EA020866B1 - Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция - Google Patents

Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция Download PDF

Info

Publication number
EA020866B1
EA020866B1 EA201300197A EA201300197A EA020866B1 EA 020866 B1 EA020866 B1 EA 020866B1 EA 201300197 A EA201300197 A EA 201300197A EA 201300197 A EA201300197 A EA 201300197A EA 020866 B1 EA020866 B1 EA 020866B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
peptide
incubation
capmptothecin
protective effect
Prior art date
Application number
EA201300197A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300197A1 (ru
Inventor
Петр Александрович Белый
Евгений Александрович ЧЕРТОРИЖСКИЙ
Михаил Владимирович ОВЧИННИКОВ
Original Assignee
Замертон Холдингс Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Замертон Холдингс Лимитед filed Critical Замертон Холдингс Лимитед
Priority to EA201300197A priority Critical patent/EA020866B1/ru
Priority to PCT/IB2014/000456 priority patent/WO2014162190A2/ru
Priority to EP14734215.8A priority patent/EP2963052A2/en
Publication of EA201300197A1 publication Critical patent/EA201300197A1/ru
Publication of EA020866B1 publication Critical patent/EA020866B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается пептидов, обладающих цитопротекторной активностью, выбираемых из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-NH-СН-СН3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, Ala-Asp-Glu, Lys-Asp-Glu и Asp-Glu-Gly, при этом пептиды являются химически стабильными при хранении. Также предложена фармацевтическая композиция, содержащая в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-NH-СН-СН3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, Ala-Asp-Glu, Lys-Asp-Glu или Asp-Glu-Gly. Выраженное цитопротекторное действие позволяет использовать фармацевтическую композицию в пищевой, косметологической и фармацевтической промышленности.

Description

(57) Изобретение относится к медицине и касается пептидов. обладающих цитопротекторной активностью. выбираемых из группы. включающей Αс-Α8р-С1и-ΟΗ. Η-Α8р-С1и-ΟСΗ3. Η-Α8рС1и-NИ-СН2-СН3. Η-Vа1-Α8р-С1и-ΟΗ. Η-^еи-Α8р-С1и-ΟΗ и Η-Α1а-Α8р-С1и-Α^д-ΟΗ. Α1а-Α8р-С1и. ^у8-Α8р-С1и и Α8р-С1и-С1у. при этом пептиды являются химически стабильными при хранении. Также предложена фармацевтическая композиция. содержащая в эффективном количестве пептиды. выбираемые из группы. включающей Αс-Α8р-С1и-ΟΗ. Η-Α8р-С1и-ΟСΗ3. Η-Α8р-С1иNИ-СН2-СН3. Η-Vа1-Α8р-С1и-ΟΗ. Η-Ьеи-Α8р-С1и-ΟΗ и Η-Α1а-Α8р-С1и-Α^д-ΟΗ. Α1а-Α8р-С1и. ^у8-Α8р-С1и или Α8р-С1и-С1у. Выраженное цитопротекторное действие позволяет использовать фармацевтическую композицию в пищевой. косметологической и фармацевтической промышленности.
Изобретение относится к медицине и касается биологически активных пептидов, обладающих цитопротекторой активностью, и фармацевтической композиции на их основе.
Уровень техники
Известен ряд коротких пептидов, содержащих в своей структуре производные дипептида Υ -Ь-С1иЬ-Лзр-Х и имеющие свойства межклеточных медиаторов [патенты РФ №№ 2177802; 2161501; 2301074; 2304444; 2155063]. Недостатком этих соединений является их химическая неустойчивость и склонность к самопроизвольным перегруппировкам. В случае, если X - остаток глицина, происходит самопроизвольная миграция этого остатка от α-карбоксила аспарагиновой кислоты к β-карбоксилу. И хотя это превращение может происходить в случае любой аминокислоты, скорость этой реакции сильно зависит от стерических препятствий [РЬаттас1иРса1 Рс^сагеН. Уо1. 11, № 5, 1994, р. 751-758; РЬаттас1иРса1 Рс^сагеН. Уо1. 7, № 8, 1990, р. 787-793]. В случае, если X - остаток пролина или любое другое органическое соединение с вторичной аминогруппой, то происходит самопроизвольный разрыв связи между этими остатками [8уи1йеРс рерРРе8, 8ес. еР., Сгедогу А. Стай, Ох&тР Ищу. Рге88 2 0 02, р. 283]. Следует отметить, что эти превращения приводят к частичной рацемизации остатка аспарагиновой кислоты.
Раскрытие изобретения
Авторами настоящего изобретения впервые предложены пептиды, обладающие цитопротекторной активностью, выбираемые из группы, включающей Ас-А8р-С1и-ОИ, Н-А8р-С1и-ОСИ3, Н-А8р-С1и-ИНСН2-СН3, Н-Уа1-А8р-С1и-ОН, Н-Ьеи-А8р-С1и-ОН и Н-А1а-А8р-С1и-Агд-ОН. Пептиды, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, оказывают выраженное цитопротекторное действие, при этом являются химически стабильными при хранении.
Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая цитопротекторным действием, содержащая в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ас-А8р-С1и-ОН, Н-А8р-С1и-ОСН3, Н-А8р-С1и-ИН-СН2-СН3, Н-Уа1-А8р-С1и-ОН, Н-Ьеи-А8р-С1и-ОН или Н-А1а-А8р-С1и-Агд-ОН.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - количество клеток во флаконе и доля погибших Р1+ клеток после инкубации с пептидом НА8р-С1и-ИН-СН2-СН3 (ИЕИНЕ1);
фиг. 2 - количество клеток во флаконе и доля погибших Р1+ клеток после инкубации с пептидом Ас-А8р-С1и-ОН (АсИЕ);
фиг. 3 - количество клеток во флаконе и доля погибших Р1+ клеток после инкубации с пептидом НА8р-С1и-ОСН3 (ИЕОМе);
фиг. 4 - количество клеток во флаконе и доля погибших Р1+ клеток после инкубации с пептидом НУа1-А8р-С1и-ОН (УИЕ);
фиг. 5 - количество клеток во флаконе и доля погибших Р1+ клеток после инкубации с пептидом НЬеи-А8р-С1и-ОН (ЬИЕ);
фиг. 6 - количество клеток во флаконе и доля погибших Р1+ клеток после инкубации с пептидом НА1а-А8р-С1и-Агд-ОН (АИЕР);
фиг. 7 - уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом Н-А8р-С1и-ИН-СН2-СН3 (ИЕИНЕ!);
фиг. 8 - уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом Ас-А8р-С1и-ОН (АсИЕ);
фиг. 9 - уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом Н-А8р-С1и-ОСН3 (ИЕОМе);
фиг. 10 - уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом УИЕ;
фиг. 11 - уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ЬИЕ;
фиг. 12 - уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом АИЕР;
фиг. 13 - протективное действие пептида Н-А8р-С1и-ИН-СН2-СН3 (ИЕИНЕ!) на клетки НеЬа в присутствии капмтотецина;
фиг. 14 - протективное действие пептида Н-А8р-С1и-ИН-СН2-СН3 (ИЕИНЕ!) на клетки И1Н3Т3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 15 - протективное действие пептида Ас-А8р-С1и-ОН (АсИЕ) на клетки №Н3Т3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 16 - протективное действие пептида Ас-А8р-С1и-ОН (АсИЕ) на клетки НеЬа в присутствии капмтотецина;
фиг. 17 - протективное действие пептида Н-А8р-С1и-ОСН3 (ИЕОМе) на клетки НеЬа в присутствии капмтотецина;
фиг. 18 - протективное действие пептида Н-А8р-С1и-ОСН3 (ИЕОМе) на клетки И1Н3Т3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 19 - протективное действие пептида Н-Уа1-А8р-С1и-ОН (УИЕ) на клетки №Н3Т3 в присутст- 1 020866 вии капмтотецина;
фиг. 20 - протективное действие пептида Н-Уа1-Акр-С1и-ОН (УИЕ) на клетки НеЬа в присутствии капмтотецина;
фиг. 21 - протективное действие пептида Н-Ьеи-Акр-СШ-ОН (ЬИЕ) на клетки НеЬа в присутствии капмтотецина;
фиг. 22 - протективное действие пептида Н-Ьеи-Акр-Си-ОН (ЬИЕ) на клетки №Н3Т3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 23 - протективное действие пептида Н-А1а-Акр-С1и-Агд-ОН (АИЕК) на клетки Ы1Н3Т3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 24 - протективное действие пептида Н-А1а-Акр-С1и-Агд-ОН (АИЕК) на клетки НеЬа в присутствии капмтотецина.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение впервые обеспечивает биологические активные пептиды, обладающие цитопротекторной активностью и выбираемые из группы, включающей Ас-Акр-С1и-ОН, Н-Акр-С1и-ОСН3, Н-Лкр-С1и-КН-СН2-СН3. Н-Уа1-Акр-С1и-ОН, Н-Ьеи-Акр-СШ-ОН и Н-А1а-Акр-С1и-Агд-ОН, причём пептиды являются химически стабильными при хранении.
Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, обладающую цитопротекторным действием, содержащую в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей АсАкр-С1и-ОН, Н-Акр-С1и-ОСН3, Н-А5р-С1и-ИН-СН2-СН3, Н-Уа1-Акр-С1и-ОН, Н-Ьеи-Акр-С1и-ОН или НА1а-Акр-С1и-Агд-ОН. Обнаруженный цитопротекторный эффект позволяет использовать предложенную фармацевтическую композицию в пищевой, косметологической или фармацевтической промышленности.
Примером ацетилированного на Ν-конце пептида является пептид Ас-Акр-С1и-ОН (АсИЕ). Примеры, иллюстрирующие соединения со сложноэфирной связью на С-конце, являются пептиды Н-Акр-С1иОСН3. Примером соединения с амидной связью на С-конце является пептид Н-Акр-С1и-МН-СН2-СН3. Синтез пептидов осуществляют с использованием общепринятых в химии биологически активных пептидов методических приемов [А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Химический синтез пептидов. Киев, Наукова думка, 1992 г.; Пептиды, основные методы образования пептидных связей. Москва, Мир, 1983 г.], как представлено в примерах 1-6.
Условные сокращения:
Вос - трет-бутилоксикарбонил
Βζ1 - бензил
Ζ-бензилоксикарбон
Ви - трет-бутил
ИСНА - дициклогексил амин
ТРА - трифторуксусная кислота
ΩΝΡ - паранитрофенил
ОЧи - Ν-оксисукценил
ΝΜΜ - Ν-метилморфолин
ИМР - диметилформамид
Ток - паратолуолсульфонат
ИСНА - дициклогексиламин
А1а (А) - остаток аланина
Акр (И) - остаток аспарагиновой кислоты
С1и (Е) - остаток глутаминовой кислоты
Ьук (К) - остаток лизина
С1у (С) - остаток глицина
Агд (К) - остаток аргинина
Тгр (^) - остаток триптофана
Ьеи (Ь) - остаток лейцина
ИМЕМ - ИйЪессо'к МоШйей Еад1е'к Мейшт, среда Игла, модифицированная Дульбекко
РВ8 - Ге1а1 Ъоуше кегит, сыворотка плода коровы
РВ8 - рНокрНШе ЪиГГег кайие, фосфатный солевой буфер, рН 7,4
НеЬа (АТСС ШтЪег - ССЬ-2.2, киЪс1опе 83) - клетки аденокарциномы матки человека эпителиальной морфологии
МН3Т3 (АТСС ШтЪег - СКЬ-1658) - эмбриональные фибробласты мыши
ИМ8О - диметилсульфоксид
ЕИТА - этилендиаминтетраацетат.
Исследование стабильности пептидов при хранении осуществляли в соответствии с примером 7. Представленные результаты (табл. 1) свидетельствуют о том, что пептиды в соответствии с изобретением хорошо хранятся в растворах при различных значениях рН.
Исследование биологической активности пептидов было проведено с использованием в качестве
- 2 020866 модельной системы культивируемых клеток мыши и человека: ΝΙΗ3Τ3 и НеЬа 83 соответственно (пример 8).
Биологическая активность каждого пептида была определена по следующим параметрам: влияние на пролиферативную активность клеток и способность вызывать апоптоз и некроз. Для этого были исследованы следующие показатели: доля погибших (с поврежденной плазматической мембраной) клеток ΝΙΗ3Τ3 при обработке пептидами от общего количества клеток (результаты представлены на фиг. 1-6), и уровень апоптотической гибели клеток.
Апоптотическую гибель клеток оценивали по доле клеток НеЬа 83 с гиподиплоидным содержанием ДНК. Метод основан на том, что в клетках, подвергающихся апоптотической гибели, появляется фрагментированная ДНК, которая удаляется из клеток во время обработки раствором НС1. Результаты определения апоптотической гибели клеток НеЬа 83 после инкубации с пептидами представлены на фиг. 7-12.
Протекторные свойства пептидов были продемонстрированы в экспериментах по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз с использованием в качестве модельной системы культивируемых клеток мыши и человека: ΝΙΗ3Τ3 и НеЬа 83 (пример 9).
Апоптоз - программируемая клеточная гибель, являющаяся результатом реализации генетической программы или ответом на внешние факторы и требующая затрат энергии и синтеза макромолекул. Апоптоз сопровождается появлением характерных цитологических признаков (маркеров апоптоза) и молекулярных процессов. В живых клетках, в частности, наблюдается асимметричное распределение различных фосфолипидов между внутренним и наружным монослоями цитоплазматической мембраны: фосфолипиды, содержащие холин, такие как фосфатидилхолин и сфингомиелин, локализованы в основном в наружном монослое, а фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин (аминофосфолипиды) - во внутреннем. В процессе апоптоза цитоплплазматическая мембрана претерпевает изменения, одним из которых является переход фосфатидилсерина из внутреннего ее монослоя в наружный, где фосфатидилсерин оказывается доступным для связывания с Апиехш-У, кальцийзависимым, фосфолипидсвязывающим белком с мол. массой 35-36 кДа, обладающим высоким сродством к фосфатидилхолину (Кд равна 5х10-10 М). Аииехш-У-связывающий анализ основан на быстром и высокоспецифическом выявлении клеток, содержащих фосфатидилхолин в наружном монослое цитоплазматической мембраны, т.е. клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза.
Данные процентного содержания апоптотических и некротических клеток в популяциях НеЬа 83 и ΝΙΠ3Τ3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях представлены в табл. 2. На гистограммах (фиг. 13-24) представлено процентное содержание апоптотических и некротических клеток в популяциях НеЬа 83 и ΝΗ3Τ3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях.
Из приведенных гистограмм и данных, представленных в табл. 2, видно, что исследуемые пептиды в диапазоне концентраций от 50 до 400 нг/мл оказывают выраженное защитное действие на клетки НеЬа 83 и ΝΗ3Τ3, т.е. обладают цитопротективной активностью.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнена в виде таблеток, капсул с использованием фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и приемов, традиционных для данной области техники, а также может быть выполнена в виде раствора для инъекций. Кроме того, композиция может быть выполнена в виде капель, или раствора для приема внутрь, или в виде спрея назального или капель назальных, аэрозоля подъязычного или орального, или в виде порошка, или в виде лиофилизата для приготовления раствора.
Перечисленые формы фармацевтической композиции получают известными методами. Композицию согласно изобретению вводят перорально или парентерально (например, внутривенно, внутримышечно, подкожно). Для получения фармацевтической композиции согласно изобретению используют любые фармацевтически приемлемые носители или растворители. Для перорального введения фармацевтическая композиция может принимать форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков и тому подобного.
Таблетки, содержащие различные наполнители, например цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция или любые другие фармацевтически приемлемые наполнители, применяются вместе с различными дезинтеграторами, например крахмалом, предпочтительно картофельным крахмалом или тапиокой, сложными силикатами или любыми другими фармацевтически приемлемыми дезинтеграторами, вместе со связывающими веществами, например поливинилпирролидоном, сахарозой, желатином, аравийской камедью, любыми другими фармацевтически приемлемыми связывающими веществами. Кроме того, часто применяются скользящие вещества, например стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк для таблетирования или любые другие фармацевтически приемлемые вещества. Композиции согласно изобретению также применяются в мягких и твердых заполненных желатиновых капсулах; предпочтительные в этом случае материалы включают, например, лактозу или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли с высоким молекулярным весом. Если для перорального введения желательны водные суспензии и/или эликсиры, соединения этого изобретения могут сочетаться с различными подслащивающими средствами, улучшающими вкус и запах, подкрашивающими веществами, эмульгирующими веществами и/или суспендирующими средствами, а также растворителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и различные подобные их комбинации. Для парентерального введения могут использо- 3 020866 ваться растворы в кунжутном или арахисовом масле или в водном пропиленгликоле, так же как и стерильные водные растворы соответствующих водорастворимых солей. Такие водные растворы могут быть соответственно буферными, если необходимо, и водный растворитель сначала изотонируют с помощью достаточного количества раствора соли или глюкозы. Эти водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи используемые водные среды легко можно получить с помощью стандартных методик, хорошо известных специалистам.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ас-Акр-О1и-ОН, Н-Акр-О1и-ОСН3, Н-Акр-О1и-ЫН-СН2-СН3, НУа1-Акр-О1и-ОН, Н-Ьеи-Акр-ОЬ-ОН или Н-А1а-А8р-О1и-Агд-ОН. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция согласно предложенному изобретению содержит пептид(ы) от 10 до 95 мас.%.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Синтез пептида Ас-Акр-О1и-ОН (АсЭЕ).
Вос-Акр(ОВ/1)-О1и (ОВ/1)-ОЬ/1.
К охлажденному до -20°С раствору 48,5 г (150 ммоль) Вос-Акр(В/1)-ОН в 300 мл ДМФ добавляли 16,5 мл (150 ммоль) ΝΜΜ и 19,5 мл (150 ммоль) изобутилхлороформиата и перемешивали в течение 15 мин. Смесь перемешивали при той же темпиратуре 20 мин. Далее прибавляли охлажденный до -20°С раствор 74,5 г (155 ммоль) аминокомпонента Н-С1и(В/1)-ОВ/1 х Ток в 200 мл ДМФ, содержащий 17 мл ΝΜΜ (155 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -10°С, в течение 2 ч при комнатной температуре. Упаривали, остаток растворяли в этилацетате (500 мл) и последовательно промывали 5% NаНСОз, Н2О, 2% Н2§О4, Н2О (дважды по 200 мл каждого), упаривали, вновь упаривали с изопропиловым спиртом. К образовавшемуся маслу приливали 500 мл гексана и 50 мл эфира и образовавшееся масло затирали до образования твердых частиц. Продукт кристаллизуется в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили. Получено 89 г (89%) хроматографически однородного продукта.
12,64 г (20 ммоль) защищенного дипептида 1 растворяли в 100 мл хлороформа и к полученному раствору при 0°С прибавляли 100 мл трифторуксусной кислоты, смесь выдерживали 1 ч при комнатной температуре и растворители упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 300 мл этилацетата и промывали 5% раствором бикарбоната 3 раза по 200 мл. Органический слой отделяли, сушили над безводным №-ь8О4 и этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 300 мл диметилформамда и к полученному раствору прибавляли 3,6 г (20 ммоль) паранитрофнилового эфира уксусной кислоты. Смесь оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали, остаток растворяли в этилацетате и промывали 5% водным раствором аммиака до исчезновения следов паранитрофенола (контороль по ТСХ), водой до рН 6-7, органический слой отделяли, сушили и этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 80% уксусной кислоты и гидрировали над 5% Рб/С при комнатной темпиратуре. После завершения гидрирования катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 300 мл воды, повторно упаривали до половины объема и лиофилизовали. Получили 5,2 г (85,8%) целевого ацильного производного дипептида. По данным ВЭЖХ чистота продукта больше 95%.
В спектре ПМР:
Акр - 4.62 (α-СН); 2.70, 2.53 ф-СН2); 8.63 (ΝΉ)
О1и - 4.20 (α-СН); 1.97, 1.78 (β-€Η2); 2.26 (у-СН2); 8.19 (ΝΉ)
Ас - 1.96 (3Н, -СОСН3).
Пример 2. Синтез пептида Н-Акр-О1и-ОСН3.
2-Акр(ОВи‘)-О1и(ОВи‘)-ОСН3.
10,0 г (46,3 ммоль) Н-О1и(ОВи1)-ОСН3 растворяли в 300 мл диметилфорамида и при комнатной температуре прибавляли 19,7 г ( 47 ммоль) 2-А5р(ОВи‘)-О№и. Через 12 ч (контроль - ТСХ в системе хлороформ:метанол:уксусная кислота - 9:1:0.5 Б) реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этилацетате, промывали последовательно 2% серной кислотой, водой, сушили над №-ь8О4. упаривали. Остаток растворяли в 100 мл эфира. Вещество кристаллизуется при 4°С. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром, высушивали на воздухе. Получено 20 г (80,3%) хроматографически однородного вещества.
г (37 ммоль) полученного выше соединения растворяли в 100 мл хлороформа и к раствору прибавляли 100 мл трифторуксусной кислоты. Смесь выдерживали 2 ч при комнатной температуре. Растворители упаривали. Остаток растворяли в этилацетате и промывали водой, 1-2% раствором бикарбоната натрия и снова водой. Органический слой отделяли, сушили и растворитель упаривали. Остаток растворяли в 10% водном метиловом спирте и гидрировали над 5% Рб/С. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывали, метанол упаривали. Продукт высаживали эфиром. Твердый осадок отфильтровывали и сушили на воздухе. Получено 9,6 г (94%) искомого метилового эфира.
В спектре ПМР:
Акр - 4.13 (α-СН); 2.79, 2.66 (β-СЮ); 8.14 (ΝΉ2)
О1и - 4.59 (α-СН); 1.93, 1.72 (β-СЮ); 2.36 (у-СН2); 8.67 (ЫН)
ОСН3 - 2.8 (3Н, СН3).
- 4 020866
Пример 3. Синтез пептида Н-Азр-О1и-МН-СН2-СН3 (ΌΕΝΗΕΐ).
Вос-А5р(ОВ71)-О1и(ОВ71)-ЫН-СН2-СНз.
К охлажденному до -20°С раствору 6,46 г (20 ммоль) Вос-Азр(ОВ/1)-ОН в 100 мл диметилформамида добавляли 2,22 мл (20 ммоль) Ν-метилморфолина и 2,6 мл (20 ммоль) изобутилхлороформиата, перемешивали в течение 15 мин и прибавляли охлажденный до -20°С раствор 5,0 г (21 ммоль) аминокомпонента Η-Ο1и(Вζ1)-NΗΕΐ в 40 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -10°С, в течение 2 ч при комнатной температуре. Упаривали, остаток растворяли в этилацетате (250 мл) и последовательно промывали 2% раствором серной кислоты, 5% раствором бикарбоната, водой (дважды по 200 мл каждого), упаривали, вновь упаривали с изопропиловым спиртом. К образовавшемуся маслу приливали 50 мл гексана и 50 мл эфира и образовавшееся масло затирали до образования твердых частиц. Продукт кристаллизуется в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили. Получено 9,9 г (85%) хроматографически однородного продукта.
5,86 г (10 ммоль) защищенного дипептида, полученного, как описано выше, растворяли в 50 мл хлороформа и к полученному раствору при 0°С прибавляли 50 мл трифторуксусной кислоты, смесь выдерживали 1 ч при комнатной температуре и растворители упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 100 мл этилацетата и промывали 5% раствором бикарбоната 3 раза по 200 мл. Этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 80% уксусной кислоты и гидрировали над 5% Ρά/С при комнатной температуре. После завершения гидрирования ( контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 300 мл воды, повторно упаривали до половины объема и лиофилизовали. Получили 2,57 г (95%) целевого дипептида. По данным ВЭЖХ чистота продукта больше 95%.
В спектре ПМР:
Азр - 4.13 (α-СН); 2.79, 2.66 (β-СШ); 8.14 (ЫН2)
О1и - 4.59 (α-СН); 1.93, 1.72 (β -СН2); 2.36 (у-СН2); 8.67 (Ν^
МН-СН2-СН3 - 2.45 (СН2), 1.43 (СН3), 7.56 (ЫН).
Пример 4. Синтез пептида Н-А1а-Азр-О1и-Агд-ОН (ΑΌΕΡ).
2-О1и(О1Ви)-АгдОН.
К раствору 104,4 г (228 ммоль) 2-О1и(О1Ви)-ОЖ в 0,5 л диметилформамида прибавляли 38,3 г (228 ммоль) Н-Агд-ОН. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 24 ч. Затем выдерживали при температуре 4°С 4 ч, образовавшийся осадок отфильтровывали и промывали на фильтре 0,4 л смеси диметилформамид-эфир (1:2), 0,45 л эфира, 0,4 л гексана. Сушили. Выход: 91,7 г (82,3%) хроматографически однородного 2-О1и(О1Ви)АгдОН, контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота (5:3:1).
2-Азр(ОВи)-О1и(ОВи)-Агд-ОН.
Раствор 90,6 г (185 ммоль) 2-О1и(О1Ви1)-АгдОН в 1,2 л этилового спирта гидрировали над 10 г 5% Ρά/С. После окончания гидрирования (контроль по ТСХ в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1) катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали. Полученный сиропообразный продукт растворяли в 500 мл диметилформамида и к полученному раствору прибавляли 75,9 г (185 ммоль) ΖАзр(О1Ви)-О№, реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 15 ч до завершения реакции (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Растворитель упаривали, образовавшееся масло растворяли в 150 мл хлороформа и наносили на колонку с силикагелем (400 г), промывали хлороформом до схода нитрофенола, 10% этиловым спиртом в хлороформе, смывали 30% этиловым спиртом в хлороформе, упаривали (контроль в системе: хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1).
Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, растворители упаривали. К остатку проливали 400 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получили 103 г (84%) хроматографически однородного защищенного трипептида.
Раствор 100 г (150 ммоль) Ζ-Азр(Ви)-О1и(ОίВиΐ)-А^дОΗ в 1,2 л этилового спирта гидрировали над 10 г 5% Ρά/С. После окончания гидрирования (контроль по ТСХ в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1) катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали. Полученный сиропообразный продукт растворяли в 500 мл диметилформамида и к полученному раствору прибавляли 51,6 г (150 ммоль) Ζ^Π^^. Реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 15 ч до завершения реакции (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Растворитель упаривали, образовавшееся масло растворяли в 150 мл хлороформа и наносили на колонку с силикагелем (примерно 400 г), промывали хлороформом до схода нитрофенола, 10% этиловым спиртом в хлороформе, смывали 30% этиловым спиртом в хлороформе, упаривали (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, растворители упаривали. К остатку проливали 400 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получили 95 г (86%) хроматографически однородного защищенного тетрапептида. Полученный продукт растворяли в 500 мл трифторуксусной кислоты и смесь выдерживали 2 ч при комнатной температуре. Кислоту упаривали, к остатку приливали 1000 мл диэтилового эфира, образовавшийся аморфный осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром два раза по 150 мл и сушили. Вещество растворяли в 1500 мл смеси воды с этиловым спиртом и гидрировали в токе водорода над 10% Ρά/С.
- 5 020866
По окончании гидрирования (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали и растворители упаривали до масла, растворяли в 300 мл воды и наносили на колонку с δΡ-сефадексом. Колонку промывали двумя объемами 0,05М пиридин-ацетатного буфера и смывали вещество тем же 0,2М буфером. Фракции, содержащие продукт, объединяли, растворители упаривали, повторно упаривали с водой для удаления остатков пиридин-ацетата и лиофилизовали.
Получили 60 г (82%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%.
В спектре ПМР:
А1а - 3.75 (α-СН); 1.42 (β-СНЗ); 8.02 (2Н, ΝΗ2)
Акр - 4.16 (α-СН); 2.82, 2.65 (β-СЖ); 8.14 (ΝΗ)
С1и - 4.35 (α-СН); 1.93, 1.87 (β-СЖ); 2.30 (у-СН2); 8.60 (ΝΗ)
Агд - 4.16 (α-СН); 1.75, 1.62 (β-СЖ); 1.54, 1.50 (у-СН2); 3.10 (5-СН2); 7.58 (ε-ΝΗ2); 8.28 (ΝΗ).
Пример 5. Синтез пептида Η-ναΙ-Αδρ-^ιι-ΟΗ (ΥΕΌ).
Ζ-να1-Α5ρ(ΟΒζ1)^1υ(ΟΒζ1)2.
г (15,8 ммоль) Βοο-Αδρ(ΟΒζ1)-Ώυ(ΟΒζ1)2 растворяли в 200 мл ТРА, выдерживали 1 ч при комнатной температуре, кислоту упаривали, остаток растворяли в 500 мл сухого ΌΜΡ и прибавляли порциями ΝνίΌ, до прекращения выделения СО2. Осадок отфильтровывали, промывали 100 мл ΌΜΡ, прибавляли 3,33 мл (30 ммоль) Ν-метилморфолина и 5,57 г (16 ммоль) Ζ-ναΙ-ΟΝδιι, оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали на 80%, к образовавшемуся сиропообразному остатку прибавляли 800 мл изопропилового спирта, выдерживали 2 ч при +4°С, осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход 10,3 г (82%) продукта.
10,3 г (13,4 ммоль) защищенного трипептида при нагревании до +50°С растворяли в 1000 мл АсОН + 100 мл воды до полного растворения осадка и гидрировали, периодически подогревая реакционную смесь. После окончания реакции (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали до консистенции жидкого масла и прибавляли 800 мл изопропилового спирта. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Вещество растворяли в деионизированной воде, упаривали остатки изопропилового спирта и лиофилизировали. Получали 4,4 г (92%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%.
В спектре ПМР:
να1 - 0.94, 0.97 (у-СН3); 418 (α-СН); 2.13 (β-СН); 8.08 (ΝΗ2)
Акр - 4.62 (α-СП); 2.70, 2.53 (β-СЖ); 8.63 (ΝΗ)
С1и - 4.20 (α-СН); 1.97, 1.78 (β-СЖ); 2.26 (у-СЖ); 8.19 (ΝΗ).
Пример 6. Синтез пептида Η-^еи-Αкρ-С1и-ΟΗ (ΕΌΕ).
Ζ-^еи-Αδρ(ΟΒζ1)-С1и(ΟΒζ1)2.
12,6 г (20,0 ммоль) Βοс-Αδρ(ΟΒζ1)-С1и(ΟΒζ1)2 растворяли в 200 мл ТРА, выдерживали 1 ч при комнатной температуре, кислоту упаривали, остаток растворяли в 500 мл сухого ΌΜΡ и прибавляли порциями ΝνίΌ, до прекращения выделения СО2. Осадок отфильтровывали, промывали 100 мл ΌΜΕ, прибавляли 3,33 мл (30 ммоль) Ν-метилморфолина и 5,0 г (20 ммоль) Ζ-Ε-οιι-ΟΝδιι, оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали на 80%, к образовавшемуся сиропообразному остатку прибавляли 800 мл изопропилового спирта, выдерживали 2 ч при +4°С, осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход: 13,3 г (84%) продукта. 13 г (16,7 ммоль) защищенного трипептида при нагревании до +50°С растворяли в 1000 мл АсОН + 100 мл воды до полного растворения осадка и гидрировали, периодически подогревая реакционную смесь. После окончания реакции (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали до консистенции жидкого масла и прибавляли 800 мл изопропилового спирта. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Вещество растворяли в деионизированной воде, упаривали остатки изопропилового спирта и лиофилизировали. Получали 5,5 г (87%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%.
В спектре ПМР:
Ьеи - 0.94, 0.90 (5-СН3); 4,38 (α-СН); 1.92 (β-СН); 1.65 (у-СН); 8.08 (ΝΗ2)
Акр - 4.62 (α-СН); 2.70, 2.53 (β-СЖ); 8.63 (ΝΗ)
С1и - 4.20 (α-СН); 1.97, 1.78 (β-СЖ); 2.26 (у-СН2); 8.19 (ΝΗ).
Пример 7. Исследование стабильности пептидов при хранении.
Пептиды растворяли в 0,05М ацетатаммонийном буфере с рН 4.5 и рН 7.5 с таким расчетом, чтобы их концентрация была примерно 1 мг/мл. Растворы стерильно фильтровали и хранили в стерильных, хорошо закупоренных флаконах. По истечении срока хранения вещества анализировали методом ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 1.
- 6 020866
Таблица 1
Стабильность пептидов при хранении
Пептид Продолжительность (время, сутки)
1час 10 30 60 90
Условия хранения (рН, 22°С)
4.5 7.5 4.5 7.5 4.5 7.5 4.5 7.5 4.5 7.5
ΌΕΝΗΕΙ 98.1 98.2 98.3 98.2 98.15 98.10 98.0 98.0 97.9 97.85
АсИЕ 98.0 98.2 98.2 98.1 98.1 98.1 98.0 98.05 97.8 97.7
УОЕ 98.1 98.1 98.0 97.7 97.6 97.6 97.55 97.55 97.55 97.2
БОЕ 96.5 96.5 96.4 96.4 96.4 96.4 96.2 96.2 96.2 95.6
АОЕК 98.1 98.1 98.0 98.0 97.9 97.7 98.0 97.7 97.8 97.6
ИЕОМе 98.0 98.0 98.1 98.0 97.7 97.65 97.55 97.5 97.5 97.2
Представленные результаты анализов свидетельствуют о том, что продукты хорошо хранятся в растворах при различных значениях рН.
Пример 8. Исследование биологической активности пептидов в условиях стандартного культивирования клеток.
Было проведено изучение биологической активности синтезированных пептидов в пяти различных концентрациях (400, 200, 100, 10 и 1 нг/мл) с использованием в качестве модельной системы культивируемых клеток мыши и человека ΝΙΗ3Τ3 и НеЬа 83.
Биологическая активность каждого пептида была определена по следующим параметрам: влиянию пептидов на пролиферативную активность клеток и способность пептидов вызывать апоптоз и некроз. Для этого были исследованы действие пептидов на фибробласты ΝΙΗ3Τ3 (определение доли погибших клеток после инкубации с пептидами и общего количества клеток) и уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83 после инкубации с пептидами.
Культивирование клеток и обработка пептидами.
Культивирование фибробластов ΝΙΗ3Τ3 проводили в полной питательной среде ИМЕМ (Панэко, РФ), содержащей 10% эмбриональной сыворотки (Панэко), гентамицин 2 ед./мл (Панэко), глютамин 29,2 мкг/мл (Панэко), в СО2-инкубаторе. Для культивирования использовали флаконы фирмы 8РЬ (Южная Корея) с площадью 25 и 175 см2. Пересев клеток осуществляли в соотношении 1:5 - 1:7.
По достижении примерно 50% конфлюэнтности во флаконы добавляли пептиды в указанных выше конечных концентрациях. В каждом эксперименте использовали по два флакона с одинаковой концентрацией каждого пептида. В контрольные флаконы добавляли соответствующий объем полной среды без пептидов. С каждым пептидом проведено по два независимых эксперимента (по два повтора в каждом). Через 24 ч инкубации с пептидами клетки извлекали из культурального флакона с помощью обработки в смеси трипсина и версена (1:3, Панэко). Клетки из каждого флакона помещали в одинаковый объем забуференного физиологического раствора (0,01М РВ8, рН 7,2). Суспензию клеток делили на 3 равные части для исследования перечисленных выше показателей.
Культивирование клеток НеЬа выполняли сходным образом за исключением того, что пересев клеток осуществляли в соотношении 1:3-1:4. Исследование показателей осуществляли с помощью проточной цитометрии. Использовали проточный цитофлуориметр-сортировщик РЛС8 УаШаде (ВесЮп Июкшкоп, США). Перед проведением каждой серии анализов прибор тестировали и калибровали по стандартным микросферам (Ро1у8с1епсе) в соответствии с методикой, рекомендованной фирмой-изготовителем.
Определение общего количества клеток во флаконе и доли погибших клеток.
К суспензии клеток, полученной, как описано выше, добавляли йодистый пропидий (ргоДшт юФДе -ΡΙ, 81дта, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл и калибровочные частицы СаНЪгПе (ВесЮп Июкшкоп, США), меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦем). Конечную концентрацию калибровочных частиц определяли с помощью камеры Горяева. Инкубировали 10-12 мин и немедленно анализировали на проточном цитометре по 4 параметрам - прямое светорассеяние, боковое светорассеяние, флуоресценция ΡΙ, флуоресценция ФИТЦа. В каждом образце анализировали по 20 тыс. клеток. Данные записывали в файл. Затем проводили компьютерную обработку данных с помощью программы СеПСиеЧРго (ВесЮп Июкшкоп, США).
Определяли долю ΡΙ+ клеток с поврежденной плазматической мембраной (погибшие клетки). Уровень гибели в контрольных флаконах (15-20 шт.) усредняли и принимали за 100%. Возможное влияние пептидов оценивали по соотношению с контролем.
В каждом файле выявляли ФИТЦ+ калибровочные частицы и определяли их количество. Затем по показателям светорассеяния идентифицировали клетки и находили их количество в тех же файлах. Рассчитывали соотношение клеток/калибровочных частиц в каждом файле (образце), по которому судили о количестве клеток во флаконе. Соотношение клеток/калибровочных частиц в контроле принимали за 100%. Количество клеток в опытных флаконах оценивали в процентах по сравнению с контролем. Ре- 7 020866 зультаты представлены на фиг. 1-6.
Определение гибели клеток путем апоптоза.
Метод основан на том, что в клетках, подвергающихся апоптотической гибели, появляется фрагментированная ДНК, которая удаляется из клеток во время обработки раствором НС1. Затем оставшуюся в клетках ДНК окрашивают специфическими красителями, например ΡΙ (пропидиум йодид), и определяют поклеточное содержание ДНК. Апоптотическую гибель клеток оценивают по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК.
Суспензию клеток, полученную, как описано выше, охлаждали до +4°С. К суспензии клеток добавляли охлажденный этанол в объемном соотношении 1:3 при постоянном перемешивании. Клетки хранили 1-2 недели до анализа. При помощи центрифугирования удаляли этанол из образцов, затем удаляли фрагментированную ДНК из клеток с помощью 0,6М НС1 (37°С, 10 мин). Далее клетки отмывали ΡΒδ и окрашивали в 0,3 мл раствора ΡΙ (50 мкг/мл) в ΡΒδ, выдерживали 15 мин при комнатной температуре и анализировали на проточном цитометре. ΡΙ в данной концентрации позволяет проводить определение поклеточного содержания ДНК и выявлять фракцию клеток с фрагментированной ДНК с высоким разрешением. Для измерения флуоресценции ΡΙ использовали узкополосные фильтры 585/42 нм, мощность лазера составляла 57 мВт. В каждом образце анализировали 5-103 клеток, затем проводили компьютерную обработку с использованием программы ίχΙΙΟικδίΡΐΌ (Вее1ои ΌίαΚίηχοη. США). На первом этапе анализа выделяли регион клеток по светорассеянию, затем в этом регионе оценивали флуоресценцию ΡΙ. Маркер гиподиплоидного содержания ДНК выставляли по контрольным образцам.
Результаты определения апоптотической гибели клеток НеЬа δ3 после инкубации с пептидами представлены на фиг. 7-12.
Пример 9. Изучение протекторных свойств пептидов.
В экспериментах по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз использовали набор реагентов АроТатде! Аииехш-У Р1ТС Αρορΐοδίδ Κίΐ Диуйтодеи, США). Помимо Аииехш-У, меченного флуоресцентным красителем Р1ТС, набор реагентов АроТатде! Аииехш-У Р1ТС Αρορΐοδίδ Κίΐ содержит краситель пропидиум йодид (ΡΙ). ΡΙ обладает способностью проникать только в те клетки, у которых нарушена целостность цитоплазматической мембраны, что является одним из характерных признаков поздних стадий апоптоза или некроза. Проникнув в клетки с поврежденной клеточной мембраной, ΡΙ связывается с ДНК. Красная флуоресценция образовавшихся комплексов выявляется с помощью поточного цитофлуориметра.
Таким образом, используя процедуру двойного окрашивания клеток (Аииехш-У Р1ТС плюс ΡΙ) и метод поточной цитофлуорометрии можно различать 3 популяции клеток и определять их процентное соотношение: 1) неапоптотические клетки (АииехГи-У-негативные и ΡΙ-негативные), 2) клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза (Аииехт-У-позитивные и ΡΙ-негативные), 3) некротические клетки или клетки, находящиеся на поздней стадии апоптоза (Аииехт-У-позитивные и ΡΙ-позитивные). По увеличению доли апоптотических и некротических клеток можно судить о степени влияния добавляемых в среду культивирования соединений на упомянутые процессы. В качестве контроля в экспериментах использовали рекомендуемое производителем соединение камптотецин (Сатр1о1йесш, 81дта, США), обладающее ярко выраженной способностью вызывать апоптоз и некроз клеток, в особенности опухолевых.
Растворы пептидов в стерильном ΡΒδ с концентрациями 1 мг/мл готовили непосредственно перед проведением экспериментов по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз. Для изучения пролиферативной активности использовали те же растворы, которые после приготовления хранили в стерильных пробирках при +4°С. В день проведения каждого эксперимента готовили рабочие разведения пептидов в среде культивирования клеток. Для этого использовали стерильный пластиковый 96-луночный планшет (Сотшид, США). Разведения готовили таким образом, чтобы при внесении 25 мкл каждого рабочего разведения в экспериментальную лунку с культивируемыми клетками конечные концентрации пептидов составляли 400, 200, 100 и 50 нг/мл.
Культивируемые клетки.
Для культивирования клеток НеЬа δ3 и ΝΙΗ3Τ3 использовали реагенты компании Ыуйтодеи (США) и пластиковые флаконы, планшеты, пипетки и фильтры компании Сотшид (США). Клетки культивировали в среде ΌΜΕΜ, приготовленной из сухого концентрата, растворенного в апирогенной дистиллированной воде (Мййроте, США). Среда содержала 10% ΡΒδ, 2 мМ глутамина и пенициллин-стрептомицин (разбавленный в соответствии с рекомендациями производителя). НеЬа δ3 и МН 3Т3 выращивали во флаконах Т150 при +37°С в атмосфере 5,6% СО2. Клетки постоянно поддерживали в логарифмической фазе роста, для чего рассеивали их не реже 2 раз в неделю, используя трипсин для снятия прикрепленных клеток с поверхности культуральных флаконов. Подсчёт живых клеток проводили в гемацитометре после окрашивания аликвоты суспензии трипановым синим. Клетки НеЬа δ3 и МН3Т3 снимали с поверхности культуральных флаконов, подсчитывали, доводили концентрацию до 105 кл/мл и рассеивали полученные суспензии по 1 мл в лунки 24-луночных культуральных планшетов. На следующий день, убедившись, что клетки прикрепились к поверхности планшетов, среду культивирования во всех лунках меняли на свежую. В контрольные лунки (положительный контроль - стимуляция апоптоза и некроза) добавляли камптотецин до конечной концентрации 50 мкМ, которая была определена в предварительных
- 8 020866 экспериментах с клетками ΝΙΗ3Τ3 и НеЬа 33. В контрольные лунки (отрицательный контроль) добавляли 25 мкл свежей среды культивирования в экспериментальные лунки добавляли по 25 мкл рабочих разведений пептидов (каждое рабочее разведение - в 2 повторах) и камптотецин в той же конечной концентрации. Инкубацию проводили при +37°С. Через 24 ч после начала инкубации клетки снимали с поверхности 24-луночных планшетов, переносили из каждой лунки в отдельную центрифужную пробирку объёмом 1,5 мл, промывали 1 мл рабочего раствора буфера для связывания красителя Лппехт-У ПТС и осаждали клетки центрифугированием (Зуктех Р1а1е1е1 СепРтГиде РС-810). Супернатант сливали, к клеточному осадку добавляли 5 мкл красителя Лппехт-У ПТС и 10 мкл красителя пропидиум йодид (ΡΙ) и инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре (+25°С). Затем в каждую пробирку добавляли 300 мкл рабочего раствора буфера для связывания Лппехш-У Р1ТС и измеряли интенсивности зелёной и красной флуоресценции. В полученных распределениях выделяли две популяции - Липехш-Упозитивные и ΡΙ-негативные (клетки, находящиеся в стадии апоптоза) и Лппехт-У-позитивные и ΡΙпозитивные клетки (клетки, находящиеся в стадии некроза). На гистограммах (фиг. 13-24) и в табл. 2 представлены данные процентного содержания апоптотических и некротических клеток в популяциях НеЬа 33 и ΝΙΗ3Τ3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях.
Таблица 2
Процентное содержание апоптотических и некротических клеток в популяциях НеЬа 33 и ΝΙΗ3Τ3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях
Действие пептида Н-Аар-Ои-ЧН-СНг-СНЗ (ΟΕΝΗΕΙ) в культуре клеток НеЬа
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 7 35 16 13 18 20
Апоптоз 5 25 8 8 9 15
Действие пептида ΟΕΝΗΕΙ в культуре клеток ΝΙΗ3Τ3
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 7 10 7 11 12 13
Апоптоз 5 26 18 21 23 25
Действие пептида Ас-Авр-СИи-ОН (АсОЕ) в культуре клеток НеЬа
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 7 14 7 8 1! 13
Апоптоз 3 25 22 15 17 21
Действие пептида АсОЕ в культуре клеток ΝΙΗ3Τ3
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 8 55 28 34 46 50
Апоптоз 7 27 19 22 30 35
Действие пептида Н-Уа1-А5р-О1и-ОН (ΥϋΕ) в культуре клеток НеЬа
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 2 4,3 2.4 4 3,6 3,1
Апоптоз 0,5 4 2 з^ за 2.2
Действие пептида УОЕ в культуре клеток ΝΙΗ3Τ3
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 3 7,8 4 3 2 5
Апоптоз 1 6 3 2Л 1,8 3,5
Действие пептида Н-Ьеи-Аьр- <31и-ОН (ЬОЕ) в культуре клеток НеЬа
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 3 7 2,1 2,2 3,1 2,5
Апоптоз и 3 I 9,5 1,4 1
Действие пептида ЬОЕ в культуре клеток ΝΙΗ3Τ3
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 4 8 3,4 3,5 3,8 3.7
Апоптоз 2 4 2Д _ 2,5 2
Действие пептида Н-А 1а-А5р-С1и-Лгл-ОН /АОЕК) в культуре клеток НеЬа
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 3.8 8 4 4 4,1 5,2
Апоптоз 2 6 2,3 1,5 2,1 2
Действие пептида АОЕК в культуре клеток ΝΙΗ3Τ3
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 4 8,5 5 3,5 3,1 4
Апоптоз 0,8 5 4,1 2,5 2,2 3
Действие пептида Н-Азр-С1и-ОСНЗ (ОЕОМе) в культуре клеток НеЬа
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 3,5 8 5,5 4,5 4,5 5
Апоптоз КЗ 5 2,5 2,3 2,1 4
Действие пептида ОЕОМе в культуре клеток ΝΙΗ3Τ3
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл
Некроз 5 8 6 5 4 6
Апоптоз 2.5 4 3,3 3 2,5 4
- 9 020866
Из приведенных гистограмм и данных, представленных в табл. 2, видно, что исследуемые пептиды в диапазоне концентраций от 50 до 400 нг/мл оказывают выраженное защитное действие на клетки НеЬа §3 и ΝΙΗ3Τ3, т.е. обладают цитопротективной активностью.
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют, что лекарственное средство, предлагаемое в соответствии с настоящим изобретением, обладает выраженным цитопротекторным действием и может быть использовано в пищевой, косметологической й фармацевтической промышленности.
Пример 10. Приготовление форм композиции.
Приготовление раствора для инъекций.
Инъекционные растворы получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 510-543). 180 г субстанции пептида растворяют при перемешивании и барботаже азотом в 0,8 л воды для инъекций, добавляют воду для инъекций до общего объема 1,0 л. Проводят стерилизующую фильтрацию полученного раствора и в асептических условиях, осуществляют под азотом его розлив в ампулы емкостью 2 мл по 1 мл в ампулу. Заполненные ампулы запаивают под азотом.
Приготовление капсул.
Капсулы получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 400-413). Для приготовления капсул смешивают ингредиенты из расчета состава одной капсулы:
пептид - 200 мг;
вспомогательные вещества (целлюлоза микрокристаллическая, кальция стеарат) - в количестве, достаточном до получения содержимого капсулы массой 300 мг.
Состав капсул: красители, желатин.
Приготовление таблеток.
Таблетки получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 335-368). Для приготовления таблеток смешивают ингредиенты из расчета состава одной таблетки:
пептид - 250 мг;
кремния диоксид коллоидный - 2,5 мг; тальк - 5 мг;
лактозы моногидрат - 90 мг; крахмал кукурузный - 102,5 мг.
- 10 020866
Перечень последовательностей <110> Замертон Холдинге Лимитед <120 Пептиды с цитопротекторной активностью <Ι40> 201300197 <141> 26.02.2013 <160> I <210> 5Ε0ΙΟΝΟ:!
<211>2 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <223> Ацетилированный на Ν-конце пептид Азр-О1и (Ас-Азр-С!и-ОН) <4О0>
Азр С1и <160 2 <210 5Ε<3ΙϋΝΟ:2 <211> 2 <232> РКТ <213> Искусственная последовательность <223> Содержащий сложноэфирную связь на С-конце пептид Αδρ-ΟΙυ (Н-Азр-О1и· ОСНЗ) <400>
Азр С1ц <160 3 <210> 5Е<? ГО N0:3 <2П>2 <212>РКТ <213> Искусственная последовательность <223> Содержащий амидную связь на С-конце пептид Азр-С1и (Н-А5р-С1и-ИН-СН2· СНЗ) <400 Азр 01и I <160 4 <21О8Е<3 ГО N0:4 <211>3 <212>РКТ <213> Искусственная последовательность <223> Пептид Н-\'а1-А$р-О1и-ОН <400 \’а! Азр С1и 1 <160 5 <210 5Е<5ГО N0:5 <211>3 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <223> Пептид Н-Беи-Азр-СЛи-ОН <400 Беи Азр С1и 1 <160> 6 <210>5Е<3 ГО N0:6 <211> 4 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <223> Пептид Н-А1а-Азр-01и-Аг§-0Н <400
А1а Азр 61и Аг§

Claims (3)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Пептиды, обладающие цитопротекторной активностью, выбираемые из группы, включающей НАзр-О1и-ЫН-СН2-СН3, Н-Уа1-Азр-О1и-ОН, Н-Беи-Азр-О1и-ОН и Н-А1а-Азр-О1и-Аг§-ОН, или их фармацевтически приемлемые соли.
  2. 2. Фармацевтическая композиция, обладающая цитопротекторным действием и содержащая в эффективном количестве пептиды по п.1.
  3. 3. Применение пептидов Н-Азр-О1и-ОСН3 и Ае-Азр-О1и-ОН в качестве цитопротекторного средства.
    - 11 020866 ϋΕΝΗΕΐ
    200 η ] Кол-во клеток
    Фиг. 1
    Количество клеток во флаконе и доля погибших ΡΙ+ клеток после инкубации с пептидом ΌΕΝΗΕΐ
    АсОЕ
    Фиг. 2
    Количество клеток во флаконе и доля погибших ΡΙ+ клеток после инкубации с пептидом ΆοΌΕ ϋΕΟΜθ
    Концентрация пептида, нг/мл
    Фиг. 3
    Количество клеток во флаконе и доля погибших ΡΙ+ клеток после инкубации с пептидом ΌΕΘΜϋ
    - 12 020866 νϋΕ Кол-во клеток □ ΡΙ+
    Концентрация пептида, нг/мл
    Фиг. 4
    Количество клеток во флаконе и доля погибших ΡΙ+ клеток после инкубации с пептидом УББ
    ШЕ
    200 150 100 Ж 50 1 о
    400 200 100 10 1
    Концентрация пептида, нг/мл
    Фиг. 5
    Количество клеток во флаконе и доля погибших ΡΙ+ клеток после инкубации с пептидом ББЕ
    I I I I I
    Количество клеток во флаконе и доля погибших ΡΙ+ клеток после инкубации с пептидом ΆΌΕΚ
    - 13 020866 ϋΕΝΗΕί
    200 τ
    150
    400 200 100 10 1
    Концентрация, нг/мл
    Фиг. 7
    Уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ΏΕΝΗΕ1
    Фиг. 8
    Уровень апоптотической гибели клеток НеЕа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ΛεΏΕ
    Фиг. 9
    Уровень апоптотической гибели клеток НеЕа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ПЕОМе
    - 14 020866
    Фиг. 10
    Уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ΥϋΕ ШЕ
    200
    150
    400 200 100 10 1
    Концентрация, нг/мл
    Фиг. 11
    Уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом I .Γ)Ε ΑϋΕΚ
    400 200 100 10 1
    Концентрация, нг/мл
    Фиг. 12
    Уровень апоптотической гибели клеток НеЬа 83, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ΆϋΕΚ
    - 15 020866
    Протективное действие пептида ΌΕΝΗΕ1 на клетки НеЕа в присутствии капмтотецина
    Пептид ϋΕΝΗΕΙ ΝΙΗ3Τ3 некроз (ΡΙ) □ апоптоз (Αηηεχϊη-ν Р1ТС)
    Фиг. 14
    Протективное действие пептида ΌΕΝΗΕ1 на клетки ΝΙΗ3Τ3 в присутствии капмтотецина
    Протективное действие пептида ΆοΌΕ на клетки ΝΙΗ3Τ3 в присутствии капмтотецина
    - 16 020866
    Пептид АсОЕ НеЬА некроз (ΡΙ) □ апоптоз (Αηηβχίπ-ν ПТС)
    Фиг. 16
    Протективное действие пептида АсЭЕ на клетки НеЕа в присутствии капмтотецина
    Протективное действие пептида ЭЕОМе на клетки ΝΙΗ3Τ3 в присутствии капмтотецина
    Протективное действие пептида ЭЕОМе на клетки НеЕа в присутствии капмтотецина
    - 17 020866
    Пептид \Я)Е ΝΙΗ3Τ3 Некроз(Р1) □Апоптоз (Аппехт-\/ПТС)
    Фиг. 19
    Протективное действие пептида νΌΕ на клетки ΝΙΗ3Τ3 в присутствии капмтотецина
    Пептид \ЛОЕ Не1.а Некроз (ΡΙ) □ Апоптоз (Аппех1П-\/Р1ТС)
    Фиг. 20
    Протективное действие пептида νΌΕ на клетки Пека в присутствии капмтотецина
    Пептид ЮЕ Не1_а
    10 9 8 - контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл Некроз (ΡΙ) □ Апоптоз (Αηηεχΐη-νΡΙΤΰ)
    Фиг. 21
    Протективное действие пептида Ι.ΠΗ на клетки Пека в присутствии капмтотецина
    - 18 020866
    Пептид ШЕ ΝΙΗ3Τ3 Некроз (ΡΙ) □ Апоптоз (Αηηεχίη-ν Р1ТС)
    Фиг. 22
    Протективное действие пептида ΕΌΕ на клетки ΝΙΗ3Τ3 в присутствии капмтотецина
    Пептид ΑΟΕΚΝΙΗ3Τ3 контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл Некроз (ΡI) □ Апоптоз (Αηηεχίη-ν Р1ТС)
    Фиг. 23
    Протективное действие пептида ΆΌΕΚ на клетки ΝΙΗ3Τ3 в присутствии капмтотецина
    Пептид ΑϋΕΚ НеЬа Некроз (ΡΙ) □ Апоптоз (Аппехт-УНТС)
    Фиг. 24
    Протективное действие пептида ΆΌΕΚ на клетки 11еЕа в присутствии капмтотецина
EA201300197A 2013-02-28 2013-02-28 Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция EA020866B1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201300197A EA020866B1 (ru) 2013-02-28 2013-02-28 Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция
PCT/IB2014/000456 WO2014162190A2 (ru) 2013-02-28 2014-02-26 Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция
EP14734215.8A EP2963052A2 (en) 2013-02-28 2014-02-26 Peptides with cytoprotective activity

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201300197A EA020866B1 (ru) 2013-02-28 2013-02-28 Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300197A1 EA201300197A1 (ru) 2014-08-29
EA020866B1 true EA020866B1 (ru) 2015-02-27

Family

ID=51033232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300197A EA020866B1 (ru) 2013-02-28 2013-02-28 Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2963052A2 (ru)
EA (1) EA020866B1 (ru)
WO (1) WO2014162190A2 (ru)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2651128A1 (fr) * 1989-08-30 1991-03-01 Chevance Leon Nouvelle utilisation des anticomplements pour le traitement des parodontoses.
RU2155063C1 (ru) 1999-10-20 2000-08-27 Санкт-Петербургская общественная организация "Институт биорегуляции и геронтологии" Тетрапептид, стимулирующий функциональную активность нейронов, фармакологическое средство на его основе и способ его применения
RU2161501C1 (ru) 2000-06-29 2001-01-10 Санкт-Петербургская Общественная Организация "Санкт-Петербургский Институт Биорегуляции И Геронтологии Сзо Рамн" Способ получения пептидов, обладающих тканеспецифической активностью, и фармацевтические композиции на их основе
RU2177802C1 (ru) 2001-01-25 2002-01-10 Санкт-Петербургская Общественная Организация "Санкт-Петербургский Институт Биорегуляции И Геронтологии Сзо Рамн" Тетрапептид, регулирующий функции предстательной железы, фармакологическое средство на его основе и способ его применения
RU2304444C1 (ru) 2006-05-23 2007-08-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" Пептид, обладающий стресспротекторным действием, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения
RU2301074C1 (ru) 2006-05-30 2007-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" Пептид, обладающий иммуногеропротекторным действием, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemical Book. AC-ASP(GLU-OH)-OH, 4910-46-7, Copyright 2010, [он-лайн] [найдено 28.05.2013] Найдено из Интернет: *
DATABASE STN CA, No. 1046152-23-1 CA, MATTHIAS K. KOCH et al. "Physiological Sites of Deamidation and Methyl Esterification in Sensory Transducers of Halobacterium salinarum" Journal of Molecular Biology, 4 July 2008, Vol. 380, Issue 2, pp. 285-302, реферат *
DATABASE STN CA, No. 104840-89-3P CA, DILL KILIAN et al. "Structural studies of neuropep-tides composed of L-Asp and D-Glu by carbon-NMR spectroscopy", Journal of Protein Chemistry, 1985, v. 4, n. 6, pp. 363-373, реферат *
KHAVINSON VKH. et al. "Tetrapeptide H-Ala-Glu-Asp-Arg-OH stimulates expression of cytoskeletal and nuclear matrix proteins" Bull Exp. Biol. Med., 2012 Aug; 153(4): pp. 559-562 (реферат) [он-лайн] [найдено 28.05.2013] Найдено из PubMed, PMID: 22977870 *
Organic Chemistry Laboratory Final Exam. Chemistry 238, 2011, с. 11, [найдено 28.05.2013] Найдено из Интернет: *
SUBASINGHE N. et al. "Synthesis of acyclic and dehydroaspartic acid analogues of Ac-Asp-Glu-OH and their inhibition of rat brain N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase (NAALA dipeptidase", J. Med. Chem., 1990 Oct; 33(10): pp. 2734-2744 (реферат) [он-лайн] [найдено 28.05.2013] Найдено из PubMed, PMID: 2213826 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014162190A2 (ru) 2014-10-09
EA201300197A1 (ru) 2014-08-29
EP2963052A2 (en) 2016-01-06
WO2014162190A3 (ru) 2014-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6807831B2 (ja) 細胞膜透過性ペプチド、並びにこの作製方法及び使用方法
EP1833978B1 (en) Tripeptide and tetrapeptide thioethers
US6399568B1 (en) Cyclic tetrapeptide derivatives and medicinal use thereof
JP6754997B2 (ja) 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法
JP7267546B2 (ja) アミノ酸組成物及びその使用
US20090180958A1 (en) Diagnostic and therapeutic agents
ES2657445T3 (es) Procedimiento para la prevención y para el tratamiento de una hiperpermeabilidad
RU2144374C1 (ru) Способ получения композита окисленного глутатиона с cis-диаминодихлорплатиной и фармацевтических композиций на его основе, регулирующих метаболизм, пролиферацию, дифференцировку и механизмы апоптоза нормальных и трансформированных клеток
EP3111951A1 (en) Anticancer functional peptide for inhibiting proliferation of cancer stem cell, and use thereof
CN110740745A (zh) 含有谷胱甘肽二硫化物和谷胱甘肽二硫化物s-氧化物的药物组合物
JP2021178855A (ja) ヒストンデアセチラーゼの阻害剤としての大環状分子のチオエステルプロドラッグ
RU2482128C1 (ru) Пептиды, обладающие цитопротекторной активностью
EA020866B1 (ru) Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция
US20070042962A1 (en) Peptide dependent upregulation of telomerase expression
CN111574588B (zh) 多肽及其在抗埃博拉病毒中的应用
US9169289B2 (en) Peptide derivatives for treatment, prevention or alleviation of a condition associated with bone loss or low bone density or to inhibit osteoclast differentiation and stimulation
EP3675841B1 (en) A novel quinochalcone compound and uses thereof for treating cancer or inflammation
JP2021527688A (ja) 血液学的障害の処置のためのコハク酸及び誘導体
RU2296131C2 (ru) Геминпептид, его фармацевтически приемлемые соли и применение в качестве противовирусного и вирулецидного агента
JP2023153362A (ja) トレオスルファンの凍結乾燥物
RU2317102C1 (ru) Пептид, являющийся аналогом фрагмента альфа-фетопротеина, конъюгат пептида с доксорубицином и фармацевтическая композиция на его основе для лечения онкологических заболеваний
CN106831949B (zh) 与细胞膜标记相关的亲和肽
EP3856252A1 (en) Solution comprising treosulfan
CN118203658A (zh) 一种重组抗Claudin18.2全人源单克隆抗体注射液制剂及制备方法
CN111393512A (zh) 一种抑制流感病毒的多肽及其在制备预防和治疗流感病毒感染药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ RU

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ RU

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment