CN106061495B - 肺内炎症的减弱 - Google Patents

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Abstract

一种氨基酸序列为式X1‑GQRETPEGAEAKPWY‑X2的环化化合物，其中X1包括1至4元，尤其1至3元氨基酸(序列)，所述氨基酸(序列)包括天然或非天然氨基酸，尤其是选自氨基酸(序列)C、KSP、K、鸟氨酸、4‑氨基丁酸、β‑丙氨酸，且X2包括一种选自天然氨基酸的氨基酸，特别是选自C、D、G和E的组，其中X1在其左侧第一位包括N‑末端氨基酸且X2在其右侧最后一位包括C‑末端氨基酸，任选地在炎症治疗中使用的盐形式，一种用于治疗炎症的药物组合物包括这种化合物，和一种用于治疗炎症的方法包括给予需要它的哺乳动物有效量的该化合物。

Description

肺内炎症的减弱
本发明涉及通过特定化合物的给药减弱肺内炎症。
脓毒症是由严重感染引起的潜在的致命全身性炎症。甚至在引起脓毒症的感染消失后，脓毒症还能延续。严重的脓毒症可能会导致器官功能障碍，包括肺功能障碍。(Levy,Mitchell M.；Fink,Mitchell P.；Marshall,John C.；Abraham,Edward；Angus,Derek；Cook,Deborah；Cohen,Jonathan；Opal,Steven M.；Vincent,Jean-Louis；Ramsay,Graham(2003).“2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis DefinitionsConference”.Critical Care Medicine 31(4):1250–6.)
脓毒症是由免疫系统对严重感染，最常见地在血液、泌尿道、肺、皮肤或其他组织中的细菌，但也有真菌、病毒和寄生虫反应引起的。可以认为脓毒症落入从感染到多器官功能障碍综合征的连续体范围内。(Annane D,Bellissant E,Cavaillon JM(2005).“Septicshock”.Lancet 365(9453):63–78.)
脓毒症的常见症状包括与特定的感染有关的症状，但通常伴有高烧、热、潮红的皮肤、心率升高、呼吸亢进、精神状态改变、浮肿及低血压。
脓毒症通常使用静脉输液和抗生素来治疗。如果补液不足以维持血压，可以使用血管加压药。可能需要机械通气和透析以分别支持肺和肾的功能。皮质甾类的使用是有争议的。已经发现最初上市为治疗严重脓毒症的活化的替加色罗α(活化的重组蛋白C)并没有帮助，且最近已退出市场。
脓毒症和肺部炎症可通过肺液中炎症标记和调控代谢物(炎症性细胞因子)，例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、免疫细胞和肺泡巨噬细胞的积聚程度来确定。
在全身菌血症中脂多糖(LPS)以革兰氏阴性细菌的糖脂形式出现，可以引发免疫反应到出现脓毒性休克和心脏循环衰竭的地步。LPS的全身效应包括血液动力退化，同时伴有肺动脉压增高和急性白细胞减少。
目前令人惊奇地发现，在全身性脓毒症或炎症反应的条件下，某些肽具有活性。在主要全身性脓毒症模型中重复吸入某些肽导致炎性细胞因子(IL-6，TNF-α)和酶(COX-2)的明显较低的肺内表达。还令人惊讶地发现，尽管由LPS输注诱导了全身性炎症反应，这类肽的重复应用减弱了肺内炎症。
本发明的一个方面提供了用于治疗炎症的氨基酸序列为式I的环化化合物，
X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2 I
(SEQ ID NO：9)其中
X1包括1至4元，尤其1至3元氨基酸(序列)，所述氨基酸(序列)包含天然或非天然氨基酸，尤其选自氨基酸(序列)C、KSP、K、鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸，
X2包括选自天然氨基酸，尤其选自C、D、G和E组中的一种氨基酸，
其中
X1在其左侧第一位包括N-末端氨基酸且X2在其右侧最后一位包括C-末端氨基酸。
本文中用于在炎症中使用的式I的环化化合物时也称为“(根据)本发明的化合物”。本文中式I的环化化合物在炎症中使用也被称为“(根据)本发明的使用”。
在本发明的化合物中，环化通过X1的氨基酸之一，优选地X1的末端氨基酸的反应性化学基团和X2的氨基酸的反应性化学基团反应，例如通过C-末端氨基酸和N-末端氨基酸的反应性基团反应来实现。
在本文中，根据本发明“炎症”包括肺内炎症、脓毒症、全身性和器官炎症。
在一个优选的方面，本发明提供了用于治疗肺内炎症的本发明的使用，在另一方面用于治疗脓毒症的本发明的使用，在其他方面用于治疗全身性炎症的本发明的使用以及在另一个方面用于治疗器官炎症的本发明的使用。
在本文中，治疗包括治疗和预防。
在本发明的方法中，氨基酸序列中所用的天然氨基酸是公知的，并且包括例如G、A、V、L、I、M、P、F、W S、T、N、Q、C、U、Y、D、E、H、K、R。
在本发明的方法中，氨基酸序列中所用的非天然氨基酸包括
-具有天然氨基酸的主要结构但非α氨基酸的氨基酸；
-D-型天然氨基酸，即非L-型天然氨基酸，即其中烷基不是L-构型，而是D-构型的天然氨基酸；
-非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括2至12个(如2至6个)碳原子，至少一个氨基(例如一个或两个)以及至少一个羧基(例如一个或两个)，例如任选地除也在天然氨基酸中存在的取代基之外，诸如例如OH、-CONH2、-NH-C(＝NH2)NH2、SH、(C1-4)烷基-S-、苯基、杂环基，例如包括5或6个环分子且包括选自N、O、S，优选N，例如一个或两个N的至少一个杂原子的杂环基，任选地与另一个环(如苯基)稠合，诸如苯，例如包括脯氨酰基、吲哚基、咪唑基；
在一个具体的方面，在本发明的方法中，氨基酸序列中的非天然氨基酸包括Ortithin、4-氨基丁酸、β-丙氨酸、7-氨基庚酸、6-氨基己酸。
在另一方面，氨基酸序列为式I的环状化合物包括
-序列SEQ ID NO：1
环(CGQRETPEGAEAKPWYC)
其中两个末端半胱氨酸残基形成二硫桥；
-序列SEQ ID NO：2
环(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)
其中在连接到N-末端赖氨酸残基的ε-碳原子上的氨基和连接到C-末端谷氨酸残基的γ-碳上的侧链羧基之间形成酰胺键；
-序列SEQ ID NO：3
环(KGQRETPEGAEAKPWYG)
其中在连接到N-末端赖氨酸残基的侧链的ε-碳原子上的氨基和C-末端甘氨酸残基的羧基之间形成酰胺键；
-序列SEQ ID NO：4
环(鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG)
其中在连接到N-末端鸟氨酸残基的侧链的δ-碳上的氨基和C-末端甘氨酸残基的羧基之间形成酰胺键；
-序列SEQ ID NO：5
环(4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD)
其中在N-末端4-氨基丁酸残基的氨基和连接到C-末端天冬氨酸残基的β-碳上的侧链羧基之间形成酰胺键；
-序列SEQ ID NO：6
环(β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE)
其中在N-末端β-丙氨酸(3-氨基丙酸)残基的氨基和连接到C-末端谷氨酸残基的γ-碳上的侧链羧基之间形成酰胺键；
-序列SEQ ID NO：7
{[7-氨基庚酸-GQRETPEGAEAKPWY](环1-16)}，
氨基酸从C-末端氨基酸酪氨酸肽连接到N-末端氨基酸甘氨酸，然而，一方面通过N-末端甘氨酸的氨基上的氮和7-氨基-庚酸的羧基上的碳C1之间的酰胺键，另一方面通过7-氨基庚酸的氨基的氮和C-末端酪氨酸的羧基的碳之间的酰胺键，C-末端氨基酸酪氨酸连接到N-末端氨基酸甘氨酸上，使得该化合物既没有N-末端氨基，也没有C-末端羧基，和
-SEQ ID NO：8
{[6-氨基己酸-GQRETPEGAEAKPWYG](环1-17)}，
氨基酸从C-末端氨基酸甘氨酸肽连接到N-末端氨基酸甘氨酸，然而，一方面通过N-末端甘氨酸的氨基的氮和6-氨基己酸的羧基的碳C1之间的酰胺键，另一方面通过6-氨基己酸的氨基上的氮和C-末端甘氨酸的羧基上的碳之间的酰胺键，C-末端氨基酸甘氨酸连接到N-末端氨基酸甘氨酸，使得该化合物既没有N-末端氨基，也没有C-末端羧基。
本发明优选的化合物是式I为氨基酸序列SEQ ID NO：5的环化化合物，即环(4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD)，其中在N-末端4-氨基丁酸残基的氨基和连接到C-末端天冬氨酸残基的β-碳上的侧链羧基之间形成酰胺键；
本发明的化合物包括化合物的任何形式，例如游离形式和盐形式，例如在生物环境中本发明的环化化合物通常是盐形式的。
在本发明的另一方面是提供了盐形式的式I化合物。
此类盐优选地包括可药用的盐，但是例如为了制备/分离/纯化为目的，也包括不可药用的盐。
在生物环境中，本发明的环状化合物的盐通常是盐酸盐。
游离态的本发明的环状化合物可被转化为盐形式的相应的化合物；反之亦然。
本发明的化合物可以以异构体及其混合物的形式存在；例如光学异构体。本发明的化合物可以例如包含不对称碳原子，因此可以以对映异构体或非对映异构体及它们的混合物的形式存在，例如外消旋体。针对本发明化合物中该不对称碳原子上的每个取代基，本发明的化合物可以以(R)-、(S)-或(R，S)-构型存在，优选地以(R)-或(S)-构型存在。例如根据例如类似地根据常规方法，可以适当地分离异构体混合物以得到纯异构体。本发明包括任何异构体形式及任何异构混合物的本发明化合物。在天然氨基酸的情况下，取代基的构型与天然氨基酸中的构型相同。
可以视情况制备本发明的化合物，例如根据例如类似地根据常规方法，例如或者如本文所说明的，例如通过固相肽合成来制备，任选地根据在2-氯代三苯甲基氯树脂上的芴甲氧羰基/叔丁基保护策略，使用适当偶联剂，如二异丙基碳二亚胺和/或N-羟基苯并三唑和适当的溶剂，例如N,N-二甲基甲酰胺。被保护的氨基酸可以从氨基酸C-末端开始连续结合至肽链。从芴甲氧羰基保护基团上脱保护可以利用碱，例如哌啶，如在适当溶剂如N,N-二甲基甲酰胺中20％哌啶来进行。可以视情况例如利用酸，如适当溶剂例如卤代烃如CH2Cl2中的乙酸，例如乙酸和CH2Cl2的1:1混合物，将受到完全地、可选择地(部分地)保护的肽从树脂上裂解下来。
在含半胱氨酸肽的情况下，当从树脂上裂解后，如果需要的话，可以利用例如强酸，如三氟乙酸(TFA)，例如95％TFA/5％H2O来进行侧链的脱保护。可以通过末端半胱氨酸残基的氧化来实现环化以获得二硫桥，例如通过粗线性肽在pH 8.5下暴露于空气下90小时可以实现。得到的粗肽产物可以例如通过色谱法，例如通过反相中压液相色谱(RP-MPLC)，在适当的色谱柱上，如RP-C18-硅胶柱上，常规地使用梯度洗脱液，如梯度为5％-40％乙腈来纯化。例如在色谱柱中如在Lewatit MP64柱(乙酸形式)中三氟乙酸盐反离子可以例如被乙酸盐替换。在水中经过最终洗涤后，可以将乙酸盐形式的纯化肽冻干并可以得到浅色的例如白色的粉末。
在半胱氨酸游离肽的情况下，可以视情况进行环化步骤，例如仍然在部分受保护的线性肽上，在从树脂中分裂之后。在使半胱氨酸游离肽选择性环化之后，如必要可以进行TFA中的侧链脱保护。例如通过色谱法，例如通过制备性的RP-MPLC，可以进行纯化步骤。从由此得到的肽，可以例如如上所述由乙酸盐置换三氟乙酸盐离子。也可以对乙酸盐形式的肽进行冻干，例如如对含半胱氨酸肽一样。
通过电喷雾电离质谱或MALDI-TOF-MS可以确定所得的肽的分子量。例如通过分析型高效液相色谱法可以确定纯度。
这种肽及其制备在例如WO 2011/085423中有描述。
本发明的化合物，例如包括式I化合物，显示出令人关注的药学活性，因此可用作药物。例如，如下所示的研究结果证明，当使用本发明的化合物时，炎症标记基因的肺内表达减弱。这些发现首次提供了在临床相关的体内肺损伤中的抗炎效果。
本发明的化合物可以以药物组合物的形式用作炎症治疗的药物。
另一方面，本发明提供了
用于炎症治疗的药物组合物，所述药物组合物包括本发明化合物
和
治疗炎症的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的本发明化合物。
对于使用本发明的化合物进行炎症治疗，当然，适宜剂量将取决于例如所用的本发明化合物的化学性质和药物动力学数据、个体受体，例如需要这种治疗的受试者的体重、年龄和个体情况、给药方式和被治疗的病症的性质和严重性。
然而，通常情况下，对较大哺乳动物，例如人类，要得到满意的结果，指导性的每日计量包括如下范围
-约0.0001克至约1.5克，如0.001克至1.5克；
-约0.001毫克/千克体重至约20毫克/千克体重，如0.01毫克/千克体重至20毫克/千克体重，
例如以多达每日四次分次给药。
通常，小孩可以接受成人剂量的一半。
本发明的化合物可以视情况给药。
本发明的化合物可以通过任何常规途径给药，例如肠内给药，例如包括鼻腔给药、口腔给药、直肠给药、口服给药；胃肠外给药，例如包括静脉注射、动脉输注、肌肉输注、心脏内输注、皮下输注、骨内输注、经皮肤给药(通过完好的皮肤的扩散)、经粘膜给药(通过粘膜扩散)、吸入给药，例如以气雾剂形式的口腔吸入；例如包衣或未包衣片剂形式、胶囊形式、(可注射的)溶液形式、固体溶液形式、悬浮液形式、分散剂形式、固体分散剂形式；例如安瓿瓶形式、小瓶形式，乳膏形式、凝胶形式、糊剂形式、吸入器粉末形式、泡沫形式、酊剂形式、唇膏形式、滴剂形式、喷雾剂形式或栓剂形式。
本发明的化合物可以是以可药用盐形式或以游离形式，任选地以溶剂化物的形式给药。盐和/或溶剂化物形式的本发明化合物显示出与游离形式的本发明化合物相同数量级的活性。
令人惊奇地发现，本发明的环化化合物的最佳给药方式是通过吸入给药。
优选地，本发明的化合物通过吸入给药，例如以气雾剂形式，重新溶解在水中的水溶液或本发明中化合物的冻干物经吸入。惊讶地发现本发明化合物的水溶液，例如氨基酸SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：9(之一)的水溶液，即使不添加通常使用的稳定剂和/或助剂，在相当长的时间内也是稳定的。同样也发现，吸入包括溶解的本发明化合物的用于吸入的汽化液滴的大小也具有有利的影响。例如，在优选的实施方案中，(大部分)雾化液滴的液滴大小都不超过5微米(上限)以获得特别成功的结果。液滴大小的合适的下限仅取决于液滴的可行性。
对于吸入给药，首先将本发明的环化化合物，例如氨基酸SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：9(之一)溶解在水中以获得水溶液，任选地将所得的溶液过滤以例如除去杂质。例如为了所期望的存储形式，任选地冻干所得到的滤液。令人惊奇的是，已发现由此得到的冻干的本发明化合物是长期稳定的。在相对湿度60％在2-8℃长达24个月和在25℃长达6个月后测定冻干物的稳定性。使用实验室常规分析方法，例如目测和反相HPLC。在2-8℃下储存24个月后，还通过膜片钳实验来测定死亡的生物活性。在上述条件下，冻干物结果是稳定的，外观没有发生变化，式I环状肽的含量和纯度只表现出很小的变化。生物活性也保持几乎没有变化。
本发明的化合物可以用于任何方法，可以如本文所述单独使用或与一种或多种，至少一种，其它，第二药物组合使用。
组合包括固定组合，其中本发明的化合物和至少一种第二药物在同一制剂中；试剂盒，其中在同一包装中提供在单独制剂中的本发明的化合物和至少一种第二药物，以及例如共同给药的说明书；和自由组合，其中本发明化合物和至少一种第二药物分开包装，但是给出了共同或连续给药的说明书。
与单独治疗相比，用根据本发明的组合进行治疗可以提供改进。
根据本发明的药物组合物可以根据例如类似地根据常规方法，例如通过混合、造粒、包衣、溶解或冻干方法制造。单位剂型可以含有例如约0.1mg至约1500mg，如1mg至约1000mg。
可以视情况为本发明的药物组合物提供如本文所述的包含本发明的组合的药物组合物和包含第二药物的药物组合物，例如根据，例如类似地根据常规的方法或如本文所述的方法。
术语“第二药物”是指化学治疗药物，特别是除本发明的化合物(如式I化合物)之外的任何化学治疗剂。
为了表征本发明化合物对炎症，如肺内炎症的作用，检测了脂多糖(LPS)诱导的脓毒症的猪模型。氨基酸序列SEQ ID NO.5的式I化合物作为活性化合物。
方法
根据动物保护委员会的批准((Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz,Koblenz,Germany；approval number 23 177-07/G 12-1-058)，随机地/研究者盲设地检测了18只幼年猪(体重25-27kg)。
麻醉和仪器
在以肌肉注射氯胺酮(8mg kg-1)和咪达唑仑(0.2mg kg-1)镇静和制备血管通路后，通过静脉注射异丙酚和芬太尼(8-12mg kg-1h-1/0.1-0.2mg h-1)诱导并保持麻醉。使用单剂量的阿曲库铵(0.5mg kg-1)以利于口腔气管插管。在压力控制模式下开始供氧(呼吸器：
Figure BDA0001104876400000071
CareFusion，美国)，使用8mL kg-1的一次呼吸量(Vt)，5cmH2O的呼气末正压(PEEP)，0.3-0.4的FiO2和可变呼吸速率以维持血碳酸正常。以10mL kg-1h-1速率持续输注平衡盐溶液(Sterofundin iso，B.Braun，德国)。按照Seldinger’s技术，在无菌条件下超声引导放置血管导管：动脉导管、脉搏波形心输出导管(PiCCO，Pulsion Medical Systems，德国)和中央静脉导管经由股静脉通路插入。通过右颈内静脉放置肺动脉导管的7.5-法国插管器。连续记录供氧和扩展的血流动力学参数(Datex S/5，GE Healthcare，德国)。通过直肠探针测量体温且通过身体表面保暖保持正常体温。
实验治疗方案
根据仪器基线参数对健康状态进行评估。图1总结了实验治疗方案：通过以100μgkg-1h-1持续地LPS输注(Escherichia coli serotype O111:B4,Sigma-Aldrich,瑞士)一小时诱导全身性炎症，随后整个实验采用10μg kg-1h-1。初始高剂量输注结合非保护性的供氧设置(Vt 25mL kg-1，零PEEP，FiO2 1.0)以添加VILI成分。随后，将供氧模式切换至更加保护肺的设置：Vt为8mL kg-1，PEEP为5cm H2O，FiO2为0.4-0.5，且呼吸速率维持pH>7.2。在脓毒症诱导后监测动物超过六小时。在诱导期，非参与者随机将动物分成两组并制备如前所述的肽溶液(Hartmann EK等，Acta anaesthesiologica Scandinavica 2013，57(3):334-341)用于盲式气管内吸入。
本研究中，研究了2组：
第(1)组动物，在0和3小时给予1mg kg-1氨基酸序列SEQ ID NO：5的式I化合物；
第(2)组动物，作为对照组(CTRL)，在0和3小时给予载体溶液。
为了保持血流动力学稳定(平均动脉压>60mmHg)，给予另外的流体(150ml平衡盐水或羟乙基淀粉，每小时一次)。通过持续中央静脉注射去甲肾上腺素来治疗持续不稳定性。在结束实验后，通过静脉注射异丙酚(200mg)和氯化钾(40mval)杀死深度全身麻醉中的动物。
血液参数
通过采用Rapidlab 248设备(Bayer Healthcare，德国)获得血气值。在基线期、诱导脓毒症以及三小时和六小时后对血液学指标进行采样。血浆乳酸水平、白细胞和血小板计数由美因兹约翰尼斯古腾堡大学医学中心检验医学研究所进行分析。通过定量酶联免疫吸附法根据制造商说明(Porcine IL-6 Quantikine ELISA，Porcine TNF-a QuantikineELISA，R&D Systems,德国)测定IL-6和TNF-α的血浆水平。
组织病理学和肺水含量评估
在胸廓切开术后将肺大块取出。如之前详细描述，对宏观肺损伤评分进行了评估(Lim CM等，Lung 2003，181(1)：23-34)。对肺表面的四个腹侧和背侧部分(每个上/下右，上/下左)的出血和充血进行检查(2分为>50％，1分为<50％，0分为没有或变化最小)。右肺被固定在10％缓冲福尔马林中。用石蜡包埋代表性的组织标本并切片用于苏木精和曙红染色。盲式研究者在资深病理学家的监督下进行组织病理学评估。在不同的肺区域中(非依赖性外周和支气管，依赖性外周和支气管)的形貌变化以七个标准评分(肺泡水肿、间质性水肿、出血、炎症性浸润、上皮损伤、微小肺不张和过度扩张)。每个参数的严重程度在0分(未出现)至5分(整个区域)之间。对于每一个肺部区域，我们采用了四个非重叠显微镜区域的平均值。在所有肺部的区域得分的总和增加了最大损伤评分，最大损伤评分为140分(来自4个肺部区域的7个参数×每个参数的5个最高分)。此外，在依赖性和非依赖性肺部区域中，对每个参数的区域分布进行了评估。类似的评分程序在之前描述过(Spieth PM等，Intensive Care Med 2007，33(2)：308-314；Wang HM等，Eur Surg Res 2010，45(3-4)：121-133)。左肺被取出后立即称重，随后在60℃下干燥72小时，以测定干湿重比(W/D)。
基因表达分析
为了确定促炎细胞因子的肺内炎症mRNA水平，对白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α和前列腺素酶G/H合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)进行定量。对双调蛋白和腱糖蛋白-c的表达水平进行检测，作为机械应力和重塑的替代。采集来自左肺的四个代表性样品(上/下肺叶，每个依赖性/非依赖性)，在液氮中快速冷冻并在-80℃下保存。如先前详细描述，进行RNA提取和通过实时聚合酶链式反应(Lightcycler480PCR系统，Roche Applied Science，德国)进行定量程序。将[17-19]mRNA表现数据针对作为对照基因的肽基脯氨酰异构酶A(PIIA)进行归一化。
统计分析
数据分别以箱行图的中位数和四分位差(IQR)来表示。采用Mann-Whitney-U-Test进行组间比较。如果进行了多次测试，P值由Bonferroni校正来调节。重复测量参数的组内时程由Friedman秩次方差分析(Friedman ANOVA on ranks)和Student-Newman-Keuls-Test后分析。P值低于0.05视为显著。仅以探索的方式对如表1中所列的生理数据(呼吸机和血液动力学数据)进行了分析。统计软件使用SigmaPlot 11.0(Systat公司，美国)。
表1中列出了呼吸机和血液动力学数据。数据以中位数(IQR)表示，没有相应的组间差异。Vt：一次呼吸量；Pendinsp：吸气末压力；PEEP：正向呼气末压力；RR：呼吸速率；FiO2：吸入氧浓度；I：E：吸气比呼气的商；Raw：呼吸道阻力；EVLW：血管外肺水含量；PaCO2：动脉血二氧化碳分压；MAP：平均动脉压；CO：心输出量；CVP：中央静脉压；MPAP：平均肺动脉压；NA：去甲肾上腺素剂量。
结果
生理数据
表1总结了血流动力学和呼吸参数的时间图。在脓毒症和供氧期间，动脉血氧分压和FiO2(PaO2/FiO2)的商没有降低。随后，两组的PaO2/FiO2和动态肺顺应性(Cdyn)在三小时内显著下降并持续不恢复(图2a和2b)。两组均未见显著差异。在基线和脓毒症/VILI诱导期间血流动力学稳定，而两组都需要持续超过六小时输注相似剂量的去甲肾上腺素。
全身和肺部炎症反应
LPS输注导致持续、持久的全身性白细胞减少。其伴随着血小板计数的下降和乳酸水平的上升。两组的IL-6和TNF-α的血浆水平都在三个小时内出现显著增加出现峰值(图3a、3b、3c和3d)。在吸入氨基酸SEQ ID NO：5的式I化合物后，肺内mRNA的定量产生显著降低的COX-2(p＝0.003)、TNF-α(p＝0.041)和IL-6(p＝0.043)的整体表达，而IL-1β和iNOS表达差异较小(图4a、4b、4c、4d和图5a、5b、5c、5d)。此外，检测到腱糖蛋白-c表达(p＝0.015)降低。未检测到相关的局部变化。
表1脓毒症症和供氧期间生理数据总结(供氧和血液动力数据)，特别是血液动力学和呼吸参数的时间图
Figure BDA0001104876400000101
病理学参数
尸体解剖的宏观和组织学评价得出两组中都存在持续的肺损伤。第(1)组动物显示出不太明显的损伤趋势以及较高的W/D比(图6a、6b、6c)。组织病理学评分最相关的特征是炎症性浸润以及起到次要作用的过度扩张区域和形成浮肿的肺不张的发展。如表2所列，对照动物组(2)的特征是更高程度的出血。没有检测到腹侧和背侧的相关差异。
组织病理学的肺损伤分布总结在图3中。肺区域(每个包含外周和支气管区域)的数据以中位数(IQR)来表示。*表示P<0.05相对于第(1)组。
表2显示了使用SEQ ID NO：5化合物治疗的动物和对照组(CTRL)动物的形成肺泡和间质性水肿出血、炎症性浸润、上皮破坏，微小肺不张和过度扩张的发展。
Figure BDA0001104876400000111
讨论
本研究研究了在LPS诱导肺损伤猪模型中吸入SEQ ID NO：5肽的影响，本研究的关键结果是在损伤后6小时SEQ ID NO：5肽显著降低了肺内炎症反应。
模型特征
在全身菌血症中LPS变成以革兰氏阴性细菌的糖脂存在，引起免疫反应到出现脓毒性休克和心脏循环衰竭的地步。LPS对猪的全身影响包括血液动力退化，同时伴有肺动脉压增高和急性白细胞减少(Matute-Bello G等,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol2008,295(3):L379-399)，这与本研究的发现一致。由于LPS输注导致的肺内变化包括白细胞和肺泡巨噬细胞的积聚以及内皮损伤(Wang HM等，Eur Surg Res 2008，40(4):305-316)。与其它模型相比(即支气管肺泡灌洗)，并没有产生由LPS诱导脓毒症引起的立即的肺不张和气体交换障碍。在计算机断层成像中，在猪体内LPS导致肺部形貌发生变化以及组织病理学的肺损伤在几个小时中发展(Otto CM等，J Appl Physiol 2008，104(5):1485-1494)。脓毒性休克和治疗顽固性血液动力学故障限制了在实验模型中最大的LPS输注剂量。本模型在尸体解剖分析中显示出显著的PaO2/FiO2和呼吸力学的恶化和肺损伤的迹象。
对炎症反应的影响
应答于LPS输注，TNF-α和IL-1β被释放进入体循环。在早期肺损伤中，肺泡巨噬细胞是炎症细胞因子的主要来源，炎症细胞因子通过例如增强嗜中性粒细胞的积聚来诱发炎症性反应。(Mittal N,Sanyal SN:Cycloxygenase inhibition enhances the effects ofsurfactant therapy in endotoxin-induced rat model of ARDS.Inflammation 2011,34(2):92-98.Matthay MA,Zemans RL:The acute respiratory distress syndrome:pathogenesis and treatment.Annu Rev Pathol 2011,6:147-163)。在本检测系统中，在脓毒症诱导后3小时内检测到具有峰值的高循环血浆水平的TNF-α和IL-6。数据表明早期的IL-6的高循环水平与死亡率增加有关，该数据支持了病理生理相关性。有趣的是，重复的SEQ ID NO：5肽的吸入显著地减弱了如TNF-α、IL-6和COX-2的关键炎症标记的肺部表达。对TNF-α和IL-6的血浆水平的影响较小。在本研究中，在肺组织中直接检测到了炎症标记基因。表达水平不依赖于肺中的定位，这可以归因于LPS输注的全身性特点。
腱糖蛋白-c是一种细胞外基质糖蛋白，尤其参与早期炎性阶段，且由炎症性细胞因子、肺重塑和纤维增生诱导。(Chiquet-Ehrismann R，Chiquet M：Tenascins:regulationand putative functions during pathological stress.The Journal of pathology2003,200(4):488-499。Snyder JC,Zemke AC,Stripp BR:Reparative capacity ofairway epithelium impacts deposition and remodeling of extracellularmatrix.American journal of respiratory cell and molecular biology2009,40(6):633-642.)。在第(1)组中腱糖蛋白-c明显较低，这表明吸入SEQ ID NO：5肽减轻了炎症相关的活性。
结论
在与肺损伤相关的全身性炎症反应的猪模型中，重复吸入SEQ ID NO：5肽显著地减弱了炎症标记基因的肺内表达。
本发明化合物的吸入代表了减弱炎症反应的新选择。在猪中吸入SEQ ID NO：5肽减轻了早期由脓毒症诱导的肺损伤中的关键炎症介质的肺内表达。
附图说明
图1示意地总结了测量肺部炎症的实验治疗方案和本发明化合物给药的影响。
图2a、2b示出了在脓毒症和供氧之后动脉血氧分压和FiO2的商(PaO2/FiO2)的降低(图2a)，以及在给予SEQ ID NO：5化合物(曲线1)和对照物(CRTL，曲线2)后3小时内动态肺顺应性(Cdyn)的降低，二者在3小时后都持续不恢复。
图3a至3d示出了在输注LPS后三小时内IL-6(图3a)和TNF-α(图3b)的血浆水平上升、乳酸水平上升(图3c)，血小板计数(图3d)下降。
图4a至5d示出了除了对照组给药(CTRL，所有图中的每个曲线2)之外，在吸入SEQID NO：5化合物(所有图中的每个曲线1)后IL-1β(图4a)、IL-6(图4b)、TNF-α(图4c)、COX-2(图5a)、双调蛋白(图5b)、INOS(图5c)和腱糖蛋白(图5d)的肺内mRNA定量表达。
图6a至6c示出了使用SEQ ID NO：5化合物(第1组)治疗的动物相对于对照治疗的动物(第2组)，关于其肺损伤的尸体解剖的宏观和组织学评价的结果(图6a为总体肺损伤，图6b为出血/充血评分，图6c为肺的湿/干重比)。
Figure IDA0001104876460000011
Figure IDA0001104876460000031
Figure IDA0001104876460000051

Claims (3)

1.氨基酸序列为式SEQ ID NO:5：环(4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD)的环化化合物或其盐在制备药物中的用途，所述药物用于通过反复吸入治疗脓毒症，
其中在N-末端4-氨基丁酸残基的氨基基团与连接到C-末端天冬氨酸残基的β-碳上的侧链羧基基团之间形成酰胺键。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述式SEQ ID NO:5的环化化合物为盐的形式。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述盐为盐酸盐。
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