CN104427993B - 用于治疗由缺氧和低气压造成的肺型高山病的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于治疗和避免肺型高山病的肽，其由7‑20个、特别是7‑17个连续氨基酸组成且包含六聚体TX1EX2X3E，其中X1、X2和X3可以是任意天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有任何TNF‑受体‑结合活性且是环化的。

Description

用于治疗由缺氧和低气压造成的肺型高山病的药物组合物
本发明涉及由缺氧和低气压造成的肺型高山病的治疗。
人类自高于海平面2500 m的高度起可能发生高山病。在超过2500米的高度，氧浓度和气压显著降低。可以区分脑型和肺型急性高山病。因此，急性高山病发生在脑中和肺中。高山病的首次详细临床描述于1891年发生在勃朗峰探险队中。该探险队的至少4个成员罹患高山病，其中一个成员于1891年9月2日在4000 m的高度死亡。自从这些病例以来，高山病被视作一种单独的危及生命的临床病症。
如果不治疗的话，肺型高山病可以在24小时以内导致死亡，死亡经常通过继发性肺栓塞而发生。
所有形式的急性高山病的最有效治疗是供氧，例如通过将患者迅速降低至较低高度，或借助于瓶装氧或借助于便携式高压舱。但是，在多山区域，迅速降低经常是不可能的。通过例如瓶装氧来供氧虽然降低增加的肺动脉压，但是不会使它正常化。在便携式高压舱的情况中，积极作用也仅仅是时间有限的。在离开高压舱以后，当患者再次进行身体活动时，患者的治疗效果立即消失。
高山病的药物治疗目前仅仅是有限的和有争议的：因而，在严重的急性高山病中，并且也尤其在脑型高山病中，建议地塞米松。此外，已经讨论了用于治疗原发性肺动脉高血压(Dana Point Classification 1)的PDE-5抑制剂是否也对高原缺氧引起的继发性肺性高血压(Dana Point Classification 3)有疗效。
还提出了高山病的自然治疗可能性(也是预防性的) (古柯灌木叶子茶；酥油茶；含有银杏作为活性成分的制品)。
但是，应当着重指出，目前肺型高山病的药物治疗的可能性仍然是非常有限的。此外，已知的是，仅在欧洲高山地带和在北美部分地区可期待有组织的救援行动。在世界的偏远高山中和在极高的高度，紧急情况下的救援行动和医疗援助(使用瓶装氧或便携式高压舱)几乎不再可能的。因此，迫切需要提供高山病的有效药物治疗，也作为可能陷入发生高山病风险的登山者的急救包的组成部分。
在EP 2 009 023 A1中，建议了用于治疗水肿的新肽。其中使用Calu-3-细胞用“TEER”(“跨上皮电阻”)试验评价了这些肽，该试验不是建立用于肺水肿情况中的液体清除(肺水肿液体清除)的试验系统。Calu-3细胞事实上是支气管细胞，其仅构成用于气体交换的肺表面的大约1%。相反，肺泡细胞构成用于气体交换的肺表面的99%(Hollenhorst等人,J. Biomed. Biotechnol. 2011 (2011), doi:10.1155/2011/174306)。与TEER试验不同，人肺泡上皮细胞系A549被建立为肺泡上皮细胞的模型，作为接受的实验标准(Lazrak等人,Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278 (2000), L848-57)。
因此，本发明的目的是，明显地提高具有肺型高山病的患者的药物治疗的可能性，并提供可以有效地治疗和避免该疾病的方法/药剂。
因此，本发明涉及一种用于治疗和预防肺型高山病的肽，其由7-20个、特别是7-17个相邻的氨基酸组成且包含六聚体TX1EX2X3E，其中X1、X2和X3每个均可以是任意天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有TNF-受体-结合活性且是环化的。
用本发明能首次提供用于肺型高山病的药物治疗。因此，本发明立即被授予“孤儿药指定”，更确切地说被EMA授予(EMA/OD/144/12)以及被US-FDA授予(12-3829)。这显示了对该疾病的治疗可能性的迫切需要，本发明满足了该需要。
根据本发明要使用的肽已经长久以来是本身已知的，例如从欧洲专利EP 1 264599 B1、US 2007/299003 A、WO 94/18325 A1、WO 00/09149 A1、WO 2006/013183 A1或WO2008/148545 A1。在本发明的实验过程中，现已认识到，这些肽令人惊讶地也适合用于治疗肺型高山病，以至于因此首次能提供对该适应症简单且有效的药物治疗形式。
根据本发明使用的这些本身已知的肽不具有TNF-受体-结合活性(Hribar等人,Eur. J. Immunol. 1999; Elia等人, AJRCCM 2003；也参见:下面的实施例部分)，并且是环化的。这些肽的优选变体由7-17个相邻的氨基酸组成，且含有六聚体TPEGAE (SEQ IDNO: 2)。
急性高山病总是从亚急性缺氧症开始。随后，低氧血症和高碳酸血症导致血管扩张，低碳酸血症导致血管收缩。在高处，低氧血症和低碳酸血症现在产生不同效应：在肺中，血管收缩占优势，而在脑中，血管扩张占优势。
急性高山病的原因在于失败的适应，主要在于个体过少的换气增加(相对肺换气不足)。后果是更显著的低氧血症、更高的肺动脉压、更高的颅内压、液体停留和更低的红细胞生成。
肺型高山病由缺氧和低气压造成，是危及生命的肺功能的改变，尤其发生在2500-6000 m的高度。所有病例中的2/3发生在海平面以上3000-4500 m。肺型高山病是急性高山病最常见的死亡原因。
肺型高山病经常特征性地在超过大约2500 m的阈值高度后开始。
肺中过度的、不均匀的缺氧性血管收缩导致被急性浸润过度灌注的肺区域。由不均匀的缺氧性血管收缩引起的巨大增加的肺性高血压是在之前完全健康的人类中主要在肺的周围区域中对巨大增加的缺氧性肺血管的应答(HPVR，hypoxic pulmonary vascularresponse)的表达。肺动脉压的增加虽然是在缺氧下的生理学，但是在肺型高山病的情况中明显更突出。但是，肺的毛细管渗透性在缺氧下没有增加。
这与其它急性肺疾病例如急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或高通透性水肿形成鲜明对比，所述其它急性肺疾病可以通过病因的直接作用以原发形式发生或作为其它疾病的后遗症以继发形式发生。在ALI、ARDS和高通透性水肿中对肺的最常见损害是细菌性和病毒性肺炎、肺挫伤、胃液抽吸、吸入创伤、烟气中毒病、近乎淹溺、大量输血、脓毒症、多发外伤、心肺转流术或大面积烧伤。在这些肺疾病中，伴随肺泡壁的损伤的炎症反应处于重要地位。该病症导致促炎和抗炎免疫过程的复杂活化，这会导致对肺泡上皮和血管内皮的炎症性损伤。后果是肺泡细胞和表面活性剂的丧失、伴有血浆蛋白质排出的毛细管渗漏的发生、和间质性水肿形成。所述炎症性变化通常是斑点状的，并且不均匀地分布在整个肺上。浸润、间质和肺泡水肿最终导致肺不张以及动脉低氧血症和肺性高血压的临床征象。这样的炎症反应在高山病中不具有病理学意义。
临床上明显的肺型高山病的发病率在3500 m以上为约15%，其中在未治疗的患者中的致死率为44%。
高山病的发病率与VO2max、训练状态、血压、营养物、抽烟或年龄不相关(与急性肺损伤(ALI/ARDS)不同，在该病症中，尤其是抽烟和高龄是明确的危险因素)，但是确定地与个体的缺氧性通气反应(HVR)以及与高山目的地或爬升速度部分相关。
一方面肺型高山病的治疗和另一方面ALI/ARDS的治疗之间的差异在许可本发明时也被药品主管机关EMA和US-FDA作为“孤儿适应症”明确地视为检验这些许可的基础。该差异一方面已经由世界卫生组织(WHO)的国际诊断分类系统(ICD)独立得出：其中将肺型高山病分类在第XIX章(损伤、中毒和外因的某些其它后果)、疾病组T66-T78 (外因造成的其它的和不明损伤)、疾病类T70 (气压和水压造成的损伤)、亚分类T70.2 (高海拔造成的其它和不明损伤)下，而将ALI/ARDS分类在完全不同的章(第X章(呼吸系统疾病)、疾病组J80-J84 (主要涉及间质的其它呼吸系统疾病)、疾病类J80 (成人呼吸窘迫综合征[ARDS]))中。临床领域是不同的(对于肺型高山病而言，为环境医学、职业医学和运动医学；对于ALI/ARDS而言，为麻醉和重症医学)。病原学是根本不同的。肺型高山病由于健康登山者快速地未适应地上升至超过3000 m的高度或改变环境条件发生在否则没有基础性或既存临床病症的健康人中，而ALI/ARDS由先前的临床病症造成，并且是基础病理生理学的结果(该患者已经罹患另一种可确定的临床病症)，诸如：局部的或全身的严重感染或炎症(例如在脓毒症的情况下)、抽吸(例如通过胃液)、吸入热气体或有毒气体、多次输血、近乎淹溺、肺挫伤、多发外伤、烧伤、脂肪栓塞等)；以及病理生理学。在肺型高山病中，通气反应不足和罕见的强血管收缩反应会导致缺氧，然后由此(也由于(神经原的)交感神经过度活跃)出现升高的肺压、内皮应力和毛细管出口；在ALI/ARDS中，肺泡损伤、富含蛋白质的液体流出进入到间质腔和肺泡腔中的和细胞因子的广泛释放和嗜中性粒细胞的迁入导致肺中的气体交换减少)。
但是，肺型高山病和ALI/ARDS的区别尤其也在于炎症性过程在这些疾病中所起的作用。炎症性过程总是先于ALI/ARDS；这些炎症性过程在病理生理学中起主要作用。相反，炎症性过程在肺型高山病中不起作用；如果发生的话，它们仅仅作为次要特征而发生，而不是作为该疾病的原因。因此，在ALI/ARDS中，增加的内皮和嗜中性粒细胞对促炎症性调节剂的分泌、通过嗜中性粒细胞活化和细胞因子释放实现的炎症应答、支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞因子和蛋白质的高含量、嗜中性粒细胞和巨噬细胞在BALF中的存在、和由急性炎症造成的增加的微血管肺渗透性是炎症的明显征象，这些至少在肺型高山病的初发阶段中完全不存在。BALF分析表明，在肺型高山病中，白血球或促炎症性调节剂没有增加，并且表面活性蛋白质A和克拉拉细胞蛋白质没有差异。
最后，肺型高山病和ALI/ARDS的诊断是完全不同的：肺型高山病发生在健康的未适应的登山者中，并在到达高海拔以后2-5天内发生。在这种情况中，肺动脉压异常地增加，但是楔压保持正常。在ALI/ARDS中，如提及的，总是存在初始临床病症(例如脓毒症)。楔压≤18 mmHg，此外通常不存在左心房高压的临床症状(肺动脉压没有增加)；在稳定状态下，PaO2/FiO2比率≤300 (ALI)。
因此，肺型高山病和ALI/ARDS是2种彼此完全不同的疾病(Peacock, Eur.Respir. J. 8 (1995), 1819-1821)。
优选地，本发明涉及用于治疗肺型高山病的肽，其由7-20个、特别是7-17个相邻的氨基酸组成且包含六聚体TPEGAE (SEQ ID NO: 2)，其中所述肽不具有TNF-受体-结合活性且是环化的。
本发明的一个特别优选的实施方案涉及用于治疗肺型高山病的药物的或用于制备治疗肺型高山病的药物的环化肽，所述环化肽由连续氨基酸的序列组成，其选自：
及其至少7个氨基酸的片段，所述片段具有六聚体TPEGAE。
优选地，所述肽含有氨基酸序列CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 1)且经由C残基环化。因此，该特别优选的肽具有下述氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)
。
根据本发明的肽的环化在这里例如可以如下实现：经由N和C端的2个C-残基之间的二硫桥的直接环化，或者所述肽经由2个半胱氨酸偶联在载体物质上。在这里，在根据本发明的肽中，所述半胱氨酸残基优选地提供在分子的首端和尾端。还可以使用实现肽的环化的其它官能团，例如通过酸基团与胺或醇产生酰胺-或酯环闭合(在这里，例如氨基酸天冬氨酸和谷氨酸可以被丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸环化，优选地分子内环化)。所述肽的环化优选地通过肽的C残基(如果存在的话)之间的二硫桥实现。但是，也可以将半胱氨酸残基或其它官能团提供在载体物质上，尤其是在载体蛋白质上，所述载体物质结合根据本发明的肽的N端或C端，从而确保根据本发明的肽的环状性质。
在这方面，在本文中对“根据本发明”的肽的任何提及当然也是对环化肽的提及。
根据本发明特别优选的是，经由半胱氨酸残基的环化，尤其是经由提供在根据本发明的肽的首端和尾端处的或额外引入的半胱氨酸残基，和/或经由载体上的半胱氨酸残基，所述载体偶联在根据本发明的肽的N和C端上。根据本发明的肽经由在N和C端处提供的或额外引入的半胱氨酸残基的分子内环化是特别优选的。
因此，根据本发明的其它优选肽是例如CGQKETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 6)、CGQRETPEGAEARPWYC (SEQ ID NO: 7)、CGQRETPEGAEAKPC (SEQ ID NO: 8)、CQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 9)或CGQRETPEGAEAKFWYC (SEQ ID NO: 10)。
根据本发明的另一组优选肽是具有序列X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2的环肽，其中X1代表1-4个氨基酸，尤其是1或3个氨基酸，这些氨基酸是天然的或非天然的氨基酸，尤其是X1代表氨基酸C、K、鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸或序列KSP，X2可以是天然的或非天然的氨基酸，其中X2具体地是氨基酸C、D、G或E，且其中X1是N-端氨基酸且X2是C-端氨基酸(GQRETPEGAEAKPWY对应于SEQ ID NO: 18)。该序列X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2的特别优选的实施例是环肽KSPGQRETPEGAEAKPWYE、KGQRETPEGAEAKPWYG、鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG、4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD、β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE。
在环肽KSPGQRETPEGAEAKPWYE中，氨基酸从C-端氨基酸谷氨酸(E)至N-端氨基酸赖氨酸(K)肽连接，而N-端氨基酸赖氨酸(K)借助于赖氨酸侧链的ε氨基的氮和谷氨酸侧基中的γ碳之间的酰胺键与C-端氨基酸谷氨酸(E)连接。
在环肽KGQRETPEGAEAKPWYG中，氨基酸从C-端氨基酸甘氨酸(G)至N-端氨基酸赖氨酸(K)肽连接，而N-端氨基酸赖氨酸(K)借助于赖氨酸侧链的ε氨基的氮和甘氨酸的羧基的碳之间的酰胺键与C-端氨基酸甘氨酸(G)连接。
在环肽鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG中，氨基酸从C-端氨基酸甘氨酸(G)至N-端氨基酸鸟氨酸(Orn)肽连接，而N-端氨基酸鸟氨酸(Orn)借助于鸟氨酸侧链的δ氨基的氮和甘氨酸的羧基的碳之间的酰胺键与C-端氨基酸甘氨酸(G)连接。
在环肽4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD中，氨基酸从C-端天冬氨酸(D)至N-端氨基酸甘氨酸(G)肽连接，而C-端天冬氨酸(D)一方面借助于N-端甘氨酸的氨基的氮和4-氨基丁酸的羧基的碳C1之间的酰胺键，另一方面借助于4-氨基丁酸的氨基的氮和C-端天冬氨酸侧链的羧基的碳之间的酰胺键，与N-端氨基酸甘氨酸连接。
在环肽β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE中，氨基酸从C-端谷氨酸(E)至N-端氨基酸甘氨酸(G)肽连接，而C-端谷氨酸(E)一方面借助于N-端甘氨酸的氨基的氮和β-丙氨酸的羧基的碳C1之间的酰胺键，另一方面借助于β-丙氨酸的氨基的氮和C-端谷氨酸侧链的羧基的碳之间的酰胺键，与N-端氨基酸甘氨酸连接。
根据本发明的肽中的环化可以如所述般进行，但是也可通过将所述肽结合在载体物质上进行。作为这种环化载体物质，能够例如与半胱氨酸的SH基团(或与所述肽的其它天然地存在的或人工引入的化学反应基团)形成共价键的所有常用的能够在药学上使用的物质均合适，其中常用的载体蛋白质诸如钥孔戚血蓝素(KLH)、破伤风毒素等是特别合适的。并且，在载体上可以具有相邻的双功能残基(例如邻近胺基或醇基的酸基团)。在此方面重要的是，“环化”包括分子内环闭合以及载体的结合（键合的肽从其伸出(通过与载体键合的肽的N和C端)），其中如此环化的肽显示出环状空间结构并相应地稳定化。
因此，根据本发明的一组特别优选的肽是具有SEQ ID NO: 1和5-15的组。
根据本发明的肽尤其对阿米洛利敏感的上皮钠离子通道(ENaC)具有活化作用。该性质可以有利地用如在实施例部分中呈现的根据Eaton等人(Fed. Proc. 45 (1986),2707)和Hamill等人(Pflugers Arch. 391 (1981), 85-100)的方法检验。
优选地，用于治疗肺型高山病的根据本发明的肽可以提供在包含药学上可接受的载体的药物组合物中。在这里该药物组合物优选地制备成适合于施用给人类的形式。
术语“药物组合物”表示包含如上定义的肽的任意组合物，根据本发明的肽与其它活性成分的混合物(即不会彼此不利地干扰的)自然也合适；但是，优选的是，提供根据本发明的肽作为预防、改善或治愈本文描述的状态的唯一活性成分。具体地，术语“药物组合物”表示具有如上所述的肽和药学上可接受的载体或赋形剂(2个术语可以互换使用)的组合物。本领域技术人员已知的载体或赋形剂的适当例子是：水、盐水溶液、磷酸钠、醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、TRIS和柠檬酸钠或其混合物。当然，还可以使用林格氏溶液、右旋糖溶液或或非还原糖的溶液；因此，甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、果糖、麦芽糖、乳糖或葡聚糖、汉克氏溶液、固定油、油酸乙酯、在盐水溶液中的5%葡萄糖、改善等张性和化学稳定性的物质、缓冲剂和防腐剂也适合作为这样的载体。其它合适的载体包括，其本身不会诱导产生对要接受所述组合物的个体有害的抗体的任何载体，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸和氨基酸共聚物。在配制根据本发明的药物组合物时，当然应注意有关的准则（例如（欧洲或美国）药典）。在这里，如提及的根据本发明的组合物中提供的肽也可以通过直接共价结合在这些载体上环化。
根据本发明的药物组合物可以用本领域技术人员已知的任何适当方法(作为药物)来施用，特别优选的是，将根据本发明待使用的肽或根据本发明的组合物施用进肺中。优选的给药途径是吸入(通过气雾剂)，但是也可以是静脉内给药、滴注、口服给药或它们的组合。在吸入、胃肠外或口服给药的情况下，将本发明的药物配制为剂量单位形式，诸如溶液、混悬液或乳剂，其与上面定义的药学上可接受的赋形剂相组合。但是，该剂量和给药方式在个别情况中当然也可取决于各个个体。
在这里，将在各自需要的有效量施用给需要给药的个体。“有效量”在这里应当理解为这样的量：其足以有效地获得预期的治疗或预防效果，即例如阻止疾病的进一步恶化，或有效地治疗疾病。在这里通常从一般患者开始，但是可以如此配制在所述组合物中的组分的实际的极为有效的量，以便考虑给药形式和患者的年龄、体重、状况以及疾病的程度和进展(例如借助适当的常规药理学方案)。
因此，优选地，在根据本发明的组合物中的药学上可接受的载体选自：水(特别优选: 注射用水)、氯化钠、磷酸钠、醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、TRIS、柠檬酸钠、林格氏溶液、右旋糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、果糖、麦芽糖、乳糖或葡聚糖、汉克氏溶液、固定油、油酸乙酯、改善等张性和化学稳定性的物质、防腐剂、药学上可接受的蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸和氨基酸共聚物。
可以例如如此给药根据本发明的药物，以便以1 μg/kg至10 mg/kg、更优选地10 μg/kg至5 mg/kg、最优选地0.1-2 mg/kg的剂量施用本发明的肽。优选地，它作为单次剂量来施用。但是，也可以使用连续吸入或输注或借助于重复施用的给药。
特别优选的根据本发明的组合物以1 μg至10 g、优选地10 μg至1 g、尤其是1 mg至100 mg的量含有所述肽。
特别优选的呈液体形式的根据本发明的组合物含有1 μg至10 g、优选地10 μg至1g、尤其是1 mg-100 mg的量的所述肽，并且以0.5-10 ml的体积、尤其是以1-5 ml的体积存在。
还可以优选地借助于粉末吸入器以干燥形式施用根据本发明的组合物。可以用于本发明的这样的粉末吸入器的例子描述在美国专利4.995.385和4.069.819中；已经确定的产品是SPINHALER®、ROTAHALER®、FLOWCAPS®、INHALATOR®、DISKHALER®和AEROLIZER®。
还可以优选地借助于液体喷雾器以气溶胶形式施用根据本发明的组合物。这样的液体喷雾器的例子是确定的产品诸如Aeroneb®和Pari®。
根据一个优选的实施方案，根据本发明的组合物的特征在于，所述肽存在于可喷雾的粉末制剂或可喷雾的液体制剂中。
借助于下述实施例和附图中的图更详细地解释本发明，但是，本发明当然不限于此。
其中：
图1：在气管内施用盐水溶液或肽SEQ ID NO: 1以后4小时，测定大鼠中的肺型高山病的强度。对照：在正常氧-和空气压值的条件下的对照大鼠。PBS：在低的氧和空气压条件下和气管内施用盐水溶液的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 100 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用100 μg肽SEQ ID NO: 1的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 300 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用300 μg肽Seq. ID NO: 1的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 600 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用600 μg肽SEQ ID NO: 1的大鼠。
图2：在气管内施用盐水溶液或肽SEQ ID NO: 1以后4小时，测定大鼠中的肺液体中的蛋白质含量。对照：在正常氧-和空气压值的条件下的对照大鼠。PBS：在低的氧和空气压条件下和气管内施用盐水溶液的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 100 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用100 μg肽SEQ ID NO: 1的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 300 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用300 μg肽SEQ ID NO: 1的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 600 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用600 μg肽SEQ ID NO: 1的大鼠。
图3：在气管内施用盐水溶液或肽SEQ ID NO: 1以后4小时，大鼠中的肺组织的组织学外观。对照：在正常氧-和空气压值的条件下的对照大鼠。PBS：在低的氧和空气压条件下和气管内施用盐水溶液的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 100 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用100 μg肽Seq. ID NO: 1的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 300 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用300 μg肽SEQ ID NO: 1的大鼠。肽SEQ ID NO: 1 600 μg：在低的氧和空气压条件下和气管内施用600 μg肽SEQ ID NO: 1的大鼠。
图4：在全细胞膜片箝试验中，向浴溶液中加入肽SEQ ID NO: 1 (“AP301”) (240nM)以后和加入阿米洛利(100 mM)以后，在以-100 mV固定的控制阶段中，A549细胞中的向内流动的Na+流的平均值。所述值是平均值±SE。
图5：合成肽QRETPEGAEAKPWY (SEQ ID NO: 3，在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的形式不同，在该实验中是未环化的)对以全细胞模式贴片的A549细胞中的Na+流的作用。在控制阶段中和在浴溶液中加入肽QRETPEGAEAKPWY (300 nM)以后以-100 mV的保持电位固定的细胞的代表性原始记录。
图6：合成肽TKPIELGPDEPKAV (SEQ ID NO: 16，在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的肽不同，没有环化，并且不含有核心序列TX1EX2X3E或TPEGAE)对以全细胞模式贴片的A549细胞中的Na+流的作用。在控制阶段中和在浴溶液中加入肽TKPIELGPDEPKAV (300 nM)以后以-100 mV的保持电位固定的细胞的代表性原始记录。
图7：合成的环肽CGTKPIELGPDEPKAVC (SEQ ID NO: 17，在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的肽不同，不含有核心序列TX1EX2X3E或TPEGAE)对以全细胞模式贴片的A549细胞中的Na+流的作用。在控制阶段中和在浴溶液中加入环肽CGTKPIELGPDEPKAVC (300 nM)以后以-100 mV的保持电位固定的细胞的代表性原始记录。
图8：取决于浓度的环肽SEQ ID NO: 1和11-15的活性。在x-轴上以对数标度的形式以nM对浓度作图；在y-轴上对钠离子流(%)作图。
实施例1：
根据本发明的具有SEQ NO: 1的肽用于治疗肺型高山病的用途。
用本实施例在高山病的实验大鼠模型中证实，通过给罹患肺型高山病的大鼠给药根据本发明的合成肽(SEQ ID NO: 1)实现了根据本发明的目的。在低的氧和空气压条件下的体力活动（诸如发生在高海拔）是导致肺型高山病发展的2个主要因素。因此，选择的大鼠模型（其中大鼠在低氧和低气压的条件下进行体力活动）模拟向高海拔的身体尽力的爬升。这在没有预先适应的情况下进行。这相应于诸如在登山家在高海拔罹患肺型高山病的情况下发现的情形。在使用的模型中，大鼠形成肺型高山病的典型征状，如可在“肺型高山病的强度”、肺液体中增加的蛋白质浓度和肺组织的组织学外观中解读的。应当进一步指出，在该模型中的肺损伤不是通过施用内毒素、微生物或损伤肺的其它因素造成。没有发生增强的肺的炎症。也没有将大鼠的特定品种用于该实验。因此，该大鼠模型非常适合用于研究治疗肺型高山病所用的药物。
方法
实验室大鼠(Sprague Dawley大鼠)在低的氧和空气压条件下通过外部刺激进行48小时体力活动。在这里，将空气压降低至低于430托的值，以便模拟4500 m以上的高度。大鼠没有预先适应4500 m以上的高度。在该时间中，大鼠能够每4小时休息15-20分钟，以便摄入水和食物。在模拟的4500 m以上的高度进行体力活动48 h以后，用300 μl/实验动物肽SEQ ID NO: 1 (100 μg、300 μg和600 μg)或300 μl盐水溶液气管内地治疗大鼠。然后这些大鼠在低的氧和空气压条件下在模拟的4500 m以上的高度度过另外4小时。然后取出肺，并确定肺型高山病的强度(图1)，确定肺液体中的蛋白质含量(图2)，并确定肺组织的组织学外观(图3)。
结果
研究表明，给暴露于低的空气压和低氧浓度条件的实验室大鼠气管内施用肽SEQID NO: 1，导致肺型高山病的强度的下降(图1)。对于100 μg/实验室大鼠和600 μg/实验室大鼠的肽SEQ ID NO: 1，和优选对于300 μg/实验室大鼠的肽SEQ ID NO: 1，这能够得到证实。
此外，该研究表明，给暴露于低的空气压和低氧浓度条件的实验室大鼠气管内施用肽SEQ ID NO: 1，导致肺液体中的蛋白质浓度的下降(图2)。对于100 μg/实验室大鼠和600 μg/实验室大鼠的肽SEQ ID NO: 1，和优选对于300 μg/实验室大鼠的肽SEQ ID NO:1，这能够得到证实。
组织学检查表明，用盐水溶液治疗的大鼠具有带有红细胞的肿胀的肺组织，而施用肽SEQ ID NO: 1以后大鼠的肺组织与没有暴露于低的氧和空气压条件的对照大鼠的健康肺组织相当。
实施例2：
在人全血中离体评估根据本发明具有SEQ ID NO: 1的肽的促炎症性质。
在人全血中进行关于根据本发明的肽SEQ ID NO: 1的药理学离体安全性研究，以便确定肽SEQ ID NO: 1是否导致从新鲜全血中释放出促炎症标志物白介素-6 (IL-6)(即肽SEQ ID NO: 1是否显示TNF-特异性的炎症活性(即TNF-受体-结合活性))。在该研究中使用新鲜全血；这是一种公认的评估体内炎症反应的预测模型。
方法概述
本研究的目标是，确定肽SEQ ID NO: 1的促炎信号传导能力。在这里使用全血培养物，并借助ELISA定量白介素-6 (IL-6)的分泌，所述白介素-6是促炎刺激的一种非常灵敏的标志物。
试验系统
在试验中使用25 ml从5位健康受试者(GP)新鲜采集的肝素化的血液。
试验对象
鉴定：肽SEQ ID NO: 1 (剂量：1 ng/ml至10µg/ml；在溶液中单次施用)
描述：白色粉末，纯度96%
全血培养
通过将1 ml全血(VB)吸量进24孔板的孔中，进行全血(VB)培养。在每个实验中，包括未刺激的和刺激的对照培养物。
如果可能的话，总是将要研究的物质和刺激物以相同的体积用于给定实验的每个孔中，所述体积不超过孔中总体积的10%。未刺激的对照用PBS进行。不同处理的体积调节和稀释同样用PBS进行。
混合每个孔的内容物，并将平板在37℃和5%CO2下温育24小时。在温育后，将每个孔的内容物转移进新鲜的1.5 ml微管，并在8000-9000 x g离心15分钟。将每个样品的上清液单独地分配至2个1.5 ml反应容器，并在-20℃保存备用。
白介素-6的分析
借助特异性的ELISA (人IL-6 ELISA-Set, BD Biosciences, 目录号555220)，使用抗-人IL-6抗体作为捕获抗体，使用生物素化的抗-人IL-6检测抗体、抗生物素蛋白质-辣根过氧化物酶缀合物作为酶试剂，和使用重组IL-6作为标准品，定量白介素-6。使用Packard FusionReader，在450 nm进行吸光度测量。
数据分析
存储每个板的结果，并使用FusionDataAnalysis软件进行评价。
研究结果总结
本研究的目标是，确定肽SEQ ID NO: 1的促炎信号传导能力。使用了全血培养物，并借助ELISA定量IL-6的分泌，所述IL-6是促炎刺激的一种非常灵敏的标志物。
将5位健康受试者的全血样品保持未刺激(阴性对照)，用高和低剂量的LPS刺激(阳性对照)，或者用从10µg/ml至1 ng/ml的9种半对数稀释肽温育。结果显示在下表中：
表：在添加肽SEQ ID NO: 1和LPS的情况中白介素-6从新鲜全血的释放
肽SEQ ID NO: 1 阳性对照(LPS)
浓度 IL-6的浓度(pg/ml, n = 5)
0 (阴性对照) 小于0.5 小于0.5
10 mg/ml 小于0.5 195.640
1 mg/ml 小于0.5 108.370
3 ng/ml 小于0.5 34.867
1 ng/ml 小于0.5 未确定。
该结果清楚表明，肽SEQ ID NO: 1在任何试验浓度都没有诱导任何可检测水平的IL-6分泌。阳性对照(LPS)导致IL-6分泌的强诱导。
讨论
进行实验来确定肽SEQ ID NO: 1是否会介导促炎级联的诱导。读出参数是得自5位健康供体的全血培养物中的诱导的IL-6分泌。该结果清楚表明，肽SEQ ID NO: 1在供体培养物中没有诱导可检测水平的IL-6。因此，证实了肽SEQ ID NO: 1在选择的先体内后体外模型中没有诱导促炎症应答，并因此不具有TNF-受体-结合活性。该试验可以应用于根据本发明的肽的任意变体，以便确定不具有TNF-受体-结合活性的特征。
实施例3：
在膜片箝测定中用A540细胞评估与未环化(且因此不是根据本发明)形式的肽和在现有技术中已经提出用于治疗水肿的其它合成肽相比的根据本发明的肽的生物活性
概要：
在本实施例中评估了根据本发明的肽与3种其它合成肽关于诱导钠流的能力的生物活性。合成的对比肽在欧洲专利申请EP 2 009 023 A1中也被提议作为用于治疗水肿的肽。关于这些肽，在EP 2 009 023 A1中假定，它们能够抑制或减少过多液体在组织中的积累。在EP 2 009 023 A1中，借助于TEER试验研究了该性质；在本实施例中，用A549细胞在全细胞膜片箝试验中研究了该生物活性。
该测量原理(全细胞膜片箝试验)明显更好地反映了人肺中的液体平衡，因此是该问题的一个公认的试验系统。健康成年人肺中的液体平衡取决于经由肺上皮引导的离子运输机制，已经在许多研究中记载了Na+转运蛋白在肺泡液体清除中的参与。具体地，在这里，将II型肺泡细胞的阿米洛利敏感的上皮钠离子通道(ENaC)鉴别为肺泡液体清除的主要调节剂。
为了测定阿米洛利敏感的上皮钠离子通道(ENaC)的活性并确定其通过生物和化学化合物的活化，将全细胞膜片箝技术确定为选择用于测量经由肺泡细胞的顶膜的钠离子移动的实验方法，以预测肺泡液体的清除。
因此，在本实施例中，借助在A549细胞（人肺泡II型细胞的连续细胞系）上的全细胞膜片箝测量，确定了根据本发明的肽和3种合成肽QRETPEGAEAKPWY (SEQ ID No: 3，在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的形式不同，在该实验中未环化)、TKPIELGPDEPKAV (SEQ ID NO: 16；在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的肽不同，未环化且不含有核心序列TX1EX2X3E或TPEGAE)和CGTKPIELGPDEPKAVC (SEQ ID NO: 17；在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的肽不同，不含有核心序列TX1EX2X3E或TPEGAE)的生物活性。
在这里证实了，肽QRETPEGAEAKPWY、TKPIELGPDEPKAV和CGTKPIELGPDEPKAVC尽管它们的基本序列与根据本发明提供的肽有关，但都对钠流没有任何作用，因此也对阿米洛利敏感的上皮钠离子通道(ENaC)没有活化作用，而根据本发明的肽当将其在使用A549细胞的全细胞膜片箝试验中加入浴溶液中时诱导钠流增加超过对照值的增加）。因为由此在使用A549细胞的全细胞膜片箝试验中，与阳性对照(根据本发明的肽 SEQ ID NO: 1;CGQRETPEGAEAKPWYC)相比，3种对比肽没有表现出对阿米洛利敏感的上皮钠离子通道(ENaC)的作用，但是，肺泡液体的清除是经由肺泡上皮细胞的钠离子移动的后果，所以可以得出结论，根据现有技术的这些肽（与根据本发明的肽不同）不能减轻肺水肿，尽管在本实施例中研究了在EP 2 009 023 A1中描述的线性肽和环肽二者的各种特别优选的变体(QRETPEGAEAKPWY、TKPIELGPDEPKAV和CGTKPIELGPDEPKAVC，它们在EP 2 009 023 A1中被指示为肽SEQ ID NO: 18、76和SEQ ID NO: 2)。这是更值得注意的，因为抵抗水肿的活性归于EP 2 009 023 A1中的对比肽。
一方面，这表明，根据本发明提供的特征，尤其是环化和核心序列TX1EX2X3E或TPEGAE，是本发明的基本特征。另一方面，本研究也对科学确证的关于以下假设的怀疑给出了理由：在现有技术中提出的这些肽本身适合用于治疗水肿。本实施例（其通过全细胞膜片箝试验的试验系统进行，这被专业人员科学界公认）同样证实，在EP 2 009 023 A1中使用的研究系统(TEER试验)明显不适合证实该活性。
简介：
健康成年人肺中的液体平衡取决于经肺上皮的离子运输机制，其中确定地记载了在清除肺泡液体时Na+转运蛋白的参与。具体地，在这里，阿米洛利敏感的上皮Na+通道(ENaC)是经肺泡上皮的Na+接受的限制性步骤，并且在肺的液体重吸收中起关键作用。由于改善的肺泡液体清除直接导致改善的预后和在肺水肿情况下的恢复，ENaC活性的改善提供了用于治疗肺水肿的有前途的治疗选择。
欧洲专利申请EP 2 009 023 A1对此提出肽诸如QRETPEGAEAKPWY、TKPIELGPDEPKAV和CGTKPIELGPDEPKAVC (在其中描述为肽SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 2)作为将抑制或减少组织中的过量液体积累的新分子。
根据专利申请EP 2 009 023 A1，将所谓的跨上皮电阻(TEER)试验用于筛选抗-肺水肿活性成分候选物。“TEER试验”不是用于预测肺水肿中的液体清除的确定试验(该试验不可在有关的科学文献中找到，并且也与在人肺中的气体交换模型中使用的细胞(Calu-3细胞)不具有关联性)。在本实施例中，除了根据本发明的肽以外，还借助于全细胞膜片箝测定研究了肽QRETPEGAEAKPWY、TKPIELGPDEPKAV和(环化的) CGTKPIELGPDEPKAVC，所述全细胞膜片箝测定是用于测量经细胞膜的离子移动、特别是用于测量经肺泡上皮细胞的细胞膜的钠运输的确定方法(Eaton等人, Fed. Proc. 45 (1986), 2707; Hamill等人,Pflugers Arch. 391 (1981) 85-100)。在这里，要检验所述肽是否可以活化肺细胞中的阿米洛利敏感的上皮钠流。
如已经在EP 2 009 023 A1中描述的“TEER试验”使用Calu-3细胞的细胞层。但是，Calu-3细胞是支气管细胞。支气管细胞代表人肺用于气体交换的表面的大约1%，且因此不代表占人肺用于气体交换的表面的大约99%的肺泡上皮细胞的适当模型。在本实施例中，使用人肺泡上皮细胞系A549，因为该细胞系定义了普遍接受的实验标准，并且在文献中被视作选择用于肺泡上皮细胞的模型(Lazrak等人, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol.Physiol. 278 (2000), 848-857)。
实验规程
研究的肽
肽“AP301”(根据本发明的肽)：
合成肽QRETPEGAEAKPWY：
(SEQ ID NO: 3，在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的形式不同，在该实验中未环化)
合成肽TKPIELGPDEPKAV：
(SEQ ID NO: 16；在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的肽不同，未环化且不含有核心序列TX1EX2X3E或TPEGAE)
合成肽CGTKPIELGPDEPKAVC：
环-H-Cys-Gly-Thr-Lys-Pro-Ile-Glu-Leu-Gly-Pro-Asp-Glu-Pro-Lys-Ala-Val-Cys-OH (SEQ ID NO: 17；在现有技术中被描述为适合用于治疗水肿，但是，与根据本发明的肽不同，不含有核心序列TX1EX2X3E或TPEGAE)。
肽合成
根据芴基甲基氧羰基/叔丁基保护策略，在2-氯三苯甲基氯树脂上通过固相肽合成制备在本实施例中的所有肽。使用二异丙基碳二亚胺和N-羟基苯并三唑作为偶联剂。在N-N-二甲基甲酰胺中进行所有偶联步骤。从C-端氨基酸开始，将受保护的氨基酸接连地偶联至肽链。在20%的哌啶在N-N-二甲基甲酰胺中的溶液中，进行芴基甲氧羰基的去保护。在乙酸和二氯甲烷的1:1混合物中，将完全地、部分地被保护的肽与树脂解离。
在肽SEQ ID NO: 1的情况中，与树脂解离以后，在95%三氟乙酸、5%水中进行侧链去保护，随后通过氧化末端半胱氨酸残基（通过在pH 8.5供氧(在1.2巴的O2)大约100小时）进行直链粗肽的环化。
用5%至40%乙腈的梯度，通过RP-C18硅胶柱上的反相中压液相色谱法(RP-MPLC)，纯化粗肽产物。最后，在Lewatit MP64柱上用乙酸根替代三氟乙酸根抗衡离子(乙酸盐形式)。在水中的最终洗涤步骤以后，将纯化的肽低压冻干为乙酸盐，并作为白色至淡黄色粉末得到。在肽2的情况中，分子间二硫桥在从Lewatit柱解离的过程中造成问题，因此以三氟乙酸盐形式（而不是乙酸盐形式）使用该环肽。
肽的表征
通过电喷射电离质谱法或MALDI-TOF-MS，确认该肽的分子质量；通过分析型高效液相色谱法，确定纯度。
在-20℃储存肽。
膜片箝方案
如在Hazemi等人(J. Med. Chem. 53 (2010), 8021-8029)中所述，进行使用A549细胞的全细胞膜片箝试验。在膜片箝试验中，将肽溶液加入外部(浴)溶液中，由此达到300nM的终浓度。在加入给定的肽以后观察到流增加的情况中，在流已经达到静止状态以后，将阿米洛利溶液(至100 mM终浓度)加入浴溶液中，以便区分阿米洛利敏感的流和阿米洛利不敏感的流。然后通过从加入阿米洛利以前的静止状态的流值减去加入阿米洛利以后的流值(阿米洛利不敏感的)，计算阿米洛利敏感的流。对于每种肽，在不同的A549细胞中进行3个实验(n = 3)。
结果
当将根据本发明的肽SEQ ID NO: 1（“AP301”）（阳性对照肽）以240 nM的终浓度在使用A549细胞的全细胞膜片箝试验中加入浴溶液中时，其导致活跃的Na+流从86 pA±5 pA的对照值(加入AP301以前)增加至1073±15 pA的最大值(加入AP301以后)。阿米洛利的随后加入造成流返回至36 pA±5 pA。这表明，通过AP301已经增加的流是阿米洛利敏感的NA+流(图4)。
当将3种合成的对比肽QRETPEGAEAKPWY、TKPIELGPDEPKAV和CGTKPIELGPDEPKAVC以300 nM的终浓度在使用A549细胞的单独全细胞膜片箝实验中加入浴溶液中时，不能观察到对流的影响；值保持在对照值的范围内(图5-7)。
结果的讨论
在本实施例中，证实了根据本发明的肽(“AP301”)作为阳性对照在使用A549细胞的全细胞膜片箝试验中增加阿米洛利敏感的Na+流的能力。向浴溶液中添加AP301导致流从先前的86 pA±5 pA的对照值(加入AP301以前)增加至1073±15 pA的最大值(加入AP301以后)。阿米洛利的随后添加造成返回至36 pA±5pA。这表明，AP301使阿米洛利敏感的Na+流从50 pA增加至1037 pA，且因此证实了AP301对阿米洛利敏感的上皮Na+通道(ENaC)的活化作用(也参见Tzotzos等人, Pulm. Pharmacol. Ther. 26 (2013), 356-363)，所述通道排列在肺顶点的肺泡上皮细胞中。ENaC的活化导致从肺泡液体进入上皮层中的Na+接受的增加，使得渗透驱动力增加，这会支持肺泡液体的清除并导致水从肺泡流入上皮下面的间质层中。形成观察到的AP301（其直接施用至肺）的肺泡液体清除效应的机制可以归因于此。
同样试验了3种其它合成对比肽QRETPEGAEAKPWY、TKPIELGPDEPKAV和CGTKPIELGPDEPKAVC中的每一种在使用A549细胞的全细胞膜片箝试验中在加入浴溶液中时影响Na+流的能力。但是，不同于表现出立即强化效应的AP301，所述其它3种肽都对这些细胞中的流没有影响，即使以比根据本发明的肽AP301稍微更高的施用浓度(3种肽为300 nM，AP301为240 nM)。
实施例4：通过根据本发明的肽活化阿米洛利敏感的钠离子通道(ENaC)
在基于细胞的研究中充分地表征了根据本发明的肽SEQ ID NO: 1和11-15。这些环肽SEQ ID NO: 1和11-15在肺细胞中活化阿米洛利敏感的钠离子通道(ENaC)。由此说明了这些肽在根据本发明的作用中与先前研究的AP301的等效。
肽序列
SEQ ID NO: 1: CGQRETPEGAEAKPWYC: 通过形成硫桥氧化末端半胱氨酸(C)来实现该肽的环化。
SEQ ID NO: 11: KSPGQRETPEGAEAKPWYE: 在环肽SEQ ID NO: 11中，氨基酸从C-端氨基酸谷氨酸(E)至N-端氨基酸赖氨酸(K) 肽连接，而N-端氨基酸赖氨酸(K)借助于赖氨酸侧链的ε氨基的氮和谷氨酸侧基中的γ碳之间的酰胺键与C-端氨基酸谷氨酸(E)连接。
SEQ ID NO: 12: KGQRETPEGAEAKPWYG：在环肽SEQ ID NO: 12中，氨基酸从C-端氨基酸甘氨酸(G)至N-端氨基酸赖氨酸(K) 肽连接，而N-端氨基酸赖氨酸(K)借助于赖氨酸侧链的ε氨基的氮和甘氨酸的羧基的碳之间的酰胺键与C-端氨基酸甘氨酸(G)连接。
SEQ ID NO: 13: 鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG：在环肽SEQ ID NO: 13中，氨基酸从C-端氨基酸甘氨酸(G)至N-端氨基酸鸟氨酸(Orn) 肽连接，而N-端氨基酸鸟氨酸(Orn)借助于鸟氨酸侧链的δ氨基的氮和甘氨酸的羧基的碳之间的酰胺键与C-端氨基酸甘氨酸(G)连接。
SEQ ID NO: 14: 4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD：在环肽SEQ ID NO: 14中，氨基酸从C-端天冬氨酸(D)至N-端氨基酸甘氨酸(G) 肽连接，而C-端天冬氨酸(D)一方面借助于N-端甘氨酸的氨基的氮和4-氨基丁酸的羧基的碳C1之间的酰胺键，另一方面借助于4-氨基丁酸的氨基的氮和C-端天冬氨酸侧链的羧基的碳之间的酰胺键，与N-端氨基酸甘氨酸连接。
SEQ ID NO: 15: β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE：在环肽SEQ ID NO: 15中，氨基酸从C-端谷氨酸(E)至N-端氨基酸甘氨酸(G)肽连接，而C-端谷氨酸(E)一方面借助于N-端甘氨酸的氨基的氮和β-丙氨酸的羧基的碳C1之间的酰胺键，另一方面借助于β-丙氨酸的氨基的氮和C-端谷氨酸侧链的羧基的碳之间的酰胺键，与N-端氨基酸甘氨酸连接。
SEQ ID NO: 19: CGQREAPAGAAAKPWYC (不是根据本发明): 通过硫桥的形成氧化末端半胱氨酸(C)来实现肽SEQ ID NO: 19的环化。
肽合成
按照下述步骤，借助于Fmoc固相合成全自动地制备环肽SEQ ID NO: 1, 11-15和19：依次偶联氨基酸；选择性地从固相解离；纯化和冷冻干燥，选择性地环化；解离保护基；纯化和冷冻干燥；分析检查。
然后借助于反相HPLC，检测环肽SEQ ID NO: 1和11-15 (根据本发明)和19 (不是根据本发明)的纯度和质量。
环肽SEQ ID NO: 1的纯度为96.3%。m/z (ESI) 1924.2 (M++1)。环肽SEQ ID NO:11的纯度为96.3%。m/z (ESI) 1924.1 (M++1)。环肽SEQ ID NO: 12的纯度为98.8%。m/z(ESI) 1888.2 (M++1)。环肽SEQ ID NO: 13的纯度为97.4%。m/z (ESI) 1873.4 (M++1)。环肽SEQ ID NO: 14的纯度为99%。m/z (MALDI-TOF) 1901.6 (M++1)。环状蛋白质SEQ ID NO:15的纯度为99%。m/z (MALDI-TOF) 1902.7 (M++1)。环肽SEQ ID NO: 19的纯度为95%。m/z(MALDI-TOF) 1778.02 (M++1)。
所有根据本发明的肽SEQ ID NO: 1和11-15具有下述共有的结构性质：
序列: X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2，
其中X1代表1个氨基酸或1-4个氨基酸，尤其是1或3个氨基酸，其中所述氨基酸是天然的或非天然的氨基酸，
其中X1代表氨基酸C、K、鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸或序列KSP，
其中X2可以是天然的或非天然的氨基酸，
其中X2可以是氨基酸C、D、G或E，
且其中X1是N-端氨基酸，且X2是C-端氨基酸。
阿米洛利敏感的钠离子通道(ENaC)的电生理学研究
借助于“膜片箝”技术(Hamill等人, Pflugers Arch. 391 (1981), 85-100)，从具有“全细胞”构型的人肺上皮细胞A549引出宏观钠离子流。为导出“全细胞”构型中的流，使用下述浴溶液和电极溶液：
浴溶液: 135 mM甲磺酸钠, 10 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2 mMMgCl2, 5.5 mM葡萄糖,和10 mM HEPES, pH 7.4。
电极溶液: 120 mM甲磺酸钾, 15 mM KCl, 6 mM NaCl, 1 mM Mg2ATP, 2 mMNa3ATP, 10 mM HEPES,和0.5 mM EGTA (pH 7.2)。
将盖玻片连同在其上面培养的细胞转移进容纳1 ml的实验浴中，在显微镜台(Axiovert 100, 400倍放大率)上固定，并用上述的浴溶液浇注（superfundieren）细胞。然后从合适的细胞(其附着于盖玻片)中引出流。为此，将装有电解质溶液的微电极(具有大约1-3 μm的给定的、热抛光的尖部开口的玻璃毛细管，相当于3-5 MΩ的电极尖部的电阻)放在细胞上，并抽吸膜，使得在膜和电极之间形成“千兆欧姆-密封”，以便使渗漏流最小化。在“全细胞构型”的情况中，在电极尖部下穿透膜，由此可以测量流过细胞的所有离子通道的流。在得到“千兆欧姆-密封”后，经由前置放大器(CV-4 Headstage, Axon Instruments)和放大器(Axopatch 1D, Axon Instr.)施加给定的膜保持电位，并测量在此种情况下流过离子通道的流。
脉冲方案由细胞膜至-100 mV保持5 s的超极化和随后逐步以20 mV的步调至+100mV的除极化组成。
在加入环状蛋白质之前(对照)和之后进行该方案。储存如此得到的流引出，并借助程序PCLAMP 6.0进行分析。为此，从以前记录的流中减去在阿米洛利存在下得到的流引出，由此能够确定通过上皮钠通道的阿米洛利敏感的钠流。
测量的结果总结在表1中。各种肽的活性作为EC50 (以nM)给出。EC50是在最大活性(即流强度的最大增加，I)的50%时测得的有效浓度。
表1. 根据本发明的肽SEQ ID 1和SEQ ID 11 - 15和非根据本发明的肽SEQ ID NO: 19对细胞的阿米洛利敏感的钠离子流的活性。将活性作为最大活性的50%时的有效浓 度(EC50)给出。50
环肽 EC50(nM)
SEQ ID NO: 1 54
SEQ ID NO: 11 56
SEQ ID NO: 12 38
SEQ ID NO: 13 45
SEQ ID NO: 14 24
SEQ ID NO: 15 19
SEQ ID NO: 19 没有活性
在图8中示出了环肽SEQ ID NO: 1和11-15与活性的关系。最大活性用100%给出。
所示的研究表明，根据本发明的肽SEQ ID NO: 1和11-15是生物学上有活性的，而非根据本发明的肽SEQ ID NO: 19是无活性的。环肽SEQ ID NO: 1和11-15与环肽SEQ IDNO: 19之间的差异在于，在一般肽序列X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2内，用丙氨酸替换氨基酸T(在第5个位置)和氨基酸E (在第7个位置)和氨基酸E (在第10个位置)。因此，重要的是序列TPEGAE。X1和X2的结构对活性没有重大影响。
序列概要：
序列表
<110> APEPTICO FORSCHUNG UND ENTWICKLUNG GMBH
<120> 用于治疗由缺氧和低空气压造成的肺型高山病的药物组合物
<130> R 63872
<150> EP 12173983.3
<151> 2012-06-28
<160> 20
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Thr Pro Glu Gly Ala Glu
1 5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Cys Gly Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Cys Gly Gln Lys Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Arg Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Cys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Cys
1 5 10 15
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Phe Trp Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Lys Ser Pro Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Trp Tyr Glu
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Lys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Orn
<400> 13
Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 4Abu
<400> 14
Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Asp
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> β-Ala
<400> 15
Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Glu
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Thr Lys Pro Ile Glu Leu Gly Pro Asp Glu Pro Lys Ala Val
1 5 10
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Cys Gly Thr Lys Pro Ile Glu Leu Gly Pro Asp Glu Pro Lys Ala Val
1 5 10 15
Cys
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Cys Gly Gln Arg Glu Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Lys Pro Trp Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(5)
<223> 未知或其它
<400> 20
Thr Xaa Glu Xaa Xaa Glu
1 5

Claims (20)

1.肽在制备用于治疗肺型高山病的药物中的用途，所述肽由7-20个连续氨基酸组成且包含六聚体TX1EX2X3E，其中X1、X2和X3可以是任意天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有TNF受体结合活性且是首尾环化的，其中所述首尾环化的肽由连续氨基酸的序列组成，其选自：CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO:1)、KSPGQRETPEGAEAKPWYE (SEQ ID NO:11)、KGQRETPEGAEAKPWYG (SEQ ID NO:12)、鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG (SEQ ID NO:13)、4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD (SEQ ID NO:14)和β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE (SEQ ID NO:15)。
2.根据权利要求1的用途，其中所述肽由7-17个连续氨基酸组成。
3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于，所述肽包含氨基酸序列CGQRETPEGAEAKPWYC(SEQ ID NO:1)且经由C残基环化。
4.根据权利要求1或2的用途，其特征在于，所述肽通过C残基之间的二硫桥环化。
5.肽和药学上可接受的载体在制备用于治疗肺型高山病的药物组合物中的用途，所述肽由7-20个连续氨基酸组成且包含六聚体TX1EX2X3E，其中X1、X2和X3可以是任意天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有TNF受体结合活性且是首尾环化的，其中所述首尾环化的肽由连续氨基酸的序列组成，其选自：CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO:1)、KSPGQRETPEGAEAKPWYE (SEQ ID NO:11)、KGQRETPEGAEAKPWYG (SEQ ID NO:12)、鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG (SEQ ID NO:13)、4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD (SEQ ID NO:14)和β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE (SEQ ID NO:15)，其特征在于，所述肽配制成适合于施用给人类的药物组合物。
6.根据权利要求5的用途，其中所述肽由7-17个连续氨基酸组成。
7.根据权利要求5的用途，其中所述肽包含氨基酸序列CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ IDNO:1)且经由C残基环化。
8.根据权利要求5-7中的任一项所述的用途，其中所述肽通过C残基之间的二硫桥环化。
9.根据权利要求5-7中的任一项所述的用途，其特征在于，其包含药学上可接受的载体，所述载体选自水，氯化钠，磷酸钠，醋酸钠，碳酸钠，柠檬酸盐，甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，TRIS，林格氏溶液，右旋糖，甘露醇，海藻糖，蔗糖，山梨醇，果糖，麦芽糖，乳糖，汉克氏溶液，固定油，油酸乙酯，防腐剂，药学上可接受的蛋白质，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚氨基酸和氨基酸共聚物。
10.根据权利要求5-7中的任一项所述的用途，其特征在于，其包含药学上可接受的载体，所述载体选自改善等张性和化学稳定性的物质。
11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述水是注射用水。
12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述载体选自柠檬酸钠或葡聚糖。
13.根据权利要求5-7任一项所述的用途，其特征在于，其以下述量包含所述肽：1 μg至10 g。
14.根据权利要求13的用途，其特征在于，其以下述量包含所述肽：10 μg至1 g。
15.根据权利要求13的用途，其特征在于，其以下述量包含所述肽：1 mg至100 mg。
16.根据权利要求5-7中的任一项所述的用途，其特征在于，其以液体形式存在且以下述量包含所述肽：1 μg至10 g，且以0.5-10 ml的体积存在。
17.根据权利要求16的用途，其特征在于，其以下述量包含所述肽：10 μg至1 g。
18.根据权利要求16的用途，其特征在于，其以下述量包含所述肽：1 mg至100 mg。
19.根据权利要求16的用途，其特征在于，其以1-5 ml的体积存在。
20.用于根据权利要求5-7中的任一项所述的用途，其特征在于，所述肽存在于可喷雾的粉末制剂中或可喷雾的液体制剂中。
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