ES2602197T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montaña causada por falta de oxígeno y presión atmosférica reducida - Google Patents

Abstract

Péptido, que consiste en 7-20, especialmente 7-17 aminoácidos adyacentes y que comprende el hexámero TX1EX2X3E, en donde X1, X2 y X3 pueden ser cualquier aminoácido natural o no natural, en donde el péptido no presenta ninguna actividad de unión a receptor de TNF y está ciclado, para la aplicación en el tratamiento y la prevención de la forma pulmonar del mal de montaña.

Description

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DESCRIPCION

Composicion farmaceutica para el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana causada por falta de oxfgeno y presion atmosferica reducida

La presente invencion se refiere al tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana causada por falta de oxfgeno y presion atmosferica reducida.

El mal de montana se puede presentar en seres humanos desde una altura de mas de 2500 m por encima del nivel del mar. A una altura superior a 2500 metros, la concentracion de oxfgeno y la presion atmosferica disminuyen de manera considerable. Se realiza una diferenciacion entre las formas cerebral y pulmonar de mal de montana agudo. El mal de montana agudo, por lo tanto, se presenta en el cerebro y tambien en el pulmon. La primera descripcion clmica detallada de mal de montana se llevo a cabo durante una expedicion al Mont Blanc en 1891. Por lo menos cuatro miembros de la expedicion presentaron mal de montana, muriendo uno de los miembros el 2 de septiembre de 1891 a una altura de 4000 m. A partir de estos casos, el mal de montana se considera que es una condicion clmica individual que pone en peligro la vida.

Si no se trata, la forma pulmonar del mal de montana puede llevar a la muerte en menos de 24 horas, produciendose la muerte con frecuencia a traves de una embolia pulmonar secundaria.

El tratamiento mas eficaz para todas las formas de mal de montana agudo es el suministro de oxfgeno, por ejemplo por descenso rapido del enfermo a altitudes mas bajas, o por medio de oxfgeno embotellado o por medio de una camara hiperbarica portatil. No obstante, en regiones montanosas con frecuencia no es posible un descenso rapido. La ventilacion con oxfgeno, por ejemplo con oxfgeno embotellado ciertamente reduce la presion arterial pulmonar aumentada, pero no la normaliza. Tambien en el caso de una camara hiperbarica portatil el efecto positivo es solo temporal. El exito del tratamiento desaparece en pacientes inmediatamente despues de abandonar la camara hiperbarica cuando se vuelven ffsicamente activos de nuevo.

Un tratamiento medicamentoso del mal de montana a dfa de hoy unicamente es limitado y genera controversia: asf, se sugiere dexametasona en mal de montana agudo grave y tambien espedficamente en la forma cerebral del mal de montana. Ademas, se ha discutido si los inhibidores de PDE-5, los cuales se usan para el tratamiento de hipertension arterial pulmonar primaria (clasificacion de Dana Point 1) tambien estan indicados para la hipertension pulmonar secundaria a causa de la falta de oxfgeno en las alturas (clasificacion de Dana Point 3).

Tambien se han propuesto posibilidades de tratamiento natural para el mal de montana (tambien de modo preventivo) (te de hojas de arbusto de coca; te de mantequilla de yak; preparaciones las cuales contienen ginkgo como principio activo).

No obstante, debe hacerse notar que actualmente la posibilidad de tratamiento medicamentoso de la forma pulmonar del mal de montana aun es muy limitada. Ademas, se sabe que operaciones de rescate organizadas unicamente se pueden considerar en la region alpina europea y parcialmente tambien en la region de Norteamerica. En regiones montanosas alejadas del mundo y en altitudes extremas, las operaciones de rescate y el auxilio medico en urgencias (con el uso de oxfgeno embotellado o una camara hiperbarica portatil) son escasamente posibles. El suministro de un tratamiento medicamentoso eficiente de mal de montana por lo tanto sena necesario con urgencia, tambien como componente de un paquete de emergencia para montaneros, quienes pueden encontrarse en riesgo de desarrollar mal de montana.

En el documento EP 2 009 023 A1 se proponen peptidos nuevos para el tratamiento de edemas. Estos peptidos se evaluan a este respecto por la prueba de "TEER" (siglas en ingles para "resistencia electrica transepitelial") usando celulas Calu-3, lo cual no constituye un sistema de prueba establecido para eliminacion de lfquido en edemas pulmonares (eliminacion de fluido de edema pulmonar). Las celulas Calu-3 de hecho son celulas bronquiales que unicamente constituyen aproximadamente el 1 % de la superficie del pulmon que sirve para intercambio de gases. En contraste, las celulas alveolares constituyen el 99 % de la superficie del pulmon que sirve para intercambio de gases (Hollenhorst y col., J. Biomed. Biotechnol. 2011 (2011), doi: 10.1155/2011/174306). En contraste con la prueba de TEER, la lmea de celulas epiteliales alveolares humanas A549 se ha establecido como la norma experimental aceptada como un modelo para celulas epiteliales alveolares (Lazrak y col., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278 (2000), L848-57).

Por lo tanto, un objetivo de la presente invencion es mejorar claramente las posibilidades para el tratamiento medicamentoso de pacientes con la forma pulmonar del mal de montana y poner a disposicion un medio mediante el cual esta enfermedad pueda tratarse eficazmente, pero tambien evitarse.

En consecuencia, la presente invencion se refiera a un peptido que consiste en de 7-20, especialmente 7-17 aminoacidos adyacentes y comprende el hexamero TX1EX2X3E, en donde X1, X2 y X3 puede ser cualquier aminoacido natural o no natural, en donde el peptido no tiene actividad de union de receptor de TNF y esta ciclado, para la aplicacion para el tratamiento y la prevencion de la forma pulmonar del mal de montana.

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Con la presente invencion, por primera vez esta disponible un tratamiento medicamentoso para la forma pulmonar del mal de montana. Por lo tanto, una "designacion de farmaco huerfano" tambien se ha otorgado inmediatamente para la presente invencion y en concreto tanto por la EMA (EMA/OD/144/12) como por la FDA de EEUU (12-3829). Esto muestra la urgente necesidad de una posibilidad de tratamiento para esta enfermedad, lo cual se cumple con la presente invencion.

Los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion en sf ya se conocen desde hace tiempo, por ejemplo, por la patente europea EP 1 264 599 B1, el documento US 2007/299003 A, WO 94/18325 A1, WO 00/09149 A1, WO 2006/013183 A1 o WO 2008/148545 A1. En el transcurso de los experimentos de la presente invencion, ahora se ha reconocido que estos peptidos sorprendentemente tambien son adecuados para el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana, de manera que por lo tanto por primera vez se puede poner a disposicion para esta indicacion una forma de tratamiento medicamentoso sencillo y eficiente.

Estos peptidos -en sf conocidos-, los cuales se usan de acuerdo con la invencion, no tienen actividad de union a receptor de TNF (Hribar y col., Eur. J. Immunol. 1999; Elia y col., ARJCCM 2003; vease tambien: seccion de Ejemplos mas adelante) y estan ciclados. Las variantes preferidas de estos peptidos consisten en 7-17 aminoacidos adyacentes y contienen el hexamero TPEGAE (SEQ ID NO: 2).

El mal de montana agudo siempre comienza con hipoxia subaguda. Subsecuentemente, la hipoxemia e hipercapnia llevan a vasodilatacion, la hipocapnia a vasoconstriccion. En altitud, resultan diferentes efectos ahora de hipoxemia e hipocapnia: en el pulmon predomina la vasoconstriccion, en el cerebro, la vasodilatacion.

La causa del mal de montana agudo se encuentra en una adaptacion fallida, principalmente en un incremento de ventilacion individualmente demasiado reducido (hipoventilacion relativa). Las consecuencias son una hipoxemia mas marcada, mayor presion arterial pulmonar, mayor presion intracraneal, retencion de lfquidos y eritropoyesis disminuida.

La forma pulmonar del mal de montana es causada por falta de oxfgeno y presion atmosferica reducida y es un cambio de la funcion pulmonar que pone en peligro la vida y se presenta principalmente a alturas de entre 2500 y 6000 m. Dos tercios de todos los casos se presentan entre 3000 y 4500 m por encima del nivel del mar. La forma pulmonar del mal de montana es la causa mas frecuente de muerte del mal de montana agudo.

La forma pulmonar del mal de montana con frecuencia comienza caractensticamente despues de exceder la altura umbral de aproximadamente 2500 m.

La vasoconstriccion hipoxica, heterogenea, excesiva en el pulmon genera areas hiperperfundidas del pulmon con infiltrados agudos. La hipertension pulmonar aumentada en gran medida como un resultado de una vasoconstriccion hipoxica heterogenea es una expresion, principalmente en areas perifericas del pulmon, de una respuesta vascular pulmonar hipoxica aumentada en gran medida (HPVR, por sus siglas en ingles) en seres humanos previamente sanos en su totalidad. Un incremento en la presion arterial pulmonar en realidad es fisiologica bajo hipoxia, pero es considerablemente mas notable en gran medida en la forma pulmonar del mal de montana. No obstante, la permeabilidad capilar pulmonar no se incrementa bajo hipoxia.

Esto contrasta claramente con otras enfermedades agudas de pulmon tales como por ejemplo lesion aguda del pulmon (ALI), smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) o edema por hiperpermeabilidad, el cual se puede presentar ya sea en la forma primaria a traves de la accion directa de una noxa o una forma secundaria como una consecuencia de otras enfermedades. Las lesiones pulmonares mas frecuentes en ALI, ARDS y en edema por hiperpermeabilidad son neumoma bacteriana y viral, contusion del pulmon, aspiracion de jugo gastrico, traumatismo por inhalacion, intoxicaciones por habito de fumar, casi ahogamiento, transfusiones de sangre masivas, septicemia, politraumatismo, derivacion cardiopulmonar o quemaduras extensas. En estas enfermedades pulmonares, la reaccion inflamatoria con lesion concomitante de las paredes alveolares estan en primer plano. Esta condicion genera una compleja activacion de procesos inmunitarios pro- y antiinflamatorios, lo que lleva a lesion inflamatoria del epitelio alveolar y del endotelio de los vasos. Las consecuencias son perdida de alveolocitos y tensioactivo, la presentacion de una fuga capilar con salida de protemas de plasma y formacion de edema intersticial. Los cambios inflamatorios tfpicamente son como parches y se distribuyen de modo heterogeneo a lo largo de la totalidad del pulmon. La infiltracion, el edema intersticial y alveolar finalmente llevan a atelectasias y a signos clmicos de hipoxemia arterial e hipertension pulmonar. Estas reacciones inflamatorias no tienen significancia patologica en el mal de montana.

La incidencia de una forma pulmonar clmicamente manifiesta del mal de montana se encuentra por encima de 3500 m en aproximadamente el 15 %, con mortalidad que se encuentra en el 44 % de los pacientes no tratados.

La incidencia de mal de montana no se correlaciona con el VO2max, el estado de entrenamiento, la presion sangumea, la alimentacion, el habito de fumar cigarros o la edad (en contraste con la lesion pulmonar aguda (ALI/ARDS), en el cual sobre todo el habito de fumar cigarros y la edad avanzada representan factores de riesgo considerables), pero ciertamente, de manera parcial con la respuesta de ventilacion hipoxica (HVR) individual y con el destino de montana o la velocidad de ascenso.

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Las diferencias entre el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana por una parte y ALI/ARDS por la otra tambien se han considerado por las autoridades de medicamentos EMA y FDA de eEuU en la autorizacion de la presente invencion como "indicacion huerfana" expresamente como base en el examen de estas autorizaciones. Esta diferenciacion resulta, por una parte, ya unicamente del sistema de clasificacion de diagnostico internacional (ICD) de la Organizacion Mundial de la Salud (OMS): la forma pulmonar del mal de montana se clasifica bajo el capftulo XIX (lesiones, envenenamientos y otras consecuencias determinadas de causas externas), grupo de enfermedad T66-T78 (Otras lesiones y lesiones no especificadas por causas externas), enfermedad clase T70 (lesiones por presion atmosferica y del agua), subcategona T70.2 (otras lesiones y lesiones no especificadas por altitud elevada), mientras que ALI/ARDS se clasifica en un capftulo completamente diferente (Capftulo X (enfermedades del sistema respiratorio), grupo de enfermedades J80-J84 (otras enfermedades de los organos respiratorios que afectan principalmente al intersticio), enfermedad clase J80 (smdrome de dificultad respiratoria del adulto [ARDS])). El campo cftnico es diferente (medicina ambiental, ocupacional y deportiva para la forma pulmonar del mal de montana; anestesia y medicina intensa para ALI/ARDS). La etiologfa es fundamentalmente diferente. La forma pulmonar del mal de montana se desarrolla en personas por lo demas sanas sin condiciones clrnicas subyacentes o existentes de antemano a traves de un ascenso rapido, sin aclimatacion por montaneros sanos a alturas superiores a 3000 m o cambios en las condiciones ambientales, mientras que aLi/ARDS es causado por condiciones clrnicas previas y como una consecuencia de una fisiopatologfa subyacente (el paciente padece de antemano de otra condicion cftnica definible) tal como: infeccion grave o inflamacion, la cual es local o sistemica (porejemplo, en el caso de septicemia), aspiracion (porejemplo, por jugo gastrico), inhalacion de gases calientes o venenosos, transfusiones de sangre multiples, casi ahogamiento, contusion de pulmon, politraumatismo, quemaduras, embolia grasa, etc.); de igual manera, la fisiopatologfa. En la forma pulmonar del mal de montana, una respuesta ventilatoria insuficiente y una fuerte reaccion de vasoconstriccion poco habitual generan hipoxia, despues de lo cual (tambien debido a hiperactividad simpatica (neurogenica)) se presentan presion pulmonar aumentada, estres endotelial y salida capilar; en ALI/ARDS, la lesion alveolar, la salida de ftquido rico en protemas el espacio intersticial y alveolar y una liberacion extensa de citocinas y migracion de neutrofilos llevan a un intercambio de gases reducido en el pulmon).

No obstante, principalmente, la forma pulmonar del mal de montana y ALI/ARDS tambien difieren en el papel el cual tienen los procesos inflamatorios en estas enfermedades. Los procesos inflamatorios siempre preceden a ALI/ARDS; estos procesos inflamatorios desempenan un papel principal en la fisiopatologfa. En contraste, los procesos inflamatorios apenas desempenan un papel en la forma pulmonar del mal de montana; se producen, en caso de que suceda, unicamente como un rasgo secundario, pero no como causa de la enfermedad. Mientras que, por lo tanto, en ALI/ARDS una secrecion aumentada de moduladores proinflamatorios del endotelio y neutrofilos, respuestas inflamatorias por activacion de neutrofilos y liberacion de citocinas, un contenido elevado de citocinas y protemas en el ftquido de lavado broncoalveolar (BALF), presencia de neutrofilos y macrofagos en BALF y permeabilidad microvascular aumentada del pulmon causada por una inflamacion aguda representan signos claros de inflamacion, estos estan completamente ausentes por lo menos en la fase inicial de la forma pulmonar del mal de montana. Los analisis de BALF muestran, en la forma pulmonar del mal de montana, que no hay incremento en leucocitos o moduladores proinflamatorios y no hay diferencia en la protema A tensioactiva y la protema de celulas Clara.

Finalmente, el diagnostico de la forma pulmonar del mal de montana y ALI/ARDS es completamente diferente: La forma pulmonar del mal de montana se presenta en montaneros no aclimatados sanos y se desarrolla dentro de dos a cinco dfas despues de la llegada a una altitud elevada. Aqrn, la presion de las arterias pulmonares esta aumentada anormalmente, pero la presion de cuna permanece normal. En ALI/ARDS, como se ha mencionado, siempre existe una condicion cftnica inicial (por ejemplo, septicemia). La presion de cuna es de < 18 mmHg, ademas generalmente no existe indicacion cftnica para presion alta auricular izquierda (no hay presion aumentada en la arteria pulmonar); la relacion PaO2/FiO2 es < 300 (ALI) en estado estable.

La forma pulmonar del mal de montana y ALI/ARDS por lo tanto son dos enfermedades las cuales son completamente diferentes entre sf (Peacock, Eur. Respir. J. 8 (1995), 1819-1821).

Preferentemente, la presente invencion se refiere a un peptido el cual consiste de 7-20, especialmente 7-17 aminoacidos adyacentes y comprende el hexamero TPEGAE (SEQ ID NO: 2), en donde el peptido no tiene la actividad de union a receptor de TNF y esta ciclado, para la aplicacion en el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana.

Una forma de realizacion particularmente preferida de la presente invencion se refiere a un peptido ciclado para la aplicacion que consiste en una secuencia de aminoacidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en

- QRETPEGAEAKPWY (SEQ ID NO: 3)

- PKDTPEGAELKPWY (SEQ ID NO: 4)

- CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 1),

- CGPKDTPEGAELKPWYC (SEQ ID NO: 5),

- CGQKETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 6),

- CGQRETPEGAEARPWYC (SEQ ID NO: 7),

- CGQRETPEGAEAKPC (SEQ ID NO: 8),

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- CQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 9),

- CGQRETPEGAEAKFWYC (SEQ ID NO: 10),

- KSPGQRETPEGAEAKPWYE (SEQ ID NO: 11),

- KGQRETPEGAEAKPWYG (SEQ ID NO: 12),

- ornitina-GQRETPEGAEAKPWYG (SEQ ID NO: 13),

- acido 4-aminobutanoico-GQRETPEGAEAKPWYD (SEQ ID NO: 14),

- p-alanina- GQRETPEGAEAKPWYE (SEQ ID NO: 15)

y fragmentos de por lo menos 7 aminoacidos de los mismos, los cuales tienen el hexamero TPEGAE, para la aplicacion o para la produccion de un medicamento para el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana.

Preferentemente, el peptido para la aplicacion comprende la secuencia de aminoacidos CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 1) y esta ciclado via los residuos C. Este peptido particularmente preferido para la aplicacion por lo tanto tiene la siguiente secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 1) (NH2)Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala- Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys(COOH).

La ciclacion de los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion se puede obtener aqm, por ejemplo, ya sea por ciclacion directa a traves de un puente disulfuro entre los dos residuos C en el extremo N y C o al acoplarse el peptido por medio de ambas cistemas a una sustancia portadora. Aqm, en los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion los residuos cistema preferentemente se proporcionan al inicio y al final de la molecula. Otros grupos funcionales los cuales obtienen una ciclacion del peptido tambien se pueden usar, por ejemplo, al llevar un grupo acido con una amina o un alcohol a un cierre de anillo amida o ester (aqm, por ejemplo, los aminoacidos acido aspartico y acido glutamico pueden ciclarse con serina, treonina, tirosina, asparagina, glutamina o lisina, preferentemente de manera intramolecular). La ciclacion de los peptidos se produce preferentemente a traves de un puente disulfuro entre los residuos C del peptido (si estan presentes). No obstante, los residuos cistema u otros grupos funcionales tambien se pueden proporcionar sobre la sustancia portadora, en particular sobre una protema portadora, que unen el extremo No el extremo C de los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion y asf aseguran la naturaleza ctelica de los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion.

A este respecto, por supuesto tambien cualquier referencia a un peptido "de acuerdo con la invencion" para la aplicacion en la presente es la referencia a un peptido ciclado.

La ciclacion por medio de residuos cistema se prefiere particularmente, en particular por medio de residuos cistema los cuales se proporcionan al inicio y al final de los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion o se introducen adicionalmente y/o a traves de residuos cistema en un portador, en el extremo N y C del peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion. La ciclacion intramolecular de los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion por medio de los residuos cistema proporcionados o introducidos adicionalmente en el extremo N y C se prefiere particularmente.

Otros peptidos preferidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion, por lo tanto, son por ejemplo CGQKETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 6), CGQRETPEGAEARPWYC (SEQ ID NO: 7), CGQRETPEGAEAKPC (SEQ ID NO: 8), CQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 9) o CGQRETPEGAEAKFWYC (SEQ ID NO: 10).

Un grupo adicional de peptidos preferidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion son peptidos ctelicos con una secuencia X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2, en donde X1 representa 1 a 4 aminoacidos, en particular 1 o 3 aminoacidos, estos aminoacidos son aminoacidos naturales o no naturales, en particular, X1 representa el aminoacido C, K, ornitina, acido 4-aminobutmco, p-alanina o la secuencia KSP, X2 puede ser un aminoacido natural o no natural en donde X2 es en particular el aminoacido C, D, G o E y en donde X1 es el aminoacido N-terminal y X2 es el aminoacido C-terminal (GQRETPEGAEAKPWY corresponde a la SEQ ID NO: 18). Son ejemplos particularmente preferidos de esta secuencia X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2 los peptidos ctelicos

KSPGQRETPEGAEAKPWYE, KGQRETPEGAEAKPWYG, ornitina-GQRETPEGAEAKPWYG, acido 4- aminobutanoico-GQRETPEGAEAKPWYD, p-alanina-GQRETPEGAEAKPWYE.

En el peptido ctelico KSPGQRETPEGAEAKPWYE, los aminoacidos estan unidos pepttelicamente desde el aminoacido C-terminal acido glutamico (E) al aminoacido N-terminal lisina (K) mientras que el aminoacido N-terminal lisina (K) esta conectado con el aminoacido C-terminal acido glutamico (E) por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino epsilon de la cadena lateral de la lisina y el carbono gamma en el grupo lateral del acido glutamico.

En el peptido ctelico KGQRETPEGAEAKPWYG, los aminoacidos estan unidos pepttelicamente desde el aminoacido C-terminal glicina (G) al aminoacido N-terminal lisina (K), mientras que el aminoacido N-terminal lisina (K) esta conectado con el aminoacido C-terminal glicina (G) por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino epsilon de la cadena lateral de la lisina y el carbono del grupo carboxilo de la glicina.

En el peptido ctelico ornitina-GQRETPEGAEAKPWYG, los aminoacidos estan unidos pepttelicamente desde el aminoacido C-terminal glicina (G) al aminoacido N-terminal ornitina (Orn), mientras que el aminoacido N-terminal ornitina (Orn) esta conectado con el aminoacido C-terminal glicina (G) por medio de un enlace amida entre el

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nitrogeno del grupo amino delta de la cadena lateral de la ornitina y el carbono del grupo carboxilo de la glicina.

En el peptido dclico acido 4-aminobutanoico-GQRETPEGAEAKPWYD, los aminoacidos estan unidos peptidicamente desde el acido aspartico C-terminal (D) al aminoacido N-terminal glicina (G), mientras que el acido aspartico C-terminal (D) esta conectado con el aminoacido N-terminal glicina por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino de la glicina N-terminal y el carbono C1 del grupo carboxilo del acido 4-aminobutmco por una parte, y por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino del acido 4-aminobutmco y el carbono del grupo carboxilo de la cadena lateral del acido aspartico C-terminal por la otra.

En el peptido dclico p-alanina-GQRETPEGAEAKPWYE, los aminoacidos estan unidos periodicamente desde el acido glutamico C-terminal (E) al aminoacido N-terminal glicina (G), mientras que el acido glutamico C-terminal (E) esta conectado con el aminoacido N-terminal glicina por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino de la glicina N-terminal y el carbono C1 del grupo carboxilo de la p-alanina por una parte, y por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino de la p-alanina y el carbono del grupo carboxilo de la cadena lateral del acido glutamico C-terminal por la otra.

La ciclacion en los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion se puede llevar a cabo, como se ha mencionado, no obstante tambien por union del peptido a sustancias portadoras. Se consideran como tales sustancias portadoras de ciclacion todas las sustancias habituales de uso farmaceutico las cuales son susceptibles, por ejemplo, de establecer un enlace covalente con los grupos SH de las cistemas (o con otros grupos presentes de manera natural o introducidos artificialmente, qmmicamente reactivos, del peptido), en donde las protemas portadoras establecidas, tales como hemocianina de lapa californiana (KLH), toxina del tetanos, etc., son particularmente adecuadas. Ademas, se pueden proporcionar residuos bifuncionales adyacentes en el portador (por ejemplo, un grupo acido adyacente a un grupo amina o alcohol). En este contexto es importante que "ciclar" incluye tanto el cierre de anillo intramolecular como la union de un portador (del cual se proyecta el peptido unido (al estar unido el extremo N y C del peptido al portador), en donde el peptido ciclado de esta manera muestra la estructura espacial dclica y esta estabilizado en conformidad.

Un grupo de peptidos particularmente preferidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion por lo tanto es el grupo con las sEq ID No: 1 y 5 a 15.

Los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion tienen en particular un efecto activador sobre el canal de ion sodio epitelial sensible a amilorida (ENaC). Esta propiedad se puede comprobar ventajosamente con la metodologfa de acuerdo con Eaton y col., (Fed. Proc. 45 (1986), 2707) y Hamill y col. (Pflugers Arch. 391 (1981), 85100), como se presenta en la seccion de Ejemplos.

Preferentemente, el peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion para el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana se pone a disposicion en una composicion farmaceutica para la aplicacion la cual comprende un portador farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica preferentemente se prepara aqrn en una forma la cual es adecuada para la administracion a seres humanos.

La expresion "una composicion farmaceutica" se refiere a cualquier composicion la cual comprende un peptido, como se define en lo anterior (naturalmente tambien mezclas adecuadas (es decir, que no interfieran negativamente entre sf) del peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion con principios activos adicionales; no obstante, se prefiere proporcionar el peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion como principio activo unico, que impide, mejora o sana las condiciones descritas en la presente. En particular, la expresion "una composicion farmaceutica" se refiere a una composicion la cual tiene un peptido, como se describe en lo anterior, y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable (ambos terminos se pueden usar de manera intercambiable). Son ejemplos adecuados de portadores o excipientes los cuales se conocen por el experto agua, solucion salina, fosfato de sodio, acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, arginina, TRIS y citrato de sodio o mezclas de los mismos. Por supuesto, la solucion Ringer, solucion de dextrosa o soluciones de azucares no reducibles tambien se pueden usar; en consecuencia, manitol, trehalosa, sacarosa, sorbitol, fructosa, maltosa, lactosa o dextrano, solucion de Hank, aceites fijos, oleato de etilo, dextrosa 5 % en solucion salina, sustancias que mejoren la isotonicidad y la estabilidad qrnmica, tampones y conservantes tambien son adecuados como estos portadores. Otros portadores adecuados incluyen cualquier portador el cual por sf mismo no induzca la produccion de anticuerpos los cuales sean daninos para el individuo que recibe la composicion, tales como protemas, polisacaridos, poli(acidos lacticos), poli(acidos glicolicos), aminoacidos polimericos y copolfmeros de aminoacidos. En la formulacion de la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion, por supuesto, deben seguirse las directrices pertinentes (por ejemplo, la farmacopea (europea o de Estados Unidos)). Aqrn, el peptido proporcionado en la composicion de acuerdo con la invencion para la aplicacion, como se menciona, tambien puede ser ciclado por union covalente directa a estos portadores.

La composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion para la aplicacion se puede administrar (como un medicamento) por cualquier procedimiento adecuado dentro del conocimiento del experto, en particular se prefiere administrar el peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion o la composicion de acuerdo con la invencion para la aplicacion en el pulmon. La via de administracion preferida es inhalacion (a traves de aerosoles) pero tambien la administracion intravenosa, instilacion, administracion oral o combinaciones de las mismas. En el caso de

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administracion por inhalacion, parenteral u oral, el medicamento de esta invencion se formula en forma de monodosis, tal como una solucion, suspension o emulsion, en combinacion con el excipiente farmaceuticamente aceptable definido antes. La dosificacion y manera de administracion, no obstante, tambien pueden por supuesto depender en casos particulares del individuo respectivo.

Aqrn, la cantidad eficaz necesaria respectivamente se administra al individuo quien requiere la administracion. La "cantidad eficaz" aqrn debe entenderse como la cantidad la cual es suficientemente eficaz con el fin de obtener el efecto terapeutico o profilactico pretendido, es decir, por ejemplo, para evitar un empeoramiento adicional de la enfermedad o para tratarlo eficazmente. Generalmente, aqrn uno parte de un paciente promedio, pero las cantidades eficaces reales de los componentes en la composicion se pueden formular de manera que el tipo de administracion y la edad, peso, estado del paciente y extension y progreso de la enfermedad se toman en consideracion (por ejemplo, por medio de un protocolo farmacologico convencional adecuado).

Preferentemente, por lo tanto, el portador farmaceuticamente aceptable en la composicion de acuerdo con la invencion para la aplicacion se selecciona de agua (de manera particularmente preferible: agua para inyeccion), sal comun, fosfato de sodio, acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, arginina, TRIS, citrato de sodio, solucion Ringer, dextrosa, manitol, trehalosa, sacarosa, sorbitol, fructosa, maltosa, lactosa o dextrano, solucion de Hank, aceites fijos, oleato de etilo, sustancias que mejoren la isotonicidad y la estabilidad qrnmica, conservantes, protemas farmaceuticamente aceptables, polisacaridos, poli(acidos lacticos), poli(acidos glicolicos), aminoacidos polimericos y copolfmeros de aminoacidos.

El medicamento se puede administrar, por ejemplo, de manera que el peptido para la aplicacion de la presente invencion se suministre en una dosis de entre 1 pg/kg y 10 mg/kg, de manera mas preferible entre 10 pg/kg y 5 mg/kg, de manera mucho mas preferible entre 0,1 y 2 mg/kg. Preferentemente, se administra como una dosis en embolada. No obstante, tambien se puede usar una inhalacion o infusion continua o una administracion mediante administracion repetida.

Las composiciones particularmente preferidas de acuerdo con la invencion para la aplicacion contienen el peptido en una cantidad de 1 pg a 10 g, preferentemente de 10 pg a 1 g, en particular de 1 mg a 100 mg.

Las composiciones particularmente preferidas de acuerdo con la invencion para la aplicacion en forma lfquida contienen el peptido en una cantidad de 1 pg a 10 g, preferentemente de 10 pg a 1 g, en particular de 1 mg a 100 mg y estan presentes en un volumen de 0,5 a 10 ml, en particular en un volumen de 1 a 5 ml.

La composicion de acuerdo con la invencion para la aplicacion preferentemente tambien se puede administrar en forma seca por medio de un inhalador de polvo. Los ejemplos de inhaladores de polvo los cuales se pueden usar para la presente invencion se describen en las patentes US n.° 4.995.385 y 4.069.819; los productos ya establecidos son SPINHALER®, ROTAHALER®, FLOWCAPS®, INHALATOR®, DISKHALER® y AEROLIZER®.

La composicion de acuerdo con la invencion para la aplicacion preferentemente tambien se puede administrar como un aerosol por medio de un nebulizador de lfquido. Los ejemplos de estos nebulizadores de lfquido son productos establecidos tales como Aeroneb® y Pari®.

De acuerdo con una forma de realizacion preferida, la composicion de acuerdo con la invencion para la aplicacion se caracteriza porque el peptido esta presente en una formulacion en polvo nebulizable o en una formulacion lfquida nebulizable.

La invencion se explica con detalle adicional por medio de los siguientes ejemplos y las figuras de los dibujos a las cuales, no obstante, por supuesto no se limita.

Muestran:

Figura 1: la intensidad de la forma pulmonar del mal de montana en ratas se determino 4 horas despues de administracion intratraqueal de solucion salina o peptido de la SEQ ID NO: 1. Control: ratas de control en condiciones de valores normales de oxfgeno y presion atmosferica. PBS: ratas en condiciones de oxfgeno y

presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de solucion salina. Peptido de la SEQ ID NO: 1

100 pg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 100 pg de peptido de la SEQ ID NO: 1. Peptido de la SEQ ID NO: 1 300 pg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 300 pg de peptido de la SEQ ID NO: 1. Peptido de la SEQ ID NO: 1 600 pg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 600 pg de peptido de la SEQ ID NO: 1.

Figura 2: el contenido de protema en el lfquido de pulmon en ratas se determino 4 horas despues de la administracion intratraqueal de solucion salina o peptido de la SEQ ID NO: 1. Control: ratas de control en

condiciones de valores normales de oxfgeno y presion atmosferica. PBS: ratas en condiciones de oxfgeno y

presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de solucion salina. Peptido de la SEQ ID NO: 1 100 pg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 100 pg de peptido de la SEQ ID NO: 1. Peptido de la SEQ ID NO: 1 300 pg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 300 pg de peptido de la SEQ ID NO: 1. Peptido de la

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SEQ ID NO: 1 600 |jg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 600 jg de peptido de la SEQ ID NO: 1.

Figura 3: apariencia histologica de tejido de pulmon en ratas 4 horas despues de administracion intratraqueal de solucion salina o del peptido de la SEQ ID NO: 1. Control: ratas de control en condiciones de valores normales de oxfgeno y presion atmosferica. PBS: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de solucion salina. Peptido de la SEQ ID NO: 1 100 jg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 100 jg de peptido de la SEQ ID NO: 1. Peptido de la SEQ ID NO: 1 300 jg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 300 jg de peptido de la SEQ ID NO: 1. Peptido de la SEQ ID NO: 1 600 jg: ratas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos y administracion intratraqueal de 600 jg de peptido de la SEQ ID NO: 1.

Figura 4: valores medios de los flujos de Na+ que fluyen hacia dentro en celulas A549, en la prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa durante la fase de control a pinzamiento con -100 mV, despues de adicion del peptido de la SEQ ID NO: 1 ("AP301") (240 nM) y despues de la adicion de amilorida (100 mM) a la solucion del bano. Los valores son valores medios +/- ET.

Figura 5: accion del peptido sintetico QRETPEGAEAKPWY (SEQ ID NO: 3, descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, a diferencia de la forma de acuerdo con la invencion, no ciclado en este experimento) sobre el flujo de Na+ en una celula A549 pinzada en el modo de celula completa. Registro original representativo de una celula pinzada con un potencial de retencion de -100 mV durante la fase de control y despues de la adicion del peptido QRETPEGAEAKPWY (300 nM) en la solucion del bano.

Figura 6: accion del peptido sintetico TKPIELGPDEPKAV (SEQ ID NO: 16; descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, a diferencia de los peptidos de acuerdo con la invencion, no esta ciclado y no contiene la secuencia central TX1EX2X3E o TPEGAE) sobre el flujo de Na+ en una celula A549 pinzada en el modo de celula completa. Registro original representativo de una celula pinzada a un potencial de retencion de -100 mV durante la fase de control y despues de la adicion del peptido TKPIELGPDEPKAV (300 nM) en la solucion de bano.

Figura 7: accion del peptido dclico sintetico CGTKPIELGPDEPKAVC (SEQ ID NO: 17; descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, a diferencia de los peptidos de acuerdo con la invencion, no contiene la secuencia central TX1EX2X3E o TPEGAE) sobre el flujo de Na+ en una celula A549 pinzada en el modo de celula completa. Registro original representativo de una celula pinzada en el potencial de retencion de -100 mV durante la fase de control y despues de la adicion del peptido dclico CGTKPIELGPDEPKAVC (300 nM) en la solucion del bano.

Figura 8: actividad de los peptidos dclicos de las SEQ ID NO: 1 y 11 a 15 como una funcion de la concentracion. En el eje x la concentracion se introduce en una escala logantmica en nM; en el eje y se introduce la corriente de ion sodio (en %).

Ejemplo 1

Uso del peptido de acuerdo con la invencion con la SEQ ID NO: 1 para el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana

Con el presente ejemplo, en un modelo de rata experimental del mal de montana se demuestra que el objetivo de acuerdo con la invencion se obtiene por el peptido sintetico de acuerdo con la invencion (SEQ ID NO: 1) que es administrado a ratas que padecen la forma pulmonar del mal de montana. El esfuerzo ffsico en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos, tal como sucede a altitudes elevadas, son los 2 factores principales que generan el desarrollo de la forma pulmonar del mal de montana. Por lo tanto, el modelo de rata seleccionado, en el cual las ratas llevaron a cabo actividad ffsica en condiciones de oxfgeno reducido y presion atmosferica reducida, simula un ascenso ffsicamente extenuante a altitudes elevadas. Esto se lleva a cabo sin realizar una aclimatacion previa. Esto corresponde al escenario tal como el que se encuentra los montaneros quienes padecen la forma pulmonar del mal de montana a altitudes elevadas. En el modelo usado, las ratas desarrollaron los smtomas ffpicos de la forma pulmonar del mal de montana, como se lee en la "intensidad de la forma pulmonar del mal de montana", la concentracion aumentada de protema en el ffquido de pulmon y la apariencia histologica del tejido de pulmon. Ademas debe hacerse notar que la lesion del pulmon en este modelo no es causado por administracion de endotoxinas, microbios u otros agentes los cuales producen lesion en el pulmon. No se produce una inflamacion intensificada del pulmon. Ademas, no se usa una cepa espedfica de rata para este experimento. Por lo tanto, este modelo de rata es adecuado para investigar un medicamento para el tratamiento de la forma pulmonar del mal de montana.

Procedimiento

Ratas de laboratorio (ratas Sprague Dawley) llevaron a cabo actividad ffsica a traves de estimulacion externa durante 48 horas en condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos. Aqrn, la presion atmosferica se redujo a un valor inferior a 430 Torr, de manera que se simulo una altitud de mas de 4500 m. Una aclimatacion previa de las ratas a la altura de mas de 4500 m no se llevo a cabo. Durante este tiempo, las ratas pudieron llevar a cabo una pausa de 15-20 minutos cada 4 horas con el fin de ingestion de agua y alimento. Despues de 48 h de actividad ffsica a la altitud simulada de mas de 4500 m, las ratas fueron tratadas por via intratraqueal con 300 jl/animal de

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experimentacion del peptido de la SEQ ID NO: 1 (100 |jg, 300 jig y 600 |jg) o 300 |jl de solucion salina. Las ratas despues pasaron 4 horas adicionales en condiciones de ox^geno y presion atmosferica reducidos a una altitud simulada de mas de 4500 m. Los pulmones despues se extirparon y se determino la intensidad de la forma pulmonar del mal de montana (figura 1), el contenido de protema en el Kquido de pulmon se determino (figura 2) y se determino la apariencia histologica del tejido de pulmon (figura 3).

Resultado

La investigacion mostro que la administracion intratraqueal del peptido de la SEQ ID NO: 1 a ratas de laboratorio las cuales fueron expuestas a las condiciones de presion atmosferica reducida y concentracion reducida de oxfgeno, genera una reduccion en la intensidad de la forma pulmonar del mal de montana (figura 1). Esto pudo demostrarse para 100 jg/rata de laboratorio y 600 jg/rata de laboratorio y preferentemente para 300 jg/rata de laboratorio del peptido de la SEQ ID NO: 1.

La investigacion mostro, ademas, que la administracion intratraqueal del peptido de la SEQ ID NO: 1 a ratas de laboratorio las cuales fueron expuestas a condiciones de presion atmosferica reducida y concentracion de oxfgeno reducida, genera una reduccion en la concentracion de protema en el lfquido de pulmon (figura 2). Esto se pudo demostrar para 100jg/rata de laboratorio y 600 jg/rata de laboratorio y preferentemente para 300 jg/rata de laboratorio del peptido de la SEQ ID NO: 1.

El examen histologico mostro que las ratas tratadas con solucion salina presentaron hinchazon del tejido de pulmon con eritrocitos, donde el tejido de pulmon en ratas despues de administracion del peptido de la SEQ ID NO: 1 era comparable con tejido de pulmon sano de las ratas control, las cuales no fueron expuestas a las condiciones de oxfgeno y presion atmosferica reducidos.

Ejemplo 2:

Determinacion ex vivo de las propiedades proinflamatorias del peptido de acuerdo con la invencion con la SEQ ID NO: 1 en sangre completa humana.

Se llevo a cabo un estudio de seguridad ex vivo farmacologico con respecto al peptido de la SEQ ID NO: 1 de acuerdo con la invencion para la aplicacion en sangre completa humana, con el fin de establecer si el peptido de la SEQ ID NO: 1 genera la liberacion del marcador proinflamatorio interleucina-6 (IL-6) de sangre completa fresca (es decir, si el peptido de la SEQ ID NO: 1 muestra o no actividad inflamatoria espedfica para TNF (es decir, actividad de union del receptor de TNF)). En este estudio se uso sangre completa fresca, este es un modelo de prediccion reconocido para la determinacion de reaccion inflamatoria in vivo.

Resumen de la metodologfa

El objetivo de este estudio era determinar la capacidad de la senal proinflamatoria del peptido de la SEQ ID NO: 1. Aqrn, se usaron cultivos de sangre completa y la secrecion de interleucina-6 (IL-6), un marcador muy sensible para estimulacion proinflamatoria, se cuantifico por medio de ELISA.

Sistema de prueba 25 ml de sangre heparinizada recien extrafda de 5 sujetos sanos (SS) se

usaron en las pruebas.

Objeto de examen identificacion: peptido de la SEQ ID NO: 1 (dosis: 1 ng/ml a 10 jig/ml; administracion unica

en solucion)

Descripcion: polvo blanco, pureza, 96 %

Cultivos de sangre completa

Los cultivos de sangre completa (SC) se llevaron a cabo al pipetear 1 ml de SC en pocillos de placas de 24 pocillos. En cada experimento se incluyeron cultivos de control no estimulados y estimulados.

Si es posible, las sustancias y los estimulantes que van a ser examinados siempre se usaron en el mismo volumen en cada pocillo en un experimento dado, el cual es no mayor de 10 % del volumen total en un pocillos. Los controles no estimulados se llevaron a cabo con PBS. El ajuste de volumen y las diluciones para los diferentes tratamientos de igual manera se llevaron a cabo con PBS.

El contenido de cada pocillo se mezclo y las placas se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 horas. Despues de la incubacion, el contenido de cada pocillos se transfirio a un microtubo de 1,5 ml nuevo y se centrifugo a de 8000 a 9000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante de cada muestra se dividio individualmente en dos recipientes de reaccion de 1,5 ml y se almaceno a -20 °C hasta su uso.

Comprobacion de interleucina-6

Se cuantifico interleucina-6 por medio de una prueba de ELISA espedfica (Human IL-6 ELISA-Set, BD Biosciences,

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Cat. N.° 555220) usando un anticuerpo anti-IL-6 humana como anticuerpo de captura, un anticuerpo de deteccion anti-IL-6 humana biotinilado, conjugado de avidina-peroxidasa de rabano rusticano como reactivo de enzima e IL-6 recombinante como patron. La medicion de absorcion a 450 nm se llevo a cabo en un lector Packard Fusion.

Analisis de datos

Los resultados de cada placa se almacenaron y evaluaron con el programa de analisis de datos Fusion.

Resumen de los resultados del estudio

El objetivo de este estudio era determinar la capacidad de senalizacion proinflamatoria del peptido de la SEQ ID NO: 1. Cultivos de sangre completa se usaron y la secrecion de IL-6, un marcador muy sensible para proestimulacion inflamatoria, se cuantifico por medio de ELlSA.

Las muestras de sangre completa de cinco sujetos sanos se dejaron sin estimular (control negativo), se estimularon con dosis altas y bajas de LPS (controles positivos) o se incubaron con el peptido en nueve diluciones semilogantmicas de 10 pg/ml a 1 ng/ml. Los resultados se presentan en la siguiente tabla 1:

Tabla: liberacion de interleucina-6 de sangre completa fresca con la adicion del peptido de la SEQ ID NO: 1 y LPS

Peptido de la SEQ ID NO: 1 Control positivo (LPS)

Concentracion

Concentracion de IL-6 (pg/ml, n = 5)

0 (control negativo)

menos de 0,5 menos de 0,5

10 mg/ml

menos de 0,5 195,640

1 mg/ml

menos de 0,5 108,370

3 ng/ml

menos de 0,5 34,867

1 ng/ml

menos de 0,5 no determinado

Los resultados muestran claramente que el peptido de la SEQ ID NO: 1 no induce cantidad detectable alguna de secrecion de IL-6 en alguna de las concentraciones probadas. Los controles positivos (LPS) generaron una induccion intensa de la secrecion de IL-6.

Discusion

Los experimentos se llevaron a cabo con el fin de establecer si el peptido de la SEQ ID NO: 1 lleva a cabo la induccion de una cascada proinflamatoria. El parametro de lectura fue la secrecion inducida de IL-6 en cultivos de sangre completa de cinco donantes sanos. Los resultados muestran claramente que el peptido de la SEQ ID NO: 1 no induce nivel detectable de IL-6 en los cultivos de donantes. Por lo tanto, se demuestra que el peptido de la SEQ ID NO: 1 no induce una respuesta proinflamatoria en el modelo ex vivo seleccionado y por lo tanto no tiene actividad de union a receptor de TNF. Esta prueba se puede aplicar para cualquiera de las variantes del peptido de acuerdo con la invencion con el fin de establecer el rasgo de libertad de actividad de union a receptor de TNF.

Ejemplo 3: determinacion de la bioactividad del peptido de acuerdo con la invencion en comparacion con la forma no ciclada (y por lo tanto, no de acuerdo con la invencion) del peptido y otros peptidos sinteticos los cuales se han propuesto en el estado de la tecnica para el tratamiento de edemas, en un analisis de pinzamiento zonal de membrana con celulas A549.

Resumen:

En este ejemplo, se determino la actividad biologica del peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion con otros tres peptidos sinteticos con respecto a la capacidad para induccion de corriente de sodio. Los peptidos comparativos sinteticos tambien se propusieron en la solicitud de patente europea EP 2 009 023 A1 como peptidos para el tratamiento de edemas. Para estos peptidos, se supuso en el documento EP 2009 023 A1 que senan capaces de inhibir o reducir la acumulacion de exceso de lfquido en tejidos. En el documento EP 2 009 023 A1, esta propiedad se investigo por medio de la prueba TEER; dentro del presente ejemplo, esta actividad biologica se investigo en la prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa con celulas A549.

Este principio de medicion (prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa) refleja el equilibrio de lfquido en el pulmon humano de modo significativamente mejor y por lo tanto es un sistema de prueba reconocido para esta cuestion. El equilibrio de lfquido en un pulmon humano adulto sano depende de los mecanismos de transporte de iones que llevan a traves del epitelio del pulmon, con la participacion del transportador de Na+ en la depuracion del lfquido alveolar que ha sido documentada en muchos estudios. En particular, aqrn, el canal de ion

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sodio epitelial (ENaC) sensible a amilorida de celulas alveolares tipo II se identifico como el regulador principal de la depuracion de Kquido alveolar.

Con el fin de determinar la actividad del canal de ion sodio epitelial (ENaC) sensible a amilorida y para determinar su activacion por compuestos biologicos y qmmicos, la tecnica de pinzamiento zonal de membrana de celula completa se establecio como la metodologfa experimental elegida para la medicion del movimiento de ion sodio a traves de la membrana apical de las celulas alveolares para predecir la depuracion de lfquido alveolar.

En consecuencia, en el presente ejemplo, la actividad biologica del peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion y de tres peptidos sinteticos, QRETPEGAEAKPWY (SEQ ID NO: 3, descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, en contraste con la forma de acuerdo con la invencion no esta ciclado en este experimento), TKPIELGPDEPKAV (SEQ ID NO: 16; descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, en contraste con los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion no esta ciclado y no contiene la secuencia central TX1EX2X3E o TPEGAE) y CGTKPIELGPDEPKAVC (SEQ ID NO: 17; descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, en contraste con los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion no contiene la secuencia central TX1EX2X3E o TPEGAE) se determino por medio de mediciones de pinzamiento zonal de membrana de celula completa en celulas A549, una lmea celular continua de celulas tipo II alveolares humanas.

Se ha demostrado aqrn que ninguno de los peptidos QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV y CGTKPIELGPDEPKAVC, aunque relacionados en su secuencia primaria con los peptidos proporcionados de acuerdo con la invencion para la aplicacion, tiene efecto alguno sobre el flujo de sodio y por lo tanto, tampoco un efecto activador sobre el canal de ion sodio epitelial (ENaC) sensible a amilorida, mientras que el peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion indujo un incremento del flujo de sodio sobre aquel del valor de control cuando se agrego a la solucion de bano en una prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa usando celulas A549. De esta manera, por lo tanto, los tres peptidos comparativos no mostraron efecto sobre el canal de ion sodio epitelial (ENaC) sensible a amilorida, en comparacion con el control positivo (peptido de acuerdo con la invencion con la SEQ ID NO: 1; CGQRETPEGAEAKPWYC) en una prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa usando celulas A549, la depuracion de lfquido alveolar, no obstante, es una consecuencia de este movimiento de ion sodio a traves de las celulas epiteliales alveolares, se puede concluir que estos peptidos de acuerdo con el estado de la tecnica -en contraste con el peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion- no son capaces de reducir los edemas pulmonares, aunque, respectivamente, las variantes particularmente preferidas tanto de los peptidos lineales asf como de los dclicos, los cuales se describen en el documento EP 009 023 A1, se investigaron en el presente ejemplo (QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV y CGTKPIELGPDEPKAVC, las cuales estan indicadas como peptidos de las SEQ ID NO: 18, 76 y SEQ ID NO: 2 en el documento EP 2 009 023 A1). Esto es en su totalidad mas remarcable puesto que una actividad en el combate de edemas se atribuye a los peptidos comparativos en el documento EP 2 009 023 A1.

Esto muestra, por una parte, que los rasgos proporcionados de acuerdo con la invencion, en particular, el ciclado y la secuencia central TX1EX2X3E o TPEGAE, son rasgos esenciales de la presente invencion. Por otra parte, las presentes investigaciones tambien justifican dudas corroboradas cientificamente respecto a la suposicion de que estos peptidos en sf mismos son adecuados para el tratamiento de edemas propuesto en el estado de la tecnica. El presente ejemplo, el cual se llevo a cabo por el sistema de prueba de la prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa, el cual es reconocido en el mundo cientffico especializado, muestra espedficamente que el sistema de investigacion (la prueba TEER) usado en el documento EP 2 009 023 A1 evidentemente no es adecuado para demostrar esta actividad.

Introduccion:

El equilibrio de lfquido en un pulmon humano adulto sano depende de los mecanismos de transporte de iones a traves del epitelio del pulmon, en donde la participacion de los transportadores de Na+ en la depuracion de lfquido alveolar esta bien documentado. En particular, aqrn, el canal de Na+ epitelial (ENaC) sensible a amilorida representa una etapa limitante para la reabsorcion de Na+ a traves del epitelio alveolar y desempena el papel clave en la reabsorcion de lfquido en el pulmon. Como una depuracion mejorada de lfquido alveolar genera directamente un pronostico mejorado y restauracion en el caso de un edema pulmonar, la mejora en la actividad de ENaC proporciona una opcion terapeutica prometedora para el tratamiento de edemas de pulmon.

La solicitud de patente europea EP 2 009 023 A1 propone para esto peptidos tales como QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV y CGTKPIELGPDEPKAVC (descritos ad como peptidos de las SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 2) como moleculas nuevas las cuales van a inhibir o reducir la acumulacion de exceso de lfquido en el tejido.

De acuerdo con la solicitud de patente EP 2 009 023 A1, la denominada prueba de resistencia electrica transepitelial (TEER) se uso para el cribado de candidatos de principios activos anti-edema de pulmon. La "prueba TEER" no es una prueba establecida para la prediccion de depuracion de lfquido en edemas de pulmon (esta prueba no se puede encontrar en la bibliograffa cientffica pertinente y tampoco tiene relevancia con respecto a las celulas usadas (celulas Calu-3) en un modelo para intercambio de gases en el pulmon humano). En el presente ejemplo, ademas

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del peptido de acuerdo con la invencion, los peptidos QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV y CGTKPIELGPDEPKAVC (ciclado) se investigaron por medio de un analisis de pinzamiento zonal de membrana de celula completa, una metodolog^a establecida para la medicion de movimiento de iones a traves de las membranas celulares y especialmente para la medicion del transporte de sodio a traves de la membrana celular de celulas epiteliales alveolares (Eaton y col., Fed. Proc. 45 (1986), 2707; Hamill y col., Pflugers Arch. 391 (1981) 85-100). Aqm, debfa probarse si los peptidos pueden activar o no el flujo de sodio epitelial sensible a amilorida en celulas de pulmon.

La "prueba TEER", como se ha descrito en el documento EP 2 009 023 A1, usa capas de celulas de celulas Calu-3. No obstante, las celulas Calu-3 son celulas bronquiales. Las celulas bronquiales representan aproximadamente el 1 % de la superficie del pulmon humano para el intercambio de gases y por lo tanto no representan un modelo apropiado para celulas epiteliales alveolares, las cuales constituyen aproximadamente el 99 % de la superficie del pulmon humano para el intercambio de gases. En el presente ejemplo se uso la lmea de celulas epiteliales alveolares humana A549, debido a que esta lmea celular define la norma experimental aceptada generalmente y se considera en la bibliograffa como el modelo de eleccion para celulas epiteliales alveolares (Lazrak y col., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278 (2000), 848-857).

Procedimiento experimental

Peptidos investigados

Peptido "AP301" (peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion):

Cyclo-H-Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys- Pro-Trp-Tyr-Cys-OH (seq id NO: 1)

Peptido sintetico QRETPEGAEAKPWY:

H-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-OH (SEQ ID NO: 3, descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, en contraste con la forma de acuerdo con la invencion, no ciclado en este experimento).

Peptido sintetico TKPIELGPDEPKAV:

H-Thr-Lys-Pro-Ile-Glu-Leu-Gly-Pro-Asp-Glu-Pro-Lys-Ala-Val-OH (SEQ ID NO: 16; descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, en contraste con los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion no esta ciclado y no contiene la secuencia central TX1EX2X3E o TPEGAE).

Peptido sintetico CGTKPIELGPDEPKAVC:

Ciclo-H-Cys-Gly-Thr-Lys-Pro-Ile-Glu-Leu-Gly-Pro-Asp-Glu-Pro-Lys-Ala-Val-Cys-OH (SEQ ID NO: 17; descrito en el estado de la tecnica como adecuado para el tratamiento de edemas, no obstante, en contraste con los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion no contiene la secuencia central TX1EX2X3E o TPEGAE).

Smtesis de peptidos

Todos los peptidos en el presente ejemplo se prepararon por smtesis de peptido en fase solida de acuerdo con la estrategia de proteccion con fluorenilmetiloxicarbonil/t-butilo en resina de cloruro de 2-clorotritilo. Se usaron diisopropilcarbodiimida y N-hidroxibenzotriazol como reactivos de acoplamiento. Todas las etapas de acoplamiento se llevaron a cabo en N,N-dimetilformamida. Los aminoacidos protegidos se acoplaron en sucesion a la cadena de peptido, comenzando con el aminoacido C-terminal. La desproteccion de fluorenilmetiloxicarbonilo se llevo a cabo en piperidina 20 % en N,N-dimetilformamida. La separacion del peptido protegido parcialmente, completado, de la resina se llevo a cabo en una mezcla 1:1 de acido acetico y diclorometano.

En el caso del peptido de la SEQ ID NO: 1, despues de separacion de la resina, la desproteccion de cadena lateral se llevo a cabo en acido trifluoroacetico 95 %, agua 5 %, seguido por ciclado del peptido crudo lineal por oxidacion de los residuos cistema terminales por el suministro de oxfgeno (O2 a 1,2 bar) a pH 8,5 durante aproximadamente 100 horas.

El producto peptfdico crudo se purifico por cromatograffa lfquida de presion media de fase inversa (RP-MPLC) en una columna de gel de sflice RP-C18 con un gradiente de acetonitrilo 5 % - 40 %. Finalmente, el contraion trifluoroacetato se sustituyo por acetato en una columna Lewatit MP64 (forma acetato). Despues de una etapa de lavado final en agua, el peptido purificado se liofilizo como sal acetato y se obtuvo como un polvo blanco a color crema. En el caso del peptido 2, el puente disulfuro intramolecular provoco problemas en la separacion de la columna de Lewatit, por lo tanto este peptido dclico se uso en forma de trifluoroacetato en vez de en forma de acetato.

Caracterizacion de los peptidos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Las masas moleculares de los peptidos se confirmaron por espectrometiia de masas por ionizacion de electronebulizacion o MALDI-TOF-EM; la pureza se determino por cromatograffa Kquida de alto rendimiento analttica.

Los peptidos se almacenaron a -20 °C.

Protocolo de pinzamiento zonal

La prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa usando celulas A549 se llevo a cabo como se describe en Hazemi y col. (J. Med. Chem. 53 (2010), 8021-8029). Se agregaron soluciones de los peptidos a una solucion externa (de bano) en la prueba de pinzamiento zonal de manera que se alcanzo una concentracion final de 300 nM. En casos en donde se observaba un incremento en el flujo despues de la adicion de un peptido dado, se agrego a la solucion del bano una solucion de amilorida (hasta una concentracion final de 100 mM), despues de que el flujo alcanzara un estado estacionario, con el fin de diferenciar el flujo sensible a amilorida del insensible a amilorida. El flujo sensible a amilorida despues se calculo al restar el valor de flujo despues de la adicion de amilorida (insensible a amilorida) del valor de flujo del estado estacionario antes de la adicion de amilorida. Para cada peptido se llevaron a cabo tres experimentos en diferentes celulas A549 (n = 3).

Resultados

El peptido de acuerdo con la invencion para la aplicacion; SEQ ID NO: 1 ("AP301"); peptido de control positivo) genero, cuando se agrego a una solucion de bano en una prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa usando celulas A549 en una concentracion final de 240 nM, un incremento en el flujo de Na+ activo a partir de un valor de control de 86 pA ± 5 pA (antes de la adicion de AP301) a un maximo de 1073 ± 15 pA (despues de la adicion de AP301). La adicion subsecuente de amilorida provoco una reversion del flujo a 36 pA ± 5 pA. Esto demostro que el flujo el cual se ha incrementado por AP301 es el flujo de Na+ sensible a amilorida (figura 4).

Cuando los tres peptidos comparativos sinteticos, QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV y CGTKPIELGPDEPKAVC se agregaron en experimentos de pinzamiento zonal de membrana de celula completa independientes usando celulas A549 a la solucion de bano en una concentracion final de 300 nM, no se pudo observar efecto sobre el flujo: los valores permanecieron en el intervalo del valor de control (figuras 5 a 7).

Discusion de los resultados

En el presente ejemplo se demostro la capacidad del peptido de acuerdo con la presente invencion ("AP301") como un control positivo en el incremento del flujo de Na+ sensible a amilorida en una prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa con celulas A549. La adicion de AP301 a la solucion de bano llevo a un incremento en el flujo partiendo de un valor de control de 86 pA ± 5 pA (antes de la adicion de AP301) a un maximo de 1073 ± 15 pA (despues de la adicion de AP301). La adicion subsecuente de amilorida provoco una reversion a 36 pA ± 5 pA. Esto muestra que AP301 incrementa el flujo de Na+ sensible a la amilorida de 50 pA a 1037 pA y por lo tanto confirma el efecto activador de AP301 sobre el canal de Na+ epitelial (ENaC) sensible a amilorida (veanse tambien Tzotzos y col., Pulm. Pharmacol. Ther. 26 (2013), 356-363), que esta dispuesto en el pulmon apicalmente en celulas epiteliales alveolares. La activacion de ENaC genera un incremento en la recepcion de Na+ desde el lfquido alveolar dentro de la capa epitelial, de manera que la fuerza de activacion osmotica se incrementa, lo cual refuerza la depuracion del lfquido alveolar y lleva a que agua fluya desde los alveolos al interior de la capa intersticial bajo el epitelio. En esto se podna basar el mecanismo subyacente al efecto de depuracion de lfquido alveolar observado de AP301 administrado directamente al pulmon.

Cada uno de los tres otros peptidos comparativos sinteticos QRETPEGAEAKPWY, TKPIELGPDEPKAV y CGTKPIELGPDEPKAVC de igual manera se probo para la capacidad de alterar el flujo de Na+ cuando se agrego a la solucion de bano en una prueba de pinzamiento zonal de membrana de celula completa con celulas A549. No obstante, a diferencia de AP301, el cual mostro un efecto intensificador inmediato, ninguno de los otros tres peptidos tuvo una influencia sobre el flujo en estas celulas, incluso en una concentracion de aplicacion un poco mayor que la del peptido AP301 de acuerdo con la invencion para la aplicacion (300 nM para los tres peptidos, 240 nM para AP301).

Ejemplo 4: activacion del canal de ion sodio (ENaC) sensible a amilorida por los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion

Los peptidos SEQ ID NO: 1 y 11 a 15 de acuerdo con la invencion para la aplicacion se caracterizaron de manera extensa en estudios basados en celulas. Estos peptidos dclicos sEq ID NO: 1 y 11 a 15 activan el canal de ion sodio (ENaC) sensible a amilorida en celulas de pulmon. Por lo cual, la equivalencia de estos peptidos con AP301 investigado previamente en el efecto de acuerdo con la invencion se clarifica.

Secuencias de peptidos

SEQ ID NO: 1: CGQRETPEGAEAKPWYC: El ciclado del peptido se obtuvo al oxidarse las cistemas terminales (C) con el desarrollo de un puente sulfuro. SEQ ID NO: 11: KSPGQRETPEGAEAKPWYE: En el peptido dclico de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

SEQ ID NO: 11, los aminoacidos se unen peptidicamente desde el aminoacido C-terminal acido glutamico (E) al aminoacido N-terminal lisina (K), mientras el aminoacido N-terminal lisina (K) se conecta con el aminoacido C- terminal acido glutamico (E) por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino epsilon de la cadena lateral de la lisina y el carbono gamma en el grupo lateral del acido glutamico.

SEQ ID NO: 12: KGQRETPEGAEAKPWYG: En el peptido dclico de la SEQ ID NO: 12, los aminoacidos estan unidos peptidicamente desde el aminoacido C-terminal glicina (G) al aminoacido N-terminal lisina (K), mientras el aminoacido N-terminal lisina (K) esta conectado con el aminoacido C-terminal glicina (G) por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino epsilon de la cadena lateral de la lisina y el carbono del grupo carboxilo de la glicina.

SEQ ID NO: 13: Ornitina-GQRETPEGAEAKPWYG: En el peptido cfclico de la SEQ ID NO: 13, los aminoacidos estan unidos peptfdicamente desde el aminoacido C-terminal glicina (G) al aminoacido N-terminal ornitina (Orn), mientras que el aminoacido N-terminal ornitina (Orn) esta conectado con el aminoacido C-terminal glicina (G) por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino delta de la cadena lateral de la ornitina y el carbono del grupo carboxilo de la glicina.

SEQ ID NO: 14: Acido 4-aminobutanoico-GQRETPEGAEAKPWYD: En el peptido cfclico de la SEQ ID NO: 14, los aminoacidos estan unidos peptfdicamente desde el acido aspartico C-terminal (D) al aminoacido N-terminal glicina (G), mientras el acido aspartico C-terminal (D) esta conectado con el aminoacido N-terminal glicina por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino de la glicina N-terminal y el carbono C1 del grupo carboxilo del acido 4-aminobutmco por una parte, y por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino del acido 4-aminobutmco y el carbono del grupo carboxilo de la cadena lateral del acido aspartico C-terminal, por la otra.

SEQ ID NO: 15: p-alanina-GQRETPEGAEAKPWYE: En el peptido cfclico de la SEQ ID NO: 15, los aminoacidos estan unidos peptfdicamente desde el acido glutamico C-terminal (E) al aminoacido N-terminal glicina (G), mientras el acido glutamico C-terminal (E) esta conectado con el aminoacido N-terminal glicina por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino de la glicina N-terminal y el carbono C1 del grupo carboxilo de la p-alanina por otra parte, y por medio de un enlace amida entre el nitrogeno del grupo amino de la p-alanina y el carbono del grupo carboxilo de la cadena lateral del acido glutamico C-terminal, por la otra.

SEQ ID NO: 19: CGQREAPAGAAAKPWYC (no de acuerdo con la invencion): El ciclado del peptido de la SEQ ID NO: 19 se obtuvo al oxidarse las cistemas terminales (C) con el desarrollo de un puente sulfuro.

Smtesis de peptidos

Los peptidos cmlicos SEQ ID NO: 1, 11 a 15 y 19 se prepararon por medio de smtesis en fase solida Fmoc de modo completamente automatico, con seguimiento de las siguientes etapas: acoplamiento secuencial de los aminoacidos; separacion selectiva de la fase solida; purificacion y liofilizacion; ciclado selectivo; separacion de los grupos protectores; purificacion y liofilizacion; examen analttico.

Los peptidos dclicos de las SEQ ID NO: 1 y 11 a 15 (de acuerdo con la invencion) y 19 (no de acuerdo con la invencion) despues se examinaron para pureza y masa por medio de HPLC inversa.

La pureza del peptido cmlico de la SEQ ID NO: 1 era del 96,3 % m/z (IEN). La pureza del peptido cfclico de la SEQ ID NO: 11 era 96,3 %. m/z (IEN) 1924,1 (M++1). La pureza del peptido dclico de la SEQ ID NO: 12 era 98,8 %. m/z (IEN) 1888,2 (M++1). La pureza del peptido dclico de la SEQ ID NO: 13 era 97,4 % m/z (IEN) 1873,4 (M++1). La pureza del peptido cfclico de la SEQ ID NO: 14 era 99 %. m/z (MALDI-TOF) 1901,6 (M++1). La pureza de la protema cmlica de la SEQ ID NO: 15 era 99 %. m/z (MALDI-TOF) 1902,7 (M++1). La pureza del peptido cfclico de la SEQ ID NO: 19 era 95 %. m/z (MALDI-TOF) 1778,02 (M++1).

La totalidad de los peptidos de acuerdo con la invencion SEQ ID NO: 1 y 11 a 15 tienen la siguiente caractenstica estructural compartida:

secuencia: X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2,

en donde X1 representa un aminoacido o 1 a 4 aminoacidos, en particular 1 o 3 aminoacidos, en donde los aminoacidos son aminoacidos naturales o no naturales,

en donde X1 representa el aminoacido C, K, ornitina, acido 4-aminobutmco, p-alanina o la secuencia KSP, en donde X2 puede ser un aminoacido natural o no natural, en donde X2 puede ser el aminoacido C, D, G o E

y en donde X1 es el aminoacido N-terminal y X2 es el aminoacido C-terminal.

Investigaciones electrofisiologicas del canal de ion sodio sensible a amilorida (ENaC)

Los flujos de ion sodio macroscopicos se derivaron de celulas epiteliales de pulmon humano A549 con la configuracion "celula completa" por medio de la tecnica "pinzamiento zonal de membrana" (Hamill y col., Pflugers Arch. 391 (1981), 85-100). Para las derivaciones de flujo en la configuracion de "celula completa" se usaron las siguientes soluciones de bano y de electrodo:

solucion de bano: metanosulfonato de sodio 135 mM, NaCI 10 mM, KCl 2,7 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 2 mM, glucosa 5,5 mM y HEPES 10 mM, pH 7,4.

Solucion de electrodo: metanosulfonato de potasio 120 mM, KCl 15 mM, NaCI 6 mM, Mg2ATP 1 mM, NaaATP 2 mM, HEPES 10 mM y EGTA 0,5 mM (pH 7,2).

5 Los cubreobjetos con las celulas cultivadas sobre los mismos se transfirieron a un bano experimental de 1 ml de cabida, se fijaron sobre una tabla de microscopio (Axiovert 100, aumento 400 x) y las celulas se superfunden con la solucion de bano descrita en lo anterior. El flujo despues se deriva a partir de una celula adecuada (la cual se adhiere al cubreobjetos). Para esto, un microelectrodo (capilar de vidrio con una abertura de punta pulida por calor definida de aproximadamente 1-3 pm, que corresponde a una resistencia de la punta de electrodo de 3-5 MQ) 10 rellenada con una solucion de electrolito se coloca sobre la celula y se succiona la membrana de manera que se forma un "sello de gigaohmios" entre la membrana y el electrodo, con el fin de minimizar la corriente de fuga. Con la configuracion de "celula completa", la membrana es penetrada debajo de la punta del electrodo de manera que el flujo, el cual fluye a traves de la totalidad de los canales de iones de la celula, se puede medir. Al obtener un "sello de gigaohmios" se aplica un potencial de retencion de membrana definido por medio de un preamplificador (CV-4 15 Headstage, Axon Instruments) y un amplificador (Axopatch 1D, Axon Instr.) y se mide el flujo, el cual fluye aqu a traves de los canales de iones.

El protocolo de pulso consiste en la hiperpolarizacion de la membrana celular a -100 mV durante 5 s y despues despolarizacion paso a paso en etapas de 20 mV hasta +100 mV.

Este protocolo se llevo a cabo antes (control) y despues de la adicion de las protemas dclicas. Las derivaciones de 20 flujo obtenidas asf se almacenan y analizan por medio del programa PCLAMp 6.0. Para esto, las derivaciones de flujo obtenidas en presencia de amilorida se restan de los flujos registrados previamente de manera que el flujo de sodio sensible a amilorida a traves de los canales de sodio epiteliales se puede determinar.

Los resultados de las mediciones se resumen en la Tabla 1. La actividad de los peptidos individuales esta indicada como CE50 (en nM). La CE50 es la concentracion eficaz a la cual se mide el 50 % de la actividad maxima (es decir, 25 incremento maximo de la intensidad de flujo, I).

Tabla 1. Actividad de los peptidos de acuerdo con la invencion para la aplicacion SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 11-15 y del peptido de la SEQ ID NO: 19 no de acuerdo con la invencion para la aplicacion sobre el flujo de ion sodio sensible a amilorida celular. La actividad esta indicada como concentracion eficaz al 50 % de la actividad maxima (CE50).

30

Peptido cclico

CE50 (nM)

SEQ ID NO: 1

54

SEQ ID NO: 11

56

SEQ ID NO: 12

38

SEQ ID NO: 13

45

SEQ ID NO: 14

24

SEQ ID NO: 15

19

SEQ ID NO: 19

Sin actividad

La actividad de los peptidos dclicos SEQ ID NO: 1 y 11 a 15 como una funcion de la concentracion se representa en la figura 8. La actividad maxima se indica con el 100 %.

Las investigaciones ilustradas muestran que los peptidos SEQ ID NO: 1 y 11 a 15 de acuerdo con la invencion para 35 la aplicacion son biologicamente activos, mientras que el peptido de la SEQ ID NO: 19, no de acuerdo con la invencion, no es activo. La diferencia entre los peptidos dclicos de las SEQ ID NO: 1 y 11 a 15 y el peptido dclico de la SEQ ID NO: 19 consiste en que dentro de la secuencia peptfdica general X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2, el aminoacido T (en la 5a posicion) y el aminoacido E (en la 7a posicion) y el aminoacido E (en la 10a posicion) se ha sustituido con alanina. La secuencia TPEGAE por lo tanto es esencial. La estructura de X1 y X2 no tiene influencia 40 esencial sobre la actividad.

Resumen de las secuencias:

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Peptido, que consiste en 7-20, especialmente 7-17 aminoacidos adyacentes y que comprende el hexamero TX1EX2X3E, en donde X1, X2 y X3 pueden ser cualquier aminoacido natural o no natural, en donde el peptido no presenta ninguna actividad de union a receptor de TNF y esta ciclado, para la aplicacion en el tratamiento y la prevencion de la forma pulmonar del mal de montana.
2. 2. Peptido para la aplicacion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el peptido consiste en 7-20, especialmente 7-17 aminoacidos adyacentes y comprende el hexamero TPEGAE.
3. 3. Peptido para la aplicacion de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el peptido ciclado consiste en una secuencia de aminoacidos consecutivos que se seleccionan del grupo que consiste en CGQRETPEGAEAKPWYC, CGPKDTPEGAELKPWYC, CGQKETPEGAEAKPWYC, CGQKETPEGAEAKPWYC, CGQRETPEGAEARPWYC, CGQRETPEGAEAKPC, CQRETPEGAEAKPWYC, CGQRETPEGAEAKFWYC, KSPGQRETPEGAEAKPWYE, KGQRETPEGAEAKPWYG, ornitina-GQRETPEGAEAKPWYG), acido 4-aminobutanoico-GQRETPEGAEAKPWYD, P-alanina-GQRETPEGAEAKPWYE y fragmentos de por lo menos 7 aminoacidos de los mismos, cuyos fragmentos presentan el hexamero TPEGAE.
4. 4. Peptido para la aplicacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el peptido comprende la secuencia de aminoacidos CGQRETPEGAEAKPWYC y esta ciclado por medio de los residuos C.
5. 5. Peptido para la aplicacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el peptido esta ciclado por un puente disulfuro entre los residuos C.
6. 6. Composicion farmaceutica para la aplicacion en el tratamiento y para evitar la forma pulmonar del mal de montana, que contiene un peptido como se define en una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque se formula en una composicion farmaceutica la cual es adecuada para administracion a seres humanos y comprende un vetnculo farmaceuticamente aceptable.
7. 7. Composicion farmaceutica para la aplicacion de acuerdo con la reivindicacion 6, caracterizada porque comprende un vetnculo farmaceuticamente aceptable el cual se selecciona de agua, en particular agua para inyeccion, sal comun, fosfato de sodio, acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, arginina, TRIS, citrato de sodio, solucion Ringer, dextrosa, manitol, trehalosa, sacarosa, sorbitol, fructosa, maltosa, lactosa o dextrano, solucion de Hank, aceites fijados, oleato de etilo, sustancias las cuales mejoran la isotonicidad y la estabilidad qrnmica, conservantes, protemas farmaceuticamente aceptables, polisacaridos, poli(acidos lacticos), poli(acidos glicolicos), aminoacidos polimericos y copolfmeros de aminoacidos.
8. 8. Composicion farmaceutica para la aplicacion de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7 caracterizada porque comprende el peptido en una cantidad de 1 |jg a 10 g, preferentemente de 10 |jg a 1 g, especialmente de 1 mg a 100 mg.
9. 9. Composicion farmaceutica para la aplicacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque esta presente en forma lfquida y comprende el peptido en una cantidad de 1 jg a 10 g, preferentemente de 10 jg a 1 g, especialmente de 1 mg a 100 mg y esta presente en un volumen de 0,5 a 10 ml, especialmente en un volumen de 1 a 5 ml.
10. 10. Composicion farmaceutica para la aplicacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque el peptido esta presente en una formulacion en polvo nebulizable o en una formulacion lfquida nebulizable.