KR20090010207A - 스트레스 방어 효과를 나타내는 펩티드 물질, 그것을 기저로하는 약제학적 조성물 및 그것의 적용 방법 - Google Patents

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블라디미르 캬트스케레비취 캬빈손
이브거니 이오시포비취 그리고리에브
블라디미르 빅토로비취 말리닌
가리나 아나토리에브나 리쟈크
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오브체스트보 에스 오그라니체노이 오트베트스트베노스티유 “시아 펩타이즈”
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Abstract

본 발명은 극심한 충격의 결과로서 발생하는 기능적 또는 스트레스 유도성 장애를 위한 예방 및 치료의 의약적 수단에 과한 것으로, 스트레스 방어 효과를 나타내는 약제로서 사용될 수 있다. 스트레스 방어 효과를 나타내는 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신을 제공한다. 스트레스 방어 효과를 나타내는 약제학적 조성물이 제공되고, 그러한 조성물은 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 유효량의 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신뿐 아니라 약제학적으로 허용가능한 담채를 함유한다. 이러한 경우, 상기 약제학적 조성물은 비경구적 또는 비강내 투여에 적합한 형태로 존재한다. 극심한 충격에 의해 야기된 기능적 또는 스트레스 유도성 장애의 예방 및/또는 치료 방법으로, 상기 방법은 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는, 유효량의 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신을 함유하는 약제학적 조성물을 치료적 효과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 하루에 한번 이상 체중의 0.01 내지 100μg/kg의 투여량으로 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는 방법이 제공된다. 이러한 경우 상기 투여는 비경구적 또는 비강내로 수행된다.
약제학적 조성물. 스트레스, 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH

Description

스트레스 방어 효과를 나타내는 펩티드 물질, 그것을 기저로하는 약제학적 조성물 및 그것의 적용 방법{PEPTIDE SUBSTANCE REVEALING A STRESS PROTECTIVE EFFECT, PHARMACEUTICAL COMPOSITION ON ITS BASE AND THE METHOD OF ITS APPLICATION}
본 발명은 극심한 충격에 의해 야기된 기능적 또는 스트레스 유도성 장애의 예방 및 치료의 의학적 수단에 관한 것으로, 스트레스 방어 효과를 나타내는 약물로서 사용될 수 있다.
스트레스는 현대인의 삶의 고유한 특징이라고 알려져 있다. 스트레스는 다음의: 신경과민, 정신병 및 대사 소진으로 유도된 스트레스에 대한 유기체의 적응 반응, 불충분한 적응 반응, 병리학적 의존성 적응 반응, 유기체의 조기 노화가 본질인 몇몇 양상을 가진다.
스트레스의 모든 양상을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있는 약물이 종래 기술에서는 발견되지 않았다.
스트레스에 대한 임상 증상에 따라, 약초 강장제뿐 아니라, 신경 안정제, 항우울증제, 베타-아드레날린 수용체 차단제, 진정제와 같은 제제 및 최면 방법이 사용된다.
이러한 약물은 유기체 적응의 항-스트레스 반응을 변경하는 경향과, 대증 요법에만 적합하다는 단점이 있으며, 부작용을 낳을 수 있다.
비타민과 아미노산 또는 아미노산만 포함하는 조성물 또는 글루탐산(루마니아 특허 제76141호), 또는 시스테인(루마니아 특허 제74505호), 아르기닌(프랑스 특허 제2494113호)에 기초한 조성물, 또는 상기 언급된 아미노산과 함께: 글리신, 라이신, 티로신, 오르니틴, 히스틴(프랑스 특허 제5937M호, 루마니아 특허 제76044호)를 포함하는 조성물이 공지되어 있다.
상기 조성물의 비-특이적 활성뿐 아니라, 유기체 노화를 늦추지 못하는 점도 단점이라고 간주될 수 있다.
상기 언급된 이유는 신규한 의학적 수단을 설계해야할 필요성을 제공한다.
일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH (STN int. BD 등록 화학 초록의 등록 번호 RN-75007-24-8)을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신은 종래 기술에 공지되어 있다.
일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신의 실험 연구는 그것의 종래 알려지지 않은 스트레스 방어 효과를 나타냈다.
본 발명은 스트레스 방어 활성을 나타내는 펩티드의 성질, 그것을 기저로 하는 약제학적 조성물 및 그것의 적용 방법에 대한 수단을 달성하려는 과제를 제시하고 해결한다.
본 발명의 기술적 성과는 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신에 의해 나타난 스트레스 방어 효과는 물론, 활성 기저로서 상기 펩티드를 함유하는 약제학적 조성물의 제조를 위한 적용에 있고, 그러한 조성물은 대뇌 피질과 혈청에 있는 바이오겐(biogen) 아민의 수준를 조절하고, 다른 뇌 구조에 있는 c-fos 유전자 발현에 영향을 미치고, 혈중 엔케팔리나제 활성을 감소시켜 스트레스 방어 효과를 발휘하기 위해 의도되었다.
본 발명을 이용하여 기술적 성과를 달성하려는 목적의 가능성은 실험 스트레스를 동물에 유도함에 따라, 당해 학문 분야에서 일반적으로 받아들여지는 방법으로 수행된 연구에서 얻어진 실험 데이타를 함유하는, 실시예에 나타낸 신뢰성 있는 데이타에 의해 확인된다.
본 발명은 스트레스 방어 효과를 나타내는 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신에 관한 것이다.
스트레스 방어 효과를 나타내는 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신의 적용이 제시된다.
본 발명의 다음 양상은 스트레스 방어 효과를 나타내는 약제학적 조성물에 관한 것이고, 그러한 조성물은 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신의 유효양 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 한다.
이러한 경우, 상기 약제학적 조성물은 비경구적 또는 비강내 투여에 적합한 형태로 존재한다.
본 발명의 다음 양상은 극심한 충격에 의해 야기된 기능적 또는 스트레스 유도성 장애의 예방 및/또는 치료 방법으로, 상기 방법은 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는, 유효량의 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신을 함유하는 약제학적 조성물을 치료적 효과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 하루에 한번 이상 체중의 0.01 내지 100μg/kg의 투여량으로 환자에게 투여하는 것으로 이루어져 있다. 이러한 경우, 약제학적 조성물은 비경구적 또는 비강내 주입으로 투여된다.
일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신은 통상적인 펩티드 합성 방법을 이용하여 용액상태로 얻어진다.
상기 펩티드의 생물학적 활성은 건강한 사람의 혈청을 이용하여 스트레스 실험 모델인 무손상 동물과, 감소된 산소 분압의 형태로 극심한 충격에 노출된 인간 지원자로 연구되었다.
개념 "약제학적 조성물"이란 스트레스 방어 효과를 나타내는 약물과 같이 치료적 적용을 발견할 수 있는, 신규한 펩티드를 함유하는 그러한 다른 의학적 형태를 의미한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 얻기 위하여, 활성 기저로서 유효양의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH는 일반적으로 약제학에서 받아들여지는 합성 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담채와 혼합된다.
개념 "유효양"이란 유능한 전문가의 지식과 활성 및 독성 정량 지표에 따라 반드시 주어진 의약적 형태에서 유효하여야 하는 활성 기저의 그러한 양의 사용을 의미한다.
담체는 유기체에 투여하는데 바람직한 물질의 의학적 형태에 따라, 다양한 형태를 가질 수 있다.
비경구 투여의 경우, 담채는 안정성을 증가시키거나 멸균성을 보존하는 다른 성분들이 또한 첨가될 수 있지만, 일반적으로 생리 식염수 또는 멸균수를 포함한다.
비강내 투여의 경우, 담채는 다른 성분들이 또한 첨가될 수 있지만, 생리 식염수 또는 멸균수를 포함한다.
본 발명의 주요부는 도면과 표에 의하여 설명된다.
도 1은 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 랫의 대뇌 피질(1- 대조군; 2- 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH)에 있는 바이오겐 아민 수준에 미치는 효과를 나타낸다(대조군의 %).
도 2는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 랫의 혈청(1- 대조군; 2- 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH)에 있는 바이오겐 아민의 수준에 미치는 효과를 나타낸다(대조군의 %).
도 3은 삼투압 스트레스 이후의 송과선 세포에 있는 c-Fos 단백질 함량에 대한 면역조직화학적 동정을 나타낸다(a- 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH 제외; b- 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 비강내 투여 후 (c-Fos 단백질 생성 세포의 집단 )).
도 4는 삼투압 스트레스 이후의 송과선 실질을 나타낸다(a- 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH 제외, b- 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 비강내 투여 후).
도 5는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 인간 혈청에 있는 엔케팔리나제 활성에 미치는 효과를 나타낸다.
표는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 독성 연구에서 기니아 피그(guinea pig) 말초 혈관의 형태학적 및 생화학적 지표에 미치는 효과를 나타낸다.
본 발명은 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신의 합성의 실시예(실시예 1), 펩티드의 생물학적 활성을 확인하는 실시예(실시예 2, 3, 4, 5)에 의해, 독성 연구의 실시예(실시예 6)에 의해, 뿐만 아니라 그것의 약제학적 특성을 나타내고 예방적 및/또는 치료적 효과의 달성 가능성을 확인하는, 펩티드의 임상 투여 결과의 실시예(실시예 7)에 의해 설명된다.
실시예 1. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 합성
1. 화합물 명칭: 글루타밀-아스파틸-글라이신
2. 구조식: H-Glu-Asp-Gly-OH
Figure 112008079502162-PCT00001
3. 이온쌍을 제외한 분자식: C11H17N3O8.
4. 이온쌍을 제외한 분자량: 319.27.
5. 이온쌍: 아세테이트.
6. 외관: 무취의 백색 비정질 분말.
7. 합성 방법: 펩티드는 하기의 도식에 따른 통상적인 합성 방법에 의해 용액으로 얻어진다:
Figure 112008079502162-PCT00002
BOC - tert-부틸옥시카보닐기,
OSu - N-옥시숙신이미드 에스터,
DCC - N,N'-디시클로헥실카보디이미드,
OBzl - 벤질 에스터,
TFA - 트리플루오르아세트산,
HOBt - N-옥시벤조트리아졸
준비된 물질의 특징:
·성분 물질 함량: 97.93% (HPLC에 의해, 220 nm),
·TLC- 개별적, Rf=0.45 (아세토니트릴-물 1:2),
·습도 함량: 6%,
·0.01% 용액의 pH: 4.9
·구체적인 회전력: [α]D22: -31°(c=l, H2O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.
합성의 예시:
1) BOC-Glu(OBzl)-OSu, N-tert.부틸옥시카보닐-(γ-벤질)글루탐산의 N-옥시숙신이미드 에스터(I).
N-tert.부틸옥시카보닐-(γ-벤질)글루탐산 BOC-Glu(OBzl)-OH (33.7g, 0.1 mole)을 50ml N,N'-디메틸포름아미드에 용해시키고, -1O℃까지 냉각시켜; 30ml N,N'-디메틸포름아미드의 냉각된(4 내지 6℃) N,N'-디시클로헥실카보디이미드 용액(23.0g, 0.11mole)과 20ml N,N'-디메틸포름아미드의 N-히드록시숙시니이미드(13.0g, 0.11mole)을 교반하는 동안 첨가하였다. 반응성 혼합물을 얼음에서 12시간 동안 교반한 후, 실온에서 24시간 동안 방치하였다. 잔류물 N,N'-디시클로헥실우레아를 걸러낸 뒤, 형성된 활성 에스터 용액을 다음 단계 동안 추출하지 않고 사용하였다.
2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, N-tert.부틸옥시카보닐-(γ-벤질)글루타밀-(β-벤질) 아스팔테이트 (II).
(β-벤질)아파스라긴산 H-Asp(OBzl)-OH(28.0g, 0.12mole)과 36ml(0.12mole) 트리에틸아민을 50ml N,N'-디메틸포름아미드에 부유시켜 1시간 동안 교반하였다. 그 다음, 전단계동안 형성된 활성 에스터 BOC-Glu(OBzl)-OSu (I) 용액을 일부 첨가하였다. 반응성 혼합물을 48시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음 혼한물을 0.5N의 황산으로 pH 2 내지 3이 될때까지 산화시키고 에틸 아세테이트 4x50ml로 추출하였다. 추출물들을 모두 모은 후 0.5N H2SO4 3x50ml, 물 2x50ml, 5% NaHCO3 용액 2x50ml, 물 2x50ml, 포화 NaCl 용액 2x50ml으로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 용매를 진공에서 제거하여, 잔류물을 헥산의 존재하에 결정화시켰다. 50g의 생성물이 얻어졌다(92%). Rf= 0.34 (벤젠-아세톤 2:1).
3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (III), N-tert.부틸옥시카보닐-(γ-벤질)글루타밀-(β-벤질)아스파틸 글라이신의 벤질 에스터 (III).
2.7g(5mmole) 디펩티드와 0.95g(7mmole) 옥시벤조트리아졸을 테트라히드로푸란(10ml)에 용해시키고 -10℃까지 냉각시켰다. 1.44g(7mmole) 디시클로헥실카보디이미드를 5ml 테트라히드로푸란에 용해시키고 같은 온도까지 냉각시켰다. 3.4g(10mmole) 벤질 에스터 글라이신 토실산을 10ml 테트라히드로푸란에 용해시키고, 1.4ml(10mmole) 트리에틸아민을 상기 용액에 첨가하여 같은 온도까지 냉각시켰다. 얼음 용기에서 냉각시키고 디펩티드 용액과 옥시벤조트리아졸을 강격하게 교반하는 과정에서 카보디이미드를 더한 후, 10분 내에 글라이신 벤질 에스터 토실산 용액을 첨가하였다. 반응성 혼합물을 3시간 동안 교반하여, 얼음으로 냉각시킨 후, 실온에서 24시간 동안 방치하였다. 침전물 디시클로헥실우레아를 걸러내고, 여과액 을 진공에서 제거하며, 잔유물을 에틸 아세테이트(100ml)에서 용해시켰다. 용액을 그 다음 0.5N H2SO4, 물, 5% NaHCO3 용액, 물로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트를 진공에서 제거하고, 잔기를 에틸 아세테이트/헥산계에서 결정화하였다. 재-결정화는 혼합물을 진공에서 건조시킨 후에 이소프로판올로 수행되었다. 2.74g의 생산물이 얻어졌다(85%). Rf= 0.78 (벤젠-아세톤 1:1).
4) H-Glu-Asp-Gly-OH (IV), 글루타밀-아스파틸-글라이신.
보호 트리펩티드 BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (III) (2.7g)을 메틸 알코올-물(4:1) 혼합물(50ml)에 용해시키고 4시간 동안 촉매 Pd/C (5%)상에서 수화시켰다. 촉매를 걸러내고, 용매를 진공에서 제거하여, 잔류물을 KOH와 P2O5상에서 진공 건조시켰다. 그 다음 생성물을 2ml의 아염소산 메틸렌-트리플루오르아세트산 (5:1) 혼합물에 용해시키고 2시간동안 실온에 두었다. 완전 비-차단 반응은 아세토니트릴-물계(1:3)에서 TLC에 의해 조절되었다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔류물를 KOH상에서 진공 건조시켰다.
정제하기 위하여, 300mg 제제를 4ml 0.01% 트리플루오르아세트산에 용해시키고 역상 컬럼 50x250mm Diasorb-130-C16T, 7μm의 고-생산성 액체 크로마토그래피에 제공하였다. 크로마토그래피 Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. 크로마토그래피의 조건: A: 0.1% TFA; B: MeCN/0.1% TFA, 10분에 구배 B가 0 → 50%. 시료 부피 5ml, 215nm에서 검출, 190 내지 600nm를 조사, 용출 속도 10ml/분. 최고점을 선택하였다. 용매를 40℃미만의 온도에서 진공 제거하고, 제거물을 10ml 10% 아세트산 용액으로 반복하여 증폭(5배)시켰다.
최종적으로 잔류물을 20ml 탈이온수에 용해시키고 감압하에 동결 건조하였다.
무취의 비정질 백색 분말 형태인 정제된 물질 150mg을 얻었다.
5) 준비된 물질의 분석
·성분 물질 함량을 컬럼 Phenomenex C 18 LUNA 4.6x150mm의 HPLC로 확인하였다. A: 0.1% TFA, B: MeCN; 10분에 구배 B 0 내지 100%. 용출 속도 1ml/분. 220nm에서 검사, 190 내지 600nm를 조사, 시료 20μl. 기저 물질 함량 97.93%.
· TLC: 개별적, Rf= 0.45 (아세토니트릴-물 1:2, Sorbfil 평판, 실리카겔 8 내지 12μm, 염소/벤지딘에서 전개).
· 습도량: 6% (중량측정, 100℃에서 20mg을 건조시켜 중량 손실로 판단함).
· O.01 % 용액의 pH: 4.9 (전위차측정) .
· 구체적인 회전력: [α]D22: -31° (c=l, H2O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.
실시예 2. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 랫의 대뇌 피질과 혈청에 있는 바이오겐 아민 수준에 미치는 효과
연구는 300 내지 32Og 중량의 암수 27 마리의 백색 잡종 랫으로 수행되었다.
동물은 2.5μg/kg 투여량의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 5일 동안 매일 0.5ml 멸균 0.9% NaCl 용액으로 복막내 주사에 제공되었다.
대조군 랫은 동일한 부피의 멸균 0.9% NaCl 용액을 동일한 일정으로 제공받았다.
펩티드 투여가 완료되면, 동물을 살처분하여, 대뇌 피질과 혈청에있는 노르아드레날린, 도파민, 5-옥시인돌아세트산, 세로토닌 및 히스타민 함량을 측정하였다.
동물에게 펩티드의 투여는 대뇌 피질과 혈청에 있는 바이오겐 아민 수준의 유의적 변화에 기여한다는 것이 관찰되었다.
또한, 랫에 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 투여한 이후에 노르아드레날린, 도파민 및 세로토닌 함량의 신뢰성있는 증가가 기록되었다(도 1).
동시에 혈청에에 있는 도파민, 세포토닌 및 히스타민 함량의 감소가 기록되었다(도 2).
따라서, 수행된 연구는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 스트레스 조절 중심과 주변 기전에 영향을 미치는 펩티드를 승인하는, 대뇌 피질 및 혈청에 있는 바이오겐 아민 함량에 영향을 미치는 조절 효과를 발휘한다는 것을 나타냈다.
실시예 3. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 정서적 스트레스를 받고 있는 랫 시상하부 뇌실결핵의 뉴런이 있는 c-fos 유전자의 발현에 미치는 효과
정서적 스트레스는 다른 뇌 구조의 초기 유전자 발현을 증폭시킨다. 신경 세포 활성화에 대한 공지된 마커로는 한쪽 측면에 자극이 미치는 상태에서 전사 변화와 다른 측면에 정보적 시그날 현실화의 장기간 표현형 변화로의 진행 중 조절자로서 기능을 하는 직접 초기 반응 유전자인, c-Fos 단백질이 있다. Fos형 단백질은 자극에 노출된 후 다른 시간대에 활성화된다. 따라서, c-fos mRNA 발현은 몇분 안에 시작되고 30 내지 60분에 최고점에 도달한다. c-fos 단백질의 최대 합성은 자극에 노출될 후 1 내지 3시간 뒤에 관찰되며, 4 내지 6시간 후에 감소하기 시작한다. 스트레스 내성 동물과 스트레스 충격에 민감한 동물의 뇌에서의 C-fos 유전자 발현은 다르다. 뇌구조(피질, 편도선, 시상 하부 및 대뇌 체간신경)에서 가장 집약적인 c-fos 유전자 발현은 정서적 스트레스에 민감한 랫에서 나타났다. 동일한 실험 조건에서 스트레스 내성 랫의 경우, c-fos 유전자 발현은 하부각막연 피질과 후각 핵에서만 기록되었다.
펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 효과는 스트레스-내성 및 스트레스-취약 동물뿐 아니라 정서적 스트레스에 노출된 랫의 시상하부(PVH) 결함수포성 핵에서 연구되었다.
실험은 28마리의 Wistar 랫으로 수행되었다.
동물 행동을 사전에 "행동관찰" 시험으로 평가하였다(정서적 스트레스에 대한 랫의 내성 정도를 확인하기 위한 목적). 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 효과는 스트레스-내성 및 스트레스-취약 랫으로 연구되었다. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 제1 "행동 관찰"시험을 한지 7 내지 10일 이후에 랫당 0.1 및 0.01μg의 투여량으로 복막내 주사하였다. 주사한지 1시간 후에 랫을 60 분간 운동 제한으로 조절되는, 정서적 스트레스에 노출하였다.
초기 c-fos 유전자 발현의 생성물인 Fos 단백질을 함유하는 세포를 동정하기 위하여, Fos-양성 세포의 자동 계수로 뇌부위의 면역조직화학적 조사를 수행하였 다. c-fos 유전자 유도의 특징은 PVH에서 연구되었다.
이러한 연구들은 스트레스-내성으로 확인된 랫의 PVH에 있는 Fos-양성 세포의 갯수가 정서적 스트레스에 민감한 동물에서 보다 현저히 많다는 것을 나타냈다. 대조군(스트레스에 노출된 그룹뿐 아니라 스트레스에 노출되지 않은 그룹) 모두 동일한 결과를 나타냈다.
0.01μg의 투여량으로 펩티드 H-GIu- Asp-Gly-OH의 투여는 스트레스에 노출된것 뿐 아니라 스트레스에 노출되지 않은, 스트레스-내성 랫에 있는 Fos-양성 신경 세포의 갯수를 증가시켰다. 반면, 0.1μg 투여량의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH은 스트레스-내성뿐 아니라 스트리스-취약 랫의 PVH에 있는 Fos-양성 신경 세포의 갯수를 감소시켰다. 스트레스를 감안할 때 0.1μg 투여량의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH는 스트레스-내성 동물에 있는 Fos-양성 뉴런 갯수를 증가시킨다.
따라서, c-fos 유전자 발현을 증가시키고, 뉴런을 활성화시키며 적응 반응을 형성하는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 투여량-의존성 스트레스 방어 효과가 나타났다.
실시예 4. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 삼투압 스트레스의 경우 랫 송과선에 있는 c-Fos 단백질 수준에 미치는 효과
시상하부-뇌하수체 복합체와 함께, 송과선은 스트레스 충격에 대한 유기체의 다중 적응성 반응을 형성하는데 관여한다. 스트레스는 송과선에서 멜라토닌과 산화, 삼투압, 심리적 및 기타 여러 스트레스의 부정적인 충격을 감소시킬 수 있는 펩티드 물질의 생산을 증가시킨다.
송과선은 혈액뇌관문을 가지지 않는 신경혈관에 속하므로, 뇌 혈액 순환에 존재하는 고-분자 생물학적 활성 물질, 특히 펩티드에 매우 민감하다. 유일하게 후각계에 위치해 있고 외부 환경뿐 아니라 중추신경계와의 화학적 결합은 물질을 비-파괴적으로 뇌 혈액 순환과 신경혈액 기관으로 침투시킬 수 있다. 용액 확산은 지주막하 공간을 거쳐 인자 뉴런을 따라 비점막하조직 및 비림프계까지 일정하다.
비강내 투여된 H-Glu-Asp-Gly-OH 펩티드의 스트레스-영향받은 랫 송과선에 있는 c-Fos 단백질 함량에 미치는 효과가 연구되었다. c-Fos 단백질 함량의 면역조직화학적 연구는 2개의 랫-무손상 그룹에서 수행되었 48-시간 삼투압 스트레스에 제공하였다. 그 후에 동물당 0.5μg 투여량의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 0.1ml 멸균 생리 0.9% NaCl 용액으로 비강내 투여(마지막 주입은 물질을 받기 2시간 전에 수행됨)하였다. 모든 동물 그룹의 송과선 실질을 빛 광학 장치를 사용하여 연구하였다.
C-Fos 단백질은 스트레스를 포함하는 극단적 인자의 충격하에 송과선의 합성 과정을 개시하는 유발 자극 중 하나이다. 생각컨대, 본 발명자의 실험에 의해 나타난, 삼투압 스트레스-영향받은 랫의 송과선의 거의 완전한 c-Fos 단백질 결핍은 c-fos 유전자 생성물의 최대양이 스트레스 요인으로 충격받은지 1 내지 2시간 후에 관찰되기 때문에, 상기 스트레스의 만성적 특징과 관련있다. 만성적 스트레스는 혈장내 글루코코르티코이드의 함량을 증가시키기 때문에 PVH에서의 c-fos 유전자 활성을 억제한다.
스트레스 상태에서의 송과샘세포에 있는 c-Fos 단백질 함량의 완만하나 신뢰 성 있는 증가는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 비강내 주입 후에만 관찰된다(도 3).
그러한 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 효과는 스트레스 상태에서만 관찰된다. 이것은 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 유기체의 극한 상태의 경우 송과선 활성에 대한 펩티드 자가-조절에 관여한다는 것을 나타낸다.
c-Fos 단백질이 다른 송과샘세포 사이에 불균일하게 분배된다는 것이 발견되었다. 스트레스는 세포질내 c-Fos을 함유하는 집단(5 내지 10개의 세포로 이루어짐)를 확인할 수 있다. 이러한 송과샘세포 집단은 관심 세포군일 수 있다.
송과선 실질 상태의 평가는 H-Glu-Asp-Gly-OH 펩티드의 비강내 주입에 의한 모세관 및 모세혈관주위의 팽창으로 유도된 삼투압 스트레스의 부분적 감소를 나타낸다(도 4).
따라서, 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH는 유기체가 극한 인자로 충격받은 경우 송과선에 영향을 미친다. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH은 삼투압 스트레스에 대한 송과선 실질 구조의 병리학적 변화를 억제하고, 송과선에 미치는 효과는 특정 유전자의 활성화에 의해 매개된다.
실시예 5. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 인간 혈청에 있는 엔케팔리나제의 활성에 미치는 효과
본 연구는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 오피오이드(opioid) 활성을 확인하기 위한 것이다. 오피오이드 활성은 다른 유형의 오피오이드 수용체와 펩티드의 상호 작용에 의해 그리고 본래 엔케팔린의 농도에 대응하여 증가하는 엔케팔지나제를 억제하여 조절될 수 있다.
예를 들면, 엔케팔린과 같은 내인성 오피오이드 펩티드 분해 효소의 활성에 영향을 미치기 위한 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 능력은 인간 혈청 효소에 의한 낮은 농도(0.15μM)의 [3H]Leu-엔케팔린의 분해로 판단하는 반응속도 연구로 측정되었다. 통상적으로 사용되는 엔케팔리나제 억제제 N-카복시메틸-Phe-Leu (N-CMPL)과 바시트라신을 비교물질로 사용하였다. 5명의 건강한 혈액제공자로부터 추출한 혈청의 대략적인 엔케팔리나제 활성 인비트로에서 측정되었다. 결과는 4번의 연구 이후에 평가되었다.
도 5는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 인간 혈청에 있는 엔케팔리나제 활성에 미치는 효과를 나타낸다.
본 연구는 0μg/ml의 최대 농도로 배지에 도입된 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 혈청 엔케팔리나제의 활성을 억제한다는 것을 나타낸다(도 5). 억제의 정도는 N-CMPL(10μg/ml) 및 바시트라신(50μg/ml)와 유사하였다.
혈액 엔케팔린의 효소 분해는 수분이 걸리는데, 그 이유는 이러한 효소가 내인성 오피오이드 펩티드의 말초적 생물학적 효과를 가장 잘 반영하기 때문이라는 것이 알려져있다. 혈청 엔케팔리나제의 활성을 억제하는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 적용은 스트레스-유도성 장애를 고치기 위한 그것의 사용에 제공하는 내인성 오피오이드 펩티드의 조절 특성을 보전하기 위함이다.
실시예 6. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 독성 연구
펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH의 공통 독성을 "신규한 약리학적 물질의 실험 연 구(임상-전)용 책자 (2000)" 에 기재된 요건에 따라 연구하였다: 물질의 단일 투여의 경우 급성 독성뿐 아니라 펩티드의 장기간 투여의 경우 아급성 및 만성 독성.
급성 독성은 20 내지 22g 체중을 갖는 66마리의 백색 잡종 수컷 마우스로 연구되었다. 동물을 임의로 6개의 동일한 그룹으로 나누었다. 물질은 1mg/kg, 2mg/kg, 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg의 투여량으로 0.25ml 멸균 0.9% NaCl 용액 상태로 동물에게 한번 근육내 투여되었다. 대조군 동물들도 같은 부피의 0.9% NaCl 용액을 제공받았다.
아급성 독성은 180 내지 220g 체중을 갖는 64마리의 백색 잡종 수컷 랫으로 연구되었다. 실험 동물은 매일, 하루에 한번, 90일 동안 1μg/kg, 0.1 mg/kg, 1mg/kg 투여량의 물질을 0.5 ml 멸균 0.9% NaCl 용액으로 근육내 제공받았다. 대조군 동물들도 같은 부피의 멸균 0.9% NaCl 용액을 제공받았다. 동물 말초 혈액의 형태학적 조성물 및 특성은 물질을 투여하기 전과, 물질의 투여를 개시하고 30, 60 및 90일째 되는 날에 연구되었다. 혈액의 생화학적 및 상호유추적인 지표가 실험 완료시 연구되었다.
만성 독성 연구는 310 내지 350g 몸무게를 갖는 92 마리의 수컷 기니아 피그로, 물질의 권장 임상 투여기간을 기초로하여, 6달 동안 수행되었다. 실험 동물은 매일, 하루에 한번 1μg/kg, 0.1mg/kg, 1mg/kg 투여량의 펩티드를 0.5ml 멸균 0.9% NaCl 용액으로 근육내 제공받았다. 대조군 동물들도 같은 부피의 멸균 0.9% NaCl 용액을 같은 일정으로 제공받았다. 통상적 방법이 동물 말초 혈액에서의 하기의 지표를 평가하기 위해 사용되었다: 적혈구 수, 헤모글로빈 수, 망상 적혈구 수, 혈소 판 수, 백혈구 수, 백혈구 형태, 적혈구 침강 속도(ESR), 적혈구 내성. 이와 관련하여, 혈청내 총 단백질 함량을 Lowry 방법으로 확인하였고, 칼륨과 나트륨 함량도 혈장 흡광광도법을 이용하여 확인하였다. 시험의 종결후 동물의 뇌 및 척수, 척수 신경절, 갑상선, 부갑상선, 부신, 고환, 뇌하수체, 심장, 폐, 대동맥, 간, 신장, 방광, 췌장, 위, 소장, 대장, 흉선, 비장, 림프절 및 골수의 병리 형태학적 연구를 수행하였다.
급성 독성 연구는 임상 투여에 권장되는 치료 투여량을 5000배 이상 초과하는 양으로 동물에게 연구 펩티드를 단일 투여하는 것이 독성 반응을 야기하지 않는것으로 나타났고, 이는 물질의 가능한 치료 투여량의 전체 범위를 지시하는 것이다.
펩티드의 아급성 및 만성 독성 연구는 치료 투여량을 100 내지 1000배 초과하는 양으로 물질을 장기 투여하는 경우 부작용이 없음을 나타내었다. 펩티드가 기니아 피그의 혈액의 형태학적 조성물에 미치는 효과에 대한 연구는 물질의 투여를 개시한지 3달 이후에 백혈구의 양이 증가한다는 것을 나타냈다. 본 지표는 6개월 간의 관찰로 표준화되었다(표 참고). 동물 혈액에 대한 모든 형태학적 조성물의 지표는 큰 변화 없이 남아있었다. ESR에 미치는 물질의 신뢰성 있는 효과, 적혈구 내성 및 혈청의 생물학적 지표가 나타나지 않았다.
동물의 일반적 상태, 말초 혈액의 형태학적 및 생화학적 지표, 내기관의 형태학적 상태, 심혈관계 및 호흡기계의 상태뿐 아니라 간과 신장의 기능에 대한 평가는 유기체에서 아무런 병리학적 변화를 나타내지 않았다.
공통 독성의 부재는 임상 연구용 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 권장하게 한다.
실시예 7. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 저 산소 분압의 영향 하에 인간의 기능적 상태에 미치는 효과.
펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 저 산소 분압의 영향 하의 극한 조건에서 인간의 기능적 상태 및 운동 능력에 미치는 효과는 80명의 20 내지 22살의 건강한 남성을 조사하여 연구되었다. 연구 참가자를 3그룹으로 나누었다: 메인 그룹 I 및 II는 각각 30명으로 이루어졌으나, 대조군은 20명으로 형성되었다. 호흡기계, 심혈관계 및 중추 신경계 조사를 포함하는 배경 연구를 실험 첫날에 수행하였다.
배경 연구를 완료한 다음, 메인 그룹 I에 속하는 구성원들은 2틀 동안 하루에 3번씩, 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 1ml 생리수 상태로 5.0mg의 투여량 (하위 그룹 I), 1.0ml의 생리수 상태로 100.0μg 투여량 (하위 그룹 II) 및 1.0μg 투여량 (하위 그룹 III)으로 비강내로 제공받기 시작했다. 또한, 메인 그룹 I에 속하는 구성원들은 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 각 과정마다 10mg (하위 그룹 I), 200μg (하위 그룹 II) 및 2μg (하위 그룹 III)의 투여량으로 비강내 제공받았다.
메인 그룹 II에 속하는 구성원들은 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 활성 기저로서 함유하는 약제학적 조성물을, 배경 연구가 완료된 후에, 2틀 동안 하루에 한번, 매일 1ml의 생리수 상태로 5.0mg(하위 그룹 I)의 투여량으로, 1.0ml 생리수 상태로 100.0μg (하위 그룹 II)의 투여량 및 1.0μg(하위 그룹 III)의 투여량으로 근육내 제공받았다.
대조군에 속하는 구성원들은 주입하는 도안 물의 형태인 플라시보를 제공받았다.
시험 4일째에 모든 3개의 그룹에 속하는 구성원들을 압력 챔버 SBK-80를 사용하여 사용하여 모방된, 보조 산소 공급없이 그들을 박람회 60분 동안 5000 미터 높이 까지 "올르게 하여" 저산소성 저산소증의 효과를 미치도록 하였다. 실험 참가자들을 "올라가기" 시작 전, 실험 도중 및 완료 후에 빨리 조사하였다. 실험 5일째 되는 날 모든 참가자들은 전기(full scale) 최종 검사에 제공하였다. 연구하는 동안 모든 참가자들의 반응성 불안은 보통 수준(31 내지 45 포인트)이었다. 그러나, 상기 지표와 다르게 지시된 역학은 상기 지표내의 다른 그룹에서 관찰되었다. 활성기저로서 다른 투여량의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 투여한지 2틀 후 실험 참가자의 반응성 불안은 대조군에 속하는 구성원들에 비해 약제학적 조성물의 투여 및 투여 방법에 따라 10 내지 13% 감소하였다. 저산소증 충격을 한 다음날 플라시보를 제공받은 대조군은 초기 수준에 비해 반응성 불안의 9 내지 10% 증가를 나타냈으나, 활성 기저로서 다른 투여량의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 제공받은 참가자들은 투여 방법에 관계없이 초기 수준과 동일한 지표를 나타냈다. 유사한 역학이 "SAN" ("건강상태, 활성, 기분")실험의 결과에서 발견되었다.
저산소성 저산소증은 정도는 다르지만, 모든 세 그룹의 주관적 상태를 악화시킨다. 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 제 공받은 사람들은 다른 투여량의 펩티드를 근육내 투여한 경우에서의 초기 수준과 동일한 주관적 상태 또는 비강내 주입의 경우 4 내지 5% 감소된 주관적 상태가 보고되었다. 플라시보 그룹은 주관적 상태의 10 내지 15% 감소를 나타냈다. 저산소증의 충격을 한 다음날, 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물로 처리된 연구 참가자의 주관적 상태는 근육내 투여의 경우보다 초기 수준이 15% 또는 비강내 주입의 경우보다 10%까지 높았으나, 플라시보 그룹은 초기 수준보다 4 내지 5% 악화된 지표를 나타냈다. 가장 안정된 지표는 근육내 주사 및 비강내 투여 모두 5.0mg 투여량의 연구 조성물을 투여받은 사람에서 기록되었다는 것이 주목된다.
얻어진 데이타는 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH가 스트레스에 대한 정서적 및 행동적 증상을 감소시키고, 불안을 감소시키며, 활동성을 강화시키고, 상태 및 기분을 증가시켜 실험 참가자의 주관적 상태에 현저히 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 근육내 그리고 비강내로 다른 투여량의 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 투여받은 연구 참가자들은 저산소성 저산소증에 더 내성이 있다는 것을 객관적으로 나타냈다. 저상소증에 대한 우수한 내성이 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 제공받은 시험 참가자의 80 내지 90% 그리고 플라시보 그룹 구성원의 60%까지 나타났다.
심박수(HR) 동력은 모든 그룹에서 유사했다. 저산소증은 HR의 신뢰성있는 증가를 야기했다: 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물은 제공받은 연구 참가자들은 투여량과 투여 방법에 따라, 지표의 10 내지 20% 증가를 나타냈으나, 플라시보 그룹에 속하는 구성원들은 30 내지 40% 증가를 나타냈다. 저산소성 시험을 완료한 후 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물로 처리된 그룹은 초기 수준과 유사한 HR수준을 나타냈으나, 플라시보 그룹은 초기 수준 보다 6 내지 7% 높은 HR수준을 나타냈다. 수축 동맥 압은 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH을 함유하는 약제학적 조성물로 처리된 그룹에서 시험 10 내지 15분까지 초기 수준으로 돌아갔으나, 플라시보 그룹은 저산소성 시험이 끝난 후에만 초기 압력을 회복하였다.
시험 참가자의 수축 동맥압 동력은 유사하였다: 저산소성 시험의 처음 10분 동안 증가, 그 후 점차 감소하였다. 신체 부하 능력은 모든 그룹의 시험이 끝날때에 높았으나, 다른 정도로 증가하였다. 그러므로, 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-HO를 함유하는 약제학적 조성물로 처리된 연구 참가자들의 신체 부하 능력 지표(PWC 170) 및 최대 산소 소비량은 투여량 및 투여 방법에 따라 10 내지 22% 까지 증가하였으나, 플라시보 그룹은 상기 지표가 10 내지 11%까지만 증가하였다. 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH 효과의 두드러지는 특징은 저산소증 충격 이후에 투여된 신체 부하의 경우 폐환기를 감소시킨다는 점이다.
제공된 데이타는 저산소성 시험 동안 기능적 상태가 플라시보 그룹에서 보다 다른 투여량의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물로 처리된 그룹에서 더 생리적으로 충분하다는 것을 나타낸다.
따라서, 보조 산소의 공급 없이 5000 미터 높이까지 압력 챔버 "올라가기"에 제공된 인간 지원자에서의 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH 효율성 연구는 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 제공받은 연구 참가자가 객관적 그리고 주관적으로 저산소증 충격에 더 내성을 나타낸다는 것을 보여준다. 나타난 투여량-의존성 효과는 연구 참가자들의 기능적 상태 장애의 정도에 따라, 근육내와 비강내로 1ml 생리수 상태로 5mg 내지 1μg 투여량의 연구된 약제학적 조성물의 적용을 권장할 수 있다.
생리학적 지표의 변동은 활성 기저로서 펩티드 H-Glu-Asp-Gly-OH를 함유하는 약제학적 조성물로 처리된 연구 참가자가 속하는 그룹에서 더 적었다. 또한, 이러한 지표는 H-Glu-Asp-Gly-OH의 스트레스 방어 특성을 나타내는 상기 그룹의 배경값에 바로 회복되었다.
Figure 112008079502162-PCT00003
SEQUENCE LISTING <110> Obschestvo s ogranichennoi otvetstvennostyu "SIA PEPTIDES" <120> Peptide substance revealing a stress protective effect, pharmaceutical composition on its base and the method of its application <130> 24-00478RU <150> 2006117586 <151> 2006-05-23 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> H-Glu-Asp-Gly-OH reveals a stress protective effect by regulating the content of biogen amines in the brain cortex and blood, by influencing c-fos gene expression in different brain structures and reducing the activity of encephalinases in the blood <400> 1 Glu Asp Gly 1

Claims (6)

  1. 스트레스 방어 효과를 나타내는 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신.
  2. 스트레스 방어 효과를 나타내는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 제1항에 따른 펩티드의 이용.
  3. 스트레스 방어 효과를 나타내는 약제학적 조성물로, 상기 조성물은 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는, 유효양의 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신 및 약제학적으로 허용가능한 염을 함유하는 조성물인 것을 특징하는 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 비경구적 또는 비강내 투여에 적합한 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 극심한 충격에 의해 야기된 기능적 또는 스트레스 유도성 장애의 예방 및/또는 치료 방법으로, 상기 방법은 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Gly-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는, 유효량의 펩티드 글루타밀-아스파틸-글라이신을 함유하는 약제학적 조성물을 치료적 효과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 하루에 한번 이 상 체중의 0.01 내지 100μg/kg의 투여량으로 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 투여는 비경구적 또는 비강내 주입으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020087028149A 2006-05-23 2007-03-05 스트레스 방어 효과를 나타내는 펩티드 물질, 그것을 기저로하는 약제학적 조성물 및 그것의 적용 방법 KR20090010207A (ko)

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