ES2876404T3

ES2876404T3 - Liofilizado que contiene un péptido cíclico de fórmula X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2 para el tratamiento de edemas pulmonares

Info

Publication number: ES2876404T3
Application number: ES14718432T
Authority: ES
Inventors: Bernhard Fischer; Rudolf Lucas
Original assignee: Apeptico Forschung und Entwicklung GmbH
Current assignee: Apeptico Forschung und Entwicklung GmbH
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2034-04-18
Also published as: AU2014257678A1; US10711041B2; CN105188734A; CA2907693A1; CA2907693C; US20160083431A1; EA038363B1; EA201592019A1; IL242075B; EP2988768A1; WO2014173842A1; KR20160002813A; DK2988768T3; JP2016518376A; KR102217476B1; EP2988768B1; CN105188734B; JP6567502B2

Abstract

Péptido cíclico de fórmula X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2 I en la que X1 comprende un aminoácido (secuencia de aminoácidos), con de 1 a 4 miembros, que comprende aminoácidos naturales o no naturales, y X2 comprende un aminoácido natural, y en la que X1 contiene el aminoácido N-terminal a la izquierda en la posición 1, y X2 contiene el aminoácido C-terminal en la última posición derecha, para su uso como fármaco para el tratamiento de edemas pulmonares en forma de aerosol acuoso para inhalación sin aditivos ni estabilizadores, que puede obtenerse a partir de un liofilizado del péptido cíclico de fórmula I sin aditivos y/o estabilizadores.

Description

DESCRIPCIÓN

Liofilizado que contiene un péptido cíclico de fórmula X¹-GQRETPEGAEAKPWY-X²para el tratamiento de edemas pulmonares

La presente invención se refiere a un péptido cíclico de fórmula X¹-GQRETPEGAEAKPWY-X²para su uso como fármaco.

La acción de los productos farmacéuticos depende de manera muy esencial de cómo lleguen estos principios activos al cuerpo o el órgano que debe tratarse.

La manera habitual de administrar un medicamento es la administración parenteral. En este caso, se inyecta un medicamento a través de la piel, por ejemplo directamente en el torrente sanguíneo o en un músculo o directamente debajo de la piel.

Otra forma común de tomar medicamentos es la administración oral al tracto gastrointestinal. Los principios activos contenidos en los medicamentos se liberan en el tracto gastrointestinal y entonces llegan por medio de reabsorción al cuerpo, la sangre y los órganos.

Los medicamentos también pueden administrarse a través de la piel y la mucosa.

Como alternativa a la inyección, se han propuesto procedimientos para la inhalación oral de medicamentos. A este respecto, se entregan medicamentos tanto como polvo como en forma de gotitas a la cavidad bucal y la garganta, que luego llegan posiblemente a la cavidad pulmonar con el aire inhalado. Desde ahí, estos medicamentos se entregan a través del tejido pulmonar a la sangre y se suministran así sistémicamente al cuerpo.

Sin embargo, la inhalación oral de medicamentos sigue representando un problema técnico importante en la actualidad. En particular, los principios activos de alto peso molecular, tal como, por ejemplo, las proteínas, solo pueden aplicarse por medio de inhalación oral de manera muy limitada. Las proteínas como principios activos se dañan e inactivan físicamente por calor y presión debido a la operación de atomización o nebulización. Los principios activos proteicos destinados a la inhalación son muy inestables, tanto durante su almacenamiento antes como durante la inhalación oral. Además, tales principios activos peptídicos pueden degradarse por procesos de degradación fisiológica ya en el volumen de aire del pulmón.

Para contrarrestar esto, se han desarrollado las más diversas formulaciones farmacéuticas en tales preparaciones para la inhalación de proteínas. Así, tales preparaciones para la inhalación de proteínas pueden contener sales, tales como sales de calcio o de sodio, estabilizadores y tensioactivos, mezclas tampón específicas, aditivos lipídicos y otros para lograr las propiedades de disolución deseadas, para garantizar la estabilidad, para proteger la actividad de la proteína. Otros aditivos durante la producción de fármacos proteicos contienen, por ejemplo, albúmina, reactivos osmólicos, antioxidantes, sustancias químicas para evitar la agregación y precipitación, liposomas, gelatina, alginatos, azúcares, etc.

Los principios activos peptídicos y proteicos producidos y preparados farmacéuticamente de esta manera para inhalación llegan entonces intencionada o involuntariamente a través del tejido pulmonar a la sangre y pueden detectarse en la misma.

En total, actualmente solo existen dos medicamentos a base de proteínas/péptidos aprobados internacionalmente para inhalación, concretamente Pulmozyme® (desoxirribonucleasa) y Exubera® (insulina). Para garantizar la actividad y estabilidad de los preparados, estos contienen, por ejemplo, sales (cloruro de sodio, cloruro de calcio, o citrato de sodio, manitol, glicerina, hidróxido de sodio).

Una forma técnicamente común para la producción de formulaciones proteicas/peptídicas para la aplicación en medicina humana es la liofilización para la extracción de agua (por ejemplo, J Pharm Sci septiembre de 2009; 98(9):2886-908). Sin embargo, en estos procesos del estado de la técnica se añaden aditivos, tales como, por ejemplo, disacáridos, para garantiar la estabilidad y actividad de los péptidos (Allison SD et al, Arch Biochem Biophys. 15 de mayo de 1999; 365 (2):289-98). Además, ha demostrado su eficacia la unión de polietilenglicol (PEG) a péptidos y proteínas para, tras la deshidratación durante la liofilización, garantizar la actividad y estabilidad (Roberts et al, Adv Drug Deliv Rev. 17 de junio de 2002; 54(4):459-76 2002, Morris et al, Antimicrob Agents Chemother. junio de 2012; 56(6):3298-308 doi: 10.1128/AAC.0635-11), así como para impedir la degradación por procesos proteolíticos (Lee et al, Regul Pept. 8 de enero de 2009; 152(1-3):101-7 Baginski et al, Pharm Res. junio de 2012; 29 (6):1425-34), o para influir favorablemente en la masa molecular (Veronese y Pasut, Drug Discov Today. 1 de noviembre de 2005; 10(21)1451-8; Patton y Byron, Nat Rev Drug Discov. enero de 2007; 6(1):67-74).

Sorprendentemente, para ciertos péptidos que tienen una influencia positiva sobre la función del pulmón, se ha encontrado ahora una forma de aplicación sin aditivos que ha demostrado ser extremadamente adecuada.

En un aspecto, la presente invención pone a disposición un péptido cíclico de fórmula

X¹-GQRETPEGAEAKPWY-X²I

en la que

X¹comprende un aminoácido (secuencia de aminoácidos), con de 1 a 4 miembros, que comprende aminoácidos naturales o no naturales, y

X²comprende un aminoácido natural, y en la que

X¹contiene el aminoácido N-terminal a la izquierda en la posición 1, y X²contiene el aminoácido C-terminal en la última posición derecha,

para su uso como fármaco para el tratamiento de edemas pulmonares en forma de aerosol acuoso para inhalación sin aditivos ni estabilizadores, que puede obtenerse a partir de un liofilizado del péptido cíclico de fórmula I sin aditivos y/o estabilizadores.

Un liofilizado se denomina en el presente documento también “ liofilizado de la presente invencion (según la presente invención)”. Un péptido en un liofilizado según la presente invención también se denomina en el presente documento “péptido de la presente invención (según la presente invención)”.

En un liofilizado de la presente invención puede haber uno o varios péptidos cíclicos de fórmula I, habiendo preferiblemente solo un péptido de fórmula I.

Un compuesto cíclico de fórmula I es el compuesto ciclizado con la secuencia de aminoácidos

Xi-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-X²I,

en la que Xi y X²son tal como se definieron anteriormente.

El anillo en un compuesto de fórmula I puede estar configurado por el enlace entre dos sustituyentes adecuados en dos de los residuos de aminoácido del compuesto de fórmula I, por ejemplo por un enlace amida o un puente de disulfuro, comprendiendo el anillo preferiblemente al menos 15, más preferiblemente al menos 17, hasta 19 o 20, por ejemplo de 17 a 19 residuos de aminoácido, que están en un compuesto de fórmula I, como miembros de anillo. Preferiblemente, la formación del anillo está configurada por el enlace entre un sustituyente adecuado en un aminoácido en X¹, preferiblemente en el aminoácido en la posición 1 en X¹, con un sustituyente adecuado en X². Los aminoácidos naturales que pueden utilizarse en una secuencia de aminoácidos de fórmula I de la presente invención se conocen y comprenden, por ejemplo, G (Gly), A (Ala), V (Val), L (Leu), I (Ile), M (Met), P (Pro), F (Phe), W (Trp), S (Ser), T (Thr), N (Asn), Q (Gln), C (Cys), U (Sec), Y (Tyr), D (Asp), E (Glu), H (His), K (Lys), R (Arg). Los aminoácidos no naturales que pueden utilizarse en una secuencia de aminoácidos de fórmula I de la presente invención comprenden:

(i) aminoácidos que presentan la estructura química básica de los aminoácidos naturales, pero que son distintos, como los aminoácidos alfa,

(ii) aminoácidos naturales en la forma D, concretamente distintos a en la forma L natural, es decir, aminoácidos naturales, en los que el grupo alquilo en el átomo C en la posición 2 no se encuentran en la configuración L sino en la configuración D,

(iii) aminoácidos no naturales, por ejemplo distintos a los definidos anteriormente entre (i) y (ii), comprenden de 2 a 12, como de 2 a 6 átomos de carbono, al menos un grupo amino, por ejemplo uno o dos, y al menos un grupo carboxi, por ejemplo uno o dos, dado el caso además de sustituyentes, que también están presentes en aminoácidos naturales, por ejemplo OH, -CONH², -NH-C(=NH²)NH², SH, alquilo(C^1-4)-S, fenilo, heterociclilo, por ejemplo que comprenden 5 o 6 miembros de anillo y que comprenden al menos un heteroátomo, por ejemplo uno o dos, seleccionados de N, O, S, preferiblemente N, dado el caso condensados con un anillo adicional, tal como fenilo, por ejemplo que comprende prolinilo, indolilo, imidazolilo;

Los aminoácidos no naturales de fórmula I de la presente invención comprenden ortitina, ácido 4-aminobutírico, palanina.

En un aspecto adicional, el compuesto de fórmula I se selecciona del grupo de los péptidos de las secuencias de aminoácidos

- secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1

Ciclo( CGQRETPEGAEAKPWYC)

en la que entre los dos residuos de cisteína terminales está configurado un puente de disulfuro;

- secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2

Ciclo(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino, que está unido al átomo de carbono e del residuo de lisina N-terminal, y el grupo carboxilo de la cadena lateral, que está unido al atomo de carbono y del residuo de ácido glutámico C-terminal;

- secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3

Ciclo(KGQRETPEGAEAKPWYG)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino, que está unido al átomo de carbono e de la cadena lateral del residuo de lisina N-terminal, y el grupo carboxilo de la residuo de glicina C-terminal;

- secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4

Ciclo(ornitina-GQRETPEGAEAKPWYG)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino, que está unido al átomo de carbono 8 de la cadena lateral del residuo de ornitina N-terminal, y el grupo carboxilo del residuo de glicina C-terminal;

- secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5

Ciclo(ácido 4-aminobutírico-GQRETPEGAEAKPWYD)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino del residuo de ácido 4-aminobutírico N-terminal y el grupo carboxilo de la cadena lateral, que está unido al átomo carbono p del residuo de ácido aspártico C-terminal; y - secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:6

Ciclo( p-alanina-GQRETPEGAEAKPWYE)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino del residuo de p-alanina N-terminal (residuo de ácido 3-aminopropanoico) y el grupo carboxilo de la cadena lateral, que está unido al átomo de carbono y del residuo de ácido glutámico C-terminal.

En los compuestos de fórmula I, tales como los compuestos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6, los aminoácidos están normalmente ligados peptídicamente, con la excepción del enlace que conduce a la formación del anillo.

Un compuesto cíclico de fórmula I también se designa en el presente documento “compuesto(s) cíclico(s) de la presente invención (según la presente invención)” y comprende un compuesto cíclico de fórmula I en cualquier forma, por ejemplo en forma libre y en forma de una sal. En un entorno biológico, un compuesto de fórmula I se encuentra generalmente en forma de una sal.

En un aspecto adicional, un compuesto de fórmula I en un liofilizado de la presente invención se encuentra en forma de sal.

Tales sales incluyen preferiblemente sales farmacéuticamente compatibles, aunque también están comprendidas sales farmacéuticamente no compatibles, por ejemplo con fines de producción/aislamiento/purificación.

En un entorno biológico, una sal de un compuesto cíclico de fórmula I es normalmente un clorhidrato.

Un compuesto cíclico de fórmula I de la presente invención en forma libre puede convertirse en un compuesto cíclico de fórmula I en forma de una sal y viceversa.

Un compuesto cíclico de fórmula I de la presente invención puede encontrarse en forma de isómeros y mezclas de isómeros; por ejemplo isómeros ópticos. Un compuesto cíclico de fórmula puede, por ejemplo, contener átomos de carbono asimétricos y, por tanto, puede encontrarse en forma de enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos, por ejemplo racematos. Un compuesto cíclico de fórmula I puede encontrarse en la configuración (R), (S) o (R,S), preferiblemente en la configuración (R) o (S), en relación con sustituyentes individuales para átomos de carbono asimétricos. Las mezclas de isómeros pueden separarse de manera adecuada, por ejemplo según, por ejemplo de manera análoga a, un método convencional para obtener isómeros puros. La presente invención comprende un compuesto cíclico de fórmula I de la presente invención en cualquier forma isomérica y en cualquier forma de mezcla de isómeros. En el caso de los aminoácidos naturales, la configuración de sustituyentes es normalmente tal como en los aminoácidos naturales.

Un compuesto cíclico de fórmula I de la presente invención puede producirse de manera apropiada, por ejemplo, según, por ejemplo de manera análoga a, los métodos convencionales, o tal como se describe en el presente documento, por ejemplo mediante síntesis de péptidos en fase sólida, dado el caso según la estrategia de protección con fluorenilmetoxicarbonilo/t-butilo en resina de cloruro de 2-clorotritilo usando agentes de acoplamiento adecuados, tales como diisopropilcarbodiimida y/o N-hidroxibenzotriazol y un disolvente adecuado, por ejemplo N,N-dimetilformamida. Los aminoácidos protegidos pueden acoplarse sucesivamente a la cadena peptídica, comenzando con el aminoácido C-terminal. La desprotección de los grupos protegidos con fluorenilmetoxicarbonilo puede tener lugar con la ayuda de una base, por ejemplo piperidina, tal como piperidina al 20% en un disolvente adecuado, tal como N-N-dimetilformamida. La escisión del péptido terminado, dado el caso todavía (parcialmente) protegido del portador (resina portadora), puede tener lugar de manera adecuada, por ejemplo con ayuda de un ácido, tal como ácido acético en un disolvente adecuado, por ejemplo en un hidrocarburo halogenado, tal como CH²O ², por ejemplo en una mezcla de ácido acético y CH²O ²en una proporción de 1:1.

En el caso de los péptidos que contienen cisteína, tras la escisión del portador (resina portadora) puede tener lugar una desprotección, si es necesario, por ejemplo con un ácido fuerte, tal como ácido trifluoroacético (TFA), por ejemplo el 95% de TFA/el 5% de H²O La ciclización para obtener un enlace de disulfuro puede tener lugar mediante la oxidación de los residuos de cisteína terminales, por ejemplo mediante el tratamiento del péptido lineal, bruto, con aire, por ejemplo a un pH de 8,5 durante 90 horas. Una purificación del péptido bruto, que se obtiene, puede tener lugar, por ejemplo, por medio e cromatografía, por ejemplo cromatografía de líquidos de media presión en fase inversa (RP-MPLC) a través de una columna adecuada, tal como una columna de gel de sílice RP-C18, pudiendo emplearse favorablemente un gradiente de eluyentes, tal como un gradiente del 5% - 40% de acetonitrilo-agua. Un contraión de ácido trifluoroacético puede reemplazarse, por ejemplo por acetato, por ejemplo con ayuda de una columna, tal como una columna Lewatite MP64 (forma de acetato). Tras un último lavado con agua, el péptido purificado puede liofilizarse como sal de acetato y obtenerse en forma de un compuesto ligeramente coloreado, por ejemplo en forma de un polvo blanco.

En el caso de los péptidos libres de cisteína, la etapa de ciclización puede realizarse de manera adecuada, por ejemplo todavía en el péptido lineal parcialmente protegido tras la escisión del portador (resina portadora). Tras la ciclización selectiva del péptido libre de cisteína puede tener lugar una desprotección de cadena lateral en TFA, si es necesario. Una etapa de purificación puede realizarse, por ejemplo por medio de cromatografía, por ejemplo mediante RP-MPLC preparativa. En el péptido, que se obtiene a este respecto, el ion ácido trifluoroacético puede reemplazarse por el ion acetato, por ejemplo tal como se describió anteriormente. La liofilización de la forma de acetato del péptido, que se obtiene a este respecto, puede tener lugar igualmente, por ejemplo tal como para los péptidos que contienen cisteína.

El peso molecular de los péptidos obtenidos puede confirmarse mediante espectrometría de masas por ionización por electrospray o MALDI-TOF-MS. La pureza puede determinarse, por ejemplo, HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento). Los compuestos cíclicos de fórmula I de la presente invención contienen compuestos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6. Tales compuestos se conocen, por ejemplo, por Hazemi P., Tzotzos, S. Fischer B., Andavan, G.S.B., Fischer H., Pietschmann H, Lucas, R. y Lemmens-Gruber, R. en J Med Chem. 25 de noviembre e 2010, 53(22):8021-8029, “Essential structural features of TNF-^alectin-like domain derived peptides for activation of amiloride-sensitive sodium current in A549 cells” como que activan el “canal de sodio epitelial (ENaC) sensible a la amilorida” y por consiguiente como útil para el tratamiento de enfermedades en el pulmón. Mediante la activación del canal de iones de sodio (ENaC) sensible a la amilorida se produce el transporte de iones de sodio a través del tejido pulmonar. Se configura un gradiente osmótico, que conduce al transporte pasivo de agua. Si este modelo se transfiere al pulmón, la activación del canal de iones de sodio sensible a la amilorida puede usarse, por ejemplo, para reducir la acumulación de agua en el pulmón, por ejemplo en el caso de edemas pulmonares.

A este respecto, en el curso del desarrollo de la presente invención se ha encontrado que un transporte activo o pasivo de los péptidos cíclicos de fórmula I de la presente invención, en la que X¹y X²son tal como se definieron anteriormente, por ejemplo con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, a través del tejido pulmonar a la sangre no es deseable y no debe tener lugar, dado que contribuye significativamente a la eficacia fisiológica de los péptidos cíclicos de las secuencias de aminoácidos SEQ ID 1 a s Eq ID 6, cuando estos llegan al volumen de aire del pulmón por medio de inhalación oral, de modo puedan depositarse en la superficie del tejido pulmonar y activar allí el canal de iones de sodio sensible a la amilorida orientado apicalmente.

Pudo mostrarse sorprendentemente (ejemplo 10) que tras la inhalación de un aerosol, que está producido a partir de un liofilizado según la presente invención mediante la adición de agua, no puede detectarse en la sangre un péptido según la presente invención. Sin embargo, se han desarrollado y se desarrollan normalmente preparaciones de inhalación para que estas pasen tras la inhalación a través del tejido pulmonar al torrente sanguíneo, y por consiguiente puede evitarse una inyección parenteral. El objetivo de los medicamentos de inhalación hasta la fecha es concretamente la acción sistémica. En el caso de distribuir un principio activo en la sangre, la molécula llega a cada tejido y órgano. Sin embargo, una desventaja esencial de la aplicación sistémica es el amplio espectro de toxicidad y efectos secundarios en órganos y tejidos del cuerpo, que no están relacionados con la enfermedad a tratar.

En el caso de emplear un aerosol acuoso, que está producido a partir de un liofilizado según la presente invención, los péptidos llegan a diferencia de esto a la capa límite entre el aire y el epitelio pulmonar, donde activan un canal de iones de sodio. Es decir, los péptidos según la presente invención actúan “ localmente” sobre el tejido epitelial del pulmón y no sistémicamente. Un paso de los péptidos a través del tejido pulmonar no se desea y tampoco tiene lugar.

A diferencia de las formulaciones peptídicas conocidas por la literatura, mediante el aerosol acuoso, que se ha producido a partir de un liofilizado según la presente invención y que no contiene aditivos, se ha conseguido evitar una difusión del péptido inhalado a través del pulmón a la sangre. De este modo se obtiene el efecto extremadamente positivo de impedir posibles propiedades sistémico-tóxicas del péptido, incluso en órganos distintos al pulmón. Por consiguiente pueden excluirse efectos secundarios sistémicos de lo contrario comunes, lo que representa un gran beneficio médico. Debido a la administración local a la superficie interna de los pulmones y sin difusión a la sangre, se requiere claramente menos principio activo en comparación con la aplicación sistémica.

Además, se ha descubierto sorprendentemente que en el caso de un liofilizado según la presente invención, el péptido cíclico de fórmula I, en particular los péptidos cíclicos de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO:6 sin aditivos, puede ser prácticamente excluirse durante meses y años una inestabilidad química o biológica. Concretamente se ha descubierto que no se daña la estructura química y la actividad biológica de los péptidos cíclicos de fórmula I de la presente invención, así como de cualquiera con las secuencias de aminoácidos s Eq ID NO:1 a SEQ ID NO:6, sorprendentemente también sin la adición de aditivos y/o estabilizadores habituales en general.

En el caso de utilizar los péptidos cíclicos de fórmula I de la presente invención, en particular las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, para inhalación, se ha descubierto que los péptidos cíclicos están diseñados de tal manera que estos son estables durante mucho tiempo también en forma disuelta, concretamente en disolución acuosa, también sin aditivos, por ejemplo, en el tanque de reserva de un dispositivo para la pulverización (nebulizador). Además, se ha mostrado que los péptidos cíclicos de fórmula I de la presente invención, en particular las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, pueden prepararse según la presente invención de tal manera que las proteínas cíclicas SEQ ID 1 a SEQ ID 6 no se dañen cuando se pasen a una forma inhalable y por consiguiente mantengan la actividad completa, sorprendentemente también sin la adición de aditivos y/o estabilizadores habituales en general.

Para producir una disolución de, por ejemplo al menos uno de, los péptidos de fórmula I de la presente invención, en particular uno con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en la forma, que es adecuada como aerosol para la pulverización, estos péptidos pueden disolverse en agua y la disolución resultante, por ejemplo sin aditivos adicionales, tales como, por ejemplo, aditivos y/o estabilizadores habituales, liofilizarse, obteniéndose un polvo. Antes de la liofilización puede filtrarse, dado el caso, la disolución para eliminar la turbidez.

En un aspecto adicional, la presente invención pone a disposición el uso de un liofilizado según la presente invención para producir un aerosol, que sea adecuado para la pulverización, sin aditivos ni estabilizadores.

El uso de un liofilizado según la presente invención se denomina en el presente documento también “uso según la presente invención”.

Se ha encontrado que los péptidos de fórmula I, en particular aquellos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, eran estables en tal forma liofilizada durante al menos 24 meses en un ambiente enfriado y a temperatura ambiente durante al menos 6 meses, incluso sin la adición de aditivos y/o estabilizadores por lo demás habituales.

Un liofilizado según la presente invención puede disolverse sin aditivos para su uso en agua para obtener un aerosol, por ejemplo para la producción directa de un aerosol o para su almacenamiento como disolución, por ejemplo en un recipiente de reserva.

En un aspecto adicional, la presente invención pone a disposición el uso de un liofilizado, en el que un péptido de fórmula I, en la X¹y X²son tal como se definieron anteriormente, se encuentra en disolución acuosa sin aditivos y/o estabilizadores.

Sorprendente y ventajosamente se ha descubierto que los péptidos cíclicos disueltos de esta manera de fórmula I, en la que X¹y X²son tal como se definieron anteriormente, en particular con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, eran estables en disolución durante al menos 7 días, es decir, que la eficacia biológica de las proteínas cíclicas no se reducía por el paso al estado inhalable, incluso sin la adición de aditivos y/o estabilizadores por lo demás habituales.

En el caso de la utilización de los péptidos cíclicos según la presente invención, en particular las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, se ha descubierto que una disolución de los péptidos cíclicos es tal que esta puede convertirse en un aerosol, por ejemplo con ayuda de un nebulizador, a través del cual se pulverizan los péptidos cíclicos. A este respecto se ha mostrado que se obtuvieron partículas de aerosol con diámetros de partícula inferiores o iguales a 5 |im.

Se ha descubierto también que un aerosol, que contiene principalmente gotitas con un diámetro de < 5 |im, es especialmente adecuado para su uso, dado que de este modo el aerosol también llega al volumen de aire del pulmón. El límite inferior del tamaño de gotita resulta simplemente de la viabilidad del tamaño de gotita.

En un aspecto adicional, la presente invención pone a disposición el uso de un liofilizado para la producción de un aerosol, en el que el tamaño de partícula presenta un diámetro < 5 |im.

La presente invención describe el uso de un liofilizado, que está caracterizado porque el aerosol producido a partir del liofilizado se usa para mejorar/acondicionar la función pulmonar en forma de inhalación.

La presente invención pone a disposición el uso de un aerosol producido a partir del liofilizado según la presente invición, sin aditivos, para el tratamiento de edemas pulmonares, y en un aspecto adicional, un procedimiento para el tratamiento de edemas pulmonares, que está caracteriza porque a un paciente se le administra un aerosol sin aditivos según la presente invención en forma de una inhalación; y, en un aspecto adicional , un liofilizado según la presente invención para mejorar/acondicionar la función pulmonar, o para la inhalación para mejorar/acondicionar la función pulmonar.

La dosis efectiva depende de diferentes factores, por ejemplo, de la naturaleza química y de la farmacocinética de un compuesto cíclico de fórmula I, el consumidor individual, por ejemplo su peso corporal, de la edad y de la condición individual del paciente, de la naturaleza y gravedad de la enfermedad. En general, para un tratamiento exitoso en mamíferos más grandes, tales como, por ejemplo seres humanos, puede partirse de la base de que una dosis (diaria) de (aproximadamente) 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 200 mg/kg, por ejemplo, de 1 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, administrada por ejemplo, en varias, por ejemplo hasta 4 dosis parciales, proporciona resultados exitosos. Los niños reciben generalmente la mitad de la dosis de un adulto.

Estudios han mostrado además que mediante el tratamiento de un pulmón donante ex vivo, concretamente antes del trasplante a un paciente, con un péptido cíclico de fórmula I, en la que Xi y X²son tal como se definieron anteriormente, en particular con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, pueden mejorarse/acondicionarse sorprendentemente las funciones pulmonares. A este respecto se ha mostrado que puede conseguirse una mejora extraordinaria cuando se trata el pulmón que va a trasplantarse antes del trasplante con un aerosol a partir de un liofilizado según la presente invención, en particular sin aditivos.

Se describe también un procedimiento extracororpóreo para mejorar/acondicionar las funciones pulmonares, que está caracterizado porque se pulveriza un pulmón donante ex vivo con un aerosol acuoso, que se ha producido en particular sin aditivos y/o estabilizadores, a partir de un liofilizado según la presente invención.

El tratamiento del pulmón también puede tener lugar (todavía) después de haber tenido lugar trasplante en el receptor.

A este respecto se obtuvieron resultados, tal como se muestra en la figura 1. La concentración de un péptido cíclico de fórmula I según la presente invención en el aerosol ascendía a este respecto a desde 5 nM hasta aproximadamente 150 nM.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra la actividad de los péptidos cíclicos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en función de la concentración. En el eje X se indica la concentración en nM (escala logarítmica) de las proteínas cíclicas SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, en el eje y la corriente de iones de sodio en %.

La figura 2 muestra los resultados del empleo por inhalación de un péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 durante una perfusión pulmonar fuera del cuerpo (extracorpórea, ex vivo), que simula un trasplante de pulmón.

En la figua 2A se indican en el eje x los puntos de tiempo T1 a T4, en los que tuvieron lugar las mediciones tras el empleo por inhalación del péptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 (una vez por hora). En el eje y está registrado el cumplimiento (compliance), y en la figura 2B en el eje x a su vez los puntos de tiempo T1 a T4 y en el eje y la diferencia de pO²arteriovenosa APo². Como control se inyectó agua (WFI). Se muestran los resultados de 8 experimentos por grupo.

La figura 3 muestra el ciclo de liofilización de los péptidos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:7, representado como temperatura del compartimento (línea continua) y temperatura del producto (línea discontinua) en °C (eje y) con el tiempo en minutos (eje x).

La figura 4 muestra una estructura de ensayo esquemática para la condensación de aerosol en una trampa fría, en la que

1 significa un recipiente de poliestireno, lleno de hielo y sal,

2 significa un tubo con el péptido disuelto (sustancia control),

3 significa un nebulizador,

4 significa una cámara de reserva, y

5 significa un módulo de control.

La figura 5 muestra la distribución del tamaño de partícula media del aerosol del péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1, generada con 2 nebulizadores diferentes (tipo A y tipo B). La medición tuvo lugar por medio e difracción láser (caudal: 15 l/min). indicadores de error = SD Las líneas muestran el respectivo porcentaje de partículas con un diámetro < 5 |im en el aerosol. En el eje X se representa el tamaño de gotita en |im, en el eje Y la cantidad acumulada en %.

La figura 6 muestra la distribución del aerosol del péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 en el simulador de respiración en la respectiva ubicación:

1 = filtro de inhalación

2 = filtro de exhalación

3 = pieza de conexión de filtro

4 = pieza Y del nebulizador (incluyendo válvula unidireccional)

5 = residuo en el nebulizador),

habiéndose utilizado 2 nebulizadores, uno de tipo A y uno de tipo B.

Ejemplo 1

Síntesis de péptidos

Los péptidos se produjeron respetando las siguientes etapas: acoplamiento secuencial de los aminoácidos; escisión selectiva de la fase sólida; purificación y liofilización, ciclización selectiva; escisión de los grupos protectores; purificación y liofilización; estudio analítico.

Todos los péptidos cíclicos de la presente invención, que comprenden los péptidos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID n O:1 a SEQ ID NO:6, así como el péptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7, se produjeron por medio de la estrategia de grupos protectores fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)/t-butilo en forma de una síntesis en fase sólida en un portador (resina de cloruro de 2-clorotritilo) de manera totalmente automática. Se usaron diisopropilcarbodiimida y N-hidroxibenzotriazoles como agentes de acoplamiento. Todas las reacciones de acoplamiento se realizaron en N,N-dimetilformamida como disolvente. Los aminoácidos protegidos se acoplaron para ello secuencialmente al aminoácido en cada caso C-terminal, que se usó como material de partida. La desprotección del grupo fluorenilmetoxicarbonilo se realizó en piperidina al 20% en N,N-dimetilformamida. La escisión de los péptidos parcialmente protegidos, acabados, del portador (resina portadora) tuvo lugar en una mezcla 1:1 de ácido acético y diclorometano. En el caso de los péptidos que contienen cisteína, la desprotección de la cadena lateral tuvo lugar tras la escisión del portador (resina portadora) en ácido trifluoroacético al 95%, tras lo cual se realizó la ciclización por oxidación de los residuos de cisteína terminales por medio de suministro de aire al péptido lineal, bruto, a un pH básico (8,5) en el plazo de 90 horas. El péptido cíclico, bruto, se hizo pasar por medio de cromatografía de líquidos de media presión en fase inversa (RP-MPLc ) a través de una columna de gel de sílice RP-C18 con un gradiente de acetronitrilo/agua el 5%-40. Finalmente, el ion trifluoroacetato se reemplazó por acetato a través de una columna Lewatit MP64 (forma de acetato). Tras un lavado con agua, la sal de acetato purificada se liofilizó y se obtuvo como polvo de blanco a ligeramente coloreado.

En el caso de los péptidos libres de cisteína, la etapa de cidización se realizó en el péptido lineal parcialmente protegido tras la escisión del portador (resina portadora). Tras la ciclización selectiva del péptido libre de cisteína tuvo lugar la desprotección de la cadena lateral con ácido trifluoroacético, seguido de cromatografía RP-MPLC preparativa, reemplazo del ion trifluoroacetato por acetato y liofilización de la forma de acetato, como para los péptidos que contienen cisteína.

A continuación se estudiaron las proteínas cíclicas SEQ ID 1 a SEQ ID 6 por medio de HPLC inversa para determinar la pureza y la masa.

La pureza de la proteína cíclica SEQ ID 1 era del 96,3%. m/z (ESI) 1924,2 (M++1).

La pureza de la proteína cíclica SEQ ID 2 era del 96,3%. m/z (ESI) 1924,2 (M++1).

La pureza de la proteína cíclica SEQ ID 3 era del 98,8%. m/z (ESI) 1888,2 (M++1).

La pureza de la proteína cíclica SEQ ID 4 era del 97,4%. m/z (ESI) 1873,4 (M++1).

La pureza de la proteína cíclica SEQ ID 5 era del 99%. m/z (MALDI-TOF) 1901,6 (M++1).

La pureza de la proteína cíclica SEQ ID 6 era del 99%. m/z (MALDI-TOF) 1902,7 (M++1).

La pureza de la proteína cíclica SEQ ID 7 era del 95%. m/z (MALDI-TOF) 1778,02 (M++1).

El compuesto con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7

C/c/o(CGQREAPAGAAAKPWYC)

en la que está configurado un puente de disulfuro entre los dos residuos de cisteína terminales ha demostrado ser biológicamente inactivo y se utilizó para fines de comparación.

Ejemplo 2

Estudios electrofisiológicos del canal de iones de sodio sensible a la amilorida (ENaC)

Se derivaron corrientes de iones sodio macroscópicas de células epiteliales pulmonares humanas A549 en la configuración de “célula entera” por medio de la técnica “patch-clamp” (Hamill et a/, Pflugers Arch. 1981, 391 (2):85-100., 1981). Para las derivaciones de corrientes en la configuración de “célula entera” se usaron las siguientes soluciones de baño y de electrodo: Solución de baño: metanosulfonato de sodio 135 mM, NaCl 10 mM, KCl 2,7 mM, CaCl²1,8 mM, MgCh 2 mM, glucosa 5,5 mM y HEPES 10 mM, pH 7,4.

Solución de electrodo: metanosulfonato de potasio 120 mM, KCl 15 mM, NaCl 6 mM, Mg²ATP 1 mM, NaaATP 2 mM, HEPES 10 mM y EGTA 0,5 mM (pH 7,2).

Se transfirieron cubreobjetos con las células cultivadas en los mismos a un baño de ensayo de 1 ml, se fijaron sobre la mesa microscópica (Axiovert 100, aumento de 400x) y se superfundieron las células con la solución de baño descrita anteriormente. Después se derivó la corriente de una célula adecuada (que está adherida al cubreobjetos). Para ello, un colocó un microelectrodo lleno de una solución de electrodo (capilar de vidrio con una abertura en punta definida y pulida térmicamente de aproximadamente 1-3 |im (corresponde a una resistencia de la punta de electrodo de 3-5 MQ) sobre la célula y se succionó la membrana, de modo que se formó un “sello gigaóhmico” entre la membrana y el electrodo, para minimizar la corriente de fuga. En la configuración de “célula entera”, la membrana se perforó debajo de la punta de electrodo, para que pudiera medirse la corriente que fluye a través de todos los canales iónicos de la célula. En el caso de obtener un “sello gigaóhmico”, se aplicó un potencial de retención de membrana definido a través de un preamplificador (CV-4 Headstage, Axon Instruments) y un amplificador (Axopatch 1D, Axon Instr.) y se midió la corriente que fluye a este respecto a través de los canales iónicos. El protocolo de pulsos consistía en hiperpolarización de la membrana celular a -100 mV durante 5 segundos y una despolarización gradual posterior en pasos de 20 mV hasta 100 mV. Este protocolo se realizó antes (control) y después de la adición de las proteínas cíclicas. Las derivaciones de corriente así obtenidas se almacenaron y se analizaron con ayuda del programa PCLAMP 6.0. Para ello, las derivaciones de corriente obtenidas en presencia de amilorida se restaron de las corrientes registradas previamente, de modo que pudo determinarse el flujo de sodio sensible a la amilorida a través de los canales de sodio epiteliales.

Los resultados de las mediciones se resumen en la tabla 1, en la que se indica la actividad de las proteínas cíclicas SEQ ID 1 a SEQ ID 7 en la corriente de iones sodio sensibles a la amilorida celular. La actividad de los péptidos individuales se indica como CE⁵⁰(en nM). La CE⁵⁰es la concentración efectiva, a la que se mide el 50% de la actividad máxima (es decir, el aumento máximo del amperaje, I).

Tabla 1

La actividad de las proteínas cíclicas SEQ ID 1 a SEQ ID 6 en función de la concentración se representa en la figura 1. La actividad máxima se indicó como el 100%.

Los estudios que se representan en la tabla 1 y la figura 1 muestran que los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 son biológicamente activos, mientras que el péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7, que presenta una cierta similitud estructural, no es activo.

Ejemplo 3

Producción del liofilizado

El desarrollo de una forma de almacenamiento estable de los péptidos cíclicos de fórmula I tuvo lugar a escala técnica. Para ello se disolvieron los péptidos cíclicos de SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 así como el péptido cíclico de SEQ ID NO:7 hasta de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml en agua pura y se filtraron mediante filtros con un tamaño de poro de 0,2 |im para la eliminación de turbidez, impurezas y posibles inesterilidades.

Tras la filtración se repartió el péptido cíclico disuelto en agua pura en ampollas de vidrio o de plástico y se pasó por medio de secado por congelación (liofilización) a un polvo estable.

A este respecto se usó el parámetro de liofilización descrito en la tabla 2 y el ciclo de liofilización descrito en la figura 3.

Tabla 2

Tiempo de Cambio de temperatura

Etapa ^_Proceso ^Tempr^e..^ratura. ^d,^e0^l_. retención (°C) durante el tiempo Presión _{compartimento (°C)}

(min) de retención (mTorr) 1 C a r g a 5 6 0 5 , 0 n / d

Como resultado de la liofilización se obtuvo en cada caso un polvo blanco para los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6.

Ejemplo 4

Estudio de estabilidad del liofilizado del ejemplo 2 tras el almacenamiento a temperatura ambiente y en el refrigerador

El estudio de estabilidad del liofilizado de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 tuvo lugar a escala técnica. El liofilizado se almacenó para ello hasta 24 meses a de 2 a 8°C y hasta 6 meses a 25°C al 60% de humedad relativa. La estabilidad se estudió en diversos puntos de tiempo durante este período de tiempo. En particular se estudiaron la apariencia, el contenido así como la pureza de los péptidos cíclicos. Para ello se usaron procedimientos analíticos habituales en laboratorio, tal como, por ejemplo, la inspección visual y la HPLC inversa.

Además, tras un almacenamiento de 24 meses a 2-8°C se determinó la actividad biológica por medio de experimentos de patch clamp. A este respecto se derivaron las corrientes macroscópicas de células A549 en la configuración de “célula entera” de la técnica “pateh-damp”, tal como se describe en “Investigaciones electrofisiológicas del canal de iones de sodio sensible a la amilorida (ENaC)”. En la tabla 3 se resumen los resultados del estudio de estabilidad del respectivo liofilizado de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en el punto de tiempo T = 0 y tras 6 meses (T = 6M) o tras 24 meses (T = 24M). . La apariencia no ha cambiado durante todo el período de tiempo. El contenido de péptido cíclico, así como la pureza estaban sujetos a fluctuaciones menores.

Tabla 3

Por tanto, el liofilizado de en cada caso uno de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 es estable en cada caso hasta 24 meses a de 2 a 8°C y hasta 6 meses a 25°C/el 60% de humedad relativa.

La medición de la actividad biológica por medio de experimentos de patch-clamp dio como resultado que un liofilizado con en cada caso uno de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 era todavía completamente activo después de 24 meses de almacenamiento a de 2 a 8°C.

Ejemplo 5

Producción de una disolución acuosa de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 antes de la inhalación

Para la preparación para la aplicación de las proteínas cíclicas con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6, los polvos blancos estables, que se habían obtenido en la liofilización según el ejemplo 2, se disolvieron en cada caso en un volumen definido de agua pura hasta una concentración de entre 0,1 mg por ml y 100 mg por ml. Las disoluciones resultantes de las proteínas cíclicas SEQ ID 1 a SEQ ID 6 se pasaron entonces a los recipientes de reserva de los nebulizadores. Mediante la disolución de las proteínas cíclicas SEQ ID 1 a SEQ ID 6 en agua se obtuvieron disoluciones claras.

Ejemplo 6

Estudio para la estabilidad de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en preparación disuelta antes de la inhalación

Por razones prácticas, una disolución acuosa de un péptido cíclico con una de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a s Eq ID NO:6 no siempre puede usarse para inhalación inmediatamente después de su producción. Por tanto, se estudió a modo de ejemplo la estabilidad de una disolución acuosa. La disolución que debe terminarse se conservó para ello o bien en una jeringa habitual en el laboratorio a de 2 a 8°C durante 7 días o bien en la cámara de un nebulizador a 25°C durante 24 horas. En particular se estudiaron la apariencia, el contenido de proteína cíclica SEQ ID 1 así como su pureza. Los métodos utilizados para ello fueron los procedimientos analíticos habituales en el laboratorio, tal como, por ejemplo, la inspección visual así como el análisis por medio de HPLC inversa.

Los resultados del estudio de estabilidad de una disolución acuosa del péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 se resumen en la tabla 4. La apariencia no ha cambiado durante todo el período de tiempo. El contenido de péptido cíclico, así como la pureza, estaban sujetos a fluctuaciones menores.

Tabla 4

Por tanto, una disolución acuosa de un péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 para inhalación es estable en una jeringa de laboratorio a de 2 a 8°C durante 7 días o en la cámara de un nebulizador a 25°C durante al menos 24 horas.

Ejemplo 7

Estudio de la estabilidad de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en una preparación disuelta durante la conversión a un aerosol

Dado que las proteínas y los péptidos a veces pueden ser muy inestables, se estudió si los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en una preparación disuelta permanecen estables durante la conversión a un aerosol. Para ello se disolvieron los péptidos cíclicos, tal como se describe en el ejemplo 4, en agua. Después de verterla en el recipiente e reserva de un nebulizador, la disolución acuosa de las proteínas cíclicas se convirtió en un aerosol. Para esto se usó un nebulizador de “tipo malla” (nebulizador). El aerosol que sale del nebulizador se captó entonces en una trampa fría, como se representa en la figura 4. La actividad biológica del aerosol captado se determinó por medio del método de patch-clamp. A este respecto se derivaron las corrientes macroscópicas de células A549 en la configuración de “célula entera” de la técnica “patch-clamp”, tal como se describe en “ Investigaciones electrofisiológicas del canal de iones de sodio sensible a la amilorida (ENaC)”. La estabilidad química del aerosol condensado se determinó por medio de HPLC/MS inversa.

Pudo mostrarse a modo de ejemplo que el péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 en una preparación disuelta conserva su estabilidad biológica y química durante la conversión a un aerosol.

Ejemplo 8

Caracterización fisicoquímica del aerosol de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6

Con ayuda de un nebulizador, que convierte disoluciones acuosas en un aerosol, pueden convertirse también las disoluciones acuosas de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en aerosoles. Tales aerosoles pueden caracterizarse en términos del tamaño medio de gotita, así como la distribución de tamaño de las gotitas de aerosol. Para ello se usan 2 métodos habituales, que también se describen en las farmacopeas (Pharmaopoeia). Un método analítico usa el impactador en cascada en su diseño actual, el impactador de próxima generación (“Next Generation Impactor”). A este respecto se conduce el aerosol a través de una serie de placas de tamiz, volviéndose cada vez más pequeño el diámetro de los agujeros con cada placa y aumentando el número de agujeros. En el otro método analítico, la medición por difracción láser, los tamaños de las gotitas se determinan por medio de láser. Los 2 parámetros importantes, que se determinan en estas mediciones, son, por un lado, la mediana del diámetro de todas las gotitas y, por otro lado, la cantidad de gotitas que tienen un diámetro de < 5 |im. En la bibliografía, este diámetro se describe como límite, bajo el cual las partículas de aerosol inspiradas llegan tambien realmente al pulmón.

Es ampliamente conocido que en la práctica, de un aerosol generado, solo está disponible una parte para el paciente. Es decir, con el fin de determinar la cantidad de aerosol, que está disponible para un usuario, se realizaron ensayos con un simulador de respiración. Para estudiar el tamaño de partícula y realizar la simulación de respiración se usó a modo de ejemplo un aerosol a partir de una disolución acuosa del péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID n O:1. Para la generación del aerosol se usaron diferentes tipos de nebulizadores. Los nebulizadores A y B eran denominados “nebulizadores de tipo malla”.

El porcentaje de gotitas con un diámetro de < 5 |im en el aerosol ascendía en todos los nebulizadores a al menos el 50%, véase la tabla 5 y la figura 5, en las que se indican y se muestran las propiedades del aerosol del péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 generado por 3 nebulizadores diferentes.

Tabla 5

Además pudo demostrarse que el porcentaje predominante de los aerosoles generados mediante los nebulizadores de una disolución acuosa del péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 está disponible para inhalación, tal como se muestra en la figura 6, representado mediante la detección cuantitativa de la proteína cíclica en el “filtro de inhalación”. La cantidad no disponible de aerosol es claramente menor (figura 6).

Ejemplo 9

Detección de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en la sangre tras administración parenteral

La detección a modo de ejemplo de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 tras administración parenteral a la sangre tuvo lugar en perros y ratas. Para ello se aplicó a modo de ejemplo una disolución acuosa de la proteína cíclica con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 como bolo (25 mg/kg de peso corporal) por vía intravenosa a los animales de ensayo. Inmediatamente después de finalizar la administración intravenosa se extrajo sangre y se determinó la concentración de la proteína cíclica con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 por medio de HPLC/MS inversa habitual en el laboratorio. Los resultados se representan en la tabla 6, en la que se indica la concentración plasmática de la proteína cíclica con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 tras la aplicación intravesosa.

Tabla 6

Ejemplo 10

Detección de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 en el tejido pulmonar tras la inhalación como aerosol

La detección de uno de los péptidos cíclicos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 puede tener lugar en el tejido pulmonar de ratas. Para ello se generó un aerosol a modo de ejemplo a partir de una disolución acuosa del péptido cíclico con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 con un nebulizador. El aerosol fue inspirado por el animal de ensayo (72 mg/kg de peso corporal). Tras la finalización de la inhalación del aerosol, se estudiaron tanto el tejido pulmonar como la sangre del animal de ensayo. Por medio de HPLC/MS inversa se determinó la concentración del péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1.

A modo de ejemplo, tras una inhalación de en total 72 mg/kg de peso corporal pudo detectarse el péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 en el tejido pulmonar con una concentración de 1,2 pg/g de tejido pulmonar. A diferencia de esto, hasta un límite de detección de 0,1 pg/ml, el péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 no pudo detectarse en la sangre.

Ejemplo 11

Efecto de los péptidos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:7 sobre superficies celulares desglicosiladas

En experimentos con células enteras, se incubaron células A549 con la enzima “PNGasa F” (péptido-W4-(W-acetil-0-D-glucosaminil)asparagina amidasa F), 100 unidades durante de 1 a 5 minutos, inmediatamente antes de las mediciones de patch-clamp y se enjuagaron los cubreobjetos con las células cultivadas con solución externa, antes de transferirse a la cámara de Bader de 1 ml.

Tras registros de control, se añadieron 240 nM de los péptidos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:7 a la solución de baño. La corriente celular total se registró a Eh = -100 mV de células sin ningún pretratamiento en condiciones controladas y tras la adición de uno de los péptidos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:7, así como con pretratamiento con PNGasa F. Los resultados de los experimentos de desglicosilación usando el ensayo de patch-clamp en el modo de células enteras los muestra la tabla 7, en la que se indica el efecto de la desglicosilación de células A549 sobre la activación de la coriente de iones de sodio por los péptidos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:7. Las corrientes de células enteras se registraron a Eh = -100 mV. La concentración de los péptidos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:7 en la solución de baño era de 240 nM.

Tabla 7

Las células con PnGasa F (tratamiento) antes del ensayo de patch-clamp acabaron con la capacidad de los péptidos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:6 de aumentar la corriente de sodio. En condiciones de control sin añadir péptido a la solución de baño y con un potencial de retención de -100 mV, la corriente de iones de sodio era de 25,4 pA, tanto en células no tratadas como en células que se habían pretratado con PNGasa F. En las células no tratadas, la adición de péptidos con la secuencia de aminoácidos s Eq ID NO:1 a SEQ ID NO:6 (concentración final 240 nM) a la solución de baño con un potencial de retención de -100 mV dio como resultado una corriente de iones de sodio notable de más de 1.000 pA. Por el contrario, un péptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7 no mostró actividad.

Ejemplo 12

Experimentos de trasplante de pulmón con cerdos

Cerdos con muerte cerebral se pusieron en la posición posterior y se realizó esternotomía longitudinal. Se abrieron el pericardio y ambas cavidades pleurales. Se rodearon la vena cava inferior y superior. Se insertó un catéter de entrada en la arteria pulmonar a través de una sutura en bolsa en el tracto de salida del ventrículo derecho. Se obtuvo un cierre de entrada conectando la vena cava inferior y superior, cierre de salida mediante el pinzamiento de la aorta. Los pulmones se protegieron entonces mediante un enjuague preventivo con solución conservante isotónica fría (50 ml por kg de peso corporal del cerdo, que contiene iones potasio, iones sodio, iones magnesio, iones calcio, iones cloruro, dextrano, glucosa, iones tampón) a través del catéter de entrada. Una incisión del tubo cardíaco izquierdo da como resultado la salida. Los pulmones se airearon durante este periodo con oxígeno al 50% y se añadió aguanieve a ambas cavidades pleurales y al mediastino.

La técnica de extracción era en su conjunto la extirpación con corazón y esófago según las siguientes etapas

a) Disección de puentes de tejido blando a la cavidad torácica a ambos lados de la tráquea.

b) Transsección de los dos ligamentos pulmonares (actuación muy profunda, difícil), entonces de la VCI, la aorta descendente baja torácica o del esófago.

c) Separación roma de las adherencias mediastínicas restantes.

d) Hinchado completo del pulmón donante antes del remate traqueal con una pinza.

Tras la extracción se envolvieron los pulmones en gasa, se colocaron en una bolsa con hielo, que estaba llena de solución extracellar de dextrano con bajo contenido en potasio, y se conservó a 4°C durante de 18 a 24 horas.

Para el acondicionamiento pulmonar ex vivo se usó la técnica EVLP (perfusión pulmonar extravascular). En la técnica EVLP se colocan los pulmones donantes en un circuito, compuesto por una bomba, aireador y filtros. En la técnica EVLP puede aumentarse la temperatura hasta los 37°C. En la EVLP se usa un aireador para suministrar oxígeno a los pulmones. La bomba se usa para hacer pasar a través de los pulmones una solución extracelular, que contiene albúmina humana y nutrientes. Durante la EVLP puede evaluarse la función pulmonar regularmente en relación a indicadores clave.

Para los experimentos de trasplante de pulmón de cerdo experimentales, se cebó el circuito de EVLP con 2,0 litros de

Claims

REIVINDICACIONES

Péptido cíclico de fórmula

X¹-GQRETPEGAEAKPWY-X²I

en la que

X¹comprende un aminoácido (secuencia de aminoácidos), con de 1 a 4 miembros, que comprende aminoácidos naturales o no naturales, y

X²comprende un aminoácido natural, y en la que

X¹contiene el aminoácido N-terminal a la izquierda en la posición 1, y X²contiene el aminoácido C-terminal en la última posición derecha,

para su uso como fármaco para el tratamiento de edemas pulmonares en forma de aerosol acuoso para inhalación sin aditivos ni estabilizadores, que puede obtenerse a partir de un liofilizado del péptido cíclico de fórmula I sin aditivos y/o estabilizadores.

Péptido cíclico para su uso según la reivindicación 1, en el que X¹en la fórmula I se selecciona del aminoácido (secuencia de aminoácidos) C (Cys), KSP (Lys-Ser-Pro), K (Lys), ornitina, ácido 4-aminobutírico, p-alanina, Péptido cíclico para su uso según una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que X²en la fórmula I se selecciona del grupo C (Cys), D (Asp), G (Gly) y E (Glu),

Péptido cíclico para uso según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un compuesto cíclico de fórmula I se selecciona de uno de los péptidos de las secuencias de aminoácidos

- SEQ ID NO:1

C/c/o(CGQRETPEGAEAKPWYC)

en la que entre los dos residuos de cisteína terminales está configurado un puente de disulfuro;

- SEQ ID NO:2

C/c/o(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino, que está unido al átomo de carbono e del residuo de lisina N-terminal, y el grupo carboxilo de cadena lateral, que está unido al átomo de carbono y del residuo de ácido glutámico C-terminal.

- SEQ ID NO:3

C/c/o(KGQRETPEGAEAKPWYG)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino, que está unido al átomo de carbono e de la cadena lateral del residuo de lisina N-terminal, y el grupo carboxilo del residuo de glicina C-terminal; - SEQ ID NO:4

C/c/o(ornitina-GQRETPEGAEAKPWYG)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino, que está unido al átomo de carbono 8 de la cadena lateral del residuo de ornitina N-terminal, y el grupo carboxilo del residuo de glicina C-terminal; - SEQ ID NO:5

C/c/o(ácido 4-aminobutírico-GQRETPEGAEAKPWYD)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino del residuo de ácido 4-aminobutírico N-terminal y el grupo carboxilo de la cadena lateral, que está unido al átomo de carbono p del residuo de ácido aspártico C-terminal; y

- SEQ ID NO:6,

C/c/o(P-alanina-GQRETPEGAEAKPWYE)

en la que está configurado un enlace amida entre el grupo amino del residuo de p-alanina N-terminal (residuo de ácido 3-aminopropanoico) y el grupo carboxilo de la cadena lateral, que está unido al átomo de carbono y del residuo de ácido glutámico C-terminal.

5. Péptido cíclico para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un compuesto cíclico de fórmula I se encuentra en forma de una sal.

6. Péptido cíclico para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tamaño de partícula del aerosol, que llega a la pulverización, presenta un diámetro < 5 |im.

7. Procedimiento para la producción de un aerosol acuoso que comprende un péptido cíclico de fórmula I, tal como se define en una de las reivindicaciones 1 a 6, disolviéndose en agua un liofilizado del péptido cíclico de fórmula I sin aditivos ni estabilizadores y pulverizándose sin aditivos ni estabilizadores.