CN115379847A - 用于调节代谢型谷氨酸受体5的合成肽 - Google Patents

用于调节代谢型谷氨酸受体5的合成肽 Download PDF

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Abstract

描述了一种包含合成神经调节肽的药物组合物。本发明公开了如权利要求书中所限定的神经调节肽以及将此类分子用于治疗应用的方法。已发现包含在所述组合物中的所述神经调节肽能有效治疗情绪障碍和运动障碍，包括伴随情绪和精神障碍的运动障碍。

Description

用于调节代谢型谷氨酸受体5的合成肽
技术领域
本公开涉及包含用于治疗抑郁症和其他精神障碍以及运动障碍的蛋白质(诸如肽治疗剂)的组合物。
优先权
本申请要求2020年4月15日提交的美国临时专利申请第63/010,425号的优先权和利益，所述美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
以电子方式提交的文本文件的描述
本申请包含通过EFS-Web以电子方式提交的ASCII格式的序列表。创建于2021年4月14日的ASCII副本被命名为LACT-002PC_ST25.txt，大小为4757字节。该序列表以引用的方式整体并入本文。
背景技术
抑郁症表现在影响受试者的情绪的多种情况中，影响着全世界数百万人，并且抑郁症的治疗仍然普遍不足。虽然已经开发了多种用于治疗抑郁症和相关病症的药物，但是这些药物通常特异性不足，并且对约40％的患者无效。另外，患者通常需要数周时间才能从药物的治疗作用中获益。此外，许多已知的药物具有各种副作用。肌张力障碍、静坐不能、帕金森症(parkinsonism)和舞蹈症运动障碍是抗精神病药物的常见副作用。虽然最初与经典的抗精神病药物(诸如氯丙嗪(chlorpromazine)或氟哌啶醇(haloperidol))相关联，但是它们也被描述为与包括所有非典型精神安定药、抗抑郁药(三环和SSRI)和抗惊厥药(诸如丙戊酸钠)的宽泛范围的其他精神病药物相关联。参见Lennox等人(2002).Mind andmovement:the neuropsychiatry of movement disorders.J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry.72(s1):i28-i31。
焦虑性障碍虽然不同于抑郁症，但是常常伴随着抑郁症。许多抗焦虑药物都有类似于抗抑郁药的问题。发现有效的抑郁症和焦虑症治疗的挑战包括鉴定适当的上调或下调靶标。另一个挑战是设计针对这些靶标并且能够在相对短的时间范围内缓和抑郁症和焦虑症症状的安全、低成本的治疗剂。抑郁症的另一个共病症状是精神运动迟缓，这是重性抑郁性障碍的核心特征，它指示障碍更严重、预后更差。与此同时，主要运动障碍(诸如帕金森氏病(Parkinson's disease)、特发性肌张力障碍、亨廷顿氏病(Huntington's disease)和抽动秽语综合征(Gilles de la Tourette's syndrome)、自发性震颤)涉及重要的精神层面，这表明需要对这些疾病的精神病学和神经病学表现进行复杂的治疗干预。因此，仍然需要开发用于治疗抑郁症、运动障碍和相关疾病的有效且安全的治疗剂。
发明内容
在各个方面，本发明提供了可用于治疗各种精神、行为、情感、神经症、运动和情绪障碍的组合物和方法，该障碍包括抑郁症、焦虑症、与应激有关的障碍以及运动机能减退、运动机能亢进和运动迟缓。在一些方面，呈药物组合物形式的合成神经调节肽(诸如四肽)可被用于治疗抑郁症和其他情绪或自主运动障碍。
在一些实施方案中，提供了包含由通式I限定的合成神经调节肽的组合物：
R1R2R3R4(I)，其中R1-R4中的至少一个是疏水性的，并且R1-R4中的至少一个是极性的或带电荷的；R1-R4中没有一个选自L、M、I、T、C、P、N、Q、F、Y和W；并且该肽调节mGluR5受体(GRM5)。
在一些实施方案中，R1是D，R2是S，R3是G，并且R4是H。在一些实施方案中，R1是R，R2是A，R3是H，并且R4是E。在一些实施方案中，R1是K，R2是E，R3是D，并且R4是V。在一些实施方案中，R1是A，R2是G，R3是A，并且R4是S。
本文所述的神经调节肽及其类似物被开发用于调节mGluR5受体(GRM5)。鉴于GRM5受体与包括焦虑症和抑郁症的精神障碍之间的已知联系，本公开的神经调节肽可有效预防或治疗各种抑郁症-焦虑症谱系障碍以及运动障碍，包括帕金森氏病。可使用所描述的神经调节肽治疗的病症的非限制性实例包括广泛性焦虑性障碍(GAD)、创伤后应激障碍(PTSD)、重性抑郁性障碍(MDD)、难治性抑郁症(TRD)、产后抑郁症(PPD)、双相型障碍或双相型抑郁症、强迫性障碍(OCD)和精神分裂症。可以使用所描述的神经调节肽治疗的运动障碍(MD)包括运动机能减退性MD，诸如帕金森氏病(原发性或特发性和继发性)和帕金森叠加综合征(Parkinson plus syndrome)；运动机能亢进性MD，诸如肌张力障碍(特别是药物诱导的肌张力障碍和特发性肌张力障碍)、运动障碍(例如，迟发性或左旋多巴诱导的运动障碍)、自发性震颤、亨廷顿氏舞蹈病、图雷特综合征(Tourette's syndrome)、刻板性运动障碍和此类具有运动成分的精神障碍(诸如注意力缺陷多动障碍(ADHD))。在一些实施方案中，该运动障碍是运动机能减退性运动障碍或运动机能亢进性运动障碍。在一些实施方案中，该运动障碍伴随精神障碍。
在一些方面，四肽可以是任选地经化学修饰的。化学修饰可以选自对其中一个或多个氨基酸的酰胺化、甲基化和乙酰化。额外的化学修饰可以包括添加甲酰基、焦谷氨酰基(pGlu)、一种或多种脂肪酸、尿素、氨基甲酸酯、磺酰胺、烷基胺或它们的任何组合。所述组合物可以包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物可以进一步包含递送媒介物，该递送媒介物可以是例如脂质体、纳米颗粒或多糖。所述组合物可以经由各种途径施用给确定需要治疗的受试者，并且在一些方面，所述组合物被配制用于鼻内施用。
附图说明
图1例示了用于新型水槽(NT)测试的器具。
图2例示了用于明暗箱(LDB)测试的器具。
图3A-3H例示了氯胺酮(“Ket”)在NT(A-E)和LDB(F-H)测试中的行为影响。图3A-在槽顶部花费的时间(“时间表面”，％)；图3B-进入槽顶部的等待时间(“到顶部的LP”，％)；图3C-在水族箱上部2/3部分(顶部+中部区域)花费的时间(“顶部+中部的时间”，％)；图3D-行进的距离(“距离”，％)；图3E-速度(“速度”，％)；图3F-在明亮隔室内花费的时间(“对明亮花费的时间”，％)；图3G-进入明亮隔室的等待时间(“到明亮的LP”，％)；图3H-转换次数(“向明亮转换”，％)。数据显示为与对照值相比的百分比。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于对照组的显著差异(曼-惠特尼U测试(Mann-Whitney U-test))。
图4A-4H例示了在NT(A-E)和LDB(F-H)测试中不同剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)治疗的行为影响。图4A-在槽顶部花费的时间；图4B-进入槽顶部的等待时间；图4C-在水族箱上部2/3部分(顶部+中部区域)花费的时间；图4D-行进的距离；图4E-速度；图4F-在明亮隔室内花费的时间；图4G-进入明亮隔室的等待时间；图4H-转换次数。数据显示为与对照值相比的百分比。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于相应对照组的显著差异(曼-惠特尼U测试)。
图5A-5H例示了在NT(A-E)和LDB(F-H)测试中不同剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)治疗的行为影响。图5A-在槽顶部花费的时间；图5B-进入槽顶部的等待时间；图5C-在水族箱上部2/3部分(顶部+中部区域)花费的时间；图5D-行进的距离；图5E-速度；图5F-在明亮隔室内花费的时间；图5G-进入明亮隔室的等待时间；图5H-转换次数。数据显示为与对照值相比的百分比。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于相应对照组的显著差异(曼-惠特尼U测试)。
图6A-6E例示了在NT(A-E)测试中不同剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)治疗的行为影响。图6A-在槽顶部花费的时间；图6B-进入槽顶部的等待时间；图6C-在水族箱上部2/3部分(顶部+中部区域)花费的时间；图6D-行进的距离；图6E-速度。数据显示为与对照值相比的百分比。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于相应对照组的显著差异(曼-惠特尼U测试)。
图7A-7H例示了在NT(A-E)和LDB(F-H)测试中不同剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)治疗的行为影响。图7A-在槽顶部花费的时间；图7B-进入槽顶部的等待时间；图7C-在水族箱上部2/3部分(顶部+中部区域)花费的时间；图7D-行进的距离；图7E-速度；图7F-在明亮隔室内花费的时间；图7G-进入明亮隔室的等待时间；图7H-转换次数。数据显示为与对照值相比的百分比。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于相应对照组的显著差异(曼-惠特尼U测试)。
图8A-8E例示了在NT测试中不同剂量的AYFE(SEQ ID NO:10)治疗的行为影响。图8A-在槽顶部花费的时间；图8B-进入槽顶部的等待时间；图8C-在水族箱上部2/3部分(顶部+中部区域)花费的时间；图8D-行进的距离；图8E-速度。数据显示为与对照值相比的百分比。结果表示为平均值±SEM。
图9例示了来自对照组(左图)和氯胺酮治疗组(右图)的斑马鱼的2D轨迹。深色线条代表位于水族箱“顶部”的轨迹的一部分。
图10例示了在用氯胺酮和不同剂量的所研究的四肽治疗后的行为影响的总结。“G”箭头代表抗焦虑样作用，“r”-致焦虑样作用，“y”-活动过度或探索活动增强，“b”-药物产生的镇静作用。
图11A、11B、11C和11D例示了BALB/C小鼠在腹膜内药物注射后30分钟在旷场测试(Open Field test)中的行为。图11A.总行进距离，cm。图11B.用后腿直立的次数。图11C.进入中心次数。图11D.在中心花费的时间。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于对照组的显著差异。单向ANOVA与费希尔LSD事后测试。
图12A、12B、12C和12D例示了BALB/C小鼠在腹膜内药物注射后30分钟在高架十字迷宫(Elevated Plus Maze)中的行为。图12A.行进的距离，cm。图12B.冻结时间，s。图12C.用后腿直立的次数。图12D.进入开臂次数。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于对照组的显著差异。单向ANOVA与费希尔LSD事后测试。
图13A、13B和13C例示了BALB/C小鼠在腹膜内药物注射后30分钟在波尔索特强迫游泳测试(Porsolt Forced Swim test)(两天修改)中的行为。图13A.主动游泳的时间,s。图13B.被动游泳时间,s。图13C.不动时间，s。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于对照组的显著差异，并且#p<0.05代表相较于氟伏沙明组(FA)的显著差异。单向ANOVA与费希尔LSD事后测试。
图14A、14B和14C例示了斯普拉-道来氏大鼠(Sprague-Dawley rat)在鼻内药物施用后30分钟在旷场测试中的行为。图14A.总行进距离，cm。图14B.进入中心次数。图14C.在中心花费的时间，s。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于对照组的显著差异。单向ANOVA与费希尔LSD事后测试。
图15A、15B和15C例示了斯普拉-道来氏大鼠在鼻内药物施用后30分钟在新奇抑制摄食测试(Novelty Suppressed Feeding test)中的行为。图15A.进食等待时间，s。图15B.进食花费的时间，s。图15C.行进的距离，cm。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于对照组的显著差异。单向ANOVA与费希尔LSD事后测试。
图16例示了斯普拉-道来氏大鼠在训练日在鼻内药物施用后30分钟在新物体识别测试(Novel Object Recognition test)中的新物体偏好(％)。对因素“实验日”的显著影响F1,63＝16.01；根据重复测量的ANOVA，p＝0.0001。结果表示为平均值±SEM。
图17A、17B、17C和17D例示了斯普拉-道来氏大鼠在鼻内药物施用后30分钟在高架十字迷宫中的行为。图17A.开臂中花费的时间，s。图17B.进入开臂次数。图17C.焦虑指数(AI)，％。图17D.行进的距离，cm。结果表示为平均值±SEM。*p<0.05代表相较于对照组的显著差异。单向ANOVA与费希尔LSD事后测试。
图18A、18B和18C例示了斯普拉-道来氏大鼠在鼻内药物施用后30分钟在波尔索特强迫游泳测试(两天修改)中的行为。图18A.主动游泳的时间,s。图18B.被动游泳时间,s。图18C.不动时间，s。结果表示为平均值±SEM。
图19例示了mGluR5(GRM5)荧光素酶测定的原理。
图20例示了使用CHPG处理的HEK 293细胞mGluR5-荧光素酶报道基因测定的结果。将该细胞与10μM和100μM剂量的mGluR5SIB 1757的选择性非竞争性拮抗剂，0.2μM、2μM和20μM剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)肽共同施用。数据呈现为3次生物重复的平均值±SE。*p<0.05代表根据学生T测试(Student’s T-test)的相较于“经转染的细胞+CHPG”组的显著差异。
图21例示了使用CHPG处理或单独的20μM和200μM剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)的HEK 293细胞mGluR5-荧光素酶报道基因测定的结果。将经CHPG处理的细胞与10μM剂量的mGluR5 SIB 1757的选择性非竞争性拮抗剂或20μM、100μM和200μM剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)肽，或与SIB 1757(10μM)在一起的RAHE(SEQID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)(200μM)共同施用。数据呈现为3次生物重复的平均值±SE。*p<0.05代表根据学生T测试(Student’s T-test)的相较于“经转染的细胞+CHPG”组的显著差异。
图22例示了维斯达大鼠(Wistar rat)在30分钟间隔(任意单位)期间在自主运动活动测试(Locomotor Activity Test)中的运动活动。结果表示为平均值±SE。相对于对照组(盐水施用)，*-p<0.05，重复测量ANOVA与事后费希尔LSD测试。
图23A和23B例示了维斯达大鼠在横梁行走测试(Beam Walking test；BWT)中的感觉运动缺陷的严重程度。图23A.感觉运动缺陷的严重程度(前肢)，％。图23B.感觉运动缺陷的严重程度(后肢)，％。结果表示为平均值±SE。相对于对照组(盐水施用)，*-p<0.05。单向ANOVA与费希尔LSD事后测试。
图24A、24B和24C例示了维斯达大鼠的额叶皮质中的mRNA相对表达水平(针对GAPDH管家基因作归一化的)。图24A.Camk2n1mRNA的相对表达。图24B.Kcna1 mRNA的相对表达。图24C.Egr2mRNA的相对表达。结果表示为平均值±SE。*p<0.05代表相较于对照组的显著差异。单向ANOVA与费希尔LSD事后测试。
图25A、25B、25C和25D例示了维斯达大鼠在10-30分钟间隔(任意单位)的自发性运动活动测试(Spontaneous Motor Activity Test)中的自主运动。图25A.在该实验的前10分钟期间的自主运动。图25B.在该实验的10-40分钟期间的自主运动。图25C.在该实验的40-70分钟期间的自主运动。图25D.在该实验的70-100分钟期间的自主运动。结果表示为平均值±SE。纵轴代表任意单位，反映大鼠每分钟的运动行动次数(区间上的平均值)。相对于对照组，*-p<0.05(重复测量ANOVA与事后费希尔LSD测试)。
图26例示了旷场测试中的冻结持续时间，秒。结果表示为平均值±SE。单向ANOVA与事后费希尔LSD测试[F(6,56)＝3.6，p＝0.004]。相较于对照组，*-p<0.05，相较于“AFS+媒介物”组，#-p<0.05。
图27例示了在EPM测试中，实验组中参观(进入)开臂和不参观(不进入)开臂的动物的比例(以％计)。*p<0.05-与对照组的显著差异，#p<0.05-与“AFS+媒介物”组的显著差异。χ2测试与耶茨校正(Yates’correction)。
图28例示了媒介物或地塞米松(DXMT)注射后的血清皮质酮浓度，nmol/L。结果表示为平均值±SE。重复测量ANOVA[F(6,56)＝3.1，p＝0.01；费希尔LSD测试]。相较于每个治疗组中相应“媒介物”，*-p<0.05。
图29A、29B、29C、29D、29E和29F例示了在不同浓度的KEDV(SEQ ID NO:4)、RAHE(SEQ ID NO:3)或MPEP的存在下，CHO-mGluR5细胞对1mM谷氨酸钠(Glu-Na)的[Ca2+]反应。图29A.施加浓度为0.02μM、2μM、20μM和200μM的KEDV(SEQ ID NO:4)后的[Ca2+]电流的实例图29B.施加浓度为0.02μM、2μM、20μM和200μM的RAHE(SEQ ID NO:3)后的[Ca2+]电流的实例图29C.施加浓度为0.1μM、1μM、10μM和100μM的MPEP后的[Ca2+]电流的实例。[Ca2+]电流被测量为在进行Glu-Na添加之前(FI基线)和之后(FI)荧光强度的变化。显示的数据是测定期间归一化荧光信号对时间的代表性平均图(n＝3)。每个平均图均对相应的图的0秒时间点时的平均FI基线作归一化。图29D.KEDV(SEQ ID NO:4)在峰CHO-mGluR5细胞活化时(Glu-Na施加后27秒)时对细胞内[Ca2+]水平的抑制作用。图29E.RAHE(SEQ ID NO:3)在峰CHO-mGluR5细胞活化时(Glu-Na施加后27秒)时对细胞内[Ca2+]水平的抑制作用。图29F.MPEP在峰CHO-mGluR5细胞活化时(Glu-Na施加后27秒)对细胞内[Ca2+]水平的抑制作用。纵坐标轴上的值1是活化前荧光的基线水平(0秒时间点时的FI基线)。使用不成对的t测试进行统计分析。相对于使用Glu-Na的阳性对照，*-p<0.05，相对于阴性对照，#-p<0.05。
具体实施方式
本文提供了肽组合物，其可用于例如治疗抑郁症、焦虑症、相关情绪病症、与应激有关的障碍和运动障碍。在一些方面，开发了用于抑郁、焦虑和运动障碍范围内的一系列精神病学和神经学病症的基于肽的神经调节治疗组合物。选择中枢神经系统(CNS)靶标以实现神经调节肽组合物的高特异性和功效。结合肽的预期安全特性，根据本公开的组合物提供了安全且有效的治疗。
在根据本公开的实施方案中，选择GRM5受体(其为代谢型受体)作为所描述的神经调节肽组的靶标。GRM受体的内源性配体是谷氨酸，其为CNS中主要的兴奋性神经递质。GRM5是功能性同型二聚体和G蛋白偶联受体(GPCR)3类的成员。GRM5具有由三个细胞内环和三个细胞外环连接的典型的GPCR七次跨膜区。它具有一个大的双叶细胞外N末端结构域，该结构域含有正构激动剂的结合位点。GRM调节神经递质释放和突触后兴奋性神经传递，并且因此调节传递的强度。GRM5在整个CNS中广泛表达。GRM5拮抗剂在抗焦虑和抗抑郁测试中表现出显著的活性(Carroll等人.(2008).Antagonists at metabotropic glutamate receptorsubtype 5:structure activity relationships and therapeutic potential foraddiction.Ann.N.Y.Acad.Sci.1141(1):221-232)。随着mGluR5的高选择性变构拮抗剂(包括2-甲基-6-(苯乙炔基)-吡啶(MPEP)和相关化合物)的发现，在GRM5生物学领域取得了重大突破。这些化合物不与变构谷氨酸结合位点相互作用，但与GRM5的七次跨膜结构域中的变构位点结合，以抑制受体与GTP结合蛋白的偶联(Knoflach等人.(2001).Positiveallosteric modulators of metabotropic glutamate 1receptor:characterization,mechanism of action,and binding site.PNAS.98(23):13402-13407)。这些mGluR5-选择性负变构调节剂(NAM)对理解这种受体的生理作用具有重要影响，并且使研究表明mGluR5的拮抗剂具有作为新型治疗剂的潜力(Rodriguez等人.(2010).Discovery of novelallosteric modulators of metabotropic glutamate receptor subtype 5revealschemical and functional diversity and in vivo activity in rat behavioralmodels of anxiolytic and antipsychotic activity.Mol.Pharmacol.78(6):1105-1123)。
本公开的发明人发现了具有新结构并具有与GRM5受体的NAM位点结合的能力的神经调节肽。发现这些肽的抗焦虑和抗抑郁样活性与氯胺酮和诸如氟伏沙明(fluvoxamine)和氟西汀(fluvoxamine)的SSRI相当。对斑马鱼(zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio))和啮齿动物的实验证实了这一点。此外，本发明人观察到肽在各种行为范例中对动物自主运动的显著影响。进一步的研究支持RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)在急性足休克应激模型中的抗焦虑样和抗抑郁样作用。足部电击是具有身体和情感成分的复杂应激源，其在精神药理学领域中被用作开发多种动物模型的工具。参见Bali&Jaggi.Electric footshock stress:a useful tool in neuropsychiatric studies.Rev Neurosci.2015；26(6):655-77。在实施方案中，RAHE(SEQ ID NO:3)和/或KEDV(SEQ ID NO:4)通过鼻内施用，或使用其他施用途径施用。为了支持所研究的肽对GRM5的负变构调节的假说，在HEK 293细胞中进行了GRM5-荧光素酶报道基因测定，以及在CHO-mGluR5细胞中进行了谷氨酸钠诱发的[Ca2+]反应的研究。在下面的实施例中更详细地讨论了结果。
本公开的发明人已经通过计算创建了肽的集合，其中该集合中的肽被假设为对NAM结合位点具有亲和力的GRM5负变构调节剂(NAM)肽。使用三维对接算法从肽集合中选择更相关的肽。结果，鉴定了具有新序列的四肽家族。在一些方面，通过计算产生了许多作为潜在药物的四肽，并且测试了该四肽的子集。在一些方面，在斑马鱼(zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio))和啮齿类动物中的体内行为测试已经证实了四种例示性肽：AGAS(SEQ IDNO:1)、DSGH(SEQ ID NO:2)、RAHE(SEQ ID NO:3)、KEDV(SEQ ID NO:4)，具有与氯胺酮和氟伏沙明相当的抗焦虑样和/或抗抑郁样活性和/或与咖啡因相当的自主运动刺激作用，如下文更详细讨论的。
本公开的发明人设计并评估了神经调节肽，其被估计为具有与GRM5受体的NAM位点结合的能力。在一些方面，本公开的发明人在如本文所述的动物模型中进行了计算分析和实验，并且结果，鉴定了由以下通式限定的一组四肽：R1R2R3R4。
在一些方面，R1是位于GRM5受体的NAM位点中的氨基酸。该肽的N末端可以位于NAM位点中。可替代地，该肽的C末端可以位于NAM位点中。在本文的以下描述中，该肽被定义为从N末端延伸至C末端的序列。
发明人使用斑马鱼(zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio))、BALB/c小鼠和斯普拉-道来氏大鼠(Sprague-Dawley rat)作为模型，评估了四种例示性肽：AGAS(SEQ ID NO:1)、DSGH(SEQ ID NO:2)、RAHE(SEQ ID NO:3)、KEDV(SEQ ID NO:4)，以及所测试的其他(已知)测试物质的功效，如下面实施例部分中更详细讨论的。以前已经观察到，斑马鱼焦虑的增加与在亮/暗箱的黑暗隔室中花费的时间增加(暗轴增加—在黑暗庇护所中的愿望)和在新型水槽测试的底部花费的时间增加相关联。暗轴增加被证明是由探索-隐藏动机平衡向隐藏的转变引起。Maximino(2011)Pharmacological analysis of zebrafish(Danio rerio)scototaxis.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 35:624–631；Nguyen(2014)Aquatic blues:Modeling depression and antidepressant action inzebrafish.Prog.Neuro-Psychopharmacology Biol.Psychiatry55:26–39。因此，斑马鱼是用于评估潜在抗焦虑物质的合适模型。
本公开的发明人的发现与关于主题的已公布数据一致，根据该数据，处于新型水槽(即，亮/暗箱)条件下的斑马鱼行为是用于评估焦虑行为以及评估抗抑郁药和抗焦虑药的作用的适当模型。Maximino(2014).Fingerprinting of Psychoactive Drugs inZebrafish Anxiety-Like Behaviors.PLoS One.9.P.e103943。
在一些实施方案中，提供了包含由通式I限定的合成神经调节肽的组合物：
R1R2R3R4(I)，
其中R1-R4中的至少一个是疏水性的，并且R1-R4中的至少一个是极性的或带电荷的；R1-R4中没有一个选自L、M、I、T、C、P、N、Q、F、Y和W；并且该肽调节mGluR5受体(GRM5)。
在一些实施方案中，R1是R或K。在一些实施方案中，R1是D或E。在一些实施方案中，R1是S。R2可以是亲水中性的或带负电荷的亲水性的。在一些实施方案中，R2是疏水中性的。在一些实施方案中，R2是A、S、E或D。在一些实施方案中，R3是G、H、S或D。在一些实施方案中，R4是S、H、V或E。
在一些实施方案中，R1是D，R2是S，R3是G，并且R4是H。在一些实施方案中，R1是R，R2是A，R3是H，并且R4是E。在一些实施方案中，R1是K，R2是E，R3是D，并且R4是V。在一些实施方案中，R1是A，R2是G，R3是A，并且R4是S。
在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一者都是疏水性脂肪族氨基酸；并且R4是极性且电荷中性的亲水性氨基酸。
在一些实施方案中，R1是极性且带负电荷的亲水性氨基酸；R2是极性且电荷中性的亲水性氨基酸；R3是疏水性脂肪族氨基酸；并且R4是芳族、极性且带正电荷的亲水性氨基酸。
在一些实施方案中，R1是D；R2是S；R3是G、A或V；并且R4是H。
在一些实施方案中，R1是极性且带正电荷的亲水性氨基酸；R2是疏水性的脂肪族氨基酸；R3是芳香族、极性且带正电荷的亲水性氨基酸；并且R4是极性且带负电荷的亲水性氨基酸。
在一些实施方案中，R1是R或K；R2是G、A或V；R3是H；并且R4是D或E。
在一些实施方案中，R1是极性且带正电荷的亲水性氨基酸；R2是极性且带负电荷的亲水性氨基酸；R3是极性且带负电荷的亲水性氨基酸；并且R4是疏水性的脂肪族氨基酸。
在一些实施方案中，R1是R或K；R2是D或E；R3是D或E；并且R4是G、A或V。在一些实施方案中，R1选自R、K、D、A和E；R2选自A、S、G、D和E；R3选自S、G、D、E、A和H；并且R4选自S、H、V和E。在一些实施方案中，R1是D；R2是S；R3是G；并且R4是H。
在一些实施方案中，提供了包含由通式II限定的神经调节肽的组合物：
R1R2R3R4(II)，
其中(1)R1选自非疏水性且非芳香族的氨基酸；在侧链上含有完全正电荷的氨基酸；在侧链上含有完全负电荷的氨基酸；以及不带电荷且在侧链中含有不超过5个原子的氨基酸；(2)R2选自不带电荷且在侧链中含有不超过5个原子的氨基酸，以及在侧链上含有完全负电荷的氨基酸；(3)R3选自不带电荷且在侧链中含有不超过5个原子的氨基酸；在侧链上含有完全负电荷的氨基酸；以及芳香族非疏水性的氨基酸；并且(4)R4选自不包括W、Y、F、P、I的氨基酸。
在一些实施方案中，R1选自A、R、K、D、E、Q、N、S、T、C和M；R2选自A、S、G、D和E；R3选自S、A、G、D、E和H；并且R4选自S、H、V和E。
在一些实施方案中，R1选自R、K、D、A和E；R2选自A、S、G、D和E；R3选自S、G、D、E、A和H；并且R4选自S、H、V和E。
在一些实施方案中，R1是D，R2是S，R3是G，并且R4是H。在一些实施方案中，R1是R，R2是A，R3是H；并且R4是E。在一些实施方案中，R1是K，R2是E，R3是D，并且R4是V。在一些实施方案中，R1是A，R2是G，R3是A，并且R4是S。
在一些实施方案中，R1是R、K、D、E、S或A。在一些实施方案中，R2是S、A、G或E。在一些实施方案中，R3是G、H、D或A。
在一些实施方案中，提供了包含由通式III限定的合成神经调节肽的组合物：
R1R2R3R4(III)，
其中(1)R1选自以下残基：含有用于堆叠相互作用的连接的p轨道系统，但不是芳族氨基酸或在侧链上含有完全正电荷的氨基酸或在侧链上含有完全负电荷的氨基酸或在侧链上含有不超过5个原子的不带电荷的氨基酸的非疏水性氨基酸；(2)R2选自不带电荷、在侧链中含有不超过5个原子或在侧链上含有完全负电荷的那些氨基酸残基；(3)R3选自不带电荷、在侧链中含有不超过5个原子或在侧链上含有完全负电荷或为芳族非疏水性的那些氨基酸残基；并且(4)R4选自除疏水性芳香族或具支链疏水性氨基酸残基之外的任何氨基酸残基，条件是V任选地被包括在R4中。
在实施方案中，R1选自带正电荷的R或K、带负电荷的D或E，或S或A。在实施方案中，R2选自A、S、G和D、E。在实施方案中，R3选自A、G、H、S、D。在实施方案中，R4不包括W、Y、F、P、I。
在一些实施方案中，合成神经调节肽由氨基酸A、G、A和S组成。在一些实施方案中，合成神经调节肽由氨基酸D、S、G和H组成。在一些实施方案中，合成神经调节肽由氨基酸K、E、D和V组成。在一些实施方案中，合成神经调节肽由氨基酸R、A、H和E组成。
在一些实施方案中，提供了包含由通式IV限定的合成神经调节肽的组合物：
R1R2R3R4(IV)
其中R1是非疏水性的氨基酸；R2是不带电荷的或亲水性的氨基酸；R3是极性亲水性或脂肪族中性氨基酸；并且R4选自不包括W、Y、F、P、I的氨基酸。
在一些实施方案中，R1是R或K。在一些实施方案中，R1是D或E。在一些实施方案中，R1是S。在一些实施方案中，R1选自不包括F、Y、W和H的氨基酸。
在一些实施方案中，R2是亲水性中性的。在一些实施方案中，R2是带负电荷的亲水性的。在一些实施方案中，R2是疏水性中性的。在一些实施方案中，R2是A、S、E或D。
在一些实施方案中，R3是G、H、S或D。
在一些实施方案中，R4是S、H、V或E。
在一些实施方案中，R1是D，R2是S，R3是G，并且R4是H。在一些实施方案中，R1是R，R2是A，R3是H，并且R4是E。在一些实施方案中，R1是K，R2是E，R3是D，并且R4是V。
在一些实施方案中，R1选自R、K、D、E、Q、N、S、T、C和M；R2选自A、S、G、D和E；R3选自S、G、D、E和H；并且R4选自S、H、V和E。
在实施方案中，该肽是四肽，并且第一、第二和第三氨基酸残基是疏水性脂肪族氨基酸，诸如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)，而第四氨基酸残基是极性且电荷中性的亲水性氨基酸，诸如天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)。
在实施方案中，该肽是四肽，并且第一氨基酸残基是极性且带负电荷的亲水性氨基酸，诸如天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，第二氨基酸残基是极性且电荷中性的亲水性氨基酸，诸如天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)，第三氨基酸残基是疏水性脂肪族氨基酸，诸如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)，并且第四氨基酸残基是芳香族、极性且带正电荷的亲水性氨基酸，诸如组氨酸(H)。
在实施方案中，该肽是四肽，并且第一氨基酸残基是极性且带正电荷的亲水性氨基酸，诸如精氨酸(R)或赖氨酸(K)，第二氨基酸残基是疏水性脂肪族氨基酸，诸如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)，第三氨基酸残基是芳香族、极性且带正电荷的亲水性氨基酸，诸如组氨酸(H)，并且第四氨基酸残基是极性且带负电荷的亲水性氨基酸，诸如天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。
在实施方案中，该肽是四肽，并且第一氨基酸残基是极性且带正电荷的亲水性氨基酸，诸如精氨酸(R)或赖氨酸(K)，第二氨基酸残基是极性且带负电荷的亲水性氨基酸，诸如天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，第三氨基酸残基是极性且带负电荷的亲水性氨基酸，诸如天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，并且第四氨基酸残基是疏水性脂肪族氨基酸，诸如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)。
根据本公开的神经调节肽可以呈药物组合物的形式。该组合物可以施用于需要治疗的受试者，例如被诊断为患有表现为抑郁和/或焦虑和/或运动损伤的障碍的受试者。
在一些实施方案中，神经调节肽由不包括脯氨酸的氨基酸组成。
在一些实施方案中，根据本公开的肽或超过一种肽可以作为活性成分包含于食料中。在这些实施方案中，该肽可以包含于作为食物制剂的组合物中。食品组合物可以包含任何非活性成分。此外，除了一种或多种根据本公开的肽之外，食物组合物还可以包含不影响该肽的有效性的其他活性成分。
在一些实施方案中，根据本公开的肽是该组合物的活性成分。在其他实施方案中，该组合物的活性成分是肽的类似物，该类似物可以是N末端修饰的类似物或C末端修饰的类似物。
在一些实施方案中，根据本公开的肽是任选地经化学修饰的。在一些实施方案中，化学修饰选自对R1、R2、R3和R4中的一者或多者的酰胺化、甲基化和乙酰化，如本文针对式I、II、III或IV所描述的。在其他实施方案中，可以执行其他各种类型的肽主链和/或侧链修饰。在一些实施方案中，化学修饰选自向R1、R2、R3和R4中的一者或多者添加甲酰基、焦谷氨酰基(pGlu)、脂肪酸、尿素、氨基甲酸酯、磺酰胺、烷基胺或它们的任何组合，如本文针对式I、II、III或IV所描述的。
例如，在一些实施方案中，该肽可以是“假肽”，其中常规肽键(CO-NH)被等排(isosteric)或等电子(isoelectronic)类似物中的一种替换。例如，还原的酰胺(CH2-NH)可以被等排地引入到该肽中。在一些实施方案中，该肽可以氮杂肽的形式制备，其中肽主链的α-碳被氮替换(不改变氨基酸残基)。作为化学修饰的进一步实例，根据本公开的合成神经调节肽可以是反向-翻转肽(retro-inverso peptide)，其中D-氨基酸以反向的顺序使用。作为又一个实例，在一些实施方案中，根据本公开的合成神经调节肽可以是肽模拟物，其侧链附接到肽主链的氮原子，而不是附接到α-碳。以此方式，在一些实施方案中，合成神经调节肽可以是类肽或聚N-取代的甘氨酸。
在一些实施方案中，可通过将非天然氨基酸掺入到肽中的某些位置来任选地修饰合成神经调节肽。非天然氨基酸的非限制性实例包括D-氨基酸、N-甲基化(或N-烷基化)氨基酸、α-取代的α-氨基酸、β-取代的α-氨基酸、β-氨基酸和γ-氨基酸。
在一些实施方案中，合成神经调节肽可以通过该肽的环化来修饰。在一些实施方案中，合成神经调节肽可以被修饰成使得该肽是β-转角模拟肽。在一些实施方案中，该肽中的苯丙氨酸(F)(如果存在)可以被硝基-、氨基-、氟-苯丙氨酸或其他蛋白酶抑制剂替换。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物进一步包含递送媒介物。递送媒介物可选自脂质体、纳米颗粒和多糖。在一些实施方案中，多糖可选自环糊精、壳聚糖、纤维素和藻酸盐。
根据本公开的组合物可以被配制用于各种施用途径。施用途径的非限制性实例包括吸入、鼻内、经口、静脉内、肌肉内和皮下施用。
在一些实施方案中，该组合物被配制用于鼻内施用。配制用于鼻内施用的组合物可以包含至少一种鼻粘膜蛋白酶抑制剂。抑制剂的非限制性实例包括一种或多种选自以下的化合物：贝斯他汀(bestatine)、初乳淀粉酶(comostate amylase)、亮抑酶酞(leupeptin)、抑酶肽(aprotinin)、杆菌肽(bacitracin)、阿美坦醌(amastatine)、硼酸亮氨酸(boroleucine)、嘌呤霉素(puromycin)、胆汁盐和夫西地酸(例如，乙二胺四乙酸二钠)。鼻内递送是治疗性肽的非侵入性施用途径，并且提供了静脉内或皮下注射的替代方案。
在一些实施方案中，该组合物被配制用于通过吸入施用。在一些实施方案中，配制用于通过吸入施用的组合物可以使用鼻内器械施用。鼻内器械可以是例如干粉鼻内器械，其被配置为以干粉形式向受试者递送治疗剂。在一些实施方案中，鼻内器械可以被配置为在临床环境之外使用，使得治疗剂可以由受试者自行施用。
在一些实施方案中，该组合物被配制用于静脉内施用。
在一些实施方案中，该组合物被配制用于经口施用。
在一些实施方案中，该肽调节mGluR5受体(GRM5)。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何实施方案或实施方案的任何组合提供了药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的组合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，提供了用于调节细胞中的mGluR5(GRM5)受体的方法。该方法包括使细胞与根据本文所述的任何实施方案或实施方案的任何组合的组合物接触。
在一些实施方案中，提供了用于治疗有需要的患者的情绪障碍的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案的组合物。在一些实施方案中，提供了一种用于治疗有需要的患者的情绪障碍和运动障碍的方法。该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案或实施方案的任何组合的组合物。情绪障碍可能是抑郁症。在一些实施方案中，抑郁症选自重性抑郁性障碍、心境恶劣、突破性抑郁症、治疗难治性抑郁症和与帕金森氏病相关的抑郁症、与创伤后应激障碍相关的抑郁症、产后抑郁症和双相型抑郁症。在一些实施方案中，情绪障碍可以是与应激有关的障碍。
在一些实施方案中，情绪障碍是焦虑性障碍。焦虑性障碍可选自广泛性焦虑性障碍、社交焦虑性障碍和惊恐障碍。在一些实施方案中，情绪障碍是精神分裂症。在一些实施方案中，情绪障碍是创伤后应激障碍。
在一些实施方案中，情绪障碍是精神分裂症。在一些实施方案中，情绪障碍是惊恐障碍。在一些实施方案中，情绪障碍是与应激有关的障碍。
在一些实施方案中，运动障碍是运动机能减退性运动障碍或运动机能亢进性运动障碍。在实施方案中，运动机能减退性运动障碍选自帕金森氏病(原发性或特发性帕金森症)、继发性帕金森症、帕金森叠加综合征、哈-斯二氏病(Hallevorden-Spatz disease)、进行性核上性眼肌麻痹和纹状体黑质变性。在实施方案中，运动机能亢进性运动障碍选自肌张力障碍、药物诱导的肌张力障碍、特发性家族性肌张力障碍、特发性非家族性肌张力障碍、痉挛性斜颈、特发性口面部肌张力障碍、眼睑痉挛、自发性震颤、药物诱导的震颤、肌阵挛、眼阵挛、舞蹈病、药物诱导的舞蹈病、风湿性舞蹈病(西德纳姆舞蹈病(Sydenham’schorea))、亨廷顿氏舞蹈病、颤搐、单侧抽搐、手足徐动症、运动障碍、迟发性运动障碍、左旋多巴诱导的运动障碍、抽动障碍、图雷特综合征、刻板性运动障碍、阵发性夜间肢体运动、不宁腿综合征、僵人综合征和大脑性麻痹。在一些实施方案中，帕金森氏病包括原发性帕金森氏病或特发性帕金森氏病、继发性帕金森氏病或帕金森叠加综合征。在一些实施方案中，运动障碍可以是肌张力障碍、自发性震颤、亨廷顿氏舞蹈病、图雷特综合征、刻板性运动障碍。在一些实施方案中，运动障碍可以是注意力缺陷多动障碍。在一些实施方案中，运动障碍包括紧张症。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的ADHD的方法，其包括施用有效量的包含合成神经调节肽的组合物。在一实施方案中，合成神经调节肽与额外的治疗剂组合施用。
在一些实施方案中，本发明包括ADHD和/或其症状的治疗。ADHD是一种以例如注意力不集中、过度活动、冲动或其组合为特征的疾病。不受理论的束缚，据信阶段性多巴胺释放减少是ADHD的重要缺陷。
因此，本发明的方法和组合物可用于治疗ADHD和/或其症状。使用本发明的方法和组合物可以治疗任何类型的ADHD，包括但不限于组合型ADHD、主要是注意力不集中型ADHD和主要是多动-冲动型ADHD。
在一些实施方案中，本发明可用于治疗同一受试者的ADHD和抑郁症。在一些实施方案中，本发明提供了一种通过向有需要的患者施用有效量的包含合成神经调节肽的组合物来治疗ADHD的方法。患者还可以接受包含一种或多种本文所述的额外治疗剂的先前存在的疗法和/或组合疗法。
使用本发明的方法和组合物治疗ADHD的功效可以通过各种方法进行评估。例如，可以使用如例如在Madaan等人.,(2008)(CNS Drugs,22(4):275-90)(其全部内容据此通过引用并入本文)中描述的ADHD等级量表来评估功效。例示性的ADHD量表包括例如成人ADHD自我报告量表(ASRS)、ADHD行为检查表/ADHD等级量表和ADHD研究者症状等级量表(AISRS)。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的精神分裂症的方法，其包括施用有效量的包含合成神经调节肽的组合物。在一实施方案中，合成神经调节肽与额外的治疗剂组合施用。
在一些实施方案中，本发明包括精神分裂症和/或其症状的治疗。以一系列精神病理学为特征的精神分裂症是指可基于临床征象分为亚型的慢性衰弱性障碍。精神分裂症的偏执型亚型以存在妄想或幻听为特征，精神分裂症的紊乱型亚型表现为紊乱的言语或行为，以及平淡或不适当的情感。精神分裂症的紧张型亚型的特征是可能涉及运动不动以及过度运动活动的精神运动障碍。紧张型精神分裂症可能包括昏迷(接近无意识的状态)、僵住症(身体僵硬的恍惚性发作)、蜡样柔韧性(四肢保持在另一个人放置的位置)和缄默症(缺乏言语反应)。精神分裂症的残余亚型以缺乏显著的阳性症状为特征。最后，未分化精神分裂症是当一个人表现出超过一种其他类型精神分裂症的行为(包括妄想、幻觉、言语或行为紊乱以及紧张性行为)时使用的分类。
因此，本发明的方法和组合物可用于治疗精神分裂症和/或其症状。使用本发明的方法和组合物可以治疗任何类型的精神分裂症，包括但不限于偏执型精神分裂症、紧张型精神分裂症、精神分裂症的残余亚型和未分化型精神分裂症。
在一些实施方案中，本发明可用于治疗同一受试者的精神分裂症和抑郁症。在一些实施方案中，本发明提供了一种通过向有需要的患者施用有效量的包含合成神经调节肽的组合物来治疗精神分裂症的方法。患者还可以接受包含一种或多种本文所述的额外治疗剂的先前存在的疗法和/或组合疗法。
患有精神分裂症的患者常常具有包括ADHD在内的其他精神障碍的症状。因此，在一些实施方案中，本发明可用于治疗同一受试者的ADHD和精神分裂症。在一些实施方案中，本发明提供了一种通过向有需要的患者施用有效量的包含合成神经调节肽的组合物来治疗ADHD和精神分裂症的方法。患者还可以接受包含一种或多种本文所述的额外治疗剂的先前存在的疗法和/或组合疗法。额外治疗剂的实例包括兴奋剂，诸如哌甲酯(methylphenidate)和安非他明(amphetamine)，尽管任何其他一种或多种额外治疗剂可用于治疗ADHD和精神分裂症二者。
用于治疗精神分裂症的治疗剂的非限制性实例包括氯丙嗪(chlorpromazine)(THORAZINE)、氟奋乃静(fluphenazine)(PROLIXIN)、氟哌啶醇(haloperidol)(HALDOL)、奋乃静(perphenazine)(TRILAFON)、硫利达嗪(thioridazine)(MELLARIL)、替沃噻吨(thiothixene)(NAVANE)、三氟拉嗪(trifluoperazine)(STELAZINE)、阿立哌唑(aripiprazole)(ABILIFY)、月桂酰阿立哌唑(aripiprazole lauroxil)(ARISTADA)、阿塞那平(asenapine)(SAPHRIS)、依匹哌唑(brexpiprazole)(REXULTI)、卡利拉嗪(cariprazine)(VRAYLAR)、氯氮平(clozapine)(CLOZARIL)、伊潘立酮(iloperidone)(FANAPT)、甲磺酸卢美哌隆(lumateperone tosylate)(CAPLYTA)、鲁拉西酮(lurasidone)(LATUDA)、奥氮平(olanzapine)(ZYPREXA)、帕利哌酮(paliperidone)(INVEGA SUSTENNA)、棕榈酸帕利哌酮(paliperidone palmitate)(INVEGA TRINZA)、喹硫平(quetiapine)(SEROQUEL)、利培酮(risperidone)(RISPERDAL)和齐拉西酮(ziprasidone)(GEODON)。
用于治疗ADHD的治疗剂的非限制性实例包括右旋安非他明(dextroamphetamine)(DEXEDRINE)、右旋安非他明(dextroamphetamine)(ZENZEDI)、右旋安非他明和安非他明(ADDERALL)、右哌甲酯(FOCALIN)、哌甲酯(METHYLIN；RITALIN)、硫酸安非他明(DYANAVEL；EVEKEO)、右旋安非他明(DEXEDRINE SPANSULE)、右旋安非他明和安非他明(ADDERALL；MYDAYIS)、右哌甲酯(FOCALIN)、赖氨酸安非他明(lisdexamfetamine)(VYVANSE)、哌甲酯(APTENSIO；CONCERTA；COTEMPLA；DAYTRANA；METADATE；RITALIN；QUILLICHEW；QUILLIVANT)、阿托西汀(atomoxetine)(STRATTERA)、氯压定(clonidine)(CATAPRES；KAPVAY)、胍法辛(guanfacine)(INTUNIV；TENEX)、布普品(bupropion)(WELLBUTRIN)和脱甲丙咪嗪(desipramine)(NORPRAMIN)、丙咪嗪(imipramine)(TOFRANIL)、去甲替林(nortriptyline)(AVENTYL；PAMELOR)。
任何上述或其他合适的治疗剂都可用作与本文所述的组合物联合的额外治疗剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的双相型障碍的方法，其包括施用有效量的包含合成神经调节肽的组合物。双相型障碍可以是双相I型障碍、双相II型障碍、循环性心境障碍，或者它可以是症状与以上三种类型的症状不匹配的双相型障碍。在一实施方案中，合成神经调节肽与额外的治疗剂组合施用。在一些实施方案中，本发明包括双相型障碍和/或其症状的治疗。用于治疗双相型障碍的治疗剂的非限制性实例包括卡马西平(carbamazepine)(CARBATROL；EPITOL；EQUETRO；TEGRETOL)、双丙戊酸钠(divalproex sodium)(DEPAKOTE)、拉莫三嗪(lamotrigine)(LAMICTAL)、丙戊酸锂(DEPAKENE)、氟哌啶醇(HALDOL)、洛沙平(loxapine)(LOXITANE；ADASUVE)、利培酮(RISPERDAL)、阿立哌唑(ABILIFY)、阿塞那平(SAPHRIS)、卡利拉嗪(VRAYLAR)、鲁拉西酮(LATUDA)、奥氮平(ZYPREXA)、富马酸喹硫平(quetiapine fumarate)(SEROQUEL)和齐拉西酮(GEODON)。
在一些实施方案中，提供了根据本文所述的任何实施方案或实施方案的任何组合治疗情绪障碍和/或运动障碍的方法，该方法进一步包括施用抗抑郁药。该抗抑郁药任选地选自由以下组成的组：血清素再摄取抑制剂、选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂、组合作用SSRI/SNRI、血清素-2拮抗剂/再摄取抑制剂、具有α-2拮抗作用加上血清素-2和血清素-3拮抗作用的抗抑郁药、具有血清素/去甲肾上腺素/多巴胺再摄取抑制作用的抗抑郁药、具有去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制作用的抗抑郁药、5-HT-1α拮抗剂、5-HT-1β拮抗剂、5-HT1A受体激动剂、5-HT1A受体激动剂和拮抗剂、5-HT2受体拮抗剂、盐酸维洛沙嗪、脱氢表雄酮、NMDA受体拮抗剂、AMPA受体增强剂、P物质拮抗剂/神经激肽-1受体拮抗剂、非肽P物质拮抗剂、神经激肽2拮抗剂、神经激肽3拮抗剂、促肾上腺皮质激素释放因子受体拮抗剂、抗糖皮质激素药物、糖皮质激素受体拮抗剂、皮质醇阻断剂、一氧化氮合成抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、脑啡肽酶抑制剂、GABA-A受体激动剂、自由基捕集剂、非典型MAOI、选择性MAOI抑制剂、激素、亚叶酸、醛氢叶酸、曲马多和色氨酸与抗精神病药物的组合，其中所述抗精神病药物选自由非典型抗精神病药物和多巴胺系统稳定剂组成的组。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何实施方案或实施方案的任何组合治疗情绪和运动障碍的方法进一步包括施用包含一种或多种额外剂的额外抑郁症治疗。
在一些实施方案中，提供了根据本文所述的任何实施方案或实施方案的任何组合治疗运动障碍的方法，该方法进一步包括施用针对运动障碍的额外焦虑治疗。
在一些实施方案中，本公开提供了进一步包含额外剂的根据任何所述实施方案的组合物和方法，以及向受试者施用该额外剂的方法。在一些实施方案中，本发明涉及共同施用和/或共同配制。本文所述的任何组合物可以与一种或多种合适的剂共同配制和/或共同施用。
在一些实施方案中，所述一种或多种额外剂包含选自以下中的一种或多种的剂：CYMBALTA经口剂、LEXAPRO经口剂、EFFEXOR XR经口剂、ZOLOFT经口剂、CELEXA经口剂、TRAZODONE经口剂、PROZAC经口剂、WELLBUTRIN XL经口剂、CITALOPRAM经口剂、PRISTIQ经口剂、AMITRIPTYLINE经口剂、SAVELLA经口剂、VIIBRYD经口剂、PAXIL CR经口剂、WELLBUTRIN经口剂、PAXIL经口剂、SERTRALINE经口剂、REMERON经口剂、NORTRIPTYLINE经口剂、VENLAFAXINE经口剂、FLUOXETINE经口剂、BUPROPION HCL经口剂、MIRTAZAPINE经口剂、RITALIN经口剂、PAROXETINE经口剂、WELLBUTRIN SR经口剂、DOXEPIN经口剂、METHYLPHENIDATE经口剂、SYMBYAX经口剂、ESCITALOPRAM OXALATE经口剂、PAMELOR经口剂、IMIPRAMINE经口剂、BRINTELLIX经口剂、DULOXETINE经口剂、NARDIL经口剂、FETZIMA经口剂、EMSAM TRANSDERMAL,PARNATE经口剂、PEXEVA经口剂、BRISDELLE经口剂、CLOMIPRAMINE经口剂、ANAFRANIL经口剂、TOFRANIL经口剂、FLUVOXAMINE经口剂、ZYBAN经口剂、DESIPRAMINE经口剂、SARAFEM经口剂、PROZAC WEEKLY经口剂、APLENZIN经口剂、METHYLIN经口剂、NEFAZODONE经口剂、QUILLIVANT XR经口剂、TOFRANIL-PM经口剂、NORPRAMIN经口剂、REMERON SOLTAB经口剂、BUPROPION HBR经口剂、OLEPTRO ER经口剂、DESVENLAFAXINESUCCINATE经口剂、BUPROBAN经口剂、IMIPRAMINE PAMOATE经口剂、VILAZODONE经口剂、MILNACIPRAN经口剂、PAROXETINE MESYLATE经口剂、SURMONTIL经口剂、MAPROTILINE经口剂、PROTRIPTYLINE经口剂、PHENELZINE经口剂、MARPLAN经口剂、OLANZAPINE-FLUOXETINE经口剂、TRANYLCYPROMINE经口剂、SELEGILINE TRANSDERMAL、AMOXAPINE经口剂、FORFIVO XL经口剂、ISOCARBOXAZID经口剂、DESVENLAFAXINE经口剂、KHEDEZLA经口剂、LEVOMILNACIPRAN经口剂、VORTIOXETINE经口剂和DESVENLAFAXINE FUMARATE经口剂。
在一些实施方案(包括但不限于涉及运动障碍的那些实施方案)中，该额外剂是以下中的一种或多种：左旋多巴、卡比多巴(CARBIDOPA)、沙芬酰胺(SAFINAMIDE)、普拉克索(PRAMIPEXOLE)、罗替戈汀(ROTIGOTINE)、罗匹尼洛(ROPINIROLE)、金刚烷胺(AMANTADINEM)、苯甲托品(BENZTROPINE)、三己芬迪(TRIHEXYPHENIDYL)、司来吉兰(SELEGILINE)、雷沙吉兰(RASAGILINE)、恩他卡朋(ENTACAPONE)、托卡朋(TOLCAPONE)、地西泮(DIAZEPAM)、氯硝西泮(CLONAZEPAM)、巴氯芬(BACLOFEN)、三己芬迪、苯甲托品、乙丙嗪(ETHOPROPAZINE)、劳拉西泮(LORAZEPAM)、溴隐亭(BROMOCRIPTINE)、四苯喹嗪(TETRABENAZINE)、普萘洛尔(PROPRANOLOL)、扑米酮(PRIMIDONE)、氟奋乃静(FLUPHENAZINE)、氟哌啶醇、利培酮、哌迷清(PIMOZIDE)、齐拉西酮、氟奋乃静、安非他明、哌甲酯、右哌甲酯、哌甲酯、盐酸阿托西汀(ATOMOXETINE HYDROCHLORIDE)和二甲磺酸赖右苯丙胺(LISDEXAMFETAMINE DIMESYLATE)。
在一些实施方案中，该一种或多种额外剂包含选自以下中的一种或多种的剂：氯丙嗪(THORAZINE)、氟奋乃静(PROLIXIN)、氟哌啶醇(HALDOL)、奋乃静(TRILAFON)、硫利达嗪(MELLARIL)、替沃噻吨(NAVANE)、三氟拉嗪(STELAZINE)、阿立哌唑(ABILIFY)、月桂酰阿立哌唑(ARISTADA)、阿塞那平(SAPHRIS)、依匹哌唑(REXULTI)、卡利拉嗪(VRAYLAR)、氯氮平(CLOZARIL)、伊潘立酮(FANAPT)、甲磺酸卢美哌隆(CAPLYTA)、鲁拉西酮(LATUDA)、奥氮平(ZYPREXA)、帕利哌酮(INVEGA SUSTENNA)、棕榈酸帕利哌酮(INVEGA TRINZA)、喹硫平(SEROQUEL)、利培酮(RISPERDAL)和齐拉西酮(GEODON)。
在一些实施方案中，该一种或多种额外剂包含选自以下中的一种或多种的剂：右旋安非他明(dextroamphetamine)(DEXEDRINE)、右旋安非他明(dextroamphetamine)(ZENZEDI)、右旋安非他明和安非他明(ADDERALL)、右哌甲酯(FOCALIN)、哌甲酯(METHYLIN；RITALIN)、硫酸安非他明(DYANAVEL；EVEKEO)、右旋安非他明(DEXEDRINE SPANSULE)、右旋安非他明和安非他明(ADDERALL；MYDAYIS)、右哌甲酯(FOCALIN)、赖氨酸安非他明(lisdexamfetamine)(VYVANSE)、哌甲酯(APTENSIO；CONCERTA；COTEMPLA；DAYTRANA；METADATE；RITALIN；QUILLICHEW；QUILLIVANT)、阿托西汀(atomoxetine)(STRATTERA)、氯压定(clonidine)(CATAPRES；KAPVAY)、胍法辛(guanfacine)(INTUNIV；TENEX)、布普品(bupropion)(WELLBUTRIN)、脱甲丙咪嗪(desipramine)(NORPRAMIN)、丙咪嗪(imipramine)(TOFRANIL)和去甲替林(nortriptyline)(AVENTYL；PAMELOR)。
在一些实施方案中，该一种或多种额外剂包含选自以下中的一种或多种的剂：卡马西平(carbamazepine)(CARBATROL；EPITOL；EQUETRO；TEGRETOL)、双丙戊酸钠(divalproex sodium)(DEPAKOTE)、拉莫三嗪(lamotrigine)(LAMICTAL)、丙戊酸锂(DEPAKENE)、氟哌啶醇(HALDOL)、洛沙平(loxapine)(LOXITANE；ADASUVE)、利培酮(RISPERDAL)、阿立哌唑(ABILIFY)、阿塞那平(SAPHRIS)、卡利拉嗪(VRAYLAR)、鲁拉西酮(LATUDA)、奥氮平(ZYPREXA)、富马酸喹硫平(quetiapine fumarate)(SEROQUEL)和齐拉西酮(GEODON)。
在一些实施方案中，该额外剂可以与根据本公开的肽缀合。
在一些实施方案中，提供了根据本文所述的任何实施方案或实施方案的任何组合治疗情绪障碍和运动障碍(其可存在于情绪障碍中)的方法，该方法进一步包括施用额外的抗焦虑治疗剂，该额外的抗焦虑治疗剂任选地选自以下中的一种或多种：苯二氮卓类，其选自阿普唑仑(alprazolam)(XANAX)、氯硝西泮(clonazepam)(KLONOPIN)、地西泮(diazepam)(VALIUM)、劳拉西泮(lorazepam)(ATIVAN)、奥沙西泮(oxazepam)(SERAX)和氯二氮卓(chlordiazepoxide)(利眠宁(librium))；β受体阻断剂，其选自普萘洛尔(propranolol)(INDERAL)和阿替洛尔(atenolol)(TENORMIN)；三环类抗抑郁药，其选自丙咪嗪(TOFRANIL)、脱甲丙咪嗪(NORPRAMIN、PERTOFRANE)、去甲替林(AVENTYL或PAMELOR)、阿米替林(amitriptyline)(ELAVIL)、多塞平(doxepin)(SINEQUAN或ADAPIN)、氯米帕明(clomipramine)(ANAFRANIL)；单胺氧化酶抑制剂(MAOI)，其选自苯乙肼(phenelzine)(NARDIL)、反苯环丙胺(tranylcypromine)(PARNATE)；选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)，其选自氟西汀(fluoxetine)(PROZAC)、氟伏沙明(fluvoxamine)(LUVOX)、舍曲林(sertraline)(ZOLOFT)、帕罗西汀(paroxetine)(PAXIL)、草酸艾司西酞普兰(escitalopram oxalate)(LEXAPRO)、西酞普兰(citalopram)(CELEXA)；血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，其选自文拉法辛(venlafaxine)(EFFEXOR)、文拉法辛缓释剂(EFFEXOR XR)和度洛西汀(duloxetine)(CYMBALTA)；温和的镇定剂，诸如丁螺环酮(buspirone)(BUSPAR)；以及抗惊厥药，其选自丙戊酸盐(DEPAKOTE)、普瑞巴林(pregabalin)(LYRICA)和加巴喷丁(gabapentin)(NEURONTIN)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗有需要的患者的神经退行性障碍的方法，该方法包括施用治疗有效量的根据本文所述的任何实施方案的组合物或其组合。该神经退行性障碍可以是例如帕金森氏病或阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)。
在一些实施方案中，根据本公开的实施方案的肽(例如，KEDV(SEQ ID NO:4)和/或RAHE(SEQ ID NO:3))或包含该肽的组合物被用作精神刺激剂。精神刺激剂是一种具有情绪增强和刺激特性的剂(例如，药物)，其能暂时增强精神运动活动、提高警觉性或暂时改善身体机能。精神刺激剂也可以被消极地定义为除了镇静剂或致幻物质以外的物质。Favrod-Coune&Broers.Pharmaceuticals(Basel,Switzerland)第3,7 2333-2361卷.2010年7月22日,doi:10.3390/ph3072333。精神刺激剂通常被用于治疗注意力缺陷障碍，并且有时被用于治疗抑郁症并经常被用作违禁物质。咖啡因是消费最多的社会认可的刺激剂。Favrod-Coune&Broers(2010)。
在实施方案中，将肽(例如，KEDV(SEQ ID NO:4)和/或RAHE(SEQ ID NO:3))施用于有需要的患者。在一些实施方案中，可以施用KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)的混合物。在一些实施方案中，该肽的施用导致Kcna1基因的表达降低。KCNA1基因属于提供制造钾通道的指令的基因家族，并且它提供了制造钾电压门控通道亚家族A成员1(Kv1.1，也表示为Kv1.1)的一部分(α亚单位)的指令。Kv1.1蛋白用作钾选择性通道，钾可通过该通道与电化学梯度一致。在实施方案中，通过鼻内施用该肽，诸如但不限于KEDV(SEQ ID NO:4)和/或RAHE(SEQ ID NO:3)。
在实施方案中，本发明组合物可以与其他部分，例如用于延长体内半衰期的额外剂或部分融合。除了增加稳定性之外，此类部分还可以增加与其融合的分子的溶解度。增加溶解度(例如，防止聚集)的部分可以使组合物更容易处理，特别是改善了稳定性和保质期。此类部分的众所周知的实例是PEG(聚乙二醇)。这个部分是特别设想的，因为它可以用作接头以及增溶部分。其他实例包括肽和蛋白质或蛋白质结构域，或甚至完整的蛋白质(例如，GFP)。在这方面，应注意的是，像PEG一样，一个部分可以具有不同的功能或效果。例如，flag标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO:5))是可以用作标记的肽部分，但是由于其电荷密度，其也将增强溶解性。聚乙二醇化已经常被证明能增加生物药物的溶解度(例如，Veronese和Mero(2008)The impact of PEGylation on biological therapies,BioDrugs.22(5)315-29)。向感兴趣的分子添加肽、多肽、蛋白质或蛋白质结构域标签已在本领域中被广泛描述。实例包括但不限于源自以下的肽：突触核蛋白(例如，Park等人.,Protein Eng.Des.Sel.2004；17:251-260)，SET(溶解度增强标签，Zhang等人,Protein Expr Purif 2004；36:207-216)、硫氧还蛋白(TRX)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、氮利用物质(NusA)、小泛素样修饰物(SUMO)、泛素(Ub)、二硫键C(DsbC)、十七千道尔顿蛋白(Skp)、噬菌体T7蛋白激酶片段(T7PK)、蛋白G Bl结构域、蛋白A IgG ZZ重复结构域和细菌免疫球蛋白结合结构域(Hutt等人.(2012)J Biol Chem.；287(7):4462-9)。该标签的性质取决于如可以由技术人员确定的应用。例如，对于本文所述分子的转基因表达，可以设想将该分子融合到更大的结构域以防止被细胞机制过早降解。其他应用可以设想与更小的增溶标签(例如，少于30个氨基酸，或少于20个氨基酸，或甚至少于10个氨基酸)融合，以便不太多地改变该分子的特性。额外的化学修饰可以包括添加甲酰基、焦谷氨酰基(pGlu)、一种或多种脂肪酸、尿素、氨基甲酸酯、磺酰胺、烷基胺或它们的任何组合。
除了延长半衰期之外，本发明的组合物(例如，根据本公开的实施方案的一种或多种肽)可以与改变其他或额外的药代动力学和药效学特性的部分融合。例如，已知与白蛋白(例如，人血清白蛋白)、白蛋白结合结构域或合成的白蛋白结合肽的融合改善了不同治疗蛋白的药代动力学和药效学(Langenheim和Chen,Endocrinol.；203(3):375-87,2009)。经常使用的另一部分是抗体的片段可结晶区(Fc)。这些部分的性质可以由本领域技术人员根据应用来确定。
在一些实施方案中，本公开的肽可以作为单独的药剂或与一种或多种其他药剂组合施用，其中该组合不会引起不可接受的副作用。
在一种或多种病症的治疗中要施用的活性成分的量可以根据诸如所用的特定肽和剂量单位，施用方式，治疗周期，所治疗患者的年龄、体重和性别以及所治疗病症的性质和程度等考虑因素而变化。根据本公开的组合物可以通过特定途径以合适的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，待施用的肽的剂量通常为约0.001mg/kg至约200mg/kg体重、约0.01mg/kg至约100mg/kg体重、约0.01mg/kg至约50mg/kg体重、约0.01mg/kg至约40mg/kg体重、约0.01mg/kg至约30mg/kg体重、约0.01mg/kg至约20mg/kg体重、约0.01mg/kg至约5mg/kg体重、约0.01mg/kg至约10mg/kg体重、约0.1mg/kg至约10mg/kg体重、约0.1mg/kg至约20mg/kg体重、约0.1mg/kg至约30mg/kg体重、约0.1mg/kg至约40mg/kg体重、约0.1mg/kg至约50mg/kg体重。临床上有用的给药计划将在一天一次给药至一天三次给药的范围内。含有本文所述的神经调节肽的药物组合物也可以作为单次剂量施用。由于该组合物的安全性和有效性，单次剂量的该组合物可以有效缓解与抑郁或焦虑有关的症状。也可以为更长时间的治疗过程制定治疗计划。例如，在一些实施方案中，根据本公开的实施方案的药物组合物可以在超过一天，例如，从2天至60天、或从2天至50天、或从2天至40天、或从2天至30天的时间内施用，并且日剂量可以在任何上述范围内。超过一天的施用可被用于治疗慢性症状或障碍，该慢性症状或障碍可以是各种精神性、行为性、情感性、神经性和情绪性障碍(包括抑郁症、焦虑症和与应激有关的障碍)中的任何一种。
“受试者”是哺乳动物，例如人(例如，女性或男性)、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人类灵长类动物，诸如猴子、黑猩猩、狒狒或恒河猴，并且术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
本发明进一步提供了可简化本文所描述的任何剂的施用的试剂盒。本发明的例示性试剂盒包含呈单位剂型的本文所描述的任何组合物。在一个实施方案中，单位剂型是容器，诸如预装注射器，其可以是无菌的，含有本文所描述的任何剂和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物。试剂盒可进一步包括指示本文所描述的任何剂的使用的标签或印刷说明书。试剂盒还可包括眼睑张开器(lid speculum)、局部麻醉剂和用于施用位置的清洁剂。试剂盒还可进一步包含一种或多种本文所描述的额外的剂。在一个实施方案中，试剂盒包括含有有效量的本发明组合物和有效量的另一种组合物，诸如本文所描述的组合物的容器。
本公开通过以下非限制性实施例来进一步说明。
实施例
实施例1：与GRM5(mGluR5)受体结合的四肽的建模
1.1.研究目标：
鉴定对mGluR5受体的负变构调节剂的结合位点具有最大亲和力的四肽。计算机生成的随机四肽文库以及来自酪蛋白和β-乳球蛋白的经实验获得的肽都被用作四肽的来源。
1.2.结果：
从总的四肽库中，排除含有半胱氨酸的肽，这将肽的总量缩小至130,321种肽。对于每种肽，执行与GRM受体的负变构调节位点(NAM位点)的对接，从而为每种肽产生至多20种对接姿态。总共产生了2 604 060个独特的对接姿态。然后对所有对接姿态进行分组和分析。简而言之，所述方法是测量特定类型的原子(芳香族碳原子、氢键供体/受体等)进入空间密度图的给定区域的频率。基于此图评估每个对接姿态，并且对原子和残基的数量作归一化。在对接阶段明确考虑传统的相互作用(静电、氢键合等)。
在以前对有限的四肽子集的研究中，鉴定了NAM对接位点的结构特征。由于结合袋的狭窄，具有大侧基的肽在空间上不能装入其中，并且聚集在对接位点的边缘上。为了防止概率模型的失真，这些肽被排除在进一步的计算之外。
1.2.1.计算机生成的随机四肽文库
0.92的阈值被用于筛选出足够数量的得分较高的最佳结果。这总共给出了29个结果。排名靠前的29个序列的标识分析揭示，虽然第一和第四位置相当易变，但第二位置明显偏好小氨基酸：丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。第三位置对甘氨酸具有明显的偏好。为了获得更好的统计意义，对1000个得分排名靠前的肽进行了标识分析，结果表明，第二位置处的丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸的存在可能是进入该位点的肽所必需的。该排名靠前的肽的第三位置甚至更不稳定，甘氨酸占显著优势。
只有少数高分(>0.9)的肽不符合以上规则。在位置2和3中不含丝氨酸和甘氨酸的肽是得分为0.94的DAHK(SEQ ID NO:6)、得分为0.93的RAHE(SEQ ID NO:3)、得分为0.91的HAMR(SEQ ID NO:7)和得分为0.91的HAHN(SEQ ID NO:8)。高分范围中的在第2位置处没有丙氨酸的唯一肽是得分为0.9的DTHK(SEQ ID NO:9)。
估计了最佳结果列表中各个四肽的出现频率。肽DSGH(SEQ ID NO:2)(0.93)出现了两次，其余的肽只出现了一次。
对于阴性对照，可以使用各种不能装入到结合袋中的不同肽或得分低的肽。为了进行精确和系统的评估，创建了其姿态不能装入到结合位点中的所有肽的标识，以及具有从0至0.1的姿态得分的肽的标识。因此，在第二位置处含有酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸和在第三个位置处含有苯丙氨酸或色氨酸的肽被建议作为阴性对照。例如，可以采用以下肽：AYFE(SEQ ID NO:10)、GFWY(SEQ ID NO:11)、QWFA(SEQ ID NO:12)、HWWM(SEQ ID NO:13)。
1.2.3.来自酪蛋白和β-乳球蛋白的经实验获得的肽
来自酪蛋白水解产物的肽样品产生了274种肽，总共5480个姿态。来自酪蛋白的肽样品(α、β和κ形式)由569种肽组成，总共10900个姿态。实验库中没有得分高于0.92的四肽。水解产物肽的最佳得分为0.81，酪蛋白肽的最佳得分为0.84。为这两个子样品选择了0.74的新阈值，导致排名靠前的水解产物肽仅产生11个独特姿态，而排名靠前的酪蛋白肽仅产生30个独特姿态。关于出现的频率，肽DAPS(SEQ ID NO:14)(最高得分0.76)出现了两次，其余的肽观察到了一次。在排名靠前的酪蛋白肽的列表中，肽ESRE(SEQ ID NO:15)(0.84)、ESTQ(SEQ ID NO:16)(0.79)、AAHA(SEQ ID NO:17)(0.77)被发现了两次。主要的水解产物肽具有相当低的得分，最好的等于0.74。
来自β-乳球蛋白的肽样品由175种肽组成，总共3020个姿态。如果使用0.74阈值并选择从β-乳球蛋白释放的肽中排名靠前的肽，就像对水解产物和酪蛋白的子样品执行的那样，那么下面的四肽将具有最好的得分。
1.3.用于测试的肽的选择
评估了130,321种四肽以及来自乳水解产物、β-乳球蛋白和酪蛋白的四肽子样品与GRM5受体的负变构调节剂结合的能力。
分析了排名靠前的四肽的各个位置处的氨基酸表示，并且观察到在第二位置具有甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的明显倾向并且在第三位置具有甘氨酸的明显倾向。
还进行了肽的最差姿态的分析，并且揭示了在它们的序列中第二和第三位置具有芳香族氨基酸的倾向。下列肽：AYFE(SEQ ID NO:10)、GFWY(SEQ ID NO:11)、QWFA(SEQ IDNO:12)、HWWM(SEQ ID NO:13)被建议作为阴性对照。
选择以下肽以用于验证该实验：
根据得分值，AGAS(SEQ ID NO:1)是最好的组合四肽；
DSGH(SEQ ID NO:2)是具有最佳出现率和标识分析的组合四肽；
RAHE(SEQ ID NO:3)也是具有高分的组合肽，但同时其与上文选择的肽根本不同，因为在标识分析中缺少共同的氨基酸G和S；
KEDV(SEQ ID NO:4)是来自抗焦虑水解产物组合物的主要四肽中最好的(根据得分)四肽。
AYFE(SEQ ID NO:10)是阴性对照。
实施例2：在斑马鱼(Zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio))中筛选所选肽的亲神经 活性
目的是研究精神活性剂对斑马鱼(Zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio))行为的影响，并且将这些结果与快速抗抑郁药氯胺酮的影响进行比较。
2.1.材料和方法
2.1.1.动物维持
将斑马鱼饲养在流通式ZebTEC斑马鱼圈舍系统(由Tecniplast制造)中，温度为28℃，pH为6.8-7.5，渗透压为550-700渗摩/升，光照方案为12/12，持续通气。斑马鱼每天被喂食两次特定饲料。在实验期间，该鱼在实验前一天的晚上和实验结束后的当天晚上被喂食。
2.1.2.物质、剂量和施用
氯胺酮
10％氯胺酮溶液用作参考物质。
AGAS
根据得分值，AGAS(SEQ ID NO:1)是最好的组合四肽。
DSGH
DSGH(SEQ ID NO:2)是具有最佳出现率和标识分析的组合四肽。
RAHE
RAHE(SEQ ID NO:3)也是具有高分的组合肽，但同时它与上文选择的肽根本不同，因为在标识分析中缺少共同的氨基酸G和S。
KEDV
KEDV(SEQ ID NO:4)是来自抗焦虑水解产物组合物的主要四肽中最好的(根据得分)四肽。
AYFE
AYFE(SEQ ID NO:10)被选择作为阴性对照。
施用
在测试前10分钟(根据文献数据，仅氯胺酮是在测试前15分钟)，使用胰岛素注射器(0.5ml，30g)将所测试的物质腹膜内注射到斑马鱼中。盐水溶液(0.9％NaCl)用作溶剂。通过将动物放置于温度为10℃的水中，实现动物的麻醉和固定。对照组鱼也在经历过预冷程序后接受等体积溶剂的腹膜内注射。
2.1.3.设备装置
在4升梯形水族箱中进行新型水槽测试，其参数如图1中所示。水族箱的底座、后壁和侧壁都由无光泽的黑色塑料制成；前面板(较短的壁)由透明Plexiglas制成。
用于亮/暗偏好测试的装置由三个主要部分组成：发射隔室、由白色塑料制成的明亮隔室和由黑色塑料制成的黑暗隔室。设施参数如图2中所示。这些测试中的明亮照明由附接到水族箱的上部的支架上的灯提供(LED灯PL，11W，光通量约600Lm，水面正上方约500Lx)。
2.1.4.行为测试
2.1.4.1.新型水槽测试
新型水槽(NT)测试如先前(Maximino等人.(2013).Behavioral andneurochemical changes in the zebrafish leopard strain.G2B.12(5):576-582)所描述的那样执行。在将斑马鱼放置于测试水族箱中之前20-30秒开始视频录制(背景拍摄)。使用网将实验用斑马鱼放置于水槽里。该录制进行了5分钟。使用EthoVision XT软件包(Noldus,Wageningen,Netherlands)进行测试。该软件记录了动物走过的距离、它的速度、参观水族箱的三个常规区域：“底部”、“中心”和“中部”(分别为水族箱的下、中和上三分之一)的次数、在这些区域中花费的时间，以及参观水族箱中部和表面的等待时间。
2.1.4.2.亮/暗箱测试
亮/暗箱(LDB)测试如先前(Maximino等人.(2011).Pharmacological analysisof zebrafish(Danio rerio)scototaxis.Prog.Neuro-Psychopharmacol.Biol.Psychiatry.35(2):624-631)所描述的那样执行。使用网将斑马鱼放置于LDB的明亮隔室中，同时打开摄像机，并且记录斑马鱼的行为5分钟。使用RealTimer(OpenScience)处理视频。在记录的处理期间，记录停留时间和参观测试装置的明亮隔室和黑暗隔室的次数，以及参观这两个隔室的等待时段。
2.1.5.数据分析
使用统计软件包STATISTICA 10和GraphPad Prism 6进行统计分析。使用科莫戈洛夫-斯米尔诺夫测试(Kolmogorov-Smirnov test)评估数据的正态性，以确定是否使用参数或非参数统计测试。为了进行配对比较，使用了学生T测试或曼-惠特尼(M-W)U测试。每个治疗组都有相应的对照组。结果表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。
2.2.评估测试物质对斑马鱼行为的影响
2.2.1.氯胺酮
在NT测试中观察到20mg/kg剂量的氯胺酮的最显著作用。接受氯胺酮注射的那些鱼表现出在水箱顶部和水族箱中部+顶部花费的时间显著增加(图3A、3C)。此外，氯胺酮处理导致动物的速度增加(图3E)以及行进的距离增加的趋势(p<0.10，曼-惠特尼U测试，图3D)。在LDB测试中，在氯胺酮处理后的动物中仅观察到显著差异的趋势(图3F-3H)。
这些结果可能表明，20mg/kg剂量的氯胺酮主要在NT和LDB测试中引起鱼的抗焦虑样反应。同时，在NT中的速度增加和行进距离的趋势以及在LDB测试中的转换次数可能表明接受氯胺酮的动物的探索活动增加或活动过度。这些结果可能表明，20mg/kg剂量的氯胺酮在NT和LDB测试中引起鱼的抗焦虑样反应。同时，在NT中的速度增加和行进距离的趋势以及在LDB测试中的转换次数可能表明接受氯胺酮的动物的探索活动增加或活动过度。
2.2.2.AGAS
在NT和LDB测试中，1mg/kg和5mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)处理没有表现出对动物的行为的任何显著影响(图4A-4H)。
注射了10mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)的鱼在NT中比来自对照组的动物具有更大的速度(图4E)。此外，肽处理导致鱼到达水槽顶部的等待时间缩短(图4B)。此外，在注射了10mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)的动物中，观察到进入明亮隔室的等待时间缩短(图4G)，以及LDB的隔室之间的转换次数增加(图4H)。这些结果可能表明10mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)四肽对被动防御行为具有积极的亲神经作用：该肽施用促进了向探索活动的转变，诸如对器具的不同区域的参观、离开“庇护所”区域的等待时间缩短和自主运动增加。本发明人认为AGAS(SEQ ID NO:1)(10mg/kg)在动物中可能具有抗焦虑样活性。
注射了20mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)导致在水族箱顶部花费的时间减少以及在NT测试中有速度显著降低的趋势(图4A、4E)。然而，在LDB测试中，实验组与对照组之间没有差异。本发明人认为20mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)具有致焦虑样或镇静作用。因此，NT和LDB测试中AGAS(SEQ ID NO:1)作用的剂量依赖性研究揭示：
10mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)在斑马鱼中具有显著的抗焦虑样活性。
1mg/kg和5mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)不影响斑马鱼的行为。
20mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)对斑马鱼具有致焦虑样或镇静作用。
2.2.3.DSGH
在NT测试中，0.5mg/kg剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)处理没有产生任何行为影响(图5A-5E)。在给定剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)注射后，观察到在明亮隔室中花费的时间减少(根据M-W测试，趋于显著性p<0.1)以及在LDB中向明亮转换的次数减少(图5F、5H)，这可能表明在DSGH(SEQ ID NO:2)处理后动物向防御行为的转变。
用1mg/kg剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)处理的鱼在NT测试中表现出到顶部的等待时间减少(图5B)，并且在LDB测试中表现出在明亮隔室中花费的时间增加和进入明亮的等待时间减少的趋势(p<0.10，曼-惠特尼U测试，图5F)。结果可能表明DSGH(SEQ ID NO:2)在1mg/kg的剂量下具有积极的亲神经活性，这导致动物的探索活动增加。
10mg/kg剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)的注射在这两个实验范例中都不影响鱼的行为参数(图5A-5H)。
结果表明，DSGH(SEQ ID NO:2)施用后出现剂量依赖性作用：
0.5mg/kg剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)在LDB测试中表现出致焦虑样作用。
1mg/kg剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)在LDB和NT测试中均具有强效抗焦虑样作用。
10mg/kg剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)未能使斑马鱼产生任何行为变化。
2.2.4.RAHE
0.5mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)的施用在NT和LDB测试中没有表现出任何行为影响(图6A-6H)。
在以1mg/kg的剂量注射RAHE(SEQ ID NO:3)后，观察到行进的距离增加(图6D)，在水族箱上部2/3部分中花费的时间增加(图6C)，并且在NT顶部花费的时间有增加的趋势(p<0.10，曼-惠特尼U测试，图6A)。本发明人认为给定剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)肽具有积极的亲神经作用，并且行为参数的变化类似于在氯胺酮处理后观察到的变化。同时，在LDB测试中，1mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)处理未表现出任何行为影响(数据未示出)。
用10mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)处理的鱼在NT测试中的自主运动和探索活动显著减少：该动物在水族箱顶部以及底部+中部区域花费的时间显著减少，行进距离和速度减少(图6A、6C、6D、6E)。这些结果可能表明给定剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)可能具有镇静或致焦虑样活性。
因此，在NT和LDB测试中RAHE(SEQ ID NO:3)作用的剂量依赖性研究揭示：
1mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)在NT中有显著的抗焦虑样作用，但在LDB测试中无此作用。
0.5mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)不影响斑马鱼的行为。
10mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)使鱼镇静或焦虑。
2.2.5.KEDV
0.5mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)的施用在NT和LDB测试中都没有改变鱼的行为(图7A-7H)。
用1mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)处理的鱼表现出增加的自主运动活动(图7D)、增加的在水族箱的上部2/3部分中花费的时间(图7C)和减少的到顶部的等待时间(图7B)。这些积极的亲神经作用与在氯胺酮处理后观察到的相似，并且表明在用1mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)处理的动物中，焦虑减少，探索活动增加。给定剂量的肽注射也导致进入明亮的次数显著增加(图7H)和在LDB的明亮隔室中花费的时间增加(图7F)。在NT和LDB测试中获得的结果表明，所述肽在1mg/kg的剂量下具有潜在的抗焦虑样作用。
10mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)的在NT测试中注射没有改变鱼的行为(图7A-7E)，但是，在LDB测试中，它减少了在器具的明亮隔室中花费的时间(图7F)，这表明给定剂量的肽具有致焦虑样作用。
结果表明，KEDV(SEQ ID NO:4)施用后出现剂量依赖性作用：
0.5mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)未能使斑马鱼产生任何行为变化。
1mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)在LDB和NT测试中均具有强效抗焦虑样作用。
10mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)在LDB测试中具有致焦虑样作用。
AYFE(SEQ ID NO:10)四肽对斑马鱼行为的影响。
2.2.6.KEDV
根据标识分析中的低得分，选择AYFE(SEQ ID NO:10)四肽作为阴性对照。
1mg/kg剂量的AYFE(SEQ ID NO:10)施用在NT(图8A-8E)和LDB测试(数据未显示)中都未改变动物的行为。用10mg/kg剂量的AYFE(SEQ ID NO:10)处理导致在NT测试中鱼的自主运动活动减弱(图8D)。LDB测试中的其他参数和动物行为与对照值没有差异。自主运动减少可能表明给定剂量的AYFE(SEQ ID NO:10)肽具有镇静作用。
AYFE(SEQ ID NO:10)肽的研究揭示：
1mg/kg剂量的AYFE(SEQ ID NO:10)在斑马鱼中没有表现出行为影响；
10mg/kg剂量的AYFE(SEQ ID NO:10)对斑马鱼产生镇静作用。
2.3.结论
在目前的研究中，评估了肽在斑马鱼中的亲神经作用。根据分子对接研究，选择肽AGAS(SEQ ID NO:1)、DSGH(SEQ ID NO:2)、RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)作为潜在的mGRM5受体负变构调节剂。
在用诸如氟伏沙明(GABA(一种有效的肽激动剂)的先前筛选研究)和氯胺酮(当前研究)的抗抑郁药处理后鱼的行为的分析已揭示，这些物质主要通过减少鱼在水族箱底部花费的时间来影响鱼在测试中的行为。与此同时，在LDB测试中动物的行为变化程度较小，只有在诸如明亮中花费的时间和参观明亮隔室的等待时间的参数方面存在显著差异的趋势。
当比较所测试的四肽施用与参考药物氯胺酮的结果时，揭示了某些剂量的一些肽在NT测试中具有相似的效果(图10)。用KEDV(SEQ ID NO:4)(1mg/kg)和RAHE(SEQ ID NO:3)(1mg/kg)肽进行的处理导致在水族箱中部和顶部(水族箱上部2/3部分)花费的时间显著增加——在施用氯胺酮后也观察到这种效果。还注意到经氯胺酮处理的动物与经KEDV处理的动物之间的运动轨迹的相似性：来自这两组的鱼都喜欢在水族箱的顶部游泳(参见图9)。这种结果可能表明，测试物质可以减少鱼的焦虑样行为。
氯胺酮处理也导致NT测试中自主运动活动增加的趋势。先前的研究显示，急性氯胺酮暴露会导致斑马鱼活动过度(Zakhary等人.(2011)A behavioral and molecularanalysis of ketamine in zebrafish.Synapse.65(2):160-167)。与此同时，KEDV(SEQ IDNO:4)(1mg/kg)和RAHE(SEQ ID NO:3)(1mg/kg)施用导致鱼的行进距离显著增加。
AGAS(SEQ ID NO:1)(10mg/kg)和DSGH(SEQ ID NO:2)(1mg/kg)和KEDV(SEQ IDNO:4)(1mg/kg)处理导致到NT顶部的等待时间增加(图10)。鱼进入水族箱顶部的等待时间增加表明动物对新条件的适应更快速，并且因此这可能表明在用肽处理后斑马鱼的焦虑样行为减少。氯胺酮施用没有改变这个参数。
在LDB测试中最显著的效果是在KEDV(SEQ ID NO:4)(1mg/kg)和AGAS(SEQ ID NO:1)(10mg/kg)处理后观察到的：该肽施用增加了在明亮中花费的时间或减少了参观明亮隔室的等待时间，同时增加了在隔室之间的转换次数。这些结果表明，用肽处理后，斑马鱼的探索活动增加，并且焦虑减少。在LDB测试中，1mg/kg剂量的氯胺酮和DSGH(SEQ ID NO:2)仅表现出减少焦虑样行为的趋势。
本发明人得出结论，所观察到的由有效剂量的潜在mGluR5负变构肽调节剂引起的亲神经作用与氯胺酮的那些作用相当。氯胺酮和KEDV(SEQ ID NO:4)(1mg/kg)处理后的轨迹图案比较也证实了所研究的物质的行为影响的相似性，并且需要进一步的动物研究来更好地了解所测试的肽的可能潜在影响(implication)。
实施例3：确定GRM5受体肽调节剂在小鼠中的亲神经活性
本实验的目的是确定具有mGluR-5受体的有效负变构调节的肽对急性腹膜内注射后BALB/C小鼠行为的潜在亲神经作用。将施用肽对BALB/C小鼠行为的影响与施用氟伏沙明(FA)对BALB/C小鼠的影响进行比较。使用旷场测试、高架十字迷宫测试、波尔索特强迫游泳测试(两天修改)来评估肽和FA对小鼠行为的影响。这些行为范例是用于评价新药的亲神经特性的有用工具。
3.1.材料和方法
3.1.1.动物模型
在本实施例中，八十只雄性BALB/C小鼠被用作受试者。在实验开始时，每个样本的体重在约18克与约20克之间。所有动物均无物种特异性病原体(根据2014年欧洲实验动物科学协会联合会(Federation of European Laboratory Animal Science Association；FELASA)名单的无特异性病原体(SPF)状态)。这些动物被饲养在自由饮水和进食的条件下。房间装有空调(交换速率不低于15转/小时)，具有12小时:12小时的亮-暗循环(上午9:00开灯)，空气温度为20-24℃±2℃(每天的极限波动不超过2℃)，湿度为30-70％。在研究中，将小鼠分成六个不同的组，如表1中所示的那样对各组施用所测试的物质。药物是每天根据剂量在新鲜盐水中制备的。对于鼻内施用(i.n.)，使用20μl的体积，对于腹膜内施用(i.p.)，使用200μl的体积。
表1.实验组。
Figure BDA0003884300210000461
Figure BDA0003884300210000471
在适应时段时段之后，将测试物质腹膜内注射到小鼠体内。注射后30分钟内测量行为参数。每天进行不超过一次测试。测试如下进行：第1天-旷场测试，第8天-高架十字迷宫测试，第15-16天-波尔索特强迫游泳(两天修改)测试。
3.1.2.统计分析
使用单向方差分析(ANOVA)进行统计数据分析，然后对正态分布数据进行费希尔LSD测试。
3.1.3.旷场测试
测试场地是一个直径为63厘米的用强光(500勒克斯)照明的运动场。记录的参数：总行进距离(以cm计)、移动花费的时间(在超过五厘米/秒的速度下)、不动花费的时间(在小于0.2厘米/秒的速度下)、平均速度和最大速度、运动活动以及冻结的发生次数。针对中心部分记录同样的参数集，以及等待时段和所花费的时间。视觉评估排便、用后腿直立(让动物用后腿站立)。该测试被设计用于评估运动和探索活动的水平。
3.1.4.高架十字迷宫测试
该测试由彼此对置放置的两个闭臂和两个开臂(臂长30cm)组成。闭臂的侧面高度为15cm。整个设施高出地面70cm。开臂具有400勒克斯的明亮均匀的照度，闭臂具有30-40勒克斯的明亮均匀的照度。动物被放置于迷宫的中心中，其头朝向开臂。在五分钟内，NoldusEthoVision XT程序(用于行为跟踪)会自动记录以下行为参数：总行进距离(以cm计)、移动花费的时间(在超过五厘米/秒的速度下)、不动花费的时间(在小于0.2厘米/秒的速度下)、平均速度和最大速度、运动和冻结发生的次数。分别针对中心部分、开臂和闭臂记录同样的参数集，以及等待时段和所花费的时间。
3.1.5.波尔索特强迫游泳测试(两天修改)
作为这种修改的一部分，在两天内进行了两次测试。该设施是一个透明圆筒，高30cm，直径10cm，装满水(水温21℃-23℃)至25cm高的标记处。第一天，将每只动物放入圆筒中10分钟。没有记录行为参数。第二天，将动物再次放入圆筒中十分钟。记录主动游泳(所有爪子的剧烈运动)和被动游泳(后腿的微弱划水)以及不动性(不动)的持续时间(Porsolt等人.(1977).Behavioral despair in mice:a primary screening test forantidepressants.Arch Int Pharmacodyn Ther,229(2),327-336)。每次测试后，将小鼠放置于加热的笼子中，直至干燥。这个测试中的行为指标使用俄罗斯NPK“OpenScience”LLC开发的实时计时器程序进行处理。记录事件的顺序和它们的持续时间，并且进行基本的统计数据处理。
3.2.测试物质的亲神经作用的评估
3.2.1.在旷场测试中评估测试物质对小鼠行为的影响
为了评估药物对运动(总行进距离)和探索活动(用后腿直立的次数、进入中心次数以及在中心花费的时间)的影响，在旷场测试中测试动物。根据总行进距离的参数，在任何所研究的组中都没有观察到与对照组的差异(图11A)。
RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)施用显著增加了用后腿直立的次数(19.6±3.4；19±2.7)(图11B)，这表明由于行为反应向探索的转变，这些化合物具有抗焦虑样作用。进入中心次数的增加也可以指示抗焦虑样作用的存在，并且肽AGAS(SEQ ID NO:1)和RAHE(SEQ ID NO:3)(分别为19.3±3和19.2±3.4)也表现出进入中心次数的增加(图11C)。然而，该两组在中心花费的时间没有差异(图11D)。与对照组(132.9±25.9)相比，用AYFE(SEQ ID NO:10)肽处理的动物在中心花费的时间(59.96±22.4)显著降低(图11D)。这指示这个组的趋触性增加，从而揭示该肽的致焦虑样作用。
3.2.2.在高架十字迷宫测试中评估测试物质对小鼠行为的影响
根据标准方案，在测试中区分两组行为参数。第一组反映了动物的运动活动：冻结时间(即没有运动的时间，s)、总行进距离(cm)以及在闭臂上用后腿直立的次数。这些参数的增加可能指示动物的被动防御行为减少并转向探索。这可以解释为药物的抗焦虑作用的表现。
在用AGAS(SEQ ID NO:1)(973±78.7)、RAHE(SEQ ID NO:3)(1021±76.6)和KEDV(SEQ ID NO:4)(963.9±43.3)肽处理的动物中观察到行进距离的增加(图12A)。与对照组动物相比，AGAS(SEQ ID NO:1)(38.7±9.6)和KEDV(SEQ ID NO:4)(35.5±5.5)组的冻结时间减少(图12B)。对于在闭臂上用后腿直立的次数(图12C)，肽AGAS(SEQ ID NO:1)(10.2±2.9)和RAHE(SEQ ID NO:3)(12.8±1.9)获得了与对照组(4.3±1.2)的统计学显著差异，这也指示行为从防御性动机转变为探索性动机。
第二组参数包括：在开臂上花费的时间、进入开臂次数。组之间的在迷宫的开臂上花费的时间没有差异。
与来自对照组的动物相比，接受KEDV(SEQ ID NO:4)肽的动物表现出进入开臂次数的增加(图12D)，这可能反映了实验组中焦虑样行为的减少。
3.2.3.在波尔索特强迫游泳测试中评估测试物质对小鼠行为的影响。
测试的两天修改允许动物在第一天适应实验装置，这导致可以被解释为“行为绝望”的更具体的行为变化。FA处理减少了不动花费的时间(229±19.8s相较于对照组中的292.1±21.2s)，并且增加了主动游泳的时间(103.5±15.1s相较于对照组中的58.3±6.1s)(图13A、13C)。
在所测试的肽中，RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)组表现出最显著的抗抑郁样特性。相对于对照值(分别为289±19.6s和246.4±17.7s)，1mg/kg剂量的RAHE(SEQID NO:3)肽的施用导致不动花费的时间减少(223.6±16.1s)，以及被动游泳增加(使用两肢或四肢漂浮)(图13B、13C)。用KEDV(SEQ ID NO:4)肽处理导致主动游泳花费的时间增加(图13A)。与对照组相比，在接受AYFE(SEQ ID NO:10)的动物组中不动花费的时间减少，并且主动游泳花费的时间增加(图13A、13C)。这些结果指示肽的抗抑郁样特性。
3.3.结果讨论
10mg/kg剂量的肽AGAS(SEQ ID NO:1)没有明显的抗抑郁样作用。然而，AGAS(SEQID NO:1)施用导致了探索和运动活动的增加，这可能表明这种肽具有抗焦虑样作用。1mg/kg剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)的施用没有引起行为参数的任何变化。用1mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)肽处理导致OF和EPM测试中运动和探索活动增加，以及FST中绝望行为减少。在RAHE(SEQ ID NO:3)施用后小鼠被动游泳增加可能表明在测试的第二天转向节能被动应对策略。根据该研究的结果，这两种肽产生抗焦虑样和抗抑郁样作用，并且最有希望用于针对药物的亲神经活性的进一步研究。
1mg/kg剂量的AYFE(SEQ ID NO:10)肽增加了OF测试中的趋触性，但是它不影响EPM中小鼠的行为。在FST中，该物质的施用产生了抗抑郁样作用。需要额外的研究来评估这种肽的行为影响。
3.4.结论
用10mg/kg剂量的AGAS(SEQ ID NO:1)肽(SEQ ID NO:1)处理导致OF和EPM中的探索和运动活动中度增加，但不影响FST中动物的行为。
用1mg/kg剂量的DSGH(SEQ ID NO:2)肽处理不影响小鼠的行为。
在行为测试前30分钟用1mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)肽处理导致与在FA处理后观察到的相似的显著抗抑郁样作用，以及抗焦虑样作用。
1mg/kg剂量的肽AYFE(SEQ ID NO:10)表现出抗抑郁样作用，并且同时增加趋触性。
实施例4：在以不同剂量鼻内施用时肽药物的亲神经活性
4.1.该研究的目的是：
研究几种各种剂量的新型肽的潜在亲神经作用，并且评估这些化合物对实验室斯普拉-道来氏大鼠的运动活动的影响。
4.2.材料和方法
4.2.1.动物模型
在70只雄性斯普拉-道来氏大鼠上进行实验。实验开始时的体重为150-200g。所有动物均无物种特异性病原体(根据2014年FELASA列表的SPF状态)。这些动物被饲养在自由饮水和进食的条件下。房间装有空调(交换速率不低于15转/小时)，具有12小时:12小时的亮-暗循环(上午9:00开灯)，空气温度为20-24℃±2℃(每天的极限波动不超过2℃)，湿度为30-70％。在研究中，将大鼠分成八个不同的组，如表2中所示的那样对各组施用所测试的物质。药物是每天根据剂量在新鲜盐水中制备的。对于鼻内施用(i.n.)，使用20μl的体积，对于腹膜内施用(i.p.)，使用200μl的体积。
在适应时段结束时，用所研究的药物处理动物，并且在30分钟之后进行行为测试(比较药物是i.p施用的)。所计划的测试的列表和顺序是：旷场(OF)-第1天，新奇抑制摄食(NSF)-第2天，新物体识别(NOR)-第3天和第4天，第8天-高架十字迷宫(EPM)。
表2.实验组。
Figure BDA0003884300210000521
4.2.2.统计分析
使用单向方差分析(ANOVA)进行统计数据分析，然后对正态分布样品进行费希尔LSD测试。
4.2.3.旷场测试(OF)
测试场地是一个直径为97厘米的用强光(500勒克斯)照明的运动场。记录的参数：总行进距离(以cm计)、移动花费的时间(在超过五厘米/秒的速度下)、不动花费的时间(在小于0.2厘米/秒的速度下)、平均速度和最大速度、运动活动以及冻结的发生次数。针对中心部分记录同样的参数集，以及等待时段和所花费的时间。视觉评估排便、用后腿直立(让动物用后腿站立)。该测试被设计用于评估运动和探索活动的水平。
4.2.4.新奇抑制摄食测试(NSF)
测试前，动物被剥夺食物8小时。第二天，将装有2个食物颗粒的皮氏培养皿(Petridish)放置于OF装置的中心中。测试时间为5分钟。使用EthoVision XT14(Noldus)视频跟踪系统进行视频处理。记录的参数是用后腿直立的次数、理毛行为、排便、平均速度(cm/s)、总行进距离(cm)、不动花费的时间(s)、进入中心次数和在测试区域中心花费的时间(动物的鼻子应在食物颗粒附近一厘米的范围内)以及在中心花费的总时间(s)。
这个测试调查了在新条件下的食物动机。这个测试是研究药物的抗焦虑样特性的标准。接近食物颗粒的次数越多，在中心花费的时间越长，所研究的化合物的抗焦虑潜力就越高(Ran等人.(2018).YL-0919,a dual 5-HT 1A partial agonist and SSRI,producesantidepressant-and anxiolytic-like effects in rats subjected to chronicunpredictable stress.APS.39(1):12)。
4.2.5.新物体识别(NOR)
在3天内进行测试。第1天是标准的OF测试。在第2天，将两个同一的物体(绿色塑料金字塔)彼此对置地放置于距离器具壁30cm的位置处。在第3天，将其中一个绿色金字塔用蓝色金字塔替换。每天观察动物的行为5分钟。使用EthoVision XT14(Noldus)视频跟踪系统进行视频处理。记录的参数是用后腿直立的次数、理毛行为、排便、平均速度(cm/s)、总行进距离(cm)、不动时间(s)、接近物体的次数和在物体附近花费的时间(动物的鼻子应在该物体附近一厘米的范围内)以及在中心花费的总时间(s)。
正常情况下，动物倾向于探索新的物体，并且接近物体的次数和对物体的嗅探增加。当记忆受损时，动物在第2天不会将物体视为新的，这反映在相对于对照组的探索行为(接近新物体的次数和对新物体花费的时间)减少(Antunes等人.(2012).The novelobject recognition memory:neurobiology,test procedure,and itsmodifications.Cogn.Process.13(2):93–110)。
4.2.6.高架十字迷宫测试(EPM)
该测试由彼此对置放置的两个闭臂和两个开臂(臂长50cm)组成。闭臂的侧面高度为30cm。整个设施高出地面70cm。开臂具有400勒克斯的明亮均匀的照度，闭臂具有30-40勒克斯的明亮均匀的照度。动物被放置于迷宫的中心中，其头朝向张臂。在5分钟内，EthoVision XT14(Noldus)程序自动记录以下行为参数：总行进距离(以cm计)、移动花费的时间(在超过五厘米/秒的速度下)、不动花费的时间(在小于0.2厘米/秒的速度下)、平均速度和最大速度、运动和冻结发生的次数。分别针对中心部分、开臂和闭臂记录同样的参数集，以及等待时段和所花费的时间。“焦虑指数”指数也通过以下公式计算：AI＝100*(1-(在开臂的时间/总测试时间+进入开臂次数/总进入次数)/2)。
4.2.7.修改的波尔索特强迫游泳测试(FST)
作为这种修改的一部分，在两天内进行了两次测试。该设施是一个透明圆筒，高30cm，直径10cm，装满水(水温21℃-23℃)至25cm高的标记处。第一天，将每只动物放置于该器具中十分钟。没有记录行为参数。第二天，将动物再次放置于圆筒中10分钟。记录主动游泳(所有爪子的剧烈运动)和被动游泳(后腿的微弱划水)以及不动性(不动)的持续时间(Porsolt等人.(1977).Behavioral despair in mice:a primary screening test forantidepressants.Arch Int Pharmacodyn Ther.229(2):327-36)。
每次测试后，将大鼠放置于加热的笼子中，直至干燥。这个测试中的行为指标使用由Open Science开发的实时计时器程序进行处理。记录事件的顺序、它们的持续时间以及进行基本统计数据处理。
4.3.结果
4.3.1.旷场测试
OF测试被用于评估施用所研究的物质后动物的运动和探索活动。0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)肽的施用都导致行进的距离增加超过15％(RAHE 0.1mg/kg(3835±80.6cm)、RAHE 0.3mg/kg(3838±137.2cm)、RAHE 1mg/kg(3651±108.7cm)、KEDV(SEQ ID NO:4)0.1mg/kg(3920±134.8cm)、KEDV(SEQID NO:4)0.3mg/kg(3879±73.7cm)、KEDV(SEQ ID NO:4)1mg/kg(3769±164.7cm))(图14A)。
然而，肽施用对进入中心的次数(图14B)和在迷宫中心花费的时间(图14C)没有影响。
4.3.2.新奇抑制摄食测试
在所有实验组中，所测试的肽对进食等待时间(图15A)和进食花费的时间(图15B)没有影响，这表明在这个测试中该肽不存在抗焦虑样作用。
然而，在NSF中发现了早期在OF测试中观察到的对运动活动的类似影响。在一些经肽处理的动物组中，与对照组(2758±149.2cm)相比，总行进距离显著增加(RAHE 0.1mg/kg(3490±212.3cm)、KEDV(SEQ ID NO:4)0.1mg/kg(3392±211.3cm)和KEDV(SEQ ID NO:4)0.3mg/kg(3608±208.6cm))(图15C)。
4.3.3.新物体识别
这个测试评估了施用测试化合物后实验室动物的认知功能。因为啮齿动物对新奇事物有天生的偏好，记得熟悉物体的啮齿动物会花费更多的时间探索新物体。正常情况下，这个参数的值应具有统计学意义，并且不同于在实验第一天获得的值。这对于评估该测试的有效性是必要的。根据呈现的数据(图16)，大多数动物在第二天花费更多的时间在新物体上。然而，没有观察到因素“实验组”的影响，这表明在处理之间没有差异。这个结果表明所有实验组的认知功能正常。
4.3.4.高架十字迷宫
与对照组(33.5±6.02s)相比，用KEDV(SEQ ID NO:4)0.1mg/kg处理导致在开臂中花费的时间增加(66.8±9.6s)(图17A)。这个组的进入开臂次数也高于对照值(分别为7.2±0.44和3.7±0.76)，记录到KEDV(SEQ ID NO:4)1mg/kg组(6.6±1.06cm)的类似增加(图17B)。KEDV(SEQ ID NO:4)0.1mg/kg组(72.8±1.96％)的焦虑指数(AI)显著低于对照值(81.3±2.32％)(图17C)。这个结果可能表明这种肽具有抗焦虑样作用。
一些剂量的肽增强了大鼠的自主运动，这表现为与对照组(17.61±139cm)相比，RAHE 0.1mg/kg(2146±170cm)、KEDV 0.1mg/kg(2505±104.2cm)、KEDV 0.3mg/kg(2247±127.8cm)和KEDV 1mg/kg(2209±111.2cm)组的总行进距离显著增加(图17D)。
4.3.5.修改的波尔索特强迫游泳测试
在实验组之间的FST中没有观察到行为变化(图18A、18B和18C)，这表明所测试的物质中没有一种表现出强效的抗抑郁样活性。
4.4.讨论
几乎在每个剂量中都观察到由肽RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)的鼻内施用诱导的运动活动增强。在OF、NSF和EPM测试中，与对照组相比，经肽处理的组的总行进距离的增加显著更高。因此，需要进一步的研究，以及影响运动和身心功能障碍的其他病症，诸如注意力缺陷障碍、帕金森氏病、各种病因的运动障碍(例如，迟发性或左旋多巴诱导的运动障碍)等。
在不同剂量的所测试的肽中，仅在0.1mg/kg和1mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)中观察到潜在的中度抗焦虑样作用。最小剂量的肽增加了在EPM的开臂中花费的时间，并且这两种剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)都能够增加在这个测试中进入开臂的次数。然而，很难对结果进行解释，因为观察到的变化可能是所研究的物质的抗焦虑样特性(由于转向探索行为)和/或肽药物的精神刺激剂特性的结果。
在用肽处理后，在NSF测试中没有观察到抗焦虑样作用。在FST(对具有潜在抗抑郁样活性的药物具有预测有效性的测试)中，没有观察到施用的肽对所研究的参数的影响。在氟西汀和肽处理的组中都没有观察到抗抑郁样特性。根据关于氟西汀的可用文献数据，抗抑郁样活性可以清楚地在应激模型中，例如在大鼠的慢性应激模型中展现出来(Farhan等人.(2016)Anxiolytic profile of fluoxetine as monitored following repeatedadministration in animal rat model of chronic mild stress.SPJ,24(5):571-578)。因此，在类似的受应激动物模型上测试肽的活性可能更合适，并且被推荐用于进一步的研究。
4.5.结论
在行为测试前30分钟0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg剂量的肽RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)的鼻内施用显著增加了运动活动。
在行为测试前30分钟0.1mg/kg和1mg/kg剂量的肽KEDV(SEQ ID NO:4)的鼻内施用在EPM中导致潜在的抗焦虑样作用。
在行为测试前30分钟0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg剂量的肽RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)的鼻内施用不影响记忆形成。
实施例5：评估通过β-抑制蛋白2募集的效率评估的所研究的肽对通过mGluR5受体 触发的信号传导级联活性的影响。
5.1.该研究的目的是：
使用荧光素酶测定调查所研究的肽KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)作为mGluR5的潜在负变构调节剂的潜在作用。
5.2.方法的原理
Kroeze先前描述了该方法(Kroeze等人.(2015).PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable humanGPCRome.Nat.Struct.Mol.Biol.22(5):362)，并且原理示于图19中。简言之，用3种类型的质粒转染HEK293细胞系的细胞：
质粒1：编码融合GRM5-tTA蛋白。GRM5与tTA之间的接头对TEV蛋白酶敏感(www.addgene.org/66390/)。
质粒2：编码β-抑制蛋白2/TEV-蛋白酶融合蛋白(www.addgene.org/107245/)。
质粒3：荧光素酶tTA报告基因(www.addgene.org/64127/)。
转染后24小时期间产生了足够量的融合蛋白。选择性激动剂CHPG(SEQ ID NO:18)(1)对mGluR5(GRM5)的活化导致β-抑制蛋白2/TEV蛋白酶融合蛋白(2)的募集，该融合蛋白切割GRM5与tTA(3)之间的接头。释放的tTA转录因子(4)与它在tTA荧光素酶报告质粒(5)中的共有位点结合，从而导致荧光素酶表达的活化。荧光素酶的活性可被用于估计mGluR5的活性，并且mGluR5的负变构调节剂的施加应导致此系统中荧光素酶活性的剂量依赖性降低(图19)。
5.3.实验程序。
在实验之前，使用标准应用程序生产了足够量的质粒。在激动剂施加前24小时，使用聚乙烯亚胺(PEI，408727，Sigma-Aldrich,USA)用三种质粒共转染HEK293细胞。用激动剂/拮抗剂处理经转染的细胞并将其温育过夜(16小时)。在激动剂之前10分钟引入拮抗剂。根据制造商的方案，使用PromegaTM荧光素酶测定系统试剂盒(PR-E1500，Promega,USA)进行荧光素酶测试。
5.3.1.激动剂/拮抗剂：
CHPG–正构选择性mGlu5受体激动剂(HB0033，HelloBio,USA)。根据文献(Chen等人.(2012).Protective effects of mGluR5positive modulators against traumaticneuronal injury through PKC-dependent activation of MEK/ERKpathway.Neurochem.Res.37(5):983-990.；Loane等人.(2009).Activation ofmetabotropic glutamate receptor 5modulates microglial reactivity andneurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.J.Biol.Chem.284(23):15629-15639)以1mM的剂量施用CHPG(SEQ ID NO:18)。
SIB 1757–mGluR5的选择性非竞争性拮抗剂(S9186，Sigma-Aldrich,USA)。SIB1757以10μM剂量(根据文献：Liu等人.(2014).Aldehyde dehydrogenase 1defines andprotects a nigrostriatal dopaminergic neuron subpopulation.J.Clin.Invest.124(7):3032-3046)和100μM剂量(过量剂量)施用。
肽RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)-mGluR5的潜在负变构调节剂。根据体内研究计算出0.2μM的肽剂量，其中这些肽展现出了功能活性。2μM和20μM的剂量也是生理上相关的。
结果计算为3次生物重复的平均值。
5.4.结果
5.4.1.第1部分.验证肽在低生理剂量下的效率。
实验设计：
对照。未经转染的对照、PEI处理的细胞
经转染的对照
经转染的细胞+CHPG
经转染的细胞+CHPG+SIB 1757，10μM
经转染的细胞+CHPG+SIB 1757，100μM
经转染的细胞+CHPG+RAHE(SEQ ID NO:3)，0.2μM
经转染的细胞+CHPG+RAHE(SEQ ID NO:3)，2μM
经转染的细胞+CHPG+RAHE(SEQ ID NO:3)，20μM
经转染的细胞+CHPG+KEDV(SEQ ID NO:4)，0.2μM
经转染的细胞+CHPG+KEDV(SEQ ID NO:4)，2μM
经转染的细胞+CHPG+KEDV(SEQ ID NO:4)，20μM
该研究的结果在图20中示出。与1mM CHPG一起温育16小时导致对应于mGluR5活化的荧光素酶信号的显著诱导。这两种剂量(10μM和100μM)的SIB 1757施用都导致对mGluR5活性的抑制。RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)肽仅在20μM的最高剂量下降低CHPG诱导的mGluR5活化水平KEDV(SEQ ID NO:4)对CHPG诱导的mGluR5活化的影响明显比RAHE(SEQ ID NO:3)的情况更显著：分别减少65％和27％。
5.4.2.第2部分.验证肽在高剂量下的效率。
这项研究的目的是测试更高剂量的肽影响CHPG诱导的mGluR5活化的水平的能力。此外，目的是确定在没有施加CHPG的情况下，所研究的肽是否可以充当变构拮抗剂并影响mGluR5活性。
实验设计：
对照。未经转染的对照、PEI处理的细胞
经转染的对照
经转染的细胞+CHPG
经转染的细胞+CHPG+RAHE(SEQ ID NO:3)，20μM
经转染的细胞+CHPG+RAHE(SEQ ID NO:3)，100μM
经转染的细胞+CHPG+RAHE(SEQ ID NO:3)，200μM
经转染的细胞+CHPG+KEDV(SEQ ID NO:4)，20μM
经转染的细胞+CHPG+KEDV(SEQ ID NO:4)，100μM
经转染的细胞+CHPG+KEDV(SEQ ID NO:4)，200μM
经转染的细胞+CHPG+SIB 1757
经转染的细胞+CHPG+SIB 1757+RAHE(SEQ ID NO:3)，200μM
经转染的细胞+CHPG+SIB 1757+KEDV(SEQ ID NO:4)，200μM
经转染的细胞+RAHE(SEQ ID NO:3)，20μM
经转染的细胞+RAHE(SEQ ID NO:3)，200μM
经转染的细胞+KEDV(SEQ ID NO:4)，20μM
经转染的细胞+KEDV(SEQ ID NO:4)，200μM
研究结果在图21中示出。CHPG、SIB 1757、RAHE(SEQ ID NO:3)(20μM)和KEDV(SEQID NO:4)(20μM)处理导致荧光素酶信号的显著降低。RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ IDNO:4)肽的较高剂量(100μM和200μM)均不影响它们对CHPG诱导的mGluR5活化水平的抑制作用的强度。RAHE(SEQ ID NO:3)或KEDV(SEQ ID NO:4)肽与SIB 1757的共同施用没有改变由SIB 1757产生的抑制作用。在没有CHPG的情况下，甚至高剂量的RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)肽也不影响mGluR5活性，这表明这两种肽都可以归类为负变构调节剂。
5.5.结论
KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)肽都充当mGluR5受体的负变构调节剂。
KEDV(SEQ ID NO:4)肽的抑制作用比RAHE(SEQ ID NO:3)的抑制作用更明显。
RAHE(SEQ ID NO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)肽的较高剂量均不影响它们对CHPG诱导的mGluR5活化的水平的抑制作用的强度。
根据这两项研究的结果，20μM似乎是KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)肽的最佳剂量。
实施例6：在鼻内施用于维斯达大鼠时KEDV和RAHE肽的精神刺激潜能的研究
该实验由两个系列组成。在系列1中，研究的目的是评估i.n.施用肽RAHE(SEQ IDNO:3)和KEDV(SEQ ID NO:4)后的峰值运动活动、耐力和协调性。在自主运动活动测试(LAT)和横梁行走测试(BWT)中评估行为影响。此外，在接受1mg/kg的KEDV(SEQ ID NO:4)或RAHE(SEQ ID NO:3)的大鼠的额叶皮质中研究了Kcna1、Camk2n1和EGR2基因的相对表达水平。在系列2中，研究的目的是使用“Activiscop”器械评估肽i.n.施用药物KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)对维斯达大鼠的自发运动活动(SMA)的影响。
6.1.材料和方法
6.1.1.动物和处理
在系列1和系列2中使用了总共64只和31只成年雄性维斯达大鼠(250-300g)。将动物圈养在受控环境中，该受控环境具有空调(交换速率不低于15转/小时)，具有12小时:12小时的亮-暗循环(上午09:00开灯)，空气温度20-24℃±2℃(每天的极限波动不超过2℃)，湿度为30-70％。在系列1中，将大鼠分成六个不同的组，并且如表3中所示的那样向各组施用所测试的物质。在系列2中，将大鼠被分成四个实验组，物质和处理方案在表4中示出。
每天在盐水中新鲜制备用于注射的咖啡因(咖啡因苯甲酸钠20％，JSC‘BZMP’)、KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)(Lactocore Inc.)溶液。对于i.n.施用，使用自动移液管在每个鼻孔中施加每千克0.1ml的体积。对于i.p.，用1mL无菌注射器注射每千克体重1ml的体积。
表3.系列1中的实验组。
Figure BDA0003884300210000631
Figure BDA0003884300210000641
表4.系列2中的实验组。
Figure BDA0003884300210000642
在系列1中，在适应时段结束时，在实验当天，给动物注射所测试的物质。然后将大鼠放置于LAT单元中持续48小时，以评估它们的峰值运动活动。此值用于计算在进行随后的行为测试之前施用测试物质的最佳时间。因此，对于所有其他行为测试，该物质是在放置于实验装置中之前15分钟引入的。
在系列2中，在适应时段之后，评估SMA。评估动物的运动活动48小时。在前24小时期间，记录背景运动活动，之后施用所研究的物质。在施用肽后，再记录24小时的运动活动。在下午12:00点将动物放置于设施中。
6.1.2.行为测试
在系列1中，进行了以下测试：第1-2天–LAT，第11天–BWT。用来自Noldus的视频跟踪系统EthoVision XT对BWT进行视频记录和处理。在系列2中，在第1-2天进行SMA评估。所有实验步骤和数据分析均由实验者在不知道处理的情况下进行。
6.1.2.1.LAT
用于LAT的器具代表32通道数字活动记录仪，其对动物运动活动的震声信号进行同步记录。每个记录室(笼子)只含有一只动物。将动物放置于标准的3型笼子中。所有的传感器和无线电电子设备元件都位于笼子的外面。该单元位于具有受控温度、湿度、噪音、振动和光的单独隔音室中。动物可以不受限制地获得食物和水。实验(在施用测试物质之后，从运动活动开始)是自动进行的，无需人员进入场地。实验在下午4点开始，并且持续48小时。估计的参数是：运动活动(任意单位)-测量为当动物移动时在笼子中发生的波动(以毫伏计)。活动密度(分数)–代表特定时间范围内活动的分钟数百分比。大鼠活动的每一分钟都被分类为活动时段或休息时段。然后针对某一时段(称为时间范围；在这种情况下是5分钟的时段)计算每组中此类分钟的比例。
6.1.2.2.BWT
这个测试用于评估运动协调性，尤其是后肢的协调性。首先，将大鼠放置于窄梁的一角中，让它们从一个端部穿过窄梁走到另一个端部至少三次。该窄梁(RPC OpenScienceLtd)宽2cm，长165cm，其下方有板以在滑动期间支撑动物的四肢。在该设施的端部是一个暗室(笼舍)，以刺激大鼠完成横梁行走到该端部。用强光(100W)照亮起点，激励大鼠跑到板的端部进入暗室中。实验连续进行3天。前2天是培训课程。在第一天，如下放置动物：1)在笼舍里1分钟；2)距离笼舍15cm；3)在笼舍里1分钟；4)在路上在距离笼舍1/4的距离处；5)在笼舍里1分钟；6)在距离笼舍1/4处。在训练的第二天，如下将动物放置于设施上：1)在笼舍里1分钟；2)在距离笼舍1/4处；3)笼舍，1分钟；4)在路上在距离笼舍的该路长度的1/2处；5)在笼舍里1分钟；6)在路上在距离笼舍3/4处。在测试日期间，每只动物有三次机会在1分钟内从板的起点(最宽的部分)到达笼舍，之后让动物在笼舍里停留1分钟。评估了以下参数：从板上滑倒的次数(错误)、从起始线到动物进入黑暗隔室所用的总步数，以及行进时间。对于前肢和后肢，单独进行计算。也使用公式：X＝错误数/总步数*100％计算前肢和后肢的感觉运动缺陷程度。
6.1.2.3.SMA
使用Activiscop装置测量自发运动活动。这些动物被饲养在家庭笼子里，可以自由地获得食物和水。使用位于每个笼子上方的红外传感器记录运动活动。实验的持续时间是48小时，前24小时是背景记录。在施用所研究的物质后，再记录大鼠24小时的运动活动。所得结果表示为每只动物每分钟的行为动作次数。
6.1.3.动物安乐死和脑组织样品收集
系列1中最后一次行为测试后的第二天，用物质处理相应组的动物，并且2h后使用断头台将它们断头处死。取出大脑，用冷盐水洗涤，并且放置于冷表面上用于解剖额叶皮质。将脑组织快速冷冻在液氮中，并且储存在-80℃下
6.1.4.Kcna1、Camk2n1和EGR2基因表达水平的实时PCR
使用ExtractRNA试剂(Eurogen,Russia)从30个大鼠额叶皮质样品中分离出总mRNA。接下来，使用莫洛尼鼠(Moloney Murine)白血病病毒逆转录酶(MMLV RT)试剂盒(Eurogen,Russia)合成第一个cDNA链。使用qPCRmix-HS SYBR+LowROX试剂盒(Eurogene,Russia)和表5中列出的引物通过实时PCR分析Kcna1、Camk2n1、EGR2和Gapdh基因的表达水平。
表5.用于实时PCR分析的引物。
Figure BDA0003884300210000671
将蛋白质基因表达结果针对GAPDH管家基因作归一化。
6.1.5.统计分析
在统计编程环境R CRAN以及程序STATISTICA 10中进行统计分析。使用方差分析(ANOVA)和事后费希尔LSD测试计算具有正态分布的实验组之间的差异。在适用的情况下，使用重复测量(重复测量ANOVA)和事后费希尔LSD测试。结果表示为平均值±平均值的标准误差。在p<0.05时，组之间的差异被认为具有统计学显著性。
6.2.结果
6.2.1.LAT
在施用物质之后，以1-180分钟的间隔评估大鼠的活动。每分钟将大鼠分类为活动或静止，并且计算5分钟间隔内每种状态下此类分钟的比例(活动密度)。1mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)施用和10mg/kg咖啡因导致运动活动中度单向增加，这通常表明这些化合物具有精神刺激作用。为了分析，以30分钟的间隔计算动物的运动活动(图22)。1mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)二者以及咖啡因(10mg/kg)在3-30分钟、30-60分钟、60-90分钟的间隔内表现出运动活动的统计学显著增加(图22)。在RAHE(SEQ ID NO:3)组中在90-120分钟和150-180分钟间隔中也观察到与对照值的差异(图22)。接受咖啡因的动物在150-180分钟的间隔内表现出显著的镇静作用，并且在KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)后没有观察到运动减缓(图22)。
6.2.2.BWT
用咖啡因(10mg/kg)和KEDV(SEQ ID NO:4)(0.1mg/kg)处理导致前爪的感觉运动缺陷的严重程度降低(图23A)。在后爪中没有观察到处理的效果(图23B)。
6.2.3.大鼠额叶皮质中Kcna1、Camk2n1和EGR2 mRNA的相对表达
获得的结果揭示，1mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)不影响Camk2n1和EGR2基因的表达水平(图24A、24C)。同时，KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ IDNO:3)均导致Kcna1基因表达的统计学显著降低(图24B)。
6.2.4.SMA
在40-100分钟间隔内在i.n.施用KEDV(SEQ ID NO:4)和在10-100-分钟间隔内在i.n.施用RAHE(SEQ ID NO:3)之后，表现出轻微的刺激作用(图25A、25B、25C和25D)。在同一时间，在实验期间在任何肽处理的组中都没有观察到镇静作用。30mg/kg剂量的咖啡因也导致动物在这些时间间隔内的运动动作次数显著增加。
6.3.讨论
本研究的目的是评估KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)肽的可能的刺激作用。为此，进行了两个系列的实验来研究在家庭笼子中(即在对动物没有应激的熟悉条件下)的自发运动活动。在系列1中，进行了从移动的动物接收到的震声信号的记录(LAT)。这种方法对动物活动的任何变化都非常精确和敏感。在系列2中，使用红外传感器(SMA测试)获得所记录的运动活动的变化。
在这两个系列中都观察到咖啡因的刺激作用。在系列1中，咖啡因施用后自主运动活动增加，随后在180分钟间隔时自主运动明显减少。在这两个系列中均观察到用KEDV(SEQID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)肽处理后运动活动增加，并且这些测试的刺激作用的持续时间为至少90-100分钟，而在之后的时间间隔中没有镇静作用。在系列1中，在以1mg/kg的剂量施用RAHE(SEQ ID NO:3)之后，运动活动的变化维持至多180分钟。在以1mg/kg和5mg/kg而不是0.1mg/kg的剂量施用肽之后观察到刺激作用。
在协调性测试(BWT)中，咖啡因和KEDV(SEQ ID NO:4)0.1mg/kg组表现出前肢感觉运动缺陷的严重程度降低。这些数值的降低可以解释为动物协调性的改善。
为了评估肽KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)的潜在作用机制，通过实时PCR分析影响mGluR5依赖性信号级联的表达标记，并且选择Kcnal、Camk2n1和EGR2作为靶基因。所分析的基因是基于示出响应于已知mGluR5拮抗剂的引入的体内表达水平变化的文献数据并且考虑到它们的功能意义来选择的。因此，在精神分裂症和其他几种病症中，EGR2的表达增加(Cheng等人.(2012)Genetic and functional analyses of early growthresponse(EGR)family genes in schizophrenia.Prog Neuropsychopharmacol BiolPsychiatry 39(1):149-155)，并且mGluR5拮抗剂可以潜在地使该病症正常化。Camk2n1基因(作为钙调蛋白依赖性MAPK级联的调节剂的CaM激酶II抑制剂α)的产物可参与调节突触可塑性，mGluR5拮抗剂对突触可塑性的影响可解释它们对学习和记忆的影响(Simonyi等人.(2010)Metabotropic glutamate receptor subtype 5antagonism in learning andmemory.Eur J Pharmacol 639(1-3):17-25)。
包括电压依赖性Kv1在内的钾通道对神经组织的兴奋性做出了重要贡献。钾通道的活化通常导致可兴奋细胞的细胞质膜的超极化，这阻止了神经冲动的传递。相反，这些通道的活性或表达的降低导致去极化，并且因此促进动作电位的进一步传递。例如，响应于mGluR5拮抗剂的引入的Kcna1基因(Kv1.1钾通道基因)的表达降低可以表现为额叶皮质中神经元兴奋性水平的变化，并导致运动活动的增加(Homayoun等人.(2006)Bursting ofprefrontal cortex neurons in awake rats is regulated by metabotropicglutamate 5(mGlu5)receptors:rate-dependent influence and interaction withNMDA receptors.Cereb Cortex 16(1):93-105)。Kcna1表达的降低大概解释了mGluR5拮抗剂降低皮质神经元的自发爆发活动和树突棘的随机活动的能力(Homayoun等人.(2006)；Gass等人.(2008)Transcriptional profiling of the rat frontal cortex followingadministration of the mGlu5 receptor antagonists MPEP and MTEP.Eur JPharmacol 584(2-3):253-262)，这也可能伴随着一般运动活动的变化。
根据获得的数据，在施用KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)二者之后，特别观察到Kcna1基因表达水平的统计学显著降低。肽对Kcna1表达水平的影响类似于已知的mGluR5拮抗剂MTEP和MPEP的影响(Gass等人.(2008))，这可能潜在地表明肽通过类似的机制起作用。
6.4.结论
以1mg/kg的剂量鼻内施用KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)导致对自主运动的显著刺激作用，与10mg/kg咖啡因的作用相当。
鼻内施用KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)后的刺激作用分别持续约90分钟和180分钟。在观察期间，在肽处理的组中没有观察到镇静作用。
小剂量(0.1mg/kg)的KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)的鼻内施用并不显著影响大鼠的自发运动活动。
在横梁行走测试中，施用10mg/kg咖啡因和0.1mg/kg KEDV(SEQ ID NO:4)导致前肢感觉运动缺陷消失，这可能表明协调性得到改善。
以1mg/kg的剂量用KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)处理导致大鼠额叶皮质中Kcna1 mRNA的表达水平降低。
实施例7：鼻内施用KEDV和RAHE对急性足休克应激模型中大鼠的行为和内分泌参 数的影响的研究
本研究的目的是调查鼻内施用KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)对急性足休克(AFS)模型中大鼠的行为和内分泌参数的潜在抗抑郁样和抗焦虑样作用。
7.1.材料和方法。
7.1.1.动物和处理
研究在来自由俄罗斯FANO生物资源收集项目资助的IPh RAS的"不同分类归属的实验室哺乳动物的集合(Collection of laboratory mammals of different taxonomicaffiliations)"的63只240-280g的成年雄性维斯达大鼠上进行(平均体重260g)，该大鼠被饲养在标准条件下。所有涉及动物的程序均根据欧洲(欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU)和俄罗斯(“GOST 33216-2014实验室动物维护和护理指南.实验室啮齿动物和兔子的维护和护理规则”)生物伦理指南进行。
KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)(Lactocore Inc.)以1mg/kg和5mg/kg的剂量每天鼻内(i.n.)施用，持续10天。每天在盐水中新鲜制备肽。15μl体积的5mg/kg的用于i.n.施用的溶液(单次施用)含有1.3mg KEDV(SEQ ID NO:4)或RAHE(SEQ ID NO:3)，10μl体积的1mg/kg的用于鼻内施用的溶液(单次施用)含有0.26mg KEDV(SEQ ID NO:4)或RAHE(SEQ ID NO:3)。
四环类抗抑郁药马普替林(Maprotiline)(MAP，“Lyudiomil”)被用作比较药物。动物每天接受腹膜内注射(i.p)MAP持续十天(M9651，Merck，剂量为4.5mg/kg，溶解在盐水中，每次施用250μl)。
7.1.2.急性足休克(AFS)应激模型
“习得性无助(learned helplessness)”(LH)的经典范式被用作大鼠抑郁样状态的实验模型(Seligman等人.(1975).Learned helplessness in therat.J.Comp.Physiol.Psychol.,88(2),534.]。为了发展LH，使大鼠经受不受控制的不可避免的厌恶性应激-急性足休克(AFS)(皮肤电刺激)。在具有导电地板的13×16×26cm大小的笼子的封闭空间中用电流(1mA，1Hz，15秒)刺激动物，在向室地板施加电流之间使用不同的持续时间的间隔，以使得每只大鼠在一小时内接受60次刺激，这导致持续抑郁样状态的发展。使用软件随机发生器自动进行刺激。
7.1.3.行为测试
行为测试的时间表如表6中所示。
7.1.3.1.旷场(OF)测试
OF测试是评估啮齿动物在新的应激产生条件下的运动活动和探索行为水平的经典方法。测试在90×90×45cm的无顶笼子中进行，笼子的地板铺在15×15cm的正方形上，并由60W的灯从上面照亮。在LH模型中应激后的第5天，将大鼠放置于OF的中心中。测量以下参数5分钟：开始移动的等待时间、交叉方格的数量、用后腿直立和冻结的持续时间。
7.1.3.2.高架十字迷宫(EPM)测试
EPM测试允许表征啮齿动物在可变应激条件下的行为，这使得评估动物焦虑水平和药物的抗焦虑作用成为可能。在实验暴露后的第6天，在EPM设施中一次测试一只大鼠，持续5分钟，该EPM设施位于地面以上75cm的高度处，并且由2个照亮的开臂和2个带出口的闭臂组成。评估动物在闭臂内部和外部(开臂中和中心中)花费的时间、臂间转换的次数、拉伸姿势(stretch-attended posture)的次数。通常，动物倾向于停留在闭臂中，抗焦虑处理导致在迷宫的开臂上花费的时间增加(Pellow等人.(1985).Validation of open:closedarm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in therat.J.Neurosci.Methods,14(3),149-167；Walf等人.(2007).The use of the elevatedplus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents.Nat.Protoc.,2(2),322-328)。
7.1.4.地塞米松测试(DXMT)
考虑到大鼠中HPA轴功能的昼夜节律的特异性，在LH发展后的第9-10天根据方案在两天的地塞米松测试中对糖皮质激素(皮质酮，一种人类中的皮质醇的类似物)的应激诱发释放及其通过引入合成糖皮质激素的抑制进行评估(Zhukov(1993).The dexamethasonesuppression test in genetically different rats exposed to inescapable andescapable electric shocks.Psychoneuroendocrinology,18(7),467-474.]。
在测试的第一天(DXMT1)上午10:00点，给动物注射(i.p.)盐水，然后在同一天下午4点，采集外周血样以确定引起应激的激素的基础水平，在将大鼠从笼子中取出并使其接受初始样品30分钟后，再次采集血样以测量激素应激水平。
为了研究HPA系统对反馈信号的敏感性，第二天(DXMT2)上午10点给大鼠注射地塞米松(DXM，10μg/kg，i.p.)。在6小时和6.5小时后重复从尾静脉采血的程序。用试剂盒“皮质酮-ELISA”(“Hema”，RF)通过酶联免疫吸附测定确定两个平行样品中的皮质酮含量。
通过计算所研究的动物亚组中的平均值和平均值的标准误差来处理实验数据，每个点n＝9。
7.1.5.试验设计
将实验室大鼠分成7个实验组，每组9只动物(表6)：
(1)“对照组”-对照组每天i.n.施用盐水持续10天。(2)“AFS+媒介物”-一组经受应激并接受媒介物(盐水)的动物。(3)“AFS+KEDV，5mg/kg”和(4)“AFS+KEDV，1mg/kg”-在应激后大鼠接受每天i.n.注射5mg/kg或1mg/kg剂量的KEDV持续10天。(5)“AFS+RAHE，5mg/kg”和(6)“AFS+RAHE，1mg/kg”-在应激后大鼠接受每天i.n.注射5mg/kg或1mg/kg剂量的RAHE持续10天。(7)“AFS+MAP”-在应激后大鼠接受每天i.n.注射4.5mg/kg剂量的比较药物马普替林(MAP)持续10天。
表6.实验设计、药物施用和行为测试时间表。
Figure BDA0003884300210000741
7.1.6.统计分析
对于正态分布数据，使用事后图基测试(post-hoc Tukey test)进行单向方差分析(ANOVA)。使用中位数测试和χ2测试以及耶茨校正对分类数据进行评估。将显著性阈值设定为p<0.05。数据呈现为平均值±平均值的标准误差或呈现为堆叠直方图(stackedhistogram)。
7.2.结果
7.2.1.OF
与对照无应激动物相比，AFS导致更长的冻结持续时间，这表明AFS组的焦虑程度更高(图26)。与经应激的盐水处理的动物相比，1mg/kg和5mg/kg剂量的KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)处理以及MAP施用导致冻结行为显著减少(图26)。这个结果表明接受肽的动物的情绪状态正常化，与在用三环抗抑郁药处理后观察到的那些类似。
7.2.2.EPM
为了估计在迷宫的开臂上花费的时间，使用了中位数测试，该测试显示所研究的组之间的中位数值是不同的(表7)。高于总中位数(0s)的值指示动物进入了迷宫的开臂。等于中位数的值指示动物没有离开EPM的暗臂。在对照组中，约67％的动物参观了迷宫的开臂，而在“AFS+媒介物”组中，没有动物离开迷宫的暗臂(图27)。这些差异具有统计学意义(p＝0.012，χ2与耶茨校正)。78％用MAP处理的动物和56％用RAHE(SEQ ID NO:3)以1mg/kg的剂量处理的动物进入迷宫的开臂。这显著高于用媒介物处理的应激组大鼠(p＝0.004和p＝0.035，χ2与耶茨校正)。5mg/kg RAHE(SEQ ID NO:3)和1mg/kg KEDV(SEQ ID NO:4)组中的动物比LH组的动物更经常地(44％的病例)进入开臂，但仅在趋势水平下。其与对照组的这个参数没有不同(图27)。
表7.在EPM的开臂中花费的时间：中位数测试的结果。
Figure BDA0003884300210000751
Figure BDA0003884300210000761
7.2.3.DXMT
以10g/kg的剂量注射DXM通常应伴随着血液皮质酮(CS)浓度的降低，如对照组动物中所展现出的(图5)。同时，注意到应激组大鼠中下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的调节的中断。在“AFS+媒介物”组中，DXM未能降低血清中的应激CS水平，相比之下，在对照组大鼠中抑制了70％，并且在施用Map的组中抑制了超过50％(图28)。以5mg/kg的剂量长期鼻内施用KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)肽也导致响应于DXMT的CS浓度显著降低(图28)。这可能指示动物在应激和肽处理后HPA调节正常化。
7.3.讨论
急性足休克应激模型导致OF测试中的冻结增强、EPM中明显的开臂回避以及大鼠中HPA轴调节的中断。这些影响表明焦虑样行为和情绪化的增加，以及内分泌系统功能障碍，这些常常伴随着抑郁性障碍。
在OF测试中，以1mg/kg和5mg/kg的剂量重复鼻内施用KEDV(SEQ ID NO:4)和-15减少了大鼠中应激诱发的冻结，这表明动物中情绪和焦虑的正常化。在EPM中，KEDV(SEQ IDNO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)都增加了离开迷宫开臂次数，因此只有1mg/kg剂量的RAHE(SEQID NO:3)显著改善了大鼠对开臂的偏好。这种影响可能表明用所研究的肽处理的动物的焦虑降低。此外，KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)都恢复了血浆中DXM诱发的皮质酮抑制。这可能表明肽处理的组中HPA轴调节的正常化。KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ IDNO:3)影响与在MAP(马普替林)处理后观察到的影响相似。
因此，研究结果表明，肽药物KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)的十天鼻内施用具有中度抗抑郁样和抗焦虑样作用，并且能够纠正应激模型中的应激后行为障碍。
7.4.结论
AFS导致动物出现焦虑和抑郁样状态。
AFS后鼻内施用KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)持续10天导致中度抗焦虑样和抗抑郁样作用。
KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)的作用类似于在用三环抗抑郁药马普替林(MAP)处理的动物中观察到的作用，这可能表明对应激诱发的障碍的处理有潜在意义。
实施例8：使用钙通量成像测试潜在的谷氨酸受体mGluR5肽拮抗剂KEDV和RAHE
研究的目的是评估潜在的mGluR5拮抗剂(KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3))对CHO-mGluR5细胞中谷氨酸钠诱发的[Ca2+]反应的影响。
8.1.材料和方法
8.1.1.模型
含有四环素诱导的人mGluR5的稳定表达的CHO-mGluR5细胞。
8.1.2.实验程序
使用T-Rex系统(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)根据制造商的说明书产生稳定表达人mGluR5的CHO细胞。简言之，将编码人mGluR5的cDNA亚克隆到诱导型表达载体pcDNA4/TO中，并且转染到携带表达四环素阻遏物的调节载体pcDNA6/TR的CHO细胞中。使用杀稻瘟菌素(Blasticidin)(5lg/ml)和腐草霉素(zeocin)(250lg/ml)选择2周后，在激动剂诱导的[Ca2+]摄取测定中针对mGluR5的表达对细胞库进行筛选。扩增并使用阳性细胞。通过在测试前16小时添加四环素(高达1lg/ml)来诱导mGluR5表达。
使用NOVOstar(BMG LABTECH,Ortenberg,Germany)进行荧光测定。将CHO-mGluR5细胞以每孔75,000个细胞的密度接种到黑壁透明底的96孔板中(不含抗生素并且含有1lg/ml的用于诱导受体表达的四环素的完全培养基)，并且在37℃下培养过夜。然后使用Fluo-4DirectTM钙测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)给细胞加载细胞质钙指示剂Fluo-4AM，并将其在黑暗中在37℃下温育60分钟，然后在25℃下温育60分钟。向该细胞中添加单独的缓冲液(对照)或含有不同浓度的KEDV(SEQ ID NO:4)肽、RAHE(SEQ ID NO:3)肽(0.02μM、2μM、20μM和200μM)或MPEP(0.1μM、1μM、10μM、100μM)(SigmaAldrich,USA)的缓冲液。在37℃下温育3分钟后，在添加mGLuR5激动剂(1mM谷氨酸钠-Glu-Na)之前和之后监测细胞荧光的变化(lex＝485nM，lem＝520nM)。在pH 7.4和37℃下进行测量。
8.2.结果
在不存在或存在不同浓度拮抗剂的情况下CHO-mGluR5细胞对1mM谷氨酸钠(GluNa)的[Ca2+]反应的测量结果在图29A、29B和29C中示出。KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)肽在1mM Glu-Na活化CHO-mGluR5细胞的峰值时刻(Glu-Na施加后27秒)对细胞内[Ca2+]水平的抑制作用在图29D、29E和29F中示出。
KEDV(SEQ ID NO:4)在整个所施加浓度的范围内有效地显著消除[Ca2+]电流(图29A和29D)。RAHE(SEQ ID NO:3)仅在20μM的浓度下能够减少对GluNa的[Ca2+]反应(图29B和29E)。
总之，与用缓冲液处理的细胞相比，将1mM GluNa施加至CHO-mGluR5细胞中导致细胞内[Ca2+]水平升高。用市售拮抗剂MPEP预处理CHO-mGluR5细胞导致GluNa诱导的活化消除。这两种所测试的肽(KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3))也展现出了mGluR5受体拮抗剂的典型作用：它们降低了CHO-mGluR5细胞中Glu-Na诱导的细胞质[Ca2+]水平。在20μM浓度下观察到RAHE(SEQ ID NO:3)肽的作用。KEDV(SEQ ID NO:4)肽在更生理相关的浓度下起作用(从0.02μM开始)。
8.3.结论
KEDV(SEQ ID NO:4)和RAHE(SEQ ID NO:3)都展现出了mGluR5受体拮抗剂的典型作用：它们降低了CHO-mGluR5细胞中Glu-Na诱导的胞质[Ca2+]水平。
等效方案
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述本发明，但应理解本发明能够具有进一步的修改，并且本申请旨在涵盖大体上符合本发明原理的、包括虽然不属于本发明所公开内容范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于上文中阐述和所附权利要求的范围所列出的必要特征中的任何变型、用途或者变更。
所属领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文具体描述的具体实施方案的许多等效物。此类等效物旨在包含在所附权利要求的范围内。
通过引用并入
本文引用的所有专利和出版物以引用的方式整体并入本文。
本文所讨论的出版物仅为其在本申请的申请日之前的公开而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借先前的发明先于这种公开。
如本文所用，所有标题仅用于组织并且不旨在以任何方式限制本公开。任何单独部分的内容可能同样适用于所有部分。
序列表
<110> 拉托科公司(Lactocore, Inc.)
A·马雷舍夫(MALYSHEV, Anton)
I·多罗宁(DORONIN, Igor)
G·巴布金(BABKIN, Gennady)
A·库丘莫夫(KUCHUMOV, Askar)
<120> 用于调节代谢型谷氨酸受体5的合成肽
<130> LACT-002PC/121851-5002
<150> US 63/010,425
<151> 2020-04-15
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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atgttgatca tgccatctcc ag 22

Claims (100)

1.一种包含合成神经调节肽的组合物，所述神经调节肽由通式I限定：
R1R2R3R4(I)
其中：
R1-R4中的至少一个是疏水性的，并且R1-R4中的至少一个是极性的或带电荷的；
R1-R4中没有一个选自L、M、I、T、C、P、N、Q、F、Y和W；并且
所述肽调节mGluR5受体(GRM5)。
2.如权利要求1所述的组合物，其中R1是R或K。
3.如权利要求1所述的组合物，其中R1是D或E。
4.如权利要求1所述的组合物，其中R1是S。
5.如权利要求1所述的组合物，其中R2是亲水性中性的。
6.如权利要求1所述的组合物，其中R2是带负电荷的亲水性的。
7.如权利要求1所述的组合物，其中R2是疏水性中性的。
8.如权利要求1所述的组合物，其中R2是A、S、E或D。
9.如权利要求1所述的组合物，其中R2是A。
10.如权利要求1所述的组合物，其中R2是S。
11.如权利要求1所述的组合物，其中R2是E或D。
12.如权利要求1所述的组合物，其中R3是G、H、S或D。
13.如权利要求12所述的组合物，其中R3是G。
14.如权利要求12所述的组合物，其中R3是H。
15.如权利要求12所述的组合物，其中R3是S。
16.如权利要求12所述的组合物，其中R3是D。
17.如权利要求1所述的组合物，其中R4是S、H、V或E。
18.如权利要求17所述的组合物，其中R4是S。
19.如权利要求17所述的组合物，其中R4是H。
20.如权利要求17所述的组合物，其中R4是V。
21.如权利要求17所述的组合物，其中R4是E。
22.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1是D；
R2是S；
R3是G；并且
R4是H。
23.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1是R；
R2是A；
R3是H；并且
R4是E。
24.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1是K；
R2是E；
R3是D；并且
R4是V。
25.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1是A；
R2是G；
R3是A；并且
R4是S。
26.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1、R2和R3中的每一者都是疏水性脂肪族氨基酸；并且
R4是极性且电荷中性的亲水性氨基酸。
27.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1是极性且带负电荷的亲水性氨基酸；
R2是极性且电荷中性的亲水性氨基酸；
R3是疏水性脂肪族氨基酸；并且
R4是芳香族、极性且带正电荷的亲水性氨基酸。
28.如权利要求27所述的组合物，其中：
R1是D；
R2是S；
R3是G、A或V；并且
R4是H。
29.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1是极性且带正电荷的亲水性氨基酸；
R2是疏水性脂肪族氨基酸；
R3是芳香族、极性且带正电荷的亲水性氨基酸；并且
R4是极性且带负电荷的亲水性氨基酸。
30.如权利要求29所述的组合物，其中：
R1是R或K；
R2是G、A或V；
R3是H；并且
R4是D或E。
31.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1是极性且带正电荷的亲水性氨基酸；
R2是极性且带负电荷的亲水性氨基酸；
R3是极性且带负电荷的亲水性氨基酸；并且
R4是疏水性脂肪族氨基酸。
32.如权利要求31所述的组合物，其中：
R1是R或K；
R2是D或E；
R3是D或E；并且
R4是G、A或V。
33.如权利要求1所述的组合物，其中：
R1选自R、K、D、A和E；
R2选自A、S、G、D和E；
R3选自S、G、D、E、A和H；并且
R4选自S、H、V和E。
34.如权利要求33所述的组合物，其中：
R1是D；
R2是S；
R3是G；并且
R4是H。
35.如权利要求33所述的组合物，其中：
R1是R；
R2是A；
R3是H；并且
R4是E。
36.如权利要求33所述的组合物，其中：
R1是K；
R2是E；
R3是D；并且
R4是V。
37.如权利要求33所述的组合物，其中：
R1是A；
R2是G；
R3是A；并且
R4是S。
38.一种包含合成神经调节肽的组合物，所述神经调节肽由通式II限定：
R1R2R3R4(II)
其中：
R1选自非疏水性且非芳香族的氨基酸；在侧链上含有完全正电荷的氨基酸；在侧链上含有完全负电荷的氨基酸；以及不带电荷且在侧链中含有不超过5个原子的氨基酸；
R2选自不带电荷且在侧链中含有不超过5个原子的氨基酸，以及在侧链上含有完全负电荷的氨基酸；
R3选自不带电荷且在侧链中含有不超过5个原子的氨基酸；在侧链上含有完全负电荷的氨基酸；以及芳香族非疏水性的氨基酸；并且
R4选自不包括W、Y、F、P、I的氨基酸。
39.如权利要求38所述的组合物，其中：
R1选自A、R、K、D、E、Q、N、S、T、C和M；
R2选自A、S、G、D和E；
R3选自S、A、G、D、E和H；并且
R4选自S、H、V和E。
40.如权利要求38所述的组合物，其中：
R1选自R、K、D、A和E；
R2选自A、S、G、D和E；
R3选自S、G、D、E、A和H；并且
R4选自S、H、V和E。
41.如权利要求40所述的组合物，其中：
R1是D；
R2是S；
R3是G；并且
R4是H。
42.如权利要求40所述的组合物，其中：
R1是R；
R2是A；
R3是H；并且
R4是E。
43.如权利要求40所述的组合物，其中：
R1是K；
R2是E；
R3是D；并且
R4是V。
44.如权利要求40所述的组合物，其中：
R1是A；
R2是G；
R3是A；并且
R4是S。
45.如权利要求38所述的组合物，其中R1是R、K、D、E、S或A。
46.如权利要求38所述的组合物，其中R1是R。
47.如权利要求38所述的组合物，其中R1是D。
48.如权利要求38所述的组合物，其中R1是K。
49.如权利要求38所述的组合物，其中R1是A。
50.如权利要求38所述的组合物，其中R2是S。
51.如权利要求38所述的组合物，其中R2是A。
52.如权利要求38所述的组合物，其中R2是G。
53.如权利要求38所述的组合物，其中R2是E。
54.如权利要求38所述的组合物，其中R3是G。
55.如权利要求38所述的组合物，其中R3是H或D。
56.如权利要求38所述的组合物，其中R3是A。
57.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中所述神经调节肽由不包括脯氨酸的氨基酸组成。
58.如权利要求1至57中任一项所述的组合物，其中所述肽是任选地经化学修饰的。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述化学修饰选自对R1、R2、R3和R4中的一者或多者的酰胺化、甲基化和乙酰化。
60.如权利要求58所述的组合物，其中所述化学修饰选自向R1、R2、R3和R4中的一者或多者添加甲酰基、焦谷氨酰基(pGlu)、脂肪酸、尿素、氨基甲酸酯、磺酰胺、烷基胺或它们的任何组合。
61.如权利要求1至60中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
62.如权利要求1至60中任一项所述的组合物，其进一步包含递送媒介物。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所述递送媒介物选自脂质体、纳米颗粒和多糖。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述多糖选自环糊精、壳聚糖、纤维素和藻酸盐。
65.如权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于鼻内施用。
66.如权利要求65所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种鼻粘膜蛋白酶抑制剂。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述抑制剂选自贝斯他汀、初乳淀粉酶、亮抑酶酞、抑酶肽、杆菌肽、阿美坦醌、硼酸亮氨酸、嘌呤霉素、胆汁盐和夫西地酸。
68.如权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过吸入施用。
69.如权利要求68所述的组合物，其中所述通过吸入施用是使用干粉鼻内器械来执行。
70.如权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内施用。
71.如权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于经口施用。
72.如权利要求1至71中任一项所述的组合物，其中所述肽调节mGluR5受体(GRM5)。
73.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1至72中任一项所述的组合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
74.一种用于调节细胞中的mGluR5(GRM5)受体的方法，其包括使所述细胞与权利要求1至72中任一项所述的组合物接触。
75.一种用于治疗有需要的患者的情绪障碍的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的权利要求1至72中任一项所述的组合物。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述情绪障碍为抑郁症。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述抑郁症选自重性抑郁性障碍、心境恶劣、突破性抑郁症、治疗难治性抑郁症和与帕金森氏病相关的抑郁症、与创伤后应激障碍相关的抑郁症、产后抑郁症、双相型抑郁症。
78.如权利要求75所述的方法，其中所述情绪障碍是焦虑性障碍。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述焦虑性障碍选自广泛性焦虑性障碍、社交焦虑性障碍和惊恐障碍、创伤后应激障碍。
80.如权利要求75所述的方法，其中所述情绪障碍为精神分裂症。
81.如权利要求75所述的方法，其中所述情绪障碍是惊恐障碍。
82.如权利要求75所述的方法，其中所述情绪障碍是与应激有关的障碍。
83.如权利要求75所述的方法，其中所述情绪障碍是双相型障碍。
84.一种用于治疗有需要的患者的运动障碍的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的权利要求1至72中任一项所述的组合物。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述运动障碍是运动机能减退性运动障碍或运动机能亢进性运动障碍。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述运动障碍是伴随精神障碍的运动障碍。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述运动机能减退性运动障碍选自帕金森氏病、哈-斯二氏病、进行性核上性眼肌麻痹和纹状体黑质变性。
88.如权利要求85所述的方法，其中所述运动机能亢进性运动障碍选自肌张力障碍、药物诱导的肌张力障碍、特发性家族性肌张力障碍、特发性非家族性肌张力障碍、痉挛性斜颈、特发性口面部肌张力障碍、眼睑痉挛、自发性震颤、药物诱导的震颤、肌阵挛、眼阵挛、舞蹈病、药物诱导的舞蹈病、风湿性舞蹈病(西德纳姆舞蹈病)、亨廷顿氏舞蹈病、颤搐、单侧抽搐、手足徐动症、运动障碍、迟发性运动障碍、左旋多巴诱导的运动障碍、抽动障碍、图雷特综合征、刻板性运动障碍、阵发性夜间肢体运动、不宁腿综合征、僵人综合征和大脑性麻痹。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述帕金森氏病包括原发性帕金森氏病、特发性帕金森氏病、继发性帕金森氏病或帕金森叠加综合征。
90.如权利要求84所述的方法，其中所述运动障碍包括肌张力障碍、紧张症、自发性震颤、亨廷顿氏舞蹈病、图雷特综合征和刻板性运动障碍。
91.如权利要求84所述的方法，所述运动障碍可以是注意缺陷多动障碍。
92.一种用于治疗有需要的患者的神经退行性障碍的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的权利要求1至72中任一项所述的组合物。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述神经退行性障碍为帕金森氏病。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述帕金森氏病包括原发性帕金森氏病、特发性和继发性帕金森氏病或帕金森叠加综合征。
95.如权利要求92所述的方法，其中所述神经退行性障碍为阿尔茨海默氏病。
96.如权利要求92所述的方法，其中所述神经退行性障碍与运动障碍相关。
97.如权利要求74至96中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用抗抑郁药，其中所述抗抑郁药任选地选自由以下组成的组：血清素再摄取抑制剂、选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂、组合作用SSRI/SNRI、血清素-2拮抗剂/再摄取抑制剂、具有α-2拮抗作用加上血清素-2和血清素-3拮抗作用的抗抑郁药、具有血清素/去甲肾上腺素/多巴胺再摄取抑制作用的抗抑郁药、具有去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制作用的抗抑郁药、5-HT-1α拮抗剂、5-HT-1β拮抗剂、5-HT1A受体激动剂、5-HT1A受体激动剂和拮抗剂、5-HT2受体拮抗剂、盐酸维洛沙嗪、脱氢表雄酮、NMDA受体拮抗剂、AMPA受体增强剂、P物质拮抗剂/神经激肽-1受体拮抗剂、非肽P物质拮抗剂、神经激肽2拮抗剂、神经激肽3拮抗剂、促肾上腺皮质激素释放因子受体拮抗剂、抗糖皮质激素药物、糖皮质激素受体拮抗剂、皮质醇阻断剂、一氧化氮合成抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、脑啡肽酶抑制剂、GABA-A受体激动剂、自由基捕集剂、非典型MAOI、选择性MAOI抑制剂、激素、亚叶酸、醛氢叶酸、曲马多和色氨酸与抗精神病药物的组合，其中所述抗精神病药物选自由非典型抗精神病药物和多巴胺系统稳定剂组成的组。
98.如权利要求74至97中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用额外的抑郁症治疗剂，所述额外的抑郁症治疗剂包括任选地选自以下中的一种或多种的剂：CYMBALTA经口剂、LEXAPRO经口剂、EFFEXOR XR经口剂、ZOLOFT经口剂、CELEXA经口剂、TRAZODONE经口剂、PROZAC经口剂、WELLBUTRIN XL经口剂、CITALOPRAM经口剂、PRISTIQ经口剂、AMITRIPTYLINE经口剂、SAVELLA经口剂、VIIBRYD经口剂、PAXIL CR经口剂、WELLBUTRIN经口剂、PAXIL经口剂、SERTRALINE经口剂、REMERON经口剂、NORTRIPTYLINE经口剂、VENLAFAXINE经口剂、FLUOXETINE经口剂、BUPROPION HCL经口剂、MIRTAZAPINE经口剂、RITALIN经口剂、PAROXETINE经口剂、WELLBUTRIN SR经口剂、DOXEPIN经口剂、METHYLPHENIDATE经口剂、SYMBYAX经口剂、ESCITALOPRAM OXALATE经口剂、PAMELOR经口剂、IMIPRAMINE经口剂、BRINTELLIX经口剂、DULOXETINE经口剂、NARDIL经口剂、FETZIMA经口剂、EMSAM TRANSDERMAL,PARNATE经口剂、PEXEVA经口剂、BRISDELLE经口剂、CLOMIPRAMINE经口剂、ANAFRANIL经口剂、TOFRANIL经口剂、FLUVOXAMINE经口剂、ZYBAN经口剂、DESIPRAMINE经口剂、SARAFEM经口剂、PROZAC WEEKLY经口剂、APLENZIN经口剂、METHYLIN经口剂、NEFAZODONE经口剂、QUILLIVANT XR经口剂、TOFRANIL-PM经口剂、NORPRAMIN经口剂、REMERON SOLTAB经口剂、BUPROPION HBR经口剂、OLEPTRO ER经口剂、DESVENLAFAXINESUCCINATE经口剂、BUPROBAN经口剂、IMIPRAMINE PAMOATE经口剂、VILAZODONE经口剂、MILNACIPRAN经口剂、PAROXETINE MESYLATE经口剂、SURMONTIL经口剂、MAPROTILINE经口剂、PROTRIPTYLINE经口剂、PHENELZINE经口剂、MARPLAN经口剂、OLANZAPINE-FLUOXETINE经口剂、TRANYLCYPROMINE经口剂、SELEGILINE TRANSDERMAL、AMOXAPINE经口剂、FORFIVO XL经口剂、ISOCARBOXAZID经口剂、DESVENLAFAXINE经口剂、KHEDEZLA经口剂、LEVOMILNACIPRAN经口剂、VORTIOXETINE经口剂和DESVENLAFAXINE FUMARATE经口剂。
99.如权利要求84至98中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用额外剂，所述额外剂选自以下中的一种或多种：左旋多巴、卡比多巴、沙芬酰胺、普拉克索、罗替戈汀、罗匹尼洛、金刚烷胺、苯甲托品、三己芬迪、司来吉兰、雷沙吉兰、恩他卡朋、托卡朋、地西泮、氯硝西泮、巴氯芬、三己芬迪、苯甲托品、乙丙嗪、劳拉西泮、溴隐亭、四苯喹嗪、普萘洛尔、扑米酮、氟奋乃静、氟哌啶醇、利培酮、哌迷清、齐拉西酮、氟奋乃静、安非他明、哌甲酯、右哌甲酯、哌甲酯、盐酸阿托西汀和二甲磺酸赖右苯丙胺。
100.如权利要求74至99中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用额外的焦虑治疗剂，所述额外的焦虑治疗剂任选地选自以下中的一种多种的剂：苯二氮卓类，其选自阿普唑仑(XANAX)、氯硝西泮(KLONOPIN)、地西泮(VALIUM)、劳拉西泮(ATIVAN)、奥沙西泮(SERAX)和氯二氮卓(利眠宁)；β受体阻断剂，其选自普萘洛尔(INDERAL)和阿替洛尔(TENORMIN)；三环类抗抑郁药，其选自丙咪嗪(TOFRANIL)、脱甲丙咪嗪(NORPRAMIN、PERTOFRANE)、去甲替林(AVENTYL或PAMELOR)、阿米替林(ELAVIL)、多塞平(SINEQUAN或ADAPIN)、氯米帕明(ANAFRANIL)；单胺氧化酶抑制剂(MAOI)，其选自苯乙肼(NARDIL)、反苯环丙胺(PARNATE)；选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)，其选自氟西汀(PROZAC)、氟伏沙明(LUVOX)、舍曲林(ZOLOFT)、帕罗西汀(PAXIL)、草酸艾司西酞普兰(LEXAPRO)、西酞普兰(CELEXA)；血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，其选自文拉法辛(EFFEXOR)、文拉法辛缓释剂(EFFEXORXR)和度洛西汀(CYMBALTA)；温和的镇定剂，诸如丁螺环酮(BUSPAR)；以及抗惊厥药，其选自丙戊酸盐(DEPAKOTE)、普瑞巴林(LYRICA)和加巴喷丁(NEURONTIN)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2157233C1 (ru) * 1999-05-11 2000-10-10 Санкт-Петербургская общественная организация "Институт биорегуляции и геронтологии" Тетрапептид, обладающий геропротекторной активностью, фармакологическое средство на его основе и способ его применения
US20060148711A1 (en) * 1999-05-14 2006-07-06 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in neurons
BRPI0517148A (pt) * 2004-12-06 2008-09-30 Univ California método de aperfeiçoamento da estrutura e/ou função arterìola; agente ativo e kit para tratamento
EP2550529B1 (en) * 2010-03-23 2021-11-17 Iogenetics, LLC. Bioinformatic processes for determination of peptide binding
EA202192460A1 (ru) * 2019-03-14 2021-11-24 Лактокор, Инк. Синтетические нейромодуляторные пептиды

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