PT2212349E - Análogos sintéticos de péptidos de regeneração neural - Google Patents

Description

ΕΡ2212349Β1

DESCRIÇÃO ANÁLOGOS SINTÉTICOS DE PÉPTIDOS DE REGENERAÇÃO NEURAL Campo da invenção

Esta invenção refere-se a análogos sintéticos de péptidos de acordo com a reivindicações que têm propriedades regeneração neural, migração, proliferação, diferenciação e/ou crescimento axonal. Estes péptidos são denominados "Péptidos de regeneração neural" ou "NRPs." Em particular, esta invenção refere-se a análogos de péptidos relativamente pequenos de acordo com as reivindicações que têm uma ou mais propriedades biológicas de NRPs.

ANTECEDENTES Péptidos de regeneração neural (NRPs) são uma classe de péptidos que mostrou que exibe propriedades desejáveis para promover a função neural em mamíferos. Estas funções incluem sobrevivência neural, proliferação neural, crescimento neuronal, migração neural e diferenciação neuronal. Diversos NRPs foram descritos previamente, e incluem aqueles revelados nos pedidos de patente US N°: 10/225.838 e 10/976.699, PCT/US02/026782, PCT/US2004/036203, PCT/US2006017534 (WO 2006/121926) e PCT/US2006026994.

SUMÁRIO

Os NRPs descritos até o momento possuem propriedades farmacodinâmicas desejáveis e promovem a regeneração neural, migração, proliferação, diferenciação e/ou crescimento axonal. Descobriu-se recentemente análogos sintéticos de NRP que também têm propriedades 1 ΕΡ2212349Β1 farmacocinéticas melhoradas. Existe uma necessidade na especialidade de moléculas sintéticas ou péptidos modificados que tenham propriedades farmacodinâmicas desejáveis similar a aquelas dos NRPs, mas também tenham propriedades farmacocinéticas melhoradas e/ou sejam quimicamente estáveis.

Certos aspectos desta invenção incluem novas moléculas análogas de NRP sintéticas que podem ser usadas para tratar distúrbios do sistema nervoso ou outros sistemas em que NPRs é eficaz. Outro aspecto é fornecer terapêuticas para distúrbios de degeneração e morte celular, incluindo certos distúrbios do sistema nervoso. Em alguns aspectos, análogos sintéticos de NRPs podem ser usados para tratar efeitos adversos de esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla (MS), stress oxidativo (por exemplo, doença de Huntington) ou neuropatia periférica (NP). Um aspecto adicional desta invenção é a produção de análogos de NRP com estabilidade melhorada.

Deve ser entendido que os termos "composto de NRP, " "análogo de NRP" "SEQ ID NO:" e outros tais termos, para simplicidade, são usados para identificar as moléculas da invenção e não para fornecer sua caracterização completa. Assim, um "análogo de NRP" pode ser caracterizado no presente documento como que tem uma sequência de aminoácido particular, uma representação bidimensional particular da estrutura, mas é entendido que a real molécula reivindicada tem outras caracteristicas, incluindo estrutura tridimensional, mobilidade ao redor de certas ligações e outras propriedades da molécula como um todo. É as próprias moléculas e suas propriedades como um todo que são o objecto desta invenção.

Também deve ser entendido que a designação de um 2 ΕΡ2212349Β1 péptido como um "NRP" não significa que ele sozinho tem efeitos neurais. Ao contrário, o termo NRP tem a intenção de incluir péptidos que têm componentes estruturais similares como descritas no pedidos de patentes, mas pode ter efeitos sobre outros tipos de células, tecidos, e/ou órgãos. Em certas formas de realização, análogos de NRPs relativamente curtos são fornecidos que pode ter estabilidade aumentada, devido pelo menos em parte a degradação enzimática diminuída. Em outras formas de realização, análogos de NRP são fornecidos tendo aminoácidos modificados. Em ainda formas de realização adicionais, análogos de NRP são fornecidos que têm aminoácidos substituindo substituintes não aminoácido.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Esta invenção será descrita com referência ÀS formas de realização específicas da mesma. Outras características e aspectos desta invenção podem ser apreciados em referência às Figuras, em que: FIG. 1 representa um gráfico de efeitos neuroprotectores de dois NRPs, SEQ ID NO: 5 desta invenção e SEQ ID N0:1 em culturas de células expostos à neurotoxina 3-NP. FIG. 2 representa um gráfico de resultados de estudos de neuroprotecção eficaz de SEQ ID N0:1 em que o péptido foi armazenado a -20°C ou -4°C. FIG. 3 representa um gráfico de resultados de estudos de efeitos neuroprotectores de SEQ ID NO: 5 desta invenção em que o péptido foi armazenado a -20°C ou -4 0 C. 3 ΕΡ2212349Β1 FIG. 4 representa um gráfico de resultados de um estudo alargado de efeitos neuroprotectores de SEQ ID NO: 5 desta invenção e SEQ ID N0:1 em culturas de células tratada com a neurotoxina 3-NP, similar a aquelas mostradas na FIG. 1. FIG. 5 representa um gráfico que mostra efeitos de longa duração significantes de sequência REGRRDAPGRAGG (SEQ ID NO:12) desta memória descritiva para diminuir a gravidade de deficiência motora em animais com EAE, quando o NRP sintético foi administrado no pico da doença. Pontuação I é a menor pontuação e envolve uma cauda flácida somente, enquanto as maiores pontuações envolve fraqueza (pontuação 2) ou paralisia completa das pernas traseiras (pontuação 3) . 0 teste Kruskal-Wallis foi usado para análise estatística; ** p < 0,01 versus tratamento dia 1 pontuação (dados expressos como média ± SEM). FIG. 6 representa um gráfico de resultados de pontuações de travessia de passarela para ratos com neuropatia periférica induzida por piridoxina (800 mg/kg/dia) e tratados com veículo ou SEQ ID NO:5 desta invenção em duas doses diferentes. FIG. 7 representa um gráfico de resultados de pontuações de travessia de passarela para ratos com neuropatia periférica induzida por piridoxina (1200 mg/kg) e tratados com veículo ou SEQ ID NO: 5 desta invenção. FIG. 8 representa gráficos de resultados de estudos de longevidade de ratinhos com um modelo murino de Esclerose lateral amiotrófica (ALS) e os efeitos de duas doses diferentes de um NRP sintético desta 4 ΕΡ2212349Β1 invenção, SEQ ID NO:5.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Na memória descritiva, compostos de NRP são fornecidos que têm uma sequência de um péptido nativo. Por exemplo, um tal NRP é um péptido de 11 aminoácido de comprimento (11 — mer) tendo a seguinte sequência. NH2-G1RRAAPGRAGG11-NH2 SEQ ID NO: 1

Deve ser apreciado que os compostos sintéticos ou análogos de NRPs podem ter terminações C amidadas ou podem ter resíduos hidroxilo (OH) C-terminais. Também de ser apreciado que os termos "composto de NRP," "análogo de NRP" e termos similares referem-se a compostos desta invenção ou aos péptidos de NRP ou proteínas de NRP descritos anteriormente.

Análogos sintéticos de NRPs

Análogos sintéticos de NPRs são fornecidos pela memória descritiva que pode ter um ou mais dos seguintes tipos de modificações: (1) estabilização de voltas β, (2) substituição de resíduos de glicina, (3) substituição do resíduo de glicina N-terminal e/ou (4) ciclização. 1. Estabilização de voltas β

Probabilidades de Chou e Fasman para a predição de volta β revelam que as voltas β prováveis na SEQ ID N0:1 podem ser encontradas nos domínios APGR (SEQ ID N0:2) e RAGG (SEQ ID N0:3), como mostrado em negrito a seguir: SEQ ID NO : 1 . NH2 . G1RRAAPGRAGG11-NH2 SEQ ID NO : 1 5 ΕΡ2212349Β1

As voltas β podem ser estabilizadas pela introdução de restrições estéricas tal como aminoácidos alquilados. Aminoácidos facilmente disponíveis que podem ser usados incluem ácido aminoisobutírico (Aib, α-H em alanina substituída com metilo) podem ser usados como uma substituição para um ou ambos dos resíduos de alanina e glicina.

A. Modificação do Domínio APGR

Na sequência APGR (SEQ ID NO: 2), a alanina ou glicina pode ser substituída com ácido aminoisobutírico (Aib). A substituição da alanina com Aib produz o seguinte análogo da invenção: NH2-G1RRA-Aib-PGRAGG11-NH2 SEQ ID NO: 4

B. Modificação do Domínio RAGG

Em outra provável sequência de volta β, RAGG (SEQ ID NO: 3), a alanina pode ser substituída com ácido aminoisobutírico (Aib) par aproduzir o análogo da invenção tendo a sequência : NH2-G1RRAAPGR-Aib-GG11-NH2 SEQ ID NO: 5

Experiências mostraram que a SEQ ID NO: 5 era: neuroprotectora (veja-se FIGs 1—4), estável sob condições de armazenamento (FIGs. 2 e 3), mais neuroprotectora que o NRP não substituído (FIGs. 1 e 4), neuropatia periférica (FIGs. 6 e 7) e ALS (FIG. 8). 2. Substituição de Resíduos de glicina

Substituição do resíduo interno de glicina por uma asparagina (N) pode induzir voltas p devido a asparagina ter maior propensão a volta β que a glicina. Portanto, o resíduo interno de glicina pode ser substituído com asparagina na posição de aminoácido 10 produzindo um péptido da invenção tendo a seguinte sequência: 6 ΕΡ2212349Β1 NH2-G1RRAAPGRANG11-NH2 SEQ ID NO: 6

Verificou-se que este análogo de NRP é neuroprotector em modelo in vitro de toxicidade neural induzida por 3-NP. 3. Substituição do resíduo de glicina N-terminal

Truncagem da G1 na terminação N pode resultar em perda de actividade biológica. A substituição da G1 com um grupo acetilo pode restaurar a actividade biológica. 0 análogo resultante de NRP é acetilado fornecendo um péptido que tem a seguinte sequência:

AcNH-RRAAPGRAGG11-NH2 SEQ ID NO: 7 estes compostos são revelados para fins ilustrativos somente.

Descobriu-se que este análogo de NRP é neuroprotector na face de toxicidade induzida por 3-NP. 4. Substituição de L-Aminoácidos com D-Aminoácidos A estrutura secundária de um péptido pode ser afectada pela presença de D-aminoácidos substituindo um ou mais L-aminoácidos (de ocorrência natural). A substituição do terceiro aminoácido da terminação N produz um composto que tem a seguinte sequência: NH2-GR (D-Arg) AAPGRAGG-NH2 SEQ ID NO:8 estes compostos são revelados para fins ilustrativos somente.

Este análogo de NRP descobriu-se que é neuroprotector no modelo in vitro de toxicidade neural induzida por 3-NP. 7 ΕΡ2212349Β1 5. Ciclização A síntese de um péptido cíclico mimético de SEQ ID N0:1 pode ser levada a cabo. Um método envolve adicionando um resíduo de cisteína a cada extremidade da sequência, e então oxidação do produto resultante para produzir um dissulfureto cíclico que tem a seguinte sequência:

NH2-C '-G-R-R-A-A-P-G-R-A-G-G-C l3-0H SEQ ID NO:9 V·

Alternativamente, tantos os resíduos N como C terminal de glicina pode ser substituída com um resíduo de cisteína e oxidado de maneira similar como acima, produzindo um análogo que tem a seguinte sequência. NHrC^R-R-A^A-P-G-R-A-G-C^-NHííamida).

| J ScQ lU WOílQ s-1-s

Ciclização directa do resíduo C terminal ao resíduo N terminal pode ser conseguida pela criação de uma ligação amida para produzir um péptido que tem a seguinte sequência.

II SEQ IDN0:11

G‘-R-R-A*A-P-G-R-A-G-G

I HN- A utilização de dicroísmo circular pode indicar estrutura secundária e a utilização de software simulação de computador para modelar pequenos péptidos pode também ser levada a cabo usando métodos convencional. Ambas técnicas podem ser usadas para a determinação de características estruturais dos análogos de NRP desta memória descritiva. 8 ΕΡ2212349Β1 Síntese de Análogos sintéticos de NRPs

Materiais de partida e reagentes usados na preparação destes compostos são disponíveis de fornecedores comerciais tais como Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Bachem (Torrance, Califórnia), Sigma (St. Louis, Mo.), ou são preparados por meio de métodos bem conhecidos ao um perito ordinário na especialidade seguindo os procedimentos descritos em tais referências como Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols. 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; March J; Advanced Organic

Chemistry, 4th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992; and Larock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989. Na maioria dos casos, aminoácidos e seus ésteres ou amidas, e aminoácidos protegidos, são amplamente comercialmente disponíveis; e a preparação de aminoácidos modificados e suas amidas ou ésteres são extensivamente descritos na literatura química e bioquímica e assim bem conhecidos a pessoas com perícia na especialidade. Por exemplo, o ácido ΛΤ-pirrolidineacético é descritos em Dega-Szafran Z and Pryzbylak R. Synthesis, IR, e estudos RMN de ácidos zwiteriónicos a-(l-pirrolidina)alcano-carboxílicos e seus derivados N-metilo. J. Mol. Struct.: 436-7, 107-121, 1997; e ácido N- piperidineacético é descrito em Matsuda O, Ito S, e Sekiya M.

De forma conveniente, a produção sintética dos polipéptidos da invenção pode ser de acordo com o método sintético em fase sólida descritos por Goodman M. (ed.), "Synthesis of Peptides and Peptidomimetics" in Methods of 9 ΕΡ2212349Β1 organic chemistry (Houben-Weyl) (Workbench Edition, E22a,b,c,d,e; 2004; Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nova Iorgue) . Esta técnica é bem entendida e é um método comum para a preparação de péptidos. O conceito geral deste método depende da ligação do primeiro aminoácido da cadeia a um polímero sólido por meio de uma ligação covalente. Aminoácidos protegidos sucessivos são adicionados, de uma ver (estratégia por etapas), ou em blocos (estratégia de segmentos), até que a sequência desejada seja montada. Finalmente, o péptido protegido é removido do suporte de resina sólido e os grupos protectores são retirados por clivagem. Por este procedimento, reagentes e sub-produtos são removidos por meio de filtração, assim eliminando a necessidade de intermediários de purificação.***

Os aminoácidos podem ser unidos a qualguer polímero adequado como uma resina. A resina deve conter um grupo funcional para que o primeiro aminoácido possa ser firmemente ligado por uma ligação covalente. Vários polímeros são adequados para esta finalidade, tais como celulose, álcool polivinílico, polimetilmetacrilato e poliestireno. As resinas apropriadas são comercialmente disponíveis e bem conhecida para os de peritos na especialidade. Os grupos de protecção adequados utilizáveis em tal síntese incluem terc-butiloxicarbonilo (BOC) , benzilo (Bzl) , t-amiloxicarbonilo (Aoc), tosilo (Tos), o-bromo-fenilmetoxicarbonilo (BrZ), 2,6-diclorobenzilo (BzlCl 2 ), e fenilmetoxicarbonilo (Z ou CBZ). Grupos de protecção adicionais são identificados em Goodman, citados acima, bem como em McOmie JFW: Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Nova Iorque, 1973.

Os procedimentos gerais para a preparação péptidos do presente invenção envolvem inicialmente unir o aminoácido carboxi-terminal protegido à resina. Após o acoplamento a 10 ΕΡ2212349Β1 resina é filtrada, lavada e o grupo de protecção no grupo alfa-amino do aminoácido carboxi-terminal é retirado. A remoção deste grupo de protecção deve ocorrer, evidentemente, sem quebrar a ligação entre o aminoácido e a resina. 0 seguinte amino, e se for necessário, aminoácido protegido por cadeia lateral, é então acoplado ao grupo amino livre do aminoácido na resina. Este acoplamento ocorre por meio da formação de uma ligação de amida entre o grupo carboxila livre do segundo aminoácido e o grupo amino do primeiro aminoácido ligado à resina. Esta sequência de acontecimentos é repetida sucessivamente com aminoácidos até que todos os aminoácidos sejam anexados à resina. Por último, o péptido protegido é clivado da resina e os grupos de protecção são removidos para revelar o péptido desejado. As técnicas de clivagem utilizadas para separar o péptido da resina e remover os grupos de protecção dependem da selecção de resina e grupos de protecção e são conhecidos por aqueles que já estão familiarizados com a arte da síntese de péptidos.

Os péptidos podem ser ciclizados pela formação de uma ligação dissulfídica entre dois resíduos de cisteína. Métodos para a formação de tais ligações são bem conhecidos e incluem métodos como os descritos em G. A. Grant (Ed.) Synthetic Peptides A User's Guide 2a Ed., Oxford University Press, 2002, W. C. Chan e P. D. White (Eds.) Fmoc Solid Phase Synthesis A Practical Approach, Oxford University Press, 2000, e as referências nele contidas. Técnicas alternativas para síntese de péptidos são descritas em Bodanszky et al. Peptide Synthesis, 2a ed, John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1976. Por exemplo, os péptidos da invenção pode também ser sintetizados utilizando metodologias de síntese de péptidos em solução padrão, envolvendo acoplamento em etapas ou em bloco de 11 ΕΡ2212349Β1 aminoácidos ou fragmentos peptídicos utilizando métodos quimicos ou enzimáticos de formação de ligação amida (ver, p. ex., H. D. Jakubke em The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Nova Iorque, 1987, P. 103-165; J. D. Vidro, ibid., pp. 167-184; e Patente Europeia 0324659 A2,descrevendo descrição métodos de síntese de péptido enzimática). Estes métodos de síntese de solução são bem conhecidos na especialidade.

Sintetizadores de péptido comerciais, tais como a Applied Biosystems Modelo 430A, estão disponíveis para a prática destes métodos.

Utilizações terapêuticas dos análogos de NRP

Os análogos NRP da presente invenção de acordo com a reivindicações podem ser usados para tratar distúrbios neurológicos. NPRs têm sido inesperadamente eficaz no tratamento degeneração neural associada adistúrbios auto-imunes do cérebro, incluindo EAE e a esclerose múltipla (EM) , esclerose lateral amiotrófica (ALS) e lesão tóxica prejuízo para as células neurais.

Distúrbios e condições tratáveis com análogos de NRP

Distúrbios e condições em que compostos de NRP desta invenção de acordo com as reivindicações podem ser de benefício incluem o seguinte.

Condições do sistema nervoso incluindo infecções do sistema nervoso central incluindo por bactérias, fungos, espiroquetas parasitas e sarcóide incluindo infecções pirogénicas, meningite bacteriana acuda ou leptomeningite.

Doenças cerebrovasculares incluindo acidente vascular 12 ΕΡ2212349Β1 cerebral, acidente vascular cerebral isquémico, hipóxia/isquemia, trombose aterosclerótica, lacunas, embolia, hemorragia hipertensiva, aneurismas rotos, malformações vasculares, ataques isquémicos transitórios, hemorragia intracraniana, hemorragia subaracnóidea espontânea, encefalopatia hipertensiva, doenças inflamatórias das artérias encefálicas, perfusão diminuída causada, por exemplo, por insuficiência cardíaca (possivelmente resultantes de cirurgia de bypass coronário) e outras formas de doença cerebrovascular.

Traumatismos crânio-cerebral incluindo fracturas do crânio basal e lesões de nervos cranianos, fístula do cavernoso-carótidas, pneumoencéfalo, aerocele andrinorreia, contusão cerebral, hemorragia cerebral traumática, lesão cerebral traumática, lesão cerebral traumática penetrante e edema cerebral agudo em crianças.

Doenças desmielinizantes incluindo neuromielite óptica, encefalomielite disseminada aguda, encefalite hemorrágica necrotizante aguda e sub-aguda, esclerose cerebral difusa de Schilder e esclerose múltipla em conjunto com neuropatia periférica. Doenças degenerativas do sistema nervoso incluindo síndrome de uma ou mais de demência progressiva, atrofia cerebral difusa, atrofia cortical difusa do tipo não-Alzheimer, demência de corpos de Lewy, doença da Pick, demência fronto-temporal, degeneração talâmica, tipos não-Huntingtoniana de coréia e demência, degeneração córtico-espinhal (Jakob) , o complexo de demência de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica (Guamanina e outros) e esclerose lateral amiotrófica (ALS).

As neuropatias periféricas são condições comuns e incapacitantes caracterizam-se por dano ou perda de neurónios periféricos. Existem mais de 100 tipos de 13 ΕΡ2212349Β1 neuropatia periférica, cada uma com seu próprio conjunto de caracteristicas de sintomas, padrão de desenvolvimento e prognóstico. Neuropatia periférica pode ser hereditária ou adquirida. As formas hereditárias de neuropatia periférica podem ser causadas por mutações genéticas. Alguns tipos de neuropatia periférica e caracteristicas comuns a elas são mostrados abaixo no quadro 1. 0 quadro I acima mostra as comparações entre neuropatia periférica e neuropatia periférica diabética induzida por piridoxina, estreptozotina e quimioterapia.

Quadro 1: Caracteristicas comuns de neuropatias periféricas

Intoxicação por Piridoxina (Vitamina B6) Neuropatia diabética induzida por Streptozotocina Neuropatia periférica diabética Neuropatia periférica Induzida por quimioterapia Modelo Modelo Modelo Condição clinica Modelo /Condição experimental & Condição clínica experimental experimental & Condição clínica Principio Axonopatia de Axonopatia de Axonopatia de neuropatia de patologia nervo periférico nervo nervo periférico Ne rvo reversível, periférico, progressiva, periférico, bem resultando em resultando em resultando em como dano aos velocidade de velocidade de velocidade de gánglios condução de condução de condução de radiculares fibra sensória fibra fibra sensória dorsais. reduzida, autonômica reduzida, com resultando em restrito a reduzida, com degeneração velocidade de células de degeneração sendo dependente condução de diâmetro grande, sendo do comprimento fibra sensória sem dependente do da fibra. reduzida, com e desmielinização. [1,2,3,4,5,6] comprimento da fibra. [11,12,13] [19,20,21] sem desmielinização. [22,23] Mecanismo de Saturação de Toxicidade degeneração (Para compostos Tonicidade Piridoxal cinase Selectiva para axonal platina) Proposto em no fígado ilhotas de Wallerians Distúrbio do pode inibir células β do resultando de metabolismo e piridoxal pâncreas neurotoxicidade transporte fosfato levando a uma hiperglicémica. axonal em nervos neuronal, condição A glucose sensoriais alterando o diabética aumentada periféricos metabolismo hiperglicémica. favorece o seguindo o neuronal. com resultante metabolismo acúmulo no DRG Metabolismo neurotoxicidade através da via leva a neuronal , como em do poliol que akonopatia. deficiente leva a um suporte de energia esgotado doas axões grandes [2,3] diabetes clinica. [14,15,16] results na produção de estresse oxidativo. [16,19,20] [22,24] 14 ΕΡ2212349Β1

Nervo Primariamente Primariamente Primariamente Primariamente periféricos nervos nervos nervos nervos Afectados sensoriais sensoriais e sensoriais sensoriais descendentes autonômicos. descendentes descendentes grandes. incluindo grandes, grandes. incluindo nervos nervos peroneal incluindo nervos incluindo nervos peroneal e sural e outros nervos peroneal e sural peroneal e sural que descendem da que descendem que descendem da que descendem da ciática. [3,6,7] da ciática. [11,13] ciática. [19,20] ciática. [22,23] Resultados Deficiência Predominantemen Inicialmente neuropat ia Funcional motora de te sintomas sintomas sonsorial, com membros positivos de positivos de dor percepção de traseiros devido hiperalgesia ou parestesia, vibração a perda de /alodinia. então dimunuida, retorno sensorial, particularmente dos membros traseiros. [3,6,7,8,9,10] [17,18] progredindo a sintomas negativos com perda de retorno sensorial, particularmente dos pés. [19,20] parestesia, perda de reflexo de tendão, dor e, posteriomente, ataxia (deficiência motora). [22,23] A neuropatia periférica adquirida pode resultar de: danos físicos (trauma) de um nervo, tumores, toxinas (incluindo quimioterapia), respostas auto-imunes, deficiências nutricionais, alcoolismo, distúrbios vasculares e metabólicos (p. ex., neuropatia diabética). 0 neuropatia periférica associada a HIV é um efeito colateral comum de medicamentos visando a transcriptase reversa do vírus HIV. Os sintomas da neuropatia periférica temporária pode variar de sensações de dormência, formigamento e perfuramento, sensibilidade ao toque ou fraqueza muscular, a sintomas mais extremos, tais como dor em queimação, perda muscular, paralisia, disfunção de órgão ou glândula. 0 primeiro relato de uma neuropatia sensorial humana induzida por uma alta dose de piridoxina (vitamina B6) deriva de Schaumberg et al., New Eng. J. Medicine 309:445-448, 1983. As doses diárias eram no intervalo de 2000-6000 mg/dia ao longo de um período de 2 a 14 meses. Todos os pacientes deslocados uma perda sensorial em "estoque de luvas" com dormência nas mãos, pés e marcha instável. 15 ΕΡ2212349Β1

Usar modelos de ratos de neuropatia periférica permite o exame de anormalidades neurológicas induzidas pela piridoxina. Por exemplo, 1.200 ou 800 mg/kg/dia de piridoxina administrado a ratos durante 5 -10 dias resulta em necrose de neurónios sensitivos, especialmente afectando neurónios de grande diâmetro no nervo ciático e o gânglio da raiz dorsal (Xu et al., Neurology 39:1077-1083, 1989). A neuropatia periférica induzida por piridoxina em animais é um sistema reconhecido para estudar os efeitos de agentes terapêuticos. Em particular, este sistema é preditivo dos efeitos desses agentes sobre neuropatia periférica em seres humanos.

Distúrbios metabólicos

Distúrbios no metabolismo adquiridos do sistema nervoso incluindo doenças metabólicas apresentando-se como uma sindrome que compreende uma ou mais de confusões, estupor ou coma-isquemia-hipoxia, hipoglicemia, hiperglicemia, hipercapnia, insuficiência hepática e sindrome de Reye, doenças metabólicas apresentando-se como uma sindrome extrapiramidal progressiva, doenças metabólicas apresentando-se como ataxia cerebelar, hipertermia, doença celíaca-canal, doenças metabólicas causando psicose ou demência, incluindo doença de Cushing e encefalopatia esteróide, psicose de tireóid ee hipotireoidismo e encefalopatia pancreática. Um exemplo de um distúrbio metabólico que pode resultar em neuropatia é excesso de piridoxina descritos mais plenamente abaixo.

Doenças do sistema nervoso devido à deficiência nutricional, o álcool e o alcoolismo

Distúrbios do sistema nervoso devido à drogas e a 16 ΕΡ2212349Β1 outros agentes químicos incluem opiáceos e analgésicos sintéticos, fármacos sedativos hipnóticos, fármacos sedativos estimulantes, fármacos psicoativos, toxinas bacterianas, venenos de plantas, mordeduras e picadas venenosas , metais pesados, toxinas industriais, agentes anti-neoplásicos e imunossupressores, talidomida, antibióticos aminoglicosídeos (ototoxicidade) e derivados à penicilina (convulsões) , agentes cardioprotectores (beta-bloqueadores, derivados digitálicos e amiodarona).

Conforme é ilustrado pela lista anterior, as composições e os métodos da invenção podem encontrar uso no tratamento de lesão e doença neural. Ainda mais geral, as composições e métodos da invenção encontram uso no tratamento de pacientes humanos que sofrem de dano neural como resultado da lesão cerebral aguda, incluindo, mas não se limitando a lesão axonal difusa, lesão hipóxico-isquémica perinatal, lesão cerebral traumática, acidente vascular cerebral, infarto isquémico, embolia e hemorragia hipertensiva; a exposição a toxinas do CNS , infecções do sistema nervoso central, tais como, meningite bacteriana, doenças metabólicas, tais como os que envolvem encefalopatia hipóxico-isquémica e neuropatia periférica, e doenças do armazenamento de glicogénio; ou de lesão neural crónica ou doença neurodegenerativa, incluindo mas não limitado à esclerose múltipla, demência de corpos de Lewy, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington. 0 sofrimento do paciente de tais doenças ou lesões podem se beneficiar muito de um protocolo de tratamento capaz de iniciar migração e proliferação neuronal, bem como crescimento de neuritos.

Ainda mais em geral, a invenção tem aplicação na indução da migração neuronal e de neuroblastos em áreas de danos após injuria sob a forma de trauma, exposição a 17 ΕΡ2212349Β1 toxina, asfixia ou hipóxia-isquemia.

Administração de análogos de NRP

Os análogos de NRP podem ser utilizados via administração directa ao paciente. Um análogo de NRP pode ser administrado como parte integrante de um medicamentos ou preparação farmacêutica. Isso pode envolver a combinação de um análogo de NRP com qualquer portador, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente apropriado. Além disso, um análogo de NRP pode ser usado com outro agente neuroprotector não-NRP, proliferativo ou outro agente. A selecção do portador, adjuvante ou excipiente pode depender da via de administração a ser empregue. A via de administração pode variar amplamente para se adequar a uma situação especial. Um análogo de NRP pode ser administrado em diferentes formas: por via intraperitoneal, por via intravenosa ou intracerebroventricular. A aplicação periférica pode ser uma via de escolha porque, então, não há interferência directa com o sistema nervoso central.

Qualquer via periférica de administração conhecida na especialidade pode ser empregue. Estas podem incluir vias parentéricas, por exemplo, injecção na circulação periférica, subcutânea, intra-orbital, oftalmológica, intraespinhal, intracisternal, tópica, infusão (usando por exemplo, dispositivos de libertação lenta ou minibombas tais como bombas osmótica ou sistemas transdérmicos), implante, aerossol, inalação, escarificação, intraperitoneal, intracapsular, intramuscular, intranasal, oral, bucal, pulmonar, rectal ou vaginal. As composições podem ser formuladas para a administração por via parentérica para seres humanos ou outros mamíferos em 18 ΕΡ2212349Β1 quantidades terapeuticamente eficazes (ex. os montantes que eliminam ou reduzem a condição patológica do paciente) para oferecer terapêutica para as doenças neurológicas descritas acima.

Uma via de administração inclui injecção subcutânea (p. ex., dissolvidos em 0,9% de cloreto de sódio) e administração por via oral (por exemplo, em uma cápsula).

Além disso, será apreciado que pode por vezes ser desejável administrar directamente o análogo de NRP ao SNC do paciente por qualquer via de administração apropriada.

Os exemplos incluem administração por injecção cerebroventricular lateral ou através de uma derivação cirurgicamente inserida no ventrículo cerebral lateral do cérebro do paciente, no líquido cefalorraquidiano ou directamente a uma parte afectada do cérebro do paciente.

Doses terapêuticas dos análogos de NRP

Em algumas formas de realização desta memória descritiva, métodos para o tratamento de dano cerebral compreendem administrar um ou mais análogos de NRP num intervalo de dose de desde cerca de 0,01mg/kg de peso corporal até cerca de 100 mg/kg de peso corporal. Em outras formas de realização desta memória descritiva, uma dose de 1 mg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal pode ser útil. Em formas de realização adicionais desta memória descritiva, uma dose de um NRP pode ser no intervalo de cerca de 0,01 mg/kg de peso corporal a cerca de 0,1 mg/kg.

Em outras formas de realização desta memória descritiva, a determinação de uma quantidade eficaz de um 19 ΕΡ2212349Β1 análogo de NRP para ser administrado está dentro da habilidades de um perito ordinário na especialidade, e vai ser rotineiro para pessoas qualificados na especialidade. Em determinadas formas de realização desta memória descritiva, o montante de um análogo de NRP a ser usado pode ser estimado por estudos in vitro utilizando uma sistema de dosagem conforme descrito no presente documento. 0 montante final de um análogo de NRP a ser administrado será dependente da via de administração, do análogo de NRP utilizado e a natureza do distúrbio neurológico ou condição a ser tratada. 0 intervalo de dose adequado pode, por exemplo, ser entre cerca de 0,01 mg e 15 mg por lkg de peso corporal ou em outras formas de realização desta memória descritiva, de cerca de 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg de peso corporal por dia.

Para a inclusão num medicamento, o análogo de NRP pode ser directamente sintetizado por métodos convencionais, tais como o método de síntese em fase sólida por etapas de Merrifield et al., 1963 (J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154) or Goodman M. (ed.), "Synthesis of Peptides and Peptidomimetics" em Methods of organic chemistry (Houben-Weyl) (Workbench Edition, E22a,b,c,d,e; 2004; Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nova Iorque). Tais métodos de síntese de péptidos são conhecidos na arte, e são descritos, por exemplo, em Fields and Colowick, 1997, Solid Phase Peptide Synthesis (Methods in Enzy-mology, vol. 289), Academic Press, San Diego, CA. Alternativamente a síntese pode envolver a utilização de sintetizadores de péptido disponíveis comercialmente, tais como o Applied Biosystems modelo 430A.

Como uma proposição geral, a quantidade farmaceuticamente eficaz total de um análogo de NRP administrado por via parentérica por dose estará em um 20 ΕΡ2212349Β1 intervalo que pode ser medido por uma curva de dose-resposta. Por exemplo, um análogo de NRP no sangue pode ser medido nos fluidos corporais do mamífero a ser tratada para determinar a dosagem. Em alternativa, pode administrar quantidades crescentes de um composto de NRP ao paciente e verificar os níveis séricos do paciente para o análogo de NRP. 0 montante do análogo de NRP para ser utilizado pode ser calculado em uma base molar com base nestes níveis séricos do análogo de NRP.

Um método para determinar a dosagem apropriada do composto implica medir níveis de NRP de um fluido biológico tal como um fluido corporal ou sanguíneo. A medição de tais níveis pode ser feita por qualquer meio, incluindo RIA e ELISA. Após medir os níveis de análogos de NRP, o fluido é posto em contacto com o composto usando uma única ou múltiplas doses. Após esta etapa de contacto, os níveis de análogo de NRP são re-medidos no fluido. Se os níveis de análogo d eNRP no fluido têm caído por um montante suficiente para produzir a eficácia desejada para a qual a molécula é para ser administrada, então, a dose da molécula pode ser ajustado para produzir máxima eficácia. Este método pode ser realizado in vitro ou in vivo. Este método pode ser levado a cabo in vitro, por exemplo, depois que o fluido é extraído de um mamífero e os níveis de análogo de NRP medidos, o composto do presente documento é administrado ao mamífero usando uma única ou múltiplas doses (isto é, a etapa de contato é conseguida pela administração a um mamífero) e, em seguida, os níveis de análogo de NRP são re-medidos a partir do fluido extraído do mamífero.

Os análogos de NRP são devidamente administrados por um sistema de libertação sustentada. Exemplos de composições de libertação prolongada adequadas incluem 21 ΕΡ2212349Β1 matrizes de polímero semi-permeáveis sob a forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Matrizes de libertação sustentada incluem poliláctidos (documento Pat. U.S. N° . 3.773.919 , documento EP 58.481), metacrilato de poli(2-hidroxietilo) Langer et al., 1981), acetato de etileno vinil (Langer et al., supra), ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Composições de libertação sustentada também incluem um composto liposomicamente associado. Lipossomas contendo o composto são preparados através de métodos conhecidos para aqueles que de especialidade na arte, como exemplificado pelos documentos DE 3,21.8,121; Hwang et al., 1980; EP 52.322; EP 36,676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; pedido de Pat. Japonesa 83-118008, Pat. U.S. N° 4.485.045 e 4.544.545 e EP 102.324. Em algumas formas de realização, os lipossomas são do tipo unilamelares pequenos (desde ou cerca de 200 a 800 angstrons) em que o conteúdo lipídico é maior do que cerca de 30 % mol. de colesterol, a proporção seleccionada sendo ajustada para a terapêutica mais eficaz. Péptidos PEGuilados tando uma vida útil mais longa do que péptidos não-PEGuilado podem também ser empregues, com base em, por exemplo, a tecnologia de conjugado descrito no documento WO 95/32003 publicado 30 de Novembro de 1995.

Em algumas formas de realização, o composto pode ser formulado em geral misturando cada a um grau de pureza desejado, em uma forma farmacêutica injectável unitária (solução, suspensão, ou emulsão), com um portador farmaceuticamente, ou parentericamente, aceitável, ou seja, que não é tóxico para os destinatários, nas dosagens e concentrações utilizadas e é compatível com os outros ingredientes da formulação. Por exemplo, a formulação preferencialmente não incluem agentes oxidantes e outros compostos que são conhecidos por ser deletérios para 22 ΕΡ2212349Β1 polipéptidos. Pode ser apreciada que as doses anteriores não são destinadas a ser um fator limitante. Outras doses fora das faixas anteriores podem ser determinadas por aqueles peritos na especialidade.

Em algumas formas de realização, as formulações podem ser preparadas colocando em contato um composto uniformemente e intimamente com portadores líquidos ou portadores sólidos finamente divididos ou ambos. Em seguida, se for desejado, o produto pode ser moldado para a formulação desejada. Em algumas formas de realização, o portador é um portador parentérico, como alternativa, uma solução que é isotónica com o sangue do receptor. Exemplos de tal veículo portadores incluem água, solução salina, solução de Ringer, solução tamponada, e solução de dextrose. Veículos não-aquosos, tais como óleos fixos e oleato de etilo são também muito úteis no presente documento. 0 portador adequadamente contém pequenas quantidades de aditivos, tais como substâncias que melhoram isotonicidade e estabilidade química. Tais materiais são desejavelmente não-tóxico para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas, e incluem, apenas a título de exemplo, tampões, tais como fosfato, citrato, succinato, ácido acético e outros ácidos orgânicos ou seus sais, antioxidantes, tais como ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos), p. ex., poliarginina ou tripéptidos; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; Glicina; aminoácidos, tais como ácido glutâmico, ácido aspártico, histidina, ou arginina, monossacarídeos, dissacarídeos e outros hidratos de carbono incluindo celulose ou seus derivados, glicose, manose, trealose, ou dextrina; agentes 23 ΕΡ2212349Β1 quelantes, tais como EDTA; álcoois de açúcar, como o manitol ou sorbitol; contra-iões tais como sódio; tensioactivos não-iónicos como polisorbatos, poloxamers, ou polietileno glicol (PEG); e/ou sais neutros, por exemplo, NaCl e KCL, MgC12, CaC12, e semelhantes. Em algumas formas de realização, um péptido da presente invenção pode ser estabilizado utilizando 0,5 M de sacarose ou 0,5 M de trealose. A utilização destes açúcares pode permitir armazenamento a longo prazo dos péptidos.

Um composto de NRP pode ser desejavelmente formulado em tais veículos a um pH de cerca de 6,5 a cerca de 8. Em alternativa, o pH pode ser de cerca de 4,5 a cerca de 8. Será entendido que a utilização de certos dos excipientes, portadores, ou estabilizantes anteriores resultará na formação de sais do composto. A preparação final pode ser um líquido estável ou sólido liofilizado.

Em outras formas de realização, podem ser utilizados adjuvantes. Adjuvantes típicos que podem ser incorporadas em comprimidos, cápsulas, e semelhantes são um aglutinante, tal como acácia, amido de milho, ou gelatina; um excipiente tal como celulose microcristalina; um agente desintegrante como amido de milho ou ácido algínico, um lubrificante, tal como estearato de magnésio; um edulcorante, como sacarose ou lactose; um aromatizante como hortelã-pimenta, gaultéria, ou cereja. Quando a forma de dosagem é uma cápsula, para além dos materiais citados, ela também pode conter um portador líquido, tal como um óleo graxo. Outros materiais de vários tipos podem ser utilizados como revestimentos ou como modificadores da forma física da unidade de dosagem. Um xarope ou elixir pode conter o composto activo, um adoçante como a sacarose, conservantes como propil parabeno, um agente corante e um aromatizante, como cereja. Composições estéreis para injecção podem ser 24 ΕΡ2212349Β1 formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional. Por exemplo, dissolução ou suspensão do composto activo em um veiculo como a água ou óleo vegetal de ocorrência natural, como gergelim, amendoim, ou óleo de semente de algodão ou veiculo gordo sintético como oleato de etilo ou semelhante pode ser desejado. Tampões, conservantes, antioxidantes, e semelhantes podem ser incorporados de acordo coma prática farmacêutica aceita.

Desejavelmente, um análogo de NRP a ser usado para fins terapêuticos pode ser estéril. A esterilidade pode ser facilmente obtida por meio de filtração através de membranas de filtração estéril (por ex., membranas com tamanhos de poros de cerca de 0,2 micron). Composições terapêuticas em geral podem ser colocadas em um recipiente estéril com uma porta de acesso, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução endovenosa com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

Em outras formas de realização, um análogo de NRP pode ser armazenado em recipientes unitários ou multi-dose, por exemplo, ampolas e frascos vedados, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para reconstituição. Como um exemplo de uma formulação liofilizada, frascos de 10 mL são preenchidos com 5 ml de solução aquosa 0,01% (p/v) filtrada estéril de composto, e a mistura resultante é liofilizada. A solução de infusão pode ser preparada reconstituindo compostos liofilizados usando água bacteriostática ou outro solvente adequado.

Em formas de realização da memória descritiva, um kit pode conter uma quantidade pré-determinada de compostos de NRP liofilizados, uma solução fisiologicamente compatível para a preparação de uma forma de dosagem, um frasco de mistura, um dispositivo de mistura, e as instruções de 25 ΕΡ2212349Β1 utilização. Esses kits podem ser fabricados e armazenados de acordo com práticas habituais da indústria.

Uma composição contendo composto de NRP pode ser administrada por uma ou mais de uma variedade de vias. A titulo de exemplo, a administração intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intraventricular, inalação, lavagem , rectal e vaginal, transdérmica, subcutânea podem ser usadas.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são apresentados para ilustrar formas de realização específicas desta invenção.

As pessoas de habilidades normais podem utilizar as revelações e ensinamentos contidos no presente documento para produzir outras formas de realização e variações sem experimentação indevida. Todas essas formas de realização e as variações são consideradas como parte integrante da presente invenção.

Exemplo 1: Efeitos de compostos NRP sobre sobrevivência e proliferação de Microexplantes cerebelares

Preparação do Composto de NRP

Compostos de NRP foram fornecidos por Auspep (Austrália). Os péptidos foram sintetizados utilizando síntese em fase sólida padrão. Os péptidos foram alimentados com uma terminação C amidada, e eram mais de 95% de pureza, como analisado por análise de espectro MALDI-MS. Os péptidos foram armazenados liofilizados a -80°C sob árgon em 0,5 M de sacarose ou 0,5 M de trealose até o uso. Foram reconstituídos em PBS, alternativamente em 26 ΕΡ2212349Β1 100 mg/ml de transferrina humana/PBS ou em outras formas de realização em lOOmg/ml de BSA/PBS, em 0,5 M de sacarose ou 0,5 M de trealose.

Preparação de Cultura Celular Córtices de cerebelo laminado dos dois hemisférios foram explantados de rato Wistar P3, P4, P7 ou P8, cortados em pedaços pequenos, GBSS com 0,65 % de solução de D(+)glicose, e triturado por uma agulha de calibre 0,4 mm e depois pressionado através de uma peneira com tamanho de poro de 125 mm. Os microexplantes obtidos foram centrifugados (60 X g) 2 vezes para um intercâmbio de meio START V complementado com BSA isento de soro (Biochrom) . Por último, os microexplantes foram reconstituídos em 500 ml de meio STARTV. Para a cultura, 38 ml da suspensão de células foi incubado durante 1 hora em uma lamela recoberta com poli-D-lisina numa em placa de Petri de 35 mm sob uma atmosfera que compreende por 5% de C02 no ar e 100 % de humidade em 34°C. Posteriormente, as toxinas de lesão (como descrito abaixo) , análogos de NRP e 1 ml de meio STARTV foram adicionados, e as culturas foram avaliadas após 2 ou 3 dias de cultura.

Para as experiências de imuno-histoguimica e migração neuronal, microexplantes cerebelares foram fixados após 2 ou 3 dias de cultura após o seguinte esguema: microexplantes foram fixados por tratamento em série de 2 minutos com 0,4 %; 1,2 %, 3 % de paraformaldeido, respectivamente, seguido por uma incubação de 5 min em 4 % de paraf ormaldeido e 0,25 % de glutaraldeido em 0,1 M de fosfato de sódio (pH 7,4). 27 ΕΡ2212349Β1

Efeitos dos compostos de NRP em lesão neural induzida por toxina

Estresse oxidativo pode resultar na neurodegeneração. Este é um possível mecanismo para os sintomas observados no distúrbio humano com a doença de Huntington. A toxina que produz estresse oxidativo, ácido 3-nitropropiónico (3-NP) tem sido mostrada anteriormente que produz efeitos em animais experimentais que imitam os efeitos observados em seres humanos com a doença de Huntington. Assim, os estudos dos fármacos terapêuticos em animais experimentais com neurotoxicidade induzida por 3-NP são preditores de efeitos colaterais desses fármacos para tratar seres humanos com a doença de Huntington ou outros distúrbios caracterizados por estresse oxidativo. Métodos gerais de toxicologia e experiências de administração de fármaco foram concebidos de tal maneira que 1/100 partes da toxina e fármacos neuroprotectores foram administradas simultaneamente ao microexplantes cerebelares preparados. Glutamato foi preparado como uma solução estoque de 50 mM em água MilliQ enquanto 50 mM de ácido 3-nitropropiónico (3-NP) foi ajustado o pH (pH 6,8 -7,2) em água MilliQ. As concentrações da toxina que induz estresse oxidativo ácido 3-nitropropiónico (3-NP), e a excitotoxina, glutamato no ensaio foram em concentrações de 0,5 mM cada. Péptidos de NRP Liofilizados foram reconstituídos em PBS ou 100 mg/ml de transferrina humana como uma solução estoque de 10 mM. Posteriormente, foram feitas diluições em série. Os microexplantes cerebelar foram cultivados durante 48 a 72 horas a 34°C e 5 % de C02 no ar e 100 % de humidade antes de terem sido fixados por quantidades crescentes de paraformaldeído (0,4 %, 1,2 %, 3% e 4% - cada tratamento de 2-3 min). 28 ΕΡ2212349Β1

Usando as toxinas descritas acima, os explantes cerebelares foram expostos durante 24 horas, no inicio da cultura a diluições do NRP (ensaio de sobrevivência) ou NRP e 0,1 mM de BrdU (ensaio de proliferação). Em seguida, 80% das médias foi alterado sem a adição de novas toxinas e PRN. As culturas cerebelo foram fixadas como descrito acima após 3 dias, in vitro. A detecção de nível de BrdU incorporado é realizada como descrito anteriormente.

Redução de Dados e Análise estatística

Para a análise estatística de sobrevivência, quatro campos (cada campo tendo uma área de 0,65 mm2) de cada cultura cerebelar fixadas com as mais altas densidades celulares foram escolhidas, e as células exibindo crescimento de neuritos foram contadas (ensaio de sobrevivência).

Resultados

Neuroprotecção

Os análogos de NRP promoveram sobrevivência neuronal aumentada em explantes tratados com 3-NP (veja-se Exemplos 2, 3 e 4) .

Exemplo 2: Promoção de sobrevivência de células neurais pelos compostos de NRP

Foram estudados os efeitos de diferentes concentrações de SEQ ID N:l, e SEQ ID N:5° da presente invenção em culturas de células preparadas de acordo com o exemplo acima. SEQ ID N:1 e SEQ ID N:5° têm a mesma sequência de aminoácidos, com a excepção de que a alanina (A) na posição 9 da sequência de aminoácidos da SEQ ID N:1 foi substituída 29 ΕΡ2212349Β1 pelo ácido aminoisobutírico (Aib), produzindo assim um composto tendo a sequência mostrada na SEQ ID N:5. Pode-se apreciar que, para além da mudança na estrutura linear do péptido, substituição por Aib de alanina pode estabilizar a volta beta, e assim, produzir um péptido tendo estrutura tridimensional diferente e mobilidades diferentes ao redor de certas ligações em relação ao péptido não substituído.

As culturas de células foram expostas ao veículo sozinho (coluna aberta) a neurotoxina 3-NP isolada (coluna sombreada) a 3-NP mais diferentes concentrações de SEQ ID N:5° (colunas hachuradas) ou de 3-NP mais diferentes concentrações de NRP não-substituído, SEQ ID N:1 (coluna sombreada escura). Em seguida, contou-se o número de células tendo neuritos como um indicador de sobrevivência de células neuronais. A FIG. 1 Mostra um gráfico dos resultados destes estudos. 3-NP sozinho produziu uma profunda perda de células exibindo neuritos em comparação com controlos tratados com veículo, indicando que o composto é neurotóxico. 0 péptido tendo a sequência SEQ ID N:1 em concentrações de 10 fM ou 1 pM diminuiu significativamente os efeitos neurotóxicos do 3-NP (média ± SEM; p< 0,001; n= 4). Do mesmo modo, a SEQ ID N:5° diminuiu a neurotoxicidade induzida por 3-NP em uma maneira dependente da concentração, com um limiar de abaixo cerca de 1 fM e um efeito máximo em uma concentração de cerca de 100 fM (média 6MEV; p< 0,001; n=4 cada). A partir deste estudo, concluiu-se que a SEQ ID N:5 é neuroprotetora. Este resultado significa que a SEQ ID N:5 pode ser um valioso composto terapêutico NRP para o tratamento de degeneração neural em humanos que sofrem de distúrbios neurológicos. Além disso, devido a que o 30 ΕΡ2212349Β1 estresse oxidativo é conhecido por induzir neurodegeneração semelhante à neurodegeneração observada em seres humanos com a doença de Huntington, os compostos sintéticos NRP deste invento podem ser usados para tratar seres humanos com neurodegeneração causada pelo estresse oxidativo.

Exemplo 3: Efeitos neuroprotetores e estabilidade de compostos de NRP não substituídos

Para determinar a estabilidade do NRP da presente invenção no armazenamento, foram levados a cabo uma série de estudos com a SEQ ID:1. Neste estudo, foram sintetizados SEQ ID N:1 e em seguida armazenou-se o péptido a temperaturas de -20°C ou -4°C durante 9 (nove) semanas.

Em seguida, testaram o NRP para eficácia na protecção neurónios cerebelares contra o efeito neurotóxico do 3-NP, conforme descrito acima. Os explantes cerebelares foram tratados com o veículo sozinho (coluna aberta), o agente neurotóxico 3-NP sozinho (coluna clara pontilhado), ou 3-NP mais quatro concentrações de SEQ ID N:1 gue tinha sido armazenado durant 9 semanas a -20°C, ou a -4°C. A FIG. 2 ilustra os resultados desses estudos.

Os explantes cerebelares tratados com 3-NP sozinho (barra clara pontilhada) mostraram poucas células gue apresentam neuritos em relação aos explantes de controlo tratados com veículo (barra aberta). SEQ ID NO: 1 que tinha sido armazenada a -20°C apresentou efeitos neuroprotetores em todas as concentrações testadas (a partir de 10 ”13 M; de 10° fM a 10“ 10 M; 100 pM) , com efeitos estatisticamente significativos observados nas concentrações de 10 11 M e 10 31 ΕΡ2212349Β1

Em contraste, a SEQ ID N:1 armazenada a uma temperatura de -4°C produziu pouca diminuição do efeito neurotóxico de 3-NP. Conclui-se a partir deste estudo, que o NRP não substituído perde actividade ao longo do período de 9 semanas de armazenamento a -4°C, e que armazenar a SEQ ID N:1 a -20°C pode proteger sua potência.

Exemplo 4: Estabilidade e efeitos neuroprotetores do NEP substituídos

No presente estudo, procuramos determinar a estabilidade de um NRP substituído, SEQ ID N:5, em diferentes condições de armazenamento e em diferentes concentrações, como com o Exemplo 3 acima. Sintetizou-se a SEQ ID N:5 e, em seguida, armazenou-se o péptido durante 9 semanas a uma temperatura de -20°C ou -4°C. Em seguida, testou-se a eficácia da SEQ ID N:5° em diminuir o efeito neurotóxico do 3-NP, conforme descrito nos exemplos 2 e 3 acima. A FIG. 3 mostra um gráfico desses estudos. Os explantes cerebelares foram tratados com o veículo sozinho (coluna aberta), 3-NP sozinho (coluna clara pontilhada) ou 3-NP mais concentrações de SEQ ID N:5, em quatro concentrações variando de 10 -13 M alO -10 M) que havia sido armazenado a -20°C ou -4°C. Quando armazenado a -20°C, Sa EQ ID N:5 produziu efeitos neuroprotetores semelhantes àqueles encontrados para SEQ ID N:1 que tinha sido armazenado a -20°C, como mostrado no exemplo 3 e representado na FIG. 2.

Descobriu-se surpreendentemente que mesmo quando armazenada a -4°C, a SEQ ID N:5° manteve o seu efeito neuroprotetor. Na verdade, o grau de neuroproteção fornecido pela SEQ ID N:5° após o período de armazenamento 32 ΕΡ2212349Β1 em -4°C não foi estatisticamente diferente do grau de neuroproteção fornecido após o armazenamento a -20°C. 0 resultado foi totalmente inesperado com base nos estudos da SEQ ID: 1 mostrada acima. 0 aumento da estabilidade da NPR tendo a SEQ ID:5 significa que este composto será mais adequado para armazenamento e transporte nas condições comummente utilizadas.

Exemplo 5: Efeitos Neuroprotectores NRP não substituídos e substituídos

Em um grande conjunto de dados obtidos com os métodos do exemplo 1, confirmou-se os resultados mostrados na FIG. 1. A FIG. 4o mostra um gráfico dos resultados dos estudos dos microexplantes cerebelares tratados com a neurotoxina 3-NP, demonstrando neuroproteção pela SEQ ID N:5° e SEQ ID: 1 em um estudo de 6 em cada grupo. Conclui-se que a SEQ ID N:1 e a SEQ ID N:5° protegem os neurónios de morrer após exposição à neurotoxina 3-NP. Conclui-se também que a SEQ ID N:5° e a SEQ ID N:1 podem ser agentes terapêuticos úteis no tratamento de seres humanos a sofrer de neurotoxicidade.

Exemplo 6: Efeitos terapêuticos e profiláticos de análogos de NRP em vim modelo da esclerose múltipla

Para determinar se NRP têm um impacto na inflamação crónica no SNC que leva a grave dano axonal e subsequentes lesões (como na esclerose múltipla; MS), testou-se NRPs em um modelo de camundongo de encefalite autoimune experimental (EAE) que imita o estado progressivo grave de MS, usando mielina oligodendrócitos glico-proteína (MOG), como imunógeno. 33 ΕΡ2212349Β1 Métodos e Materiais

Animais

Camundongos fêmeas, de 6 a 8 semanas de idade, estirpe C57B1/6J pesando uma média de 24 g foram utilizados.

Preparação de NRP 0 péptido tendo a sequência: NH2-REGRRDAPGRAGG-NH2 SEQ ID NO: 12 (Também conhecido como SEQ ID: 30 divulgado no pedido de patente US Número 10/ 976.699), foi fornecido por Auspep (Austrália). O péptido da SEQ ID N:12 foi fornecido com uma terminação C amidada, e foi mais de 95% de pureza, conforme determinado pela espectroscopia MALDI-MS HPLC. A sequência foi confirmada por espectroscopia de massa. O péptido foi armazenado liofilizado a uma temperatura de -80°C, sob gás árgon até o momento da utilização. O péptido foi reconstituído em PBS no dia da utilização.

Inducção de EAE

Um 200pul L de uma emulsão contendo 200 200 pug do péptido encefalitogénico MOG35-55 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK SEQ ID NO:13 foi obtida a partir de C S Bio Co. USA) de adjuvante completo de Freund (Difco, Detroit, EUA) contendo 800 pug de Mycobacterium tuberculosis (Difco, Detroit, EUA) foi injectado por via subcutânea, em um dos flancos. Os camundongos foram injectados imediatamente intraperitonealmente com 400 ng toxina pertussis (List Biological Laboratories, EUA) e novamente 48 horas mais tarde. 34 ΕΡ2212349Β1

Tratamento

Terapêutica

No pico da doença (dia 17, após imunização com MOG) os animais foram tratados com SEQ ID NO: 12 Intra- peritonealmente (i.p.) durante 14 dias com uma dose diária de 0,1 mg de péptido/animal (4,16 mg/kg).

Avaliação do comprometimento neurológico

Os camundongos foram monitorizados diariamente e comprometimento neurológico foi pontuada por uma pontuação clinica arbitrária como segue: 0, Nenhum sinal clinico; 1, cauda flácida; 2, fraqueza do membro traseiro; 3, paralisia do membro traseiro; 4, fraqueza do membro traseiro e membro dianteiro fraqueza; 5, paraplegia; 6, morte.

Resultados

Efeitos terapêuticos do NRP na EAE em camundongos

O resultado 31° dias após o primeiro tratamento com NRP é mostrado na FIG. 5. Há um significativo efeito terapêutico da SEQ ID NO: 12 quando perifericamente administrado. Um efeito de fármaco similar tem sido mostrado para o composto neuroregenerativo EPO em uma terapêutica de combinação com metilprednisolona. A desvantagem da EPO é a sua grande dimensão, pois não pode ser facilmente sintetizada ou administrada. Conclui-se que NRP tem grande potencial a longo prazo para diminuir a gravidade da deficiência motora que ocorre no modelo de doença EAE de MS quando administrado como fármaco terapêutico no pico da doença. A pontuação 1 é a menor pontuação e envolve uma cauda flácida somente, enquanto as 35 ΕΡ2212349Β1 maiores pontuações envolve fraqueza (pontuação 2) ou paralisia completa das pernas traseiras (pontuação 3) . ** p < 0,01 versus pontuação no dia 1 do tratamento.

Exemplo 7: Efeitos dos análogos de NRP em animais com neuropatia periférica

Para determinar se os análogos de NRP da presente invenção podem ser agentes terapêuticos úteis para tratar neuropatia periférica, levou-se a cabo uma série de estudos em ratos com neuropatia periférica induzida pela piridoxina.

Demonstrou-se que NH2-G1RRAAPGR-Aib-GG11-NH2 (SEQ ID N:5) em doses muito baixas aplicadas como um bolus único por dia pode atenuar os déficits motores em animais tratados com doses tóxicas de piridoxina.

Materiais e Métodos

Ratos Sprague-Dawley machos foram utilizadas e foram pesados 278-349g no inicio da intoxicação com cloreto de piridoxina. Antes da intoxicação, os ratos eram habituados caminhar através de uma passarela em intervalos diários durante uma semana.

Experiência I: Os ratos foram administrados com 400 mg/kg de cloreto de piridoxina dissolvido em água destilada esterilizada ajustada a pH neutro por via intraperitoneal (i.p ) duas vezes ao dia, durante 8 dias, e ao mesmo tempo, o péptido tendo a sequência SSEQ ID NO: 5 foi administrado por via intraperitoneal durante um total de 10 dias. Os ratos foram observados durante um total de 29 dias.

Experiência II: Os ratos foram administrados com uma 36 ΕΡ2212349Β1 dose maior de piridoxina (1200 mg/kg/dia) durante um período de tempo mais curto. Cloreto de piridoxina dissolvido em água destilada esterilizada ajustada a pH neutro foi administrado por via intraperitoneal em ratos na dose de 600 mg/kg duas vezes ao dia, durante 4 dias. Ao mesmo tempo, o péptido tendo a seguência SEQ ID N:5 foi administrado durante 4 dias.

No 5o dia, os ratos foram testados para déficits motores.

Os déficits motores após intoxicação com piridoxina e os efeitos da SEQ ID N:5 foram analisados utilizando uma travessia de passarela de precisão.

Sete etapas de passos subseguentes através de uma passarela de l,5m de comprimento foram gravadas em vídeo, de acordo com o posicionamento do tarso do pé, estas etapas foram pontuadas de 1 a 4 (1- tarso da pata traseira da mediana da passarela; 2- tarso estava tocando a metade superior do meio da passarela; 3-tarso estava tocando a metade inferior da mediana da passarela e 4- tarso abaixo da mediana da passarela). Os resultados de pontuação de todas as sete etapas foram adicionados juntamente. Uma pontuação de 30 foi dado se o animal só foi capaz de ficar na passarela, mas foi incapaz de caminhar. No caso de incapacidade de ficar na passarela foi dada pontuação de 32 .

Grupos de Tratamento

Experiência I: As duas concentrações testadas para SEQ ID N:5 foram de 40 ng/kg/dia e 4 mg/kg/dia. Experiência II: Solução salina e SEQ ID N:5 em uma dose de 4 mg/kg/dia foram testados. 37 ΕΡ2212349Β1

Análise Estatística

Os dados de déficit motor foram avaliados por análise de duas vias de variância e teste post-hoc de Bonferroni. a significância estatística foi concluída de p<0,05 entre as coortes de tratamento de drogas e tratamento com veículo.

Resultados

Experiência I:

Quatro dias após a cessação da intoxicação por piridoxina, ambas as coortes de ratos tratados com SEQ id N:5- mostram déficits motores atenuados (dose baixa: p< 0,05; dose alta: p< 0,01) em comparação com o grupo tratado com veículo. No dia 16 após início da intoxicação com piridoxinao grupo de maior dose de SEQ ID NO:5 ainda tinha déficit motor significativamente menor que o grupo de controlo (p< 0,05). (FIG. 6).

Experiência II:

Quatro dias consecutivos de altas doses de intoxicação por piridoxina levam a grandes déficits motores do grupo de controlo de ratos. No dia 5, o grupo de ratos tratados com SEQ ID N:5 (dosagem: 4 mg/kg/dia) mostrou-se atenuação altamente significativa de déficit motor (p< 0,001) (FIG. 7) .

Conclusões

Concluiu-se que a SEQ ID N:5 mostrou-se altamente significativa e atenuação clinicamente substancial do déficit motor de neuropatia periférica induzida por piridoxina. Conclui-se também que, na dose de 4 mg/kg/dia, 38 ΕΡ2212349Β1 a SEQ ID N:5 foi bem tolerada. A concentração de 4 mg/kg/dia trabalhou igualmente no modelo mais crónico de intoxicação por piridoxina (800 mg/kg/dia durante 8 dias) e a intoxicação por piridoxina aguda induzida por 1200 mg/kg/dia, administrada durante 4 dias.

Concluiu-se também a partir destes estudos que a SEQ ID N:5 pode ser eficaz no tratamento de neuropatias periféricas em seres humanos.

Exemplo 8: Efeito de SEQ ID N: 5 em animais com Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS)

Nesta série de estudos, que examinou os efeitos da SEQ ID N:5 em camundongos tendo um defeito genético (SOD-1) que produz uma doença neuronal motora semelhante à que em seres humanos com o ALS. Os animais com este distúrbio apresentam uma perda progressiva da coordenação motora ao longo do tempo, e por fim a morte prematura pela doença. Este sistema é útil para estudar os efeitos de agentes potencialmente úteis no tratamento ALS em seres humanos. Assim, os resultados obtidos são altamente preditivos de resultados obtidos em seres humanos com o ALS. Métodos

Os camundongos foram alocados aleatoriamente para receber veiculo ou SEQ ID N:5 desde o ponto de surgimento da doença em diante. Inicio da doença em cada um dos grupo de alocação de tratamentos não foi significativamente diferente. 92-93 dias.

Tratamento com SEQ ID N:5 (40 mg/kg, dando 1/dia, i.p. (FIG. 8A ) ou 0,4 mg/kg, dado 1/dia, i.p. (FIG. 8B) 39 ΕΡ2212349Β1

Resultados

Em dois estudos, o tratamento com SEQ ID N:5° resultou em um aumento significativo do tempo de vida nos camundongos sofrem o distúrbio semelhante a ALS ( Figs. 8A e 8B). Uma dose diária de 40 mg/kg i.p. SEQ ID N:5 promoveram a longevidade de forma significativa após inicio da doença. As figs. 8-A e 8-B mostram as curvas de probabilidade de sobrevivência de Kaplan-Meier, para os camundongos transgénicos SOD1 mutante (ALS).

Os animais tratados com veiculo começaram a morrer no dia 120, e todos estavam mortos no dia 143 (Estudo 1; FIG. 8A e linha sólida). Da mesma forma, no estudo 2 (FIG. 8B; linha sólida), os animais tratados com veículo começaram a morrer no dia 120 e estavamtodos mortos no dia 154 (FIG. 8B; linha sólida).

Em contrapartida, no estudo 1 (FIG. 8A, linha tracejada) os camundongos tratados com a SEQ ID N:5 começaram a morrer mais tarde (em dia 131) gue os animais tratados com veículo e viveram mais tempo (até 156 dias) significativamente, as duas curvas de Kaplan-Meier não se sobrepõem (FIG. 8A e 40 mg/kg de SEQ ID N:5; p <0,01 em comparação com a sobrevivência de animais tratados com o veículo sozinho). No Estudo 2 animais tratados com a SEQ ID N:5 (FIG. 8B; linha tracejada; 0,4 mg/kg) começaram a morrer mais tarde (no dia 125) que os animais tratados com veículo (FIG. 8-B; linha sólida) e, de um modo geral, viveram mais tempo (até 189 dias: FIG. 8B; linha tracejada; SEQ ID N:5. 40 ΕΡ2212349Β1

Conclusões

Conclui-se a partir desses estudos que a SEQ ID N:5 é um agente eficaz que tem inesperadamente uma maior estabilidade em comparação com o seu homólogo não substituído. Conclui-se também que estabilizar a volta beta de um PNR pode melhorar eficácia terapêutica e pode melhorar a estabilidade, ambos dos quais pode melhorar a utilidade terapêutica do análogos de NRP. Os resultados inesperados que análogos de NRP substituídos têm tanto de uma melhor potência como uma melhor estabilidade indica que od análogod de NRP podem ser valiosas alternativas terapêuticas para o tratamento de uma variedade de condições caracterizadas pela neuro-degeneração.

Portanto, análogos de NRP da presente invenção podem ser úteis no tratamento agudo, bem como as doenças neurodegenerativas crónicas incluindo ALS, neurotoxicidade, neurodegeneração associada a estresse oxidativo, distúrbios auto-imunes, lesão cerebral traumática e de outras doenças e condições neurológicas. Além disso, concluímos que análogos de NRP podem ter efeitos terapêuticos benéficos em situações onde a perda da função neurológica é um sintoma.

Exemplo 9: N Migração mediada por análogo de NRP em Condições fisiológicas (sem lesão)

Um análogo de NRP é testado para de actividade indução de migração/quimioatractiva em células estaminais neurais de ratinho em um ensaio de migração haptotáctica conforme descrito abaixo. 41 ΕΡ2212349Β1 Métodos

Revestimento Inicial de NRP

Poços de controlo de placas Transwell (Corning) com 12 mm de tamanho de poros são revestidos em 1,5 ml do veiculo BSA/PBS. As placas restantes são revestidas com 0,1 ng/ml de análogo de NRP (preparados em PBS contendo 10 ug/ml de BSA) .

Revestimento da matriz extracelular

Laminina (7 mg/ml) é usada como revestimento de matriz extracelular (MEC) para células estaminais primárias de ratinho. A matriz é incubada a 37°C; 5 % de C02 durante 2 horas em temperatura ambiente.

As células são semeadas sobre as inserções (30.000 células por poço).

As placas são fixadas em 1 ou 2 dias in vitro (DIV). Revestimento de inserções

Uma mistura 5 ug/mL de PDL/PLL (em PBS) é usada para revestir as inserções. Posteriormente, as inserções são lavadas com água MilliQ.

Fixação Celular

As inserções são descartados e os poços fixados em diluições sucessivas de PFA (0,4, 1,2, 3 e 4 %) durante 3-5 min. em cada diluição. Os poços são enxaguados e armazenados em diluições sucessivas de PFA (0,4, 1,2, 3 e 4 %, 3 a 5 min em cada diluição. Os poços são enxaguados e 42 ΕΡ2212349Β1 armazenadas no PBS até contagem. Todas as células que apresentam crescimento de neuritos e foram até o fundo da câmara são contadas como células migrantes.

Resultados

Mais células migram nas placas tratadas com análogo de NRP que migraram em placas sem análogo de NRP. Análogos de NRP podem induzir a migração de células neuronais, e que cada um deles pode ser usado para tratar neurodegeneração associada à lesão ou doença neural.

Exemplo 10: Migração mediada por análogo de NRP em Condições de lesões

Um análogo de NRP é testado para de actividade indução de migração/quimioatractiva em células estaminais neurais de ratinho em um ensaio de migração haptotáctica em condições de lesão conforme descrito abaixo. Métodos

Produção de uma monocamada de astrócitos

Ratos PI (dia pós-natal 1) Wistar ou Sprague Dawley são sacrificados por decapitação. Os hemisférios corticais são removidas e colhidos em tubos separados contendo 4 ml de DMEM - 1 córtex por tubo. 0 tecido é mecanicamente triturado. As células são transferidas ao meio utilizando uma pipeta esterilizada e filtradas através de um filtro celular 100 um em um tubo de centrífuga de 50 ml. Cada tubo é abastecido até 50 ml com DMEM. Os tubos foram centrifugados durante 5 minutos em 350 x g a 22°C. As células são ressuspensas em 40 ml de meio DMEM + 10 % de FBS. As células são então semeadas em uma placa de 12 poços 43 ΕΡ2212349Β1 + 5 nM de ácido ocadaico (para remover neurônios por induzir morte celular por apoptose) e incubadas a 37°C/ 10 % de C02 durante 24 horas em uma câmara Boyden. 0 meio + FBS é substituído depois de 1 dia com DMEM + 10% de FBS. O crescimento celular é monitorizado até confluência (14-18 dias).

Lesão mecânica e farmacológica A indução de lesões na monocamada astrocitária é feita usando-se o agente farmacológico factor de transformação de crescimento βΐ (TGFpi) e em simultâneo raspagem mecânica da monocamada, com a finalidade de ativar os astrócitos. 10 ng/ml de TGFpi é administrado à monocamada astrocitária durante 24 horas. Além disso, as culturas de astrócitos são mecanicamente novamente lesionadas por um bisturi (uma raspagem em todo o fundo do poço).

Semeadura de células estaminais Pré-marcadas Células estaminais neurais embrionárias de ratinho marcadas com diacetato de fluoresceína indiferenciadas (NSCs) são semeadas em inserções revestidas com poli-D-lisina (PDL - 5 mg/ml). O compartimento inferior da câmara de Boyden recebe 100 fM de um análogo de NRP.

Fixação celular

As inserções são descartados e os poços fixados em diluições sucessivas de PFA (0,4, 1,2, 3 e 4 %) durante 3-5 min. em cada diluição. Os poços são enxaguados e armazenados em diluições sucessivas de PFA (0,4, 1,2, 3 e 4 %, 3 a 5 min em cada diluição. Os poços são enxaguados e armazenadas no PBS até contagem. Todas as células gue apresentam crescimento de neuritos e foram para o fundo da 44 ΕΡ2212349Β1 câmara são contadas como células migrantes.

Análise 0 número de células estaminais que migraram de células marcadas novamente analisados após 24 horas por um sistema informatizado de obtenção de imagens baseado em fluorescência (Discovery-1).

Resultados

Os análogos de NRP estimulam mais células estaminais para migrar que os controlos tratados com veiculo. Conclui-se que os análogos de NRP induzem a migração de células estaminais neuronais, e que os análogos de NRP podem ser úteis para tratar neurodegeneração associada à lesão ou doença neural.

Referências [1] Schaumburg H, Kaplan J, Windebank A, Vick N, Rasmus S, Pleasure D, Brown MJ (1983) Sensory neuropathy from pyridoxine abuse. A new megavitamin syndrome. N. Engl. J. Med. 309: 445-448.

[2] Krinke G, Naylor DC, Skorpil V (1985) Pyridoxine megavitaminosis: an analysis of the early changes induced with massive doses of vitamin B6 in rat primary sensory neurons. J Neuropathol. Exp. Neurol. 44: 117-129.

[3] Windebank AJ, Low PA, Blexrud MD, Schmelzer JD, Schaumburg HH (1985) Pyridoxine neuropathy in rats: specific degeneration of sensory axons. Neurology 35: 1617-1622 . 45 ΕΡ2212349Β1 [4] Albin RL, Albers JW, Greenberg HS, Townsend JB, Lynn RB, Burke Jr. JM, Alessi AG (1987) Acute sensory neuropathy-neuronopathy from pyridoxine overdose. Neurology 37: 1729-1732.

[5] Dalton K, Dalton MJ (1987) Characteristics of pyridoxine overdose neuropathy syndrome. Act Neurol. Scand. 76: 8-11.

[6] Xu Y, Sladky JT, Brown MJ (1989) Dose-dependent expression of neuropathy after experimental pyridoxine intoxication. Neurology 39: 1077-1083.

[7] Perry TA, Weerasuriya A, Mouton PR, Holloway HW, Greig NH (2004) Pyridoxine-induced toxicity in rats: a stereological quantification of the sensory neuropathy. Exp Neurol. 190: 133-144.

[8] Helgren ME, Cliffer KD, Torrento K, Cavnor C, Curtis R, Distefano PS, Wiegand SJ, Lindsay RM (1997) Neuro-trophin-3 administration attenuates déficits of pyridoxine-induced large-fiber sensory neuropathy. J. Neurosci. 17: 372-382.

[9] Callizot N, Warter J-M, Poindron P (2001) Pyridoxine-induced neuropathy in rats: a sensory neuropathy that responds to 4-methylcatechol. Neurobiol. Dis. 8: 626-635.

[10] Perry TA, Holloway HW, Weerasuriya A, Mouton PR, Duffy K, Mattinson JA, Greig NH (2007) Evidence of GLP-l-mediated neuroprotection in an animal model of pyridoxine-induced peripheral sensory neuropathy. Exp. Neurology 203:.293-303.

[11] Jakobsen J, Lundbaek K. (1976) Neuropathy in experimental diabetes: an animal model. Br. Med. J. 2: 278-279 46 ΕΡ2212349Β1 [12] Bell RH, Hye RJ (1983) Animal models of diabetes mellitus: physiology and pathology. J. Surg. Res. 35: 433-460 .

[13] Mattingly GE, Fischer VW. (1983) Peripheral neuropathy following prolonged exposure to streptozotocin-induced diabetes in rats: a teased nerve fiber study. Acta Neuropathol. 59: 133-138.

[14] Szkudelski T (2001) The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas. Physlol. Res. 50: 536-546.

[15] Schmeichel AM, Schmelzer JD, Low PA (2003) Oxidative injury and apoptosis of dorsal root ganglion neurons in chronic experimental diabetic neuropathy. Diabetes 52: 165-171.

[16] Tomlinson DR, Gardiner NJ (2008) Glucose neurotoxicity. Nature Neurosci. Rev. 9:36-45.

[17] Wuarin-Bierman L, Zahnd GR, Kaufmann F, Burcklen L, Adler J. (1987) Hyperalgesia in spontaneous and experimental animal models of diabetic neuropathy. Diabetologia. 30: 653-658.

[18] Courteix C, Eschalier A, Lavarenne J. (1993) Streptozocin-induced diabetic rats: behavioural evidence for a model of chronic pain. Pain. 53: 81-88.

[19] Dyck PJ, Giannini C. (1996) Pathologic alterations in the diabetic neuropathies of humans: a review. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55: 1181-1193.

[20] Yagihashi S, Yamagishi S-I, Wada R. (2007) Pathology 47 ΕΡ2212349Β1 and pathogenic mechanisms of diabetic neuropathy: correlation with clinicai signs,and symptoms. Diab. Res. Clin. Prac. 77S: S184-S189.

[21] Chong MS, Hester J (2007) Diabetic painful neuropathy.

Current and future treatment options. Drugs 67: 569-585.

[22] Quasthoff S, Hartung HP (2002) Chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J. Neurol. 249: 9-17.

[23] Windebank AJ, Grisold W. (2008) Chemotherapy-induced neuropathy. J. Peripher. Nerv. Syst. 13: 27-46.

[24] Gregg RW, Molepo JM, Monpetit VJ, Mikael NZ, Redmond D, Gadia M, Stewert DJ. (1992) Cisplatin neurotoxicity: the relationship between dosage, time, and platinum concentration in neurologic tissues, and morphologic evidence of toxicity. J. Clin. Oncol. 10: 795-803.

Os compostos e as composições desta invenção de acordo com as reivindicações têm utilidade industrial em muitos aspectos do comércio, incluindo fabrico, formulação, e venda farmacêutica. Os compostos e as composições desta invenção de acordo com as reivindicações tem utilidade industrial em campos médicos de neurologia, e em particular, para o tratamento de distúrbios neurológicos em animais e seres humanos.

LISTA DE SEQUÊNCIA <110> Neuren Pharmaceuticals Limited Neuren Pharmaceuticals Inc. Inventor (1) Paul William Richard Harris Inventor (2) Margaret Anne Brimble Inventor (3) Frank Sieg

<120> ANÁLOGOS SINTÉTICOS DE PÉPTIDOS DE REGENERAÇÃO NEURAL 48 ΕΡ2212349Β1 <130> NEUN-010 91WOO <140> <141> 2008-10-17 <150> 60/999,292 <151> 2007-10-17 < 15 0 > 60/999,503 <153> 2007-10-18 < 16 0 > 13 <17 0> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> HUMANO <22 0> <221> MOD RES <222> (11) <223> AMIDAÇÃO <4 0 0> 1 Gly Arg Arg Ala Ala Pro Gly Arg Ala Oly Gly 1 -5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> HUMANO <4 0 0> 2 49 ΕΡ2212349Β1

Ala Pro Gly Arg 1 5 <2 10> 3 <2 11> 4 <2 12> PRT <2 13> HUMANO <4 Λ O O 3

Arg Ala Gly Gly 1 s <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <22 0> <221> MOD RES <222> (11) <223> AMIDAÇÃO <4 0 0> 4

Gly Arg Arg Ala Aib Pro Gly Arg Alã Gly Gly 15 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <22 0> <221> M0D_RES <222> (11) <223> AMIDAÇÃO <4 0 0> 5 50 ΕΡ2212349Β1

Gly Arg Arg Ala Ala Pro Oly Arg Aib Gly Gly 1. 5 10 <210> 6 <211> 11

<212> PRT

<213> SINTÉTICO <400> 6

Gly . Arg.Árg Ala Ala Pro Gly Arg Ala Asn Gly i: s ío <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICO <22 0> <221> M0D_RES <222> (11) <223> AMIDAÇÃO <22 0> <221> MOD RES' <222> (D <223> ACETILAÇÃO <400> 7

Arg Arg Ala Ala Pro Gly Arg Ala Oly Gly 1 S 10

<210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO 51 ΕΡ2212349Β1 <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Arg <4Ο0> 8

Gly. Arg Αβρ Arg Ala Ala Pro Gly Arg Ala Gly Gly 1 S 10 <210> 9 <211> 13

<212> PRT

<213> SINTÉTICO <22 0> <221> MOD_RES <222> (1)..(13)

<223> DISSULFURETO <400> 9

Cyó Gly Arg Arg Ala Ala Pro Gly Arg Ala Gly Gly Cya 1 5 10

<210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <220> <221> MOD_RES <222> (1)...(11)

<223> DISSULFURETO <4 0 0> 10 52 ΕΡ2212349Β1

Cys Arg Arg *1® Ala Pro Gly Arg Ala Gly cye 1 5 lo <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <22 0> <221> M0D_RES <222> (13) <223> AMIDAÇÃO <4 0 0> 11

Gly Arg Arg Ala Ala Pro Gly Arg Ala Gly Gly 1 S io <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> SINTÉTICO <22 0> <221> MOD RES <222> (13) <223> AMIDAÇÃO <4 0 0> 12 1 5 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> MYCOBACTERIUM TUBÉRCULOSIS <400> 13

Arg Glu Gly Arg Arg Aap Ala Pro Gly Arg Ala Gly Gly 53 ΕΡ2212349Β1

Met Glu Vai Gly Trp Tyr Arg Ser Pro phe Ser Arg Vai Vai 15 10

His Leu Tyr Arg Gin Gly Lys 15 20 54 ΕΡ2212349Β1

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP nao assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição • US 10225838 B [0002] • US 10976699 B [0002] • US 02026782 W [0002] • US 2004036203 W [0002] • US 2006017534 W [0002] • WO 2006121926 A [0002] • US 2006026994 W [0002] • EP 0324659 A2 [0031] • US 3773919 A [0058] • EP 58481 A [0058] • EP 133988 A [0058] • DE 3218121 [0058] • EP 52322 A, Hwang [0058] • EP 36676 A [0058] • EP 88046 A [0058] • EP 143949 A [0058] • EP 142641 A [0058] • JP 58118008 A [0058] • US 4485045 A [0058] • US 4544545 A [0058] • EP 102324 A [0058] • WO 9532003 A [0059] • US 976699 A [0091] 55 ΕΡ2212349Β1

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição: • FIESER ; FIESER'S. Reagents for Organic Synthesis. John Wiley and Sons, 1991, vol. 1-17 [0026] • 1-5. Rodd's Chemistry of Carbon Compounds. Elsevier Science Publishers, 1989 [0026] • Organic Reactions. John Wiley and Sons, 1991, vol. 1-40 [0026] • MARCH J. Advanced Organic Chemistry. John Wiley and Sons, 1992 [0026] • LAROCK. Comprehensive Organic Transformations. VCH Publishers, 1989 [0026] • DEGA-SZAFRAN Z ; PRYZBYLAK R. ; SYNTHESIS, IR ; NMR. studies of zwitterionic oí-(1-pyrrolid- ine)alkanocarboxylic acids and their N-methyl derivatives. J. Mol. Struct., 1997, vol. 436-7, 107- 121 [0026] • Synthesis of Peptides and Peptidomimetics. Methods of organic chemistry (Houben-Weyl. Georg Thieme Verlag, 2004 [0027] [0055] • MCOMIE JFW. Protective Groups in Organic Chemistry.

Plenum Press, New York, 1973 [0028] • Synthetic Peptides A User's Guide. Oxford University Press, 2002 [0030] • Fmoc Solid Phase Synthesis A Practical Approach.

Oxford University Press, 2000 [0030] • BODANSZKY et al. Peptide Synthesis. John Wiley and

Sons, 1976 [0031] • H. D. JAKUBKE. The Peptides, Analysis, Synthesis,

Biology. Academic Press, 1987, 103-165 [0031] • J. D. GLASS. THE PEPTIDES, ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. 167-184 [0031] • SCHAUMBERG et al. New Eng. J. Medicine, 1983, vol. 309, 445-448 [0041] 56 ΕΡ2212349Β1 • XU et al. Neurology, 1989, vol. 39, 1077-1083 [0042] • MERRIFIELD et al. J. Am. Chem. Soc., 1963, vol. 15, 2149-2154 [0055] • Solid Phase Peptide Synthesis. FIELDS ; COLOW-ICK. Methods in Enzymology. Academic Press, 1997, vol. 289 [0055] • S CHAUMBURG H ; KAPLAN J ; WINDEBANK A ; VICK N ; RASMUS S ; PLEASURE D ; BROWN MJ. Sensory neuropathy from pyridoxine abuse. A new megavitamin syndrome. N. Engl. J. Med., 1983, vol. 309, 445-448 [0129] • KRINKE G ; NAYLOR DC ; SKORPIL V. Pyridoxine megavitaminosis: an analysis of the early changes induced with massive doses of vitamin B6 in rat primary sensory neurons. J Neuropathol. Exp. Neurol., 1985, vol. 44, 117-129 [0129] • WINDEBANK AJ ; LOW PA ; BLEXRUD MD ; SCHMELZER JD ; SCHAUMBURG HH. Pyridoxine neuropathy in rats: specific degeneration of sensory axons. Neurology, vol. 35, 1617-1622 [0129] • ALBIN RL ; ALBERS JW ; GREENBERG HS ; TOWNSEND JB ; LYNN RB ; BURKE JR. JM ; ALESSI AG. Acute sensory neuropathy-neuronopa-thy from pyridoxine overdose. Neurology, 1987, vol. 37, 1729-1732 [0129] • DALTON K ; DALTON MJ. Characteristics of pyri-doxine overdose neuropathy syndrome. Act Neurol. Scand., 1987, vol. 76, 8-11 [0129] • XU Y ; SLADKY JT ; BROWN MJ. Dose-dependent expression of neuropathy after experimental pyridox-ine intoxication. Neurology, 1989, vol. 39, 1077-1083 [0129] • PERRY TA ; WEERASURIYA A ; MOUTON PR ; HOLLOWAY HW ; GREIG NH. Pyridoxine-induced toxicity in rats: a stereological quantification of the sensory neuropathy. Exp Neurol., 2004, vol. 190, 133-144 [0129] 57 ΕΡ2212349Β1 • HELGREN ΜΕ ; CLIFFER KD ; TORRENTO K ; CAVNOR C ; CURTIS R ; DISTEFANO PS ; WIE-GAND SJ ; LINDSAY RM.

Neurotrophin-3 administration attenuates déficits of pyridoxine-induced large-fiber sensory neuropathy. J. Neurosci., 1997, vol. 17, 372-382 [0129] • CALLIZOT N ; WARTER J-M ; POINDRON P. Pyri-doxine- induced neuropathy in rats: a sensory neuropathy that responds to 4-methylcatechol. Neuro-biol. Dis., 2001, vol. 8, 626-635 [0129] • PERRY TA ; HOLLOWAY HW ; WEERASURIYA A ; MOUTON PR ; DUFFY K ; MATTINSON JA ; GREIG NH. Evidence of GLP-1-mediated neuropro-tection in an animal model of pyridoxine-induced peripheral sensory neuropathy. Exp. Neurology, 2007, vol. 203, 293-303 [0129] • JAKOBSEN J ; LUNDB£K K. Neuropathy in experimental diabetes: an animal model. Br. Med. J., 1976, vol. 2, 278-279 [0129] • BELL RH ; HYE RJ. Animal models of diabetes mel-litus: physiology and pathology. J. Surg. Res., 1983, vol. 35, 433-460 [0129] • MATTINGLY GE ; FISCHER VW. Periphe ral neuropathy following prolonged exposure to streptozotoc-in-induced diabetes in rats: a teased nerve fiber study. Acta Neuropathol., 1983, vol. 59, 133-138 [0129] • SZKUDELSKI T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas. Physlol. Res., 2001, vol. 50, 536-546 [0129] • SCHMEICHEL AM ; SCHMELZER JD ; LOW PA. Oxidative injury and apoptosis of dorsal root ganglion neurons in chronic experimental diabetic neuropathy. Diabetes, 2003, vol. 52, 165-171 [0129] • TOMLINSON DR ; GARDINER NJ. Glucose neuro-toxicity. Nature Neurosci. Rev., 2008, vol. 9, 36-45 [0129] • WUARIN-BIERMAN L ; ZAHND GR ; KAUFMANN F ; BURCKLEN L ; ADLER J. Hyperalgesia in spontaneous and 58 ΕΡ2212349Β1 experimental animal models of diabetic neuropathy. Diabetologia, 1987, vol. 30, 653-658 [0129] • COURTEIX C ; ESCHALIER A ; LAVARENNE J.Streptozocin- induced diabetic rats: : behavioural evidence for a model of [0129] chronic pain . Pain, 1993, vol. 53, 81-88 • DYCK PJ ; GIANNINI C. Pathologic alterations in the diabetic neuropathies of humans: a review. J. Neu- ropathol. Exp. Neurol ., 1996, vol. 55, 1181-1193 [0129] • YAGIHASHI S ; YAMAGISHI S-I ; WADA R. Pathology and pathogenic mechanisms of diabetic neuropathy: correlation with clinicai signs,and symptoms. Di-ab. Res. Clin. Prac., 2007, vol. 77, S184-S189 [0129] • CHONG MS ; HESTER J. Diabetic painful neuropathy. Current and future treatment options. Drugs, 2007, vol. 67, 569-585 [0129] • QUASTHOFF S ; HARTUNG HP. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J. Neurol., 2002, vol. 249, 9- 17 [0129] • WINDEBANK AJ ; GRISOLD W. Chemotherapy-induced neuropathy. J. Peripher. Nerv. Syst., 2008, vol. 13, 27-46 [0129] • GREGG RW ; MOLEPO JM ; MONPETIT VJ ; MI-KAEL NZ ; REDMOND D ; GADIA M ; STEWERT DJ. Cisplatin neurotoxicity: the relationship between dosage, time, and platinum concentration in neurologic tissues, and morphologic evidence of toxicity. J. Clin. Oncol, 1992, vol. 10, 795-803 [0129]

Lisboa, 31 de Outubro de 2013 59

Claims (7)

1. ΕΡ2212349Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de péptido de regeneração neural sintético (NRP) que compreende um domínio de péptido modificado APGR e/ou um domínio de péptido modificado RAGG, em que o composto de NRP é seleccionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID N0:5 e SEQ ID NO:6.
2. 2. 0 composto de NRP sintético de acordo com a reivindicação 1 que consiste em SEQ ID NO:5.
3. 3. 0 composto de NRP sintético de acordo com a reivindicação 1 que consiste em SEQ ID NO:4.
4. 4. Uma composição farmacêutica que compreende o composto de NRP sintético de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
5. 5. 0 composto de NRP sintético de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4 para utilização em terapêutica.
6. 6. 0 composto de NRP sintético de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4 para utilização num método de tratamento de um distúrbio neurológico num mamífero que compreende administrar ao mamífero uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição farmacêutica ou composto de NRP sintético.
7. 7. 0 composto de NRP sintético ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6 onde o distúrbio neurológico é esclerose lateral amiotrófica, lesão por 1 ΕΡ2212349Β1 ΕΡ2212349Β1 neurotoxin neuropatia traumática coronário, a, lesão oxidativa, esclerose múltipla, periférica, hipoxia/ isquemia, lesão cerebral , ou cirurgia de enxerto de bypass arterial preferentemente neuropatia periférica diabética. Lisboa, 31 de Outubro de 2013 2