KR20150037815A - 산소 부족 및 공기압 감소에 인한 고산병의 폐 형태의 치료를 위한 약학 조성물 - Google Patents

산소 부족 및 공기압 감소에 인한 고산병의 폐 형태의 치료를 위한 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고산병의 폐 형태의 치료 및 예방에 사용되는 펩티드로서, 7~20개, 특히 7~17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고 헥사머 TX1EX2X3E를 포함하고(여기서, X1, X2 및 X3은 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있고), 펩티드는 TNF 수용체 결합 활성을 갖지 않고, 고리화되어 있다.

Description

산소 부족 및 공기압 감소에 인한 고산병의 폐 형태의 치료를 위한 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF THE PULMONARY FORM OF ALTITUDE SICKNESS CAUSED BY LACK OF OXYGEN AND REDUCED AIR PRESSURE}
본 발명은 산소 부족 및 공기압 감소에 인한 고산병의 폐 형태의 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
고산병은 해발 2500m의 높이에서 인간에게 발생할 수 있다. 2500미터의 높이에서 산소 농도 및 공기압은 상당히 감소한다. 급성 고산병의 폐 형태와 뇌 사이에서 차이가 발생한다. 따라서, 급성 고산병은 뇌 및 폐에서도 발생한다. 고산병의 첫번째 상세한 임상 설명은 1891년 몽블랑 원정대 중에서 일어났다. 원정대의 최소 4명이 고산병으로 고통받았고, 4000m의 높이에서 1891년 9월 2일에 1명이 죽었다. 이들 경우에 있어서, 고산병은 개인의 생명을 위협하는 임상 상태로 간주되어 왔다.
치료하지 않으면, 고산병의 폐 형태는 24시간 이내에 사망으로 이어질 수 있고, 사망은 이차 폐색전증을 통하여 자주 발생한다.
급성 고산병 모든 형태의 가장 효과적인 치료는, 예를 들면 고통받는 환자를 낮은 고도로 급속히 하강시키거나, 또는 병에든 산소 또는 휴대용 고압 챔버에 의한 산소의 공급이다. 그러나, 산악 지역에서 급속한 하강이 가능하지 않은 경우가 종종있다. 예를 들면, 병에 든 산소에 의한 산소 환기는 증가된 폐동맥압이 확실히 감소되지 않고 정상화되지도 않는다. 또한, 휴대용 고압 챔버의 경우에 긍정적인 효과는 일시적이다. 치료의 성공은 고압 챔버를 떠난 직후에 그들이 물리적으로 다시 활성화될 때에 환자에게서 나타난다.
고산병에 대한 약물 치료는 현재 제한적이고 논란이 많다: 따라서, 덱사메타손은 중증 급성 고산병, 및 구체적으로는 고산병의 뇌 형태에 제안되고 있다. 또한, PDE-5 억제제가 고도에서 산소 부족을 통한 이차 폐고혈압(다나 포인트 분류 3)에 의해 나타나는 일차 폐동맥압(다나 포인트 분류 1)의 치료에 사용되는지에 대해서 논의되고 있다.
고산병에 대한 자연 치료의 가능성도(예방용으로도) 제안되고 있다(코카부시(coca bush) 잎의 차; 야크버터티(yak butter tea); 활성 성분으로서 은행나무(ginkgo)를 함유하는 제조).
그러나, 현재는 고산병의 폐 형태의 약물 치료에 대한 가능성이 여전히 매우 제한된다는 것에 주목해야 한다. 또한, 조직적인 구조 작업은 유럽 산악 지역 및 북미 지역에서 부분적으로만 의지되고 있다고 알려져 있다. 세계의 외지 높은 산 및 가장 높은 고도에 있어서, 구조 작업 및 응급 의료 원조(병에 든 산소 또는 휴대용 고압 챔버의 사용)는 부족할 수 있다. 따라서, 고산병의 효율적인 약물 치료의 제공은 고산병이 걸릴 수 있는 산악인에 대해서 비상 팩과 같은 구성 요소로서 긴급하게 필요하다.
EP 2 009 023 A1에 있어서, 새로운 펩티드는 부종의 치료를 위해 제안되고 있다. 이들 펩티드는 폐부종에 있어서 유체 클리어런스(폐부종 유체 클리어런스)를 위해서 설정된 테스트 시스템을 구성하지 않는 Calu-3 세포를 사용한 "TEER(Transepithelial elecrical resistance)" 테스트에 의해 본 명세서에서 평가된다. Calu-3 세포는 가스 교환을 위해서 작용하는 폐의 표면의 약 1%를 구성하는 팩트 기관지 세포에만 있다. 대조적으로, 폐포 세포는 가스 교환을 위해서 작용하는 폐의 표면의 99%를 구성한다(Hollenhorst 외, J. Biomed. Biotechnol. 2011 (2011), doi:10.1155/2011/174306). 상기 TEER 테스트와 대조적으로, 사람의 폐포 상피 세포주 A549는 폐포 상피 세포에 대한 모델로서 승인된 실험 기준으로서 설정되어 있다(Lazrak 외, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278 (2000), L848-57).
따라서, 본 발명의 목적은 고산병의 폐 형태를 가진 환자의 약물 치료에 대한 가능성을 뚜렷하게 향상시키고 이 질환을 효과적으로 치료할 뿐만 아니라 예방할 수 있는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 고산병의 폐 형태의 치료 및 예방을 위해서, 7~20개, 특히 7~17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고, 헥사머 TX1EX2X3E를 포함하는 펩티드에 관한 것이고, X1, X2 및 X3은 임의의 천연 또는 비천연 아미노산이어도 좋고, 상기 펩티드는 TNF 수용체 결합 활성을 갖지 않고, 고리화되어 있다.
본 발명에 있어서, 초기 약물 요법에 대해서는 고산병의 폐 형태에 대해서 행할 수 있다. 따라서, "희귀 의약품 지정"은 본 발명, 즉 EMA(EMA/OD/144/12) 및 US-FDA(12-3829) 둘 모두에 의해 즉시 승인된다. 이것은 본 발명에 의해 달성할 수 있는 이 질병에 대한 치료의 가능성을 절실히 나타낸다.
본 발명에 의해 사용될 수 있는 펩티드는, 예를 들면 유럽 특허 EP 1 264 599 B1, US 2007/299003 A, WO 94/18325 A1, WO 00/09149 A1, WO 2006/013183 A1 또는 WO 2008/148545 A1로부터 오랫동안 그 자체가 미리 알려져 있다. 본 발명에 대한 실험 과정에 있어서, 이들 펩티드는 놀랍게도 고산병의 폐 형태를 치료하는데 적합하다는 것을 확인하여, 초기 간단하고 효율적인 약물 치료 형태를 위해서 이 증상에 대해 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 용도에 작용하는 그 자체가 알려져 있는 이들 펩티드는 TNF 수용체 결합 활성을 갖지 않고(Hribar 외, Eur. J. Immunol. 1999; Elia 외, AJRCCM 2003; 또한, 이하의 실시예 섹션 참조) 고리화되어 있다. 이들 펩티드의 바람직한 변형은 7~17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고, 헥사머 TPEGAE를 함유하고 있다(SEQ ID No: 2).
급성 고산병은 항상 아급성 저산소증으로 시작된다. 그 후에, 저산소혈증 및 과탄산혈증은 혈관 확장으로 이어지고, 저탄산증은 혈관 수축으로 이어진다. 고도에서, 다른 효과는 저산소혈증 및 저탄산증을 야기하고; 폐에 있어서는 혈관 수축이 우세하여 뇌 혈관 확장을 야기한다.
급성 고산병의 원인은 주로 개별적으로 너무 작은(상대적으로 호흡 저하) 환기 증가에 있어서 실패한 적응에 있다. 결과는 보다 뚜렷한 저산소혈증, 높은 폐동맥압, 높은 두개내압, 유체 보유 및 낮은 적혈구 생성이다.
고산병의 폐 형태는 산소 부족 및 감소된 공기압에 의해 야기되고, 폐기능에 생명을 위협하는 변화이고, 2500과 6000m 사이의 높이에서 주로 발생한다. 모든 경우의 3분의 2는 해발 3000과 4500m 사이에 발생한다. 고산병의 폐 형태는 급성 고산병에 있어서의 사망의 가장 흔한 원인이다.
고산병의 폐 형태는 약 2500m의 한계 높이를 초과한 후에 특징적으로 자주 시작된다.
폐에 있어서 과량의 비균일한 저산소 혈관 수축은 급성 침투로 폐의 과관류(overperfused) 지역으로 이어진다. 불균일 저산소성 혈관 수축의 결과로서 크게 증가된 폐고혈압은 이전에 완전히 건강한 사람에 있어서 크게 증가된 저산소 폐 혈관 반응(HPVR)의 폐의 주변 영역에서의 주된 표현이다. 폐동맥압의 증가는 저산소증 하에서 생리적이지만, 상당히 보다 강하게 고산병의 폐 형태로 표시된다. 그러나, 폐의 모세혈관 투과성은 저산소증 하에서 증가하지 않는다.
이것은, 병독의 직접 행동을 통한 기본적인 형태 또는 다른 질병의 결과로서의 이차 형태 중 어느 하나를 발생시킬 수 있는 예를 들면, 급성 폐 손상(ALI), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 과투과성 부종 등의 다른 급성 폐질환과 명백히 대조적이다. ALI, ARDS 및 과투과성 부종에 있어서 폐의 가장 흔한 손상은 세균 및 바이러스성 폐렴, 폐 좌상, 위액의 흡인, 흡입 외상, 연기 중독, 유사 익사, 대량 수혈, 패혈증, 다발성 외상, 심폐바이패스 또는 광범위 화상이다. 이들 폐질환에 있어서, 폐포벽의 손상을 수반하는 염증성 반응이 가장 중요하다. 이 조건은 염증전 및 항염증 면역 과정의 복합 활성화로 이어지고, 폐포 상피와 혈관 내피에 염증성 손상으로 이어진다. 결과는 폐포 세포질과 계면활성제의 손실, 혈장 단백질과 간질성 부종 형성의 방출로 모세관 누출의 발생이다. 염증성 변화는 일반적으로 고르지 못하고 전체 폐에 걸쳐서 비균일하게 분산된다. 침투, 간질성 및 폐포 부종은 궁극적으로 무기폐(atelectasis) 및 동맥 저산소혈증과 폐고혈압의 임상적 징후로 이어진다. 이러한 염증성 반응은 고산병에 있어서 병리학적 의의를 갖지 않는다.
고산병의 임상적으로 뚜렷한 폐 형태의 발생 빈도는 3500m 이상에서 약 15%이고, 미치료 환자의 44%에서는 치명적인 상태이다.
고산병의 발생 빈도는 VO2max, 트레이닝 상태, 혈압, 영양, 흡연 또는 나이(급성 폐 손상(ALI/ARDS)과 대조적으로 상당한 위험 요소를 나타내는 특히 담배 흡연 및 나이)와 관련되지만, 개인의 저산소 호흡 반응(HVR)과 산 목적지 또는 각각 등산 속도에 대해서는 확실하게 부분적으로 관련되지 않는다.
한편으로는 고산병의 폐 형태의 치료와 다른 한편으로는 ALI/ARDS의 차이는 "오펀 인디케이션(orphan indication)"으로서 본 발명의 인증에 있어서 의약품 당국 EMA 및 US-FDA에 의해 이들 인증의 시험의 기준으로 간주한다. 한편으로는 세계보건기구(WHO)의 국제질병분류(ICD)로부터 이미 단독으로 결정되어 있다: 고산병의 폐 형태는 제 XIX 장(손상, 중독 및 외부 원인의 특정 기타 결과들) 하에서 질병 그룹 T66-T78(외부 원인의 다른 불특정 효과), 질병 클래스 T70(공기압 및 수압의 효과), 하위 카테고리 T70.2(높은 고도의 다른 불특정 효과)로 분류되고, 반면에 ALI/ARDS는 완전히 다른 장(제 X 장(호흡계의 질병), 질병 그룹 J80-J84(주로 간질에 영향을 미치는 다른 호흡기 질환), 질병 클래스 J80(성인 호흡곤란 증후군[ARDS]))으로 분류된다. 임상 분야는 다르다(고산병의 폐 형태에 대한 환경, 직업 및 스포츠 의학; ALI/ARDS에 대한 마취 및 집중 치료). 병인학은 근본적으로 다르다. 고산병의 폐 형태는 3000m 이상 높이 또는 환경 조건에 대한 각각의 변화에서 건강한 등산객에 의한 급속한, 비순응 상승을 통한 이미 존재하는 또는 근본적인 임상 조건이 없는 그외의 건강한 사람에서 발생되고, 반면에 ALI/ARDS는 심한 감염 또는 염증은 일부 또는 전신(예를 들면, 패혈증의 경우), 흡인(예를 들면, 위액에 의해), 뜨거운 것이나 유독가스의 흡입, 대량 수혈, 유사 익사, 폐 좌상, 다발성 외상, 화상, 지방 색전증 등); 마찬가지로 병리 생태학 등의 이전의 임상 조건 및 근본적인 병태 생태학(환자는 이미 정의할 수 있는 다른 임상 조건으로부터 고통받고 있음)의 결과로서 발생된다. 고산병의 폐 형태에 있어서, 불충분한 환기 반응 및 그 후에 저산소증으로 이어지는 매우 심한 혈관수축 반응, 증가된 폐 압력, 폐포 손상 및 모세관 배출(또한 (신경성) 교감신경 과활동에 인해)이 발생되고; ALI/ARDS에 있어서, 폐포 손상, 간질(interstitial)과 폐포 영역으로 단백질이 풍부한 유체의 배출 및 사이토카인의 광범위한 방출 및 호중구의 이주는 폐에 있어서의 감소된 가스 교환으로 이어진다.
그러나, 주로, 고산병과 ALI/ARDS의 폐 형태는 이들 질환을 갖는 염증성 과정에서 역할에 차이가 있다. 염증성 과정은 항상 ALI/ARDS에 앞서고; 이들 염증성 과정은 병태 생태학에서 중요한 역할을 한다. 대조적으로, 염증성 과정은 고산병의 폐 형태의 어느 부분에만 좋은 역할을 하고; 그들은 적어도 보조 기능으로서가 아닌 질병의 원인으로서 발생한다. 따라서, 반면에 ALI/ARDS에 있어서 내피 및 호중구로부터 염증 유발 조절인자의 증가된 분비물, 호중구 활성화 및 사이토카인의 방출에 의한 염증성 반응, 사이토카인 및 기관지 폐포 세척액(BALF)에 있어서 단백질의 높은 함량, 상기 BALF에 호중구 및 대식세포의 존재는 염증의 뚜렷한 표시를 나타내는 급성 염증에 의해 야기되고, 이들은 적어도 고산병의 폐 형태의 초기 단계에서는 완전히 존재하지 않는다. BALF는 고산병, 백혈구 또는 염증 유발 조절인자의 증가없이 계면활성제 단백질 A와 클라라 세포 단백질에 차이가 없는 폐 형태에 있어서 표현을 분석한다.
최종적으로, 고산병 및 ALI/ARDS의 폐 형태의 진단은 완전히 다르다: 고산병의 폐 형태는 건강, 비순응 등산객에서 발생하고, 높은 고도에 도착 후 2~5일 내에 발생한다. 여기서, 폐동맥의 압력은 비정상적으로 증가되지만, 쐐기압은 정상으로 유지된다. 언급한 바와 같이, ALI/ARDS에 있어서 초기 임상 조건은 항상 존재한다(예를 들면, 패혈증). 쐐기압은 ≤18mmHg이고, 또한 좌심방 고압(폐동맥에 있어서 비증가된 압력)에 대한 임상 징후는 일반적으로 없고; PaO2/FiO2 비는 안정한 상태에서 ≤300(ALI)이다.
고산병 및 ALI/ARDS의 폐 형태는 서로 완전히 다른 두 질병이다(Peacock, Eur. Respir. J. 8 (1995), 1819-1821).
바람직하게, 본 발명은 7~20개, 특히 7~17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고 헥사머 TPEGAE를 포함하는 펩티드에 관한 것이고(SEQ ID NO: 2), 상기 펩티드는 고산병의 폐 형태를 치료하기 위해서 TNF 수용체 결합 활성을 갖지 않고, 고리화되어 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태는 하기 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 연속적인 아미노산의 서열로 이루어진 고리화 펩티드에 관한 것이고, 고산병의 폐 형태의 치료용 약의 용도 또는 각각 제조하기 위해서 헥사머 TPEGAE를 갖는다.
- QRETPEGAEAKPWY(SEQ ID NO: 3)
- PKDTPEGAELKPWY(SEQ ID NO: 4)
- CGQRETPEGAEAKPWYC(SEQ ID NO: 1),
- CGPKDTPEGAELKPWYC(SEQ ID NO: 5),
- CGQKETPEGAEAKPWYC(SEQ ID NO: 6),
- CGQRETPEGAEARPWYC(SEQ ID NO: 7),
- CGQRETPEGAEAKPC(SEQ ID NO: 8),
- CQRETPEGAEAKPWYC(SEQ ID NO: 9),
- CGQRETPEGAEAKFWYC(SEQ ID NO: 10),
- KSPGQRETPEGAEAKPWYE(SEQ ID NO: 11),
- KGQRETPEGAEAKPWYG(SEQ ID NO: 12),
- 오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG(SEQ ID NO: 13),
- 4-아미노부탄산 GQRETPEGAEAKPWYD(SEQ ID NO: 14),
- β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE(SEQ ID NO: 15)
및 그 아미노산의 적어도 7개의 프레그먼트.
바람직하게, 상기 펩티드는 아미노산 서열 CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 1)를 함유하고, 상기 C 잔기를 통하여 고리화되어 있다. 따라서, 특히 바람직한 펩티드는 이하의 아미노산 서열을 갖는다(SEQ ID NO: 1).
(NH2)Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys(COOH).
본 발명에 의한 펩티드의 고리화는, 예를 들면 N 및 C 말단에서 2개의 C 잔기 사이에 이황화 가교를 통한 직접 고리화, 아니면 담체 물질로 모든 시스테인을 통하여 커플링된 펩티드에 의해 달성할 수 있다. 여기서, 본 발명에 의한 펩티드에 있어서, 시스테인 잔기는 분자의 시작과 끝에 제공되는 것이 바람직하다. 펩티드의 고리화를 달성하는 다른 작용기도, 예를 들면 아민 또는 아미드- 또는 에스테르 폐환으로 이어지는 알콜을 가진 산성기에 의해 사용될 수 있다(여기서, 예를 들면 아미노산 아스파르트산 및 글루탐산이 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 또는 리신, 바람직하게는 분자 내에서 고리화될 수 있다). 상기 펩티드의 고리 화는 바람직하게는 펩티드(존재하는 경우)의 C 잔기 사이에 이황화 가교에 의해 일어난다. 그러나, 시스테인 잔기 또는 다른 작용기도 본 발명에 의한 각각의 펩티드의 C 말단 또는 N 말단과 결합함으로써 본 발명에 의한 펩티드의 고리형 특성을 보장할 수 있는 담체 물질, 특히 담체 단백질에 제공될 수 있다.
이 점에 있어서, 본 명세서에 "발명에 의한" 펩티드에 대한 임의의 참조는 고리형 펩티드에 대한 참조이다.
본 발명에 의해서는 시스테인 잔기를 통한 고리화가 특히 바람직하고, 특히 본 발명에 의해 펩티드의 시작과 끝에 제공되거나 또는 추가적으로 도입, 및/또는 시스테인 잔기를 통하여 커플링된 시스테인 잔기를 통하여 본 발명에 의한 펩티드의 N 및 C 말단에 제공된다. N 및 C 말단에 제공되거나 추가적으로 도입된 시스테인 잔기를 통하여 본 발명에 의한 펩티드의 분자내 고리화가 특히 바람직하다.
또한, 본 발명에 의한 바람직한 펩티드는, 예를 들면 CGQKETPEGAEAKPWYC(SEQ ID NO: 6), CGQRETPEGAEARPWYC(SEQ ID NO: 7), CGQRETPEGAEAKPC(SEQ ID NO: 8), CQRETPEGAEAKPWYC(SEQ ID NO: 9) 또는 CGQRETPEGAEAKFWYC(SEQ ID NO: 10)이다.
본 발명에 의한 바람직한 펩티드의 다른 기는 서열 X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2를 가진 고리형 펩티드이고, 여기서 X1은 1~4개의 아미노산, 특히 1~3개의 아미노산을 나타내고, 이들 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산이고, 특히 X1은 아미노산 C, K, 오르니틴, 4- 아미노부티르산, β-알라닌, 또는 서열 KSP를 나타내고, X2는 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있고, 여기서 X2는 특히 아미노산 C, D, G 또는 E이고, 여기서, X1은 N-말단 아미노산이고 X2는 C-말단 아미노산이다(GQRETPEGAEAKPWY는 SEQ ID NO: 18에 상응). 이 서열 X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2의 특히 바람직한 예는 고리형 펩티드 KSPGQRETPEGAEAKPWYE, KGQRETPEGAEAKPWYG, 오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG, 4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD, β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE이다.
상기 고리형 펩티드 KSPGQRETPEGAEAKPWYE에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 아미노산 글루탐산(E)으로부터 N-말단 아미노산 리신(K)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 N-말단 아미노산 리신(K)은 상기 리신의 측쇄의 엡실론 아미노기의 질소와 상기 글루탐산의 측쇄의 감마 탄소 사이의 아미드 결합에 의해 C-말단 아미노산 글루탐산(E)과 연결되어 있다.
상기 고리형 펩티드 KGQRETPEGAEAKPWYG에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 아미노산 글리신(G)으로부터 N-말단 아미노산 리신(K)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 N-말단 아미노산 리신(K)은 상기 리신의 측쇄의 엡실론 아미노기의 질소와 상기 글리신의 카르복실기의 탄소 사이의 아미드 결합에 의해 C-말단 아미노산 글리신(G)과 연결되어 있다.
상기 고리형 펩티드 오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 아미노산 글리신(G)으로부터 N-말단 아미노산 오르니틴(Orn)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 N-말단 아미노산 오르니틴(Orn)은 상기 오르니틴의 측쇄의 델타 아미노기의 질소와 상기 글리신의 카르복실기의 탄소 사이의 아미드 결합에 의해 C-말단 아미노산 글리신(G)과 연결되어 있다.
상기 고리형 펩티드 4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 아스파르트산(D)으로부터 N-말단 아미노산 글리신(G)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 C-말단 아스파르트산(D)은 한편으로는 N-말단 글리신의 아미노기의 질소와 4-아미노부티르산의 카르복실기의 탄소 C1 사이의 아미드 결합에 의해, 다른 한편으로는 4-아미노부티르산의 아미노기의 질소와 C-말단 아스파르트산의 측쇄의 카복실기의 탄소 사이의 아미드 결합에 의해 N-말단 아미노산 글리신과 연결되어 있다.
상기 고리형 펩티드 β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 글루탐산(E)으로부터 N-말단 아미노산 글리신(G)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 C-말단 글루탐산(E)은 한편으로는 N-말단 글리신의 아미노기의 질소와 β-알라닌의 카르복실기의 탄소 C1 사이의 아미드 결합에 의해, 다른 한편으로는 β-알라닌의 아미노기의 질소와 C-말단 글루탐산의 측쇄의 카르복실기의 탄소 사이의 아미노 결합에 의해 N-말단 아미노산 글리신과 연결되어 있다.
본 발명에 의한 펩티드에 있어서의 고리화는 상술한 바와 같이, 담체 물질과 펩티드 결합으로 일어날 수 있다. 이러한 고리화 담체 물질로서 작용할 수 있는 모든 확립된 물질은 약학적으로 사용될 수 있고, 예를 들면 시스테인의 SH기(또는 펩티드의 다른 자연적으로 존재하거나 또는 인공적으로 도입된 화학적 반응성기)와의 공유 결합에 관여할 수 있고, 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH), 파상풍 독소 등의 확립된 담체 단백질이 특히 적합하다. 또한, 인접한 이관능성 잔기는 담체(예를 들면, 알콜 또는 아민기에 인접한 산성기)에 제공될 수 있다. 이러한 맥락에 있어서, "고리화"는 분자 내 폐환 및 담체(결합된 펩티드 프로젝트로부터(상기 담체에 결합되어 있는 펩티드의 N 및 C 말단에 의해))의 결합 모두를 포함하고, 여기서 상기 펩티드는 환상 공간 구조를 나타내는 이러한 방식으로 고리화됨으로써 안정화된다.
따라서, 본 발명에 의한 특히 바람직한 펩티드의 기는 SEQ ID NOS: 1 및 5~15를 가진 기이다.
본 발명에 의한 펩티드는 특히 아밀로라이드 민감성 상피 나트륨 이온 채널(ENaC)의 활성화 효과를 갖는다. 이 특성은 실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, Eaton 외(Fed. Proc. 45 (1986), 2707) 및 Hamill 외(Pflugers Arch. 391 (1981), 85-100)에 따른 방법으로 유리하게 테스트할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 의한 펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 있어서 고산병의 폐 형태를 치료하기 위해서 사용할 수 있다. 약학 조성물은 인간에게 투여하기 위해서 적합한 형태로 본 명세서에 바람직하게 제조된다.
용어 "약학 조성물"은 상술한 바와 같이(자연스럽게 또한 적합한(즉, 서로 부정적으로 간섭하지 않는)) 펩티드, 즉 추가 활성 성분과 함께 본 발명에 의한 펩티드의 혼합물을 포함하는 임의의 조성물을 말하지만; 본 명세서에 기재된 조건에서 지연, 개선 또는 치유하는 유일한 유효 성분으로서 본 발명에 의한 펩티드를 제공하는 것이 바람직하다. 특히, 용어 "약학 조성물"은 상술한 바와 같이, 펩티드를 갖는 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제(두 용어는 교환가능하게 사용될 수 있음)를 말한다. 기술분야에서 전문가에게 공지되어 있는 담체 또는 부형제의 바람직한 예는 물, 식염수, 인산나트륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리신, 글리실글리신, 히스티딘, 리신, 아르기닌, TRIS 및 시트르산나트륨 또는 그 혼합물이다. 물론, 링거액, 덱스트로스 용액 또는 비환원성 당의 용액이 사용될 수 있고; 따라서, 만니톨, 트레할로오스, 사카로오스, 소르바이트, 프룩토오스, 말토오스, 락토오스 또는 덱스트란, 행크 용액, 고정유, 에틸올레이트, 생리식염수에 5% 덱스트로오스, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 완충제 및 보존제도 이러한 담체로서 적합하다. 다른 적합한 담체는 그 자체가 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산 및 아미노산 공중합체 등의 조성물을 개별적으로 수용하기 위해서 해로운 항체의 제조를 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 본 발명에 의한 약학 조성물의 처방에 있어서, 물론 적절한 가이드 라인(예를 들면, (유럽 또는 US) 약전)을 따른다. 여기서, 상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 조성물에 제공되는 펩티드는 이들 담체에 직접 공유 결합에 의해 고리화될 수 있다.
본 발명에 의한 약학 조성물은 기술분야의 전문가의 지식 내에 임의의 적절한 방법에 의해 (의약으로서) 폐에 투여될 수 있고, 본 발명에 의해서 또는 본 발명에 의한 각각의 조성물에 사용될 펩티드를 투여하는 것이 특히 바람직하다. 바람직한 투여 경로는 흡입(에어로졸을 통하여)뿐만 아니라, 정맥내 투여, 점적 주입, 경구 투여 또는 그 조합이다. 흡입성 비경구 또는 경구 투여의 경우에 있어서, 본 발명의 의약은 상기에 정의된 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 용액, 현탁액 또는 에멀션 등이 투여량 단위 형태로 처방된다. 그러나, 투여량 및 투여 방법은 물론 각각의 개인의 특별한 경우에 따라 달라질 수 있다.
여기서, 각각 필요한 유효량은 투여를 필요로 하는 개인에게 투여된다. 상기 "유효량"은 의도된 치료 또는 예방 효과를 달성하기 위해서, 즉 예를 들면 질병의 악화를 예방하거나 또는 효과적으로 치료하기 위해서 충분히 효과적인 유효량으로서 이해될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서는 평균적인 환자에게서 진행되지만, 조성물 중에 성분의 실제 유효량은 투여의 종류 및 연령, 체중, 환자의 상태, 및 질병의 정도 및 진행을 고려하여(예를 들면, 적합한 종래의 약학적인 프로토콜에 의해서) 처방될 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명에 의한 조성물 중에 약학적으로 허용가능한 담체는 물(특히 바람직하게는: 주사용수), 식염, 인산나트륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리신, 글리실글리신, 히스티딘, 리신, 아르기닌, TRIS, 구연산나트륨, 링거액, 덱스트로스, 만니톨, 트레할로오스, 사카로오스, 소르바이트, 프룩토오스, 말토오스, 락토오스 또는 덱스트란, 행크 용액, 고정유, 에틸올레이트, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 방부제, 약학적으로 허용가능한 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산 및 아미노산 공중합체로부터 선택된다.
본 발명에 의한 약제는, 예를 들면 본 발명의 펩티드가 1㎍/㎏과 10㎎/kg 사이, 보다 바람직하게는 10㎍/㎏과 5㎎/kg 사이, 더욱 바람직하게는 0.1과 2㎎/kg 사이의 투여량이 제공되도록 투여할 수 있다. 바람직하게는, 일회 투여로서 제공된다. 그러나, 반복된 투여에 의한 연속적인 흡입 또는 주입, 또는 투여도 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 특히 바람직한 조성물은 1㎍~10g, 바람직하게는 10㎍~1g, 트특히 1mg~100mg의 양으로 펩티드를 함유한다.
본 발명에 의한 특히 바람직한 조성물은 액상으로 1㎍~10g, 바람직하게는 10㎍~1g, 특히 1mg~100mg의 양으로 펩티드를 함유하고, 0.5~1ml, 특히 1~5ml의 체적으로 존재한다.
본 발명에 의한 조성물은 바람직하게는 분말 흡입기에 의해 건조 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 이러한 분말 흡입기의 예는 미국 특허 제 4.995.385호 및 제 4.069.819호에 기재되어 있고; 이미 확립된 제품은 SPINHALER®, ROTAHALER®, FLOWCAPS®, INHALATOR®, DISKHALER® 및 AEROLIZER®이다.
본 발명에 의한 조성물은 바람직하게는 액체 분무기에 의해 에어로졸로서 투여될 수 있다. 이러한 액체 분무기의 예는 Aeroneb® 및 Pari® 등의 제품을 설정할 수 있다.
바람직한 실시예에 의하면, 본 발명에 의한 조성물은 펩티드가 분무형 분말 제형 또는 분무형 액체 제형으로 존재하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 이하의 실시예 및 도면에 의해 보다 상세하게 설명하지만, 이들로 제한되지 않는다.
도 1은 식염수 또는 각각의 펩티드 SEQ ID NO: 1을 기관내 투여 4 시간 후에 측정된 랫트 중에 고산병의 폐 형태의 강도를 나타낸다. 대조군: 정상 산소 및 공기압 값의 조건 하에서의 대조군 랫트. PBS: 감소된 산소 및 공기압, 및 식염수의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 100㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 펩티드 SEQ ID NO: 1 100㎍의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 300㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 펩티드 SEQ ID NO: 1 300㎍의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 600㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 펩티드 SEQ ID NO: 1 600㎍의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트.
도 2는 식염수 또는 각각의 펩티드 SEQ ID NO:1의 기관내 투여 4시간 후에 측정된 랫트의 폐 유체 중의 단백질 함량을 나타낸다. 대조군: 정상 산소 및 공기압 값의 조건 하에서의 대조군 랫트. PBS: 감소된 산소 및 공기압, 및 식염수의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 100㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 펩티드 SEQ ID NO: 1의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 300㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 펩티드 SEQ ID NO: 1 300㎍의 기관내 투여 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 600㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 펩티드 SEQ ID NO: 1 600㎍의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트.
도 3은 식염수 또는 각각 펩티드 SEQ ID NO: 1의 기관내 투여 4시간 후에 랫트의 폐 조직의 조직학적 외관을 나타낸다. 대조군: 정상 산소 및 공기압 값의 조건 하에서의 대조군 랫트. PBS: 감소된 산소 및 공기압, 및 식염수의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 100㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 SEQ ID NO: 1 100㎍의 기관내 투여 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 300 ㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 펩티드 SEQ ID NO: 1 300㎍의 기관내 투여의 조건 하에서의 랫트. 펩티드 SEQ ID NO: 1 600㎍: 감소된 산소 및 공기압, 및 펩티드 SEQ ID NO:1 600㎍의 기관내 투여 조건 하에서의 랫트.
도 4는 PEPTIDE SEQ ID NO: 1("AP301")(240nM)의 첨가 후 및 배스 용액에 아밀로라이드의 첨가 후에, 클램프된 -100mV에서 대조군 상태 중에 전체 세포 패치 클램프 테스트에서 A549 세포에 흐르는 내부 흐름 Na+의 평균값을 나타낸다. 상기 값은 +/- SE값을 의미한다.
도 5는 전체 세포 모드에서 패치된 A549 세포에 흐르는 Na+의 합성 펩티드 QRETPEGAEAKPWY의 작용(SEQ ID NO: 3, 부종의 치료용으로 적합하지만, 본 발명에 의한 형태와 대조적으로 이 실험에서 고리화되지 않은 종래 기술에 기재되어 있음)을 나타낸다. 대조군 단계 중 및 배스 용액에 펩티드 QRETPEGAEAKPWY(300nM)의 첨가한 후에 -100mV의 유지 전위에서 클램프된 세포의 대표적인 원본 기록.
도 6은 전체 세포 모드에서 패치된 A549 세포에 흐르는 Na+의 합성 펩티드 TKPIELGPDEPKAV의 작용(SEQ ID NO: 16, 부종의 치료용으로 적합하지만, 본 발명에 의한 형태와 대조적으로 이 실험에서 고리화되지 않은 종래 기술에 기재되어 있음)을 나타낸다. 대조군 단계 중 및 배스 용액에 펩티드 TKPIELGPDEPKAV(300nM)의 첨가 후에 -100mV의 유지 전위에서 클램프된 세포의 대표적인 원본 기록.
도 7은 전체 세포 모드에서 패치된 A549 세포에서 흐르는 Na+의 합성 펩티드 CGTKPIELGPDEPKAVC의 작용(SEQ ID NO: 17, 종래 기술에 기재된 바와 같이, 부종의 치료용으로 적합하지만, 본 발명에 의한 형태와 대조적으로 이 실험에서 고리화되지 않음)을 나타낸다. 대조군 단계 중 및 배스 용액에 펩티드 CGTKPIELGPDEPKAVC(300nM)의 첨가 후에 -100mV의 유지 전위에서 클램프된 세포의 대표적인 원본 기록.
도 8은 농도의 함수로서 환상 펩티드 SEQ ID NOS: 1 및 11~15의 활성을 나타낸다. x축의 농도에서는 nM의 대수 눈금이 입력되고; Y축의 나트륨 이온 흐름(%)이 입력된다.
실시예 1:
고산병의 폐 형태의 치료를 위한 본 발명에 의한 SEQ NO: 1을 가진 펩티드의 사용
본 실시예에 있어서, 고산병의 폐 형태의 실험용 랫트 모델에 있어서, 본 발명의 목적은 고산병의 폐 형태로 고통받는 랫트에 투여할 수 있는 본 발명에 의한 합성 펩티드(SEQ ID NO: 1)에 의해 달성될 수 있는 것을 나타냈다. 높은 고도에서 발생하는 등의 감소된 산소 및 공기압의 조건 하에서 신체적 활동은 고산병의 폐 형태의 발병으로 이어지는 주된 요인이다. 따라서, 감소된 산소 및 감소된 공기압의 조건 하에서 신체적 활동을 행하는 랫트에 있어서, 선택된 랫트 모델을 높은 고도에서 육체적으로 격렬한 상승을 시뮬레이션했다. 이것은 사전 적응을 행하지 않고 일어났다. 높은 고도에서 고산병의 폐 형태로 고통받는 산악인의 경우에서 발견할 수 있는 등의 시나리오에 해당된다. 사용할 수 있는 모델에 있어서, 고산병의 폐 형태에 대한 일반적인 증상을 나타내는 랫트를 폐 유체 및 폐 조직의 조직학적 외관에서 증가된 단백질 농도를 "고산병의 폐 형태의 강도"로 나타낸다. 이 모델에서 폐 손상은 폐를 손상시키는 내독소, 미생물 또는 다른 제제의 투여에 의해 발생된 것이 아닌지를 보다 주목해야 한다. 폐의 강화된 염증은 발생하지 않았다. 또한, 랫트의 특정 변형은 이 실험에서 사용하지 않았다. 따라서, 이 랫트 모델은 고산병의 폐 형태의 치료용 약제를 연구하는데 적합하다.
방법
실험용 랫트(Sprague Dawley rats)는 감소된 산소 및 공기압의 조건 하에서 48시간 동안 외부 자극을 통하여 신체적인 활동을 행했다. 여기서, 4500㎛ 이상의 높이가 되도록 시뮬레이션하기 위해서, 상기 공기압을 430Torr 이하의 값으로 감소시켰다. 450m 이상의 높이에서 랫트의 사전 적응은 행하지 않았다. 이 기간 동안에, 랫트는 물 및 음식을 섭취하기 위해서 4시간마다 15~20분 잠시 멈추는 것을 약속했다. 4500m 이상의 시뮬레이션 높이에서 48시간 신체 활동 후에, 300㎕ 식염수 또는 300㎕/동물 대상 펩티드 SEQ ID NO: 1(100㎍, 300㎍ 및 600㎍)로 랫트를 기관내 처리했다. 그 후에, 상기 랫트는 4500m 이상의 시뮬레이션 높이에서 감소된 산소 및 공기압의 조건 하에서 4시간을 더 보냈다. 그 후에, 폐를 제거하고 고산병의 폐 형태의 강도(도 1), 폐 유체 중의 단백질 함량을 측정하고(도 2), 폐 조직의 조직학적 외관을 측정했다.
결과
상기 연구는 감소된 공기압 및 감소된 산소 농도의 조건에 노출시키고 실험용 랫트에 펩티드 SEQ ID NO: 1의 기관내 투여하여 고산병의 폐 형태의 강도의 감소를 이끌었다(도 1). 이것은 100㎍/실험용 랫트 및 600㎍/실험용 랫트, 특히 300㎍/실험용 랫트 펩티드 SEQ ID NO: 1에 대해서 입증할 수 있었다.
또한, 상기 연구는 감소된 공기압 및 감소된 산소 농도의 조건에 노출된 실험용 랫트에 펩티드 SEQ ID NO: 1의 기관내 투여하여, 폐 유체 중의 단백질 농도의 감소를 이끌었다(도 2). 이것은 100㎍/실험용 랫트 및 600㎍/실험용 랫트, 특히 300㎍/실험용 랫트 펩티드 SEQ ID NO: 1에 대해서 입증할 수 있었다.
조직학적 검사는 감소된 산소 및 공기압의 조건에 노출되지 않은 대조군 랫트의 건강한 폐 조직과 비교하여 펩티드 SEQ ID NO: 1의 투여 후에 랫트의 폐 조직에 대하여, 적혈구와 함께 팽윤된 폐 조직을 나타내는 식염수 처리된 랫트를 나타냈다.
실시예 2
인간의 전체 혈액에서 SEQ ID NO: 1을 가진 본 발명에 의한 펩티드의 염증 유발 특성의 생체외 평가
약학적 생체외 안전성 연구는 펩티드 SEQ ID NO: 1이 신선한 전체 혈액으로부터 염증성 마커 인터류킨-6(IL-6)의 방출을 이끄는지(즉, 펩티드 SEQ ID NO: 1이 TNF 특정 염증성 활성(즉, TNF 수용체 결합 활성)을 나타내는 여부)를 밝히기 위해서, 인간의 전체 혈액에서 본 발명에 의한 펩티드 SEQ ID NO: 1에 대해서 행했다. 본 연구에 있어서, 신선한 전체 혈액을 사용하고; 이것은 생체내 염증성 반응의 평가에 대해 승인된 예측 모델이었다.
방법론의 개요
본 연구의 목적은 펩티드 SEQ ID NO: 1의 염증 유발 시그널 용량을 결정하는 것이다. 여기서, 전체 혈액 배양을 사용하고, 인터류킨-6(IL-6), 염증 유발 자극에 대해 매우 민감한 마커의 분비를 ELISA에 의해 정량했다.
-테스트 시스템
5명의 건강한 피험자(HS)로부터 얻은 25ml의 헤파린화 혈액을 테스트에 사용했다.
-테스트 대상
식별: 펩티드 SEQ ID NO: 1(투여량: 1ng/ml~10㎍/ml; 용액에 단일 투여)
설명: 백색 분말, 순도 96%
전체 혈액 배양
전체 혈액(FB) 배양은 24웰 플레이트의 오목부에 FB 1㎖를 피펫팅함으로써 행했다. 각각의 실험에 있어서, 비자극 및 자극 대조군 배양을 포함했다.
가능하다면, 물질 및 자극제는 웰에서 총 체적의 10%를 초과하지 않는 특정 실험에서 각각의 웰에 동일한 체적으로 항상 사용된 경우에 검사했다. 미자극 대조군은 PBS로 발생되었다. 다른 치료에 대한 체적 조절 및 희석은 마찬가지로 PBS로 행했다.
각각의 웰의 내용물을 혼합하고, 상기 플레이트를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 배양 후에, 각각의 웰의 내용물을 새로운 1.5ml의 마이크로튜브로 이송하고, 15분 동안 8000~9000×g에서 원심분리했다. 각각의 샘플의 상청액을 1.5ml의 반응 용기에 각각 나누고, 사용할 때까지 -20℃에서 저장했다.
인터류킨-6의 분석
인터류킨-6은 포획 항체로서 항인간-IL-6 항체, 바이오티닐화된 항인간 IL-6 검출 항체, 효소 시약으로서 아비딘 호스래디시 페록시다아제 공액 및 기준으로서 재조합 IL-6을 사용하는 특정 ELISA(인간 IL-6 ELISA-세트, BD 바이오사이언스, Cat. No. 555220)에 의해 정량했다. 450nm에서 흡광도 측정은 Packard Fusion 리더로 행했다.
데이터 분석
각각의 플레이트의 결과를 저장하고, 융합 데이터 분석 소프트웨어로 평가했다.
연구 결과의 요약
본 연구의 목적은 펩티드 SEQ ID NO: 1의 염증 유발 시그널링 용량을 결정했다. 전체 혈액 배양을 사용하고, IL-6의 분비, 염증성 친자극에 대해 매우 민감한 마커를 ELISA에 의해 정량했다.
5명의 건강한 피험자의 전체 혈액 샘플을 미자극(음성 대조군), LPS의 높고 낮은 투여량으로 자극(양성 대조군)하거나, 또는 10㎍/㎖~1ng/㎖의 9개의 반대수 희석물에서 펩티드와 함께 배양했다. 결과는 이하의 표에 나타냈다:
표: 펩티드 SEQ ID NO: 1 및 LPS의 첨가로 신선한 전체 혈액으로부터 인터류킨-6의 방출
펩티드 SEQ ID NO: 1: 양성 대조군(LPS)
농도: IL-6의 농도(pg/ml, n=5)
0(음성 대조군) 0.5 미만 0.5 미만
10㎎/㎖ 0.5 미만 195.640
1㎎/㎖ 0.5 미만 108.370
3ng/㎖ 0.5 미만 34.867
1ng/㎖ 0.5 미만 측정되지 않음
상기 결과는 펩티드 SEQ ID NO: 1이 테스트된 농도 중 어느 하나에 IL-6 분비물의 임의의 검출가능한 양을 유도하지 않는 것을 명백히 나타냈다. 양성 대조군(LPS)은 IL-6 분비물의 집중 유도로 이어졌다.
토론
펩티드 SEQ ID NO: 1가 염증 유발 캐스케이드의 유도를 초래하는지를 증명하기 위해서 실험을 행했다. 판독 파라미터는 5명의 건강한 기증자로부터 전체 혈액 배양물에서 IL-6의 분비를 유도했다. 상기 결과는 펩티드 SEQ ID NO: 1이 기증자 배양물에서 IL-6의 검출가능한 레벨을 유도하지 않는 것을 명백히 나타냈다. 따라서, 상기 펩티드 SEQ ID NO: 1은 선택된 생체외 모델에서 염증 유발 반응을 유도하지 않으므로, TNF 수용체 결합 활성을 갖지 않는 것을 입증했다. 상기 테스트는 TNF 수용체 결합 활성으로부터 방출의 기능을 증명하기 위해서, 본 발명에 의한 펩티드 중 어느 변형에 적용할 수 있다.
실시예 3: A540 세포와 패치 클램프 분석에 있어서, 부종의 치료를 위해서 선행기술에서 제안된 다른 합성 펩티드 및 펩티드의 비고리화(따라서, 본 발명에 의한) 형태와 비교하여 본 발명에 의한 펩티드의 생체 활성을 평가
요약:
이 실시예에 있어서, 본 발명에 의한 펩티드의 생물학적 활성은 나트륨 흐름의 유도 능력에 대하여 3개의 다른 합성 펩티드와 함께 평가했다. 또한, 상기 비교 합성 펩티드는 부종의 치료용 펩티드로서 유럽 특허 출원 EP 2 009 023 A1에서 제안되고 있다. 이들 펩티드에 대해서, EP 2 009 023 A1에서는 조직에서 과잉의 유체의 축적을 억제 또는 감소시킬 수 있다고 가정했다. EP 2 009 023 A1에 있어서, 이 특성은 TEER 테스트에 의해 조사했고; 본 실시예에 있어서, 이 생물학적 활성은 A549 세포와 전체 세포 패치 클램프 테스트로 조사했다.
이 측정 원리(전체 세포 패치 클램프 테스트)는 인간의 폐에서 상당히 좋은 유체 밸런스를 반영하므로, 이러한 문제에 대한 승인 테스트 시스템이다. 건강한 성인의 폐에서 유체 밸런스는 여러 연구에서 기록되어 있는 폐포 유체의 클리어런스에 Na+ 수송의 참여와 함께, 폐 상피를 통하여 이루어지는 이온 수송 메커니즘에 의존한다. 여기에 특히, II형 폐포 세포의 아밀로라이드 민감성 상피 나트륨 이온 채널(ENaC)은 폐포 유체의 클리어런스의 주요 레귤레이터로 확인되었다.
아밀로라이드 민감성 상피 나트륨 이온 채널(ENaC)의 활성을 평가하고, 생물학적 및 화학적 화합물에 의해 그 활성을 결정하기 위해서, 전체 세포 패치 클램프 기술은 폐포세포의 꼭지면 막(apical membrane)을 통하여 나트륨 이온 이동의 측정을 위한 실험 방법으로서 설정되어 폐포 유체의 클리어런스를 예측했다.
따라서, 본 실시예에 있어서, 본 발명에 의한 펩티드 및 3개의 합성 펩티드, QRETPEGAEAKPWY(SEQ ID NO: 3, 부종의 치료에 적합한 것으로서 종래 기술에 기재되어 있지만, 본 발명에 의한 형태와 대조적으로 본 실험에서는 비고리화되어 있음), TKPIELGPDEPKAV(SEQ ID NO: 16; 부종의 치료에 적합한 것으로서 종래 기술에 기재되어 있지만, 본 발명에 의한 펩티드와 대조적으로 고리화되어 있지 않고 코어 서열 TX1EX2X3E 또는 각각의 TPEGAE를 함유하지 않음) 및 CGTKPIELGPDEPKAVC(SEQ ID NO: 17; 부종의 치료에 적합한 것으로서 종래 기술에 기재되어 있지만, 본 발명에 의한 펩티드와 대조적으로 코어 서열 TX1EX2X3E 또는 각각의 TPEGAE를 함유하지 않음)의 생물학적 활성은 A549 세포, 인간의 II형 폐포 세포의 연속적인 세포주에 전체 세포 패치 클램프 측정에 의해 측정했다.
발명에 의해 제공되는 펩티드의 주요한 서열과 관련되지만, 펩티드 QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV, CGTKPIELGPKAVC는 모두 나트륨 흐름에 영향이 거의 없으므로 아밀로라이드 민감성 상피 나트륨 흐름에 대한 활성화 효과도 없고, 반면에 본 발명에 의한 펩티드는 A549 세포를 사용하는 전체 세포 패치 클램프 테스트에 있어서 배스 용액에 첨가했을 때에 펩티드는 대조군값 이상으로 나트륨 흐름의 증가를 유도했다. 따라서, 3개의 비교 펩티드는 A549 세포를 사용하는 전체 세포 패치 클램프 테스트에 있어서 양성 대조군과 비교하여 아밀로라이드 민감성 상피 나트륨 이온 채널에 어떠한 영향을 나타내지 않았지만, 폐포 유체의 클리어런스는 페포 상피 세포 위로 나트륨 이온 이동의 결과이고, 본 발명에 의한 펩티드와 대조적으로 종래기술에 의한 펩티드는 폐부종을 감소시킬 수 없었고, EP 2 009 023 A1에 기재되어 있는 선형 및 환상 펩티드가 각각 특히 바람직한 변형이지만 본 실시예에서 연구되고 있다(QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV 및 CGTKPIELGPDEPKAVC은 EP 2 009 023 A1의 펩티드 SEQ ID NO: 18, 76 및 SEQ ID NO: 2로서 나타내고 있음). 부종의 방지에 있어서 활성이 EP 2 009 023 A1에 기재된 비교 펩티드에 기인하므로, 이것은 보다 주목할만하다.
한편으로는, 본 발명에 의해 제공되는 특성, 특히 고리화 및 코어 서열 TX1EX2X3E 또는 각각의 TPEGAE는 본 발명의 필수적인 특징을 나타냈다. 다른 한편으로는, 본 연구는 이들 펩티드 자체는 종래기술에서 제안된 부종 치료에 적합하다는 가정에 대해 과학적으로 입증된 의심을 정당화했다. 전문가 과학계에서 승인되는 전체 세포 패치 클램프 테스트의 테스트 시스템에 의해 행해지는 본 실시예에서는 활성을 증명하기 위해서 EP 2 009 023 A1에 사용되는 조사 시스템(상기 TEER 테스트)은 분명히 부적합했다.
소개:
건강한 성인의 폐에서 유체 밸런스는 상기 폐 상피 위로 이온 수송 메커니즘에 의존하고, 폐포 유체의 클리어런스에서 Na+ 수송의 참여가 잘 설명되어 있다. 특히, 본 명세서에 있어서 아밀로라이드 민감성 상피 Na+ 채널(ENaC)은 폐포 상피 세포 위로 Na+ 수용에 대한 제한 단계를 나타내고, 폐에서 유체 재흡수에 중요한 역할을 한다. 폐포 유체의 향상된 클리어런스가 폐부종의 경우에 있어서 향상된 예후 및 회복을 직접 이끔으로써, ENaC 활성의 향상은 폐부종의 치료를 위한 유망한 치료 옵션을 제공한다.
유럽 특허 출원 EP 2 009 023 A1에서는 조직에 과도한 유체의 축적을 억제하거나 감소시키는 새로운 분자로서 QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV 및 CGTKPIELGPDEPKAVC 등의 펩티드(펩티드 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 76 및 SEQ ID NO: 2로서 기재되어 있음)가 제안되어 있다.
특허 출원 EP 2 009 023 A1에 의하면, 소위 경상피 전기 저항( transepithelial electrical resistance; TEER) 테스트는 항폐부종 활성 성분 후보들의 스크리닝에 사용했다. 상기 "TEER 테스트"는 폐부종에 유체 클리어런스의 예측을 위해서 설정된 테스트는 아니다(이 테스트는 관련 과학 문헌에서 찾을 수 있고, 또한 인간의 폐에서 가스 교환을 위한 모델에 사용되는 (CALU-3 세포)와 관련이 없다). 본 발명에 의한 펩티드 이외에 본 실시예에 있어서, 상기 펩티드 QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV 및 (고리화) CGTKPIELGPDEPKAVC는 전체 세포 패치 클램프 분석, 세포막 위로 이온 이동의 측정을 위한 증명된 방법에 의해 조사하고, 특히 폐포 상피 세포의 세포막 위로 나트륨 수송을 측정하기 위해서였다(Eaton 외, Fed. Proc. 45 (1986), 2707; Hamill 외, Pflugers Arch. 391 (1981) 85-100). 여기서, 이것은 펩티드가 폐 세포에 흐르는 아밀라이드에 민감한 상피 나트륨 흐름을 활성화할 수 있는지 여부를 테스트하는 것이었다.
EP 2 009 023 A1에 기재된 바와 같이, "TEER 테스트"는 Calu-3 세포의 세포층을 사용한다. 그러나, Calu-3 세포는 기관지 세포이다. 기관지 세포는 가스 교환을 위해서 인간의 폐의 표면의 약 1%를 나타내므로, 가스 교환에 대한 인간의 폐의 표면의 약 99%를 형성하는 폐포 상피 세포에 대한 적절한 모델을 나타내지는 않았다. 본 실시예에 있어서, 이 세포주는 일반적으로 허용되는 실험 기준을 정의하고 폐포 상피 세포에 대한 선택의 모델(Lazrak 외, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278 (2000), 848-857)로서 문헌에서 간주되기 때문에, 인간의 폐포 상피 세포주 A549를 사용했다.
실험 절차
펩티드 조사
펩티드 "AP301"(본 발명에 의한 펩티드):
Cyclo-H-Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys-OH (SEQ ID NO: 1)
합성 펩티드 QRETPEGAEAKPWY:
H-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-OH
(SEQ ID NO: 3; 부종의 치료에 적합한 것으로서 종래 기술에 기재되어 있지만, 본 발명에 의한 형태와 대조적으로 본 실험에서는 고리화되어 있지 않음)
합성 펩티드 TKPIELGPDEPKAV:
H-Thr-Lys-Pro-Ile-Glu-Leu-Gly-Pro-Asp-Glu-Pro-Lys-Ala-Val-OH
(SEQ ID NO: 16; 부종의 치료에 적합한 것으로서 종래 기술에 기재되어 있지만, 본 발명에 의한 펩티드와 대조적으로 고리화되어 있지 않고 코어 서열 TX1EX2X3E 또는 각각 TPEGAE를 함유하지 않음)
합성 펩티드 CGTKPIELGPDEPKAVC:
Cyclo-H-Cys-Gly-Thr-Lys-Pro-Ile-Glu-Leu-Gly-Pro-Asp-Glu-Pro-Lys-Ala-Val-Cys-OH
(SEQ ID NO: 17; 부종의 치료에 적합한 것으로서 종래 기술에 기재되어 있지만, 본 발명에 의한 펩티드와 대조적으로 각각 코어 서열 TX1EX2X3E 또는 각각의 TPEGAE를 함유하지 않음)
펩티드 합성
본 실시예에 있어서 모든 펩티드는 2-클로로트리틸클로라이드 수지에 플루오레닐메틸옥시카르보닐/t-부틸 보호 전략에 따라 고상 펩티드 합성에 의해 제조했다. 디이소프로필카르보디이미드 및 N-히드록시벤조트리아졸은 커플링 시약으로서 사용했다. 모든 커플링 단계는 N-N-디메틸포름아미드 중에서 행했다. 보호된 아미노산은 C-말단 아미노산에서 시작되어 펩티드 쇄에 순차적으로 커플링되었다. 플루오레닐메틸옥시카르보닐의 탈보호는 N-N-디메틸포름아미드 중에서 20% 피페리딘을 행했다. 상기 수지로부터 완료, 부분적으로 보호된 펩티드의 분리는 아세트산 및 디클로로메탄의 1:1 혼합물 중에서 행했다.
펩티드 SEQ ID NO: 1의 경우에 있어서, 상기 수지로부터 분리한 후에 측쇄 탈보호는 95% 트리플루오로아세트산, 5% 물 중에서 행한 후, 약 100시간 동안 pH 8.5에서 산소의 공급(1.2bar에서 O2)에 의해 말단 시스테인 잔기의 산화에 의해 선형 원료 펩티드를 고리화했다.
상기 원료 펩티드 생성물은 5~40% 아세토니트릴의 변화도를 가진 RP-C18 실리카 겔 컬럼 상에서 역상 중압 액체 크로마토 그래피(RP-MPLC)로 정제했다. 최종적으로, 상기 트리플루오로아세테이드 반대 이온은 Lewatit MP64 컬럼(아세테이트 형태) 상에서 아세테이트로 대체했다. 물에서 최종 세척 단계 후에, 정제된 펩티드는 아세테이트염으로서 동결 건조시켜 크림색에 가까운 백색 분말을 얻었다. 펩티드 2의 경우에 있어서, 분자간 이황화 가교는 Lewatit 컬럼으로부터 분리에 있어서 문제를 일으키므로, 이 환상 펩티드는 아세테이트 형태 대신에 트리플루오로아세테이트 형태로 사용했다.
펩티드의 특성
펩티드의 분자 질량은 전자분무 이온화 질량 분석법 또는 MALDI-TOF-MS로 확인하고; 순도는 고성능 액체 크로마토 그래피로 측정했다.
펩티드는 -20℃에서 저장했다.
패치 클램프 프로토콜
A549 세포를 사용하는 전체 세포 패치 클램프 테스트는 Hazemi 외에 기재된 바와 같이 일어났다(J. Med. Chem. 53 (2010), 8021-8029). 펩티드의 용액을 패치 클램프 테스트에서 외부 (배스) 용액에 첨가하여 300nM의 최종 농도에 도달했다. 특정 펩티드의 첨가 후에 흐름의 증가가 관찰되는 경우에 있어서, 아밀로라이드 용액(100mM 최종 농도)은 아밀라이드 둔감성 흐름으로부터 아밀로라이드 민감성을 구별하기 위해서 상기 흐름이 정상 상태에 도달한 후에 배스 용액에 첨가했다. 그 후에, 아밀로라이드의 첨가 이전의 정상 상태의 유량값으로부터 아밀로라이드(아밀로라이드 둔감성)를 첨가한 후에 흐름량을 뺌으로써 상기 아밀로라이드 민감성 흐름을 산출했다. 각각의 펩티드에 대해서, 3개의 실험을 다른 A549 세포에서 행했다(n=3).
결과
86±5pA(AP301의 첨가 전)의 대조군값으로부터 1073±15pA의 최대값으로 활성 Na+ 흐름을 증가시키기 위해서 240nM의 최종 농도에서 A549 세포를 사용한 전체 세포 패치 클램프 테스트에서 배스 용액에 첨가했을 때에, 본 발명에 의한 펩티드; SEQ ID NO: 1("AP301")(양성 대조군 펩티드)을 이끌었다. 아밀로라이드의 후속 첨가는 36pA±5pA로 흐름의 복귀가 발생했다. AP301에 의해 증가된 흐름이 아밀로라이드 민감성 Na+ 흐름을 나타냈다(도 4).
3개의 합성 비교 펩티드, QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV 및 CGTKPIELGPDEPKAVC를 300nM의 최종 농도에서 배스 용액 중에서 A549 세포를 사용하는 별도의 전체 세포 패치 클램프 테스트에 첨가하는 경우, 흐름에 대한 영향을 관찰할 수 없었고: 상기 값은 대조군값의 범위에 포함되었다(도 5-7).
결과의 토론
본 실시예에 있어서, 기능은 A549 세포와 전체 세포 패치 클램프 테스트에서 아밀로라이드 민감성 Na+ 흐름의 증가에 있어서의 양성 대조군으로서 본 발명에 의한 펩티드("AP301")를 나타냈다. 배스 용액에 AP301의 첨가는 86pA±5pA의 대조군값(AP3012의 첨가 전)으로부터 1073±15pA의 최대값(AP301의 첨가 후)으로 진행되는 흐름의 증가로 이어졌다. 아밀로라이드의 후속 첨가는 36pA±5pA로의 복귀가 발생했다. 이것은 AP301이 50pA~1037pA의 아밀로라이드 민감성 Na+ 흐름을 증가시키므로, 폐포 상피 세포의 정점에서 폐에 배치된 아밀로라이드 민감성 상피 Na+ 채널(ENaC)(참조, Tzotzos 외, Pulm. Pharmacol. Ther. 26 (2013), 356-363)에서 AP301의 활성 효과를 확인하는 것을 나타냈다. ENaC의 활성화는 폐포 유체로부터 상피층으로 Na+ 수용의 증가로 이어져, 삼투압 구동력은 폐포 유체의 클리어런스를 뒷받침하도록 증가되고, 상피 아래의 층 사이의 폐포로부터 흐르는 물에 이르게 했다. 상기 메커니즘은 이것에 의해 폐로 직접 투여되는 AP301의 관찰된 폐포 유체 클리어링 효과의 기초를 형성한다.
각각의 3개의 다른 합성 비교 펩티드 QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV 및 CGTKPIELGPDEPKAVC는 마찬가지로 그것이 A549 세포와 전체 세포 패치 클램프 테스에서 배스 용액 중에 첨가되었을 때에 Na+의 흐름에 영향을 주는 능력에 대해서 테스트했다. 그러나, 즉각적인 강화 효과를 나타내는 AP301과는 달리, 본 발명에 의한 펩티드 AP301보다 약간 높은 애플리케이션 농도인 경우에도 다른 3개의 펩티드 중에서는 이들 세포에서의 흐름에 영향은 없었다(3개의 펩티드에 대한 300nM, AP301에 대한 240nM).
실시예 4: 본 발명에 의한 펩티드에 의해 아밀로라이드 민감성 나트륨 이온 채널(ENaC)의 활성화
본 발명에 의한 펩티드 SEQ ID NOS:1 및 11~15는 세포 기반 연구에서 광범위하게 특징되어 진다. 이들 환상 펩티드 SEQ ID NOS: 1 및 11 내지 15는 폐 세포에서 아밀로라이드 민감성 나트륨 이온 채널(ENaC)을 활성화한다. 이로써, 본 발명에 의한 효과를 이전에 조사된 AP301의 이들 펩티드의 동등성이 명확해진다.
펩티드 서열
SEQ ID NO: 1: CGQRETPEGAEAKPWYC: 상기 펩티드의 고리화는 말단 시스테인(C)이 황 가교의 발생으로 산화된 것으로 달성될 수 있었다.
SEQ ID NO: 11: KSPGQRETPEGAEAKPWYE: 상기 환상 펩티드 SEQ ID NO: 11에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 아미노산 글루탐산(E)으로부터 N-말단 아미노산 리신(K)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 N-말단 아미노산 리신(K)은 상기 리신의 측쇄의 엡실론 아미노기의 질소와 상기 글루탐산의 측쇄에 감마 탄소 사이에 아미노 결합에 의해 C-말단 아미노산 글루탐산(E)과 결합되어 있다.
SEQ ID NO: 12: KGQRETPEGAEAKPWYG: 상기 환상 펩티드 SEQ ID NO: 12에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 아미노산 글리신(G)으로부터 N-말단 아미노산 리신(K)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 C-말단 아미노산 리신(K)은 상기 리신의 측쇄의 엡실론 아미노기의 질소와 상기 글리신의 카르복실기의 탄소 사이에 아미노 결합에 의해 C-말단 아미노산 글리신(G)과 결합되어 있다.
SEQ ID NO: 13: 오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG: 상기 환상 펩티드 SEQ ID NO: 13에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 아미노산 글리신(G)으로부터 N-말단 아미노산 오르니틴(Orn)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 N-말단 아미노산 오르니틴(Orn)은 상기 오르니틴의 측쇄의 델타 아미노기의 질소와 상기 글리신의 카르복실기의 탄소 사이에 아미노 결합에 의해 C-말단 아미노산 글리신(G)과 결합되어 있다.
SEQ ID NO: 14: 4-아미노부탄산 GQRETPEGAEAKPWYD: 상기 환상 펩티드 SEQ ID NO: 14에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 아스파르트산(D)으로부터 N-말단 아미노산 글리신(G)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 C-말단 아스파르트산(D)은 한편으로는 상기 N-말단 글리신의 아미노기의 질소와 상기 N-말단 글리신의 아미노기의 질소 사이에 아미노 결합에 의해, 다른 한편으로는 상기 4-아미노부티르산의 아미노기의 질소와 상기 C-말단 아스파르트산의 측쇄의 카르복실기의 탄소 사이에 아미노 결합에 의해 N-말단 아미노산 글리신과 결합되어 있다.
SEQ ID NO: 15: β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE: 상기 환상 펩티드 SEQ ID NO: 15에 있어서, 상기 아미노산은 C-말단 글루탐산(E)으로부터 N-말단 아미노산 글리신(G)으로 펩티드적으로 연결되어 있고, 반면에 상기 C-말단 글루탐산(E)은 한편으로는 상기 N-말단 글리신의 아미노기의 질소와 상기 β-알라닌의 카르복실기의 탄소 C1 사이에 아미노 결합에 의해, 다른 한편으로는 상기 β-알라닌의 아미노기의 질소와 상기 C-말단 글루탐산의 측쇄의 카르복실기의 탄소 사이에 아미노 결합에 의해 N-말단 아미노산 글리신과 결합되어 있다.
SEQ ID NO: 19: CGQREAPAGAAAKPWYC(본 발명에서는 생략): 상기 펩티드 SEQ ID NO: 19의 고리화는 말단 시스테인(C)이 황 가교의 발생으로 산화된 것으로 달성될 수 있었다.
펩티드 합성
고리형 펩티드 SEQ ID NOS: 1, 11~15 및 19는 이하의 단계를 고수하면서, 완전히 자동적으로 Fmoc 고상 합성에 의해 제조했다: 아미노산를 순차적으로 커플링하는 단계; 고상으로부터 선택적으로 분리하는 단계; 정제 및 동결 건조, 선택적으로 고리화하는 단계; 보호기를 분리하는 단계; 정제 및 동결 건조하는 단계; 분석 시험하는 단계.
상기 고리형 펩티드 SEQ ID NOS: 1 및 11~15(본 발명에 있어서) 및 19(본 발명에서는 생략)는 역방향 HPLC에 의해 순도 및 질량에 대해 조사했다.
상기 고리형 펩티드 SEQ ID NO: 1의 순도는 96.3% m/z(ESI) 1924.2(M++1)이었다. 상기 고리형 펩티드 SEQ ID NO: 11의 순도는 96.3% m/z(ESI) 1924.1(M++1)이었다. 상기 고리형 펩티드 SEQ ID NO: 12의 순도는 98.8% m/z(ESI) 1888.2(M++1)이었다. 상기 고리형 펩티드 SEQ ID NO: 13의 순도는 97.4% m/z(ESI) 1873.4(M++1)이었다. 상기 고리형 펩티드 SEQ ID NO: 14의 순도는 99% m/z(MALDI-TOF) 1901.6(M++1)이었다. 상기 고리형 단백질 SEQ ID NO: 15의 순도는 99% m/z(MALDI-TOF) 1902.7(M++1)이었다. 상기 고리형 펩티드 SEQ ID NO: 19의 순도는 95% m/z(MALDI-TOF) 1778.02(M++1).
본 발명에 의한 모든 펩티드 SEQ ID NOS: 1, 11~15는 이하의 공유 구조적 특징을 갖는다:
서열: X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2,
여기서, X1은 1개의 아미노산 또는 1~4개의 아미노산, 특히 1~3개의 아미노산을 나타내고, 상기 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산이고,
X1은 아미노산 C, K, 오르니틴, 4- 아미노부티르산, β-알라닌, 또는 서열 KSP를 나타내고,
X2는 천연 또는 비천연 아미노산이어도 좋고,
X2는 아미노산 C, D, G 또는 E이어도 좋고,
X1은 상기 N-말단 아미노산이고 X2는 C-말단 아미노산이다.
아밀로라이드 민감성 나트륨 이온 채널(ENaC)의 전기 생리학적 조사
거시적인 나트륨 이온 흐름은 "패치 클램프" 기술에 의해 "전체 세포" 구성으로 인간의 폐 상피 세포 A549로부터 유래되었다(Hamill 외, Pflugers Arch. 391 (1981), 85-100). 이하의 배스 용액 및 전극 용액을 구성하는 "전체 세포"에 있어서의 흐름 유도에 대해서 이하를 사용했다:
배스 용액: 135mM 나트륨 메탄술포네이트, 10mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.8mM CaCl2, 2mM MgCl2, 5.5mM 글루코오스, 및 10mM HEPES, pH 7.4.
전극 용액: 120mM 칼륨 메탄술포네이트, 15mM KCl, 6mM NaCl, 1mM Mg2ATP, 2mM Na3ATP, 10mM HEPES, 0.5mM EGTA(pH 7.2).
1ml의 실험용 배스로 이송된 그 안에 배양된 세포와 커버 슬립을 현미경 테이블(Axiovert 100, 400×배율) 상에 고정하고, 상기 세포를 상술한 배스 용액에 부었다. 그 후에, 상기 흐름은 적절한 세포(커버 슬립에 부착되는)로부터 유래되었다. 이에 대하여, 전해질 용액으로 채워진 미세 전극(약 1~3㎛의 열 연마 팁 개구로 정의된 유리 모세관은 3~5MΩ의 전극 팁의 저항에 상응함)을 상기 세포에 놓고, 누설 전류를 최소화하기 위해서 상기 세포와 상기 막을 흡입하여 "기가옴 씰"을 막과 전극 사이에 형성했다. "전체 세포 구성"에 대하여, 상기 막을 상기 전극 팁 아래로 관통하여 상기 세포의 모든 이온 채널을 통하여 흐르는 흐름을 측정했다. "기가옴 씰"을 얻기 위해서, 정의된 막 홀딩 전위는 전치 증폭기(CV-4 Headstage, Axon Instruments) 및 증폭기(Axopatch 1D, Axon Instr.), 및 이온 채널을 통하여 흐르는 흐름을 측정했다.
펄스 프로토콜은 5초 동안 -100mV에서 세포막의 과분극 및 20mV 단계에서 +100mV 후속 증분 감극으로 이루어져 있었다.
이 프로토콜은 환상 단백질의 첨가 이전(대조군)과 이후에 행했다. 이와 같이 하여 얻어진 흐름은 PCLAMP 6.0프로그램에 의해 저장 및 분석했다. 이에 대하여, 아밀로라이드의 존재 하에서 얻어진 흐름 유도는 이전에 등록된 흐름으로부터 뺌으로써 상피 나트륨 채널을 통한 아밀로라이드 민감성 나트륨 흐름을 결정할 수 있었다.
측정의 결과는 표 1에 요약되어 있다. 각각의 펩티드의 활성은 EC50(nM으로)으로서 표시되어 있다. 상기 EC50은 측정된 최대 활성(즉, 흐름의 강도, I의 최대 증가)의 50%에서 유효 농도이었다.
표 1은 세포의 아밀로라이드 민감성 나트륨 이온 흐름에 대하여 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 11~15에 의한 펩티드, 및 본 발명에 의하지 않는 SEQ ID NO: 19의 활성을 나타낸다. 상기 활성은 최대 활성(EC50)의 50%에서 유효 농도로서 나타낸다.
Figure pct00001
환상 펩티드 SEQ ID NOS: 1 및 11~15의 활성은 농도의 함수로서 도 8에 나타낸다. 최대의 활성은 100%로 나타냈다.
본 발명에 의한 펩티드 SEQ ID NOS: 1 및 11~15는 생물학적 활성이고, 반면에 본 발명에 의하지 않는 펩티드 SEQ ID NO:19는 활성이 없는 것을 예시된 조사에 나타냈다. 상기 환상 펩티드 SEQ ID NOS: 1 및 11~15와 상기 환상 펩티드 SEQ ID NOS: 19 사이의 차이는 일반적인 펩티드 서열 X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2 내에 구성되어 있고, 상기 아미노산 T(5번째 위치) 및 아미노산 E(7번째 위치) 및 아미노산 E(10번째 위치)는 알라닌으로 교환했다. 따라서, 상기 서열 TPEGAE는 필수적이다. X1 및 X2의 구조는 활성에 본질적인 영향을 주지 않았다.
(서열의 요약)
SEQ ID NO: 1 CGQRETPEGAEAKPWYC
SEQ ID NO: 2 TPEGAE
SEQ ID NO: 3 QRETPEGAEAKPWY
SEQ ID NO: 4 PKDTPEGAELKPWY
SEQ ID NO: 5 CGPKDTPEGAELKPWYC
SEQ ID NO: 6 CGQKETPEGAEAKPWYC
SEQ ID NO: 7 CGQRETPEGAEARPWYC
SEQ ID NO: 8 CGQRETPEGAEAKPC
SEQ ID NO: 9 CQRETPEGAEAKPWYC
SEQ ID NO: 10 CGQRETPEGAEAKFWYC
SEQ ID NO: 11 KSPGQRETPEGAEAKPWYE
SEQ ID NO: 12 KGQRETPEGAEAKPWYG
SEQ ID NO: 13-오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG
SEQ ID NO: 14 4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD
SEQ ID NO: 15 β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE
SEQ ID NO: 16 TKPIELGPDEPKAV
SEQ ID NO: 17 CGTKPIELGPDEPKAVC
SEQ ID NO: 18 GQRETPEGAEAKPWY
SEQ ID NO: 19 CGQREAPAGAAAKPWYC
SEQ ID NO: 20 TXEXXE
SEQUENCE LISTING <110> APEPTICO FORSCHUNG UND ENTWICKLUNG GMBH <120> Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der durch Sauerstoffarmut und verringerten Luftdruck vermittelten pulmonalen Form der H?enkrankheit <130> R 63872 <150> EP 12173983.3 <151> 2012-06-28 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 1 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 2 Thr Pro Glu Gly Ala Glu 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 3 Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 4 Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 5 Cys Gly Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 6 Cys Gly Gln Lys Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 7 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Arg Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 8 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Cys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 9 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 10 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Phe Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 11 Lys Ser Pro Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro 1 5 10 15 Trp Tyr Glu <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 12 Lys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Orn <400> 13 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> 4Abu <400> 14 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Asp <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> beta-Ala <400> 15 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Glu <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 16 Thr Lys Pro Ile Glu Leu Gly Pro Asp Glu Pro Lys Ala Val 1 5 10 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 17 Cys Gly Thr Lys Pro Ile Glu Leu Gly Pro Asp Glu Pro Lys Ala Val 1 5 10 15 Cys <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 18 Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <400> 19 Cys Gly Gln Arg Glu Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetisches Peptid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(5) <223> unbekannt oder sonstige <400> 20 Thr Xaa Glu Xaa Xaa Glu 1 5

Claims (10)

  1. 고산병의 폐 형태의 치료 및 예방 용도의 펩티드로서,
    7~20개, 특히 7~17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고, 헥사머 TX1EX2X3E를 포함하고(여기서, X1, X2 및 X3은 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있고),
    TNF 수용체 결합 활성을 갖지 않고, 고리화되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    7~20개, 특히 7~17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고, 헥사머 TPEGAE를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 고리화 펩티드는 CGQRETPEGAEAKPWYC, CGPKDTPEGAELKPWYC, CGQKETPEGAEAKPWYC, CGQKETPEGAEAKPWYC, CGQRETPEGAEARPWYC, CGQRETPEGAEAKPC, CQRETPEGAEAKPWYC, CGQRETPEGAEAKFWYC, KSPGQRETPEGAEAKPWYE, KGQRETPEGAEAKPWYG, 오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG, 4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD, β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE, 및 적어도 7개의 그 아미노산의 프레그먼트로 이루어진 군으로부터 선택된 연속적인 아미노산의 서열로 이루어지고, 상기 프레그먼트는 상기 헥사머 TPEGAE를 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산 서열 CGQRETPEGAEAKPWYC를 포함하고, C 잔기를 통하여 고리화되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    C 잔기 사이의 이황화 가교에 의해 고리화되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하는 약학 조성물로서,
    인간에게 투여하기에 적합한 약학 조성물로 처방되고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    물, 특히 주사용수, 식염, 인산나트륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리신, 글리실글리신, 히스티딘, 리신, 아르기닌, TRIS, 구연산나트륨, 링거액, 덱스트로스, 만니톨, 트레할로오스, 사카로오스, 소르바이트, 프룩토오스, 말토오스, 락토오스 또는 덱스트란, 행크 용액, 고정유, 에틸올레이트, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 방부제, 약학적으로 허용가능한 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산 및 아미노산 공중합체로부터 선택되는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 펩티드를 1㎍~10g, 바람직하게는 10㎍~1g, 특히 1mg~100mg의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    액상으로 존재하고, 상기 펩티드를 1㎍~10g, 바람직하게는 10㎍~1g, 특히 1mg~100mg의 양으로 포함하고, 0.5~10ml, 특히 0~5ml의 체적으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드는 분무형 분말 제형 또는 분무형 액체 제형으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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