑马鱼(Danio rerio)行为的影响的评估
目的是通过分析精神活性剂(psychoactive agent)对斑马鱼(Danio rerio) 行为的影响，来开发用于评估新型神经调节肽的亲神经活性(neurotropic activity)的标准方案。具体地，评估了单次注射抗抑郁药和抗焦虑药例如氟伏沙明和地西泮对斑马鱼的scototaxis、自主活动、探索性反应和社会行为的影响。
3.1.材料和方法
3.1.1.动物维护
将斑马鱼保持在温度28℃、pH6.8-7.5、渗透压550-700osmol/升的流通式ZebTEC斑马鱼饲养系统(由Tecniplast制造)中，并采用12/12的光照方案和持续曝气。每日两次喂给斑马鱼专门饮食。在实验期间，在实验前一天晚上和实验结束后当天晚上给鱼喂食。所有涉及动物的程序均根据欧洲(欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的指令 2010/63/EU)和俄罗斯(“用于实验室动物的维护和护理的GOST33216-2014 指南。用于实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。
3.1.2.物质、剂量和施用
地西泮
地西泮是一种苯二氮卓类抗焦虑药，其通过与GABA-A受体(Cl-通道) 的苯二氮卓位点结合、延长它们的开放状态而发挥作用。因此，在低剂量下，已显示地西泮产生抗焦虑作用，而在高剂量下，其能导致强烈的镇静作用。在所述实验中，地西泮以1.25mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的剂量施用。
氟伏沙明
氟伏沙明，代表选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)组的一种已知抗抑郁药，以5mg/kg和10mg/kg的剂量施用给斑马鱼。
β-酪啡肽-7(BCM-7)
BCM-7是牛乳β-酪蛋白的片段(H-YPFPGPI-OH(SEQ ID NO：34)； IUPAC：L-酪氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-异亮氨酸(L-tyrosyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-prolyl-glycyl-L-prolyl-L-isoleucine))。 BCM-7已知具有阿片活性(例如镇痛和抗焦虑活性)，主要通过mu-阿片受体起作用(KamińskiS.,et al.(2007)Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on humanhealth.J.Appl.Genet.48:189–198)。BCM-7在本研究中以5mg/kg的剂量施用。
α-Casozepine-10(ACZ-10)
ACZ-10是牛乳α-酪蛋白的片段(H-YLGYLEQLLR-OH(SEQ ID NO：35)；IUPAC：L-酪氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酰-L-α-谷氨酰-L- 谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酸 (L-tyrosyl-L-leucyl-glycyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-alpha-glutamyl-L-glutaminyl-L -leucyl-L-leucyl-L-arginine))。根据Miclo et al.,2001(Miclo(2001)Characterization of alpha-casozepine,a tryptic peptide from bovine alpha(s1)-casein with benzodiazepine-like activity.FASEB J.15:1780–2)， ACZ-10显示出苯二氮卓样活性，这归因于其三维结构使其与GABA-A受体的苯二氮卓位点结合。ACZ-10在本研究中以0.6mg/kg的剂量施用。
创造性的四肽
在两个剂量水平–1mg/kg和10mg/kg下测试了四种选定的GABA-A 苯二氮卓位点的四肽配体。所述肽具有以下一级结构：FQSE(SEQ ID NO： 10)、DKTE(SEQ ID NO：26)、WDQV(SEQ ID NO：14)和FLPY(SEQ ID NO：36)。在这些肽中，FQSE(SEQ ID NO：10)、DKTE(SEQ IDNO： 26)和WDQV(SEQ ID NO：14)是示例性四肽，而FLPY(SEQ ID NO： 36)是阴性对照。
施用
在试验前10分钟使用胰岛素注射器(0.5ml，30g)将测试物质腹膜内(ip)注射到斑马鱼中。使用盐水溶液(0.9％NaCl)作为溶剂。通过将动物置于10℃的水中来完成麻醉和固定。对照组鱼也在经过预冷却程序后腹腔注射等体积溶剂。
3.1.3.设备设置
在4升梯形水族箱中进行旷场试验，其参数显示在图2中。水族箱的底面、背墙和侧壁由哑光黑色塑料制成；前板(较矮的壁)由透明Plexiglas制成。明/暗偏好试验的设置由三个主要部分组成：一个启动区室(launch compartment)、一个由白色塑料制成的明区室和一个由黑色塑料制成的暗区室。安装参数显示在图3中。这些试验中的灯光照明(brightlighting)是由安装在水族箱上部的支架上的灯(LED灯PL，11W，光通量≈600Lm，水面正上方约500Lx)提供的。
使用具有可移除隔板的Plexiglas容器(如图4所示)作为研究斑马鱼群聚行为的装置。将5只成年Danio rerio样本的鱼群放入小区室中；并将试验鱼放入大区室中。这个装置中的散射照明(diffused lighting)由房间的通常照明(约200Lx)提供。
3.1.4.行为试验
3.1.4.1.旷场试验
如Maximinoetal.,2013中所述地进行旷场试验。在将斑马鱼放入试验水族箱之前20-30秒开始视频记录(背景拍摄)。使用网将实验斑马鱼放入旷场(“OF”)水族箱中。录制进行五分钟。使用EthoVision XT软件包(Noldus) 进行试验。软件记录了动物覆盖的距离、其速度、探访水族馆三个常规区域：“底部(bottom)”、“中央(center)”和“中部(middle)”(分别为水族箱的下、中和上三分之一)的次数、在这些区域度过的时间以及探访水族箱中部和表面的潜伏。
3.1.4.2.群聚行为试验
如Parkeretal.,2014.(Parker et al.(2014)The utility of zebrafish tostudy the mechanisms by which ethanol affects social behavior and anxietyduring early brain development.Prog.Neuro-PsychopharmacologyBiol.Psychiatry.94-100) 所述，进行群聚行为试验。将斑马鱼放入设置的同时开始视频录制并录制5 分钟。使用RealTimer(OpenScience Ltd.,Moskow,Russia)处理视频。在处理记录的过程中，记录了水族箱壁三个常规区域(靠近“鱼群”，水族箱中部，和靠近对侧；三者尺寸相等)的停留时间和探访次数。
3.1.4.3.明/暗箱试验
如Maximino et al.,2011所述，进行明/暗箱(LDB)试验。使用网将斑马鱼放入LDB的明区室中，同时打开相机，并记录斑马鱼的行为5分钟。视频使用RealTimer(OpenScience)进行处理。在记录的处理过程中，记录下试验设置的明和暗区室的停留时间和探访次数，以及探访两个区室的潜伏期。
3.1.5.数据分析
使用STATISTICA平台评估在行为试验期间获得的数据。数据的统计处理和结果的可视化表示的构建(包括图表)均在Graph Pad Prism 6中进行。
使用Kolmogorov-Smirnov正态性检验，来评估获得的数据分布的正态性。使用非参数检验(Mann-Whitney检验)来比较分布不符合正态分布的参数。配对检验的使用是有效的，因为针对每种物质均记录了配对对照。使用非参数Kruskal-Wallis检验进行多重比较，而后者根据Dunn多重比较检验进行。结果以平均值(average/mean)的形式显示在图形上，且分布(spread) 表示为平均值的标准误差。
3.2.评估测试物质对斑马鱼行为的影响
3.2.1.地西泮
在旨在评估地西泮对斑马鱼行为的影响的实验期间，发现与对照动物相比，1.25mg/kg、5mg/kg和10mg/kg(ip)剂量的地西泮改变了所处理的斑马鱼的行为。在1.25mg/kg的剂量下，检测到在“鱼群”附近的区室度过的时间在统计学上显著减少(图1A)，而其他行为参数没有变化。注射5mg/kg 剂量的地西泮引起了远更显著的行为作用：实验斑马鱼在“鱼群”对侧的壁附近的区室度过的时间增加(图1B)。在光室中度过的时间也显著增加(图1C)。未显示地西泮在旷场试验中对斑马鱼行为有作用(影响)。
10mg/kg剂量的地西泮导致明/暗箱中明和暗区室之间的转换次数增加 (图5A)以及第一次退回明/暗箱的光室的时间(潜伏期)减少(图5B)。在高剂量地西泮的作用下，斑马鱼往往在旷场试验期间覆盖较少的距离(图 5C)。
3.2.2.氟伏沙明
5mg/kg和10mg/kg剂量水平的氟伏沙明在OFT导致了经处理的斑马鱼的行为变化，但在“鱼群”和光/暗箱试验中未导致。在两个剂量下，氟伏沙明均导致在旷场的水族箱表面度过的时间在统计学上显著增加(图6A和 6B)。在光下度过的时间在5mg/kg剂量下增加了约6.8倍，且在10mg/kg 剂量下增加了约7.2倍。
3.2.3.α-Casozepine-10(ACZ-10)
证明了与对照组相比，接受ACZ-10腹膜内注射的斑马鱼在群聚区室内度过的时间在统计学上显著减少(图7A)，以及在旷场试验中在水面的停留时间增加了约两倍(图7B)。
3.2.4.β-酪啡肽-7(BCM-7)
如图8A和8B所示，与对照组相比，接受腹膜内注射5mg/kg剂量的β- 酪啡肽(BCM-7)的斑马鱼显示在“鱼群”试验中在其样本附近度过的时间减少，且行进长度略有增加(Mann-Whitney U-检验中趋向于显著差异，p≈ 0.07)。
3.2.5.测试物质对斑马鱼行为的影响的比较
在进行的实验中，显示仅BCM-7影响实验斑马鱼平均覆盖的距离。平均覆盖距离参数反映了整体自主活动，并且在一定程度上反映了所测斑马鱼的身体状况。但是地西泮、氟伏沙明和ACZ-10对实验斑马鱼平均覆盖的距离没有表现出任何显著影响。与相应的对照组相比，或在连续的对照组之间没有观察到变化，如图9所示。
本文所述的实验说明，地西泮作为苯二氮卓类抗焦虑药的典型代表，在 1.25mg/kg剂量下降低了群聚反射，并在5mg/kg剂量下降低了群聚反射和明/暗箱中scototaxis的严重程度。这表明用地西泮处理的鱼在所述实验环境中的焦虑水平降低。10mg/kg剂量的地西泮，除了在明/暗箱中的抗焦虑作用外，还导致轻微的镇静作用，这表现为在旷场试验中运动活动下降的趋势。这些结果与描述苯二氮卓类抗焦虑药的类似作用的其他研究中获得的结果一致(Gebauer et al.(2011)Effects of anxiolytics in zebrafish:similarities and differences between benzodiazepines,buspirone andethanol.Pharmacol. Biochem.Behav.99:480-486；Bencan(2009).Buspirone,chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety.Pharmacol.Biochem.Behav., 94(1):75-80；Giacomini et al.,(2016)Fluoxetine anddiazepam acutely modulate stress induced behavior.Behav.Brain Res.296)。
此外，在所述实验中，在单次腹膜内注射后观察到ACZ-10和BCM-7 肽对斑马鱼行为的抗焦虑和正向亲神经作用。发明人发现了斑马鱼行为的变化，这表明神经肽能够在对各种焦虑-抑郁症产生亲神经作用。值得注意的是， ACZ-10(更作为抗焦虑药而知名)的功效特征与氟伏沙明而非地西泮的特征更接近。同时，BCM-7仅表现出中等的抗焦虑功效。这些结果表明，斑马鱼是在各种焦虑-抑郁症内筛选新药的亲神经作用的合适模型，其中新药不仅限于小分子，还可以包括肽(例如，寡肽)。
3.2.6.FQSE(SEQ ID NO：10)四肽
在1mg/kg和10mg/kg剂量下对FQSE(SEQ ID NO：10)肽进行研究。在所述实验中，在10mg/kg剂量下观察到最显著的斑马鱼行为的变化。因此，如图10A所示，在旷场试验中，显示斑马鱼在水族箱上部(即靠近表面和中部，而不是在底部)度过的时间在统计学上显著增加。相同的试验在斑马鱼试验组中显示离开底部的潜伏期明显减少，如图10B所示。这个结果显示，暴露于10mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)肽作用下的斑马鱼的焦虑降低。如在本文所述的氟伏沙明实验中观察到的，对斑马鱼进行旷场试验的结果是氟伏沙明活性的良好指示。因此，在旷场试验中观察到的FQSE(SEQ ID NO：10)的作用可以解释为FQSE(SEQ IDNO：10)抗抑郁作用的指示。
如图11A和11B所示，与其他测试物质(ACZ-10和氟伏沙明)相比， 10mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)与ACZ-10(0.6mg/kg)相比更有效，其不影响在上层水体(upper watercolumn)中度过的时间，尽管它显著减少了离开试验水族箱底部时的LP量。与氟伏沙明(5mg/kg)相比，FQSE (SEQ ID NO：10)的功效略低：随着离开底部的LP的同样降低(图11B)，FQSE(SEQ ID NO：10)使在上部度过的时间增加了35％，而氟伏沙明使其增加了80％以上。然而，在FQSE(SEQ ID NO：10)的作用下观察到显著的行为变化，类似于注射氟伏沙明引起的行为变化。
在明/暗盒(LDB)试验过程中，注射了高剂量FQSE(SEQ ID NO：10) 肽的鱼表现出在明区室中度过的时间在统计学上显著增加，且在暗区室中度过的时间减少(图12A和12B)。在5mg/kg剂量的苯二氮卓类抗焦虑药地西泮中观察到类似的作用(图13A和13B)。与对照组相比，注射了FQSE (SEQ ID NO：10)后在明区室中度过的时间相对增加了约140％，而注射地西泮(5mg/kg)导致增加约210％。与对照组相比，两组中在暗区室中度过的时间均减少了约40％。
Scototaxis(追求黑暗空间)的减少解释为焦虑的减少，因为这个参数受典型抗焦虑药地西泮的显著影响但完全不受氟伏沙明的影响。因此，10mg/kg 剂量的FQSE(SEQ IDNO：10)似乎具有明显的抗焦虑作用。
图14A和14B示出了FQSE(SEQ ID NO：10)在群聚试验中对斑马鱼行为的影响。群聚行为试验表明，在FQSE(SEQ ID NO：10)(10mg/kg) 的影响下，离开“鱼群”扇区(the sectorwith the“shoal”)的潜伏期(图 14B)减少，其伴随可见的在群聚区室外度过的时间延长的趋势(根据 Mann-Whitney U-检验，p＝0.054，图14A)。
图15A和15B示出了地西泮、BCM-7和FQSE(SEQ ID NO：10)肽在群聚试验中对斑马鱼行为的影响的比较。10mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO： 10)导致的离开“鱼群”的潜伏期的降低小于1.25mg/kg和5mg/kg剂量的地西泮导致的，并与BCM-7中的水平大约相同，其也没有显示对群聚区室外的时间有统计上的显著影响(图15B)。如前所述，由FQSE(SEQ ID NO：10)肽导致的“鱼群”外度过的时间增加只能认为是增加的趋势，而地西泮 (1.25mg/kg)则导致统计学上的显著变化(图15A)。群聚反射通常解释为保护机制，其表明在有天敌存在下、暴露于焦虑化合物或新环境时的焦虑增加。地西泮在这个试验中具有稳定的抗焦虑作用，因为其减少了离开“鱼群”的潜伏期(一条鱼很快适应并轻易地游离其同品系鱼(conspecifics))，并增加了在群聚区室外度过的时间。
图16A、16B、17A和17B示出了FQSE(SEQ ID NO：10)肽和氟伏沙明在旷场试验中对斑马鱼行为的影响的比较。观察到，在1mg/kg剂量下， FQSE(SEQ ID NO：10)肽在旷场试验中是有效的，在统计学上增加了在水面附近度过的时间(图16A)和来到水面的潜伏期(图17A)。此外，可以将低剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)的作用与10mg/kg剂量的氟伏沙明的作用进行比较(图16B和17B)，即，1mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO： 10)显示出稳定的抗抑郁作用。
图18示出了施用了以下测试物质的斑马鱼组在旷场试验中的平均轨迹长度：1.25mg/kg(“Diaz1.25”)、5mg/kg(“地西泮5”)和10mg/kg (“地西泮10”)剂量的地西泮以及相应对照组(“对照-diaz1.25”、“对照-diaz5”、“对照-diaz10”)；5mg/kg(“氟伏沙明5”)和10mg/kg (“氟伏沙明10”)剂量的氟伏沙明以及相应对照组(“对照-fluv5”和“对照-fluv10”)；0.6mg/kg剂量的ACZ-10(“ACZ-100.6”)以及相应对照组(“对照-ACZ-100.6”)；5mg/kgBCM-7(“BCM-75”)以及相应对照组(“对照-BCM-75”)；1mg/kg和10mg/kg剂量的四肽FQSE(SEQ ID NO：10)(分别为“FQSE1”和“FQSE10”)以及相应对照组(“对照-FQSE 1”和“对照-FQSE10”)。图18示出了在1mg/kg剂量以及10mg/kg剂量下，FQSE(SEQ ID NO：10)对斑马鱼的运动活性没有显著影响，其也不引起旷场试验中覆盖的轨迹长度的变化。
这些实验说明，FQSE(SEQ ID NO：10)肽对斑马鱼行为具有复杂的抗焦虑和抗抑郁作用。FQSE(SEQ ID NO：10)的抗焦虑作用在明/暗箱试验中已经证明。在明/暗箱的明区室中度过的时间增加是焦虑减少的结果，其进一步由群聚反射的减少证实。还观察到FQSE(SEQ ID NO：10)在旷场试验中的抗抑郁作用。1mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)在旷场试验中表现出稳定的抗抑郁作用，而不改变斑马鱼在其他试验中的行为。
3.2.7.FLPY(SEQ ID NO：36)四肽
在所述实验中，FLPY(SEQ ID NO：36)四肽用作阴性对照。在两个 FLPY(SEQ IDNO：36)剂量–1mg/kg和10mg/kg下研究FLPY(SEQ ID NO：36)肽对斑马鱼行为的影响。如图19A、19B、19C、20A、20B和20C 所示，没有一个FLPY(SEQ ID NO：36)剂量引起试验斑马鱼基本行为参数的统计学显著变化。这证明了FLPY(SEQ ID NO：36)肽缺乏抗抑郁或抗焦虑作用。
3.2.8.DKTE(SEQ ID NO：26)四肽
在两个DKTE(SEQ ID NO：26)剂量–1mg/kg和10mg/kg下研究 DKTE(SEQ ID NO：26)肽对斑马鱼行为的作用。图21A、21B和21C示出了群聚试验中斑马鱼行为的参数。以1mg/kg的剂量向斑马鱼腹部注射 DKTE(SEQ ID NO：26)导致群聚反射降低，其表现为试验组斑马鱼在群聚区室对侧壁附近度过的时间在统计学上显著增加(图21A)，以及探访“鱼群”的潜伏期在统计学上显著增加(图21B)。这个组在群聚区室中度过的时间的减少是趋势水平(图21C)。
图22示出了旷场试验中探访水族箱底部的潜伏期。如图22所示，旷场试验表明，1mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO：26)肽导致试验斑马鱼探访水族箱底部的潜伏期增加。
图23示出了地西泮、FQSE(SEQ ID NO：10)肽和DKTE(SEQ ID NO： 26)肽在群聚试验中对斑马鱼行为的影响的比较。当比较1mg/kg剂量的 DKTE(SEQ ID NO：26)肽对群聚行为的影响与地西泮和FQSE(SEQ ID NO： 10)肽的影响时，观察到这个剂量的DKTE(SEQ IDNO：26)的作用与地西泮(1.25mg/kg)的作用相当，如图23所示。同时，还如图23所示，1mg/kgDKTE(SEQ ID NO：26)对群聚活动的影响高于10mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)，其在统计学上仅显示出活动增加的趋势。此外，鉴于DKTE (SEQ ID NO：26)肽在明/暗箱试验中未观察到功效以及DKTE(SEQ ID NO： 26)肽在旷场试验中的作用弱，可以得出结论，与FQSE(SEQ ID NO：10) 相比，1mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO：26)整体具有较弱的抗焦虑作用。
图24A和24B示出了1mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO：26)在旷场试验中的自主活动参数(轨迹长度和平均速度)。显示1mg/kg剂量的DKTE (SEQ ID NO：26)不影响这些运动活动参数。
图25A、25B和25C示出了向斑马鱼注射10mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO：26)后的斑马鱼行为参数。具体地，图25A显示了在表面附近度过的时间(在旷场中)，图25B显示了在明/暗箱的明区室中度过的时间，且图 25C显示了在群聚试验中测量的在群聚区室外度过的时间。如所示，腹膜内注射10mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO：26)不会导致旷场、明/暗箱和群聚试验中斑马鱼行为参数的任何统计学上的显著变化。这可能指示了对于 DKTE(SEQ IDNO：26)肽，10mg/kg的剂量超出了有效浓度范围。
如这些实验所示，1mg/kg剂量的DKTE(SEQ ID NO：26)肽在群聚试验中表现出抗焦虑活性。在这个剂量的DKTE(SEQ ID NO：26)的影响下，在群聚区室外度过的时间的减少可以与1.25mg/kg剂量的地西泮引起的相同参数的减少相比较。在旷场试验中，DKTE(SEQ IDNO：26)(1mg/kg) 导致轻微的抗抑郁作用，其表现为探访底部的潜伏期增加。10mg/kg剂量下的DKTE(SEQ ID NO：26)在任意试验中均未表现出任何行为影响。
3.2.9.WDQV(SEQ ID NO：14)四肽
在两个WDQV剂量–1mg/kg和10mg/kg下研究了WDQV(SEQ ID NO：14)肽对斑马鱼行为的影响。图26A、26B和26C示出了注射了1mg/kg 剂量的WDQV(SEQ ID NO：14)后的斑马鱼行为参数。如这些图所示，在 1mg/kg的剂量下，在全部三种行为试验–旷场、明/暗箱和群聚试验中均未观察到WDQV(SEQ ID NO：14)肽对鱼行为的显著影响。
图27A、27B、27C和27D示出了在明/暗箱试验中在注射了10mg/kg剂量的WDQV(SEQID NO：14)后的斑马鱼行为参数。如图27A和27C所示，在10mg/kg的剂量下，肽WDQV(SEQ IDNO：14)仅影响明/暗箱试验中的鱼行为。来自试验组的鱼表现出在明/暗箱的明区室中度过的时间增加，无论是试验全部5分钟期间的全部时间，还是从试验的第3分钟至第5 分钟。因此，在10mg/kg WDQV(SEQ ID NO：14)下，观察到在LDB的暗区室中度过的时间减少，无论是全部时间还是动态时间，如图27B和27D 所示。
图28A和28B示出了在明/暗盒试验中WDQV(SEQ ID NO：14)(10 mg/kg)的作用与地西泮(5mg/kg)和FQSE(SEQ ID NO：10)(10mg) 的比较。观察到WDQV(SEQ ID NO：14)肽具有与地西泮和FQSE(SEQ ID NO：10)相似的抗焦虑功效特征。
图29示出了在施用了以下测试物质的斑马鱼组在旷场试验中的平均轨迹长度：1.25mg/kg(“地西泮1.25”)、5mg/kg(“地西泮5”)和10mg/kg (“地西泮10”)剂量的地西泮以及相应对照组(“Contr-diaz1.25”、“对照-diaz5”、“对照-diaz10”)；5mg/kg(“氟伏沙明5”)和10mg/kg (“氟伏沙明10”)剂量的氟伏沙明以及相应对照组(“对照-fluv5”和“对照-fluv10”)；0.6mg/kg剂量的ACZ-10(“ACZ-100.6”)以及相应对照组(“对照-ACZ-10”)；BCM-7“BCM-75”以及相应对照组(“对照-BCM-7”)； 10mg/kg剂量的四肽WDQV(SEQ ID NO：14)(“WDQV 10”)以及相应对照组(“对照-WDQV 10”)。图29示出了在10mg/kg的剂量下，WDQV(SEQ ID NO：14)肽没有表现出任何行为作用，尤其是所述四肽在旷场试验中对运动活动没有影响。
这些实验证明，10mg/kg剂量的WDQV(SEQ ID NO：14)四肽在明/ 暗箱试验中表现出与注射地西泮(5mg/kg)和FQSE(SEQ ID NO：10)(10 mg/kg)后观察到的类似的抗焦虑作用。然而，其他试验未揭示WDQV(SEQ ID NO：14)肽(10mg/kg)对斑马鱼的行为有任何作用。在1mg/kg的剂量下，WDQV(SEQ ID NO：14)对斑马鱼行为也没有任何显著作用。总之，可以得出结论，WDQV(SEQ ID NO：14)具有正向亲神经作用，尽管与地西泮和FQSE(SEQ ID NO：10)四肽相比较不明显，后两者均显示出更广泛的行为作用。
实施例4：FQSE(SEQ ID NO：10)肽在小鼠中的亲神经活性的测定
这个实验的目的是鉴定不同剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)肽在急性腹膜内注射后对BALB/C小鼠行为的潜在亲神经作用。将施用FQSE(SEQ ID NO：10)肽对BALB/C小鼠行为的影响与施用地西泮对BALB/C小鼠的影响进行比较。使用埋珠试验、高架十字迷宫试验、Porsolt游泳试验(两日修正)和旷场试验评估FQSE(SEQ ID NO：10)肽和地西泮对小鼠行为的影响。这些试验是用于测量动物模型中应激和焦虑相关行为以评估潜在抗抑郁药和抗焦虑药的有效性的技术。
在本研究中进行的实验中，对BALB/C小鼠进行旷场、高架十字迷宫和埋珠试验，以确定地西泮和FQSE(SEQ ID NO：10)肽对小鼠的抗焦虑作用。根据在旷场试验、高架十字迷宫试验和埋珠试验中获得的结果，向小鼠施用地西泮(通过腹腔注射)导致了显著的抗焦虑作用。这些发现证实，小鼠模型是用于测试与GABA-A受体结合的药物(包括肽)的作用的有效模型。此外，在本研究中，对BALB/C小鼠进行了Porsolt游泳试验(两日修正)，以确定地西泮和FQSE(SEQ ID NO：10)肽对小鼠的抗抑郁作用。1mg/kg 至20mg/kg剂量范围内的FQSE(SEQ ID NO：10)肽显示出抗抑郁作用。
4.1.材料与方法
4.1.1.动物模型
在本实施例中，79只雄性BALB/C小鼠用作受试者。实验开始时每个样本的体重在约18克至约20克之间。所有动物均不含物种特异性病原体(根据FELASA列表的SPF状态，2014)。将动物保持在可自由获得水和食物的条件下。房间装有空调(交换率不低于15r/h)，具有12h:12h明暗循环(上午09:00开灯)，气温20-24°±2℃(可能波动限制在每天不超过2℃)，湿度30-70％。在研究中，将小鼠分为六个不同的组，并按表1所示对各组施用测试物质。考虑到分组，试验之间的间隔为一天。所有涉及动物的程序均根据欧洲(欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的指令2010/63/EU)和俄罗斯(“用于实验室动物的维护和护理的GOST 33216-2014指南。用于实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。
表1：实验组
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在适应期后，将测试物质腹膜内注射到小鼠中。在注射后30分钟内测量行为参数。试验如下进行：第1天-旷场试验，第3天-高架十字迷宫试验，第5天–埋珠试验，第12-13天-Porsolt游泳(两日修正)试验。
4.1.2.统计学分析
对非正态分布的样品使用非参数标准(Manna-Whitney)或对正态分布的样品使用单向方差分析(ANOVA)后接Fisher'sLSD检验，来进行统计学数据分析。
4.1.3.旷场试验
在旷场试验中，装置为直径63cm的场地，由强光(500lux)(OpenScience, Russia)照亮。在5分钟的实验中测量以下参数：总距离(cm)、运动时间 (如果速度大于5cm/s)、不动(如果速度小于0.2cm/sec)、平均和最大速度，以及运动活动和“冻结”经历的次数。对场地的中央扇区记录了相同的一组参数，以及潜伏期和停留时间。通过视觉评估排便和用后肢直立(rearing，动物利用后肢直立起身)(File and Wardill(1975)Validity of head-dipping as a measure of exploration in a modified hole-board.Psychopharmacol.,44,53-59)。所述试验经设计测量运动和探索活动的水平。
4.1.4.高架十字迷宫试验
在高架十字迷宫试验中，试验场地包括在中间交叉的两个开臂(open arm)和两个闭臂(closed arm)。臂长为30cm，闭臂侧壁的高度为15cm。整个装置高出地面70cm。开臂具有约400lux的明亮均匀照度，且闭臂具有约30-40lux的照度。将小鼠放在迷宫四个臂的连接处(中央)，面向开臂。在实验的5分钟内通过EthoVision Noldus程序自动记录以下行为参数：总距离(cm)、运动时间(如果速度超过5cm/s)、不动(如果速度小于0.2cm/sec)、平均和最大速度，以及运动活动和“冻结”经历的次数。分别测量中央扇区、开臂和闭臂的相同一组参数以及潜伏期和停留时间。(由OpenScience,Russia 制造)。
4.1.5.埋珠试验
在埋珠试验中，装置是一个标准T3笼子(19cmx29cmx13cm)，填充有垫料(beddingmaterial)。标准玻璃珠(直径15mm，重5.2g，任意颜色)用于试验。二十颗珠子以4行，每行5个均匀地分布在表面上。将动物放在试验笼中30分钟。时间段结束时，将动物小心移出后，对超过三分之二被垫料覆盖的珠子进行计数。
4.1.6.Porsolt游泳试验(两日修正)
在Porsolt游泳试验中，在两天内进行了两次试验。装置是一个透明的圆筒，高30cm，直径10cm，装有水(温度约21-23℃)至25cm高度标记处。在第一天，将每只动物放入圆筒中10分钟。不记录行为参数。在第二天，将动物放入圆筒中5分钟。测量了以下参数：主动(所有四肢有力运动)和被动(后肢弱运动)游泳，以及不动(停止)的持续时间(Porsolt etal.(1977) Behavioral despair in mice:a primary screening test forantidepressants.Arch Int Pharmacodyn Ther.229(2):327-36)。每次试验后，将小鼠放入加热单元中晾干。
4.2.对测试物质抗焦虑作用的评估
以下试验用于评估不同剂量(1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg) 的肽的抗焦虑作用：第1天–旷场试验，第3天-高架十字迷宫试验，第 5天-埋珠试验。地西泮(0.75mg/kg)用作比较药物。在行为测试前30分钟以每1克动物体重10μl溶液的体积将所有物质腹膜内注射。
在动物模型中，焦虑状态可以定义为防御性(defensive)和探索性(exploratory)动机的冲突。因此，如果防御性动机占上风，则形成高度焦虑的情绪状态，且反之，如果探索性动机占上风，则可以得出动物情绪状态平静的结论。因此，药物的抗焦虑作用可以表现为防御性动机的减弱或探索性成分的加强，以及对这两种成分的综合多方向作用。通常，抗焦虑药的作用定义为防御性动机和探索性动机之间的冲突向后者转移。
4.2.1.使用旷场试验评估测试物质对小鼠行为的影响
旷场试验用于评估药物对运动(总距离)和探索性(用后肢直立、在中央的时间、中央进入)活动的初步影响。如图30所示，“地西泮”组的总距离(2542.2±179.77)显著高于对照组(1925.6±129.31)。在施用FQSE(SEQ ID NO：10)肽的全部四个组中均显示相似的趋势：FQSE 1mg/kg(2423± 133.81)、FQSE 5mg/kg(2464±124.67cm)、FQSE 10mg/kg(2441±185.97)， FQSE 20mg/kg(2478±100.41)。
图31和32显示了反映动物探索性活动的参数(分别是“用后肢直立次数”和“中央进入次数”)。在地西泮组中，与对照组(4.7±0.94)相比用后肢直立次数显著增加(10.8±2.1)，而地西泮和对照组之间的中央进入次数和动物在中央度过的时间没有显著差异。对于FQSE1mg/kg和FQSE 10 mg/kg组，与对照组相比，用后肢直立次数显著更高(分别为11.7±2.3和 11.7±3.6)。对于接受了1mg/kg和20mg/kg剂量的肽的动物，与对照组(5.3 ±1.44)相比，中央进入次数(分别为13.1±2.26和11.6±2.5)显著更高。
4.2.2.使用高架十字迷宫试验评估测试物质对小鼠行为的影响
在高架十字迷宫试验中鉴定了表征施用药物的抗焦虑作用的两组行为参数。第一组参数与动物的运动活动有关。这组包括以下参数：不动、测量的不移动的时间(秒)和总距离(以cm测量)。运动活动的整体增加可表明被动防御性动机成分的减少(即抗焦虑药作用)。图33显示了总距离参数。显示了与对照组(960±56)相比，地西泮组中的这个参数(1219±91.4)显著更高。以1mg/kg和20mg/kg的剂量注射FQSE(SEQ ID NO：10)肽也导致总距离增加(分别为1156±48.2和1290±30.5)，同时不动时间相对于对照值(57.7±7.05)减少(图34)(分别为36.6±3.97和30.1±3.07)。
第二组参数包括开臂时间(秒)(图35)、开臂进入次数(图36)、风险行为次数(用后肢直立和悬垂(dangle)事件的次数，如图37所示)和焦虑指数(图38)。使用以下公式计算焦虑指数(AI)：
AI＝100*(1-(开臂时间/总试验时间+开臂进入次数/进入总次数)/2)
在开臂度过的时间增加和焦虑指数的相关减少是探索性动机增加和焦虑减少的标准度量。这些观察结果表明了所述物质的抗焦虑作用。
根据本文所述试验的实验结果，腹膜内注射地西泮导致显著的抗焦虑作用：在响应地西泮施用的行为参数的分析过程中，显示地西泮组的“开臂时间”(67.4±18.43)、“开臂进入”(6.5±0.99)、“危险行为次数”(15±2.8) 与对照组(分别为23±8.12；3.5±0.81；7±2.3)相比显著更高，其导致地西泮组的“焦虑指数”(73±4.7％)与对照组(85±3.4％)相比在统计学上显著降低。
对于肽施用组观察到类似的结果。与对照组(23±8.12)相比，FQSE 20 mg/kg组的“开臂时间”(69.1±9.98)显著增加。与对照组(3.5±0.81；7±2.3) 相比，FQSE 1mg/kg(7.7±0.79；15±2.1)、FQSE 10mg/kg(6.5±1.07； 15±3.2)和FQSE 20mg/kg(6.9±0.79；16±2.1)的“开臂进入”和“风险行为次数”显著更高。因此，这些组中的动物的“焦虑指数”也低于对照值，并且在FQSE1mg/kg组中为72±2％；在FQSE10mg/kg组中为72±3.8％，在肽20mg/kg组中为69±3.3％。
4.2.3.使用埋珠试验评估测试物质对小鼠行为的影响
动物将位于实验区的闪亮珠子视为应激因素，这是一种必须埋藏在垫料中的负面刺激，因此小鼠不必与其有视觉和触觉接触。在30分钟的实验中在药物施用影响下的埋珠数减少(图39)表明，动物的焦虑水平降低。根据获得的数据，对照组中动物埋珠平均数为5.2±1.04，而地西泮组动物埋珠数显著较少-1.2±0.39。在以下组中也观察到埋珠数减少：FQSE 5mg/kg(1.9± 0.99)、FQSE 10mg/kg(2.6±0.877)和FQSE 20mg/kg(1.4±0.68)。
4.3.评估测试物质的抗抑郁作用
为了评估药物的抗抑郁作用，使用Porsolt游泳试验(两日修正)。这些行为试验是用于评估动物行为的抑郁成分和试验药物对其影响的主要方法。
4.3.1.Porsolt游泳试验(两日修正)
两日修正让动物在实验的第一天适应试验条件，并且这使对第二天的行为应答有更明智的评估。根据文献，不动时间(动物在“冻结”状态下度过的时间)越长，动物越抑郁。在药物影响下不动时间的显著减少表征了其表现出抗抑郁作用和调节抑郁样行为的能力。
根据本文所述实验的结果，腹膜内注射0.75mg/kg剂量的地西泮不会导致任何试验参数(主动和被动游泳的持续时间、不动时间)的变化(图40、 41、42)。相比之下，注射研究肽FQSE(SEQ ID NO：10)(图40)导致所有实验组的总不动时间减少：FQSE 1mg/kg(142±12.7)，FQSE 5mg/kg (115±15.4)、FQSE 10mg/kg(145±16.5)和FQSE 20mg/kg(144±10.2)，且这些结果与对照组(189±11.1)有显著差异。此外，对于FQSE 5mg/kg、 FQSE10mg/kg和FQSE 20mg/kg组，观察到与对照值(105±11.1)相比，被动游泳的持续时间增加(分别为151±12.5、162±12.1和143±14.6)。应注意的是，施用20mg/kg剂量的肽显著增加主动游泳(动物四肢同时移动时)时间至27±8.3sec，而对照组的平均值为5±2sec。
4.4.测试物质的抗焦虑样和抗抑郁样作用的比较
本公开的发明人基于在三种不同的行为试验(旷场试验、高架十字迷宫试验和埋珠试验)中获得的结果发现，在实验前30分钟腹膜内施用(单次注射)1mg/kg至20mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)肽导致显著的抗焦虑样作用。类似地，在行为试验前30分钟单次腹膜内注射0.75mg/kg剂量的地西泮给BALB/C小鼠导致了地西泮的显著抗焦虑样作用。
根据在旷场试验、高架十字迷宫试验和埋珠试验中获得的结果，施用地西泮(通过腹膜内注射)给小鼠导致了显著的抗焦虑样作用。这些发现与科学文献中的信息一致，证实了小鼠模型是用于测试药物(包括与GABA-A受体结合的肽)作用的有效模型。关于药物抗焦虑作用的结论基于以下数据：旷场试验中运动和探索活动增加；高架十字迷宫试验中，参数“开臂时间”、“开臂进入”和“风险行为”次数增加，以及“焦虑指数”参数降低；埋珠试验中的埋珠数减少。本研究中使用的所有肽剂量均导致旷场试验中动物运动活动的增加。观察到FQSE 1mg/kg和FQSE 20mg/kg试验组的探索活动(基于“开臂进入”参数)增加。高架十字迷宫试验显示，FQSE 1mg/kg、FQSE 10mg/kg和FQSE 20mg/kg组的“焦虑指数”参数降低。因此，基于在三种不同行为试验中获得的结果，可以得出结论，在实验前30分钟腹膜内施用1 mg/kg至20mg/kg剂量的所述肽产生了显著的抗焦虑样作用。
在本公开发明人进行的实验中，对BALB/C小鼠进行了Porsolt游泳试验 (两日修正)，以测定地西泮和FQSE(SEQ ID NO：10)肽对小鼠的抗抑郁作用。向BALB/C小鼠单次腹膜内注射0.75mg/kg剂量的地西泮未引起抗抑郁作用。然而，根据Porsolt游泳试验的结果，单次腹膜内注射1mg/kg至 20mg/kg剂量范围的FQSE(SEQ ID NO：10)肽显示出抗抑郁作用。此外，地西泮注射导致镇静副作用，而腹膜内注射1mg/kg至20mg/kg范围内所有剂量水平的FQSE(SEQ ID NO：10)肽均不会对CNS产生负面抑制作用。
实施例5：鼻内施用肽FQSE(SEQ ID NO：10)在对雄性Sprague Dawley 大鼠焦虑和 抑郁的行为试验中的作用
研究目的是评估对大鼠焦虑和抑郁的行为试验中肽的有效鼻内(i.n.)剂量。
5.1.材料与方法
5.1.1.动物
总共110只雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River,Wilmington,MA) 用于研究。初始将3-5只大鼠关在位于圆塔(Animal Care Systems,Inc, Centennial,CO)中的聚丙烯笼子中，所述圆塔位于温度和湿度受控并保持 12:12的明/暗循环(6AM开灯)的饲养所内。实验开始时大鼠重约250-350 gm，并且至少100日龄。在整个研究过程中可以随意获得食物和水。所有程序均由休斯顿大学动物护理和使用机构委员会根据美国国立卫生研究院指南批准。
5.1.2.药品和测试物(test article)
在无菌盐水中配制地西泮(DZ2.0,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA,2 mg/kg,IP)和克他命(Miller Veterinary Supply,Fort Worth,TX,10mg/kg,IP)。每个试验日在无菌盐水中新鲜制备五个剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)(0.01、 0.1、0.5、1和3mg/kg,CS,MenloPark,CA)并在实验前30分钟鼻内(i.n.) 施用。每个肽剂量每组测试15只大鼠，但媒介物(0)组中有20只大鼠。每个剂量以随机顺序在大鼠中施用。给药前，用异氟醚(2.5％，0.5L/min氧气) 轻微麻醉大鼠(直至丧失翻正反射)，将其置于卧位，然后将一根细塑料移液管(Fischer Scientific)插入鼻孔，并且将肽以每个鼻孔15-20μL的体积施用。进行行为试验的每个人对药物治疗不知情。
5.1.3.行为装置和试验程序
旷场(OF)
旷场试验在由灰色Plexiglas构成的旷场装置(17"Lx17"Wx12"H(43.2cmx43.2cmx30.5cm；Noldus,Leesburg,VA)中进行，其中数码相机位于场地上方以使用专门的软件(Ethovision,XT12)检测不同的活动量度。首先让大鼠在其家笼中适应试验房间30分钟。试验开始时将动物放在旷场室的中央并记录行为30分钟。试验期间观察者不在房间内。试验在红灯下进行。在受试者之间用LpH消毒剂彻底清洁场地。
高架十字迷宫(EPM)
首先让大鼠在其家笼中适应试验房间30分钟。在试验过程中，将一只大鼠放在由以下组成的迷宫中5分钟：两个开臂(长45cmx宽10cm)、两个闭臂(长45cmx宽10cmx高30cm)和一个中央区室(长4cmx宽4cm) 形成一个加号，位于地面上方50cm处。试验阶段以数字记录以供之后分析 (Ethovision，XT12)。所有试验均在红灯下进行。实验者在试验过程中通过行为试验房间门上设置的专门观察窗来观察大鼠。每只动物进行后，用LpH 消毒剂清洁装置。
强迫游泳试验(FST)
首先让大鼠在其家笼中适应试验房间30分钟。强制游泳试验使用 Plexiglas圆筒(宽10，高18)进行，其装有保持在约25℃的水。在第1天，通过将大鼠放入水中面向圆筒壁，来让大鼠首先习惯(15分钟)强制游泳装置。第二天进行强制游泳试验(5分钟)。活动由数码相机记录并用专用软件(Ethovision XT12)进行分析。
5.1.4.统计学分析
使用以药物剂量(0、0.01、0.1、0.5、1.0、3.0，地西泮2.0或克他命10 mg/kg)作为主要因素的1X7单向ANOVA，来分析旷场试验的中央区时间、中央区进入，EPM试验中的开臂时间％，以及FST中的不动和移动时间。使用Student-Newman-Keuls方法或Fisher’s最小显著差异(LSD)事后检验来进行成对多重比较程序。统计学显著性设定为P<0.05。
5.2.结果
OFT
施用不同药物剂量后的中央区时间如图43A所示。分析揭示了药物剂量的显著主要作用(P<0.05)。对不同药物剂量的中央区时间的事后多重比较表明，对照(90.9±11.6s)和两个FQSE(SEQ ID NO：10)剂量：0.5mg/kg (204.1±46.6s；P＝0.0017)和3mg/kg(166.2±18.4s；P＝0.038)的肽之间有显著差异。施用不同药物剂量后的中央区进入如图43B所示。分析揭示了药物剂量的显著主要作用(P<0.05)。对不同药物剂量的中央区进入的事后多重比较表明，媒介物(33.6±3.9)和四个试验组：0.01mg/kg(49.1±6.5； P＝0.048)、0.5mg/kg(54.2±8.3；P＝0.009)、3mg/kg(54.1±4.6；P＝0.011)、地西泮(54.3±6.2；P＝0.0089)之间有显著差异。施用不同药物剂量后的总距离(cm)如43C所示。分析揭示了药物剂量的显著主要作用(P<0.05)。 Fisher’sLSD事后检验在媒介物(4441±292cm)和两个试验组：0.5mg/kg (5338±316.2cm；P＝0.014)和地西泮(5289±263cm；P＝0.02)之间产生了显著差异。
EPM
EPM试验后的开臂时间百分比如图44所示。分析揭示了药物剂量的显著主要作用(P<0.05)。Fisher’s LSD事后检验显示，媒介物(6.1±1.4％)、两个试验组：0.01mg/kg(10.6±1.6％；P＝0.032)、0.5mg/kg(11.3±2.05％； P＝0.015)和地西泮(10.8±1.11％；P＝0.028)之间有显著差异。
FST
强迫游泳试验的不动结果如图45A所示。对不动量度的分析揭示了药物剂量的显著主要作用(P<0.001)。Fisher’s LSD事后检验表明，媒介物(231.1 ±7.99s)和两个药物剂量：0.5mg/kg(157.1±7.98s；P<0.0001)和克他命 10mg/kg(196.4±8.9s；P<0.008)之间有显著差异。与0.1mg/kg肽(238.1 ±9.19s；P＝0.003)相比，克他命也与不动显著降低相关。在任意其他试验剂量之间未观察到显著差异。移动(mobility)量度如图46B所示。对移动量度的分析揭示了药物剂量的显著主要作用(P<0.001)。Fisher’s LSD事后检验表明，0.5mg/kg(142.9±7.98s；P<0.0001)和媒介物(68.6±7.99s) 之间有显著差异。与媒介物(P＝0.008)和0.1mg/kg肽剂量(P＝0.0032)相比，施用克他命后的移动(103.6±8.9s)也更大。在任意其他试验剂量之间未观察到显著差异。
5.3.讨论
本研究解决了不同剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)四肽与施用地西泮或克他命相比的行为影响。
在OF中，发现FQSE(SEQ ID NO：10)处理导致行进距离增加(在 0.5mg/kg的剂量下)以及在中央度过的时间(在0.5和3mg/kg的剂量下) 和中央进入次数(在0.01、0.5、3mg/kg的剂量下)增加。OF试验中的动物行为反映了在新环境中探索性动机和恐惧之间的平衡。趋触性(thigmotaxis) 下降伴随运动增加表明，接受了FQSE(SEQ ID NO：10)的大鼠的焦虑减少。在0.5mg/kg的剂量下观察到最显著的肽效果，且其与地西泮的效果相当。所有剂量下的肽均不引起镇静。
在EPM中，观察到在以0.01和0.5mg/kg的剂量进行FQSE(SEQ ID NO： 10)处理后，在开臂度过的时间减少。EPM试验对于筛选抗焦虑药物具有强大的预测可信度。这个试验中FQSE(SEQ ID NO：10)处理的行为结果显示了所述肽在0.01和0.5mg/kg剂量下具有抗焦虑样活性。
FS试验是用于评估具有潜在抗抑郁样活性的药物的有效工具。在当前研究中，观察到在以0.5mg/kg的剂量施用FQSE(SEQ ID NO：10)后，不动度过的时间显著减少，且主动游泳度过的时间增加。这些变化与克他命处理后观察到的变化相似，并表明肽具有抗抑郁样作用。用其他剂量的肽处理的大鼠与接受盐水的动物没有差异。
5.4.结论
在当前研究中，使用高架十字迷宫和强迫游泳试验评估了不同剂量的 FQSE(SEQID NO：10)在旷场中对Sprague-Dawley大鼠行为的影响。施用FQSE(SEQ ID NO：10)后的行为变化部分重历了在OF和EPM试验中地西泮处理的大鼠和在FST的克他命处理的中观察到的结果。根据行为范式，在0.5mg/kg和0.01mg/kg剂量下可见最显著的肽的抗焦虑样和抗抑郁样作用。结果表明了FQSE(SEQ ID NO：10)的剂量依赖性活性，其在0.5mg/kg 的鼻内剂量下具有最大功效。
实施例6：FQSE(SEQ ID NO：10)肽在慢性轻度不可预测应激(CUMS)模型中的抗焦 虑和抗抑郁作用的研究
本研究的目的是研究CUMS模型中在慢性(chronic)鼻内施用后不同剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)肽的抗焦虑和抗抑郁潜力。
6.1.材料与方法
6.1.1.动物
实验中使用了110只来自Stolbovaya实验动物培育室的Wistar系雄性大鼠。按照生物实验室的要求(实验室动物法规和指南，莫斯科，2003年)，将动物保持在标准下。使用环保硬木刨花作为垫料(TU 5313-001-1897639-92)。大鼠可以自由获取食物和水。日光模拟持续时间为7:00至19:00，且光照时间期间的照度为70-90lux。永久保藏室(permanentholding room)的温度为24℃。所有涉及动物的程序均根据欧洲(欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的指令2010/63/EU) 和俄罗斯(“用于实验室动物的维护和护理的GOST 33216-2014指南。用于实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。
所有动物实验均根据实验动物的人道待遇规则进行。对于这个实验，执行以下指示的要求：来自2003年6月19日“俄罗斯联邦实验室实践规则”的指示MZ RF 267、“新药理学物质实验(临床前)研究手册”2005年(第二版)以及“育儿室和实验生物实验室(VivariumsA)中实验动物的维护和繁殖及其出于科学、教育和工业目的用途的指南”，M.,2003。
运送至动物饲养所后，在实验开始前将动物隔离2周(适应期)。
6.1.2.实验方案
实验方案如图46所示。在实验开始时，将动物放在单独单元中进行蔗糖偏好试验，并确定用于消除蔗糖偏好指数低于65％(SP1)的动物的快感缺乏水平。
将符合所选标准的动物分成天然对照组(n＝10)和经受慢性轻度不可预测应激(CUMS)的组(n＝52)。
6.1.3.应激方案
在应激期间，将动物放在单独单元中并每天暴露于应激条件下，持续26 天。每天使用两个应激源，按以下顺序使用：
第1天：10am-6pm，将大鼠放在冷室中一小时。从6PM至10am，灯每2小时开关一次。
第2天：10am-6pm，笼子倾斜至45°。从6PM至10am断水。
第3天：10am-6pm，频闪灯。从6PM至10am，灯亮着过夜。
第4天：10am-6pm，湿垫料。从6PM至10am，将动物放入小的鼠笼中。
第5天：10am-6pm，无垫料。从6PM至10am，灯每2小时开关一次。
第6天：10am-6pm，将一只新大鼠放入笼中(6月龄)。从6PM至 10am，灯亮过夜。
第7天：10am-6pm，白噪声。从6PM至10am，频闪灯亮过夜。
第8-26天：以指定顺序重复之前使用过的应激源。
在应激程序之后，重新测试动物的蔗糖偏好(SP2)以评估应激的有效性并鉴定表现出快感缺乏迹象的大鼠。作为评估的结果，1只大鼠由于蔗糖偏好值低(<65％)而排除在天然对照组之外。选择40只动物作为实验组。
6.1.4.实验组
将所有选定的动物分成以下组：1)“CUMS+媒介物”，其中10只雄性接受生理盐水i.n.2)“CUMS+0.05”，其中对10只雄性i.n.施用0.05mg/kg 溶解在盐水中的实验药物，3)“CUMS+0.5”，其中对10只雄性i.n.施用0.5 mg/kg溶解在盐水中的实验药物，4)“CUMS+Diaz”，其中对10只雄性施用0.5mg/kg/i.p.的地西泮，和5)“对照”，其中对9只雄性腹膜内和鼻内施用盐水。从实验的第58-59天开始每天施用实验物质。施用发生在行为试验开始前30分钟。在没有试验的日子里，在早上施用物质。
表2：至行为试验开始，所研究物质的注射次数
试验 肽注射次数
高架十字迷宫(第58-59天) 1
社交互动(第61-62天) 4
雌性尿液嗅探试验(第65-66天) 8
新奇抑制摄食(第68-69天) 11
蔗糖偏好(第73-75天) 16
Porsolt强迫游泳试验(第75-76天) 18
收集脑样品(实验结束，第79-80天) 22
6.1.5.行为试验
蔗糖偏好试验(SPT)
使用试验来确定对蔗糖溶液的偏好以评估快感缺乏(拒绝愉悦，抑郁症的关键症状)的状态。向动物提供2个饮水器24小时，可自由接触它们。一个仅含有水，另一个含有1％蔗糖溶液。试验前一天晚上给大鼠提供2％蔗糖溶液2小时。在试验期间，调换饮水器以避免产生位置偏好。将饮水器预先称重，并根据质量差计算消耗的液体体积。测量的参数包括普通水、甜水的体积和消耗的液体总体积。偏好指数使用以下公式计算：
消耗的甜水体积*100％/消耗的液体总体积。
高架十字迷宫试验(EPM)
高架十字迷宫试验用于评估实验室动物的焦虑、运动和探索活动的水平。装置由彼此相对的两个闭臂和两个开臂(臂长45cm)组成，闭臂侧面高度为10cm。整个装置置于高出地面70cm的平台上。将大鼠放在迷宫中央，使它们的头朝向开臂。记录下5分钟内退回(exitto)开臂的次数和在其中度过的时间、在臂之间的转换次数、休息时间、梳理动作的持续时间和次数、伸展进入迷宫开臂的姿势的次数以及用后肢直立的次数。通常，啮齿动物倾向于呆在暗臂中。药物抗焦虑作用的一个重要指标是退回迷宫开臂的次数和持续时间增加。
社交互动试验(SI)
为了评估动物的社交活动和抑郁状态，使用评估啮齿动物社交互动的试验。在试验中，将一只1月龄的幼雄性放入家笼中。记录下10分钟内与幼雄性社交接触的持续时间和次数以及恐吓和攻击性接触的次数。社会接触被认为是跟随和嗅探幼雄性等的反应(Vishnivetskaya et al.(2007).Effect of MAO A deficiency on different kinds ofaggression and social investigation in mice. Aggress.Behav.33(1),1-6)。通常，幼雄性不会对成年大鼠构成任何危险，因此处于平静状态的大鼠表现出相当高的社交互动指标和低攻击性。攻击性的迹象是行为偏差的结果，且社会接触减少可以表明存在抑郁行为。
新奇抑制摄食试验(NSFT)
为了评估焦虑和食物动机，使用了新环境中的饮食行为试验。在这个试验中，将先前已经历禁食(food deprivation)24小时的实验动物放在方形场地(50x50x40cm)中5分钟(Jiao et al.(2019).Influence of Xiaoyaosan on depressive-like behaviors inchronic stress-depressed rats through regulating tryptophan metabolism in hippocampus.Neuropsych.Dis.Treat.15,21)。将一个零食(一个食物颗粒)放在场地的明亮照明中央。记录下开始进食的时间和进食的持续时间。由于啮齿动物害怕开放照明空间，这个试验用于评估焦虑水平。表现出高焦虑水平的动物通常不会接近零食。抗焦虑药物显著减少开始进食的时间。慢性施用抗抑郁药还导致这个试验中开始进食的潜伏期减少。
雌性尿液嗅探试验(FUST)
FUST试验用于评估与啮齿动物抑郁状况相关的快感缺失、性动机和探索行为(Gouldetal.(2009).Mood and anxiety related phenotypes in mice. Humana Press)。试验在含垫料的笼子中在昏暗光线(3lux)下进行。在实验的第一阶段，将蒸馏水润湿的棉签提供给动物3分钟。记录下接近棉签的潜伏期、嗅探时间和次数。休息45分钟后，向大鼠提供用同系雌性发情期尿液润湿的棉签。也记录下接近棉签的潜伏期、嗅探时间和次数。为了确定偏好，使用以下公式计算指数：嗅探尿液所用的时间*100％/总嗅探时间。成熟雄性对有雌性尿液的棉签表现出高度兴趣，表现出很高的性动机。这表现为接触润湿棉签的潜伏期减少和互动持续时间更长。同时，与棉签的低互动率可表明探索行为受到干扰和快感缺乏的发展——这是临床抑郁症的主要症状。
Porsolt游泳试验
强迫游泳试验是用于评估抗抑郁药物、新化合物的抗抑郁功效以及旨在致使或防止抑郁样状态的实验操作的啮齿动物行为试验。在试验期间，将每只动物放在装有水(温度24℃)至30cm的圆筒中8分钟。筒直径为31cm 且高度为40cm。在最后6分钟，记录下主动(四肢有力运动)和被动(后肢弱划水)游泳的持续时间和不动的持续时间。不动参数反映了动物绝望和拒绝尝试逃离实验装置的状态。这可以反映临床抑郁症中出现的冷漠和运动迟缓的状态。
6.1.6.统计学分析
使用Shapiro-Wilk标准来检查数据分布，并基于此来选择参数或非参数统计学比较标准。
使用ANOVA方差分析和Tukey多重比较标准的事后分析，进行站立次数(number ofstands)、社交互动时间、雌性尿液偏好指数和蔗糖偏好呈正态分布的情况下的参数分析。使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验的事后分析来进行非参数分析(在非正态分布的情况下)。p<0.05时认为差异是显著的。
6.2.结果
6.2.1.EPM
进行试验以确定大鼠的焦虑水平，其在具有抑郁样表型的动物中可增加。
使用Shapiro-Wilk检验的正态性检验未证明数据在组中的正态分布，因此将使用非参数标准来评估结果。使用Kruskal-Wallis标准的结果揭示了处理因子(H(4,N＝49)＝21.5；p＝0.0002)对在开臂度过的时间有显著影响。显示了与对照组相比，“CUMS+veh”组的动物中这个参数显著降低(p＝0.04)，这表明了焦虑表型的发展(图47A)。对照和肽处理的动物之间没有差异，这表明了应激水平的正常化。0.05mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)与媒介物处理相比也显示出这个参数增加的趋势(p＝0.07)，这可以表明所述肽具有温和的抗焦虑作用。与用溶剂(p＝0.0001)和两个剂量的所述肽(与 FQSE(SEQ ID NO:10)0.05相比p＝0.05，且与FQSE(SEQ ID NO：10) 0.5相比p＝0.009)处理的应激动物相比，慢性应激后用地西泮处理的动物在开臂度过的时间增加(图47A)，这反映了其强大的抗焦虑作用。
此外，处理(H(4,N＝49)＝12.6；p＝0.013)对EPM试验中的冻结时间有显著的主要影响。仅在用地西泮处理的动物中观察到冻结增加(与对照组相比p＝0.006)(图47B)，这可能是药物强镇静作用的结果。
6.2.2.SI
社交互动试验表明大鼠对社交接触的兴趣，其在抑郁样状态下可减少。
使用Shapiro-Wilk检验的正态性检验证实了正态分布，并且因此将使用参数标准来评估结果。单向ANOVA揭示了处理(F(4,44)＝7.5；p＝0.0001) 对社交接触时间的显著影响。通过使用Tukey检验对各组进行多重成对比较，观察到与对照非应激大鼠相比，接受了溶剂(p＝0.0002)、地西泮(p＝0.01) 和0.5mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO:10)(p＝0.007)的应激动物组的社交接触持续时间显著减少。虽然接受了0.05mg/kg剂量的肽的动物与对照动物在这个参数上没有差异，但与CUMS+veh组相比，社交接触持续时间显著更高(p＝0.01)(图48)。
6.2.3.FUST
正态性检验证实了正态分布，因此将使用参数标准来评估结果。单向 ANOVA显示处理(F(4,44)＝5,8073；p＝0.0007)对雌性尿液偏好指数有显著影响。事后分析显示，接受了溶剂的应激动物组与对照组相比减少(p＝0.03)。与经历了应激并接受了媒介物的动物相比，施用0.05和0.5mg/kg剂量的肽导致大鼠对雌性尿液的偏好增加(p＝0.003和p＝0.001)(图49)。在这个试验中，地西泮对动物行为没有影响。
6.2.4.NSFT
进行NSFT试验以确定大鼠的焦虑水平。
使用Kaplan-Meyer乘数估计(Kaplan—Meyer multiplier estimates)来评估开始进食的潜伏期，其考虑了删失变量(censored variables)。所得曲线如图50所示。
卡方标准的使用揭示了各组之间的显著差异(Chisq＝12.1；df＝4； p＝0.01)。使用Cox-Mantel检验对各组进行比较。显示了慢性应激不会导致接近食物的潜伏期增加(F(6,8)＝1.3，与对照组相比p＝0.35)。应当注意的是，在对照组中，超过60％的动物没有接近食物，这归因于这个试验中的高应激水平。与对照和CUMS+veh.组相比，地西泮的引入导致潜伏期显著降低 (分别为F(6,14)＝3.5，p＝0.02，和F(8,14)＝3.2，p＝0.02)。在接受了0.05mg/kg 剂量的肽的大鼠组中观察到相似的效果；观察到与对照和CUMS+veh.组相比，时间显著增加(F(6,16)＝4.2，p＝0.009，和F(8,16)＝3.71p＝0.01)。接受了0.5mg/mg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)的动物与对照组和接受了盐水的应激动物没有区别。
6.2.5.SPT
这个试验表征了经历慢性应激的动物的快感缺乏程度。
使用Shapiro-Wilk检验的正态性检验未证实正态分布，因此将使用非参数标准来评估结果。Kruskal-Wallis的结果显示处理因子对蔗糖偏好指数有显著影响(H(4,N＝49)＝11.8；p＝0.018)。经历应激并接受了溶剂的动物的指数显著低于对照动物(p＝0.017)。与对照或CUMS+veh组相比，接受地西泮和肽的受应激动物没有显示显著变化(图51)。
6.2.6.FST
用于评估物质的有效抗抑郁活性的一种广泛使用的试验。
使用Shapiro-Wilk检验的正态性检验未确认正态分布，因此将使用非参数标准来评估结果。Kruskal-Wallis检验的结果揭示了处理对不动时间的显著影响(H(4,N＝49)＝12.2，p＝0.01)。观察到与对照组相比，CUMS+veh组的不动显著增加(p＝0.04)。与CUMS+veh.组相比，0.5mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)在这个试验中显著减少了不动时间(p＝0.03)(图52)。0.05mg/kg 剂量的地西泮和肽与对照或接受盐水的应激组没有差异。
6.3.讨论
慢性应激模型导致在所有使用的行为试验中观察到的持续性抑郁样病况的发展。施用0.5mg/kg剂量的地西泮在EPM和NSFT试验中仅产生抗焦虑作用，并且在抑郁样病况的试验中对动物行为没有影响(表3)。
所研究的实验药物在Porsolt试验、社交互动试验中具有抗抑郁样作用，并且在雌性尿液偏好试验中影响快感缺乏水平。两个剂量的肽都具有抗抑郁样作用，但在所有行为试验中并非如此。在FUST试验中，在所述肽的两个剂量观察到最显著效果。在第4次注射后观察到FQSE(SEQ ID NO：10) 的抗抑郁作用。
在0.05mg/kg的剂量下，FQSE(SEQ ID NO：10)在NSFT中具有抗焦虑样作用。应当注意的是，在这个试验中，在慢性施用临床上使用的抗抑郁药选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)后观察到抗焦虑作用。
6.4.结论
这种不可预测慢性应激模型导致大鼠持续抑郁状态的发展。
地西泮的施用具有显著的抗焦虑和镇静作用。
0.05和0.5mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)在多种行为试验中具有抗抑郁样作用。
0.05mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)在NSFT中表现出抗焦虑作用，并在EPM中表现出轻微的抗焦虑样作用，而没有镇静迹象。
表3：引入所研究的物质后在慢性应激模型中获得的结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实施例7：FQSE(SEQ ID NO：10)在创伤后应激疾病(PTSD)动物模型中的作用
迄今为止，目前还没有针对PTSD的有效治疗：PTSD的一线治疗包括 SSRI，然而医学研究所的报告得出结论认为，现有证据不足以支持SSRI或其他药物疗法在PTSD中的疗效(Treatment of posttraumatic stress disorder:An assessment of theevidence.Washington,DC:National Academies Press.Institute of Medicine；2008)。显然，针对焦虑症的新药物治疗的发现代表了巨大的未满足的医疗需求。
研究目的是评估FQSE(SEQ ID NO：10)肽在PTSD模型中的作用。
7.1.材料与方法
7.1.1.动物和住所
总共120只雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River,Wilmington,MA) 用于研究。初始将3-5只大鼠关在位于圆塔(Animal Care Systems,Inc, Centennial,CO)中的聚丙烯笼子中，所述圆塔位于温度和湿度受控并保持 12:12的明/暗循环(6AM开灯)的饲养所内。实验开始时大鼠重约250-350 gm，并且至少100日龄。在整个研究过程中可以随意获得食物和水。所有程序均由休斯顿大学动物护理和使用机构委员会根据美国国立卫生研究院指南批准。
7.1.2.动物和住所
在无菌盐水中制备多沙唑嗪(DOX,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA, 1mg/kg,IP)。先前已经表明，DOX可有效治疗退伍军人的一些PTSD症状 (Rodgman et al.(2016).Doxazosin XL reduces symptoms of posttraumatic stress disorder in veteranswith PTSD:a pilot clinical trial.J.Clin.Psychiat., 77(5),e561-565)。
每个试验日在无菌盐水中新鲜制备两个剂量的FQSE(SEQ ID NO：10) (0.05和0.5mg/kg,CS,Menlo Park,CA)，并在试验前30分钟鼻内施用。在各组之间以随机顺序施用每个剂量。给药前，用异氟醚(2.5％，0.5L/min 氧气)轻微麻醉大鼠(直到失去翻正反射)，将其置于卧位，然后将一根细塑料移液管(Fischer Scientific)插入鼻孔，且肽以每个鼻孔15-20μL的体积施用。使用与异氟醚相同的程序来施用多沙唑嗪，但通过IP施用药物。进行行为试验的个体对药物治疗是不知情的。
7.1.3.行为装置和试验程序
捕食者气味应激暴露和条件性位置厌恶方案基于先前发表的研究 (Edwards etal.(2013).Traumatic stress reactivity promotes excessive alcohol drinking andalters the balance of prefrontal cortex-amygdala activity.Transl. Psychiatry,3(8),e296；Roltsch et al.(2014).Predator odor stress alters corticotropin-releasing factor-1 receptor(CRF1R)-dependent behaviors in rats.Neuropharmacology,79,83-89；Whitaker et al.(2015).Blunted hypothalamo-pituitary adrenal axis response to predator odor predicts high stressreactivity.Physiol.Behav.,147,16-22)。使用由视觉(墙壁颜色)和触觉(地板纹理)提示都不同并由一个较小中间区室(5x8x11in)连接的两个区室(8x8x11in)组成的位置调节装置(place conditioning apparatus，MED Associates,Fairfax,VT)，使大鼠暴露于无气味(无菌盐水)或捕食者气味(山猫(bobcat)尿液,PMart,Sandy Point,ME)。区室由自动闸门分隔。使用了无偏见调节方法，使老鼠并未相对一个室偏好另一个。在8-10am(AM)之间，将大鼠放在中间区室中并升起闸门，并允许其探索调节装置15分钟(适应)。每个区室中的时间和活动通过红外传感器记录并用市售软件(MED Test，版本4.2.0.0，MED Associates，Fairfax，VT)制成表格。在2-4pm(PM) 之间，再次允许大鼠探索调节装置并记录时间和活动(调节前基线)。24小时后，将大鼠随机分配至一个室，并暴露于生理盐水(AM)而同时将其限制在调节区室中15分钟。在同一天晚上(PM)，将大鼠限制在对面区室中，并暴露于捕食者气味(或无气味)15分钟。在配对期间，将放在称量船中的 2x2英寸方形滤纸片浸在5mL的盐水或山猫尿液中，并放在室的网格地面下。捕食者气味应激后第二天，将大鼠放在中央区室，并允许其探索整个装置15 分钟。大鼠没有途径直接接触山猫尿液。每次调节阶段后用消毒剂清洁整个装置。
7.1.4.统计学分析
通过从117只大鼠的基线测量值中减去在气味配对区室中的时间，来进行统计学分析。使用独立t-检验对施用了媒介物的无气味和气味暴露组之间在分配室中的时间进行分析。使用单向ANOVA以药物剂量为主要因素，来分析未暴露气味组和暴露气味组之间的潜在差异。在成对多重比较程序 (Student Newman-Keuls方法)后得到显著主要作用。显著性设定为P<0.05。
7.2.结果
图53A显示用VEH处理的无气味和气味暴露组。分析证实了捕食者气味暴露在暴露后24小时产生显著的(t(27)＝2.690，P＝0.012)条件性位置厌恶。如图53B所示，ANOVA揭示了在未暴露于捕食者气味后的处理组中没有显著差异(P＝0.746)。暴露于捕食者气味的组的时间分析揭示了药物剂量的显著主要作用(F(3,57)＝2.780，P＝0.050)。事后多重比较产生了最高肽剂量(FQSE(SEQ ID NO：10)0.5)和VEH之间的显著差异(P＝0.036)(图 53C)以及低肽剂量(FQSE(SEQ ID NO：10)0.05)和高肽剂量之间显著差异的趋势(P＝0.159)。
7.3.结论
这个报告描述了鼻内施用的肽测试物对PTSD动物模型中试验的影响。主要发现包括：1)确认了捕食者气味诱导的条件性位置厌恶，如前所述，2) 没有明显的药物或肽的副作用和3)在施用了最高剂量肽的大鼠中，捕食者气味诱导的位置厌恶显著减弱。
捕食者气味诱导的位置厌恶，作为PTSD的动物模型是稳健的，并且重复了先前的研究(Edwards et al.(2013).Traumatic stress reactivity promotes excessivealcohol drinking and alters the balance of prefrontal cortex-amygdalaactivity.Transl.psychiatry,3(8),e296)。对接受了DOX和肽并且未暴露于捕食者气味的组的分析显示了正常行为，因为没有发现对在随机配对的室中的时间有显著影响。各组之间的总活动(未显示)也没有差异。如图53C所示，最高剂量的肽(FQSE(SEQ ID NO：10)0.5)完全减弱了捕食者气味诱导的位置厌恶。DOX，一种已显示对患有PTSD的人类有效的药物(Rodgman et al.(2016).Doxazosin XL reduces symptoms of posttraumatic stressdisorder in veterans with PTSD:a pilot clinical trial.J.Clin.Psychiat.,77(5),e561-565)，也减弱了捕食者气味诱导的位置厌恶，然而使用所采用的统计学模型发现与VEH没有显著差异。总之，数据支持进一步开发肽测试物作为PTSD的潜在疗法。
实施例8：对鼻内施用FQSE(SEQ ID NO：10)对抑郁症“习得性无助”模型中大鼠行 为和内分泌参数的影响的研究
研究目的在于研究鼻内施用肽GABA-AR调节剂FQSE(SEQ ID NO： 10)对“习得性无助”(LH)抑郁模型中大鼠行为和内分泌参数的潜在抗抑郁和抗焦虑作用。
8.1.材料与方法
8.1.1.动物
研究在45只成年雄性Wistar大鼠220-250g(平均体重230g)中进行，所述大鼠来自IPh RAS的“不同分类学从属的实验室哺乳动物中心(Collection of laboratory mammalsof different taxonomic affiliations)”，由俄罗斯FANO 的生物资源收集项目支持，保持在标准条件下。所有涉及动物的程序均根据欧洲(欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的指令2010/63/EU)和俄罗斯(“用于实验室动物的维护和护理的GOST 33216-2014指南。用于实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。
8.1.2.测试物质
肽GABA-A调节剂FQSE(SEQ ID NO：10)(LC)每日以0.5mg/kg 或2.5mg/kg的剂量鼻内(i.n)施用10天。为了制备FQSE(SEQ ID NO： 10)肽的溶液，制备了0.3％碳酸氢盐缓冲液(每1升ddH2O中含有3g碳酸氢钠NaHCO3，pH 8；为了制备溶液，通过具有0.45μm Millex注射器的 (Millipore)滤嘴来收集缓冲液)。用于在20μl体积中以2.5mg/kg i.n.施用的溶液(单次施用)含有0.575mg FQSE(SEQ ID NO：10)，用于在10μl 体积中以0.5mg/kg鼻内施用的溶液(单次施用)含有0.115mg FQSE(SEQ ID NO：10)。在分析天平上称重，精确度为0.0001g，以0.5ml余量配制溶液。在实验中，使用新鲜制备的FQSE(SEQ ID NO：10)溶液；第二天，将此溶液储存在+4℃的冰箱中。
8.1.3.比较药物
四环抗抑郁药马普替林(Maprotiline，Lyudiomil)是一种单胺再摄取抑制剂，用作阳性对照。动物接受每日腹膜内注射(i.p)马普替林十天(M9651, Merck,4.5mg/kg,溶于盐水：每次施用200μl)。
8.1.4.习得性无助(LH)模型
“习得性无助”(LH)的经典范式用作抑郁症的实验模型(Seligman et al.(1975).Learned helplessness in the rat.J.Comp.Physiol.Psychol., 88(2):534-541)。根据现代概念，“习得性无助”的状态充分反映了焦虑-抑郁综合征，再现了一个人内源性抑郁的主要迹象，包括无助、绝望和特征性内分泌失调的影响的严重程度。为了发展LH，使大鼠经受无法控制且不可避免的厌恶应激(皮肤电刺激)。在具有导电地板的13x16x26cm大小的笼子的封闭空间中，使用电流(1mA，1Hz，15sec)刺激动物，在向室地板施加电流之间使用不同持续时间的间隔，以使每只大鼠在一小时内接受60 次刺激，其导致持续抑郁样状态的发展。使用软件随机发生器(software randomizer)自动进行刺激。
8.1.5.《旷场》试验(OF)
旷场试验是用于评估啮齿动物在新应激产生条件下的运动活动和探索行为水平的经典方法。试验在90×90×45cm的没有顶的笼子中进行，其地面以15×15cm方格铺开，并由60W灯从上方照亮。在LH模型中应激后第5 天，将大鼠放在OF中央。在5分钟内测量以下参数：开始移动的潜伏、交叉方格的次数(外侧、中间和中央)、用后肢直立的持续时间和不动时间。
8.1.6.《高架十字迷宫》试验(EPM)
EPM试验可以表征啮齿动物在可变应激条件下的行为，其使得评估动物焦虑水平和药物抗焦虑作用成为可能。在实验暴露后第6天，在EPM装置中逐一测试大鼠5分钟，所述EPM装置位于地面上方75cm的高度，由2 个有照明的开臂和2个带出口的闭臂组成。评估动物在闭臂内和外(在开臂和在中央)度过的时间、臂之间的转换次数、拉伸姿势的次数。通常，动物倾向于待在闭臂中，抗焦虑治疗导致在迷宫开臂度过的时间增加(Pellowetal.(1985).Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as ameasure of anxiety in the rat.J.Neurosci.Methods,14(3),149-167；Walf et al.(2007).The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-relatedbehavior in rodents.Nat.Protoc.,2(2),322-328)。
8.1.7.《Porsolt强迫游泳试验》，一日修正(FS)
Porsolt游泳试验(FS)是通过评估放在玻璃圆筒中的大鼠的运动活动来检测物质的强力抗抑郁样特性的标准试验。圆筒的直径为30cm且高度为90 cm，其中2/3装满水且温度为26±1℃。在Porsolt试验的一日修正中(Porsolt et al.(1977).Behavioral despairin mice:a primary screening test for antidepressants.Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.,229(2),327-336；Slattery et al. (2012).Using the rat forced swim test toassess antidepressant-like activity in rodents.Nat.Protoc.,7(6):1009-14)，将动物放在圆筒中并测量以下参数5分钟：主动和被动游泳的时间，不动度过的时间。
8.1.8.地塞米松试验(DXMT)
考虑到大鼠中HPA轴功能的生理节律特异性(Zhukov(1993)The dexamethasonesuppression test in genetically different rats exposed to inescapable andescapable electric shocks.Psychoneuroendocrinology,18(7): 467-474)，在根据方案的为期两天的地塞米松试验中，在LH发展后的第9-10 天，评估应激诱发的糖皮质激素(皮质酮，人类皮质醇类似物)释放及其通过引入合成糖皮质激素的抑制。
在试验第一天(DXMT1)10:00AM，向动物腹膜内注射生理盐水，然后在同一天04:00PM采集外周血样品以测定激素(引起应激)的基础水平，且在从笼子里取出大鼠并接受初始样品后30分钟，重新采集血液以测量激素应激水平。
为了研究HPA系统对反馈信号的灵敏度，第二天(DXMT2)10am向大鼠注射地塞米松(10μg/kg，腹膜内)。在6小时和6.5小时后重复从尾静脉取血的程序。使用试剂盒“皮质酮-ELISA”(“Hema”，RF)通过酶联免疫吸附测定法测定两个平行样品中的皮质酮含量。
通过计算所研究的动物亚组中的平均值和平均值的标准误差，来处理实验数据，每个点n＝9。
8.1.9.实验设计
将实验室大鼠分成5个实验组，每组9只动物：
“对照”-注射对照组每天鼻内施用溶剂(0.3％碳酸氢盐缓冲液)，持续10天。“LH”-经受应激的一组动物，其中发展了“习得性无助”的抑郁状态。LH组未进行药物治疗；研究了实验性抑郁症的发展。“LH+FQSE (SEQ ID NO：10)0.5”-经药理学校正的LH组，每天接受鼻内施用0.5mg/kg 剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)，持续10天。“LH+FQSE(SEQ ID NO： 10)2.5”-经药理学校正的LH组，其每天接受鼻内施用2.5mg/kg剂量的 FQSE(SEQ ID NO：10)，持续10天。“LH+Map.”–比较药物组。每天以4.5mg/kg的剂量腹膜内注射马普替林共10天，以发展实验性抑郁症。
表4：实验、药物施用和检测的总体方案(在文中说明)。
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8.1.10.统计学分析
对于正态分布的数据，使用了使用事后Tukey检验的单向方差分析 (ANOVA)。对于非正态分布的数据，使用Kruskal-Wallis检验，然后使用 Dunn’s检验进行多重比较。显著性阈值为0.05。数据表示为平均值±平均值的标准误差，或表示为中位数和具有最小值和最大值的四分位距。
8.2.结果
8.2.1.OF
LH组的特征在于与对照组相比的冻结显著增加(其对应于患有抑郁症的患者的运动抑制)。这在迷宫中央在初始阶段尤其明显(p＝0.01，图54)。此外，垂直探索活动的时间显著减少(p＝0.03，图55A)，这表明了动物的焦虑以及其探索活动减少。当将动物放在OF中央时，与LH组相比，慢性施用FQSE(SEQ ID NO：10)2.5mg/kg(i/n)和马普替林4.5mg/kg(i/p) 导致冻结时间显著减少(分别为p＝0.04和p＝0.044，图54)。每天施用马普替林导致LH后表现为不动的动物数量减少了2.3倍；在FQSE(SEQ ID NO：10)处理组中，这个指标也降低：2.5mg/kg组中为1.75倍，0.5mg/kg 组中为1.4倍，然而，这些组中所有动物的平均不动时间与LH组没有显著差异。
在经受LH并接受0.5mg/kg剂量的肽的动物组中也发现了垂直活动的显著降低(p＝0.01，图55A)。“LH+Map”和“LH+FQSE(SEQ ID NO： 10)0.5”组与对照组或与LH组均没有差异，这可以表明这些物质对不可避免应激的负面影响的部分校正。在所有实验组中，动物的运动活动均没有变化(图55B)。
8.2.2.EPM
在EPM试验中，在对照组和LH组中几乎完全不存在开臂进入。这一结果可表明这个试验的高水平的新奇性(novelty)和应激。同时，用Map或 FQSE(SEQ ID NO：10)处理的动物更常出现在臂中，但这些差异没有达到统计学显著性(图56A)。闭袖(closed-sleeve)中的拉伸姿势次数在各组之间也没有差异(图56B)。
8.2.3.FS
在强迫游泳试验中，与对照组和LH组相比，在应激条件后施用抗抑郁药马普替林导致不动度过的时间显著减少(分别为p＝0.02和p＝0.03，图57A)，以及主动游泳时间增加(分别为p＝0.01和p＝0.02，图57B)。引入0.5mg/kg 剂量而非2.5mg/kg剂量的FQSE(SEQ IDNO：10)导致不动减少，并且因此，与对照组相比主动游泳在趋势水平上增加(分别为p＝0.09和p＝0.08)。
8.2.4.DXMT
大鼠血浆中皮质酮(CS)基础水平的研究显示，与对照组中的动物相比，经受应激并接受盐水注射的动物中的激素含量有增加的趋势(p＝0.07)。这个结果表明HPA轴的过度激活(hyperactivation)。同时，用Map和两个剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)处理的大鼠与未受应激的动物没有差异，并且与LH组相比具有显著较低的CS水平(p<0.02)，这表明动物应激反应性降低(图58)。有趣的是，在先前的研究中，在这个模型中使用高剂量抗抑郁药lyudiomil(马普替林)预防实验性抑郁症(Rybnikova et al.(2008).The possible useof hypoxic preconditioning for the prophylaxis of post-stress depressive episodes.Neurosci.Behav.Physiol.,38(7),721-726)导致血液皮质酮水平降低至对照水平以下。
地塞米松试验是原发性抑郁症的标志。根据临床资料，在健康受试者中，在引入地塞米松的情况下，由于负反馈回路抑制了皮质醇和ACTH的分泌，皮质醇水平降低。在患有内源性抑郁症的患者中，这样的皮质醇水平降低较不显著，因为在这种疾病中负反馈机制被扰乱。地塞米松对血液中皮质醇水平的微弱影响(阳性试验结果)表明存在内源性抑郁症。
DXM试验揭示了LH组大鼠的糖皮质激素负反馈中脑垂体-肾上腺系统的调节受损。与对照大鼠中超过50％的抑制相比，向这些动物注射地塞米松实际上没有降低CS的基础水平或应激水平(图59，表2)。发现引入Map 和0.5mg/kg而非2.5mg/kg剂量的FQSE(SEQ IDNO：10)导致施用DXM 后血液中CS的应激诱导的增加被显著抑制(图59，表5)，其可以表明这些组的大鼠中HPA系统抑制的正常化。
施用2.5mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)对由外源性糖皮质激素导致的应激激素水平抑制具有较不显著的作用：LH+FQSE(SEQ ID NO： 10)2.5组的Δ比对照组低两倍，但同时其超过LH组的这个值(表2，Δ (FR-DXM))。
表5：通过引入外源类固醇对皮质酮应激释放的抑制程度
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8.3.结论
研究结果表明，肽GABA-A调节剂FQSE(SEQ ID NO：10)的十天鼻内施用具有剂量依赖的抗焦虑样(对EPM中在开臂度过的时间，OF中不动时间的影响)和抗抑郁样(DXMT，FS试验中的不动时间减少)作用。并且显然，它可以防止下丘脑-脑垂体-肾上腺皮质激素系统的过度激活以及反馈机制对其调节的干扰，这表现为动物对应激的响应。
因此，肽GABA-A调节剂FQSE(SEQ ID NO：10)表现了应激保护性特性，并证明了对校正应激后焦虑的有效性。这些数据结合所研究的药物剂量不存在明显的行为副作用的结果表明了进一步研究FQSE(SEQ ID NO： 10)的前景以及其在焦虑-抑郁症中应用的可能性。
实施例9：对鼻内施用FQSE(SEQ ID NO：10)在慢性束缚应激模型中的亲神经作用 的研究
研究目的是评估施用FQSE(SEQ ID NO：10)的行为影响以及分析在慢性束缚应激(Chronic Restraint Stress，CRS)后用FQSE(SEQ ID NO：10) 处理的大鼠脑结构中BDNF、p-p70S6k、p-ERK(1和2)、p-GSK3β和p-PKC 蛋白相对水平。
9.1.材料与方法
9.1.1.动物
实验在三至四个月龄的雄性Sprague-Dawle大鼠(n＝50)中进行。动物饲养在研究所饲养室，可以自由获取食物和水，并且每日光照自然交替。所有涉及动物的程序均根据欧洲(欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的指令2010/63/EU)和俄罗斯(“用于实验室动物的维护和护理的GOST33216-2014指南。用于实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。
9.1.2.慢性束缚应激模型
为了模拟抑郁状态，将实验动物放在单独的束缚器(“Open Science”，俄罗斯)中每天6小时，持续14天(下文中“慢性束缚应激Chronic restraint stress＝CRS”)。为了研究FQSE(SEQ ID NO：10)的亲神经作用，将动物分成5组，每组10只。各组如下：第1组，对照无应激动物，鼻内接受10μl (一对5μl剂量)盐水；第2组，应激动物，鼻内接受10μl盐水(CRS+Veh)；第3组，应激动物，腹膜内接受5mg/kg剂量的氟西汀(FO)(CRS+FO，阳性对照)；第4组，应激动物，鼻内接受含0.3mg/kg剂量肽药物的10μl 盐水(CRS+FQSE(SEQ ID NO：10)0.3)；第5组，应激动物，鼻内接受在含3mg/kg剂量肽药物的10ml盐水(CRS+FQSE(SEQ ID NO：10)3)。在将大鼠放入束缚器之前30分钟，每日进行药物施用。基于初步研究的结果来选择FQSE(SEQ ID NO：10)的剂量。
9.1.3.行为试验
在实验开始十四天后，在旷场(OFT)和Porsolt强迫游泳试验(FST) 中评估动物运动活动和情绪状态的变化。在所有情况下，在试验前30分钟向动物注射药物。OF试验设计为方形盒，边长90cm且高35cm。将装置地板分成25个方格。测量水平和垂直运动活动三分钟。计算跨方格的总次数，以及行进距离的长度和用后肢直立的次数。FST在玻璃圆筒中进行，其高40cm 且直径19cm，水温24℃。在8分钟的实验中，计算主动(主动游泳+攀爬) 和非主动游泳(不动+被动游泳)度过的时间。使用动物行为视频监控系统“AnyMaze”进行行为实验的记录和分析。
9.1.4.脑样品制备
在行为检查结束时，将大鼠斩首，并提取它们的大脑用于随后的蛋白质印迹分析。从客户处收到了总共51个来自Sprague-Dawley大鼠(3-4个月龄) 的匀浆脑组织样品。25个样品为大脑皮层匀浆，26个样品为从大鼠脑分离的海马体匀浆。每个样品中匀浆组织的量小于50mg。在缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，1％NP-40，0.1％SDS)中以每100mg样品 1ml缓冲液的比例进行匀浆化。将其在冰上孵育30分钟。然后将样品以 12000g、+4℃离心15分钟。
9.1.5.实验设计
根据标准方法使用三氯乙烷提供对所研究样品中总蛋白水平的分析 (Ness etal.(2015).Western blot optimized exercise:an efficient and moreenvironmentally friendly approach in the lab classroom.Biochem.Mol.Biol.Educ.,43(5),358-365)。
使用蛋白质印迹在研究样品中提供分析BDNF、p-p70S6k (Thr421/Ser424)、p-ERK(1和2)、(Thr202/Tyr204)、p-GSK3β(Ser9)、 p-PKC(PKCGγThr514)和GAPDH参考蛋白的蛋白水平所需的所有步骤。
进行了以下程序：
根据Laemmli在12％变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE：0.375M Tris-HCl， pH 8.8，0.1％SDS，12％丙烯酰胺)中以10V/cm进行蛋白的电泳分离。使用Thermo Scientific高质量蛋白试剂盒作为标记。
在转移缓冲液(25mM Tris，190mM甘氨酸，10％EtOH，pH 8.3)中在室温下过夜将蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素膜(PVDF 0.45μm)。通过用非特异性AmidoBlack染料将膜上所有条带染色来评估转移质量(如有必要)。
用PBS-T溶液(8mMNa2HPO4、150mM NaCl、2mM KH2PO4、3mM KCl、0.05％
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20，pH 7.4)洗涤膜并在室温下封闭(用脱脂奶粉或BSA，取决于抗体)60分钟。
洗涤膜并在+4℃下用制造商推荐的稀释度的针对靶蛋白的一抗孵育过夜。之后，再次洗涤膜并与偶联辣根过氧化物酶的二抗孵育1小时。将膜用 Thermo ScientificSuperSignalTMWest Dura Extended Duration Substrate化学发光底物染色。对染色的膜的分析在ChemiDoc检测和成像系统(Bio-Rad，USA) 上进行。
计算获得的斑点(spot)的积分面积作为定量评估，然后相对样品中蛋白的量标准化。
9.1.6.统计学分析
在Statistica10中使用单向ANOVA和后验Fisher标准处理数据以用于各组间比较。在偏离正态分布的情况下，使用Kruskal-Wallis ANOVA检验和事后Dunn多重比较检验。在p≤0.05时考虑有统计学显著差异，且数据表示为平均值±SE.M。
9.2.结果
9.2.1.FQSE(SEQ ID NO：10)在CRS模型中的行为影响
9.2.1.1.OF
在应激暴露后或药物治疗后，总行进距离均没有改变：在各组之间观察到的水平活动没有显著差异(图60)。
9.2.1.2.FST
应激或FO处理对动物主动游泳的持续时间没有影响。然而，经历了应激并接受了3mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)的大鼠比来自“CRS+Veh”组的动物主动游泳时间更长(图61A)。
在经历了应激并接受了媒介物注射的动物亚组中，低活动行为(low activitybehavior)的持续时间更长。与“CRS+Veh”相比，施用3mg/kg剂量的肽显著减少了在FST中被动游泳的时间(图61B)。FO的引入对该试验中的大鼠行为没有影响。
9.2.2.对FQSE(SEQ ID NO：10)在CRS模型中的行为影响的讨论
慢性可预测应激(chronic predictable stress，CPS)是对啮齿类动物的焦虑-抑郁表型进行建模的主要工具之一。然而，经常注意到慢性不动应激是一种微弱的应激作用。这个模型的再现性程度因实验室而异。在这个研究中，计划评估慢性施用肽FQSE(SEQ IDNO：10)后大鼠针对不动应激的行为。
在旷场试验中，未检测到应激动物的水平运动活动(MA)的变化。所述肽对运动活动没有影响。
在Porsolt游泳试验中，应激不会导致主动游泳所用的时间发生变化。然而，对低活动行为的持续时间(被动游泳和不动的总时间)存在显著影响。施用3mg/kg的所述肽消除了这种影响。存在主动和被动游泳的比例向不主动游泳减少的转移。
9.2.3.结论
根据文献，CPS导致旷场试验中探索活动的降低。其还导致Porsolt游泳试验中的不动增加(Bowman et al.(2002).Effect of Chronic Restraining Stress andEstradiol on Open Field Activity,Spatial Memory and MonoaminergicNeurotransmitters in Ovariectomized Rats.Neurology,113(2),401-410；Guedrietal.(2017).Chronic Stress Deterrence Induced Neurobiologie Changes andHistological Changes in Rats.Toxicol.Environ.Sci.,9(2),123-129)。结果表明了应激效应对动物行为的影响微弱。在旷场试验中，施用0.3和3mg/kg剂量的肽对应激动物的情绪没有作用。与应激+媒介物组相比，3mg/kg的剂量具有抗抑郁样作用，其可以表明慢性施用FQSE(SEQ ID NO：10)具有积极的亲神经作用。
9.2.4.蛋白质印迹分析的结果和讨论
获得的印迹的示例如图62所示。根据对GAPDH参考基因获得的结果(图 63A、63B)，在任何实验组中均没有观察到统计学上的显著差异，这表明样品中的蛋白分布一致。
应激效应导致海马体中p-ERK-1(增加60％)、p-ERK-2(增加100％)、 p-GSK3β(减少40％)和p-PKC(减少53％)，然而，在大脑皮层中，这种效应本身不影响所研究蛋白的水平。获得的结果可以表明所用模型中的轻度应激(低级应激)。大脑皮层(图64A)和海马体(图64B)中的BDNF蛋白水平显示与应激或氟西汀施用无关。同时，两个剂量的FQSE(SEQ IDNO： 10)(0.3mg/kg和3mg/kg)均导致皮质中BDNF水平降低20％至40％，且海马体中BDNF水平降低40％。
这种变化对应于GABA-A受体的变构调节剂的作用。显示施用苯二氮卓类导致成年雄性大鼠海马体、下丘脑和大脑皮层中的BDNF水平降低 (Kellogg et al.(2000).Sex-specific effects of intrauterine GABA receptor manipulation on pre-andpostnatal BDNF expression in rats.Dev.Brain.Res., 121(2),157-167；Chan et al.(2017).SexDifferences in Brain Neurotrophic Factor Signals andFunctions.J.Neurosci.Res.,95(1-2),328-335)。在小鼠大脑皮层中观察到了相同的作用(Huopaniemi et al.(2004).Adaptive plasticity induced by diazepam is revealedby profiling the specific expression of the α1GABAA receptor.J.Neurochem.,88(5),1059-1067)。它还降低了BDNF蛋白的血清水平(Ventrilla et al.(2013).Serumlevels of brain neurotrophic factors in various neurological diseases.BiomedRes.Int.,2013)。然而，应该注意的是，目前还没有关于GABA-A和BDNF相互作用的研究(Kimet al.(2017).Brain neurotropic factor and GABAergic transmission inneurodegeneration and neuroregeneration.Neural Regen.Res.,12(10),1733)。一些论文已经注意到响应GABA-A刺激后BDNF转移，其与胚胎或发育中的神经元有关(Porcher etal.(2011).Regulation of positive feedback between the signaling of the γ-aminobutyric acid receptor type A(GABAA)and the release of brain neurotrophicfactor(BDNF)in developing neurons.J.Biol.Chem.,286(24), 21667-21677；Porscheretal.(2018).MechanismofBDNFmodulationin GABAergic synaptictransmission in healthy and diseased brains.Front.Cell. Neurosci.,12,273)。作为对GABA-A刺激响应的BDNF水平变化的性质可以取决于所研究的神经元和脑区域的类型、GABA-A调节剂的模式和持续时间，以及所使用的实验模型的类型(Kimetal.(2017).Brainneurotropic factor and GABAergic transmission in neurodegeneration andneuroregeneration.Neural Regen.Res.,12(10),1733)。同时，获得的数据作为本研究的结果允许高度可能性范围内的以下假设：响应于FQSE(SEQ ID NO：10)施用的BDNF 水平变化表明了GABA系统的调节。
p-p70S6k(Thr421/Ser424)的磷酸化形式的水平显示与大脑皮层(图65A) 或海马体(图65B)中的应激或氟西汀无关。响应于两个剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)，皮质中的蛋白水平增加了80％，海马体中的蛋白水平增加了 170％至200％。
S6激酶是mTORC1信号级联的主要效应子之一。它与蛋白生物合成活性增加有关(Maoetal.(2018).The role of mTOR in glucose and lipidmetabolism.Int.J.Mol.Sci.,19(7),2043)。GABAA受体的激活导致mTORC1 级联的失活，尤其是p-p70S6k(Thr421/Ser424)的增加(Thanapreedawatet al. (2013).Influence ofGABA on brain protein synthesis mediated by the mammalian target on therapamycin pathway.Biosci.Biotechnol.Biochem., 120808；Weston et al.(2012).Multiple roles for mammalian target of rapamycin signaling in bothglutamatergic and GABAergic synaptic transmission.J. Neurosci.Res.,32(33),11441-11452)。S61和mTROC1的激活具有抗抑郁作用，在克他命上进行研究。在这种情况下，克他命的抗抑郁作用通过使用雷帕霉素而被中和，这表明mTROC1在介导这种作用中的重要作用(Dwyer et al.(2015).Ribosomal protein S6 kinase 1signaling in prefrontalcortex controls depressive behavior.Proc.Natl.Acad.Sci.,112(19),6188-6193)。因此可以得出结论，响应于FQSE(SEQ ID NO：10)引入的S6k高水平磷酸化表明了 mTORC1级联的激活，其可能通过GABA-A受体的调节而启动。
在海马体中，显示p-ERK1蛋白磷酸化(图66B)和p-ERK2(图66B) 水平响应于应激而分别增加60％和100％。两个剂量的FQSE(SEQ ID NO： 10)均导致p-ERK1和p-ERK2水平正常化至完整对照水平。
一些文献表明，个体应激模型显示脑中p-ERK1和2的磷酸化增加(Kim etal.(2018).Social support rescues acute stress-induced cognitive impairments bymodulating ERK1/2phosphorylation in adolescent mice.Sci.Rep.,8(1),1-13；Hebert et al.(2005).Single and repeated immobilization stress differentiallytrigger induction and phosphorylation of several transcription factors andmitogen-activated protein kinases in the rat locus coeruleus.J.Neurochem., 95(2),484-498)，证据支持本研究结果。还已知GABA-A的变构调节剂(尤其是苯二氮卓类药物)能够抑制p-ERK系统的磷酸化(Kim et al.(2012). Hippocampal extracellularsignaling-regulated kinase signaling has a role in passive avoidance memoryretrieval induced by GABA receptor modulation inmice.Neuropsychopharmacology,37(5),1234)。
因此，FQSE(SEQ ID NO：10)的性质对应于变构调节剂GABA-A的特征。然而，应当注意的是，在文献中描述的其他模型中，抑郁状态和严重的慢性应激与p-ERK1/2和MAPK激酶级联的抑制有关。抗抑郁作用，尤其是克他命的抗抑郁作用，与这个系统的激活有关(Réuset al.(2014).MAPK signaling correlates with the antidepressant effects ofketamine.J.Psychiatr.Res., 55,15-21)。获得的数据清楚地表明了FQSE(SEQ ID NO：10)对MAPK 信号传导级联的作用，并且在轻度应激模型中可以观察到一定的变化方向。
大脑皮层中的p-ERK1(Thr 202)水平显示与任意所研究的作用无关(图 66A)。p-ERK2(Tyr204)的皮质水平不响应于应激而变化，但在响应于氟西汀和0.3mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO：10)相对于应激和对照水平而降低(图67A)。这可能和GABA-A受体调节有关。由于应激不影响皮层中的ERK1/2磷酸化水平，因此所述发现需要在不同的应激模型中进行验证。
在大脑皮层中，p-PKC的磷酸化形式(Thr514)的水平在应激、氟西汀或FQSE(SEQID NO：10)0.3mg/kg施用后没有显示出变化(图68A)。然而，FQSE(SEQ ID NO：10)3mg/kg的施用导致p-PKC降低51％。这种作用可能是由于这个组中BDNF水平降低，这归因于p-PKC参与由TrkB触发的级联(Duman et al.(2012).Signaling pathways underlyingthepathophysiology and treatment of depression:novel mechanisms for rapid-actingagents.Trends Neurosci.,35(1),47-56)。3mg/kg剂量的FQSE(SEQ ID NO： 10)与0.3mg/kg剂量相比导致BDNF的更显著降低(图64A)。这可以解释较低剂量对p-PKC水平的无效性。此外，p-PKC水平的降低可间接表明 mTORC2依赖性级联的抑制(其对mtorc1激活具有拮抗作用)，p-PKC是针对其的效应子(Mao et al.(2018).The role of mTOR in glucose andlipid metabolism.Int.J.Mol.Sci.,19(7),2043)。然而，上述结果并不能保证任何关于FQSE(SEQ ID NO：10)对p-PKC的影响的明确结论。
CRS引起海马体中p-PKC的显著降低(图68B)，其对应于抑郁状态 (Thiels et al.(2000).Protein phosphatase-mediated regulation of protein kinase C duringlong-term depression in the adult hippocampus in vivo.J.Neurosci., 20(19),7199-7207；Shelton et al.(2009).Protein kinases A and C in post-mortemprefrontal cortex from persons with major depression and normalcontrols.Int.J. Neuropsychoph.,12(9),1223-1232)。同时，氟西汀和肽FQSE(SEQ IDNO： 10)均未促进其水平的正常化：这些组中的值与对照组没有统计学差异。应当注意的是，海马体中p-PKC和FQSE(SEQ ID NO：10)激活的缺乏可以认为是积极作用。
已知p-PKC的高活性与GABA-A受体(尤其是γ2亚基)中苯二氮卓特异性位点的磷酸化相关，其降低调节剂对受体的亲和力并抑制其作用(Gao et al.(2005).Activationof protein kinase C reduces benzodiazepine potency at GABAA receptors in NT2-N neurons.Neuropharmacology,48(3),333-342；Qi et al.(2007).Protein kinase C∈regulatesγ-aminobutyrate type A receptor sensitivity to ethanol andbenzodiazepines through phosphorylation ofγ2subunits.J.Biol. Chem.,282(45),33052-33063)。上述机制可以揭示对苯二氮卓类药物耐受性的增加。慢性施用期间p-PKC的激活导致GABA-A受体磷酸化和对这些药物的敏感性降低(Vinkers et al.(2012).Mechanisms underlying tolerance after long-term benzodiazepine use:a futurefor subtype-selective GABAA receptor modulators？Adv.Pharmacol.Sci.,2012)。在这个实验中不存在PKC激活最能够表明，提供FQSE(SEQ ID NO：10)不会激活自我耐受机制。
蛋白p-GSK3β的水平显示不依赖于皮质中的任何作用(图69A)。海马体(图69B)显示对应激的响应降低了40％，而同时显示对氟西汀或FQSE (SEQ ID NO：10)的施用没有响应。
总之，可以得出结论，在多种所测试的蛋白中FQSE(SEQ ID NO：10) 水平的性质与GABA-A受体的正变构调节剂的特征相匹配。BDNF和ERK1/2 磷酸化形式的水平降低是苯二氮卓类的特征。响应于FQSE(SEQ ID NO： 10)施用的皮层和海马体中高水平的p70S6k磷酸化表明了mTORC1级联的激活并且对应于显著的抗抑郁作用。p70S6k磷酸化增加可以影响行为，如观察到与对照组中大鼠相比，主动游泳和漂流(drift)时间显著增加以及被动游泳时间减少。来自Porsolt试验的观察结果可能是mTORC1级联激活的结果(Chen et al.(2015).AMPA receptor–mTOR activation is required for the antidepressant-likeeffects of sarcosine during the forced swim test in rats: Insertion of AMPAreceptor may play a role.Front.Behav.Neurosci.,9,162)。这种作用也可以表明GABA-A受体调节，在此期间mTORC1级联开始并且应观察到p-p70S6k(Thr421/Ser424)水平增加。
然而，必须提及的是，所分析的标志物实际上是由大量作用因素调控的普遍级联的参与者。因此，不可能明确说明由FQSE(SEQ ID NO：10)介导的GABA-A受体的特异性调节。
9.2.5.结论
应激作用导致海马体中蛋白p-ERK-1、p-ERK-2、p-GSK3β和p-PKC的水平发生显著变化。然而，这并没有影响大脑皮层中所研究蛋白的水平。获得的结果可以表明所用模型中的温和应激模式(低级应激)。
施用两个剂量(0.3mg/kg和3mg/kg)的FQSE(SEQ ID NO：10)导致皮层(20-40％)和海马体(40％)中的BDNF水平均降低。这对应于GABA-A 受体的变构调节剂的特征。在进一步的实验中可以使用BDNF作为GABA-A 受体调节的标志物。
实施例10：用于在体外研究[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)的特异性结合位点的放射性 配体结合测定
10.1.研究目的
阶段1.当将50μl试验化合物添加至孵育培养基使终浓度为10-10-10-4M 时，评估未标记的FQSE(SEQ ID NO：10)肽相对于[3H]-SR95531(GABAA 受体的拮抗剂)结合的IC50值。
阶段2.在以下实验中确定FQSE(SEQ ID NO：10)肽在脑结构中的结合位点(使用氚放射性标记肽)：
分离大脑皮层的具有GABAA受体的质膜(Ito的改进方法(Ito et al. (1992).Effects of bicuculline on[3H]SR 95531binding indiscrete regions of ratbrains.Neurochem.res.,17(4),307-313；Hawkinson et al.(1996).Steroid inhibitionof[3H]SR 95531binding to the GABAA recognition site.Eur.J. Pharmacol.,304(1-3),141-146))。
分离具有a+/b-GABAA受体位点的全脑的质膜(根据Maldifassi et al. (2016).Molecular mode of action of CGS 9895at α1β2γ2GABAA receptors.J. Neurochem.,138(5),722-730；Ramerstorfer et al.(2011).The GABAA receptor α+β-interface:anovel target for subtype selective drugs.J.Neurosci.,31(3), 870-877的改进方法)。
通过其他方法分离脑的质膜。
阶段3.在使用不同“经典”GABAA受体配体的配体替换实验中，使用处于以下孵育条件的大鼠大脑皮层膜，来确定脑结构中FQSE(SEQ ID NO： 10)肽的结合位点(使用氚放射性标记肽)：
在室温下孵育25分钟；
增加孵育时间；
用已知的“冷”配体和随后添加的标记肽进行预孵育(假设“热”肽与完整膜的结合将减少，因为“冷”配体将占据其位点——间接确定竞争)。
阶段4.通过计算以10-10-10-4M浓度范围(与[3H]氟硝西泮和[3H]地西泮相关)添加的未标记肽的IC50，来评估GABAA受体的BZD位点的体内结合；
阶段5.利用不同方案修饰来评估与GABAA受体的不同位点结合的多种物质对[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)与大鼠皮层膜的特异性结合的影响。
阶段6.为了获得对[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)结合位点的具有阴性对照的数据：通过特定方法(NMDA，添加配体MK-801)分离膜，其与之前实验中获得的不同，并检查这个方案中肽的结合位点的不存在。
10.2.材料与方法
对Wistar雄性大鼠(250-300克)进行研究。将动物斩首，取出大脑，置于冰上，并根据普遍接受的方案(Glowinski et al.(1966).Regional studies of catecholamines inthe rat brain-I:the disposition of[3H]norepinephrine,[3H] dopamine and[3H]dopain various regions of the brain.J.Neurochem.,13(8), 655-669)分离脑结构用于放射性受体分析。所有涉及动物的程序均根据欧洲 (欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的指令 2010/63/EU)和俄罗斯(“用于实验室动物的维护和护理的GOST33216-2014 指南。用于实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。
10.2.1.系列1.分离具有大脑皮层GABAA受体的质膜。
根据改进的方法(Ito et al.(1992).Effects of bicuculline on[3H]SR95531binding in discrete regions of rat brains.Neurochem.res.,17(4),307-313；Hawkinson et al.(1996).Steroid inhibition of[3H]SR 95531binding to the GABAArecognition site.Eur.J.Pharmacol.,304(1-3),141-146)制备含有大鼠的GABAA-大脑皮层受体的膜样品。斩首后，立即将组织冷冻在液氮中，并储存在-80℃的低温冰箱中。在实验当天，将额叶皮层在Teflon玻璃Potter 匀浆器中在冰冷缓冲液(0.32M蔗糖；pH 7.1)中以1:20W:V匀浆。然后将匀浆以1,000g离心10分钟。将上清液以20,000g重新离心20分钟。将沉淀重悬于20ml冷蒸馏水中，并以8000g离心20分钟。将上清液以48,000g 重新离心20分钟。将沉淀悬浮在0.05M Tris-柠檬酸缓冲液(pH 7.1)中，并以48,000g离心20分钟。将所得膜部分冷冻并储存在-80℃。在实验当天，将膜悬浮在40体积的0.05M Tris-柠檬酸缓冲液(pH7.1)中，并以48,000g 离心20分钟。将沉淀悬浮于40体积的0.05M Tris-柠檬酸缓冲液(pH7.1) 中，并在24℃下孵育30分钟。然后将其以48,000g再次离心20分钟。将最终沉淀物重悬于新鲜缓冲液中。
10.2.2.GABAA受体的放射性配体分析
孵育混合物(终体积0.5ml)含有50μl[3H]SR 95531、250μl缓冲液和200μl膜蛋白悬浮液，添加50μl未标记的SR 95531配体(gabazine)或未标记的FQSE(SEQ ID NO：10)肽用于非特异性结合。将反应混合物在40℃下孵育1小时。
10.2.3.系列2.确定所研究的肽在脑结构中的结合位点(使用氚放射性标记的 FQSE(SEQ ID NO：10)肽)。
根据多种改进的技术(Ito et al.(1992).Effects of bicuculline on[3H]SR95531binding in discrete regions of rat brains.Neurochem.res.,17(4),307-313；Hawkinson et al.(1996).Steroid inhibition of[3H]SR 95531binding to the GABAArecognition site.Eur.J.Pharmacol.,304(1-3),141-146；Asano et al. (1979).Identification of inosine and hypoxanthine as endogenous ligands for thebrain benzodiazepine-binding sites.Proc.Nat.Acad.Sci.,76(2),977-981；Maldifassi et al.(2016).Molecular mode of action of CGS 9895atα1β2γ2 GABAAreceptors.J.Neurochem.,138(5),722-730；Ramerstorfer et al.(2011). The GABAAreceptorα+β-interface:a novel target for subtype selective drugs.J.Neurosci.,31(3),870-877)分离质膜。然后，使用[3H]FQSE(SEQ ID NO： 10)及其未标记形式对分离的膜在体外进行放射性配体分析。因此，获得了在0％至47％范围内的相对总结合的特异性FQSE(SEQ ID NO：10)结合百分比。为了进一步研究，选择特异性结合百分比最高的技术。所述技术的方案如下所述。
10.2.4.质膜分离和放射性配体分析。
斩首后，立即将组织冷冻在液氮中，并储存在-80℃的低温冰箱中。在实验当天，将脑组织(皮质，约300mg)在Teflon-玻璃Potter匀浆器中在缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4)中以1:25W:V匀浆。将匀浆以40,000g离心 20分钟。将获得的沉淀物在缓冲液(50mM Tris-HCl；pH＝7.4)中匀浆，并以40,000g再次离心20分钟。再次进行类似的程序。将沉淀物重悬于15ml 相同缓冲液中并用于放射性配体分析。
孵育混合物(最终体积0.5ml)含有50μl[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)、 200或250μl缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝7.4)和200μl膜蛋白悬浮液，添加50μl未标记的FQSE(SEQ IDNO：10)用于非特异性结合。
之后，实验性地，通过时间和温度的变化，选择最佳孵育模式用于FQSE (SEQ IDNO：10)与大鼠皮层中其自身结合位点的结合：在室温(RT)下孵育反应混合物25分钟(表6)。
表6：放射性配体分析中孵育的不同实验条件。*-所选孵育条件。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
当选择了孵育模式后，通过添加各种盐类——NaCl、KCl、KH2PO4、 CaCl2、MgCl2来改变缓冲液的组成。结果，特异性结合的百分比降低至63％。
此外，应用质膜提取的这种改进，研究了已知受体位点(表7)的配体对[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)与其自身特异性结合位点的结合的影响，以确定其性质。
表7：各种受体的配体对[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)与FQSE(SEQ ID NO： 10)结合皮质位点的结合的体外影响。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Figure DEST_PATH_IMAGE012
10.2.5.液体闪烁光谱法(Liquid scintillation spectrometry)
在孵育结束时，将样品通过预先用0.3％聚乙烯亚胺在室温下润湿2小时的GF/C玻璃纤维过滤器(Whatman)进行过滤。每个管用冷缓冲液洗涤两次，然后用相同体积的缓冲液洗涤过滤器两次。
将过滤器风干并转移到闪烁瓶中。向过滤器倒入5ml基于甲苯的闪烁液 (每升甲苯含4g PPO，0.2g POPOP)。在Tri-Carb 2900TR计数器(Perkin Elmer)上测定样品的放射性，计数效率为42-46％。通过标准Lowry方法 (1951)测定蛋白浓度。
10.2.6.系列3.使用不同“经典”GABAA受体配体在配体替换实验中，确定脑结构中 所研究的肽的结合位点(使用氚放射性FQSE(SEQ ID NO：10)肽)。
对于样品制备和放射性配体结合测定的方案，参见9.2.3。
表8：“经典”GABAA配体列表
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure DEST_PATH_IMAGE014
10.2.7.系列4.GABAA受体(苯二氮卓位点)的放射性配体分析。
孵育混合物(终体积0.5ml)含有50μl[3H]氟硝西泮、250μl缓冲液和 200μl膜的蛋白悬浮液，添加50μl未标记的地西泮配体或未标记的FQSE (SEQ ID NO：10)肽用于非特异性结合。
如10.2.5中所述进行液体闪烁光谱法的程序和结果的处理。
苯二氮卓受体的体外放射性配体分析的第一个改进如下：在40℃和 24℃下孵育30分钟；对于非特异性结合，使用以下未标记物质的组合：1)地西泮10-6M+FQSE10-4M；2)地西泮10-6M+FQSE10-5M；3)地西泮10-6M (对照)。
第二个改进与上述相似，但也包括预孵育，其持续25分钟，并在预孵育期间添加未标记的FQSE(SEQ ID NO：10)，并且随后仅在孵育期间随[3H]- 氟硝西泮添加地西泮。
10.2.8.系列5.与GABAA受体不同位点结合的各种物质对[3H]-FQSE(SEQ ID NO： 10)与大鼠皮层膜特异性结合的影响。
对于样品制备和放射性配体结合测定的方案，参见9.2.3。
表9：GABAA配体列表
Figure DEST_PATH_IMAGE015
Figure DEST_PATH_IMAGE016
10.2.9.系列6.[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)结合位点的阴性对照。
10.2.9.1.具有海马体NMDA受体的质膜的分离。
使用改进的方法分离海马体质膜(Zhou et al.(1997).(2S, 4R)-4-methylglutamic acid(SYM 2081):a selective,high-affinity ligand for kainatereceptors.J.Pharmacol.Exp.Ther.,280(1),422-427.,LePage et al.(2005).Differential binding properties of[3H]dextrorphan and [3H]MK-801inheterologously expressed NMDA receptors.Neuropharmacol.,49(1),1-16)。斩首后，立即将组织冷冻在液氮中，并储存在-80℃的低温冰箱中。在实验当天，将海马体在Potter匀浆器中在10体积1号缓冲液(5m MHEPES，4.5mM Tris，0.32M蔗糖，pH 7.6)中以“Teflon-玻璃”匀浆。将匀浆稀释于50体积的2号缓冲液(5mM HEPES，4.5mM Tris，pH 7.6)中，并在Optima L-70K 超速离心机(Beckman Coulter)上以1000g离心10分钟。弃去上清液并以25000g再次离心20分钟。为了提高蛋白产量，将这个操作进行两次。将所得沉淀重悬于50体积的2号缓冲液中，并以8000g离心20分钟。倒出上清液和上层棕色沉积层，并以25000g离心20分钟。将沉淀物重悬于50体积的 3号缓冲液(5mM HEPES、4.5mM Tris、1mM Na4EDTA，pH7.6)中，并以25,000g离心3次，每次20分钟。将所得沉淀物重悬于50体积的2号缓冲液中，并以25,000g离心20分钟。将最终沉淀物重悬于5体积的2号缓冲液中，并冷冻在冷冻管中的液氮中。在分析当天，将组织解冻，稀释于10 体积的2号缓冲液中，以25,000g离心20分钟。将沉淀物重悬于所需量的2 号缓冲液中。
10.2.10.NMDA受体的放射性配体分析。
孵育混合物(终体积0.5ml)含有50μl[3H](+)MK-801、250μl缓冲液和200μl膜的蛋白悬浮液，添加50μl未标记的配体((+)MK-801,1用于非特异性结合mM)。反应混合物在室温下孵育2小时。
10.2.11.结果的分析和呈现。
通过添加50μl的测试化合物到培养培养基中至终浓度为10-10-10-4M，来确定关于标记配体的结合的IC50值。孵育混合物的体积为500μl。为了构建放射性配体替换的曲线，测试物质的每个浓度进行3次重复。
10.2.12.统计学分析。
为了分析放射性配体结合结果，使用了程序GraphPad Prism4和Statistica 6.0。结果表示为平均值±SE.M。
10.3.结果。
10.3.1.系列1。
FQSE(SEQ ID NO：10)不影响在所用的整个浓度范围内的[3H]SR 95531 与GABAA受体的特异性结合，这表明所研究的化合物与GABAA受体的 GABA位点不存在直接相互作用：发现IC50值大于100μmol/L(图70)。
10.3.2.系列2。
发现特异性FQSE(SEQ ID NO：10)结合位点的IC50＝2±0.1μM(图 71)。在所用的整个浓度范围内，所研究的物质均不影响标记的肽的特异性结合(所有配体的IC50>100μM)，这意味着所选配体的受体不是所研究的肽的结合位点(图71)。
10.3.3.系列3。
10.3.3.1.在室温下孵育25min。
所研究的物质在所用的整个浓度范围内均不影响标记肽的特异性结合：发现IC50值大于100μmol/L(图72)。
10.3.3.2.增加孵育时间。
这系列实验中的孵育也在室温下进行，但将持续时间延长至50分钟、1 小时、1小时30分钟。在所研究的物质中，仅地西泮和孕烯醇酮影响了标记的肽的特异性结合(图73，表10)。
表10：地西泮和孕烯醇酮与大鼠皮层中FQSE(SEQ ID NO：10)特异性结合位点的竞争性结合的潜力(IC50，μmol/L)。结果表示为平均值±SE.M。
Figure DEST_PATH_IMAGE017
10.3.3.3.预孵育方案。
以预孵育和孵育持续时间的2个改进进行实验：
预孵育-20min，孵育-25min；
预孵育-1h，孵育-30min。
在两种孵育方案的变型中，结合的[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)的量仅在与地西泮或孕烯醇酮预孵育后降低(p<0.05，t-检验)(表11)。
表11：与地西泮和孕烯醇酮预孵育对[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)结合位点的量的影响。对照水平(100％)在未添加任何未标记配体而进行预孵育的探针中计算。
Figure DEST_PATH_IMAGE018
10.3.4.系列4。
特异性结合计算为总结合和非特异性结合之间的差异。在此阶段获得的结果如表12所示。
表12：FQSE(SEQ ID NO：10)对苯二氮卓类与相应GABAA受体位点结合的影响。对于对照水平(100％)，接受了特异性结合值，为此，在放射性配体分析的相应改进中的非特异性结合中仅使用地西泮。
Figure DEST_PATH_IMAGE019
显示放射性配体结合测定的所有改进方案中的FQSE(SEQ ID NO：10) 均不影响BZD与GABAA受体特异性位点的结合。
10.3.5.系列5。
对于实验的第二部分，使用不同的孵育时间——25和50分钟于室温下 (根据先前实验中获得的结果使用这些方案)。在所用的整个浓度范围内，所研究的配体(表9)对标记的肽的特异性结合没有影响，IC50值>100μmol/L (图74)。
在第二阶段，孵育在室温下进行，但是向孵育混合物添加组分的顺序不同：首先，以10-4或10-5M的浓度添加膜的蛋白悬浮液和未标记的GABAA 受体配体至缓冲液中，并在预孵育1小时后添加[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)。孵育持续25分钟。所示的时间间隔基于先前实验中获得的数据选择。如果所研究的物质之一与FQSE(SEQ ID NO：10)位点结合，则结合的[3H]-FQSE (SEQ ID NO：10)的量会减少，这可以表明所研究的配体的结合位点与FQSE(SEQ ID NO：10)结合位点的亲和力。
在这个实验的改进中，测试物质均不改变结合的[3H]-FQSE(SEQ ID NO： 10)的量(p<0.05，t-检验)(表13)。
表13：与所研究的物质预孵育对[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)的结合位点的数量的影响。对照水平(100％)在不添加任何未标记的配体进行预孵育的探针中计算。
Figure DEST_PATH_IMAGE020
10.3.6.系列6。
获得了[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)结合位点的阴性对照数据。为此，使用方法部分中描述的专门技术来分离具有NMDA受体的膜。验证了相应配体MK-801在这些膜上的特异性结合。
作为NMDA受体的体外放射性配体分析的结果，获得了IC50＝0.007+ 0.0004μmol/L的替换曲线。使用[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)和未标记的 FQSE(SEQ ID NO：10)在相同的膜上进行放射性配体分析，这表明所研究的肽不存在结合位点(总结合和非特异性结合的差异为11％)。
10.4.结论
测定大鼠皮层膜中[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)肽的特异性结合位点， IC50＝2*10-6M。
FQSE(SEQ ID NO：10)肽不与[3H]-SR 95531竞争GABAA受体的GABA 位点。
[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)的特异性结合位点不同于以下物质的结合位点：已知的GABA-受体配体(蝇蕈醇、荷包牡丹碱、gabazine、CGS-9895) 和多巴胺(seroperidol、舒必利、螺哌隆、7-OH-DPAT)、血清素(酮色林)、乙酰胆碱(尼古丁)、谷氨酸盐(谷氨酸盐、甘氨酸、Ro-256981、LY-354740、 MK-801、精胺、arkain)受体。
已显示地西泮和孕烯醇酮对[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)的结合位点的部分亲和力(IC50～10-4M)。
FQSE(SEQ ID NO：10)对苯二氮卓类与相应GABAA受体位点的结合没有影响。
[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)的特异性结合位点与以下已知的GABAA 受体配体的结合位点不同：异四氢烟酸、SCS、Bretanezil、SL651498、MK0343、 THDOC、TB21007、加波沙朵、FGIN-1-27、四氢孕酮。
获得了[3H]-FQSE(SEQ ID NO：10)的结合位点的阴性对照数据，其证实了肽的特异性结合位点的存在。
实施例11：使用荷包牡丹碱模型研究FQSE(SEQ ID NO：10)肽施用的影响
本研究的目的是使用荷包牡丹碱模型评估FQSE(SEQ ID NO：10)肽腹膜内施用的潜在亲神经作用。
为了评价本研究中肽作用的机制，使用荷包牡丹碱模型。荷包牡丹碱是一种天然生物碱化合物，其提取自荷包牡丹(Fumariaceae)科植物Dicentre cucullaria的叶子，本质上是GABA-A受体的竞争性拮抗剂。当静脉内施用 0.1-0.4mg/kg的剂量时，其会导致小鼠持续长达数小时的抽搐，这归因于Ca2+依赖性钾通道被破坏(Khawaled(1999).Bicuculline block of small-conductance calcium-activated potassiumchannels.Pflügers Archiv,438(3):314-321)。在以5 mg/kg的剂量腹膜内施用药物期间，未观察到惊厥，但行为试验表明，与不含荷包牡丹碱的这些化合物观察到的值相比，属于GABA-A调节剂组的药物的活性大大降低，这证实了所研究物质对GABA-A受体的功能作用(Mizushige(2013).Aromatic amino acid-leucine dipeptides exhibit anxiolytic-likeactivity in young mice.Neurosci.lett.,543:126-129)。可以提出，当前研究中使用的FQSE(SEQ ID NO：10)肽属于GABA-A组调节剂。
研究目的是评估i.p.施用FQSE(SEQ ID NO：10)肽对使用荷包牡丹碱模型的高架十字迷宫(EPM)、Porsolt强迫游泳试验(FST)中的BALB/C 小鼠行为的影响。
11.1.材料与方法
11.1.1.动物模型
在本实施例中，48只雄性BALB/C小鼠用作受试者。实验开始时每个样本的体重在约18克和约20克之间。所有动物均不含物种特异性病原体(根据FELASA清单的SPF状态，2014)。将动物保持在可自由获得水和食物的条件下。房间装有空调(交换率不低于15r/h)，具有12h:12h明暗循环(09:00 am开灯)，气温20-24°±2℃(可能波动限制每天不超过2℃)，湿度30-70％。所有涉及动物的程序均根据欧洲(欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的指令2010/63/EU)和俄罗斯(“用于实验室动物的维护和护理的GOST33216-2014指南。用于实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。对于本研究，将小鼠分成四个不同的组，并如表2所示向各组施用测试物质。
表14：实验组
Figure DEST_PATH_IMAGE021
在行为试验前30分钟，以每1g动物体重10μl溶液的体积腹膜内施用所有物质，其中FQSE(SEQ ID NO：10)肽剂量为20mg/kg，荷包牡丹碱为5mg/kg。每天进行试验不超过一次。所计划的试验的列表和顺序：第1 天-高架十字迷宫试验，第8-9天-Porsolt游泳(两日修正)试验。
11.1.2.统计学分析
对于非正态分布的样品，使用非参数标准(Manna-Whitney)，或对于正态分布的样品，使用单向方差分析(ANOVA)然后Fisher's LSD检验，来进行统计学数据分析。
11.1.3.高架十字迷宫试验
在高架十字迷宫试验中，试验场地包括在中间交叉的两个开臂和两个闭臂。臂长为30cm，闭臂侧壁高度为15cm。整个装置高出地面70cm。开臂具有约400lux的明亮均匀照度，闭臂具有约30-40lux的照度。将小鼠放在迷宫四个臂的连接处(中央)，面向开臂。在实验5分钟内通过EthoVision Noldus程序自动记录以下行为参数：总距离(cm)、运动时间(如果速度超过5cm/s)、不动(如果速度小于0.2cm/s)、平均和最大速度，以及运动活动和“冻结”事件的次数。分别测量中央扇区、开臂和闭臂的一组相同参数以及潜伏期和停留持续时间。(由OpenScience,Russia制造)。在EPM中，表征药物施用与对照组相比的抗焦虑作用的主要行为参数是“开臂时间”、“开臂进入”和“焦虑指数”。焦虑指数(AI)通过以下公式计算：AI＝100* (1-(开臂时间/总试验时间+开臂进入次数/总进入次数)/2)。开臂时间和开臂进入次数的增加以及焦虑指数的相关减少是探索动机增加和焦虑减少的标准指标。这些参数可以指示物质的抗焦虑作用。
11.1.4.Porsolt游泳试验(两日修正)
在Porsolt游泳试验中，在两天内进行了两次试验。装置是一个透明圆筒，高30cm，直径10cm，装水(温度约21-23℃)至25cm高的标记处。在第一天，将每只动物放入圆筒中10分钟。不记录行为参数。第二天，将动物放入圆筒中5分钟。测量以下参数：主动(四肢有力运动)和被动(后肢弱运动)游泳，以及不动(不动性)的持续时间(Porsolt et al.(1977)Behavioral despair in mice:a primary screening test for antidepressants.ArchInt Pharmacodyn Ther.229(2):327-36)。每次试验后，将小鼠放入加热单元中晾干。FST(两日修正)用于评估药物的抗抑郁样特性。这个试验是评价动物行为的抑郁成分和研究药物对其影响的主要方法之一。
实验研究根据以下进行：与实验动物一起工作时的装备场所和组织程序的GOST33215-2014规则；与实验室啮齿动物和兔子一起工作的GOST 33216-2014规则；欧洲议会和欧盟理事会关于保护用于科学目的动物的指令 2010/63/EU，Rus-LASA，2012的翻译。
11.2结果
11.2.1.使用高架十字迷宫试验评估测试物质对小鼠行为的影响
FQSE(SEQ ID NO：10)肽施用增加了在开臂度过的时间(60.9±13.31 相比于对照组中的32.4±6.77s)(图75A)和开臂进入(图75B)(4±0.65 相比于对照组中的2.2±0.48)。这些参数的变化导致FQSE(SEQ ID NO： 10)处理的动物中“AI”与对照相比降低(分别为73±3.8与85±2.7％)(图 75C)。获得的结果表明20mg/kg剂量的测试物质具有显著的抗焦虑样作用。
我们没有观察到用5mg/kg剂量的荷包牡丹碱处理的实验组在EPM试验中有任何差异。肽与荷包牡丹碱的共同施用也没有减少小鼠的焦虑样行为。
获得的结果表明了20mg/kg剂量的测试物质具有显著的抗焦虑样作用。当肽与荷包牡丹碱(GABA-A受体的竞争性拮抗剂)共同施用时，FQSE(SEQ ID NO：10)的这些作用不存在，这可能表明FQSE(SEQ ID NO：10)通过与GABA-A受体相互作用的功能作用。
11.2.2.使用Porsolt强迫游泳试验评估测试物质对小鼠行为的影响
与对照组(57.1±17.62s)相比，FQSE(SEQ ID NO：10)肽处理导致主动游泳所用的时间增加(103.7±16s)(图76)，这可以认为是测试化合物的抗抑郁样作用。
在这个试验中，单独施用荷包牡丹碱不影响小鼠的行为。这些结果与先前的研究一致。在Mizushige的工作(Mizushige et al.(2013).Characterization of Tyr-Leu-Gly,a novel anxiolytic-like peptide released from bovine αS-casein. FASEBJ.,27(7),2911-2917)中，i.p.施用5mg/kg剂量的荷包牡丹碱不影响 FST中动物的参数。接受了FQSE(SEQ ID NO：10)和荷包牡丹碱的小鼠在主动游泳所用的时间上也没有表现出任何变化。这些结果可表明，荷包牡丹碱可以减弱肽的作用，并且FQSE(SEQ ID NO：10)的抗抑郁样特性可与与GABA-A受体的相互作用有关。
11.3.结论
在行为试验前30分钟，向BALB/C小鼠腹膜内注射20mg/kg剂量的 FQSE(SEQ IDNO：10)肽，导致显著的抗焦虑样和抗抑郁样作用。
在行为试验前30分钟向BALB/C小鼠注射5mg/kg剂量的荷包牡丹碱不影响小鼠在EPM和FS试验中的行为。
FQSE(SEQ ID NO：10)与荷包牡丹碱的共同施用显著降低了所述肽的抗焦虑样和抗抑郁样特性的表现，这可表明药物通过与GABA-A受体相互作用发挥功能作用的可能机制。
实施例12：新肽FQSE(SEQ ID NO：10)对神经炎症的体外作用，使用原代神经胶质 细胞
研究目的是评估FQSE(SEQ ID NO：10)肽对鼠原代神经胶质细胞中 LPS诱导的神经炎症的体外潜在作用。
12.1.方法
将细胞分成10组并进行以下处理。
对照细胞
+LPS(500ng/mL,24小时)
+LPS+FQSE(SEQ ID NO:10)，0.04μM
+LPS+FQSE(SEQ ID NO:10)，4μM
+LPS+FQSE(SEQ ID NO:10)，40μM
+LPS+FQSE(SEQ ID NO:10)，400μM
+FQSE(SEQ ID NO:10)，0.04μM
+FQSE(SEQ ID NO:10)，4μM
+FQSE(SEQ ID NO:10)，40μM
+FQSE(SEQ ID NO:10)，400μM
12.1.1.分析的参数
以下炎性生物标志物的表达水平(mRNA、qPCR)：IL-6、Il-1b、TNFa、 IKKb。
12.1.2.实验步骤
收集来自1-2日龄的新生C57/Bl6小鼠的全脑，不包含脑膜，并且置于不含钙或镁的HBSS改良培养基(Gibco 14190144)中，并根据Miltenyi Biotech 的制造商说明进行处理。所有程序均由韦恩州立(Wayne State University)大学机构动物护理和使用委员会根据美国国立卫生研究院指南批准。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1-2mL达尔伯克改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/营养混合物F-12，无酚红(DMEM/F-12)，(Gibco 21041025)中，其富含10％灭活胎牛血清(FBS)(ThermoFischer 10082147) 和1％抗生素-抗真菌药(ThermoFischer 15240062)。匀浆后，使细胞在含有 10mL培养基[DMEM/F-12；10％FBS；1％抗生素-抗真菌药]的带过滤盖的 NuncTM细胞培养处理瓶(ThermoFischer，178905)中，在5％CO2培养箱(Galaxy 170R，Eppendorf)中于37℃下生长。将细胞保持培养8-10天，每48-72小时更换部分培养基(70％)。在80％汇合时，将细胞在200rpm的摇床中于37℃下孵育2小时，以从神经胶质细胞培养物中分离少突胶质细胞(oligodendrocyte)和神经元。弃去悬浮的细胞，并用1mL不含钙或镁的达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS)(Gibco 14190144)洗涤粘附的细胞。然后，添加5mL 1x胰蛋白酶(ThermoFischer 15400054)，并将细胞在培养箱(5％CO2，37℃)中保持15分钟。这个步骤后，添加等量的完全培养基以停止胰蛋白酶作用，并将细胞在室温下1000 rpm离心10min。然后将细胞培养在24孔板(80000个细胞/孔)中，并在接种后48小时进行处理。
用以下条件将细胞处理24小时：LPS[250ng/ml]和单独的药物FQSE (SEQ ID NO：10)[400μM、40μM、4μM、0.04μM]。此外，使用所有浓度的药物FQSE(SEQ ID NO：10)与LPS[400μM+LPS、40μM+LPS、4 μM+LPS、0.04μM+LPS]。每组N＝3-4个样品。完全培养基用作对照。
暴露后，用1ml冷DPBS洗涤细胞并立即用1mlTrizol收获，随后用于 RNA提取。分析了TNF-α、IL-1b、IL-6、IKKb的基因表达。
12.2.结果
TNFa、IL-1b和Il-6表达水平的qPCR测量结果如图77所示。FQSE(SEQ ID NO：10)证明了对TNFa表达的显著剂量-响应作用。在400μM时，其有效抑制LPS诱导的TNFa表达，然而较低FQSE(SEQ ID NO：10)浓度的作用在统计学上不显著。在比LPS更弱的潜在应激源的慢性刺激下，较低浓度的FQSE(SEQ ID NO：10)仍可具有抗炎作用。这个假设由FQSE(SEQ IDNO：10)(即使在0.04μM时)能够降低非活化神经胶质细胞中基础TNFa 和IL-6表达水平的事实支持。
FQSE(SEQ ID NO：10)证明了在广泛的剂量范围内抑制LPS诱导的 IL-1b和IL-6表达的高效性。
NFKb下游信号转导基因IKKb的表达(图78)与FQSE(SEQ ID NO： 10)无关，然而所述基因的表达水平在所有处理中都相对较弱。此外，值得一提的是，未检测到响应于LPS的IKKb表达有显著变化，这表明这个基因在这个模型中似乎是不相关的标志物。
12.3.结论
FQSE(SEQ ID NO：10)抑制LPS诱导的促炎细胞因子TNF-α、IL-1b 和IL-6在原代神经胶质细胞中的表达，这可以表明其在调控神经炎症中的作用。
获得的数据与之前的蛋白质印迹结果高度相关，其中发现FQSE(SEQ ID NO：10)能够使应激诱导的ERK1/2(MAPK通路参与者)磷酸化水平正常化。在本研究中观察到的促炎细胞因子的受抑制表达也可认为是GABAa触发的MAPK抑制的结果(Leeetal.(2013).Neurotransmitters and microglial-mediated neuroinflammation.Curr.Prot.Pept.Sci.,14(1),21-32)。
实施例13：对鼻内施用后大鼠脑区域中的FQSE(SEQ ID NO：10)分布的研究
药代动力学研究目的是确定鼻内施用后大鼠脑区域中的FQSE(SEQ ID NO：10)分布。
研究设计
以在盐水中稀释的500μg/kg剂量鼻内(i.n.)施用氚标记肽FQSE(SEQ ID NO：10)。施用的样品含有2000μKi的氚标记肽[3H]FQSE(SEQ ID NO： 10)。施用后6分钟，获取脑、血、尿液的测试样品。
动物物种的选择
动物研究提供了认定供人类使用的物质的完整毒性信息。本研究是旨在治疗神经退行性疾病的药物的复杂药代动力学和药理学研究的一部分。选择 Wistar雄性大鼠进行研究。
动物数量
研究中使用的动物数量——5只Wistar雄性大鼠，其足以用于所测试作用的数据的显著性。
施用方法和剂量选择
施用物质一次，一次性鼻内施用(推注)。
剂量制备
使用氚标记肽FQSE(SEQ ID NO：10)进行研究。为此，向大鼠施用 500μg/kg(约150μg)剂量的2000μKi[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)。向动物施用的溶液使用盐水溶液制备。用于大鼠鼻内施用的溶液体积为20μl。
制备好剂量后，在施用前在4-2℃下保持3小时。
动物饲养
将动物饲养在聚碳酸酯笼子3型(825sq.cm)中的垫料上；笼子覆盖有钢格栅喂料器。关于垫料，使用了由专门制备的木屑制成的商业垫料 LIGNOCEL(JRS，德国)。定期检查垫料是否有微生物污染。试验数据保存在实验室文件中。
将用于实验动物的完全混合饲料“Chara”(Range of Agro products，俄罗斯)自由提供至笼盖中的喂食器。对饲养物质的微生物污染进行定期分析。分析结果以及有关生产者的饲喂的组成和质量的数据都记录在实验室文件中。
在标准饮用瓶中自由供给纯净饮用水。定期对水样进行微生物污染的试验。试验结果提交在当前实验室文件中。
将动物保持在受控的环境条件下(18-26℃和30-70％相对湿度)。在每个实验房间中不断监测温度和湿度。在饲养动物的房间中，保持12小时的光照周期和每小时至少10倍的房间换气。
在给药前使动物在实验室适应至少3天。在此期间，每天检查动物外观。检查时发现具有异常的动物排除在实验组外。
每只动物分配单独的编号，通过耳廓穿刺标记并固定在笼子标签上。所有涉及动物的程序均根据欧洲(欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的指令2010/63/EU)和俄罗斯(“用于实验室动物的维护和护理的GOST33216-2014指南。用于实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。
13.1方法
向动物施用肽并采血
在大鼠实验中，产品FQSE(SEQ ID NO：10)作为单次、推注、鼻内注射来施用。初步地，用水合氯醛(300mg/kg)麻醉大鼠，并且在10分钟内，以500μg/kg的剂量在20μl的体积(其中含有2000μKi的标记肽[3H] FQSE(SEQ ID NO：10))中施用产品FQSE(SEQ ID NO：10)。产品施用后6分钟内处死大鼠。将器官活组织在盐水溶液中漂洗5-7秒，转移至称重的塑料小瓶中，称重并用液氮冷冻。使用无菌盐水溶液(0.9％NaCl)制备旨在施用给动物的FQSE(SEQ ID NO：10)溶液。
组织样品的制备
在制备用于高效液相色谱(HPLC)测定的组织之前，将塑料管中的冷冻并称重的组织样品冷冻干燥2天。为了制备肽提取物，进行有机稀释剂的连续提取、减压蒸发和离心。将冻干的血液样品在65℃下加热30分钟，之后将样品分散在相同的塑料小瓶中且水平刀以5000rot/min的速度旋转。首先用含有1％三氟乙酸的90％水-乙腈来提取样品。然后，将旨在在色谱中鉴定肽级分的10μg肽FQSE FQSE(SEQ ID NO：10)添加至提取用水-乙腈溶液中。离心后，将含有氚标记肽和血浆成分的溶液在减压下干燥，用甲醇重新提取并重新离心。将所得含有氚标记肽和血浆成分的溶液在减压下干燥，用0.1％的七氟丁酸水溶液再提取并进一步离心。为了验证样品制备的方法，将含10μKi的肽[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)的10μl溶液施用给200μl大鼠新鲜血液，之后根据所述方案处理样品。作为分析结果，在样品中发现了 95％的初始标记肽[3H]FQSE(SEQ ID NO：10)。
13.2结果
肽的定量分析HPLC是在柱Kromasil C18(4x150mm)上进行，甲醇梯度(0-40％)，且具有0.08％TFA和0.02％HFBA(七氟丁酸)。收集含有肽FQSE(SEQ ID NO：10)的级分，并用液体闪烁计数测定其放射性。肽 (SEQ ID NO：10)在组织中的分布如表15所示。
表15：鼻内施用500μg/kg剂量的2000μKi[3H]FQSE(SEQ ID NO：10) 后6分钟内的肽FQSE(SEQ ID NO：10)在大鼠脑组织中的分布。浓度表示为平均值±平均值的误差。
Figure DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE023
发现鼻内施用后肽FQSE(SEQ ID NO：10)的最大亲和力在嗅球中，在此的含量显著高于其他脑区域。还发现与其他脑区域相比，前额叶皮层、海马体和下丘脑中存在更高水平的肽FQSE(SEQ ID NO：10)。组织中肽 FQSE(SEQ ID NO：10)的浓度低于血液中：鼻内施用后6分钟，脑中的 FQSE(SEQ ID NO：10)浓度约为其血液浓度的1/5-1/10。
13.3结论
发现了肽FQSE(SEQ ID NO：10)的最大亲和力发现在嗅球中，在此的含量显着高于其他脑区域。还表明，与其他脑区域相比，前额叶皮层、海马体和下丘脑中存在更高水平的肽FQSE(SEQ ID NO：10)。这些结果表明肽FQSE(SEQ ID NO：10)能够穿过血脑屏障。
等价物
本领域技术人员仅使用常规实验就能认识到或能够确定本文中具体描述的特定实施方案的多个等价物。此类等价物也包含在以下权利要求的范围内。
通过引用并入
本文中引用的所有专利和出版物都通过引用以其全文并入本文。
提供本文中讨论的出版物仅仅是因为它们在本申请申请日之前公开。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类出版物。
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尽管开放式术语“包含”作为例如包括、含有或具有的术语的同义词，在本文中用于描述和要求保护本发明，但本发明或其实施方案可替代地使用替代术语例如“由……组成”或“基本上由……组成”来描述。
如本文所用，词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下提供某些益处的技术的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，列举一个或多个优选实施方案并不暗示其他实施例是无用的，并且不旨在将其他实施方案排除在技术范围之外。
序列表
<110> 拉托科公司（Lactocore, Inc.）
A·马雷舍夫（MALYSHEV, Anton）
I·多罗宁（DORONIN, Igor）
G·巴布金（BABKIN, Gennady）
A·库丘莫夫（KUCHUMOV, Askar）
<120> 合成的神经调节肽
<130> LACT-001PC/121851-5001
<150> US 62/818,458
<151> 2019-03-14
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 1
Tyr Leu Gln Tyr
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 2
Tyr Gln Leu Tyr
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 3
Tyr Leu Glu Gln
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 4
Gln Tyr Leu Tyr
1
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 5
Tyr Leu Lys Tyr
1
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 6
Tyr Leu Lys Thr
1
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 7
Phe Leu Leu Tyr
1
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 8
Tyr Gln Lys Phe
1
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 9
Leu Tyr Gln Glu
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 10
Phe Gln Ser Glu
1
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 11
Phe Tyr Gln Lys
1
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 12
Tyr Leu Gly Tyr
1
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 13
Pro Phe Thr Glu
1
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 14
Trp Asp Gln Val
1
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 15
Pro Glu Val Phe
1
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 16
Leu Ser Arg Tyr
1
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 17
Leu Leu Arg Phe
1
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 18
Met Pro Leu Trp
1
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 19
Lys Tyr Gln Phe
1
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 20
Tyr Gln Phe Leu
1
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 21
Phe Phe Val Ala
1
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 22
Lys Thr Val Tyr
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 23
Phe Ser Asp Ile
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 24
Ser Phe Ser Asp
1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 25
Leu Leu Tyr Gln
1
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 26
Asp Lys Thr Glu
1
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 27
Tyr Tyr Val Pro
1
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 28
Phe Thr Glu Ser
1
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 29
Gly Thr Gln Tyr
1
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 30
Phe Leu Gly Ala
1
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 31
Tyr Thr Asp Ala
1
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 32
Tyr Pro Ser Tyr
1
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 33
Phe Pro Lys Tyr
1
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 34
Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 35
Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg
1 5 10
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 36
Phe Leu Pro Tyr
1

Claims (98)

1.包含合成的神经调节肽的组合物，所述神经调节肽由通式I定义：
R1R2R3R4(I)
其中：
R1选自氨基酸W、F和D；
R2是亲水性氨基酸；
R3是亲水性氨基酸；且
R4选自氨基酸V和E。
2.如权利要求1所述的组合物，其中R1是W。
3.如权利要求1所述的组合物，其中R1是F。
4.如权利要求1所述的组合物，其中R1是D。
5.如权利要求1所述的组合物，其中R2是亲水性氨基酸，所述亲水性氨基酸选自极性且带正电荷的亲水性氨基酸、极性且电荷中性的亲水性氨基酸和极性且带负电荷的亲水性氨基酸。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述极性且电荷中性的亲水性氨基酸选自N、Q、S、T和C。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述极性且带负电荷的亲水性氨基酸选自D、E、C和Y。
8.如权利要求1所述的组合物，其中R2选自D、Q和K。
9.如权利要求8所述的组合物，其中R2是D。
10.如权利要求8所述的组合物，其中R2是Q。
11.如权利要求8所述的组合物，其中R2是K。
12.如权利要求1所述的组合物，其中R3是亲水性氨基酸，所述亲水性氨基酸选自极性且带正电荷的亲水性氨基酸、极性且电荷中性的亲水性氨基酸和极性且带负电荷的亲水性氨基酸。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述极性且带正电荷的亲水性氨基酸选自R和K。
14.如权利要求12所述的组合物，其中所述极性且电荷中性的亲水性氨基酸选自N、Q、S、T和C。
15.如权利要求14所述的组合物，其中R3是N。
16.如权利要求14所述的组合物，其中R3是Q。
17.如权利要求14所述的组合物，其中R3是S。
18.如权利要求14所述的组合物，其中R3是T。
19.如权利要求14所述的组合物，其中R3是C。
20.如权利要求12所述的组合物，其中所述极性且带负电荷的亲水性氨基酸选自D和E。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述极性且带负电荷的亲水性氨基酸是E。
22.如权利要求1所述的组合物，其中R3选自Q、S和T。
23.如权利要求22所述的组合物，其中R3是Q。
24.如权利要求22所述的组合物，其中R3是S。
25.如权利要求22所述的组合物，其中R3是T。
26.如权利要求1所述的组合物，其中R4是V。
27.如权利要求1所述的组合物，其中R4是E。
28.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1选自W、F和D；
R2选自D、Q和K；
R3选自Q、S和T；且
R4选自V和E。
29.如权利要求28所述的组合物，其中：
R1是W；
R2是D；
R3是Q；且
R4是V。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的苯二氮卓结合位点结合。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的神经类固醇位点结合。
32.如权利要求29所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的α-β结合位点结合。
33.如权利要求28所述的组合物，其中：
R1是F；
R2是Q；
R3是S；且
R4是E。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的苯二氮卓结合位点结合。
35.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的神经类固醇结合位点结合。
36.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的α-β结合位点结合。
37.如权利要求28所述的组合物，其中：
R1是D；
R2是K；
R3是T；且
R4是E。
38.如权利要求37所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的苯二氮卓结合位点结合。
39.如权利要求37所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的神经类固醇结合位点结合。
40.如权利要求37所述的组合物，其中所述组合物能够与GABA-A受体的α-β结合位点结合。
41.如权利要求1至40中任一项所述的组合物，其中所述神经调节肽的等电点(pI)值小于约6。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述神经调节肽的等电点(pI)值在约3.5至约4.5之间。
43.如权利要求42所述的组合物，其中所述神经调节肽的等电点(pI)值在约3.3至约4.2之间。
44.如权利要求1至43中任一项所述的组合物，其中所述神经调节肽由不包括脯氨酸的氨基酸组成。
45.包含神经调节肽的组合物，所述神经调节肽由通式Ia定义：
R1R2R3R4(Ia)
其中：
R1选自氨基酸W、F和D；
R2选自氨基酸D、Q和K；
R3是极性且电荷中性的亲水性氨基酸；且
R4选自氨基酸V和E。
46.如权利要求45所述的组合物，其中R1是W。
47.如权利要求45所述的组合物，其中R1是F。
48.如权利要求45所述的组合物，其中R1是D。
49.如权利要求45所述的组合物，其中R2是D。
50.如权利要求45所述的组合物，其中R2是Q。
51.如权利要求45所述的组合物，其中R2是K。
52.如权利要求45所述的组合物，其中R3是选自N、Q、S、T、P和C的极性且电荷中性的亲水性氨基酸。
53.如权利要求52所述的组合物，其中R3选自Q、S和T。
54.如权利要求52所述的组合物，其中R3是Q。
55.如权利要求52所述的组合物，其中R3是S。
56.如权利要求52所述的组合物，其中R3是T。
57.如权利要求45所述的组合物，其中R4是V。
58.如权利要求45所述的组合物，其中R4是E。
59.如权利要求45所述的组合物，其中：
R1选自W、F和D；
R2选自D、Q和K；
R3选自Q、S和T；且
R4选自V和E。
60.如权利要求59所述的组合物，其中：
R1是W；
R2是D；
R3是Q；且
R4是V。
61.如权利要求59所述的组合物，其中：
R1是F；
R2是Q；
R3是S；且
R4是E。
62.如权利要求59所述的组合物，其中：
R1是D；
R2是K；
R3是T；且
R4是E。
63.如权利要求45至62中任一项所述的组合物，其中所述神经调节肽的等电点(pI)值小于约6。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述神经调节肽的等电点(pI)值在约3.5至约4.5之间。
65.如权利要求64所述的组合物，其中所述神经调节肽的等电点(pI)值在约3.3至约4.2之间。
66.如权利要求45至65中任一项所述的组合物，其中所述神经调节肽由不包括脯氨酸的氨基酸组成。
67.如权利要求1至65中任一项所述的组合物，其中所述肽任选地被化学修饰。
68.如权利要求67所述的组合物，其中所述化学修饰选自R1、R2、R3和R4中的一个或多个的酰胺化、甲基化和乙酰化。
69.如权利要求67所述的组合物，其中所述化学修饰选自将甲酰基、焦谷氨酰基(pGlu)、脂肪酸、尿素、氨基甲酸酯、磺酰胺、烷基胺或其任意组合添加到R1、R2、R3和R4中的一个或多个。
70.如权利要求1至68中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
71.如权利要求1至68中任一项所述的组合物，其进一步包含递送媒介物。
72.如权利要求71所述的组合物，其中所述递送媒介物选自脂质体、纳米颗粒和多糖。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述多糖选自环糊精、壳聚糖、纤维素和藻酸盐。
74.如权利要求1至72中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制为鼻内施用。
75.如权利要求74所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种鼻粘膜蛋白酶抑制剂。
76.如权利要求75所述的组合物，其中所述抑制剂选自bestatine、comostate淀粉酶、亮抑酶肽、抑肽酶、杆菌肽、amastatine、硼亮氨酸、嘌呤霉素、胆汁盐和夫西地酸。
77.如权利要求1至72中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制为通过吸入施用。
78.如权利要求77所述的组合物，其中所述通过吸入施用是使用干粉鼻内装置进行的。
79.如权利要求1至72中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制为静脉内施用。
80.如权利要求1至72中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制为口服施用。
81.如权利要求1至79中任一项所述的组合物，其中所述肽调节γ-氨基丁酸A(GABA-A)受体。
82.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1至81中任一项所述的组合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
83.一种调节细胞中γ-氨基丁酸A(GABA-A)受体的方法，包括使所述细胞与权利要求1至81中任一项所述的组合物接触。
84.一种治疗有此需要的患者的情绪疾病的方法，包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1至81中任一项所述的组合物。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述情绪疾病是抑郁症。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述抑郁症选自重度抑郁症、心境恶劣、爆发性抑郁症、难治性抑郁症和与帕金森病相关的抑郁症、与创伤后应激疾病相关的抑郁症、产后抑郁症、双相抑郁症和自杀意图。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述情绪疾病是焦虑症。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述焦虑症选自分离焦虑症、选择性缄默症、特定恐惧症(SP)、社交焦虑症(SAD)、恐慌症、广场恐惧症、物质/药物诱发的焦虑症和归因于另一种药物情况的焦虑症、广泛性焦虑症(GAD)、创伤后应激疾病(PTSD)、重度抑郁症(MDD)、治疗抗性抑郁症(TRD)、产后抑郁症(PPD)、双相障碍或双相抑郁症、强迫症(OCD)、注意力缺陷多动症(ADHD)、社交恐惧症、阿尔茨海默病中的躁动、阿尔茨海默病中的攻击性和强迫症。
89.如权利要求84所述的方法，其中所述情绪疾病是精神分裂症。
90.如权利要求84所述的方法，其中所述情绪疾病是恐慌症。
91.如权利要求84所述的方法，其中所述情绪疾病是注意力缺陷多动症(ADHD)。
92.如权利要求84所述的方法，其中所述情绪疾病是应激相关疾病。
93.如权利要求84至86中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用抗抑郁药，其中所述抗抑郁药任选地选自由以下组成的组：血清素再摄取抑制剂、选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂、联合作用SSRI/SNRI、血清素-2拮抗剂/再摄取抑制剂、具有α-2拮抗作用加上血清素-2和血清素-3拮抗作用的抗抑郁药、具有血清素/去甲肾上腺素/多巴胺再摄取抑制作用的抗抑郁药、具有去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制作用的抗抑郁药、5-HT-1alpha拮抗剂、5-HT-1beta拮抗剂、5-HT1A受体激动剂、5-HT1A受体激动剂和拮抗剂、5-HT2受体拮抗剂、盐酸维洛沙嗪、脱氢表雄酮、NMDA受体拮抗剂、AMPA受体增强剂、P物质拮抗剂/神经激肽-1受体拮抗剂、非肽P物质拮抗剂、神经激肽2拮抗剂、神经激肽3拮抗剂、促肾上腺皮质激素释放因子受体拮抗剂、抗糖皮质激素药物、糖皮质激素受体拮抗剂、皮质醇阻断剂、一氧化氮合成抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、脑啡肽酶抑制剂、GABA-A受体激动剂、自由基捕获剂、非典型MAOI、选择性MAOI抑制剂、激素、亚叶酸、甲酰四氢叶酸、曲马多以及色氨酸与抗精神病药物组合，其中所述抗精神病药物选自由非典型抗精神病药物和多巴胺系统稳定剂组成的组。
94.如权利要求84至86中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用任选选自以下一种或多种药剂的额外抑郁症治疗剂：CYMBALTA口服、LEXAPRO口服、EFFEXOR XR口服、ZOLOFT口服、CELEXA口服、TRAZODONE口服、PROZAC口服、WELLBUTRIN XL口服、CITALOPRAM口服、PRISTIQ口服、AMITRIPTYLINE口服、SAVELLA口服、VIIBRYD口服、PAXIL CR口服、WELLBUTRIN口服、PAXIL口服、SERTRALINE口服、REMERON口服、NORTRIPTYLINE口服、VENLAFAXINE口服、FLUOXETINE口服、BUPROPION HCL口服、MIRTAZAPINE口服、RITALIN口服、PAROXETINE口服、WELLBUTRIN SR口服、DOXEPIN口服、METHYLPHENIDATE口服、SYMBYAX口服、ESCITALOPRAM OXALATE口服、PAMELOR口服、IMIPRAMINE口服、BRINTELLIX口服、DULOXETINE口服、NARDIL口服、FETZIMA口服、EMSAM TRANSDERMAL、PARNATE口服、PEXEVA口服、BRISDELLE口服、CLOMIPRAMINE口服、ANAFRANIL口服、TOFRANIL口服、FLUVOXAMINE口服、ZYBAN口服、DESIPRAMINE口服、SARAFEM口服、PROZAC WEEKLY口服、APLENZIN口服、METHYLIN口服、NEFAZODONE口服、QUILLIVANT XR口服、TOFRANIL-PM口服、NORPRAMIN口服、REMERONSOLTAB口服、BUPROPION HBR口服、OLEPTRO ER口服、DESVENLAFAXINE SUCCINATE口服、BUPROBAN口服、IMIPRAMINE PAMOATE口服、VILAZODONE口服、MILNACIPRAN口服、PAROXETINEMESYLATE口服、SURMONTIL口服、MAPROTILINE口服、PROTRIPTYLINE口服、PHENELZINE口服、MARPLAN口服、OLANZAPINE-FLUOXETINE口服、TRANYLCYPROMINE口服、SELEGILINETRANSDERMAL、AMOXAPINE口服、FORFIVO XL口服、ISOCARBOXAZID口服、DESVENLAFAXINE口服、KHEDEZLA口服、LEVOMILNACIPRAN口服、VORTIOXETINE口服和DESVENLAFAXINE FUMARATE口服。
95.如权利要求87至88中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用任选选自以下一种或多种药剂的额外焦虑治疗剂：苯二氮卓类，选自阿普唑仑(XANAX)、氯硝西泮(KLONOPIN)、地西泮(VALIUM)、劳拉西泮(ATIVAN)、奥沙西泮(SERAX)和氯氮卓(librium)；β阻断剂，选自普萘洛尔(INDERAL)和阿替洛尔(TENORMIN)；三环抗抑郁药，选自丙咪嗪(TOFRANIL)、地昔帕明(NORPRAMIN、PERTOFRANE)、去甲替林(AVENTYL或PAMELOR)、阿米替林(ELAVIL)、多塞平(SINEQUAN或ADAPIN)、氯米帕明(ANAFRANIL)；单胺氧化酶抑制剂(MAOI)，选自苯乙肼(NARDIL)、反苯环丙胺(PARNATE)；选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)，选自氟西汀(PROZAC)、氟伏沙明(LUVOX)、舍曲林(ZOLOFT)、帕罗西汀(PAXIL)、草酸艾司西酞普兰(LEXAPRO)、西酞普兰(CELEXA)；血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，选自文拉法辛(EFFEXOR)、文拉法辛缓释剂(EFFEXOR XR)和度洛西汀(CYMBALTA)；温和的镇静剂，例如丁螺环酮(BUSPAR)；以及抗惊厥药，选自丙戊酸盐(DEPAKOTE)、普瑞巴林(LYRICA)和加巴喷丁(NEURONTIN)。
96.一种治疗有此需要的患者的神经退行性疾病的方法，包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1至81中任一项所述的组合物。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述神经退行性疾病是帕金森病。
98.如权利要求96所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。
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