WO2021118212A1

WO2021118212A1 - P53과 foxo4의 상호작용을 억제시키는 펩타이드를 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: WO2021118212A1
Application number: PCT/KR2020/017892
Authority: WO
Inventors: 한장희; 김민서
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-06-17
Also published as: JP2023506626A; KR20210074207A; EP4046647A4; EP4046647A1; US20230023726A1

Abstract

본 발명은 특정 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포노화에 의한 퇴행성 질환, 바람직하게는 골관절염 또는 죽상동맥경화증의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드는 p53과 FOXO4(Forkhead box protein O4)의 상호작용을 현저하게 억제시킴으로써, 세포노화 조절자의 발현을 억제할 수 있다.

Description

P53과 FOXO4의 상호작용을 억제시키는 펩타이드를 포함하는 약학 조성물

본 발명은 p53과 FOXO4(Forkhead box protein O4)의 상호작용을 억제시키는 펩타이드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 p53과 FOXO4의 상호작용을 억제시키는 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포노화에 의한 퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

FOXO4는 이온화 방사선(ionizing radiation)과 같은 외부 자극을 받으면 DNA 손상부위에서 p53과 결합하여 세포노화 조절자인 p21의 발현을 통해 세포노화(cell senescence)를 유발한다. FOXO4-p53 결합을 억제할 경우, p53이 미토콘드리아로 이동하고 시토크롬 c(cytochrome c)의 방출을 유도하여 노화세포(senescent cell)의 세포사(apoptosis)를 유발하게 된다(Baar MP. et. al. (2017). targeted apoptosis of senecent cells restores tissue homeostasis in response to chemotoxicity and aging. Cell 169: 132-147, e16).

이러한 원리를 이용하여 세포노화에 의한 다양한 퇴행성 질환을 치료할 가능성이 제기되고 있다(Childs BG et al. (2017) Senescent cells: an emerging target for diseases of aging. Nat Rev Drug Discov. 16:718-735). 예를 들면 골관절염의 경우 관절연골 표면에 축적된 노화연골세포를 제거하면 통증완화 및 연골재생이 되며, 죽상동맥경화증의 경우 노화된 거품세포(foam cell), 혈관민무늬근세포(vascular smooth muscle cell), 내피세포(endothelial cell) 등을 제거하면 플라크 형성(plaque formation)과 병변 성장(lesion growth)을 억제하여 병세를 완화할 수 있다.

이와 같이, p53과 FOXO4의 상호작용을 억제할 경우, 세포노화의 주된 조절자인 p21의 발현을 억제시킴으로써 골관절염, 죽상동맥경화증 등과 같은 퇴행성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명자들은 특정 펩타이드가 PKA(protein tyrosine kinase)와 SHP2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2)의 상호작용을 현저하게 증가시킴으로써, β1 인테그린 신호전달을 매개로 한 암세포 전이를 억제할 수 있으며, 또한 염증 질환을 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다는 것을 밝혀낸 바 있다(대한민국 특허공개 제10-2018-0099092호). 놀랍게도, 본 발명자들은 상기 특정 펩타이드가 p53과 FOXO4의 상호작용을 현저하게 억제시킴으로써, 골관절염, 죽상동맥경화증 등과 같은 퇴행성 질환에 대한 예방, 개선, 또는 치료활성을 갖는다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 특정 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 하기 화학식 1로 표시되는 3개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포노화에 의한 퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다:

<화학식 1>

Leu-X-Asp

식 중,

X는 글루타민산(Glu), 세린(Ser), 글라이신(Gly), 알라닌(Ala), 글루타민(Gln), 아르기닌(Arg), 라이신(Lys), 류신(Leu), 타이로신(Tyr), 아스파르트산(Asp), 페닐알라닌(Phe), 아스파라긴(Asn), 시스테인(Cys), 히스티딘(His), 아이소류신(Ile), 메싸이오닌(Met), 프롤린(Pro), 트레오닌(Thr), 트립토판(Trp), 또는 발린(Val)이고,

-는 펩타이드 결합이다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 바람직하게는 상기 펩타이드는 서열번호 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 세포노화에 의한 퇴행성 질환은 골관절염 또는 죽상동맥경화증일 수 있다.

화학식 1의 펩타이드, 즉 화학식 1로 표시되는 3개의 아미노산으로 구성된 펩타이드가 p53과 FOXO4의 상호작용을 현저하게 억제시킨다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 상기 펩타이드는 세포노화 조절자, 예를 들어 p21의 발현을 억제함으로써, 골관절염, 죽상동맥경화증과 같은 퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 인간 각질세포 HaCaT을 본 발명의 펩타이드 및 활성산소인 H₂O₂로 처리하였을 때, p53과 FOXO4의 상호작용에 미치는 영향을 평가하여 얻어진 결과를 나타낸다.

도 2는 인간 각질세포 HaCaT에 대한 본 발명의 펩타이드, 활성산소 H₂O_2,ERK 억제제, 및 SHP2 억제제 처리를 통하여, 펩타이드에 의한 ERK와 SHP2 활성화가 p53과 FOXO4의 상호작용에 미치는 영향을 평가하여 얻어진 결과를 나타낸다.

도 3은 인간 망막색소상피세포 ARPE-19를 본 발명의 펩타이드 및 활성산소인 H₂O₂로 처리하였을 때, 펩타이드가 활성산소에 의해 유도된 노화세포의 사멸에 미치는 영향을 β-Galactosidase 염색법을 통해 얻어진 결과를 나타낸 것이다.

도 4는, 도 3에서 β-Galactosidase 염색을 통하여 확인된, 남아있는 노화세포의 수를 정량분석한 결과를 나타낸다.

본 명세서에서, "퇴행성 질환(degenerative diseases)"이라 함은 세포의 노화(cell senescence)에 따라 야기되는 질환을 말하며, 예를 들어 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 골관절염(osteoarthritis), 알쯔하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 망막질환(ratinopathy) 등을 포함하며, 바람직하게는 골관절염과 죽상동맥경화증을 포함한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포노화에 의한 퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

<화학식 1>

Leu-X-Asp

식 중,

-는 펩타이드 결합이다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 서열번호 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 p53과 FOXO4의 상호작용을 억제시키는데 있어서 특히 우수한 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구투여 제제 형태(oral dosage form) 또는 비경구투여 제제 형태(parenteral dosage form) 형태로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 경피 투여, 피하 투여, 근육내 투여 등의 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 근육내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 퇴행성 질환을 예방, 개선 또는 치료하기에 적합한 양으로 환자에게 투여될 수 있으며, 그 투여용량은 통상 각 환자의 연령, 체중 및 환자의 증상에 따라 일반적으로 변화시킬 수 있는 용량, 예를 들어 1일 약 0.01 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드의 합성

서열번호 1 내지 20의 펩타이드(하기 표 1 참조)는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)를 이용하여 FMOC 고체-상 방법(FMOC solid-phase method)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 분석용 RP 컬럼(Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.

펩타이드 명칭	서열번호	아미노산 서열
Pep1	서열번호 1	Leu-Glu-Asp
Pep2	서열번호 2	Leu-Ser-Asp
Pep3	서열번호 3	Leu-Gly-Asp
Pep4	서열번호 4	Leu-Ala-Asp
Pep5	서열번호 5	Leu-Gln-Asp
Pep6	서열번호 6	Leu-Arg-Asp
Pep7	서열번호 7	Leu-Lys-Asp
Pep8	서열번호 8	Leu-Leu-Asp
Pep9	서열번호 9	Leu-Tyr-Asp
Pep10	서열번호 10	Leu-Asp-Asp
Pep11	서열번호 11	Leu-Phe-Asp
Pep12	서열번호 12	Leu-Asn-Asp
Pep13	서열번호 13	Leu-Cys-Asp
Pep14	서열번호 14	Leu-His-Asp
Pep15	서열번호 15	Leu-Ile-Asp
Pep16	서열번호 16	Leu-Met-Asp
Pep17	서열번호 17	Leu-Pro-Asp
Pep18	서열번호 18	Leu-Thr-Asp
Pep19	서열번호 19	Leu-Trp-Asp
Pep20	서열번호 20	Leu-Val-Asp

실시예 2. 펩타이드를 포함하는 조성물의 제조

서열번호 1 내지 20의 펩타이드를 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 각각 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1. p53과 FOXO4의 물리적 결합에 미치는 펩타이드의 활성 평가

본 발명의 펩타이드와 H₂O₂를 세포에 처리한 후, in situ PLA (proximity ligation assay) 방법을 통하여 p53과 FOXO4의 물리적 결합에 대한 영향을 평가하였다. 24-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 4.5 X 10⁴ 개의 HaCaT 세포(사람각질세포, CLS)를 10% 우태아혈청을 함유하는 DMEM 배지에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 배지 중 H₂O₂와 펩타이드의 농도가 각각 200 μM 및 20 μM이 되도록 실시예 2의 펩타이드 용액을 가한 다음, 1시간 동안 동일한 조건에서 인큐베이션하였다. 대조군으로 무처리군(도 1에서 "control"로 표기)과 H₂O₂단독 처리군(도 1에서 "-"로 표기)을 사용하였다. 각 웰의 세포를 PBS로 세정하고 2% 포름알데히드로 15분 동안 처리하여 고정시킨 후, 0.1% TritonX-100을 5분간 처리하여 세포 안으로의 항체 투과성을 높였다. anti-p53 다클론항체(Abcam, UK) 및 anti-FOXO4 다클론 항체(Santa cruz, CA, USA)를 첨가하고, In situ PLA 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 PLA 프로브를 가한 다음, 하이브리디제이션(hybridization), 라이게이션(ligation), 증폭(amplification) 및 마운팅 단계를 수행하였다. 각각의 세포에서 검출되는 발광 신호(PLA signals)를 공초점 레이져 현미경(Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan)으로 측정하여 p53 및 FOXO4 항체의 물리적인 상호작용을 정량하였다. 그 결과는 도 1와 같다. 도 1의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드 처리군은 미처리 대조군(즉, "-"군)에 비하여 p53과 FOXO4의 상호작용을 유의성 있게 억제시켰음을 확인할 수 있다. 특히, Pep 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 또는 20(즉, 서열번호 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 또는 20의 펩타이드)는 대조군에 비하여 p53와 FOXO4의 상호작용을 현저하게 억제시켰으며, Pep 1, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 및 20(즉, 서열번호 1, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 및 20의 펩타이드)는 대조군에 비하여 p53와 FOXO4의 상호작용을 2배 이상 현저하게 억제시켰음을 확인할 수 있다.

시험예 2. 펩타이드의 p53과 FOXO4의 물리적결합 억제 신호에 ERK와 SHP2가 미치는 영향 평가

본 발명의 펩타이드(서열번호 3의 펩타이드), H₂O_2,ERK 저해제(PD98059), 및 SHP2 저해제(NSC878777)를 세포에 처리한 후, in situ PLA (proximity ligation assay) 방법을 통하여 p53과 FOXO4의 물리적 결합에 대한 영향을 평가하였다. 24-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 4.5 X 10⁴ 개의 HaCaT 세포(사람각질세포, CLS)를 10% 우태아혈청을 함유하는 DMEM 배지에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, H₂O₂(200 μM)와 서열번호 3의 펩타이드(20 μM)를 병합처리하거나, H₂O₂(200 μM)와 서열번호 3의 펩타이드(20 μM) 병합처리군에 PD98059(10 μM) 또는 NSC878777(10 μM)을 추가 처리한 후, 1시간 동안 동일한 조건에서 인큐베이션하였다. 대조군으로 무처리군(도 2에서 "control"로 표기)과 H₂O₂ 단독 처리군을 사용하였다. 각 웰의 세포를 PBS로 세정하고 2% 포름알데히드로 15분 동안 처리하여 고정시킨 후, 0.1% TritonX-100을 5분간 처리하여 세포 안으로의 항체 투과성을 높였다. anti-p53 다클론항체(Abcam, UK) 및 anti-FOXO4 다클론 항체(Santa cruz, CA, USA)를 첨가하고, In situ PLA 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 PLA 프로브를 가한 다음, 하이브리디제이션(hybridization), 라이게이션(ligation), 증폭(amplification) 및 마운팅 단계를 수행하였다. 각각의 세포에서 검출되는 발광 신호(PLA signals)를 공초점 레이져 현미경(Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan)으로 측정하여 p53 및 FOXO4 항체의 물리적인 상호작용을 정량하였다. 그 결과는 도 2와 같다. 도 2의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드 처리군은 미처리 대조군에 비하여 p53과 FOXO4의 상호작용을 유의성 있게 억제시켰고, 펩타이드의 억제 신호는 ERK와 SHP2 활성화에 의존함을 확인할 수 있다.

시험예 3. p53 활성 증가를 통한 노화세포 사멸유도에 미치는 펩타이드의 활성 평가

H₂O₂를 세포에 처리하여 노화를 유도한 후 본 발명의 펩타이드(서열번호 3의 펩타이드)를 24시간 처리하여 노화된 세포의 사멸에 미치는 활성을 평가하기 위해, X-Gal 염색을 하여 남아 있는 노화세포의 수를 확인하였다. 12-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 80% 밀도의 ARPE-19(망막색소상피세포)를 10% 우태아혈청을 함유하는 DMEM 배지에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후, 배지 중 H₂O₂의 농도가 25 μM이 되도록 용액을 가한 다음, 24시간 동안 추가적으로 동일한 조건에서 배양하였다. 이후 각 웰의 세포를 PBS로 세정하고 서열번호 3의 펩타이드의 농도가 각각 0.2 μM, 2 μM, 20 μM이 되도록 실시예 2의 펩타이드 용액을 가한 다음, 24시간 동안 동일한 조건에서 인큐베이션하였다. 대조군으로 무처리군(도 3 및 4에서 "control"로 표기)과 H₂O₂만 단독 처리군(도 3 및 4에서 "-"로 표기)을 사용하였다. 각 웰의 세포를 PBS로 세정하고 Senescence β-Galactosidase Staining Kit (CST)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 X-gal 염색을 수행하였다. 노화가 유도된 세포에서 검출되는 청록색 발색을 위상차 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 측정하고 노화 세포의 수를 정량하였다. 그 결과는 도 3 및 도 4와 같다. 도 3 및 도 4의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드 처리군은 미처리 대조군(즉, "-"군)에 비하여 노화세포의 사멸을 유의성 있게 유도시켰음을 확인할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 3개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포노화에 의한 퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물:

<화학식 1>

Leu-X-Asp

식 중,

X는 글루타민산(Glu), 세린(Ser), 글라이신(Gly), 알라닌(Ala), 글루타민(Gln), 아르기닌(Arg), 라이신(Lys), 류신(Leu), 타이로신(Tyr), 아스파르트산(Asp), 페닐알라닌(Phe), 아스파라긴(Asn), 시스테인(Cys), 히스티딘(His), 아이소류신(Ile), 메싸이오닌(Met), 프롤린(Pro), 트레오닌(Thr), 트립토판(Trp), 또는 발린(Val)이고,

-는 펩타이드 결합이다.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드가 서열번호 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포노화에 의한 퇴행성 질환이 골관절염 또는 죽상동맥경화증인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.