ES2825101T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos usando un agonista del receptor de la endotelina B - Google Patents

Abstract

Un agonista del receptor de endotelina B para usar en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo mediante la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista del receptor de endotelina B, en donde la administración comprende tres dosis del agonista de endotelina B administradas por vía intravenosa a intervalos de 1 a 6 horas, y en donde el agonista del receptor de endotelina B se selecciona del grupo que consiste en IRL-1620, BQ-3020, [Ala1,3,11,15]-Endotelina, Sarafotoxina S6c, endotelina-3 y una mezcla de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos usando un agonista del receptor de la endotelina B

MATERIAL REMITIDO ELECTRÓNICAMENTE

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Campo de la invención

La presente invención proporciona el uso de un agonista del receptor de endotelina-B como agente neurorregenerativo.

Antecedentes de la invención

La endotelina (ET) es un péptido endógeno que se ha relacionado con numerosos fenómenos fisiológicos y patológicos en el organismo. Al actuar sobre dos receptores distintos, ET^a y ET^b, la ET influye en una variedad de procesos, desde la regulación de la presión arterial hasta los neurotransmisores y hormonas (Kojima et al., 1992; Levin, 1995; Schiffrin et al., 1997; Schneider et al., 2007). Aunque se han estudiado más ampliamente por sus acciones sobre el sistema cardiovascular, los receptores de ET están diseminados por todo el cuerpo, incluido el cerebro. Los receptores ET^b, específicamente, se encuentran en abundancia en neuronas y células gliales, así como en el revestimiento endotelial de la vasculatura cerebral (Schinelli, 2006). La función exacta de estos receptores dentro del cerebro, particularmente durante su desarrollo, no se comprende bien.

El documento WO 02/43654 divulga composiciones farmacéuticas para el tratamiento de lesiones cerebrales, lesiones de la médula espinal, ictus y enfermedades neurodegenerativas, comprendiendo dichas composiciones también el agonista del receptor de endotelina B endotelina-3. El documento WO 2012/138043 divulga el uso de endotelina-3 en composiciones para la prevención o el tratamiento de la enfermedad isquémica. El documento WO 2004/045592 divulga compuestos y métodos para aumentar la neurogénesis y que son beneficiosos para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

Desarrollo del sistema nervioso central

Se ha demostrado que una deficiencia de receptores ET^b al nacimiento tiene como resultado una disminución de las células progenitoras neuronales y un aumento de la apoptosis dentro de la circunvolución dentada y el cerebelo postnatal de las ratas(Ehrenreich et al., 2000; Vidovic et al., 2008). Adicionalmente, El modelo de inactivación de ET^b en ratas conduce a aganglionosis congénita en el intestino y trastornos del SNC asociados (Dembowski et al., 2000). Estos ratones con ET^b inactivado, que tienen una mortalidad postnatal de 4 semanas, sirven como modelos para la enfermedad de Hirschsprung. Estudios previos han demostrado que la expresión del receptor ET^b es particularmente alta inmediatamente después del nacimiento, pero que desciende hasta niveles más bajos en el día postnatal 21 (Briyal et al., 2012b). La ubicación de estos receptores y su correlación, o la falta de ella, con los factores de crecimiento del SNC durante estas etapas cruciales de desarrollo quedan por determinar.

Aunque está claro que los receptores ET^b son necesarios para el desarrollo normal del SNC, no se sabe en qué células o vías ejercen una influencia protectora o proliferativa. Estudios anteriores han demostrado que la estimulación selectiva de los receptores ET^b produce una neuroprotección frente al estrés oxidativo y una reducción significativa del volumen de infarto en el cerebro de ratas adultas sometidas a isquemia cerebral (Leonard et al., 2011; 2012). También se descubrió que la protección y recuperación de la condición isquémica se debió, al menos en parte, a un aumento de la angiogénesis y neurogénesis dentro de los 7 días posteriores al infarto y el tratamiento con el agonista del receptor ET^b, IRL-1620 (Leonard and Gulati, 2013). Un aumento en los factores de crecimiento vascular y nervioso dentro del cerebro de animales infartados tratados con IRL-1620 coincidió con un aumento en el nivel de receptores ET^b.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se expresa normalmente en los microvasos cerebrales así como en el tejido neuronal tanto de recién nacidos como de adultos (Hoehn et al., 2002). El VEGF en el cerebro humano fetal se encuentra en células neuroepiteliales, neuroblastos, células gliales radiales y células endoteliales, y su expresión parece estar regulada por el desarrollo y correlacionada con la angiogénesis (Virgintino et al., 2003). Si bien se sabe que el VEGF es necesario para el crecimiento de los vasos sanguíneos, investigaciones recientes han indicado que también desempeña un papel importante en la promoción de la neurogénesis, el patrón neuronal y la migración neuronal (Rosenstein et al., 2010). Se ha demostrado que existe una correlación entre el VEGF, el factor de crecimiento neuronal (NGF) y los receptores ET^b en el cerebro en desarrollo. Los receptores ET^b pueden estimularse administrando agonistas del receptor ET^b tales como IRL-1620, pudiendo promover el crecimiento del SNC y tratar enfermedades en las que el SNC ha resultado dañado o no ha crecido apropiadamente.

Enfermedades neurodegenerativas

Neurodegeneración es un término que indica la pérdida progresiva de estructura o función de las neuronas, incluida la muerte de las neuronas. Muchas enfermedades neurodegenerativas, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), el Parkinson, el Alzheimer y la enfermedad de Huntington son el resultado de procesos neurodegenerativos. A medida que avanza la investigación, aparecen muchas similitudes que relacionan estas enfermedades entre sí a nivel subcelular. El descubrimiento de estas similitudes ofrece la esperanza de avances terapéuticos que podrían mejorar muchas enfermedades simultáneamente. Existen muchos paralelismos entre los diferentes trastornos neurodegenerativos, incluidos los conjuntos de proteínas atípicas y la muerte celular inducida (Bredesen et al., 2006; Rubinsztein, 2006).

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por disfunciones cerebrovasculares y neuronales que conducen a un deterioro progresivo de las funciones cognitivas. Las características neuropatológicas de la EA incluyen placas de beta amiloide (Ap) y ovillos neurofibrilares (Johnson et al., 2008). Durante mucho tiempo se ha especulado que la disfunción cerebrovascular contribuye a la EA. Se ha demostrado que el Ap disminuye la respuesta miogénica, el flujo sanguíneo cerebral (FSC) y las respuestas vasodilatadoras (Han et al., 2008; Niwa et al., 2000; Paris et al., 2004; Shin et al., 2007). La regulación del FSC tiende a verse afectada en ratones transgénicos con altos niveles intracerebrales de Ap (Niwa et al., 2002). Se ha demostrado que el Ap sintético altera la relajación dependiente de la endotelina (ET) y mejora la vasoconstricción in vivo e in vitro (Niwa et al., 2000; Niwa et al., 2001).

Varios estudios han demostrado una implicación de la ET en la EA. La ET es un péptido vasorregulador endógeno que se dirige a dos receptores principales: - ET^a y ET^b. Los receptores ET^a se encuentran principalmente en las células del músculo liso vascular y median en la vasoconstricción, mientras que los receptores ET^b se encuentran principalmente en las células endoteliales vasculares y median en la vasodilatación (Goto et al., 1989; Tsukahara et al., 1994). Se ha demostrado que la ET está presente en el cerebro y juega un papel importante en la regulación de la circulación sanguínea cerebral y sistémica (Gulati et al., 1997; Gulati et al., 1996; Gulati et al., 1995; Rebello et al., 1995a). Inicialmente se demostró que las concentraciones de ET-1 en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EA eran menores en comparación con el control (Yoshizawa et al., 1992), sin embargo, estudios posteriores indican que la inmunorreactividad similar a ET-1 estaba significativamente aumentada en la corteza cerebral (lóbulos frontal y occipital) de pacientes que padecían EA en comparación con cerebros de control (Minami et al., 1995). Las muestras de cerebro de pacientes con EA obtenidas post mortem mostraron un aumento de la expresión de inmunorreactividad de ET-1 en los astrocitos (Zhang et al., 1994). Se ha sugerido que la ET-1 liberada por los astrocitos puede llegar a las células del músculo liso vascular e inducir vasoconstricción. Se descubrió que los sitios de unión a ET en los cerebros humanos con EA estaban disminuidos, lo que podría deberse a la pérdida de neuronas en la corteza (Kohzuki et al., 1995).

El mecanismo por el cual el Ap soluble interfiere con la función vascular no se conoce completamente. Un posible mecanismo por el cual el Ap soluble interfiere con la función vascular puede estar mediado por ET-1, que desempeña un papel central en la regulación de las funciones cardiovasculares y el flujo sanguíneo regional (Gulati et al., 1997; Gulati et al., 1996; Gulati et al., 1995). Anteriormente se había descubierto que unos antagonistas del receptor ET^a específicos (BMS182874 y BQ123) evitaban el estrés oxidativo y los déficits cognitivos inducidos por Ap (Briyal et al., 2011). Algunos receptores de ET^a específicos reducían las latencias de escape y también aumentaban la preferencia por el cuadrante diana. Por otro lado, un antagonista del receptor ET^a/ET^b no específico (TAK-044) no produjo ninguna mejora en el déficit de memoria espacial ni pérdida de preferencia por el cuadrante objetivo (Briyal et al., 2011). Esta falta de mejoría con el antagonista de ET^a/ET^b no específico nos indicó la implicación específica de los receptores de ET^b en la EA.

Los sitios de unión de ET en el cerebro son fundamentalmente de receptores ET^b y se ha demostrado que los agonistas del receptor ET^b son antiapoptóticos contra la neurotoxicidad de Ap (Yagami et al., 2002). La deficiencia completa o bloqueo de los receptores ET^b conduce a la exacerbación del daño cerebral isquémico, posiblemente debido a un cambio en el equilibrio vasomotor por la ET (Chuquet et al., 2002; Ehrenreich et al., 1999). Se ha demostrado que la activación de los receptores ET^b con IRL-1620 intravenoso, un agonista de ET^b altamente selectivo, da como resultado una elevación significativa del FSC en ratas normales y una reducción del déficit neurológico y el volumen de infarto de las ratas con ictus (Leonard et al., 2011; Leonard and Gulati, 2009). También se descubrió que la eficacia de IRL-1620 en un modelo de ictus en rata se veía completamente antagonizada por BQ788 lo que indica una implicación de los receptores ET^b (Leonard et al., 2011; 2012).

Ictus y trastornos cerebrovasculares

El ictuses la pérdida rápida de la función cerebral debido a una alteración en la irrigación sanguínea del cerebro, que puede deberse a una isquemia o a una hemorragia (Sims and Muyderman, 2009). Es la segunda causa principal de muerte y la cuarta causa principal de discapacidad en todo el mundo (Mathers et al., 2009; Strong et al., 2007). También es un factor predisponente para la epilepsia, las caídas y la depresión (Fisher and Norrving, 2011) y es una de las principales causas de deficiencias funcionales, requiriendo el 20 % de los supervivientes cuidado institucional después de 3 meses y del 15 %-30 % quedan permanente incapacitados (Steinwachs et al., 2000).

El ictus se divide en dos categorías amplias: ictus isquémicos, causados por la oclusión repentina de las arterias que irrigan el cerebro, ya sea debido a un trombo en el sitio de la oclusión o formado en otra parte de la circulación. De acuerdo con los datos recientes publicados por la Asociación Americana del Corazón, el 87 % de los ictus se clasifican como isquémicos (Deb et al., 2010; Feigin et al., 2009; Roger et al., 2012). Los ictus hemorrágicos, causados por hemorragia de una de las arterias del cerebro en el tejido cerebral (hemorragia subaracnoidea) o hemorragia arterial en el espacio entre las meninges (hemorragia intracerebral).

El resultado después de un ictus depende del sitio y la gravedad de la lesión cerebral. Un ictus muy grave puede causar muerte súbita. El área del cerebro afectada por el ictus no puede funcionar, lo que puede dar como resultado una incapacidad para mover una o más extremidades de un lado del cuerpo, la incapacidad para comprender o formular el habla o incapacidad para ver un lado del campo visual (Bath and Lees, 2000; Donnan et al., 2008). El reconocimiento temprano del ictus es más importante para acelerar las pruebas de diagnóstico y los tratamientos. A pesar de la gravedad del ictus isquémico, el único tratamiento farmacológico aprobado por la FDA actualmente disponible es el activador de plasminógeno tisular recombinante (rtPA), que disuelve el coágulo y restaura el flujo sanguíneo al cerebro. Este tratamiento se complica por la ventana de tiempo relativamente corta entre el infarto y el tratamiento (3-4 h) y el mayor riesgo de hemorragia subaracnoidea (Micieli et al., 2009). Un gran número de otros agentes, ampliamente clasificados como neuroprotectores y cuyo objetivo es ralentizar o detener el daño secundario asociado con la cascada isquémica posterior al ictus, se han mostrado prometedores en las etapas iniciales de la investigación, pero hasta ahora no han logrado demostrar su eficacia en los ensayos clínicos (Ly et al., 2006). Por lo tanto, se necesita un nuevo enfoque, uno que tenga el potencial de abordar tanto la restauración del flujo sanguíneo como la atenuación del daño secundario en el área penumbral.

Después de un ictus isquémico y hemorragia subaracnoidea, los niveles de ET en la sangre y la inmunorreactividad de ET en los tejidos se elevan (Asano et al., 1990; Rebello et al., 1995b; Viossat et al., 1993). Una demostración de que el aumento de los niveles de ET coincide con una disminución del flujo sanguíneo regional en las áreas isquémicas del cerebro después de un ictus experimental llevó a la investigación de varios antagonistas de ET en el tratamiento del ictus isquémico focal (Patel et al., 1995). Aunque algunos antagonistas específicos de ETA y no específicos de ETA/B se han mostrado prometedores en modelos experimentales de ictus, otros no (Barone et al., 2000; Barone et al., 1995; Briyal and Gulati, 2010; Briyal et al., 2007; Briyal et al., 2012a; Gupta et al., 2005; Kaundal et al., 2012; Zhang et al., 2008; Zhang et al., 2005). En general, este enfoque no ha sido útil. Se ha demostrado que los receptores ET^b, que aumentan el VEGF y el NGF en el cerebro, están sobreexpresados en el momento del nacimiento y su expresión disminuye con la madurez del cerebro (Briyal et al., 2012b). Parece que los receptores ET^b presentes en gran número en el SNC desempeñan un papel clave en su desarrollo. Esta información fundamental demuestra la posible participación del receptor ET^b en el desarrollo del cerebro para generar plasticidad neurovascular del cerebro que se ha dañado después de la isquemia cerebral. Se ha observado que la estimulación de los receptores ET^b con IRL-1620 intravenoso, un agonista de ET^b altamente selectivo, dio como resultado una elevación significativa del flujo sanguíneo cerebral en ratas normales (Leonard and Gulati, 2009). Además, se ha demostrado que los receptores ET^b funcionales aumentan la proliferación de progenitores neuronales y protegen contra la apoptosis en la circunvolución dentada, el epitelio olfativo y las neuronas corticales (Ehrenreich et al., 1999; Laziz et al., 2011; Lee et al., 2003; Yagami et al., 2005). La evidencia de que una deficiencia de receptores ET^b conduce a un peor resultado después de la isquemia cerebral (Chuquet et al., 2002) y la deficiencia completa o bloqueo de los receptores ET^b conduce a la exacerbación del daño cerebral isquémico (Ehrenreich et al., 1999) condujo a la investigación del papel de los receptores ET^b en un modelo de ictus isquémico. Aunque la mayoría de la investigación sobre la ET y el ictus hasta ahora se ha centrado en antagonizar los receptores ET^a de forma selectiva o no selectiva para prevenir una vasoconstricción excesiva, se ha examinado el efecto de la activación selectiva de los receptores ETB en un modelo de ictus focal (Leonard et al., 2011; 2012; Leonard and Gulati, 2013).

En la práctica clínica en la actualidad existen dos tratamientos básicos, el tratamiento preventivo con agentes antiplaquetarios o anticoagulantes a largo plazo para reducir el riesgo de ictus, o el tratamiento agudo con fibrinolíticos. Sin embargo, menos del 2% de los pacientes pueden recibir fibrinolíticos (Font et al., 2010). Se está llevando a cabo una amplia investigación en busca de agentes neuroprotectores para su posible uso en la fase aguda del ictus y de agentes que se puedan usar para la reparación neurológica en las etapas posteriores del ictus.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona el uso de IRL-1620, BQ-3020, [Ala1,3,11,15]-Endotelina, Sarafotoxina S6c, endotelina-3 y una mezcla de los mismos, agonistas del receptor de endotelina B, en dosis apropiadas para actuar como agente neurorregenerativo, administrados en tres dosis del agonista de endotelina B administrados por vía intravenosa a intervalos de 1 a 6 horas.

En algunas realizaciones, el agonista del receptor de endotelina B se coadministra con un agente adicional para tratar el trastorno neurodegenerativo. En algunas realizaciones, el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un antidepresivo, un agente antiinflamatorio, un estimulante del SNC, un neuroléptico y un agente antiproliferativo.

La presente divulgación contempla que en realizaciones adicionales, el trastorno neurodegenerativo se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrófica.

En algunas realizaciones, el agonista del receptor de endotelina B se administra a una dosis que varía de 0,0001 a 0,5 mg/kg. En realizaciones adicionales, el agonista del receptor de endotelina B se administra repetidamente a intervalos de 1 a 6 horas después de cada dos a cinco días.

En cualquiera de las realizaciones de la divulgación, se contempla que el paciente sea un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Estructura de IRL-1620 (Suc-Asp-Glu-Glu-Ala-Val-Tyr-Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp; SEQ ID NO: 1). Figura 2. Expresión del factor de crecimiento endotelial vascular y receptores de endotelina B en la vasculatura del cerebro de rata postnatal. A) Imágenes representativas de los vasos sanguíneos en la corteza de la rata en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales, teñidos para el VEGF (rojo) y los receptores ET^b (verde). Barra de escala = 10 |jm. B) Intensidad del VEGF en la vasculatura del cerebro de rata en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. C) Número de vasos VEGF positivo por corte de cerebro de rata de 20 jm de grosor los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. D) Intensidad de receptores ET^b en la vasculatura del cerebro de rata en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. *P<0,05 frente a día 1; #P<0,01 frente a día 7. Los valores se expresan como la media ± EEM. Treinta crías macho se dividieron en los siguientes grupos: Día 1 (N=10); Día 7 (N=10); Día 14 (N=5); Día 28 (N=5).

Figura 3. Expresión del factor de crecimiento nervioso y receptores de endotelina B en la corteza y en la zona subventricular del cerebro de rata postnatal. A) Imágenes representativas de la corteza de la rata en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales, teñidas para los receptores de NGF (rojo) y los receptores ET^b (verde). Barra de escala = 100 jm. B) Imágenes representativas de la SVZ de rata en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales, teñidas para los receptores de NGF (rojo) y los receptores ET^b (verde). Barra de escala = 100 jm. C) Intensidad del ⁿG^f en la corteza y la SVZ del cerebro de rata en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. D) Número de células NGF positivo por 100 jm 2 en la corteza y la SVZ del cerebro de rata en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. E) Intensidad de los receptores ET^b en la corteza y la SVZ del cerebro de rata en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. *P<0,001 frente a día 1; #P<0,01 frente a día 7. Los valores se expresan como la media ± EEM. Treinta crías macho se dividieron en los siguientes grupos: Día 1 (N=10); Día 7 (N=10); Día 14 (N=5); Día 28 (N=5).

Figura 4. Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620, sobre el factor de crecimiento endotelial vascular y la expresión de ET^b en el cerebro de rata postnatal. A las crías de rata se les administró solución salina (control; N=5) o IRL-1620 (5 jg/kg, IV; N=5) el día 21 postnatal. A continuación, las crías se sacrificaron el día 28 postnatal y se extrajeron los cerebros para su análisis. A) Imágenes representativas de vasos sanguíneos en la corteza de rata de control y tratada con IRL-1620 en el día 28 potsnatal, teñidos para el VEGF (rojo) y los receptores ET^b (verde). Barra de escala = 10 jm. B) Intensidad del VEGF en la vasculatura del cerebro de rata en el día 28 postnatal. C) Número de vasos VEGF positivo por corte de cerebro de rata de 20 jm de grosor el día 28 postnatal. D) Intensidad de receptores ET^b en la vasculatura del cerebro de la rata en el día 28 postnatal. *P<0,05 frente al control. Los valores se expresan como la media ± EEM.

Figura 5. Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620, sobre el factor de crecimiento nervioso y la expresión de ET^b en el cerebro de rata postnatal. A las crías de rata se les administró solución salina (control; N=5) o IRL-1620 (5 jg/kg, IV; N=5) el día 21 postnatal. A continuación, las crías se sacrificaron el día 28 postnatal y se extrajeron los cerebros para su análisis. A) Imágenes representativas de la corteza de cerebros de rata de control y tratados con IRL-1620 en el día 28 postnatal, teñidas para los receptores de NGF (rojo) y los receptores ET^b (verde). Barra de escala = 100 jm. B) Imágenes representativas de la SVZ de cerebros de rata de control y tratados con IRL-1620 en el día 28 postnatal, teñidas para los receptores de NGF (rojo) y los receptores ET^b (verde). Barra de escala = 100 jm. C) Intensidad del n Gf en la corteza y la SVZ del cerebro de rata en el día 28 postnatal. D) Número de células NGF positivo por 100 jm 2 en la corteza y la SVZ del cerebro de rata en el día 28 postnatal. E) Intensidad de los receptores ET^b en la corteza y la SVZ del cerebro de rata el día 28 postnatal. *P<0,05 frente al control. Los valores se expresan como la media ± EEM.

Figura 6. Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620, sobre los niveles de proteína del factor de crecimiento vascular, el factor de crecimiento nervioso y los receptores ET^b en el cerebro de rata postnatal. A las crías de rata se les administró solución salina (control; N=5) o IRL-1620 (5 jg/kg, IV; N=5) el día 21 postnatal. A continuación, las crías se sacrificaron el día 28 postnatal y se extrajeron los cerebros para su análisis. A) Gráficas representativas de la expresión de VEGF, Expresión de ET^b y proteína NGF en los cerebros de rata de control y tratadas con IRL-1620 en el día 28 postnatal con p-tubulina o p-actina como controles de carga de proteínas. Carril 1 = Control; Carril 2 = IRL-1620. B) Factor de cambio en la expresión del VEGF en el cerebro de rata en el día 28 postnatal. C) Factor de cambio en la expresión de los receptores ET ^b en el cerebro de rata el día 28 postnatal. D) Factor de cambio en la expresión del NGF en el cerebro de rata el día 28 postnatal. *P<0,05 frente al control. Los valores se expresan como la media ± EEM.

Figura 7. Efecto de un agonista del receptor ET ^b , IRL-1620, en presencia y ausencia de un antagonista del receptor ET ^b , BQ788, sobre los niveles de malondialdehído (MDA) (A), glutatión reducido (GSH) (B) y superóxido dismutasa (SOD) (C) en el estrés oxidativo inducido por Ap en el cerebro de la rata. Los valores se expresan como la media ± EEM. *p<0,0001 en comparación con simulado; ^#p<0,001 en comparación con Ap vehículo (N=6).

Figura 8. Efecto de un agonista del receptor ET ^b , IRL-1620, en presencia y ausencia de un antagonista del receptor ET^B, BQ788, sobre la latencia de escape (A) y la longitud de la trayectoria (B) en cada día de entrenamiento de la tarea del laberinto de agua en ratas no diabéticas. Los animales fueron sometidos a cuatro ensayos diarios para encontrar una plataforma oculta durante 4 días de entrenamiento. Los valores se expresaron como la media ± EEM. *p<0,001 en comparación con simulado; #p<0,001 en comparación con Ap vehículo (N=6).

Figura 9. Efecto de un agonista del receptor ET ^b , IRL-1620, en presencia y ausencia de un antagonista del receptor ET^B, BQ788, en la tarea de la prueba del laberinto de agua. Tiempo empleado en cada cuadrante del ensayo de la sonda en ratas no diabéticas (A). Trayectorias representativas de cada grupo durante la prueba de la sonda en la tarea del laberinto de agua (B). Los valores se expresaron como la media ± EEM. *p<0,001 en comparación con simulado; ^#p<0,001 en comparación con Ap vehículo (N=6).

Figura 10. Efecto de un agonista del receptor ET ^b , IRL-1620, en presencia y ausencia de un antagonista del receptor ET^B, BQ788, sobre la latencia de escape (A) y la longitud de la trayectoria (B) en cada día de entrenamiento de la tarea del laberinto de agua en ratas diabéticas. Los animales fueron sometidos a cuatro ensayos diarios para encontrar una plataforma oculta durante 4 días de entrenamiento. Los valores se expresaron como la media ± EEM. *p<0,001 en comparación con simulado; ^#p<0,001 en comparación con Ap vehículo (N=6).

Figura 11. Efecto de un agonista del receptor ET ^b , IRL-1620, en presencia y ausencia de un antagonista del receptor ET ^b , BQ788, en la tarea de la prueba del laberinto de agua. Tiempo empleado en cada cuadrante del ensayo de la prueba en ratas diabéticas (A). Trayectorias representativas de cada grupo durante la prueba de la sonda en la tarea del laberinto de agua (B). Los valores se expresaron como la media ± EEM. *p<0,001 en comparación con simulado; ^#p<0,001 en comparación con Ap vehículo (N=6).

Figura 12: Cortes coronales de dos mm de cerebro teñidas con TTC para visualizar el área infartada 7 días después de la oclusión de la arteria cerebral media (el rojo indica tejido normal y el blanco indica tejido infartado). Se muestran cortes representativos de grupos. Se inyectó IRL-1620 (5 pg/kg, IV) o solución salina isotónica (1 ml/kg, IV) a las 2, 4, y 6 h después de la M^cAO. Se administró BQ-788 (1 mg/kg, IV) una vez 15 min antes de la primera inyección de IRL-1620 o vehículo.

Figura 13: Efecto del agonista del receptor ET ^b , IRL-1620, en presencia y ausencia de BQ788 en la supervivencia de 7 días de ratas sometidas a cirugía simulada u oclusión de la arteria cerebral media.

Figura 14: Afinidad de unión (K^d) y densidad de receptores (B^max) de receptores ET ^b en el hemisferio cerebral izquierdo y derecho en ratas Sprague Dawley (A) 24 horas y (B) 7 días después de la MCAO. Los valores se expresaron como la media ± EEM, N=4 cada grupo. No se observó ningún cambio significativo en K^d o B^max entre los hemisferios izquierdo y derecho en el grupo simulado (control) y en el grupo de ictus (MCAO).

Figura 15: Efecto del agonista del receptor ET ^b , IRL-1620 (3 dosis de 5 pg/kg, i.v., a las 2, 4 y 6 horas post­ isquemia), y del antagonista, BQ788 (1 mg/kg, i.v.), sobre la proteína ácida fibrilar (GFAP) tras la oclusión de la arteria cerebral media. A. Corte de cerebro isquémico de 30 pm de grosor representativo teñido para el receptor ET ^b (verde) y GFAP (rojo). Barra de escala = 2000 pm. El panel inferior muestra el número de astrocitos reactivos (células GFAP+) por 100 pm² en la corteza, el cuerpo estriado y la zona subventricular de ratas con la arteria cerebral media ocluida a las 24 h después del infarto. *P<0,001 frente a simulado. #P<0,0001 frente a MCAO vehículo. @P<0,01 frente a MCAO IRL-1620; y número de astrocitos reactivos (células GFAP+) por 100 pm² en la corteza, el cuerpo estriado y la zona subventricular de la arteria cerebral media ocluida 1 semana después del infarto. Los valores se expresan como la media ± EEM (n=5/grupo). *P<0,001 frente a simulado. Figura 16: Efecto del agonista del receptor ETB, IRL-1620 (tres dosis de 5 pg/kg, i.v., a las 2, 4 y 6 h post­ isquemia), y del antagonista, BQ788 (1 mg/kg, i.v.), sobre los núcleos neuronales (NeuN) después de la oclusión de la arteria cerebral media. (A) Imagen representativa de la corteza de un animal tratado con IRL-1620 1 semana después de la MCAO, teñida para el receptor ETB (verde) y NeuN (rojo). Barra de escala = 100 pm. (B) Imagen representativa del cuerpo estriado de un animal tratado con IRL-1620 1 semana después de la MCAO, teñida para el receptor ETB (verde) y NeuN (rojo). Barra de escala = 10 |jm. (C) Número de núcleos neuronales por 100 jm 2 en la corteza, el cuerpo estriado y la zona subventricular de ratas con la arteria cerebral media ocluida a las 24 h después del infarto. *P<0,05 frente a simulado. #P<0,01 frente a MCAO+vehículo. @P<0,0001 frente a MCAO+IRL-1620. (D) Número de núcleos neuronales por 100 jm 2 en la corteza, el cuerpo estriado y la zona subventricular de ratas con la arteria cerebral media ocluida 1 semana después del infarto. Los valores se expresan como la media ± EEM (n= 5/grupo). *P<0,0001 frente a simulado. #P<0,0001 frente a MCAO+vehículo. @P<0,0001 frente a MCAO+IRL-1620.

Figura 17: Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620 (3 dosis de 5 jg/kg, i.v., a las 2, 4 y 6 horas post­ isquemia), y del antagonista, BQ788 (1 mg/kg, i.v.), sobre las células en proliferación después de la oclusión de la arteria cerebral media. Imagen representativa de la corteza de un animal tratado con IRL-1620 1 semana después de MCAO que muestra un vaso sanguíneo cerebral, teñida para el receptor ET^b (verde) y BrdU (rojo). Barra de escala = 100 jm. El panel inferior muestra el número de células en proliferación (BrdU+) por 100 jm 2 en la corteza, el cuerpo estriado y la zona subventricular de ratas con la arteria cerebral media ocluida 1 semana después del infarto. Los valores se expresan como la media ± EEM (n=5/grupo). *P<0,01 frente a simulado. #P<0,0001 frente a MCAO vehículo. @P<0,0001 frente a MCAO IRL-1620.

Figura 18: Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620 (3 dosis de 5 jg/kg, i.v., a las 2, 4 y 6 horas post­ isquemia), y del antagonista, BQ788 (1 mg/kg, i.v.), sobre el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) después de la oclusión de la arteria cerebral media. A) Imágenes representativas de los vasos sanguíneos en la corteza de la rata a las 24 h después de la MCAO, teñidas para el receptor ET^b (verde) y VEGF (rojo). Filas: 1. Simulado; 2. MCAO vehículo; 3. MCAO IRL-1620; 4. MCAO BQ788 vehículo; 5. MCAO BQ788 IRL-1620. Barra de escala = 10 jm. B) Imágenes representativas de los vasos sanguíneos en la corteza de la rata 1 semana después de la MCA^o , teñidas para el receptor ET^b (verde) y VEGF (rojo). Las filas son iguales que en (A 24 h). Barra de escala = 10 jm.

Figura 19: Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620 (3 dosis de 5 jg/kg, i.v., a las 2, 4 y 6 horas post­ isquemia), y del antagonista, BQ788 (1 mg/kg, i.v.), sobre el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) después de la oclusión de la arteria cerebral media. El panel superior muestra el número de vasos VEGF+ por corte de cerebro de 30 jm de grosor de ratas con la arteria cerebral media ocluida a las 24 h después del infarto. *P<0,05 frente a simulado. #P<0,01 frente a MCAO vehículo. @P<0,05 frente a MCAO IRL-1620. El panel inferior muestra el número de vasos VEGF+ por corte de cerebro de 30 jm de grosor de ratas con la arteria cerebral media ocluida 1 semana después del infarto. Los valores se expresan como la media ± EEM (n=5/grupo). *P<0,01 frente a simulado. #P<0,01 frente a MCAO vehículo. @P<0,05 frente a MCAO IRL-1620.

Figura 20: Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620 (3 dosis de 5 jg/kg, i.v., a las 2, 4 y 6 horas post­ isquemia), sobre los niveles de proteína del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) después de la oclusión de la arteria cerebral media. A. Gráfica representativa de los niveles de proteína VEGF en el cerebro de rata 24 horas después de la MCAO con p-tubulina como un control de carga. Carril 1- simulado (LH), Carril 2-simulado (RH), Carril 3- MCAO Vehículo (LH), Carril 4- MCAO Vehículo (RH), Carril 5 - MCAO IRL-1620 (LH), Carril 6- MCAO IRL-1620 (RH). Lh = hemisferio izquierdo, RH = hemisferio derecho. B. Gráfica representativa de los niveles de proteína VEGF en el cerebro de rata 1 semana después de la MCAO con ptubulina como un control de carga, siendo la distribución del carril igual que en (A). C. Expresión de los niveles de proteína VEGF en el cerebro de rata 24 horas después de la MCAO. D. Expresión de los niveles de proteína VEGF en el cerebro de rata 1 semana después de la MCAO. Los valores se expresan como la media ± EEM (n=5/grupo). *P<0,001 frente a simulado. #P<0,01 frente a MCAO Vehículo.

Figura 21: Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620 (3 dosis de 5 jg/kg, i.v., a las 2, 4 y 6 horas post­ isquemia), y del antagonista, BQ788 (1 mg/kg, i.v.), sobre el factor de crecimiento nervioso (NGF) después de la oclusión de la arteria cerebral media. A. Imagen representativa de la corteza de un animal tratado con IRL-16201 semana después de la MCAO, teñida para el receptor ET^b (verde) y NGF (rojo). Barra de escala = 10 jm. (B) Número de células NGF+ por 100 jm 2 en la corteza, el cuerpo estriado y la zona subventricular de ratas con la arteria cerebral media ocluida 1 semana después del infarto. Los valores se expresan como la media ± EEM (n=5/grupo). #P<0,0001 frente a MCAO vehículo. @P<0,0001 frente a MCAO IRL-1620.

Figura 22: Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620 (3 dosis de 5 jg/kg, i.v., a las 2, 4 y 6 horas post­ isquemia), sobre los niveles de proteína del factor de crecimiento nervioso (NGF) después de la oclusión de la arteria cerebral media. A. Gráfica representativa de los niveles de proteína NGF en el cerebro de rata 24 horas después de la MCAO con p-tubulina como un control de carga. Carril 1- simulado (LH), Carril 2- simulado (RH), Carril 3- MCAO Vehículo (LH), Carril 4- MCAO Vehículo (RH), Carril 5 - MCAO IRL-1620 (LH), Carril 6-MCAO IRL-1620 (RH). LH = hemisferio izquierdo, RH = hemisferio derecho. B. Gráfica representativa de los niveles de proteína NGF en el cerebro de rata 1 semana después de la MCAO con p-tubulina como un control de carga, siendo la distribución del carril igual que en (A). C. Expresión de los niveles de proteína NGF en el cerebro de rata 24 horas después de la MCAO. D. Expresión de los niveles de proteína ⁿG^f en el cerebro de rata 1 semana después de la MCAO. Los valores se expresan como la media ± EEM (n=5/grupo). *P<0,01 frente a simulado.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación proporciona composiciones para tratar un trastorno neuropsiquiátrico. En el presente documento se divulga que un agonista del receptor de endotelina B funciona como agente neuroprotector y neurorregenerativo. Las composiciones de la divulgación generalmente se refieren a la administración de un agonista del receptor de endotelina B a un paciente que lo necesita para tratar un trastorno neuropsiquiátrico.

En consecuencia, en un aspecto la divulgación proporciona un agonista del receptor de la endotelina B para el tratamiento de un trastorno neuropsiquiátrico.

En algunas realizaciones, el agonista del receptor de endotelina B se selecciona del grupo que consiste en IRL-1620, BQ-3020, [Ala1,3,11,1 ]-Endotelina, Sarafotoxina S6c, endotelina-3 y una mezcla de los mismos.

En algunas realizaciones, la presente divulgación contempla que los agonistas del receptor ET^b tales como IRL-1620 (Figura 1) se pueden usar para tratar varios trastornos neuropsiquiátricos tales como enfermedades cerebrovasculares, ictus, isquemia cerebral, hemorragia cerebral, traumatismo cerebral, lesión cerebral, tumores cerebrales, esclerosis múltiple y enfermedades desmielinizantes, demencia, demencia vascular, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ataxias, enfermedad neuronal motora, esclerosis lateral amiotrófica, intoxicación farmacológica, alcoholismo, infecciones cerebrales crónicas, abscesos cerebrales, enfermedad de la sustancia blanca, enfermedad de Binswanger, enfermedad de Moyamoya, hipoxia perinatal, asfixia cerebral, lesión natal intracraneal, malformación congénita del cerebro, trastornos del estado de ánimo, y depresión. En algunas realizaciones, el agonista del receptor de endotelina B se coadministra con un agente adicional para tratar el trastorno neuropsiquiátrico. En algunas realizaciones, el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un antidepresivo, un agente antiinflamatorio, un estimulante del SNC, un neuroléptico y un agente antiproliferativo.

Agentes adicionales generales

Ejemplos de antidepresivos, estimulantes del SNC y agentes neurolépticos útiles en las composiciones de la divulgación incluyen, pero sin limitación, Abilify, Adapin, Adderall, Alepam, Alertec, Aloperidina, Alplax, Alprax, Alprazolam, Alviz, Alzolam, Amantadina, Ambien, Amisulprida, Amitriptilina, Amoxapina, Amfebutamona, Anafranil, Anatensol, Ansial, Ansiced, Antabus, Antabuse, Antideprin, Anxiron, Apo-Alpraz, Apo-Primidona, Apo-Sertral, Aponal, Apozepam, Aripiprazol, Aropax, Artane, Asendin, Asendis, Asentra, Ativan, Atomoxetina, Aurorix, Aventyl, Axoren, Baclofeno, Beneficat, Benperidol, Bimaran, Bioperidolo, Biston, Brotopon, Bespar, Bupropión, Buspar, Buspimen, Buspinol, Buspirona, Buspisal, Cabaser, Cabergolina, Calepsin, Carbonato de calcio, Carbimida de calcio, Calmax, Carbamazepina, Carbatrol, Carbolith, Celexa, Chloraldurat, Hidrato de cloral, Clordiazepóxido, Clorpromazina, Cibalith-S, Cipralex, Citalopram, Clomipramina, Clonazepam, Clozapina, Clozaril, Concerta, Constan, Convulex, Cylert, Cymbalta, Dapotum, Daquiran, Daytrana, Defanyl, Dalmane, Damixane, Demolox, Depad, Depakene, Depakote, Depixol, Desyrel, Dostinex, Dextroanfetamina, Dexedrina, Diazepam, Didrex, Divalproex, Dogmatil, Dolofina, Droperidol, Desoxyn, Edronax, Effectin, Effexor (Efexor), Eglonyl, Einalon S, Elavil, Elontril, Endep, Epanutin, Epitol, Equetro, Escitalopram, Eskalith, Eskazinyl, Eskazine, Etrafon, Eukystol, Eunerpan, Faverin, Fazaclo, Fevarin, Finlepsin, Fludecate, Flunanthate, Fluoxetina, Flufenazina, Flurazepam, Fluspirileno, Fluvoxamina, Focalin, Gabapentina, Geodon, Gladem, Glianimon, Guanfacina, Halcion, Halomonth, Haldol, Haloperidol, Halosten, Imap, Imipramina, Imovane, Janimine, Jatroneural, Kalma, Keselan, Klonopin, Lamotrigina, Largactil, Levomepromazina, Levoprome, Leponex, Lexapro, Libotryp Libritabs, Librium, Linton, Liskantin, Lithane, Litio, Lithizine, Lithobid, Lithonate, Lithotabs, Lorazepam, Loxapac, Loxapina, Loxitane, Ludiomil, Lunesta, Lustral, Luvox, Lyrica, Lyogen, Manegan, Manerix, Maprotilina, Mellaril, Melleretten, Melleril, Melneurin, Melperona, Meresa, Mesoridazina, Metadate, Metanfetamina, Metotrimeprazina, Methylin, Metilfenidato, Minitran, Mirapex, Mirapexine, Moclobemida, Modafinilo, Modalina, Modecate, Moditen, Molipaxin, Moxadil, Murelax, Myidone, Mylepsinum, Mysoline, Nardil, Narol, Navane, Nefazodona, Neoperidol, Neurontin, Nipolept, Norebox, Normison, Norpramine, Nortriptilina, Novodorm, Nitrazepam, Olanzapina, Omca, Oprymea, Orap, Oxazepam, Pamelor, Parnate, Paroxetina, Paxil, Peluces, Pemolina, Pergolida, Permax, Permitil, Perfenazina, Pertofrane, Fenelzina, Fenitoína, Pimozida, Piportil, Pipotiazina, Pragmarel, Pramipexol, Pregabalina, Primidona, Prolift, Prolixin, Prometazina, Protipendilo, Protriptilina, Provigil, Prozac, Prysoline, Psymion, Quetiapina, Ralozam, Reboxetina, Redeptin, Resimatil, Restoril, Restyl, Rotrimina, Riluzol, Risperdal, Risperidona, Rispolept, Ritalin, Rivotril, Rubifen, Rozerem, Sediten, Seduxen, Selecten, Serax, Serenace, Serepax, Serenase, Serentil, Seresta, Serlain, Serlift, Seroquel, Seroxat, Sertan, Sertralina, Serzone, Sevinol, Sideril, Sifrol, Sigaperidol, Sinequan, Sinqualone, Sinquan, Sirtal, Solanax, Solian, Solvex, Songar, Stazepin, Stelazine, Stilnox, Stimuloton, Strattera, Sulpiride, Sulpiride Ratiopharm, Sulpiride Neurazpharm, Surmontil, Symbyax, Symmetrel, Tafil, Tavor, Taxagon, Tegretol, Telesmin, Temazepam, Temesta, Temposil, Terfluzine, Tioridazina, Tiotixeno, Thombran, Thorazine, Timonil, activador del plasminógeno tisular (tPA), Tofranil, Tradon, Tramadol, Tramal, Trancin, Tranax, Trankimazin, Tranquinal, Tranilcipromina, Trazalon, Trazodona, Trazonil, Trialodine, Trevilor, Triazolam, Trifluoperazina, Trihexane, Trihexifenidilo, Trilafon, Trimipramina, Triptil, Trittico, Troxal, Tryptanol, Tryptomer, Ultram, Valium, Valproato, Ácido valproico, Valrelease, Vasiprax, Venlafaxina, Vestra, Vigicer, Vivactil, Wellbutrin, Xanax, Xanor, Xydep, Zaleplon, Zamhexal, Zeldox, Zimovane, Zispin, Ziprasidona, Zolarem, Zoldac, Zoloft, Zolpidem, Zonalon, Zopiclona, Zotepina, Zydis, y Zyprexa.

Agentes antiinflamatorios

En la presente invención se puede utilizar cualquier agente que tenga efectos antiinflamatorios. El agente antiinflamatorio puede ser un agente antiinflamatorio esteroideo, un agente antiinflamatorio no esteroideo o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los agentes antiinflamatorios incluyen, pero sin limitación, alclofenaco, alclometasona dipropionato, acetónido de algestona, alfa amilasa, amcinafal, amcinafida, amfenaco sódico, clorhidrato de amiprilosa, anakinra, anirolaco, anitrazafeno, apazona, balsalazida disódica, bendazaco, benoxaprofeno, clorhidrato de bencidamina, bromelinas, broperamol, budesonida, carprofeno, cicloprofeno, cintazona, cliprofeno, propionato de clobetasol, butirato de clobetasona, clopiraco, propionato de cloticasona, acetato de cormetasona, cortodoxona, deflazacort, desonida, desoximetasona, dipropionato de dexametasona, diclofenaco potásico, diclofenaco sódico, diacetato de diflorasona, diflumidona sódica, diflunisal, difluprednato, diftalona, sulfóxido de dimetilo, drocinonida, endrisona, enlimomab, enolicam sódico, epirizol, etodolaco, etofenamato, felbinaco, fenamol, fenbufeno, fenclofenaco, fencloraco, fendosal, fenpipalona, fentiazaco, flazalona, fluazacort, ácido flufenámico, flumizol, acetato de flunisolida, flunixina, flunixina meglumina, fluocortina butilo, acetato de fluorometolona, flucuazona, flurbiprofeno, fluretofeno, propionato de fluticasona, furaprofeno, furobufeno, halcinonida, propionato de halobetasol, acetato de halopredona, ibufenaco, ibuprofeno, ibuprofeno de aluminio, ibuprofeno piconol, ilonidap, indometacina, indometacina sódica, indoprofeno, indoxol, intrazol, acetato de isoflupredona, isoxepaco, isoxicam, ketoprofeno, clorhidrato de lofemizol, lomoxicam, etabonato de loteprednol, meclofenamato sódico, ácido meclofenámico, dibutirato de meclorisona, ácido mefenámico, mesalamina, meseclazona, suleptanato de metilprednisolona, morniflumato, nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, naproxol, nimazona, olsalazina sódica, orgoteína, orpanoxina, oxaprozina, oxifenbutazona, clorhidrato de paranilina, pentosan polisulfato sódico, glicerato sódico de fenbutazona, pirfenidona, piroxicam, cinamato de piroxicam, piroxicam olamina, pirprofeno, prednazato, prifelona, ácido prodólico, procuazona, proxazol, citrato de proxazol, rimexolona, romazarit, salcolex, salnacedina, salsalato, cloruro de sanguinario, seclazona, sermetacina, sudoxicam, sulindaco, suprofeno, talmetacina, talniflumato, talosalato, tebufelona, tenidap, tenidap sódico, tenoxicam, tesicam, tesimida, tetridamina, tiopinaco, pivalato de tixocortol, tolmetina, tolmetina sódica, triclonida, triflumidato, zidometacina, zomepiraco sódico, aspirina (ácido acetilsalicílico), ácido salicílico, corticoesteroides, glucocorticoides, tacrolimus, pimecorlimus, profármacos de los mismos, cofármacos de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Agentes anti-proliferativos

En la presente invención se puede utilizar cualquier agente que tenga efectos antiproliferativos. El agente antiproliferativo puede ser un agente proteínico natural tal como una citotoxina o una molécula sintética. En algunas realizaciones, los agentes activos incluyen sustancias antiproliferativas tales como actinomicina D, o derivados y análogos de la misma (los sinónimos de actinomicina D incluyen dactinomicina, actinomicina IV, actinomicina I1, actinomicina X1, y actinomicina CO, todos los taxoides, tales como taxoles, docetaxel, y paclitaxel, derivados de paclitaxel, todos los fármacos olimus, tales como antibióticos macrólidos, rapamicina, everolimus, derivados estructurales y análogos funcionales de rapamicina, derivados estructurales y análogos funcionales de everolimus, inhibidores de mTOR mediados por FKBP-12, biolimus, profármacos de los mismos, cofármacos de los mismos, y combinaciones de los mismos). Derivados de rapamicina representativos incluyen 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina, o 40-O-tetrazol-rapamicina, 40-epi-(N-1-tetrazolil)-rapamicina (ABT-578 fabricado por Abbot Laboratories, Abbot Park, I11.), profármacos de los mismos, cofármacos de los mismos, y combinaciones de los mismos.

La presente divulgación contempla que en realizaciones adicionales, el trastorno neuropsiquiátrico se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad cerebrovascular, ictus, isquemia cerebral, hemorragia cerebral, traumatismo cerebral, lesión cerebral, un tumor cerebral, esclerosis múltiple y enfermedades desmielinizantes, demencia, demencia vascular, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ataxia, enfermedad neuronal motora, esclerosis lateral amiotrófica, intoxicación farmacológica, alcoholismo, infecciones cerebrales crónicas, abscesos cerebrales, enfermedad de la sustancia blanca, enfermedad de Binswanger, enfermedad de Moyamoya, hipoxia perinatal, asfixia cerebral, lesión natal intracraneal, malformación congénita del cerebro, trastornos del estado de ánimo, y depresión.

De acuerdo con la divulgación, el agonista del receptor de endotelina B se puede administrar a una dosis que varía de 0,0001 a 0,5 mg/kg. En realizaciones adicionales, el agonista del receptor de endotelina B se administra a una dosis que varía de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,5 mg/kg, o de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,4 mg/kg, o de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,3 mg/kg, o de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,2 mg/kg, o de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,1 mg/kg, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,5 mg/kg, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,4 mg/kg, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,3 mg/kg, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,2 mg/kg, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,4 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,3 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,2 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 mg/kg, o de aproximadamente 0,0005 a aproximadamente 0,5 mg/kg, o de aproximadamente 0,0005 a aproximadamente 0,4 mg/kg, o de aproximadamente 0,0005 a aproximadamente 0,3 mg/kg, o de aproximadamente 0,0005 a aproximadamente 0,2 mg/kg, o de aproximadamente 0,0005 a aproximadamente 0,1 mg/kg. En realizaciones adicionales, el agonista del receptor de endotelina B se administra a una dosis de al menos aproximadamente 0,0001 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,0002 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,0005 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,001 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,002 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,005 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,007 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,01 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,02 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,03 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,04 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,05 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,06 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,07 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,08 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,09 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,2 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,3 mg/kg, o al menos aproximadamente 0,4 mg/kg. En todavía otras realizaciones, el agonista del receptor de endotelina B se administra a una dosis de menos de aproximadamente 0,0001 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,0002 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,0005 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,001 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,002 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,005 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,007 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,01 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,02 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,03 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,04 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,05 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,06 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,07 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,08 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,09 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,1 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,2 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,3 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,4 mg/kg, o menos de aproximadamente 0,5 mg/kg.

El agonista del receptor de endotelina B, en diversas realizaciones, se administra a un paciente repetidamente a intervalos de 1 a 6 horas. En algunas realizaciones, el agonista del receptor de endotelina B se administra al paciente cada 1 a 5 horas, o cada 1 a 4 horas, o cada 1 a 2 horas, o cada hora, o cada 2 horas, o cada 3 horas, o cada 4 horas, o cada 5 horas, o cada 6 horas. En realizaciones adicionales, el agonista del receptor de endotelina B se administra al paciente cada dos a cinco días, o cada tres a cinco días, o cada dos días, o cada tres días, o cada cuatro días, o cada cinco días.

Ontogenia del receptor de endotelina B en el cerebro de rata postnatal

Se ha descrito una reducción de la expresión de receptores ET^b en el cerebro de crías de rata en el día 28 postnatal, medida mediante la técnica de inmunotransferencia(Briyal et al., 2012b). Para determinar la ubicación de estos receptores y su posible correlación con los factores de crecimiento vascular y neural en el cerebro en desarrollo, los cerebros de crías de rata se marcaron por inmunofluorescencia los días 1, 7, 14 y 28 postnatales con anticuerpos para los receptores ET^b, VEGF y NGF. La intensidad de la tinción del receptor ET^b en la vasculatura fue significativamente más alta el día 14 en comparación con el día 1 y el día 7 de edad postnatal (Figura 2). Por el contrario, la intensidad de tinción del ET^b en la corteza y las zonas subventriculares del cerebro de rata en desarrollo disminuyó significativamente el día 14 de la edad postnatal en comparación con el día 1 y el día 7 (P<0,0001; Figura 3). Se observó que la intensidad de ET^b era similar a la edad postnatal de 14 y 28 días. Estos resultados indican que efectivamente existe una disminución en la expresión de los receptores ET^b dentro del tejido neural del cerebro de rata en desarrollo, pero no en la neurovasculatura.

Ontogenia del factor de crecimiento endotelial vascular en el cerebro de rata postnatal

El VEGF en la vasculatura del cerebro de rata postnatal se evaluó el día 1, 7, 14 y 28 de edad postnatal mediante marcaje inmunofluorescente. Como se ilustra en la figura 2, la intensidad de la tinción del VEGF en la neurovasculatura aumentó de manera constante desde los días 1 a 14 postnatales. Análogamente, el número de vasos VEGF positivo por corte de cerebro de 20 pm de grosor aumentó significativamente (P<0,0001) de 2,22 ± 0,36 el día 1 a 5,69 ± 0,74 el día 14 de edad postnatal (Figura 2). Aunque tanto la intensidad como la expresión de VEGF y ET^b dentro de la vasculatura cerebral del cerebro de rata en desarrollo aumentó con la edad, no hubo una correlación significativa entre las dos (r2 = 0,8279; P=0,0901).

Ontogenia del factor de crecimiento nervioso en el cerebro de rata postnatal

Se utilizó marcaje inmunofluorescente para determinar la expresión y distribución de NGF en el cerebro de rata postnatal en los días 1, 7, 14 y 28. La intensidad de la tinción para el NGF en la corteza del cerebro de rata en desarrollo disminuyó significativamente desde el día 1 hasta el día 7 (P<0,001) y nuevamente desde el día 7 hasta el día 14 (P<0,01) de edad postnatal. No hubo diferencia significativa en la intensidad del NGF desde el día 14 hasta el día 28 postnatal (Figura 3). La intensidad del NGF dentro de la zona subventricular del cerebro de rata postnatal disminuyó entre los días 7 y 14 (P <0,01), sin disminución adicional entre los días 14 y 28 (Figura 3) de la edad postnatal. Curiosamente, el número medio de células que se tiñeron positivas para NGF no se alteró significativamente durante el curso del experimento ni en la corteza ni en la SVZ. Había, sin embargo, una correlación significativa entre una disminución de los receptores ET^b y NGF en la corteza del cerebro de rata en desarrollo con la edad (r2=0,9742; P=0,0130). Estos resultados indican que, a medida que madura el cerebro de la rata, la expresión general de NGF disminuye. Esta disminución puede estar correlacionada con la reducción de receptores ET^b dentro del tejido neuronal.

Efecto de IRL-1620 sobre los receptores de endotelina B en el cerebro de rata postnatal

La administración del agonista del receptor ET^b, IRL-1620, el día 21 postnatal tuvo como resultado un aumento significativo de los receptores ET^b en el cerebro de rata de 28 días en comparación con el grupo de control. En general, la expresión de proteínas de los receptores ET^b, medida usando la técnica de la inmunotransferencia, aumentó en los animales que habían recibido IRL-1620 (Figura 6). Tras el marcaje inmunofluorescente de los cortes de cerebro, se observó que la intensidad de tinción del receptor ET^b fue significativamente mayor tanto en la vasculatura cerebral (Figura 2) como en la corteza (Figura 3) de los animales tratados con IRL-1620 en comparación con el control (P<0,05). Estos resultados sugieren que la estimulación selectiva de los receptores ET^b durante el desarrollo neonatal puede tener como resultado una regulación positiva de estos receptores.

Efecto de IRL-1620 sobre el factor de crecimiento endotelial vascular en el cerebro de rata postnatal Como se observa en la Figura 2, el VEGF aumenta en la vasculatura cerebral durante todo el desarrollo en ratas. La estimulación selectiva de los receptores ET^b que usan el agonista IRL-1620 conduce a un aumento adicional tanto en la intensidad de la tinción de VEGF como en el número de vasos VEGF positivo (P<0,05; Figuras 4) dentro del cerebro de rata postnatal en comparación con animales de control de la misma edad. Estos resultados se confirmaron usando la técnica de inmunotransferencia que muestra que la expresión global de VEGF mejora significativamente dentro de los cerebros postnatales de ratas tratadas con IRL-1620 (P<0,05); Figura 6). Estos hallazgos sugieren que la estimulación selectiva de los receptores ET^B durante el desarrollo potencia la angiogénesis cerebrovascular.

Efecto de IRL-1620 sobre el factor de crecimiento nervioso en el cerebro de rata postnatal

El marcaje inmunofluorescente de NGF disminuye significativamente el día 14 postnatal en el cerebro de rata. La administración del agonista del receptor ET^b, IRL-1620, el día 21 postnatal no alteró ni la intensidad de la tinción de NGF ni el número de células NGF positivo dentro de la corteza o las zonas subventriculares de ratas en comparación con el control (Figura 5). Análogamente, la expresión global de NGF dentro del cerebro de rata postnatal medida mediante la técnica de inmunotransferencia fue comparable tanto en los grupos de control como en los tratados (Figura 6). La estimulación selectiva del receptor ET^b no parece tener ningún efecto significativo sobre los niveles de NGF dentro del cerebro de la rata durante el desarrollo postnatal.

Procedimientos experimentales

Animales

Se enjaularon ratas hembras Sprague-Dawley (Harlan, Indianapolis, IN) preñadas cronometradas individualmente en una habitación con temperatura ambiente controlada (23 ± 1 °C), humedad (50 ± 10 %) y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (6:00 am - 6:00 pm). La comida y el agua estaban disponibles a voluntad. Todo el cuidado y uso de animales para los procedimientos fue aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de la Universidad Midwestern. Para evitar variaciones debidas a cambios hormonales, solo se separaron y utilizaron para este estudio las crías macho. Las crías se sacrificaron mediante decapitación los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. Los cerebros se extrajeron asépticamente y se procesaron para el marcaje inmunofluorescente o el análisis de inmunotransferencia de los receptores ET^B, VEGF y NGF.

Diseño del estudio y administración del agente

Después de 21 días de gestación, nacieron 70 machos y 65 hembras de 10 ratas hembras preñadas. Se seleccionaron al azar 30 crías macho para el Estudio I y se dividieron en 4 grupos de la siguiente manera: Grupo 1 = crías macho sacrificadas el día 1 postnatal (N = 10); Grupo 2 = crías macho sacrificadas el día 7 postnatal (N = 10); Grupo 3 = crías macho sacrificadas el día 14 postnatal (N = 5); Grupo 4 = crías macho sacrificadas el día 28 postnatal (N = 5). Adicionalmente se seleccionaron al azar 20 crías macho para el Estudio II y se dividieron en 2 grupos: Control (N=10) y tratadas con IRL-1620 (N=10). Las crías del estudio II recibieron 3 dosis de solución salina isotónica (1 ml/kg) o de agonista del receptor ET^b IRL-1620 (5 pg/kg; American Peptide Co, Inc., Sunnyvale, CA) el día 21 postnatal. Las dosis se administraron por vía intravenosa a intervalos de 2 horas. Todas las crías fueron pesadas y evaluadas en cuanto a características de desarrollo y comportamiento en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. Las características de desarrollo y comportamiento incluyeron comportamiento activo frente a lento, aspecto saludable frente a pérdida de pelo, lamido, aseo, comportamiento agresivo, defecación, micción y sacudidas corporales.

Marcaje inmunofluorescente

Se utilizaron anticuerpos marcados con inmunofluorescencia para determinar la expresión de los receptores ET^B, VEGF y NGF en el cerebro de rata en desarrollo. Se sacrificaron crías de rata macho mediante decapitación y se extrajeron los cerebros en los días 1, 7, 14 y 28 postnatales. Los cerebros se lavaron en solución salina isotónica y se transfirieron a una solución de paraformaldehído (PFA) al 4 %/tampón NaPO4 durante 2 horas para fijar el tejido, seguido de suspensión en una solución de sacarosa al 20 %/PFA al 4 % durante 48 horas a 4 °C. A continuación, se cortaron los cerebros en cortes coronales de 20 |jm de grosor a -30 °C usando un criostato (Microtome HM 505 E; Walldorf, Alemania). Los cortes se procesaron para tinción inmunofluorescente como describe Loo, et al. (Loo et al., 2002), con modificaciones menores. El anticuerpo primario para los receptores ET^b fue un anticuerpo anti-receptor ET^b obtenido en oveja contra el péptido carboxi terminal del receptor ET^b de rata (1:200; ab50658; Abcam, Cambridge, MA). La determinación de los marcadores angiogénicos y neurogénicos se realizó usando anticuerpos contra VEGF (anti-VEGF; 1:500; ab46154; Abcam) y el factor de crecimiento nervioso (anti-NGF; ab6199; Abcam). Los cortes se lavaron en PBS y a continuación se bloquearon con suero al 10 % v/v en PBS que contenía Triton X-100 al 0,3 % durante 1 h. A continuación, los cortes se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C, se lavaron de nuevo con PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado durante 2 h a temperatura ambiente. Se realizó secuencialmente un marcaje doble para la co-localización. Los cortes se aclararon con PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio con Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). La fluorescencia se detectó usando un microscopio fluorescente invertido (Nikon Eclipse TiE, Melville, NY). Todas las imágenes para el análisis se tomaron con la misma exposición (300 mseg para VEGF y NGF; 800 mseg para ET^b) y objetivo (Plan Fluor 10x Ph1DL) con una adquisición ND multicanal utilizando el software de imágenes NIS Elements BR (Nikon Instruments, Inc., Melville, NY).

Análisis inmunofluorescente

Los análisis de NGF se realizaron específicamente en la corteza y SVZ del cerebro de rata. Superponiendo una cuadrícula de cuadrados de 100 x 100 jm en cada imagen, se determinó el número de células que se tiñeron positivamente para NGF en seis cortes seleccionados al azar, no congruentes, de 100 jm 2 de grosor por corte de cerebro en cada área. Se contaron todas las células que caían al menos en un 50 % dentro del área de 100 jm 2. Para la evaluación de la angiogénesis, se determinó el número total de vasos sanguíneos VEGF positivo por corte de cerebro. La intensidad de la fluorescencia para cada marcador se midió usando las imágenes inalteradas con el software de imágenes NIS Elements BR (Nikon Instruments, Inc., Melville, NY).

Inmunotransferencia

Los niveles de proteína de VEGF, NGF y receptores ET^b en el cerebro de rata postnatal de los animales del estudio II se estimaron usando la técnica de inmunotransferencia. Se decapitaron los animales y se extrajeron los cerebros el día 28 postnatal, que es 7 días después de la administración de solución salina o agonista del receptor ET^b, IRL-1620. El tejido se homogeneizó en tampón de lisis RIPA 10x (p/v) y se determinó la concentración de proteína de acuerdo con el método de Lowry, utilizando albúmina de suero bovino como patrón (Lowry et al., 1951). La proteína (60 jg ) se desnaturalizó en tampón de muestra Laemmli y se resolvió en SDS-PAGE al 10 %, y a continuación se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Después del bloqueo, las membranas se incubaron con anti-VEGF policlonal de conejo (1:1000; Abcam, Cambridge, M^a ), anti-NGF (1:500; Abcam, Cambridge, MA), o anticuerpos anti-ET^b (1:1000; Sigma-Aldrich) durante la noche a 4 °C, seguido de incubación durante 1,5 horas con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:2000; Cell Signaling Technology, Inc., MA) a temperatura ambiente. Como controles de carga se usaron p-tubulina (1:2000; Cell Signaling Technology, Inc. MA) o p-actina (1:10000; Sigma-Aldrich). Las proteínas marcadas se visualizaron con sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Thermo Scientific) usando el sistema de imágenes Kodak Gel Logic 1500 (Carestream Health Inc., New Haven, CT). La expresión de las proteínas se analizó usando el software Image J (NIH).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de la potencia usando el GraphPad Instat-2.00. La potencia se estableció en 80 % (beta=0,8) y el nivel de significancia (alfa) usado fue 0,05. El análisis de la potencia indicó que un tamaño de muestra de 5 por grupo era suficiente para alcanzar la potencia deseada. Los datos se presentan como media ± E.E.M. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de comparación post-hoc de Tukey para la comparación entre grupos. Se utilizó la prueba t para datos no apareados para comparar los grupos de control del día 28 postnatal frente a los de IRL-1620. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó usando GraphPad Prism 6.02 (GraphPad, San Diego, CA).

El objetivo del presente estudio era determinar la ontogenia de los receptores ET^b, VEGF y NGF en el cerebro de rata postnatal, así como para investigar si la estimulación selectiva de los receptores eT^b durante el desarrollo postnatal tendría como resultado o no cambios en la expresión de los receptores o de los factores de crecimiento. Como confirmación de estudios previos (Briyal et al., 2012b), se descubrió que los receptores ET^b parecían reducirse en el tejido neuronal con la edad postnatal. Curiosamente, tanto la intensidad del receptor ET^b como de VEGF aumentaban dentro de la vasculatura cerebral desde el día 1 hasta el día 14 postnatal. El NGF, por otro lado, se redujo simultáneamente con los receptores ET^B en la corteza y la SVZ del cerebro de rata desde el día 1 hasta el día 14 postnatal. La estimulación selectiva de los receptores ET^b mediante IRL-1620 intravenoso el día 21 postnatal condujo a un aumento significativo de los receptores ET^B y de VEGF, pero no de NGF. Estos resultados sugieren que, aunque la ontogenia de los receptores ET^b puede estar relacionada tanto con el factor de crecimiento vascular como neuronal en el cerebro en desarrollo, la estimulación de los receptores ET^b durante el desarrollo postnatal ejerce más influencia sobre la angiogénesis que la neurogénesis.

Si bien el modelo de rata se usa comúnmente en estudios ontológicos, es importante reconocer que la gestación y el desarrollo, particularmente en lo que respecta al cerebro, difiere entre roedores y humanos. Se ha descrito que 16,7 días de rata equivalen a 1 año humano (Quinn, 2005). La extrapolación de esta información a la línea cronológica del presente estudio proporciona la siguiente información: día postnatal 1 = 21 días humanos; día postnatal 7 = 5 meses humanos; día postnatal 14 = 10 meses humanos; y día 28 postnatal = 20 meses humanos. Esto es significativo ya que el rápido crecimiento del cerebro del ser humano comienza al final del segundo trimestre, alcanza su punto máximo al nacer y luego disminuye durante los próximos años. Las ratas, sin embargo, con un período de gestación de solo 21 días, experimentan el aumento más rápido en el crecimiento y desarrollo del cerebro dentro de los primeros 10 días postnatales (Gil-Mohapel et al., 2010). Este período es aproximadamente equivalente al tercer trimestre del desarrollo del cerebro humano.

El período de tiempo evaluado por el presente estudio, días postnatales de la rata 1 a 28, coincide con los primeros 2 años de desarrollo equivalente del cerebro humano. Como se esperaba, los niveles más altos de factor de crecimiento neuronal junto con los receptores ET^b se observaban en la corteza y la ZVS el primer día después del nacimiento. Estos niveles disminuyeron significativamente con el aumento de la madurez cerebral desde el día 1 hasta el día 14. No se observaron cambios significativos entre los días 14 y 28. Se ha descrito una reducción de la expresión de proteína del receptor ET^b con el cerebro de rata completo en día 21 postnatal (Briyal et al., 2012b). Los presentes datos arrojan luz sobre trabajos anteriores de niveles bajos de progenitores neuronales y aumento de alteraciones del SNC en crías de rata deficientes de ET^b (Ehrenreich et al., 2000; Riechers et al., 2004; Vidovic et al., 2008). Se encontró una correlación significativa entre las disminuciones en la intensidad de la tinción del NGF y del receptor ET^b en la corteza cerebral del cerebro en desarrollo; sin embargo, cuando IRL-1620 se administraba el día 21 postnatal, para estimular los receptores ET^b, y esta correlación se perdió y un aumento en la tinción del receptor ET^b no se acompañó de un aumento de la tinción con NGF en la corteza cerebral. Es posible que exista un mecanismo regulador que inicie una disminución en la tinción del receptor ET^B y del NGF a medida que el cerebro madura y este mecanismo regulador no permite que IRL-1620 produzca ningún aumento de la tinción del receptor ET^B y NGF farmacológicamente inducido del cerebro que está cerca de la madurez.

La estimulación del receptor ET^b, por lo tanto, no parece aumentar la neurogénesis durante el desarrollo tardío del SNC, aunque se ha demostrado que mejora este proceso durante los procesos de reparación neurovascular en adultos (Leonard and Gulati, 2013), lo que indica una pérdida del mecanismo regulador después de la isquemia cerebral. La estimulación selectiva de los receptores eT^b, sin embargo, aumentó la expresión general de ET^b en todo el cerebro, medido mediante la técnica de inmunotransferencia, así como la intensidad de la tinción del receptor ET^b de la vasculatura cerebral del cerebro de rata en desarrollo, lo que sugiere que tal estimulación potencia la angiogénesis durante el período postnatal tardío.

En general, tanto la intensidad de VEGF como de ET^b en la vasculatura cerebral aumentó durante todo el período estudiado. El VEGF es un potente factor angiogénico esencial para la vascularización, desarrollo y reparación del SNC. Investigaciones anteriores han indicado que el VEGF se restringe principalmente a las neuronas corticales en las primeras etapas del desarrollo, pero luego cambia a células gliales maduras alrededor de los vasos sanguíneos a medida que el lecho vascular comienza a estabilizarse (Ogunshola et al., 2000). Si bien la expresión de VEGF dentro del tejido neuronal no se determinó específicamente, los resultados demuestran un aumento de VEGF alrededor de la vasculatura a medida que se desarrolla el cerebro. En las primeras etapas del desarrollo del SNC, cuando los niveles de NGF son altos, el VEGF puede servir como promotor de la neurogénesis, la migración neuronal y la neuroprotección (Rosenstein et al., 2010). Se observan efectos similares en el cerebro adulto después de una lesión isquémica, con niveles elevados de VEGF que promueven la reparación cerebrovascular (Gora-Kupilas and Josko, 2005; Nowacka and Obuchowicz, 2012). En efecto, estudios previos han demostrado que la estimulación selectiva de receptores ET^b después de la isquemia cerebral permanente conduce a un aumento tanto de la expresión de VEGF como de ET^b, coincidente con la neuroprotección y la reparación cerebrovascular (Leonard and Gulati, 2013). En el presente estudio, la estimulación selectiva de los receptores ET^B en el día 21 postnatal dio como resultado aumentos de la expresión de VEGF y de ET^b tanto en la vasculatura cerebral como en todo el cerebro. Estos resultados sirven tanto para confirmar la relación entre los receptores ET^B y VEGF como para destacar su importancia en el cerebro en desarrollo.

El daño cerebral por hipoxia-isquemia durante el período neonatal es uno de los principales factores de la disfunción cerebral (Li et al., 2008). Los bebés prematuros, en particular, a menudo experimentan episodios de hipoxiaisquemia que pueden conducir a un crecimiento y desarrollo cortical reducido. Estas deficiencias pueden continuar durante la infancia y la adolescencia y pueden causar disfunción dentro del microcircuito neuronal que conduce a epilepsia, trastornos del neurodesarrollo y enfermedades psiquiátricas (Malik et al., 2013). Se sabe que los episodios de hipoxia-isquemia dentro del cerebro aumentan el factor de transcripción 1 inducible por hipoxia, que a su vez regula al alza el VEGF (Trollmann et al., 2008). Se ha demostrado que la estimulación selectiva del receptor ET^b regula al alza tanto los receptores ET^B como VEGF en los cerebros tanto de recién nacidos normales como de ratas adultas sometidas a isquemia cerebral. Es posible que el tratamiento temprano con un receptor selectivo de ET^B pueda aumentar el VEGF y la neuroprotección, lo que permite que el cerebro de los bebés que sufren daño hipóxico repare este daño neuronal.

El presente estudio indica que la estimulación selectiva de los receptores ET^b aumenta el VEGF en el cerebro de la rata en desarrollo. Si bien no se observó una regulación al alza significativa similar del NGF en el presente estudio, se observó una correlación en la ontogenia de los receptores ET^b y NGF en la corteza y la SVZ de crías de rata postnatales. Parece que tanto los receptores ET^b como NGF son importantes en la fase inicial del desarrollo del SNC. Como los estudios han demostrado que la estimulación selectiva del receptor ET^b es capaz de potenciar la reparación cerebrovascular en el cerebro adulto después de la isquemia, sería interesante determinar si un tratamiento similar podría mejorar significativamente los mecanismos de reparación dentro del cerebro en desarrollo sometido a isquemia.

Estudios en un modelo animal de la enfermedad de Alzheimer

Se permitió que ratas macho Sprague-Dawley (Harlan, Indianapolis, IN) que pesaban 280-310 g se aclimataran durante al menos 4 días antes de su uso. Los animales se alojaron en una habitación con temperatura controlada (23±1 °C), humedad (50±10 %), y luz (6:00 A.M. a 6:00 P.M.). La comida y el agua estaban disponibles de forma continua. El cuidado y uso de animales para los procedimientos experimentales fue aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de la Universidad de Midwestern. Todos los procedimientos anestésicos y quirúrgicos cumplieron con las directrices establecidas por el IACUC de la Universidad de Midwestern.

Agentes y diseño experimental

Se disolvieron amiloide-p (1-40) (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, EE.UU.), IRL-1620 [N-Sucinil-[Glu9, Ala11,15] endotelina 1] (American Peptide Co, Inc., Sunnyvale, CA, EE.UU.) y BQ788 (American Peptide Co, Inc., Sunnyvale, Ca, EE.UU.) en solución salina estéril y todas las soluciones se prepararon en el momento de las inyecciones. Se administró ketamina (Butler Animal Health Supply, Dublín, OH, EE.UU.) a una dosis de 100mg/kg, por vía intraperitoneal (i.p.) y xilazina (Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA, EE.UU.) a una dosis de 10 mg/kg, i.p. Las ratas se anestesiaron con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) y se canuló un ventrículo cerebral lateral colocando a la rata en un instrumento estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, California, EE.UU.) y fijando la cánula (coordenadas: 1,0 mm lateral, 1,5 mm caudal a bregma y 4,0 mm profundidad desde el hueso). La cánula (Plastics One, Roanoke, VA, EE.UU.) se ancló con acrílico dental a tres tornillos colocados en el cráneo. Se permitió que los animales se recuperaran de la cirugía durante al menos siete días. Después de 7 días, las ratas se trataron con vehículo, Ap (1-40), agonista y/o antagonista del receptor ET^b en los ventrículos cerebrales laterales usando la cánula implantada. El vehículo, Ap o el agonista y el antagonista del receptor ET^b se inyectaron en un volumen de 5 |jl durante un período de 5 minutos. Se utilizó Ap (1-40) porque es altamente soluble en comparación con Ap (1­ 42) e induce disfunción endotelial de los vasos sanguíneos cerebrales y sistémicos además del déficit de memoria (Nitta et al., 1994; Niwa et al., 2000; Smith et al., 2004; Weller et al., 1998). Los agentes se administraron usando una jeringa Hamilton de 10 j l y los tratamientos con el agente se llevaron a cabo individualmente usando una jeringa separada de 10 jl. IRL-1620 se administró 1 hora después de la inyección de Ap, mientras que BQ788 se administró 15 minutos antes de la inyección de IRL-1620. Al final del experimento, se confirmó la colocación de la cánula inyectando colorante azul de metileno (5 jl) y observando el sitio y la extensión de la tinción. Todos los experimentos se realizaron el día 15 (Briyal et al., 2011). La prueba del laberinto de agua se realizó desde el día 15 hasta el día 19, después de lo cual se sacrificó a los animales. Los animales utilizados para las mediciones del estrés oxidativo se sacrificaron el día 15 sin someterlos a ninguna prueba de comportamiento. Se indujo diabetes mellitus tipo 2 en ratas pertenecientes al grupo de diabéticos mediante la administración de estreptozotocina recién preparada a la dosis de 45 mg/kg, i.p. Se disolvió estreptozotocina en tampón de citrato de sodio 0,01 M de pH 4,3. En el día 3, se obtuvo la glucosa en sangre de la cola de rata y se analizó la hiperglucemia usando el kit de control de glucosa en sangre SureStep Complete. Las ratas con niveles de glucosa en sangre superiores a 11,1 mM se consideraron diabéticas. Los animales diabéticos y no diabéticos se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (6 ratas por grupo) (i) Simulado, (ii) Ap Vehículo, (iii) Ap IRL-1620, (iv) Ap BQ788 (v) Ap BQ788 IRL-1620. Ap (1-40) se administró por vía intracerebroventricular (i.c.v.) (20 jg en 3 dosis divididas igualmente, es decir, 6,67 jg se inyectaron 3 veces en una dosis total de 20 jg ) el día 1, 7, y 14. El agonista del receptor ET^b específico, IRL-1620 (3 jg ) y el antagonista del receptor ET^b específico, BQ788 (10 jg ) se administraron i.c.v. el día durante 14 días comenzando desde el día 1 de la inyección de Ap. Las dosis de IRL-1620 y BQ788 se seleccionaron basándose en estudios previos realizados en nuestro laboratorio (Leonard et al., 2011).

Estimación de los marcadores del estrés oxidativo

El malondialdehído (MDA), el glutatión reducido (GSH) (B) y la superóxido dismutasa (SOD) se estimaron el día 15 en el cerebro de la rata. Se decapitaron ratas y se extrajeron rápidamente los cerebros, se limpiaron con solución salina fría y se almacenaron a -80 °C. El análisis bioquímico se realizó dentro de las 48 horas siguientes.

Medición de la peroxidación de los lípidos

MDA, un marcador de la peroxidación de los lípidos, se midió espectrofotométricamente (Ohkawa et al., 1979). Brevemente, se extrajo todo el cerebro de cada animal por separado y se homogeneizó con 10 veces (p/v) en tampón fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,4). Se añadieron ácido acético 1,5 ml (20 %), pH 3,5, ácido tiobarbitúrico 1,5 ml (0,8 %) y 0,2 ml de dodecil sulfato sódico (8,1 %) a 0,1 ml de muestra de tejido procesada. La muestra se calentó a continuación a 100 °C durante 60 minutos. La mezcla se enfrió y se añadieron 5 ml de butanol:piridina (15:1 % v/v) y 1 ml de agua destilada. Después de centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos, se retiró la capa orgánica y se midió la absorbancia a 532 nm usando un espectrofotómetro.

Medición del glutatión

El glutatión se midió espectrofotométricamente (Ellman, 1959). Brevemente, se homogeneizó todo el cerebro con 10 veces (p/v) tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,4). A continuación, este homogeneizado se centrifugó con ácido tricloroacético al 5 % para separar las proteínas. A 0,1 ml de sobrenadante, se añadieron 2 ml de tampón fosfato (pH 8,4), 0,5 ml de 5'5 ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) y 0,4 ml de agua bidestilada. La mezcla se agitó con vórtex y se leyó la absorbancia a 412 nm en 15 min.

Medición de la superóxido dismutasa

La SOD se estimó como se describe por Kakkar et al (Kakkar et al., 1984). Brevemente, se homogeneizó todo el cerebro con 10 veces (p/v) tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,4). Los reactivos tampón de pirofosfato de sodio 1,2 ml (0,052 M) pH 8,3, 0,1 ml de metosulfato de fenazina (186 j M), 0,3 ml de tetrazolio azul nitro (300 j M) y 0,2 ml de NADH (780 j M) se añadieron a 0,1 ml de muestra de tejido procesada. La mezcla se incubó a continuación durante 90 min a 30 °C. A continuación se añadieron 4 ml de n-butanol y 1 ml de ácido acético. La mezcla se agitó vigorosamente. Después de centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos, se retiró la capa orgánica y se midió la absorbancia a 560 nm usando un espectrofotómetro. La proteína se estimó usando el método de Lowry (Lowry et al., 1951).

Prueba de laberinto de agua de Morris (MWM) para el deterioro cognitivo

El aprendizaje espacial y la memoria de los animales se probaron en un MWM (Morris, 1984). Un tanque de agua circular (132 cm de diámetro, 60 cm de altura, pintado de blanco se llenó con agua (25 ± 2 °C) hasta una profundidad de 40 cm, el agua se volvió opaca mediante la adición de leche desnatada. El tanque se dividió en cuatro cuadrantes iguales, marcados como norte, sur, este, y oeste. Se sumergió una plataforma de escape circular, blanca (10 cm de diámetro) aproximadamente 2 cm por debajo de la superficie del agua, a 10 cm del borde del tanque en un posición designada como cuadrante II (cuadrante objetivo). Se montó una cámara de vídeo en el techo en el centro de la piscina. La latencia de los escapes y la longitud de la trayectoria de nado se monitorizaron con un sistema de seguimiento Videomex y los datos se recopilaron utilizando el software Videomex Water Maze (Columbus Instruments, Ohio, EE.UU.).

La plataforma permaneció en el mismo cuadrante durante todos los experimentos de la fase de adquisición y se eliminó en la prueba de la sonda. Los ensayos de adquisición (4 ensayos por día durante 4 días) se iniciaron colocando a la rata en una piscina frente a la pared del tanque desde diferentes posiciones de inicio elegidas al azar, y se registró el tiempo requerido para encontrar la plataforma invisible. Un ensayo duraba hasta que la rata encontraba la plataforma o hasta que hubieron transcurrido 60 segundos y un intervalo entre ensayos de aproximadamente 30 segundos. Si la rata no encontraba la plataforma en 60 segundos, se guiaba hasta la plataforma y se colocaba sobre ella durante 60 segundos. Se midió el tiempo para llegar a la plataforma (latencia en segundos) y la longitud de la trayectoria de nado (en centímetros). Después de completar la cuarta prueba cada día, la rata se secó y se devolvió a su jaula de origen. Veinticuatro horas después del ensayo de adquisición final, la plataforma se retiró del tanque y se realizó un ensayo con sonda que duró 60 segundos; se registró el tiempo pasado en el cuadrante objetivo. El tiempo pasado en el cuadrante objetivo indicó el grado de consolidación de la memoria que había tenido lugar después del aprendizaje.

Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como la media ± EEM. En los ensayos de adquisición del laberinto de agua de Morris se registraron los siguientes parámetros: latencia de escape (tiempo requerido para llegar a la plataforma desde el punto de liberación en segundos) y longitud de la trayectoria (distancia recorrida por la rata desde el punto de liberación hasta alcanzar la plataforma en centímetros). Se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) sobre estos datos, con el grupo como el factor entre sujetos y con medidas repetidas, tales como el ensayo y el día como factores dentro del mismo sujeto. Se utilizó un análisis post hoc (prueba de Tukey) para determinar la significancia entre los grupos. Para los datos ensayo de sonda, el tiempo pasado en el cuadrante II se registró y analizó mediante ANOVA unidireccional y análisis post hoc mediante la prueba de Bonferroni. Las medidas de estrés oxidativo se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de análisis post hoc utilizando la prueba de Bonferroni. Todos los análisis se llevaron a cabo utilizando el software estadístico GraphPad Prism, versión 5.00 (GraphPad, San Diego, CA, EE.UU.). P<0,05 representa el nivel de significancia.

Efecto de la diabetes mellitus tipo 2 en ratas

Las ratas diabéticas eran lentas y la locomoción era menor en comparación con las ratas no diabéticas. Sin embargo, las ratas diabéticas y no diabéticas tuvieron un rendimiento similar en las pruebas del laberinto de agua de Morris (Fig. 8-11). La Figura 7 ilustra que no hubo diferencia en los parámetros de estrés oxidativo entre ratas diabéticas y no diabéticas.

Efecto del agonista y antagonista del receptor ET ^r sobre los parámetros de estrés oxidativo en ratas tratadas con Ap diabéticas y no diabéticas

Para determinar la implicación de los receptores ET^b en los cambios en los parámetros de estrés oxidativo inducidos por Ap, se midieron los niveles de malondialdehído, glutatión reducido y superóxido dismutasa en los cerebros de ratas simuladas y tratadas con Ap después de la administración de vehículo, IRL-1620 o BQ788+IRL-1620 (Fig. 1).

Efecto sobre los niveles de malondialdehído en el cerebro

Se midieron los niveles cerebrales de malondialdehído (MDA) para determinar el efecto de la estimulación del receptor ET^b sobre la peroxidación de lípidos tras el tratamiento con Ap (Fig. 7A). Como se esperaba, los niveles de MDA fueron significativamente (p<0,0001) más altos en ratas tratadas con Ap para los grupos diabéticos y no diabéticos en comparación con los grupos simulados. El nivel de MDA para los animales tratados con Ap no diabéticos fue de 516,13 ± 14,02 nmol/g de tejido húmedo, que fue mayor en comparación con los animales simulados (112,1±1,84 nmol/g de tejido húmedo). En ratas diabéticas, el nivel de MDA fue de 531,58 ± 9,02 nmol/g de tejido húmedo en los animales tratados con Ap, mientras que fue de 114,32 ± 2,05 nmol/g de tejido húmedo en los animales simulados. Los niveles de MDA se redujeron significativamente (P<0,001) en las ratas tratadas con IRL-1620 en comparación con las ratas Ap tratadas con vehículo tanto para los animales no diabéticos (278,47 ± 8,55 nmol/g tejido húmedo) como diabéticas (315,09 ± 5,25 nmol/g de tejido húmedo). La administración de BQ788 antes de IRL-1620, bloqueaba el cambio inducido por IRL-1620 en los niveles de MDA y los niveles fueron similares a los observados en las ratas tratadas con vehículo.

Efecto sobre los niveles de glutatión reducido en el cerebro

Los niveles de glutatión reducido (GSH) en animales diabéticos y no diabéticos tratados con Ap fueron significativamente (P <0,0001) más bajos que los de los animales operados de forma simulada. El nivel medio de GSH para los grupos tratados con Ap no diabéticos y diabéticos fue 102,5 ± 5,96 y 81,2 ± 4,33 pg/g de tejido húmedo, respectivamente, mientras que en las ratas simuladas fue de 239,1 ± 8,0 pg/g de tejido húmedo. El tratamiento con IRL-1620 aumentó significativamente (P<0,001) los niveles de GSH en los cerebros de ratas no diabéticas y diabéticas tratadas con Ap (192,74 ± 6,26 y 166,42 ± 6,63 pg/g de tejido húmedo, respectivamente) (Fig. 7B). El pretratamiento con BQ788 bloqueó el efecto positivo del tratamiento con IRL-1620 sobre los niveles de GSH (81,2 ± 5,49 pg/g de tejido húmedo; P<0,001).

Efecto sobre los niveles de superóxido dismutasa en el cerebro

Los niveles de superóxido dismutasa (SOD) en los cerebros de ratas Ap tratadas con vehículo no diabéticas (13,23 ± 0,53 U/mg de proteína) y diabéticas (11,07 ± 0,54 U/mg de proteína) fueron significativamente (P<0,0001) más bajos que los del grupo operado de forma simulada (35,22 ± 1,43 U/mg de proteína). La administración de IRL-1620 mejoró significativamente los niveles de SOD en ratas no diabéticas y diabéticas (22,26 ± 1,16 y 21,4 ± 1,65 U/mg de proteína, respectivamente) (Fig. 7C). De manera similar al GSH, los niveles de SOD fueron significativamente (P<0,001) más bajos cuando los animales Ap no diabéticos y diabéticos fueron pretratados con BQ788 antes de la administración de IRL-1620 (15,32 ± 0,44 y 16,52 ± 0,45 U/mg de proteína, respectivamente).

Efecto del agonista y antagonista del receptor ET ^r sobre el déficit de memoria en ratas tratadas con AB diabéticas y no diabéticas

No se observaron diferencias significativas entre las ratas no diabéticas y diabéticas en la adquisición del laberinto de agua (Fig. 8 y 10) ni en la prueba de ensayo con sonda (Fig. 9 y 11). Las ratas tratadas con Ap tardaron significativamente (p<0,0001) más tiempo (latencia de escape) en encontrar la plataforma. El grupo simulado mejoró su rendimiento en la prueba de plataforma oculta, como lo indica una disminución en las latencias de escape en los días sucesivos (efecto del día, F(^3,100)=3,968, p<0,001). Hubo una diferencia significativa entre las latencias de escape en el día 1, 2, 3 y 4 en ratas Ap tratadas con vehículo en comparación con las simuladas (F(^3,59)=8,273, p<0,0001). Sin embargo, cuando el agonista del receptor ET^b, IRL-1620 se administraba a ratas tratadas con Ap, la latencia de escape disminuyó significativamente en los días 3 y 4 de entrenamiento en comparación con las ratas Ap tratadas con vehículo (F^(4,59)=19,602, p<0,001). IRL-1620 mejoró significativamente el deterioro cognitivo causado por el tratamiento con Ap en ratas. Por otro lado, la administración de un antagonista del receptor ET^b, BQ788, bloqueó la mejora en la latencia de escape producida por IRL-1620 en ratas Ap (Fig. 8 y 10). También se muestra una diferencia en la latencia de escape en las trayectorias representativas de cada grupo durante un ensayo de adquisición en la tarea de laberinto de agua (Fig. 8 y 10). La distancia recorrida por una rata para llegar a la plataforma (longitud de la trayectoria) disminuyó a lo largo de los días (F(^3,5-ⁱ )=76,3, p<0,0001), y también hubo una interacción significativa día x grupo (F(^12,10q)=8,88, p<0,0001) lo que indica diferencias entre los grupos dentro de cada día de ensayo. Hubo una diferencia significativa entre las ratas Ap simuladas, tratadas con vehículo y las ratas Ap tratadas con IRL-1620 (F(2,57)=24,2, p<0,01); El análisis post hoc mostró que el grupo de ratas Ap tratadas con vehículo nadaron trayectorias más largas en comparación con el grupo simulado (p<0,001). El grupo de ratas Ap tratadas con IRL-1620 nadaron significativamente (p <0,001) longitudes de trayectoria más cortas en comparación con el grupo de vehículo, lo que indica los efectos beneficiosos del tratamiento con IRL-1620 (Fig. 8 y 10). Ap produjo un deterioro significativo de la función cognitiva en ratas que podría mejorarse con el agonista del receptor ET^b y se bloqueaba mediante el antagonista del receptor ET^b específico.

La eliminación de la plataforma del cuadrante objetivo (cuadrante II) dio como resultado una tendencia general a nadar preferentemente en el cuadrante objetivo frente a otros cuadrantes (prueba con sonda). Por lo tanto, se comparó el tiempo empleado en el cuadrante II para todos los grupos para observar el efecto de los agentes sobre la retención de la memoria. El tiempo pasado en otros cuadrantes, específicamente, no refleja el grado de consolidación de la memoria y, por lo tanto, no se sometió a análisis. En el ensayo con sonda, el tiempo pasado en el cuadrante objetivo disminuyó significativamente en las ratas tratadas con Ap en comparación con las ratas tratadas de forma simulada, lo que indica un déficit de memoria en las ratas tratadas con Ap. La administración del agonista del receptor ET^b, IRL1620, aumentó significativamente (p<0,0001) el tiempo pasado en el cuadrante diana en comparación con las ratas Ap tratadas con vehículo (Fig. 9 y 11). La administración de un antagonista del receptor ET^b, BQ788, a ratas tratadas con Ap no produjo ninguna mejora en el tiempo pasado en el cuadrante diana. La diferencia en el tiempo empleado en el cuadrante objetivo se muestra en las trayectorias representativas de cada grupo durante el ensayo con sonda en la tarea del laberinto de agua (Fig. 9 y 11). Ap produjo un déficit de memoria significativo en ratas que mejoró significativamente con el tratamiento con el agonista del receptor ET^b pero que se bloqueaba mediante el antagonista del receptor ET^b específico.

El propósito de este estudio era determinar el efecto de la estimulación selectiva del receptor ET^b por IRL-1620 sobre la recuperación funcional después de un deterioro cognitivo inducido experimentalmente por inyecciones intracerebroventiculares de Ap en ratas adultas diabéticas y no diabéticas. Los hallazgos actuales sugieren que IRL-1620 produjo un efecto preventivo significativo en el deterioro cognitivo inducido por Ap en ratas diabéticas y no diabéticas. Para confirmar que los efectos de IRL-1620 eran específicos de la estimulación de los receptores ET^b, se usó un antagonista selectivo del receptor ET^b, BQ788, para bloquear el efecto de IRL-1620. El tratamiento con Ap produjo un aumento significativo de los marcadores de estrés oxidativo en ratas no diabéticas y diabéticas y el tratamiento con el agonista selectivo del receptor ET^b, IRL-1620, redujo significativamente los marcadores de estrés oxidativo. La reducción del marcador de estrés oxidativo inducida por IRL-1620 fue bloqueada por el pretratamiento con el antagonista específico del receptor ET^b, BQ788, en ratas Ap no diabéticas y diabéticas.

La incidencia de diabetes mellitus y EA aumenta con la edad, y la incidencia de EA es significativamente mayor en pacientes con diabetes mellitus (Janson et al., 2004). Patológicamente, ambos se asocian con alteraciones de la homeostasis de la glucosa y la acumulación extracelular de proteínas amiloides. Esto sugiere que existen mecanismos subyacentes comunes, tales como la siembra cruzada de proteínas amiloides o la disfunción metabólica. Por lo tanto, se estudió el efecto de IRL-1620 en ratas diabéticas y no diabéticas tratadas con Ap.

La prevalencia de la demencia, particularmente de tipo EA, está aumentando y es uno de los trastornos neurodegenerativos más importantes en los ancianos. Estudios recientes apoyan que las disfunciones metabólicas y vasculares están implicadas en la patología y progresión de la EA. Las alteraciones vasculares, con deterioro de la utilización de glucosa y cambios en el flujo sanguíneo, ocurren con y antes del diagnóstico de EA (Baquer et al., 2009; Casadesus et al., 2007; Meier-Ruge et al., 1994). Estos cambios preceden al deterioro cognitivo y exacerban la patología subyacente de la EA. El descubrimiento y la prevención de la disfunción vascular podría conducir a nuevas estrategias para prevenir o detener la progresión de la EA. Estrechamente relacionado con los cambios vasculares en la EA está el Ap, el principal componente proteico de las placas seniles en los cerebros con EA. Un nivel elevado de Ap en el cerebro es una de las características destacadas de la EA (Hardy and Selkoe, 2002). Los tejidos que producen la mayor cantidad de Ap son el cerebro y el músculo esquelético, los cuales poseen un alto metabolismo y redes vasculares bien desarrolladas (Cirrito et al., 2005; Ethell, 2010). El daño vascular y la gliosis reactiva se localizan junto con los depósitos de amiloide en los cerebros con EA, lo que sugiere que la vasculatura puede ser un sitio clínicamente significativo de patología de la EA (Suo et al., 1998).

Se sabe desde hace mucho tiempo que el sistema de la ET juega un papel importante en la regulación de la circulación sanguínea cerebral. Varios estudios han demostrado la implicación de la ET en la EA. Debido a la potentísima vasoconstricción causada por la ET-1 a través de los receptores de ET^a , se postuló que la administración de un antagonista de la ET disminuiría el daño asociado con la EA. Los antagonistas del receptor ET^a , BQ123 y BMS182874, demostraron una reducción del estrés oxidativo y mejoraron el déficit de aprendizaje y memoria después del tratamiento con Ap en ratas. Sin embargo, un antagonista del receptor ET^a/b combinado no tuvo ningún efecto beneficioso (Briyal et al., 2011). Esto nos llevó a investigar la implicación de los receptores ET^b en la EA. De hecho, los sitios de unión de ET en el cerebro son fundamentalmente de receptores ET^b y se ha demostrado que los agonistas del receptor ET^b actúan como factor antiapoptótico contra la neurotoxicidad de Ap (Yagami et al., 2002). La elevación de Ap está directamente implicada en la patología vascular, y la disfunción vascular en la EA se caracteriza por la alteración de la arquitectura vascular que incluye una menor densidad capilar y un flujo sanguíneo reducido (Bell and Zlokovic, 2009; de la Torre, 1994; Iadecola et al., 2009; Zlokovic, 2008). En cambio, se sabe que la activación de los receptores ET^b endoteliales provoca vasodilatación y estudios previos en nuestro laboratorio han indicado que esto conduce a un aumento del FSC en ratas normales (Leonard and Gulati, 2009), lo que indica un posible papel de los agonistas de ET^b en el tratamiento y prevención de la EA.

En el presente estudio, las ratas tratadas con Ap recibieron vehículo o IRL-1620 durante 14 días. En el día 15, se evaluó el deterioro cognitivo de los animales y se extrajeron sus cerebros para analizar los marcadores de estrés oxidativo. El tratamiento con IRL-1620 redujo eficazmente el estrés oxidativo medido por la disminución de los niveles de malondialdehído (MDA) y el aumento de los niveles de glutatión reducido (GSH) y superóxido dismutasa (SOD) en comparación con el grupo tratado con vehículo. El bloqueo de los receptores ^eT^b con BQ788, por otro lado, tuvo como resultado un aumento del estrés oxidativo. Los niveles elevados de MDA junto con los niveles reducidos de los antioxidantes GSH y SOD son características de la generación de radicales libres de oxígeno que ocurren como un evento temprano en la patología de la EA (Cutler et al., 2004; Nunomura et al., 2001). Se cree que la etiología de la EA es compleja e inicia una variedad de reacciones bioquímicas que conducen a un exceso de Ca²+ intracelular, excitotoxicidad del glutamato, producción de especies reactivas de oxígeno y eventual apoptosis. Los agentes que se dirigen a estos eventos para retrasar o prevenir lesiones irreversibles se consideran como neuroprotectores. El estrés oxidativo y el Ap están relacionados entre sí (Hensley et al., 1994; Mark et al., 1997). El estrés oxidativo también contribuye a la disfunción vascular. Se ha descrito que el daño oxidativo durante la patogénesis de la EA puede deberse directamente al Ap (Murray et al., 2007; Murray et al., 2005). Se divulga en el presente documento que el agonista del receptor ET^b, IRL-1620, disminuyó los marcadores de estrés oxidativo que aumentaron con el Ap. Parece que el Ap puede producir vasoconstricción y un aumento del estrés oxidativo, los cuales podrían estar mediados por la ET. Se sabe que la estimulación de los receptores ET^b endoteliales provocan vasodilatación, y estudios previos en nuestro laboratorio han indicado que esto conduce a un aumento del FSC. Por lo tanto, los agonistas del receptor ET^b pueden ser bastante eficaces para prevenir el daño debido al Ap en la EA.

Por consiguiente, se divulga en el presente documento que la estimulación de los receptores ET^b después del tratamiento con Ap conduce a la recuperación funcional. Se realizaron estudios de comportamiento utilizando el MWM para determinar si los agonistas del receptor ET^b pueden mejorar el deterioro del aprendizaje y la memoria causado por Ap. Se observó que el Ap producía un deterioro significativo en la memoria espacial como lo demuestran las latencias de escape significativamente más largas y sin preferencia por el cuadrante que anteriormente contenía la plataforma en la prueba con sonda. Otros investigadores también han mostrado déficits de aprendizaje y memoria debido al Ap (Ahmed et al., 2010; Lopes et al., 2010; Tsukuda et al., 2009). En el presente documento se muestra que el agonista específico del receptor ET^b, IRL-1620, mejoró significativamente el déficit de memoria espacial causado por el tratamiento con Ap. Por otro lado, el antagonismo de los receptores ET^b con BQ788, administrado antes del vehículo o IRL-1620, dio como resultado un déficit de aprendizaje y memoria similar a los observados en el grupo del vehículo. Estos resultados sugieren que la mejora observada con IRL-1620 se debe a la estimulación selectiva de los receptores ET^b. Los déficits funcionales observados coincidieron con los cambios observados en los marcadores de estrés oxidativo.

Se sabe que la activación de los receptores ET^b con IRL-1620 provoca vasodilatación cerebral y un aumento del flujo sanguíneo mediante la liberación de óxido nítrico (ON) (Kitazono et al., 1995; Leonard and Gulati, 2009; Tirapelli et al., 2005). Hallazgos anteriores han revelado que la disfunción neurovascular cerebral en relación con la biodisponibilidad de NO formado por el NO endotelial contribuye al deterioro cognitivo y la neurodegeneración en la EA (de la Torre et al., 2003). El NO también juega un papel obligatorio en la regulación del FSC y la viabilidad celular y en la protección de las células nerviosas en la EA (Toda et al., 2009). Estudios recientes han demostrado que la estimulación del NO endotelial y el aumento de FCS por medios farmacológicos mejoran la angiogénesis (Chen et al., 2007; Ding et al., 2008). En esta línea, se ha demostrado que el receptor ET^b aumenta la formación de nuevos vasos sanguíneos a través de la eNOS (Goligorsky et al., 1999). Trabajos previos que usan un modelo deficiente en receptor ET^b apuntan a que este receptor promueve la supervivencia neuronal y disminuye la apoptosis en el hipocampo, la circunvolución dentada y el epitelio olfativo (Ehrenreich, 1999; Laziz et al., 2011; Riechers et al., 2004). Tanto la inducción de eNOS como los efectos neuronales antiapoptóticos directos de la activación del receptor ET^B puede desempeñar un papel en la reducción del estrés oxidativo y la mejora de la recuperación del comportamiento tras la EA.

En conclusión, la reducción del estrés oxidativo y la mejora del deterioro cognitivo tras la administración del agonista del receptor ET^b, IRL-1620, y la atenuación de estos efectos por un antagonista específico del receptor ET^b, BQ788, en el estudio actual indica que los receptores ET^b pueden ser una nueva diana terapéutica para la neuroprotección en la EA.

Estudios en un modelo animal de ictus

Efecto de IRL-1620 sobre los niveles de receptores de endotelina cerebrales en ratas con la arteria cerebral media ocluida: Los receptores ET^b están presentes en gran número en el SNC y parece que desempeñan un papel clave en su desarrollo. Se ha demostrado que los receptores ET^b en el cerebro están sobreexpresados en el momento del nacimiento y que su expresión disminuye con la madurez del cerebro (Briyal et al., 2012b). También se ha demostrado que la fase isquémica aguda va seguida de un intenso brote de neuronas y capilares (Carmichael, 2006; Murphy and Corbett, 2009) junto con la activación de las células gliales para crear un entorno para el crecimiento y la plasticidad neuronal (Hermann y Zechariah, 2009; Zhang and Chopp, 2009). Se activará farmacológicamente una respuesta regenerativa en el cerebro isquémico al estimular los receptores ET^b. Se ha demostrado que la estimulación de los receptores ET^b por IRL-1620 proporciona efecto neuroprotector en ratas con MCAO (Leonard et al., 2011; 2012; Leonard and Gulati, 2013). Los receptores ET^a aumentan en el hemisferio infartado a las 24 horas después de la isquemia y posteriormente vuelven a los niveles normales en una semana, por otro lado, 1 semana después se observa un aumento significativo de la expresión del receptor ET^b solo en el hemisferio infartado de las ratas tratadas con IRL-1620 (Leonard et al., 2012). Se contempla que IRL-1620 no solo estimula los receptores ET^b, sino que en períodos más largos aumenta el número y la afinidad de estos receptores.

Efecto de IRL-1620 sobre el déficit neurológico tras las isquemia cerebral focal: En un estudio preliminar, se determinó el efecto de activar selectivamente los receptores ET^b por IRL-1620 después de la oclusión permanente de la arteria cerebral media en ratas. Veinticuatro horas después de la oclusión de la arteria cerebral media, hubo un déficit neurológico significativamente mayor (P<0,001) y una función motora deficiente en comparación con las ratas operadas simuladamente, indicativo de un deterioro neurológico después de la inducción de isquemia cerebral. Los animales tratados con IRL-1620 mostraron una mejora significativa en todas las pruebas de la función neurológica y motora en comparación con los tratados con vehículo. En un estudio a más largo plazo, la isquemia cerebral tuvo como resultado una pérdida clara de la coordinación motora medida mediante las pruebas de marcha sobre rejilla y varilla giratoria a los 1,4 y 7 días después del infarto. Mientras que las ratas ocluidas tratadas con vehículo obtuvieron peores resultados en cada evaluación, los animales tratados con el agonista del receptor ET^b, IRL-1620, mostraron un déficit mínimo el día uno después de la oclusión, que mejoró en el transcurso de 7 días. El pretratamiento con antagonista del receptor ET^b, BQ-788, seguido de vehículo o IRL-1620 dio como resultado significativamente más déficits que el tratamiento con operación simulada (p<0,001) o IRL-1620 (P<0,05), lo que indica que la mejora observada con IRL-1620 es específica de la estimulación de los receptores ET^b (Leonard et al., 2011; 2012).

Efecto de IRL-1620 sobre las características de unión de los receptores ET^r tras la isquemia cerebral focal: Los cambios en las características de unión de los receptores ET^r se determinaron en el cerebro, 1 y 7 días después de la MCAO. Se realizó la MCAO en ratas y se llevaron los estudios de unión usando [¹²⁵I]-IRL-1620 (actividad específica 2200 Ci/mmol) como el radioligando y IRL-1620 frío (0-32 nM) como desplazador. La unión no específica se determinó usando la concentración 1 pM de IRL-1620. Los valores K^d y B^max se calcularon usando GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego). Las características de unión (K^d y B^max) no mostraba ninguna alteración a las 24 horas después de la MCAO. Sin embargo, se observó una disminución significativa de los valores K^d de la unión al receptor ET^r tanto en el hemisferio izquierdo como derecho 7 días post-MCAO. La disminución de K^d en el hemisferio derecho (isquémico) fue significativamente (P<0,001) mayor en comparación con el hemisferio izquierdo (no isquémico). B^max aumentó tanto en el hemisferio izquierdo como en el derecho, mostrando el hemisferio derecho un aumento significativamente mayor (P<0,001) en comparación con el hemisferio izquierdo (Figura 14). Se puede concluir que un aumento en la densidad y afinidad de los receptores ET^r el 7^o día después de la isquemia cerebral es un intento por proporcionar neuroprotección del cerebro isquémico.

Efecto de IRL-1620 sobre el volumen de infarto en las ratas con oclusión de la arteria cerebral media: La oclusión de la arteria cerebral media durante 7 días tuvo como resultado un volumen de infarto de 177,06 ± 13,21 mm³ en las ratas tratadas con vehículo. La administración de IRL-1620 redujo significativamente el volumen de infarto (54,06 ± 14,12 mm³; P<0,05) en comparación con el vehículo. Los volúmenes de infarto no se redujeron cuando el antagonista del receptor ET^r, BQ-788, se administraba con vehículo o IRL-1620 (Fig. 12). Se observó un edema sustancial en los animales tratados con vehículo, con el hemisferio infartado 9,73 ± 1,26% más grande que el hemisferio contralateral, mientras que los animales tratados con IRL-1620 no mostraron edema significativo, con el hemisferio infartado solo 1,51 ± 1,81 % más grande que el hemisferio no infartado. En cambio, el bloqueo del receptor ET^r con BQ-788 seguido de tratamiento con vehículo o IRL-1620 aumentó significativamente el edema (17,02 ± 3,17 y 17,97 ± 5,17 %, respectivamente, P<0,01) (Leonard et al., 2012).

Efecto de IRL-1620 sobre la supervivencia a los 7 días de las ratas tras las isquemia cerebral focal: También se realizaron estudios para determinar el efecto de la estimulación de los receptores ET^r usando un agonista selectivo, IRL-1620, en ratas con oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Se observó que no hubo mortalidad en las ratas tratadas de forma simulada durante el período de observación de 7 días. Sin embargo, las ratas con MCAO en el grupo tratado con vehículo presentaron una mortalidad del 38 % en el 7^o día. Por otro lado, las ratas con MCAO tratadas con IRL-1620 no mostraron mortalidad durante el período de 7 días. Sin embargo, las ratas con MCAO tratadas con un antagonista del receptor ET^r, BQ-788+vehículo o BQ-788+IRL-1620, mostraron una mortalidad del 25 % durante la observación de 7 días (Figura 13) (Leonard et al., 2012). Los resultados preliminares y la bibliografía de apoyo han impulsado la investigación del mecanismo involucrado en los efectos neuroprotectores y neurorrestauradores de los receptores ET^r en ratas con isquemia cerebral.

Efecto de IRL-1620 sobre la angiogénesis y la neurogénesis tras la isquemia cerebral en ratas: La angiogénesis y la neurogénesis son las fuerzas impulsoras de la remodelación neurovascular que es esencial después de un ictus para restaurar la función cerebral normal (Hawkins and Davis, 2005). El VEGF es una proteína endógena conocida por su capacidad para promover la angiogénesis y mejorar la permeabilidad vascular. En condiciones hipóxicas tales como la isquemia cerebral, la expresión de VEGF se induce en neuronas, astrocitos y células endoteliales a través del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) (Breier and Risau, 1996). Una vez expresado, el VEGF inicia acciones neuroprotectoras tanto directas como indirectas, inhibiendo la apoptosis, estimulando la neurogénesis y la angiogénesis, aumentando la captación de glucosa y activando los antioxidantes (Gora-Kupilas y Josko, 2005). Se ha demostrado que la administración intracerebroventricular (i.c.v.) de un agonista del receptor ET^b en ratas normales estimula la producción de VEGF y activa los receptores de VEGF en el cerebro, mientras que, en astrocitos cultivados, este agonista aumenta el ARNm de VEGF-A, así como la incorporación de BrdU (Koyama et al., 2012; Koyama et al., 2011). El agonista del receptor ET^b, IRL-1620, ha demostrado en nuestros estudios previos, que proporciona una neuroprotección significativa a las 24 horas y 1 semana después de la isquemia cerebral permanente. Por lo tanto, se estudió el efecto neuroprotector y neurorestaurador tras la estimulación de los receptores ET^b en ratas con isquemia cerebral (Leonard and Gulati, 2013). A las 24 horas después de la oclusión, se observó que el tratamiento con IRL-1620 aumentaba la expresión del receptor ET^b y se mantenían el número de neuronas en la corteza, el cuerpo estriado y la zona subventricular (SVZ) del cerebro de la rata isquémica (Figuras 15-22). IRL-1620 también aumentó el número de vasos sanguíneos marcados con factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en comparación con el tratamiento con vehículo (Figuras 18-20). Una semana después de la MCAO, los vasos VEGF positivo/corte de cerebro de 30 pm en el grupo IRL-1620 eran 11,33 ± 2,13 frente a 4,19 ± 0,79 en el grupo de vehículo (P<0,01), lo que indica un aumento de la angiogénesis. Adicionalmente, los animales que recibieron IRL-1620 mostraron un mayor número de células en proliferación (P<0,0001) y las células que se tiñeron positivamente para NGF (P<0,0001) en el cerebro infartado. El número de células NGF positivo en la corteza, el cuerpo estriado y la ZVS de los animales tratados con IRL-1620 fue 2,29 ± 0,31, 2,08 ± 0,26 y 3,05 ± 0,38 por 100 pm2, respectivamente, lo que demuestra un aumento significativo de la neurogénesis en comparación con el grupo de vehículo, lo que era un promedio de menos de 1 célula NGF positivo por 100 pm2 (Figuras 21 y 22). El pretratamiento con antagonista del ET^b, BQ-788, bloqueó los efectos del tratamiento con IRL-1620, lo que confirma el papel de los receptores ET^b en las acciones de remodelado neurovascular de IRL-1620. Los resultados del presente estudio indican que IRL-1620, administrado el día del infarto, es neuroprotector y mejora la remodelación angiogénica y neurogénica después de la isquemia cerebral (Leonard and Gulati, 2013).

Agonista del receptor ETB, IRL-1620, en el tratamiento del ictus isquémico: En el presente documento se divulga que los antagonistas específicos del receptor ETA previenen el aumento inducido por Ap de la expresión de los receptores ETA, el estrés oxidativo y los déficits cognitivos. Sin embargo, se observó que cuando se usaba un antagonista combinado del receptor ETA/B, se perdían los efectos beneficiosos (Briyal et al., 2011). Estos hallazgos llevaron a la investigación del papel de los receptores ETB en los trastornos del SNC. Los receptores ETB están presentes en gran número en el SNC y parece que desempeñan un papel clave en su desarrollo. Se ha demostrado que los receptores ETB en el cerebro están sobreexpresan en el momento del nacimiento y su expresión disminuye con la madurez del cerebro (Briyal et al.2012b). También se ha demostrado que el cerebro dañado exhibe un resurgimiento de los patrones organizativos de la infancia, que recuerda a un estado ontogénico y está preparado para la recuperación. Sin embargo, la remodelación endógena del SNC no es suficiente para restaurar la función neurológica. Se ha descubierto que el antagonista del receptor ET^b, IRL-1620 [Suc-[Glu9,Ala11,15]-Endotelina-1(8-12)], puede aumentar la expresión de los receptores ET^b en el SNC. Un aumento de los receptores ET^b puede producir una reducción de la apoptosis y promover la angiogénesis y la neurogénesis. Se ha demostrado que la expresión de los receptores eT^b está aumentada en neuronas, células de glía y macrófagos tras una isquemia. Adicionalmente, los estudios demuestran que la activación del receptor ET^b mejora la proliferación de neuronas e inhibe la apoptosis. Se activó farmacológicamente una respuesta regenerativa en el cerebro dañado al estimular los receptores ETB. La estimulación del receptor ETB, mediante el agonista de ETB selectivo, IRL-1620, mejoró significativamente el déficit neurológico, las funciones motoras y los marcadores de estrés oxidativo y disminuyó el volumen del infarto después de la isquemia en ratas (Leonard et al., 2011; 2012). El agonista del receptor ETB, IRL-1620, proporciona una neuroprotección significativa tanto a las 24 horas (Leonard et al., 2011) como 1 semana (Leonard et al., (2012) después de la isquemia cerebral permanente y el volumen del infarto se redujo en un 83,66 % en el estudio agudo y 69,49 % en estudio crónico. El tratamiento con IRL-1620 aumentó la expresión del receptor ETB y conservó el número de neuronas en la corteza, el cuerpo estriado y la zona subventricular (SVZ) del cerebro de la rata isquémica. IRL-1620 también aumentó el número de vasos sanguíneos marcados con factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en comparación con el tratamiento con vehículo (Leonard and Gulati, 2013). Por consiguiente, se descubrió que IRL-1620 administrado por vía intravenosa es muy eficaz para prevenir el daño después de un ictus y ayuda en la remodelación neurovascular del cerebro isquémico por angiogénesis y neurogénesis (Leonard y Gulati, 2013). Los estudios indican además que la estimulación de los receptores ETB por IRL-1620 proporciona neuroprotección (Leonard et al., 2011; 2012), y puede usarse como agente terapéutico para la enfermedad de Alzheimer (Briyal et al., 2011). Se ha demostrado que IRL-1620 previene el deterioro cognitivo y el estrés oxidativo inducido por el Ap (Briyal et al., 2011). Se contempla que la mejora de los posibles mecanismos de supervivencia mediante la estimulación de los receptores ET^b por ⁱRL-1620 conduce a una mejor recuperación después de la isquemia cerebral. La mayoría de los pacientes con ictus muestran una mejora neurológica sustancial (Dimyan y Cohen, 2011), lo que indica mecanismos de restauración endógenos. Por lo tanto, existe la posibilidad de desarrollar agentes farmacológicos que puedan estimular y amplificar estos mecanismos. Los dos enfoques principales que se pueden utilizar para el tratamiento de la isquemia cerebral son la neuroprotección, que requiere una intervención aguda, que puede instituirse durante la fase de recuperación del ictus (Andres et al., 2011; Bacigaluppi et al., 2009; Liu et al., 2008). Se han realizado o están en curso varios ensayos con agentes farmacológicos tales como anfetamina, metilfenidato, levodopa, sildenafilo, inhibidores de la captación de serotonina, eritropoyetina, estatinas y factor estimulante de colonias de granulocitos, pero ninguno implica la estimulación de receptores ETb. Se contempla en el presente documento que la estimulación de los receptores ETb produce, en diversas realizaciones, neuroprotección, neurorestauración o ambas.

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Tabla 1: Efecto del agonista del receptor ET^b, IRL-1620, y el antagonista, BQ788, sobre el déficit neurológico y la función motora tras la oclusión de la arteria cerebral media. Se inyectó IRL-1620 (5 pg/kg, i.v.) o solución salina isotónica (1 ml/kg, i.v.) a las 2, 4 y 6 h post MCAO. Se inyectó BQ788 (1 mg/kg, i.v.) 15 min antes de la primera inyección de IRL-1620 o vehículo. Los valores se expresan como la media ± EEM (n=5-8/grupo). *P<005 frente a simulado. #P<005 frente a MCAO vehículo. P<005 frente a MCAO IRL-1620.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un agonista del receptor de endotelina B para usar en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo mediante la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista del receptor de endotelina B, en donde la administración comprende tres dosis del agonista de endotelina B administradas por vía intravenosa a intervalos de 1 a 6 horas, y en donde el agonista del receptor de endotelina B se selecciona del grupo que consiste en IRL-1620, BQ-3020, [Ala 11 ' ]-Endotelina, Sarafotoxina S6c, endotelina-3 y una mezcla de los mismos.

2. Un agonista del receptor de endotelina B para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agonista del receptor de endotelina B se coadministra con un agente adicional para tratar el trastorno neurodegenerativo.

3. Un agonista del receptor de endotelina B para usar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un antidepresivo, un agente antiinflamatorio, un estimulante del SNC, un neuroléptico y un agente antiproliferativo.

4. Un agonista del receptor de endotelina B para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el trastorno neurodegenerativo se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrófica.

5. Un agonista del receptor de endotelina B para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde dicha cantidad terapéuticamente eficaz del agonista del receptor de endotelina B es de 0,0001 mg/kg a 0,5 mg/kg.

6. Un agonista del receptor de endotelina B para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la administración comprende tres dosis del agonista de endotelina B administradas por vía intravenosa a intervalos de dos horas.