JP6113277B2 - 酸素欠乏および気圧低下を原因とする高山病肺型の治療のための医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、酸素欠乏および気圧低下を原因とする高山病肺型の治療に関する。

高山病は、海抜２５００ｍを超える標高以上でヒトおいて発症する可能性がある。２５００メートルを超える標高では、酸素濃度および気圧は大きく低下する。急性高山病の脳型および肺型は区別される。つまり、急性高山病は、脳だけでなく肺でも起こる。高山病についての最初の詳細な臨床的記述は、１８９１年のモンブラン遠征中に為された。遠征隊の内で少なくとも４名が高山病に罹り、１名が４０００ｍの標高で１８９１年９月２日に死亡した。この事例以降、高山病は個人の生命を脅かす病態であると認識されている。

治療が為されなければ、高山病肺型は、２４時間以内に死亡に至る可能性があり、二次性肺塞栓症を経て死亡することが多い。

急性高山病の全ての型に関する最も有効な治療は、例えば患者をより低い標高へと迅速に降下させるか、または酸素ボンベまたは携帯用高圧チャンバーによる酸素の供給である。しかし、山岳地域では、迅速な降下は不可能であることが多い。酸素ボンベなどによる酸素喚気法は、上昇した肺動脈圧を確かに低下させるが、正常には戻らない。また、携帯用高圧チャンバーの場合には、ポジティブな効果は一過性に過ぎない。この治療に関する成功は、患者が身体的に活動を再開し始める際、高圧チャンバー退室直後に患者から消失する。

高山病のための薬物療法は、現在非常に制限されており、議論の的である：このために、重度の急性高山病、また特に高山病脳型においてデキサメタゾンが提案される。さらに、原発性肺動脈性高血圧症(ダナポイント分類１）の治療のために使用されるＰＤＥ−５阻害剤が、高地での酸素欠乏による二次性肺高血圧症(ダナポイント分類３）に適応されるかどうかについても議論されている。

また高山病のための自然療法(予防手段としても)の可能性も提唱されている(コカの葉のお茶；ヤクバター茶；有効成分としてイチョウを含有する製剤)。

しかし、高山病肺型の現行の薬物療法に対する可能性は依然として非常に制限されていることに注目すべきである。さらに、組織立った救援活動は、欧州の高山地域および一部の北米地域においてのみ利用できることが知られている。世界の遠隔地の高山帯や非常に高い標高地における緊急事態では、救助活動および医療行為（酸素ボンベまたは携帯用高圧チャンバーの使用による）はほぼ不可能である。それ故に、高山病の有効な薬物療法を提供することは緊急に必要であり、また高山病を発症するリスクが存在し得る登山者のための非常用キットの構成要素としても必要である。

EP 2 009 023 A1において、新規ペプチドが浮腫を治療するために提案されている。これらのペプチドは、その文献ではＣａｌｕ−３細胞を用いる「ＴＥＥＲ」(「経上皮電気抵抗」）試験により評価されているが、この試験は肺水腫における液体クリアランス（肺水腫液体クリアランス）のための確立された試験系ではない。Ｃａｌｕ−３細胞は、実際には、ガス交換のために機能する肺表面のうちのおおよそ１％のみを占有する気管支細胞である。これに対して、肺胞細胞は、ガス交換のために機能する肺表面のうちの９９％を占有する(Hollenhorst et al., J. Biomed. Biotechnol. 2011 (2011), doi:10.1155/2011/174306)。ＴＥＥＲ試験とは異なり、ヒトの肺胞上皮細胞株Ａ５４９は、肺胞上皮細胞のモデルとして認められた実験標準として確立されている(Lazrak et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278 (2000), L848-57)。

それ故に、本発明の目的は、高山病肺型罹患患者の薬物療法のための可能性を明確に改善することであって、また該疾患を効率的に治療できるだけでなく、回避できるような手段も利用できるようにすることである。

従って、本発明は、高山病肺型の治療および予防のための、７〜２０個、特に７〜１７個の隣接するアミノ酸からなり、かつヘキサマーＴＸ_１ＥＸ_２Ｘ_３Ｅ（式中、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３は、いずれかの天然または非天然アミノ酸であってもよい）を含むペプチドに関するもので、前記ペプチドは、ＴＮＦ受容体結合活性を有さず、かつ環化されている。

本発明により初めて、薬物療法を高山病肺型に利用することが可能となった。それ故に、本発明についての“希少疾病用医薬品認定”もまた、ＥＭＡ(EMA/OD/144/12)およびＵＳ−ＦＤＡ(12-3829)双方にて直ぐに承認された。このことは、前記疾患を治療する実現性が緊急に必要であることを示しており、この必要性は本発明により達成される。

本発明により使用されるペプチドは、以前から（例えば、欧州特許EP 1 264 599 B1、US 2007/299003 A、WO94/18325 A1、WO00/09149 A1、WO2006/013183A1またはWO2008/148545 A1）ペプチド自体既に知られている。本発明の実験経過中に、驚くべきことにこれらのペプチドは高山病肺型を治療するために好適であり、故にこの結果、簡易かつ効率的な薬物療法形態を、この適応症に初めて利用することができることが認められた。

本発明により使用されるようになった自体既知のこれらペプチドは、ＴＮＦ受容体結合活性を有さず(Hribar et al., Eur. J. ImMunol. 1999； Elia et al., AJRCCM 2003：実験の章を参照されたい）、かつ環化されている。これらのペプチドの好ましい改変体は、７〜１７個の隣接するアミノ酸からなり、かつヘキサマーＴＰＥＧＡＥ（配列番号：２）を含有する。

急性高山病は、常に亜急性低酸素症を伴って発症する。その後、低酸素血症および高炭酸血症により血管拡張へ、低炭酸血症により血管収縮へと至る。高地では、様々な影響が、低酸素血症および低炭酸血症により引き起こされる：肺では、血管収縮が主であり、脳では血管拡張が主である。

急性高山病の原因は、適応不全、主に個々に少なすぎる換気量（相対的な換気不足）の増加における適応不全という点にある。結果として、さらに著しい低酸素血症、肺動脈圧の上昇、頭蓋内圧の上昇、体液貯留および赤血球生成低減となる。

高山病肺型は、酸素欠乏および気圧低下が原因であり、生命を脅かす肺機能の変化であり、主に２５００〜６０００ｍの標高で起こる。全事例の３分の２が、海抜３０００〜４５００ｍで起こる。高山病肺型は、急性高山病では最も頻度の高い死因である。

高山病肺型は、特徴としておよそ２５００ｍの閾値標高を超えた後に開始することが多い。

肺における過剰で不均一な低酸素性血管収縮は、急性浸潤による肺の過灌流域をもたらす。不均一な低酸素性血管収縮の結果として大きく上昇した肺高血圧は、基本的には肺周辺部でおこり、発症前に完全に健康なヒトにおいて大きく増強された低酸素性肺血管応答（ＨＰＶＲ）の表れである。肺動脈圧の上昇は、低酸素下では確かに生理的事象であるが、高山病肺型においては相当強く表れる。しかし、肺の毛細血管の透過性は、低酸素下において上昇しない。

これは、病毒の直接作用による一次形態または他の疾患の結果としておこる二次形態のいずれかにより生じ得るその他の急性肺疾患、例えば急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または高透過性浮腫などとは明確に異なる。ＡＬＩ、ＡＲＤＳおよび高透過性浮腫における肺に対する最も頻度の高い障害は、細菌性およびウイルス性肺炎、肺挫傷、胃液誤嚥、吸入外傷、喫煙中毒、溺水、大量輸血、敗血症、多発性外傷、心肺バイパスまたは広範な火傷である。これらの肺疾患において、肺胞壁に随伴する損傷による炎症反応が中心にある。この状況が、炎症誘発性免疫過程および抗炎症性免疫過程に関する複雑な活性化を導き、肺胞上皮および血管内皮に対する炎症性の損傷を引き起こす。結果として、肺胞細胞およびサーファクタントの脱落、血漿タンパク質の流出による毛細血管漏出発症および間質性浮腫形成がおこる。炎症性変化は、通常、肺全体にわたり疎らで、かつ不均一に分散している。浸潤、間質性水腫および肺胞水腫は、最終的には無気肺ならびに動脈低酸素血症および肺高血圧症の臨床症状へと至らしめる。かかる炎症反応は、高山病においては病理的意義を有さない。

臨床学的に明白な高山病肺型の発症率は、３５００ｍを超えると約１５％であり、致死率は、非治療患者の４４％である。

高山病の発症率は、ＶＯ_２ｍａｘ、訓練状態、血圧、栄養、喫煙または年齢と相関しないが［前記全て中の喫煙および老齢が重要なリスクファクターである急性肺障害（ＡＬＩ／ＡＲＤＳ）とは異なる］、ある一部分においては、確かに各自の低酸素換気応答（ＨＶＲ）および登山地または登山速度と相関する。

また、高山病肺型の治療と、かたやＡＬＩ／ＡＲＤＳの治療との間にある相違は、本発明の承認の際に医薬品認可機関であるＥＭＡおよびＵＳ−ＦＤにより承認審査基準として明示される“希少疾病用医薬品適応”としても認められた。この決定は、一方では、世界保健機関(WHO)の国際疾病分類(international diagnosis Classification System)(ICD)からだけでも既になされている：高山病肺型は、その中で第XIX章(損傷、中毒およびその他の外因の影響)、疾病群T66-T78(外因のその他不特定の影響)、疾病分類T70(気圧および水圧の影響)、下位分類T70.2(高地のその他不特定の影響)として分類されているが、ＡＬＩ／ＡＲＤＳは、全く異なる章(第X章(呼吸器系疾患)、疾病群J80-J84(主として間質に影響するその他の呼吸器疾患)、疾病分類J80（急性呼吸不全症候群［ＡＲＤＳ］））に分類されている。双方の臨床分野は相違する（高山病肺型については、環境、職業およびスポーツ医学；ＡＬＩ／ＡＲＤＳについては、麻酔および集中治療医学）。この原因は基本的に異なる。高山病肺型は、健康な登山者による３０００ｍを超える標高への未順化での急激な登山または環境条件に対する個々の変化により、内在する病態または既に存在している病態がない健康な人に発症する。しかし、一方でＡＬＩ／ＡＲＤＳは、既往病態および内在する病態生理（この患者は、既に別の規定された病態に罹患している）の結果、例えば、局所または全身（例えば、敗血症の場合）の重度の感染または炎症、誤嚥（例えば胃液）、高温ガスまたは有毒ガスの吸入、多重輸血、溺水、肺挫傷、多発性外傷、火傷、脂肪塞栓症など；ならびに同様の病態生理の結果を原因とする。高山病肺型においては、不十分な換気応答および異常に強い血管収縮反応により、低酸素へと至り、その後肺圧の増加［（神経性）交換神経過剰活性も理由とする］から、内皮応力および毛細血管漏出が起こる；ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおいては、肺胞損傷、タンパク質を多く含む体液の間質領域および肺胞領域への漏出、サイトカインの大量放出および好中球の移動により、肺内のガス交換が低下する。

しかし基本的に、高山病肺型とＡＬＩ/ＡＲＤＳは、これらの疾患における炎症過程が果たす役割の点でもまた異なる。炎症過程は、常にＡＬＩ／ＡＲＤＳに先行しておこる；これらの炎症過程は、病態生理において主要な役割を担っている。これに対して、炎症過程は、高山病肺型においては一切拘わりがないも同然である；炎症過程がもし存在したとしても、単なる二次的特性としてのみおこり、この疾患の病因ではない。すなわち、ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける内皮由来および好中球由来の炎症促進モジュレーターの分泌増加、好中球活性化およびサイトカイン放出による炎症応答、肺胞洗浄液体（ＢＡＬＦ）中のサイトカインおよびタンパク質含量の増加、ＢＡＬＦ中の好中球およびマクロフファージの存在ならびに急性の炎症を原因とする微小血管の肺透過性亢進は、明確な炎症兆候を提示するが、高山病肺型の初期段階においては、少なくともこれらは全く存在していない。ＢＡＬＦ分析は、高山病肺型においては、好酸球または炎症促進モジュレーターの増加がないこと、ならびにサーファクタントタンパク質Ａおよびクララ細胞のタンパク質において相違がないことを示す。

結局、高山病肺型およびＡＬＩ／ＡＲＤＳの診断は全く異なる：高山病肺型は、健康で環境に慣れていない登山者に起こり、高地到着後の２〜５日以内で発症する。ここで、この肺動脈圧は異常に上昇するが、楔入圧は正常圧を維持している。ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおいては、言及したとおり、起因病態は常に存在している（例えば、敗血症）。楔入圧は、＜１８ｍｍＨｇであって、また一般的に左心房高圧についての臨床適応はない（肺動脈における圧力上昇がない）；このＰａＯ_２／ＦｉＯ_２比は、安定状態において＜３００（ＡＬＩ）である。

すなわち、高山病肺型およびＡＬＩ/ＡＲＤＳは、互いに完全に相違する２つの疾患である(Peacock, Eur. Respir. J. 8 (1995), 1819-1821)。

好ましくは、本発明は、高山病肺型の治療のための、７〜２０個、特に７〜１７個の隣接するアミノ酸からなり、かつヘキサマーＴＰＥＧＡＥ（配列番号：２）を含むペプチドに関するもので、前記ペプチドはＴＮＦの各結合活性を有さず、環化されている。

本発明の特に好ましい実施態様は、高山病肺型の治療のための医薬を使用または各々製造するための、後記からなる群から選択される連続するアミノ酸の配列：
−ＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ（配列番号：３）
−ＰＫＤＴＰＥＧＡＥＬＫＰＷＹ（配列番号：４）
−ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ（配列番号：１）、
−ＣＧＰＫＤＴＰＥＧＡＥＬＫＰＷＹＣ（配列番号：５）、
−ＣＧＱＫＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ（配列番号：６）、
−ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＲＰＷＹＣ（配列番号：７）、
−ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＣ（配列番号：８）、
−ＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ（配列番号：９）、
−ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＦＷＹＣ（配列番号：１０）、
−ＫＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ（配列番号：１１）、
−ＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ（配列番号：１２）、
−オルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ（配列番号：１３）、
−４−アミノ酪酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ（配列番号：１４）、
−β-アラニンＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ（配列番号：１５）
ならびにその少なくとも７個のアミノ酸フラグメントを含んでなる、ヘキサマーＴＰＥＧＡＥを含む環状ペプチドに関する。

好ましくは、このペプチドは、アミノ酸配列ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ（配列番号：１）を含有し、Ｃの残基を介して環化される。従って、特に好ましいこのペプチドは、以下のアミノ酸配列（配列番号：１）
（ＮＨ_２）Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（ＣＯＯＨ）を有する。

本発明のペプチドの環化は、例えばＮおよびＣ末端にある２つのＣの残基間のジスルフィド架橋により直接環化するか、またはペプチドを双方のシステインを介して担体物質にカップリングさせるかのいずれかにより達成される。ここで、本発明のペプチドにおいて、システイン残基は、好ましくは分子の開始部分および終結部分で提供される。ペプチドの環化を実現するその他の官能基も使用して、例えば酸基をアミンまたはアルコールと共に使用して、アミド閉環またはエステル閉環させることができる（例えば、アミノ酸のアスパラギン酸およびグルタミン酸を、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンまたはリジンと共に環化すること、好ましくは分子内で環化することができる）。ペプチドの環化は、好ましくはペプチドのＣの残基間で（存在するならば）ジスルフィド架橋によりおこる。しかし、システイン残基または他の官能基はまた、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端各々を結合する担体物質上、特に担体タンパク質上で提供されてもよく、これにより本発明のペプチドの環化を確実にする。

これに関して、もちろん本明細書において、「本発明の」ペプチドに対するあらゆる言及は、環状ペプチドに対する言及である。

本発明によれば、システイン残基を介する環化が特に好ましく、特に、本発明のペプチドのＮおよびＣ末端上で、本発明のペプチドの開始部分および終結部分にて提供されるシステイン残基を介するか、または追加導入されるシステイン残基を介するか、および／または担体上のシステイン残基を介してカップリングされるシステイン残基を介する環化が好ましい。ＮおよびＣ末端にて、提供されるシステイン残基または追加導入されるシステイン残基を介する本発明のペプチドの分子内環化が特に好ましい。

従って、本発明のさらなる好ましいペプチドは、例えばＣＧＱＫＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ（配列番号：６）、ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＲＰＷＹＣ（配列番号：７）、ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＣ（配列番号：８）、ＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ（配列番号：９）またはＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＦＷＹＣ（配列番号：１０）である。

本発明の好ましいペプチドのさらなる基は、配列Ｘ_１−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ−Ｘ_２を有する環状ペプチドである（ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹは、配列番号：１８に対応する）：式中、Ｘ_１は、１〜４個のアミノ酸、特に１または３個のアミノ酸を表し、これらのアミノ酸は、天然または非天然アミノ酸であり、特にＸ_１はアミノ酸Ｃ、Ｋ、オルニチン、４−アミノ酪酸、β-アラニンまたは配列ＫＳＰを表す、そしてＸ_２は天然または非天然アミノ酸であってもよく、特にＸ_２はアミノ酸Ｃ、Ｄ、ＧまたはＥである、ここでＸ_１はＮ末端アミノ酸であり、かつＸ_２はＣ末端アミノ酸である。この配列Ｘ_１−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ−Ｘ_２の特に好ましい例は、環状ペプチドのＫＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ、ＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ、オルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ、４−アミノ酪酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ、β-アラニンＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥである。

環状ペプチドのＫＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥにおいて、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）からＮ末端アミノ酸のリジン（Ｋ）までペプチド結合されており、同時にＮ末端アミノ酸のリジン（Ｋ）は、リジン側鎖のイプシロンアミノ基の窒素とグルタミン酸側鎖基中のγ炭素との間のアミド結合によりＣ末端アミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）と連結される。

環状ペプチドのＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧにおいて、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）からＮ末端アミノ酸のリジン（Ｋ）までペプチド結合されており、同時にＮ末端アミノ酸のリジン（Ｋ）は、リジン側鎖のイプシロンアミノ基の窒素およびグリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合によりＣ末端アミノ酸グリシン（Ｇ）と連結される。

環状ペプチドのオルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧにおいて、アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）からＮ末端アミノ酸のオルニチン（Ｏｒｎ）までペプチド結合されており、同時にＮ末端アミノ酸のオルニチン（Ｏｒｎ）は、オルニチン側鎖のデルタアミノ基の窒素とグリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合によりＣ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）と連結される。

環状ペプチドの４−アミノ酪酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤにおいて、アミノ酸は、Ｃ末端のアスパラギン酸（Ｄ）からＮ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）までペプチド結合されており、同時にＣ末端のアスパラギン酸（Ｄ）は、一方でＮ末端グリシンのアミノ基の窒素と４−アミノ酪酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合により、さらに他方で４−アミノ酪酸のアミノ基の窒素とＣ末端アスパラギン酸側鎖のカルボキシル基の炭素との間のアミド結合により、Ｎ末端アミノ酸のグリシンと連結される。

環状ペプチドのβ-アラニンＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥにおいて、アミノ酸は、Ｃ末端グルタミン酸（Ｅ）からＮ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）までペプチド結合されており、同時にＣ末端グルタミン酸（Ｅ）は、一方でＮ末端のグリシンのアミノ基の窒素とβ−アラニンのカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合により、さらに他方でβ−アラニンのアミノ基の窒素とＣ末端グルタミン酸側鎖のカルボキシル基の炭素との間のアミド結合により、Ｎ末端アミノ酸のグリシンと連結される。

本発明のペプチドにおける環化は、言及したとおりにおこるだけなく、ペプチドを担体物質に結合させることによってもおこり得る。かかる環化担体物質として考慮すれば、医薬上使用可能な全ての確立された物質、例えばシステインのＳＨ基との共有結合の一部となることができるもの（または、他の天然存在物またはペプチドの人工的に導入された化学反応基）であって、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風毒素などの前記確立された担体タンパク質が特に好適である。また、隣接する二官能価残基(例えば、アミン基またはアルコール基に隣接する酸基）は、担体上で提供され得る。これに関連して重要なことは、「環化」には、分子内閉環および担体への結合(ペプチドのＮおよびＣ末端を担体に結合することによる結合ペプチドプロジェクト）の双方が含まれており、このような手法で環化された前記ペプチドは、環状立体構造を示し、その結果安定しているということである。

従って、本発明の特に好ましいペプチドの一群は、配列番号：１および５〜１５を有する群である。

本発明のペプチドは、特に、アミロライド感受性上皮ナトリウムイオンチャンネル（ＥＮａＣ）に対する活性化効果を有する。この特性は、実施例の章に示したように、Eatonら(Fed. Proc. 45 (1986), 2707)およびHamillら(Pflugers Arch. 391 (1981), 85-100)による方法を用いて有利に試験され得る。

好ましくは、本発明のペプチドは、医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物中の高山病肺型の治療のために利用され得る。医薬組成物は、ヒトに投与するために好適な形態で好ましくは本発明において製造される。

用語「医薬組成物」は、上記に規定したペプチドならびに本発明のペプチドとさらなる有効成分との（生来適合性も有している、即ち、互いにネガティブに干渉しない）混合物を含むあらゆる組成物をいう；しかし、本発明のペプチドは、本明細書に記載した症状を阻止、改善または治癒させる唯一の有効成分として提供されることが好ましい。特に、用語「医薬組成物」は、上記したペプチドおよび医薬上許容し得る担体または賦形剤（双方の語は互換的に使用できる）を有する組成物をいう。当業者には既知の担体または賦形剤の好適な例は、水、生理食塩水、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、ＴＲＩＳおよびクエン酸ナトリウムまたはその混合物である。もちろん、リンガー溶液、デキストロース溶液または非還元糖の溶液も使用できる；したがって、マンニトール、トレハロース、サッカロース、ソルビトール、フルクトース、マルトース、ラクトースまたはデキストラン、ハンクス溶液、不揮発性油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の５％デキストロース、浸透圧および化学安定性を改善する物質、緩衝液および保存剤もまた、かかる担体として好適である。その他の好適な担体は、組成物を受容する個体にとって有害である抗体の産生をそれ自体誘導しないあらゆる担体、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸およびアミノ酸共重合体を含む。本発明の医薬組成物の処方において、もちろん好適なガイドライン(例えば、欧州薬局方または米国薬局方）に従うべきである。ここに記載したような本発明の組成物中に提供されるペプチドは、これらの担体に直接共有結合することにより環化され得る。

本発明の医薬組成物は、当業者の知識の範囲内であらゆる好適な方法により(医薬として）投与され得る。特に、本発明に従って使用されるペプチドまたは本発明の組成物を各々肺に投与することが好ましい。好ましい投与経路は、吸入(エアゾールによる）のみならず、静脈内投与、点滴、経口投与またはその組合せである。吸入投与、非経口投与または経口投与の場合には、本発明の医薬は、上記に規定した医薬上許容し得る賦形剤を組み合わせた単位用量形態、例えば、溶液、懸濁液またはエマルジョンに処方される。しかし、投薬および投与様式はもちろん、特定の症例においては、個体によって変更できる。

ここで、各々必要な有効量が、投与を必要とする個体に投与される。「有効量」は、本明細書では、目的とする治療効果または予防効果を達成するために、即ち、例えば疾患のさらなる悪化を防止するか、または疾患を有効に治療するために十分に有効である量と理解されるべきである。一般的に、本明細書に記載した有効量は、平均的な患者から得られるが、組成物中の成分の実際の有効量は、投与形態および年齢、体重、患者の症状ならびに疾患の程度および進行を考慮して（例えば、好適な従来の薬理学的プロトコールにより）処方される。
従って、好ましくは、本発明の組成物中の医薬上許容し得る担体は、水（特に好ましくは：注射用蒸留水）、食塩、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、ＴＲＩＳ、クエン酸ナトリウム、リンガー溶液、デキストロース、マンニトール、トレハロース、サッカロース、ソルビトール、フルクトース、マルトース、ラクトースまたはデキストラン、ハンクス溶液、不揮発性油、オレイン酸エチル、浸透圧および化学安定性を改善する物質、保存剤、医薬上許容し得るタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸およびアミノ酸共重合体から選択される。

本発明の医薬は、例えば本発明のペプチドが、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.１〜２ｍｇ／ｋｇの用量で提供されるように投与され得る。好ましくは、それはボーラス投与として提供される。しかし、連続吸入または点滴あるいは反復投与による投与もまた使用できる。

特に好ましい本発明の組成物は、ペプチドを１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１０μｇ〜１ｇ、特に１ｍｇ〜１００ｍｇの量で含有する。

特に好ましい本発明の液体形態の組成物は、ペプチドを１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１０μｇ〜１ｇ、特に１ｍｇ〜１００ｍｇの量で含有し、かつ０.５〜１０ｍｌの容量、特に１〜５ｍｌ容量にて存在する。

本発明の組成物は、好ましくは、粉末吸入器により乾燥形態で投与され得る。本発明に使用され得るかかる粉末吸入器の例は、米国特許第4.995.385号および同4.069.819号に記載されている；既に確立された製品は、SPINHALER(登録商標)、ROTAHALER(登録商標)、FLOWCAPS(登録商標)、INHALATOR(登録商標)、DISKHALER(登録商標)およびAEROLIZER(登録商標)である。

本発明の組成物はまた、好ましくは液体噴霧器によりエアゾールとして投与されることもできる。かかる液体噴霧器の例は、確立された製品、例えばAeroneb（登録商標）およびPari（登録商標）である。

好ましい実施態様によれば、本発明の組成物は、ペプチドが噴霧可能な粉末製剤または噴霧可能な液体製剤中に存在することを特徴する。

本発明は、以下の実施例および図面によりさらに詳細に説明されるが、当然この説明により本発明を制限するものではない。

図１：ラットにおける高山病肺型の程度を、生理食塩水または配列番号：１のペプチド各々の気管内投与４時間後に決定した。コントロール：正常な酸素および気圧値の条件下にあるコントロールラット。ＰＢＳ：低酸素および低い気圧条件下で、生理食塩水を気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド１００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド１００μｇを気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド３００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド３００μｇを気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド６００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド６００μｇを気管内投与したラット。

図２：ラットにおける肺液中のタンパク質含量を、生理食塩水または配列番号：１のペプチド各々を気管内投与４時間後に決定した。コントロール：正常な酸素および気圧値の条件下にあるコントロールラット。ＰＢＳ：低酸素および低い気圧条件下で、生理食塩水を気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド１００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド１００μｇを気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド３００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド３００μｇを気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド６００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド６００μｇを気管内投与したラット。

図３：生理食塩水または配列番号：１のペプチド各々を気管内投与した４時間後のラットにおける肺組織の組織学的所見。コントロール：正常な酸素および大気圧値の条件下のコントロールラット。ＰＢＳ：低酸素および低い気圧条件下で、生理食塩水を気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド１００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド１００μｇを気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド３００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド３００μｇを気管内投与したラット。配列番号：１のペプチド６００μｇ：低酸素および低い気圧条件下で、配列番号：１のペプチド６００μｇを気管内投与したラット。

図４：−１００ｍＶで固定したコントロール段階のホールセルパッチクランプ試験において、槽溶液への配列番号：１のペプチド（“ＡＰ３０１”）（２４０ｎＭ）の添加後およびアミロライド（１００ｍＭ）の添加後における、Ａ５４９細胞において内部に流れるＮａ^＋流量の平均値。この値は平均値＋/−ＳＥである。

図５：ホールセル様式で端子を繋げたＡ５４９細胞におけるＮａ^＋流量に対する、合成ペプチドＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ（配列番号：３、即ち浮腫の治療に好適なものとして先行技術に記載されているものであるが、この実験では環化されておらず、本発明の形態とは異なるものである）の作用。コントロールフェーズ中に−１００ｍＶの保持電位にて固定された細胞ならびに槽溶液にペプチドＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ（３００ｎＭ）を添加した後の細胞の代表的な原記録値。

図６：ホールセル様式で端子を繋げたＡ５４９細胞におけるＮａ^＋流量に対する、合成ペプチドＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶ（配列番号：１６、即ち浮腫の治療に好適なものとして先行技術に記載されているものであるが、本発明のペプチドとは異なり、環化されておらず、かつコア配列ＴＸ_１ＥＸ_２Ｘ_３ＥまたはＴＰＥＧＡＥ各々を含有しない）の作用。コントロールフェーズ中に−１００ｍＶの保持電位で固定された細胞ならびに槽溶液中にペプチドＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶ（３００ｎＭ）を添加した後の細胞の代表的な原記録値。

図７：ホールセル様式で端子を繋げたＡ５４９細胞におけるＮａ^＋流量に対する、合成環状ペプチドＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣ（配列番号：１７、即ち浮腫の治療に好適なものとして先行技術に記載されているものであるが、本発明のペプチドのペプチドとは異なり、コア配列ＴＸ_１ＥＸ_２Ｘ_３ＥまたはＴＰＥＧＡＥ各々を含有しない）の作用。コントロールフェーズ中に−１００ｍＶの保持電位で固定された細胞ならびに槽溶液中に環状ペプチドＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣ（３００ｎＭ）を添加した後の細胞の代表的な原記録値。

図８：濃度関数としての環状ペプチドの配列番号：１および１１〜１５の活性。ｘ軸上に対数スケールにて濃度が記載される；ｙ軸上にはナトリウムイオン流量（％）が記載される。

実施例１：高山病肺型の治療のための本発明の配列番号：１を有するペプチドの使用
本実施例にて、高山病の実験ラットモデルにおいて、本発明の合成ペプチド（配列番号：１）を高山病肺型に罹患しているラットに投与することにより本発明の目的が達成されたことが示される。高地で生じるような、低酸素および低い気圧条件下での身体労作は、高山病肺型を発症させる２つの主要ファクターである。そのため、選択したラットモデルは、低酸素および低い気圧条件下で運動させ、高地への身体的に過激な登山を擬似体験させたラットである。ラットに事前順化をさせずに行なう。これは、例えば高地で高山病肺型に罹患する登山者に見られるシナリオに合致している。使用したモデルにおいて、このラットは、“高山病肺型の程度”に記載されているような高山病肺型として典型的な兆候、即ち肺液中のタンパク質濃度の増加および肺組織の組織学的所見を示す。さらに注目すべきは、このモデルにおける肺の損傷が、肺に対して損傷を与える内毒素、細菌または他の薬剤の投与により引き起こされないことである。肺の炎症激化は起こらない。また、特定のラット株をこの実験に使用しなかった。故に、このラットモデルは、高山病肺型を治療するための医薬を探査するために十分適している。

方法
実験用ラット(Sprague Dawley rats）に、低酸素および低い気圧条件下で４８時間、外部刺激による運動を実施させた。ここでは、気圧を４３０Ｔｏｒｒ以下の値に低下させて、４５００ｍを超える標高を模倣した。４５００ｍを超える標高に対するラットの事前順化は行なわなかった。この期間中、ラットは、水および食餌を摂食するために４時間毎に１５〜２０分の休息をとることができた。４５００ｍを超える模倣高度で４８時間の運動後に、このラットに３００μｌ／動物対象にて配列番号：１のペプチド（１００μｇ、３００μｇおよび６００μｇ）または３００μｌ生理食塩水を気管内投与して治療した。その後４５００ｍを超える模倣高度時の低酸素および低い気圧条件下で、ラットをさらに４時間経過させた。その後、肺を摘出して、高山病肺型の程度を決定し（図１）、肺液中のタンパク質含量を決定し（図２）、肺組織の組織学的所見を決定した（図３）。

結果
この研究は、低い気圧および低酸素濃度条件下に暴露された実験用ラットに、配列番号：１のペプチドを気管内投与することにより、高山病肺型の程度が低下した（図１）ということを示した。このことは、配列番号：１のペプチドの１００μｇ／実験用ラットおよび６００μｇ／実験用ラット、特に３００μｇ／実験用ラットについて実証することができた。

この研究は、さらに低い気圧および低酸素濃度条件下に暴露された実験用ラットに、配列番号：１のペプチドを気管内投与することにより、肺液中のタンパク質濃度が低下した（図２）ことを示した。このことは、配列番号：１のペプチドの１００μｇ／実験用ラットおよび６００μｇ／実験用ラット、特に３００μｇ／実験用ラットについて実証することができた。

組織学的試験から、生理食塩水で処置されたラットは、赤血球を伴い膨張した肺組織を示し、配列番号：１のペプチド投与後のラットは、低酸素および低い気圧条件下に暴露されなかったコントロールラットの正常肺組織に匹敵することが示された。

実施例２：ヒト全血における配列番号：１を有する本発明のペプチドの炎症促進特性に関するエクスビボ評価
配列番号：１のペプチドが、炎症促進マーカーであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）を新鮮な全血から放出させるかどうかを［即ち、配列番号：１のペプチドがＴＮＦ−特異的炎症活性（即ち、ＴＮＦ受容体結合活性）を示すかどうか］立証するために、本発明の配列番号：１のペプチドに関して、エクソビボの安全性薬理試験をヒト全血中で行なった。この試験において、新鮮な全血を使用した；これは、インビボでの炎症反応を評価するために認められた予測モデルである。

方法の要約
この試験の目的は、配列番号：１のペプチドの炎症促進シグナル伝達能を決定することであった。ここで、全血試料を使用して、炎症促進刺激に対する高感受性マーカーであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の分泌をＥＬＩＳＡにより定量した。

全血試料
全血（ＦＢ）試料を、２４−ウェルプレートの窪みの中にＦＢ（１ｍｌ）をピペット操作により入れた。各実験には、非刺激および刺激コントロール試料が含まれた。

可能であれば、試験すべき物質および刺激物質を、所定の試験において各ウェルにて常に同じ量で使用した。この量はウェル全容量の１０％より少ない。非刺激コントロールはＰＢＳを用いて行った。様々な処理のために容量調整および希釈は、ＰＢＳを用いて同じように行なった。

各ウェルの内容物を混合して、プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後に、各ウェルの内容物を、新しいマイクロチューブ（１.５ｍｌ）に移して、８０００〜９０００ｘｇにて１５分間遠心分離した。各試料の上清を、各々２つの反応容器（１.５ｍｌ）に分割して、−２０℃で使用時まで貯蔵した。

インターロイキン−６の分析
捕捉抗体として抗ヒトＩＬ−６抗体、ビオチン化抗ヒトＩＬ−６検出抗体、酵素試薬としてアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートおよび標準物として組換えＩＬ−６を用いて、特異的ＥＬＩＳＡ(Human IL-6 ELISA-Set, BD Biosciences, カタログ番号555220)により、インターロイキン−６を定量した。４５０ｎｍでの吸光度測定を、パッカード・フュージョン読み取り機(Packard Fusion reader)を用いて行なった。

データ分析
各プレートの結果を収集して、上記フュージョン読取機のデータ分析用ソフトウェアを用いて評価した。

試験結果の要約
この試験の目的は、配列番号：１のペプチドの炎症促進シグナル伝達能を決定することであった。全血試料を使用して、炎症促進刺激に対する高感受性マーカーであるＩＬ−６の分泌を、ＥＬＩＳＡにより定量した。

５名の正常対象の全血試料のいずれか１つを非刺激とし（ネガティブコントロール）、残りを高用量および低用量のＬＰＳを用いて刺激し（ポジティブコントロール）、または９の片対数希釈にて１０μｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌのペプチドと共にインキュベートとした。結果を以下の表に示した：

この結果は、試験したあらゆる濃度において、配列番号：１のペプチドは、いかなる検出可能な量のＩＬ−６分泌をも誘導しなかったということを明示している。ポジティブコントロール（ＬＰＳ）は、ＩＬ−６の分泌を強く誘導した。

考察
この実験を、配列番号：１のペプチドが炎症促進カスケードの誘導をもたらすかどうかを立証するために行なった。読取ったパラメーターは、５名の正常なドナー由来の全血試料中に誘導されたＩＬ−６の分泌である。この結果は、配列番号：１のペプチドが、ドナー試料中にＩＬ−６の検出可能なレベルを誘導しなかったことを明確に示した。従って、配列番号：１のペプチドは、選択したエクソビボモデルにおいて炎症促進応答を誘導しないこと、すなわちＴＮＦ受容体結合活性を有さないことを実証した。この試験は、ＴＮＦ受容体結合活性がないという特徴を立証するために、本発明のペプチドのあらゆる改変体に適用され得る。

実施例３：本発明のペプチドを、本発明のペプチドの非環状形態(即ち、本発明ではない）、および浮腫の治療のために先行技術において提案されてきた他の合成ペプチドと比較した、Ａ５４０細胞を用いるパッチクランプアッセイにおける生物活性の評価
要約:
この実施例において、本発明のペプチドの生物学的活性を、ナトリウム流量の誘導能に関して、その他の３つの合成ペプチドを用いて評価した。この比較用合成ペプチドは、浮腫の治療用ペプチドとして欧州特許出願EP 2 009 023 A1において提案されたものでもある。これらのペプチドについて、EP 2 009 023 A1ではこれらが組織中の過剰な体液貯留を阻害または減少させ得るということが考えられた。EP 2 009 023 A1においては、この特性は、ＴＥＥＲ試験により試験された；本実施例においては、この生物学活性を、Ａ５４９細胞を用いるホールセルパッチクランプ試験にて試験する。

この測定原理（ホールセルパッチクランプ試験）は、ヒトの肺における体液バランスを非常に正確に反映するものであって、それ故この問題について認められた試験系である。正常な成人のヒト肺における体液バランスは、肺上皮を介して流れるイオンの輸送機序に拠って変わり、肺胞液クリアランスにおけるＮａ^＋輸送体の関与は幾つかの試験において確認されている。特にここでは、ＩＩ型肺胞細胞のアミロライド感受性上皮ナトリウムイオンチャンネル（ＥＮａＣ）を、肺胞液クリアランスの主要レギュレーターとして特定した。

アミロライド感受性上皮ナトリウムイオンチャンネル（ＥＮａＣ）の活性を評価するため、ならびに生体化合物および合成化合物によるその活性化を決定するために、ホールセルパッチクランプ技術を、肺細胞の頂端膜を介するナトリウムイオンの移動を測定するために選択する実験方法として定め、肺胞液クリアランスを予測した。

したがって、本実施例において、本発明のペプチドの生物学的活性および３つの合成ペプチドＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ（配列番号：３、即ち浮腫の治療に好適なものとして先行技術に記載されているが、本発明の形態とは異なり、この実験では環化されていない）、ＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶ（配列番号：１６、即ち浮腫の治療に好適なものとして先行技術に記載されているが、本発明のペプチドとは異なり、環化されておらず、かつコア配列ＴＸ_１ＥＸ_２Ｘ_３ＥまたはＴＰＥＧＡＥ各々を含有しない）およびＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣ（配列番号：１７、即ち浮腫の治療に好適なものとして先行技術に記載されているが、本発明のペプチドとは異なり、コア配列ＴＸ_１ＥＸ_２Ｘ_３ＥまたはＴＰＥＧＡＥ各々を含有しない）の生物学的活性を、ヒトのＩＩ型肺胞細胞の継代細胞株であるＡ５４９細胞のホールセルパッチクランプ測定により決定した。

この試験では、上記ペプチドＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ、ＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶおよびＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣは、本発明により提供されるペプチドの一次配列と関連はあるが、いずれもナトリウム流量に対して何ら効果を示さなかったし、それ故にアミロライド感受性上皮ナトリウムイオンチャンネル（ＥＮａＣ）を活性化する効果も無かったが、一方本発明のペプチドは、Ａ５４９細胞を用いるホールセルパッチクランプ試験にて槽溶液に当該ペプチドを添加した場合に、コントロール値を超えるナトリウム流量の増加を誘導することを示した。このように、この３つの比較用ペプチドは、Ａ５４９細胞を用いるホールセルパッチクランプ試験において、ポジティブコントロール（配列番号：１；ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣを有する本発明のペプチド）と比較して、アミロライド感受性上皮ナトリウムイオンチャンネル（ＥＮａＣ）に対する効果を示さなかったが、肺胞液クリアランスは、肺胞上皮細胞全体のこのナトリウムイオンの移動の結果によるものであるので、EP 2 009 023 A1に記載された直線および環状ペプチド双方の特に好ましい各改変体を本実施例（ＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ、ＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶおよびＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣであり、これはEP 2 009 023 A1において配列番号：１８、７６および配列番号：２のペプチドとして示されるものである）において調べたけれども、先行技術に記載のこれらのペプチド（本発明のペプチドとは異なる）は、肺水腫を低減させることはできないということが結論づけられる。浮腫を解消する活性が、EP 2 009 023 A1における比較用ペプチドに起因するので、このことはそれだけにいっそう注目に値する。

このことは、一方で、本発明により提供される特徴、特に環化およびコア配列ＴＸ_１ＥＸ_２Ｘ_３ＥまたはＴＰＥＧＡＥの各々は、本発明の重要な特徴であることを示している。他方で、本発明の試験は、これらのペプチド自体が先行技術において提案される浮腫の治療に適しているという仮定に関して科学的に確認されている疑義も証明する。科学分野の専門家に認められているホールセルパッチクランプ試験の試験系により行なった本発明の実施例は、EP 2 009 023 A1で使用される試験系（ＴＥＥＲ試験）が明らかにこの活性を証明するのに適していないということを示している。

導入：
正常な成人のヒト肺における体液バランスは、肺上皮上のイオンの輸送機序に依存しており、肺胞液クリアランスにおけるＮａ^＋輸送体の関与は十分確認されている。特に本明細書では、アミロライド感受性上皮Ｎａ^＋チャンネル（ＥＮａＣ）は、肺胞上皮上のＮａ^＋取り込み過程の制限を示し、肺内での液体再吸収の重要な役割を担う。改良された肺胞液クリアランスは、肺水腫の場合において改善された予後と回復を直接的に導くため、このＥＮａＣ活性の改善は、肺水腫治療のための有望な治療選択肢を提供する。

欧州特許出願EP 2 009 023 A1は、組織内の過剰な体液貯留を阻害または減少させる新規分子として、ペプチド、例えばＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ、ＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶおよびＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣ（そこでは配列番号：１８、配列番号：７６および配列番号：２のペプチドとして記述される）を提案している。

特許出願EP 2 009 023 A1によれば、いわゆる経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）試験を、抗肺水腫有効成分の候補物質のスクリーニングに使用した。「ＴＥＥＲ試験」は、肺水腫における液体クリアランスを予測するための確立された試験ではない（この試験は、関連文献には見出すことはできず、ヒトの肺におけるガス交換のためのモデルで使用される細胞（Ｃａｌｕ−３細胞）に関して関連性もない）。本実施例では、本発明のペプチドに加えて−ペプチドＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ、ＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶおよび（環化）ＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣを、ホールセルパッチクランプアッセイ（細胞膜上のイオンの移動を測定するため、特に肺胞上皮細胞の細胞膜上のナトリウム輸送を測定するための確立された方法）により試験した［Eaton et al., Fed. Proc. 45 (1986）, 2707；Hamill et al., Pflugers Arch. 391 (1981）85-100］。本明細書では、ペプチドが、肺細胞においてアミロライド感受性上皮ナトリウム流量を活性化できるかどうかを試験した。

「ＴＥＥＲ試験」は、EP 2 009 023 A1に記載されているたようにＣａｌｕ−３細胞の細胞層を使用する。しかし、Ｃａｌｕ−３細胞は気管支細胞である。気管支細胞は、ガス交換のためのヒト肺表面のうちのおおよそ１％に相当するものであり、それ故ガス交換のためのヒト肺表面のおおよそ９９％を構成する肺胞上皮細胞についての適切なモデルとはいえない。本実施例では、ヒト肺胞上皮細胞株Ａ５４９を使用した。その理由は、ヒト肺胞上皮細胞株Ａ５４９は、一般的に認められた実験標準を規定し、また文献(Lazrak et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278(2000), 848-857）において肺胞上皮細胞のための選択モデルと見なされているためである。

実験方法
試験したペプチド
ペプチド「ＡＰ３０１」（本発明のペプチド）：
環状−Ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−ＯＨ（配列番号：１）。
合成ペプチドＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ：
Ｈ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−ＯＨ
（配列番号：３、即ち浮腫の治療に適したものとして先行技術に記載されているものであるが、本発明の形態とは異なり、この実験では環化されていないものである）。
合成ペプチドＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶ：
Ｈ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＨ
（配列番号：１６、即ち浮腫の治療に適したものとして先行技術に記載されているものであるが、本発明のペプチドとは異なり、環化されておらず、かつコア配列ＴＸ_１ＥＸ_２Ｘ_３ＥまたはＴＰＥＧＡＥ各々を含有していないものである）。
合成ペプチドＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣ：
環状−Ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−ＯＨ（配列番号：１７、即ち浮腫の治療に適したものとして先行技術に記載されているものであるが、本発明のペプチドとは異なり、コア配列ＴＸ_１ＥＸ_２Ｘ_３ＥまたはＴＰＥＧＡＥ各々を含有していないものである）。

ペプチド合成
本実施例における全てのペプチドを、２−クロロトリチルクロリド樹脂上でフルオレニルメチルオキシカルボニル／ｔ−ブチル保護ストラテジーに従って固相ペプチド合成により製造した。ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールをカップリング試薬として使用した。全てのカップリング工程を、Ｎ−Ｎ−ジメチルホルムアミド中で行なった。保護されたアミノ酸を、Ｃ末端アミノ酸から開始して、ペプチド鎖に連続してカップリングさせた。フルオレニルメチルオキシカルボニルの脱保護を、Ｎ−Ｎ−ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンで行なった。前記完了後で、部分的に保護されたペプチドを樹脂から分離する操作は、酢酸とジクロロメタンの１：１混合物中で行なった。

配列番号：１のペプチドの場合、樹脂から分離した後に、側鎖の脱保護を、９５％のトリフルオロ酢酸、５％の水中で行ない、その後ｐＨ８.５でおおよそ１００時間、酸素供給（１.２バールでＯ_２）により末端のシステイン残基を酸化して、直線状の原料ペプチドを環化した。

原料ペプチド生成物を、５％〜４０％のアセトニトリルグラジエントを用いるＲＰ−Ｃ１８シリカゲルカラムでの逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）により精製した。最後に、トリフルオロ酢酸の対イオンを、Lewatit MP64カラム(アセテート形態）上で、アセテートに置換した。水での最終洗浄工程後に、精製ペプチドを酢酸塩として凍結乾燥させて、白色からクリーム色の粉末として得た。ペプチド２の場合には、分子内のジスルフィド架橋が、Lewatitカラム上から分離する際に問題を引き起こしたため、環状ペプチドを、アセテート形態ではなくトリフルオロ酢酸形態で使用した。

ペプチドの特徴分析
ペプチドの分子量を、エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認した；純度を、分析用高速液体クロマトグラフィーにより決定した。
このペプチドを−２０℃で貯蔵した。

パッチクランプ法の手順
Ａ５４９細胞を用いるホールセルパッチクランプ試験を、Hazemiら(J. Med. Chem. 53 (2010), 8021-8029）に記載のとおりに行なった。ペプチド溶液を、最終濃度が３００ｎＭとなるようにパッチクランプ試験における外部（槽）溶液に添加した。所定のペプチド添加後に流量増加が観察された場合にはこの流量が定常状態に達した後に、アミロライド溶液（１００ｍＭの終濃度）を、槽溶液に添加した（アミロライド感受性の流量をアミロライド非感受性の流量と区別するためである）。その後、アミロライド感受性の流量を、アミロライド添加後の流量値（アミロライド非感受性）をアミロライド添加前の定常状態の流量値から控除して算出した。各ペプチドについて、３つの実験を、異なるＡ５４９細胞（ｎ＝３）にて実施した。

結果
本発明のペプチド；配列番号：１（“ＡＰ３０１”）；ポジティブコントロールペプチドは、それを２４０ｎＭの最終濃度でＡ５４９細胞を用いるホールセルパッチクランプ試験の槽溶液へ添加した場合に、８６ｐＡ±５ｐＡ（ＡＰ３０１の添加前）のコントロール値から１０７３±１５ｐＡ（ＡＰ３０１の添加後）の最大値へと、能動的なＮａ^＋流量を増加させた。アミロライドのその後の添加により、その流量が３６ｐＡ±５ｐＡに戻った。このことは、ＡＰ３０１により増加していたその流量がアミロライド感受性のＮａ^＋流量であることを示した（図４）。

Ａ５４９細胞を用いる別のホールセルパッチクランプ実験において、３つの合成比較用ペプチドＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ、ＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶおよびＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣを各々、３００ｎＭの最終濃度で槽溶液に添加した場合、その流量に対する効果を観察できなかった：この値はコントロール値の範囲を維持していた（図５〜７）。

結果考察
本実施例において、ポジティブコントロールとして本発明のペプチド（“ＡＰ３０１”）の能力は、Ａ５４９細胞を用いるホールセルパッチクランプ試験におけるアミロライド感受性のＮａ^＋流量の増加に示された。槽溶液へのＡＰ３０１の添加により、８６ｐＡ±５ｐＡ（ＡＰ３０１の添加前）のコントロール値から１０７３±１５ｐＡ（ＡＰ３０１の添加後）の最大値までＮａ^＋流量が増加した。その後のアミロライドの添加により、３６ｐＡ±５ｐＡへと戻った。この結果は、ＡＰ３０１により、アミロライド感受性のＮａ^＋流量が５０ｐＡから１０３７ｐＡへと上昇したこと、故に肺内で肺胞上皮細胞の頂端膜に並んでいるアミロライド感受性の上皮Ｎａ^＋チャンネル（ＥＮａＣ）に対するＡＰ３０１の活性化効果が認められたことを示す(Tzotzos et al., Pulm. Pharmacol. Ther. 26 (2013）, 356-363も参照されたい）。ＥＮａＣの活性化により、肺胞液から上皮層へのＮａ^＋輸送が増加して、この結果肺胞液のクリアランスが支持され、かつ肺胞から上皮下の間質層へと水を流す浸透圧駆動力が増強される。肺に直接投与したＡＰ３０１の観察された肺胞液クリアランス効果の根拠を形づくる機序は、恐らくこのことが理由であろう。

その他の３つの合成比較用ペプチドＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ、ＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶおよびＣＧＴＫＰＩＥＬＧＰＤＥＰＫＡＶＣの各々を、Ａ５４９細胞を用いるホールセルパッチクランプ試験の槽溶液に添加した場合に、Ｎａ^＋流量に影響を及ぼす能力について同様に試験した。しかし、即時的に強い効果を示したＡＰ３０１とは異なり、その他の３つのペプチドは、本発明のペプチドのＡＰ３０１よりも適用濃度が多少高くても（３つのペプチドについては３００ｎＭ、ＡＰ３０１については２４０ｎＭ）、これらの細胞においてＮａ^＋流量に対する影響を示さなかった。

実施例４：本発明のペプチドによるアミロライド感受性のナトリウムイオンチャンネル（ＥＮａＣ）の活性化
本発明の配列番号：１および１１〜１５のペプチドを、細胞を基にした試験において広範に特徴付けを行なった。これらの環状ペプチド配列番号：１および１１〜１５は、肺細胞内のアミロライド感受性ナトリウムイオンチャンネル（ＥＮａＣ）を活性化する。この結果より、これらのペプチドおよび先に試験したＡＰ３０１は本発明の効果において同等であるということが明らかにされる。

ペプチド配列
配列番号：１：ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ：
ペプチドの環化は、末端システイン（Ｃ）が酸化されて、硫黄架橋の生成により達成された。

配列番号：１１：ＫＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ：
環状ペプチド配列番号：１１において、前記アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）から、Ｎ末端アミノ酸のリジン（Ｋ）までペプチド結合されており、同時にＮ末端アミノ酸のリジン（Ｋ）は、リジン側鎖のイプシロンアミノ基の窒素とグルタミン酸側鎖基のγ炭素との間のアミド結合によりＣ末端アミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）と連結される。

配列番号：１２：ＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ：
環状ペプチドの配列番号：１２において、前記アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）からＮ末端アミノ酸のリジン（Ｋ）までペプチド結合されており、同時にＮ末端アミノ酸のリジン（Ｋ）は、リジン側鎖のイプシロンアミノ基の窒素とグリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合によりＣ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）と連結される。

配列番号：１３：オルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ：
環状ペプチド配列番号：１３において、前記アミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）からＮ末端アミノ酸のオルニチン（Ｏｒｎ）までペプチド結合されており、同時にＮ末端アミノ酸のオルニチン（Ｏｒｎ）は、オルニチン側鎖のデルタアミノ基の窒素とグリシンのカルボキシル基の炭素との間のアミド結合によりＣ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）と連結される。

配列番号：１４：４−アミノ酪酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ：
環状ペプチド配列番号：１４において、前記アミノ酸は、Ｃ末端のアスパラギン酸（Ｄ）から、Ｎ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）までペプチド結合されており、同時に一方でＣ末端アスパラギン酸（Ｄ）は、Ｎ末端グリシンのアミノ基の窒素と４−アミノ酪酸のカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合、さらに他方で４−アミノ酪酸のアミノ基の窒素とＣ末端のアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基の炭素との間のアミド結合によりＮ末端アミノ酸のグリシンと連結される。

配列番号：１５：β−アラニンＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ：
環状ペプチド配列番号：１５において、前記アミノ酸は、Ｃ末端のグルタミン酸（Ｅ）から、Ｎ末端アミノ酸のグリシン（Ｇ）までペプチド結合されており、同時に一方でＣ末端グルタミン酸（Ｅ）は、Ｎ末端グリシンのアミノ基の窒素とβ−アラニンのカルボキシル基の炭素Ｃ１との間のアミド結合、さらに他方でβ−アラニンのアミノ基の窒素とＣ末端グルタミン酸側鎖のカルボキシル基の炭素との間のアミド結合によりＮ末端アミノ酸のグリシンと連結される。

配列番号：１９：ＣＧＱＲＥＡＰＡＧＡＡＡＫＰＷＹＣ（本発明のものではない）：
ペプチド配列番号：１９の環化は、末端システイン（Ｃ）が酸化されて硫黄架橋の生成により達成された。

ペプチド合成
環状ペプチド配列番号：１、１１〜１５および１９を、以下の工程：
アミノ酸を連続的にカップリングする工程；固相から選択的に分離する工程；精製および凍結乾燥、選択的環化の工程；保護基を分離する工程；精製および凍結乾燥の工程；分析試験の工程に従い、全自動化Ｆｍｏｃ固相合成により作成した。

環状ペプチド配列番号：１および１１〜１５（本発明のもの）および１９（本発明のものではない）を、次いで逆相ＨＰＬＣにより純度および質量について試験した。

環状ペプチド配列番号：１の純度は、９６.３％，ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１９２４.２（Ｍ＋＋１）であった。環状ペプチド配列番号：１１の純度は、９６.３％，ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１９２４.１（Ｍ＋＋１）であった。環状ペプチド配列番号：１２の純度は、９８.８％，ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１８８８.２（Ｍ＋＋１）であった。環状ペプチド配列番号：１３の純度は、９７.４％，ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１８７３.４（Ｍ＋＋１）であった。環状ペプチド配列番号：１４の純度は、９９％，ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１９０１.６（Ｍ＋＋１）であった。環状タンパク質配列番号：１５の純度は、９９％，ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１９０２.７（Ｍ＋＋１）であった。環状ペプチド配列番号：１９の純度は、９５％，ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１７７８.０２（Ｍ＋＋１）であった。

本発明の配列番号：１および１１〜１５のペプチドは、以下の共通する構造特性：
配列：Ｘ_１−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ−Ｘ_２
［式中、
Ｘ_１は、１個のアミノ酸または１〜４個のアミノ酸、特に１または３個のアミノ酸を表し、前記アミノ酸は天然または非天然アミノ酸であり、
Ｘ_１は、アミノ酸Ｃ、Ｋ、オルニチン、４−アミノ酪酸、β−アラニンまたは配列ＫＳＰを表し、
Ｘ_２は、天然または非天然アミノ酸であってもよく、
Ｘ_２は、アミノ酸Ｃ、Ｄ、ＧまたはＥであってもよく、
Ｘ_１は、Ｎ末端アミノ酸であり、
Ｘ_２はＣ末端アミノ酸である］
を有する。

アミロライド感受性ナトリウムイオンチャンネル（ＥＮａＣ）の電気生理学的試験
肉眼で見えるナトリウムイオン流量は、“パッチクランプ”技術の“ホールセル”形態を用いて、ヒト肺上皮細胞Ａ５４９から得たものである(Hamill et al., Pflugers Arch. 391 (1981), 85-100）。“ホールセル”形態においてナトリウムイオン流量を誘導するために、以下の槽溶液および電極用溶液を使用した：
槽溶液：１３５ｍＭ メタンスルホン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２.７ｍＭ ＫＣｌ、１.８ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５.５ｍＭ グルコースおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）
電極用溶液：１２０ｍＭ メタンスルホン酸カリウム、１５ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｍｇ_２ＡＴＰ、２ｍＭ Ｎａ３ＡＴＰ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０.５ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ７.２）。

培養された細胞を載せたカバースリップを実験用槽容器（１ｍｌ）に移して、顕微鏡テーブル(Axiovert 100, 400 x 倍率）に固定し、この細胞を上記槽溶液により表面潅流した。次いで、この流量を、適切な細胞(カバースリップと密着した）から得た。このために、電解質溶液で満たされた微小電極（約１〜３μｍの熱加工された規定開口部を有するガラス毛細管は３〜５ＭΩの電極チップの抵抗に相当する）を細胞上におき、膜を吸引して、漏出電流を最小とするために膜と電極の間に「ギガオームシール」を形成させた。この“ホールセル形態”にて、前記膜を電極チップの下で貫通させると、結果として細胞の全イオンチャンネルを通過する流量を測定できた。“ギガオームシール”を得た時点で、規定した膜保持電位を、前段階増幅器(CV-4 Headstage, Axon Instruments）および増幅器(Axopatch 1D, Axon Instr.）を介して電圧をかけて、イオンチャンネルを通過する流量を測定した。

パルスプロトコールは、５秒間の−１００ｍＶへの細胞膜の過分極、その後２０ｍＶ段階ごとに＋１００ｍＶまでの漸増的脱分極からなった。

このプロトコールを、環状タンパク質の添加前(コントロール）および後に行った。こうして得た流量の誘導を、PCLAMP 6.0 programmeにより収集および分析した。これに関して、アミロライド存在下で得た流量の誘導を、先に記録した流量から控除して、上皮ナトリウムチャンネルからのアミロライド感受性ナトリウム流量を決定することができた。

測定結果を表１にまとめた。個々のペプチドの活性を、ＥＣ５０（ｎＭ）として示す。ＥＣ５０は、最大活性（即ち、流量の最大増加、Ｉ）の５０％効果濃度として示される。

濃度関数として、環状ペプチド配列番号：１および１１〜１５のペプチドの活性を図８に示す。最大活性を１００％で示した。

図示した試験は、本発明の配列番号：１および１１〜１５のペプチドが、生物学的に活性であることを示すが、本発明ではない配列番号：１９のペプチドは活性ではないことを示す。環状ペプチド配列番号：１および１１〜１５と環状ペプチド配列番号：１９との相違は、一般的ペプチド配列Ｘ_１−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ−Ｘ_２のアミノ酸の中で、Ｔ（５番麺の位置）およびアミノ酸Ｅ（７番目の位置）およびアミノ酸Ｅ（１０番目の位置）がアラニンに交換されているという点である。すなわち、ＴＰＥＧＡＥの配列は必須である。Ｘ_１およびＸ_２の構造は、活性に対しては重要な影響はない。

Claims (13)

1. １７〜２０個の隣接するアミノ酸からなり、かつ環化されたペプチドを含み、該ペプチドがアミノ酸配列ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣを含み、かつＣの残基を介して環化されており、ＴＮＦ受容体結合活性を有さない、肺型の高山病の治療用医薬。
2. Ｃの残基間のジスルフィド架橋により環化されている、請求項１に記載の医薬。
3. 医薬上許容し得る担体を含む、ヒトへの投与に好適な、請求項１または２に記載の医薬。
4. 前記医薬上許容し得る担体が、水もしくは注射用水、食塩、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、ＴＲＩＳ、クエン酸ナトリウム、リンガー溶液、デキストロース、マンニトール、トレハロース、サッカロース、ソルビトール、フルクトース、マルトース、ラクトースまたはデキストラン、ハンクス溶液、不揮発性油、オレイン酸エチル、浸透圧および化学安定性を改善する物質群、保存剤、医薬上許容し得るタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸ならびにアミノ酸共重合体から選択される、請求項３に記載の医薬。
5. 前記ペプチドを、１μｇ〜１０ｇの量で含む、請求項３または４に記載の医薬。
6. 前記ペプチドを１０μｇ〜１ｇの量で含む、請求項３または４に記載の医薬。
7. 前記ペプチドを１ｍｇ〜１００ｍｇの量で含む、請求項３または４に記載の医薬。
8. 液体形態であり、および０.５〜１０ｍｌの容量で存在する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の医薬。
9. 前記容量が１〜５ｍｌである、請求項８に記載の医薬。
10. 前記ペプチドが、噴霧可能な粉末製剤または噴霧可能な液体製剤中に存在する、請求項３〜９のいずれか１項に記載の医薬。
11. 前記ペプチドが乾燥粉末形態である、請求項１または２に記載の医薬。
12. 前記ペプチドが配列番号１に記載のアミノ酸配列ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣからなり、かつ乾燥粉末形態である、請求項１または２に記載の医薬。
13. 噴霧形態である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬。

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