CN102458441A - 用于治疗神经疾病的模型系统和治疗方案 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于评估化学剂在治疗和预防中风以及其它神经疾病，特别是至少部分地由兴奋性神经毒性介导的疾病，中的潜在用途的动物模型和临床试验。本发明也提供此化学剂临床应用的优选剂量、输注方案和药物组合物。

Description

用于治疗神经疾病的模型系统和治疗方案

相关申请的交叉引用

本申请为正式申请，要求美国临时申请号61/185,989(2009年6月10日递交)的权利。

发明背景

关于兴奋性神经毒性的早期工作表明，可以使用阻断谷氨酸受体的药物来治疗中风和神经创伤(Albers，Archives in Neurology 49：418-420(1992)；Albers Ann Neurol 25：398-403(1989))。尽管早期在体外和在动物模型中的测试看上去很有希望，但不幸的是，迄今，所有谷氨酸拮抗物的中风临床试验都没显示出益处，甚至表现出毒性副作用(Davis等，Lancet349：32(1997)；Morris等，J Neurosurg 91：737-743(1999)；Davis等，Stroke31：347-354(2000)；Ikonomidou等，Proc Natl Acad Sci U S A 97：12885-12890(2000)；Lees等，Lancet 355：1949-1954(2000))。可能的解释是施用抑制CNS中兴奋性神经传递的化学剂后的负面影响超过了它们作为神经保护剂的效用(Ikonomidou和Turski，Lancet Neurology383-386(2002)。谷氨酸能信号传递为CNS行使功能所需，因此，阻断必需的兴奋性神经传递具有负面后果(Ikonomidou，Biochem.Pharmacol.62：401-405(2001))。因此，需要更为完善的治疗神经元死亡的方法，以规避阻断谷氨酸受体的负面后果。

本发明的发明人之一报道了突触后密度蛋白95(PSD-95)将NMDARs偶联到介导兴奋性神经毒性和缺血性脑损伤的途径上(Aarts等，Science298，846-850(2002))。这种偶联通过向神经元转导多肽而被破坏，所述多肽结合到PSD-95/NMDAR相互作用复合体一侧的模块结构域上。这种处理减弱了下游NMDAR信号传导而不阻断NMDAR活性，保护了培养的皮层神经元不受到兴奋性毒性的损伤，减少了遭受短暂性局灶性脑缺血大鼠的脑梗死体积。

发明概述

本发明提供了治疗或预防由兴奋性神经毒性介导的疾病的方法，包括对患有该病或具有罹患该病风险的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2B结合和/或PSD-95与nNOS结合的药剂(pharmacological agent)，其中当该化学剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ IDNO：6)的肽时，剂量为2-3mg/kg，如果该化学剂不是具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽时，剂量递送与2-3mg/kg具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽等价有效浓度的该化学剂。在一些方法中，该化学剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽，剂量为2.6mg/kg。在一些方法中，每疾病发作期，施用一次剂量。在一些方法中，施用剂量，不共施用抗炎药。

本发明也提供了治疗或预防由兴奋性神经毒性介导的疾病的方法，包括对患有该病或具有罹患该病风险的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2B结合和/或PSD-95与nNOS结合的药剂，其中药剂被连接到内化肽(internalization peptide)，药剂通过静脉输注5-15分钟的时间来施用。在一些方法中，连接到内化肽的药剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6)的肽，施用时间为5分钟。在一些方法中，药剂的剂量大于1mg/kg。在一些方法中，药剂的剂量为2-3mg/kg。在一些方法中，药剂的剂量为2.6mg/kg。在一些方法中，剂量不超过50mg/kg，前提是如果剂量大于3mg/kg，则该剂量与抗炎药共施用。在一些方法中，施用剂量，不共施用抗炎药。在一些方法中，受试者患有中风。在一些方法中，受试者正在经历手术，可选地，治疗动脉瘤的血管内手术。

本发明还提供了抑制神经手术或血管内手术(无论其是否发生在CNS中)中的缺血性损伤的方法，包括对经历神经手术的患者施用有效给药方案的抑制PSD-95与NMDAR 2B结合的化学剂。在一些方法中，神经手术为诊断性脑血管造影术。在一些方法中，神经手术为治疗动脉瘤的血管内手术。在一些方法中，在血管内手术之前施用化学剂。在一些方法中，在完成血管内手术后1小时内施用化学剂。在一些方法中，血管内手术包括向动脉瘤中置入线圈(coil)。在一些方法中，血管内手术包括将支架(stent)置入有动脉瘤的血管中。在一些方法中，血管内手术包括置入微导管(microcatheter)。

本发明提供了对药剂进行临床试验的方法，包括对经历脑动脉瘤血管内手术的患者群体施用药剂，并将这些患者中手术损伤效应的频率与经历血管内手术而没有施用药剂的对照患者进行比较，以确定药剂是否降低了损伤效应。在一些方法中，通过脑梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。一些方法还包括在中风的动物模型中测试药剂。一些方法还包括在患有中风的人类患者中测试药剂。一些方法还包括标记药剂用于治疗中风。在一些方法中，药剂抑制PSD95与NMDAR 2B和/或PSD-95与nNOS的结合。

本发明还提供了测试药剂的方法。这些方法包括：(a)将微粒(particles)置入到灵长类动物的脑血管中；(b)给灵长类动物施用药剂；以及(c)将此灵长类动物的损伤效应与没有用化合物处理的对照灵长类动物进行比较。在一些方法中，通过梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。在一些方法中，通过MRI或CAT扫描来确定梗死。在一些方法中，通过与对照灵长类动物比较灵长类动物的行为症状来评估损伤效应。一些方法还包括在恢复期后对同样的灵长类动物重复步骤(a)-(c)，条件是在重复步骤(a)-(c)中测试的药剂可以与在之前进行步骤(a)-(c)时的相同或可以不同。一些方法还包括重复步骤(a)-(c)，但是其中对照灵长类动物接受药剂且将之前接受了药剂的动物作为对照动物。在一些方法中，药剂抑制PSD-95与NMDAR 2B和/或PSD-95与nNOS的结合。一些方法还包括对人中风受试者施用药剂。一些方法还包括对经历动脉瘤血管内手术的人受试者施用药剂。在一些方法中，在将微粒置入到脑血管中之后施用药剂。在一些方法中，在将微粒置入到脑血管中之前施用药剂。在一些方法中，微粒为100微米的聚苯乙烯球体。在一些方法，对灵长类动物施用20个球体。在一些方法中，灵长类动物为猕猴。

本发明还提供了冻干的组合物，所述组合物包含具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6)的肽，其从在GMP条件下制备的于生理盐水中的肽溶液冻干而来。

本发明还提供了储存药物组合物的方法，所述方法包括将包含具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6)的肽的药物组合物，于生理盐水中，以10-30mg/ml的浓度，在GMP条件下于低于0℃储存至少2年的时间。可选地，浓度为18-20mg/ml。一些方法还包括对患者施用药物组合物。

附图简述

图1显示，在对照动物中注射球体后24小时，梗死的弥散加权MRI扫描，与接受了血管内手术以置入线圈来修复动脉瘤的人进行比较。上部显示在44岁的女性中于动脉瘤线圈置入后48小时的扩散缺陷。下部显示在雄性食蟹猴(Cynomolgus macaque)中注射20x 100um聚苯乙烯微球后24小时的扩散缺陷。

图2比较经治疗的动物和对照动物中MRI可见梗死的数量和体积。

图3显示有关皮层中梗死的与图2类似的数据。

图4显示按50mg/kg以及输注时间3分钟或60分钟施用Tat-NR2B9c后的血压变化。

图5显示，对于7.6mg/kg Tat-NR2B9c的5分钟输注而非1小时输注(最右栏)，与盐水安慰剂相比，治疗后24小时所测定的梗死的大小显著降低。

定义

“嵌合肽”是指天然不彼此连接的两个肽组分作为融合蛋白或通过化学键互相连接而成的肽。

“融合”蛋白或多肽是指复合的多肽，即单一的连续氨基酸序列，其由通常不以单一多肽序列的形式融合在一起的两个(或更多个)不同的、异源的多肽组成。

术语“PDZ结构域”是指约90个氨基酸的模块蛋白质结构域，其特征在于与脑突触蛋白PSD-95、果蝇的分隔连接蛋白Discs-Large(DLG)、和上皮紧密连接蛋白ZO1(ZO1)具有显著的序列同一性(例如，至少60％)。PDZ结构域也被称作Discs-Large同源重复序列(“DHRs”)和GLGF重复序列。通常，PDZ结构域表现出维持核心共有序列(Doyle，D.A.，1996，Cell 85：1067-76)。示例性的包含PDZ结构域的蛋白质和PDZ结构域序列公开于美国申请号10/714,537，在此就其全部内容通过参考引用并入本文。

术语“PL蛋白”或“PDZ配体蛋白”是指与PDZ-结构域形成分子复合物的天然蛋白质，或是指其羧基端，当与全长蛋白质分开来表达时(例如，作为3-25个残基的肽片段，例如3，4，5，8，9，10，12，14或16个残基)，形成这样的分子复合物的蛋白质。可以对分子复合物进行体内观察，或者使用描述于例如美国申请号10/714,537中的“A分析法”或“G分析法”进行体外观察。

术语“NMDA受体”或“NMDAR”是指已知与NMDA相互作用的膜相关蛋白(包括以下所描述的各种亚基形式)。该受体可以是人的或非人的(例如，小鼠、大鼠、兔、猴)。

“PL基序”是指PL蛋白的C末端氨基酸序列(例如C末端3，4，5，6，7，8，9，10，12，14，16，20或25个连续的残基)(“C末端PL序列)或已知结合PDZ结构域的内部序列(“内部PL序列”)。

“PL肽”是包含特异地与PDZ结构域结合的PL基序、或由PL基序组成、或基于PL基序的肽。

术语“分离的”或“纯化的”意思是指，目标物(例如，肽)已经从存在于样品中的污染物中纯化出来，所述样品例如从天然来源获得的包含目标物的样品。如果目标物被分离或纯化，则其是于样品中存在的主要大分子(例如，多肽)(即，基于摩尔计，其在组合物中比任何一种其它物更加丰富)，以及优选地，目标物占存在的所有大分子物的至少约50％(基于摩尔计算)。通常，分离的、纯化的或基本上纯的组合物占存在于组合物中的所有大分子物的80％以上至90％。最优选地，目标物被纯化至基本同质(即，以常规检测方法在组合物中不能检测到污染物)，其中组合物基本上由单一一种大分子组成。术语分离的或纯化的不必排除旨在与分离物联合起作用的其它组分的存在。例如，内化肽可以被描述为分离的，尽管其与活性肽连接。

“肽模拟物”是指合成的化学化合物，所述化合物具有与天然氨基酸组成的肽基本相同的结构和/或功能特征。肽模拟物可以完全包含氨基酸的合成的非天然类似物，或可以为部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。肽模拟物也可以包含任何数量的天然氨基酸保守性替换，只要这样的替换不实质性改变模拟物的结构和/或抑制或结合活性。多肽模拟组合物可以包含任何组合的非天然结构组分，所述非天然结构组分典型来自3类结构基团：a)非天然酰胺键(“肽键“)连接的残基连接基团；b)代替天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构模拟(即诱导或稳定二级结构)的残基，所述二级结构例如，β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象等。在包含活性肽和内化肽的嵌合肽的肽模拟物中，活性部分或内化部分或两者均可以为肽模拟物。

术语“特异性结合”是指两个分子例如配体和受体间的结合，其特征在于即使在许多其它不同分子存在的条件下，一个分子(配体)也具有与另一个特定的分子(受体)结合的能力，即在非均质的分子混合物中，一种分子表现出和另一种分子的优先结合。配体和受体的特异性结合也可以通过在存在过量未标记配体时可检测标记的配体与受体的结合减少(即结合竞争试验)，而证明。

兴奋性神经毒性是神经元由于兴奋性神经递质谷氨酸的受体(例如NMDA受体(例如，NMDAR 2B))的过度激活而被损伤或杀死的病理学过程。

术语“受试者”或“患者”包括人和兽医动物，例如哺乳动物。

术语“剂/化学剂”(agent)包括任何化合物，包括具有或不具有药物活性的化合物、天然化合物、合成的化合物、小分子、肽和肽模拟物。

术语“药剂”是指具有药理学活性的化学剂。药剂包括为已知药物的化合物、药理学活性已经被鉴定但正在动物模型或临床试验中进行进一步治疗性评估的化合物。嵌合剂包括与内化肽连接的药剂。如果一种化学剂在筛选系统中表现出活性，表明该活性剂在疾病的预防或治疗中有用或可能有用，则该化学剂可以被描述为具有药理学活性。筛选系统可以是体外的、细胞的、动物或人。化学剂可以被描述为具有药理学活性，尽管可能需要进一步的测试来确立其在疾病治疗中实际的预防或治疗效用。

Tat肽是指包含GRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)或由其组成的肽，其中在该序列中不超过5个残基被缺失、替换或插入，保留了其促进所连接的肽或其它化学剂吸收到细胞中的能力。优选地，任何氨基酸改变为保守替换。优选地，任何替换、缺失或内部插入合计起来使肽保留净的阳离子电荷，优选地与以上序列的电荷相似。Tat肽的氨基酸可以用生物素或类似的分子衍生化以减轻炎症反应。

将连接到内化肽的药剂与抗炎药进行共施用的意思是，这两种化学剂的用药时间足够接近，从而抗炎药可以抑制由内化肽诱导的炎症反应。

统计上显著是指p值小于0.05，优选地小于0.01，以及最优选地小于0.001。

疾病的发作期是指存在疾病的病征和/或症状的时期，该时期穿插在没有病征和/或症状、或病征和/或症状表现较轻的更长时期之中。

发明详述

I.概要

本发明提供了动物模型和临床试验，用于评估化学剂在治疗或预防中风和其它神经疾病中的潜在用途。本发明也提供了该化学剂临床应用的优选剂量、输注方案和药物组合物。

II.用于治疗疾病的化学剂

尽管在以下所描述的动物模型或临床试验中可以对任何化学剂(包括在以前的中风临床试验中失败了的化学剂)进行功效筛选，但优选类型的化学剂抑制PSD-95和一种或多种NMDARs之间的相互作用。这样的化学剂可以用于减轻至少部分由NMDAR兴奋性神经毒性介导的中风和其它神经病学状况的损伤效应。这样的化学剂包括肽，所述肽具有包含或基于NMDA受体的PL基序或PSD95的PDZ结构域的氨基酸序列。这样的肽也可以抑制PSD-95和nNOS以及其它谷氨酸受体(例如，钾盐镁矾(kainite)受体或AMPA受体)，例如KV1-4和GluR6，之间的相互作用。优选的肽抑制突触后密度蛋白95(PSD-95)的PDZ结构域1和2(人氨基酸序列由Stathakism提供，Genomics 44(1)：71-82(1997))与一或多种NMDA受体2亚基的C末端PL序列之间的相互作用，所述NMDA受体2亚基包括神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR2B亚基(Mandich等，Genomics 22，216-8(1994))。NMDAR2B的GenBank识别号为4099612、其具有C末端20个氨基酸FNGSSNGHVYEKLSSIESDV(SEQ IDNO：11)和PL基序ESDV(SEQ ID NO：12)。优选的肽抑制人PSD-95和人NMDAR受体。然而，对于这些蛋白质的物种变体，也能够显示出抑制作用。可以使用的NMDA和谷氨酸受体的列表显示如下：

表1：具有PL序列的NMDA受体

一些肽抑制PSD-95与多个NMDAR亚基之间的相互作用。在这种情况下，对肽的利用不一定需要理解这些不同的NMDARs各自对兴奋性神经传递的贡献。其它的肽对单一NMDAR是特异性的。

肽可以包括或基于来自任何以上亚基的C末端的PL基序，并具有包含[S/T]-X-[V/L]的氨基酸序列。该序列优选存在于本发明的肽的C末端。优选的肽具有在其C末端包含[E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L](SEQ IDNO：38)的氨基酸序列。示例性肽包括：ESDV(SEQ ID NO：12)，ESEV(SEQ ID NO：29)，ETDV(SEQ ID NO：39)，ETEV(SEQ ID NO：40)，DTDV(SEQ ID NO：41)，和DTEV(SEQ ID NO：42)作为C末端氨基酸。两个特别优选的肽是KLSSIESDV(SEQ ID NO：5)和KLSSIETDV(SEQ IDNO：43)。这样的肽通常具有3-25个氨基酸(在没有内化肽的情况下)，优选的肽长度为5-10个氨基酸，特别是9个氨基酸(也在没有内化肽的情况下)。在一些这样的肽中，所有的氨基酸(不包括来自内化肽的氨基酸)都来自NMDA受体的C末端。

其它抑制PDS95与NDMARs之间相互作用的肽包括来自PSD-95的PDZ结构域1和/或2的肽或任何这些肽的亚片段，所述亚片段抑制PSD-95与NMDA受体(例如NMDA 2B)之间的相互作用。这样的活性肽包含来自PSD-95的PDZ结构域1和/或PDZ结构域2的至少50，60，70，80或90个氨基酸，这些氨基酸大概位于Stathakism，Genomics 44(1)：71-82(1997)提供的PSD-95(人序列)或NP_031890.1，GI：6681195(鼠序列)的第65-248位氨基酸中、或其它物种变体的对应区域。

本发明的肽和肽模拟物可以包含修饰的氨基酸残基，例如N-烷基化的残基。N端烷基修饰可以包括，例如N-甲基，N-乙基，N-丙基，N-丁基，N-环己基甲基，N-环己基乙基，N-苯甲基，N-苯乙基，N-苯丙基，N-(3，4-二氯苯基)丙基，N-(3，4-二氟苯基)丙基，以及N-(萘-2-基)乙基)。

Bach，J.Med.Chem.51，6450-6459(2008)和WO 2010/004003描述了一系列NMDAR 2B 9c的类似物。具有仅3个C末端氨基酸(SDV)的肽显示出PDZ结合活性。Bach也报道了具有包含YtSXV(SEQ ID NO：68)或由其组成的氨基酸序列的类似物，其中t和S为替代性氨基酸(alternative amino acids)，Y选自E，Q和A，或其类似物，X选自A，Q，D，N，N-Me-A，N-Me-Q，N-Me-D和N-Me-N，或其类似物。可选地，肽在P3位置(自C末端起第3个氨基酸，即由tS占据的位置)被烷基化。肽可以以环己烷或芳族取代基进行N-烷基化，并进一步地在取代基和肽或肽类似物的末端氨基之间包含间隔基团，其中间隔基为烷基，优选地选自亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基。芳族取代基可以为萘-2-基部分、或以一个或两个卤素和/或烷基基团取代的芳香环。

也可以掺入不对活性产生不利影响的其它修饰，这些修饰包括以D异构体形式的氨基酸替代一个或多个天然L异构体形式的氨基酸。因此，任何以L构型天然存在的氨基酸(根据该化学实体的结构，其也可以被称为R或S)均可以被手性相反的但化学结构类型相同的氨基酸或肽模拟物(通常被称为D型氨基酸，但可以另外被称为R或S型)替代。因此，肽模拟物可以包括1，2，3，4，5个、至少50％、或100％的D-氨基酸残基。包含一些或所有D残基的肽模拟物有时被称为“反转”肽(inversopeptide)。

肽模拟物也包括逆向肽(retro peptides)。逆向肽具有反向的氨基酸序列。肽模拟物也包括逆向反转肽(retro inverso peptide)，其中氨基酸的顺序是反向的，由此，原来的C末端氨基酸出现在N末端，并且以D型氨基酸代替了L型氨基酸。WO 2008/014917描述了具有氨基酸序列vdseisslk-rrrqrrkkrgyin(SEQ ID NO：69)(小写字母表示D型氨基酸)的Tat-NR2B9c的逆向反转类似物，并报道了其对脑缺血的有效抑制。在本文中描述的另一个有效的肽为Rv-Tat-NR2B9c(RRRQRRKKRGYKLSSIESDV；SEQ ID NO：70)。

可以使用接头(例如，聚乙二醇接头)使肽或肽模拟物的活性部分进行二聚化，以增强其对包含串联PDZ结构域的蛋白质的亲和性和选择性。见例如，Bach等，(2009)Angew.Chem.Int.Ed.48：9685-9689和WO 2010/004003。包含PL基序的肽优选地通过连接两个这样的分子的N末端来进行二聚化，而使C末端处于自由状态。Bach还报道了来自NMDAR 2B的C末端的五肽IESDV(SEQ ID NO：71)有效抑制NMDAR2B与PSD95的结合。可选地，可以以串联的方式加入约2-10个拷贝的PEG作为接头。

如果期望的话，在以本申请描述的灵长类动物和临床试验进行测试之前，可以使用以前描述的大鼠中风模型来确认肽、肽模拟物或其它化学剂的合适的药理学活性。也可以使用描述于例如US 20050059597(通过参考引用并入本文)中的分析法，对肽或肽模拟物抑制PSD-95和NMDAR2B之间相互作用的能力进行筛选。在这样的分析中，有用的肽典型地具有小于50μM，25μM，10μM，0.1μM或0.01μM的IC50值。优选的肽典型地具有0.001至1μM之间的IC50值，更优选地为0.05至0.5或0.05至0.1μM。当肽或其它化学剂被表征为抑制一种相互作用(例如，PSD-95与NMDAR2B之间的相互作用)的结合时，这样的描述不排除该肽或化学剂也抑制另外的相互作用，例如抑制PSD-95结合到nNOS。

可以任选地对肽例如刚才所描述的肽进行衍生化(例如，乙酰化、磷酸化和/或糖基化)，以提高该抑制剂的结合亲和力、提高抑制剂跨细胞膜运输的能力或提高稳定性。作为一个具体的例子，对于其中自C末端起第3个残基为S或T的抑制剂，在利用该肽之前，该残基可以被磷酸化。

药剂也包括小分子，所述小分子抑制PSD95和NMDAR 2B之间的相互作用、和/或以上所描述的其它相互作用。合适的小分子抑制剂描述于WO/2009/006611中。示例性的合适化合物类型具有下式：

其中R¹选自以0-4个R⁷取代的环己基，以0-4个R⁷取代的苯基，-(CH₂)_u-(CHR⁸R⁹)，支链C_1-6烷基(异丙基、异丁基、1-异丙基-2-甲基-丁基、1-乙基-丙基)和-NH-C(O)-(CR¹⁰R¹¹)_vH；

每一个R⁷独立地选自C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，-C(O)R¹²，OH，COOH，-NO，N取代的二氢吲哚和细胞膜易位肽；

每一个R⁸和R⁹独立地选自H、OH、环己烷、环戊烷、苯基、取代的苯基、以及环戊二烯；

每一个R¹⁰和R¹¹独立地选自H、环己烷、苯基和细胞膜易位肽；

R¹²选自C_1-6烷基和芳基；并且每个u和v独立地为0至20；

其中R²，R³，R⁴，R⁵和R⁶中的一个为-COOH，并且R²，R³，R⁴，R⁵和R⁶中的其余几个各自独立地选自F，H，OCH₃和CH₃。

一个这样的化合物为0620-0057，其结构为：

可以将药剂与内化肽连接，以促进吸收到细胞中和/或跨过血脑屏障。内化肽是一类熟知的、可以使许多细胞的或病毒的蛋白质穿过膜的、相对较短的肽。内化肽(也被称为细胞膜转导肽或细胞穿透肽)可以具有例如5-30个氨基酸。这样的肽典型地具有阳离子电荷，所述阳离子电荷来自高于正常表现(与一般蛋白质相比较)的精氨酸和/或赖氨酸残基，这被认为可以促进穿膜。一些这样的肽具有至少5，6，7或8个精氨酸和/或赖氨酸残基。其例子包括触角足蛋白(Bonfanti，Cancer Res.57，1442-6(1997))(及其变体)、人类免疫缺陷病毒的tat蛋白、VP22蛋白、单纯疱疹病毒1型的UL49基因的产物、Penetratin、SynB1和3、Transportan、Amphipathic、gp41NLS、polyArg，以及几种植物和细菌蛋白质毒素，例如蓖麻毒素、相思豆毒素、蒴莲根毒蛋白、白喉毒素、霍乱毒素、炭疽毒素、热不稳定毒素和绿脓假单胞菌外毒素A(ETA)。其它的例子描述于以下参考文献中(Temsamanl，Drug Discovery Today，9(23)：1012-1019，2004；De Coupade，Biochem J.，390：407-418，2005；Saalik，BioconjugateChem.15：1246-1253，2004；Zhao，Medicinal Research Reviews 24(1)：1-12，2004；Deshayes，Cellular and Molecular Life Sciences 62：1839-49，2005)(所有文献均通过参考引用并入本文)。

优选的内化肽为来自HIV病毒的tat。在以前的工作中报道的tat肽包含在HIV Tat蛋白中发现的标准氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQID NO：2)或由其组成。如果在这样的tat基序的侧翼存在额外的残基(除了该药剂以外)，这些残基可以为例如来自tat蛋白的位于该片段侧翼的天然氨基酸；或为典型地用来连接两个肽结构域的间隔或接头氨基酸，例如gly(ser)₄(SEQ ID NO：44)，TGEKP(SEQ ID NO：45)，GGRRGGGS(SEQ ID NO：46)或LRQRDGERP(SEQ ID NO：47)(见，例如Tang等(1996)，J.Biol. Chem.271，15682-15686；Hennecke等(1998)，Protein Eng.11，405-410))；或可以为不显著降低在无侧翼残基的情况下赋予变体的吸收能力的任何其它氨基酸。优选地，在YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：2)的任一侧，除了活性肽以外的侧翼氨基酸的数量不超过10个。一个包含位于YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：2)C末端侧翼的额外氨基酸残基的合适tat肽为YGRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO：48)。然而，优选地，不存在侧翼氨基酸。其它可以利用的tat肽包括GRKKRRQRRRPQ(SEQID NO：4)和GRKKRRQRRRP(SEQ ID NO：72)。

WO/2008/109010中描述了与N型钙通道结合能力减弱的以上tat肽的变体。这样的变体可以包含氨基酸序列XGRKKRRQRRR(SEQ IDNO：49)或由其组成，其中X为除了Y以外的氨基酸、或为空缺(在此情况下，G为自由N末端残基)。优选的tat肽的N末端Y残基被F替换。因此，优选包含FGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：3)或由其组成的tat肽。另一个优选的变体tat肽由GRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)组成。另一个优选的tat肽包含RRRQRRKKRG(SEQ ID NO：70的第1至11位氨基酸)或由其组成。促进药剂的吸收而不抑制N型钙通道的其它tat衍生肽包括列于以下表2中的那些肽。

表2：

X-FGRKKRRQRRR(F-Tat)(SEQ ID NO：3)
	X-GKKKKKQKKK (SEQ ID NO：50)
X-RKKRRQRRR  (SEQ ID NO：51)
	X-GAKKRRQRRR (SEQ ID NO：52)
X-AKKRRQRRR  (SEQ ID NO：53)
	X-GRKARRQRRR (SEQ ID NO：54)
X-RKARRQRRR  (SEQ ID NO：55)
	X-GRKKARQRRR (SEQ ID NO：56)
X-RKKARQRRR  (SEQ ID NO：57)
	X-GRKKRRQARR (SEQ ID NO ：58)
X-RKKRRQARR  (SEQ ID NO：59)
	X-GRKKRRQRAR (SEQ ID NO：60)
X-RKKRRQRAR  (SEQ ID NO：61)
	X-RRPRRPRRPRR(SEQ ID NO：62)
X-RRARRARRARR(SEQ ID NO：63)
	X-RRRARRRARR (SEQ ID NO：64)
X-RRRPRRRPRR (SEQ ID NO：65)
	X-RRPRRPRR   (SEQ ID NO：66)
X-RRARRARR   (SEQ ID NO：67)

X可以表示自由氨基末端、一个或多个氨基酸、或缀合的部分。可以以反转或逆向或逆向反转的形式使用内化肽，其中连接的肽或肽模拟物是或不是这样的形式。例如，优选的嵌合肽具有包含RRRQRRKKRGY-KLSSIESDV(SEQ ID NO：70)或由其组成的氨基酸序列。

可以通过常规方法将内化肽连接到药剂上。例如，可以通过化学连接(例如通过偶联或缀合剂)将药剂连接到内化肽上。许多这样的化学试剂可以商业获得，并由S.S.Wong进行了综述(蛋白质缀合和交联化学，CRC出版社(1991))。交联试剂的一些例子包括J-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)或N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺；N，N′-亚乙基-双-(碘代乙酰胺)或其它具有6至11个碳亚甲基桥的试剂(其对巯基基团相对特异)；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成不可逆的连接)。其它的交联试剂包括p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯基砜(其与氨基和酚基形成不可逆连接)；己二酰亚氨酸二甲基酯(其对氨基基团特异)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要与氨基基团起反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或偶氮苯基-p-二异硫氰酸酯(其主要与氨基基团起反应)；戊二醛(其与几种不同的侧链起反应)和disdiazobenzidine(其主要与酪氨酸和组氨酸起反应)。

当药剂为肽时，可以通过产生融合蛋白来获得与内化肽的连接，所述融合蛋白包含融合到，优选地在其N末端融合到，内化肽的肽序列。

药理学肽(可选地，与tat肽融合)可以通过固相合成或重组方法来合成。可以使用多种描述于科学和专利文献中的程序和方法，合成肽模拟物，这些文献例如，有机合成合辑(Organic Syntheses Collective Volumes)，Gilman等(编辑)John Wiley&Sons，Inc.，NY；al-Obeidi(1998)Mol.Biotechnol.9：205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1：114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.3：17-27；Ostresh(1996)Methods Enzymol.267：220-234。

III.非人灵长类动物模型

如在背景部分所描述，先前几个针对中风治疗的药剂临床试验已经失败了，尽管这些化学剂在中风的低等动物(例如大鼠)模型中显示出有希望的结果。在非人灵长类动物中进行类似的模型试验将为化学剂在人中的表现提供更好的指示，并因此可能节省花费在不成功的临床试验上的精力和费用。然而，在大鼠中进行的实验类型通常涉及处死动物，并因此当在灵长类动物中实施到评估化学剂所需程度时将是不道德的和/或是过度昂贵的。

本申请提供了脑缺血疾病的灵长类动物模型，该模型不需要处死该灵长类动物，并对灵长类动物只产生轻微的(如果有的话)永久性伤害。通过向灵长类动物的脑血管中导入微粒来诱导脑缺血。可以通过血管内手术导入微粒，所述血管内手术类似于在人身上进行的手术，例如用于治疗动脉瘤的手术。所使用的微粒直径可以为约50-200微米，优选为75-150微米或100微米。所导入的微粒的数量可以为例如1-100个、或10-30个，优选为每只动物约20个。微粒的数量和大小会增加中风的严重性。例如，400微米大小的微粒可导致中风到大动物不能恢复。来自Polysciences公司的聚苯乙烯微球是合适的。在模型中可以使用任何类型的非人灵长类动物，例如猕猴、狨猴、狒狒或黑猩猩。可以对任何化学剂进行测试，包括以上所描述的那些或本领域中以前在动物模型或临床试验中测试过的那些。

可以通过例如MRI、CAT扫描和/或从行为上对导入微粒的效果进行评估。MRI分析显示，导入微粒通常会在微粒所在位置的周围诱导出几个小梗死。MRI分析优选为弥散加权的(DW-MRI)。弥散加权MRI是对中风进行成像分析的标准技术，在该技术中，梗死比其周围组织显得更暗。使用双极性梯度脉冲(bipolar gradient pulse)和合适的脉冲顺序可以获得弥散加权影像(在该影像中，快速质子扩散区域可以与慢扩散区域区分开)。弥散加权影像对于鉴定任何急性缺血区域和将急性梗死与老的中风及其它脑部慢性变化区分开来特别有用。只有急性梗死在弥散影像上呈现出超强度。

梗死的外观与经历修复动脉瘤的血管内手术的人受试者中常见的梗死类似。可以在例如导入微粒后4小时、24小时或14天后对梗死进行评估。典型地，注射20个100微米的微球产生12至14个可被MRI成像检测的梗死。典型地，这样的梗死所占据的脑体积为每个约5-10mm³，或总计约60-70+/-30mm³。在经历血管内手术的人受试者中梗死更大，典型地直径为5-10mm，对应于每个约0.5-1.5cm³。

可以在微粒导入之前、期间或之后给灵长类动物施用药剂。在一些方法中，于导入微粒后0-3或1-3小时窗内施用药剂。在其它方法中，于导入微粒前0-3小时施用药剂。通常，与药剂的施用平行，给也接受微粒的对照灵长类动物施用媒介物(例如PBS)。

通过在治疗的灵长类动物或治疗的灵长类动物群体和对照或对照灵长类动物群体之间比较梗死的数量、体积和/或外观和/或行为特征，评估治疗的效果。与对照灵长类动物(群体)相比较，在治疗的灵长类动物(群体)中梗死的数量和/或体积的减少表示，该化学剂具有潜在地可以用于治疗中风和其它部分由兴奋性神经毒性介导的疾病的活性。

用于在非人灵长类动物中进行认知功能或神经损伤评估的多种方法已经被描述(见Marshall等，Stroke 2003，34：2228-2233；Stroke 2001，32：190-198；Brain Res Bull 2003，61：577-585；Hatsopoulos等，ProcNatl Acad Sci U S A1998，95：15706-15711；Spetzler等，Neurosurgery1980，7：257-261；Barbay等，Exp Brain Res 2006，169：106-116)。一个示例性实验包括：训练猴子以它们的上肢采用平面伸臂动作，目视引导计算机屏幕上的光标从中心保持位置到位于径向的目标位置。移动光标至目标位置的时间提供了对认知功能或相反地神经损伤的量度。

在对治疗动物和对照动物进行的分析完成后，动物被给予一段时期以恢复，在此期间来自梗死的弥散加权MRI信号消失。此时期典型地为约10-14天。在最初置入微珠后约14-28天后，可选地重复进行该操作程序，其中以治疗动物作为对照且反过来将对照用于治疗。该程序在治疗动物和对照动物之间的交叉重复可以用于消除由于特定动物的异常导致的任何结果偏差。按照这样的重复操作程序，可以从仅包括10只灵长类动物的试验中获得可靠的结果。每只灵长类动物可以经历至少5个循环的微粒置入，然后继续正常生活而具有轻微的(如果有的话)永久性神经损伤。

此实验模型尤其可以用于评估药剂在中风治疗中的应用、以及作为辅助剂在涉及对脑部供血的血管进行的任何操作的手术方法中，特别是脑动脉瘤的血管内修复中的应用。此试验也提供了有关药剂在治疗其它疾病和失调中的适用性的有用指示，所述疾病和失调的特征在于脑缺血和/或由兴奋性神经毒性介导。如果药剂在该灵长类动物试验中抑制梗死形成或神经病学行为障碍，该药剂可以被用于在人类临床试验中进行测试，例如在中风受试者中、或在经历脑动脉瘤血管内修复的受试者上进行的试验。

IV.临床试验

涉及对大血管例如主动脉弓(心肺转流术)进行操作的手术以及将导管置入颈动脉的手术(例如诊断性和治疗性脑血管造影术)通常造成栓子脱落，从而可能导致不同频率和不同严重度的缺血性中风(由Bendszus综述，Lancet Neurol 2006 April；5(4)：364-722006)。例如，在一项代表性的研究中，对35位连续受试者进行了可选的冠状动脉旁路移植术(CABG)，弥散加权磁共振成像显示，在9位(26％)受试者中出现了新的缺血性损伤(Bendszu等，Arch.Neurol.59(7)：1090-1095，2002)，其中在文献中通过弥散加权MRI(DWI-MRI)估计的新损伤在CABG受试者中高达45％(Knipp等，Eur.J.Cardiothorac.Surg.25(5)：791-80，0 2004)和在经历心脏瓣膜修复术的受试者中高达47％(Knipp等，Eur.J.Cardiothorac.Surg.28(1)：88-962005)。大多数受试者显示出两处或更多处损伤(Knipp等，2004，出处同上)。该效果在经历体外循环(on-pump)或非体外循环(off-pump)CABG的受试者中可见，可能因为这是对损伤性栓子脱落关键的大血管进行的操作。

脑血管造影术本身是导致中风的原因。Bendszus等(Lancet 354(9190)：1594-1597(1999))在经历诊断性或介入性脑血管造影术的受试者中进行了类似的研究。

在一项前瞻性研究中，对91位受试者进行了100例连续的血管造影术(66例诊断性的和34例介入性的手术)，在血管造影术之前和之后进行了弥散加权磁共振成像(MRI)，以对栓塞事件进行评估。在血管造影术之前，通过弥散加权MRI没有发现异常情况。在23位受试者中在23例手术(17例诊断性的，6例介入性的)后，弥散加权MRI显示42处明亮的损伤，其模式与栓塞事件一致。

在对有血管病变病史的受试者进行诊断性血管造影术后，损伤的频率显著高于没有血管危险因素的受试者(44％对13％，p＝0.03)。与诊断性血管造影术相比较，血管内动脉瘤线圈术显著地增加了手术中风的危险。在一项前瞻性研究中，Cronqvist等(Neuroradiology 47(11)：855-73(2005))证明了在40位经历血管内动脉瘤修复术的受试者中37位(92.5％)出现了47次新的缺血性中风。在于University Health Network对47位经历脑动脉瘤神经介入修复的受试者进行的研究中，通过DWI-MRI成像检测到的小缺血性中风的发生率为75％，其中大多数受试者经历至少两个栓塞事件。在大多数病例中，在血管造影术或心肺转流术后发生的中风为小体积圆形损伤，其直径小于20mm，外观与腔隙性中风(lacunar strokes)的类似。尽管它们通常不产生即刻的术后缺陷，但大量文献目前将在一生中获得的轻微中风与认知退化、早发血管性痴呆以及阿尔茨海默病强烈地联系起来(Devasenapathy和Hachinski，Options Neurol 2：61-72(2000)；Merino和Hachinski，Curr Atheroscler Rep 4：285-290(2002)；Di和Hachinski，Curr Opin Investig Drugs 4：1082-1087(2003)；De等，J NeurolSci 231：3-11(2005)；Hachinski，Stroke 38：1396(2007))。

急性缺血性中风折磨着老龄患者群体，这些老龄患者普遍地具有医学共病，例如缺血性心脏病、糖尿病、高血压、以及在后数十年中流行率上升的其它失调。与其它临床试验中通常的情况相比，这类患者群体因而更容易受到药物毒性的伤害。对患有急性缺血性中风的患者进行临床试验的另一困难是他们必须在限制的时间窗内入选试验，他们没有统一接受侵入性监测，以及通常在开始时没有受到麻醉医师的监护。在过去，尽管在早期的试验中候选药物表现出可耐受性，但一些针对急性缺血性中风的临床试验不得不由于在3期中出现的安全问题而终止。

经历颅内动脉瘤手术的患者是测试药剂疗效的合适患者群体，并代表了还未得到满足的医学需求。这样的患者通常年龄较老(动脉瘤发病的诊断高峰在第6个和第7个十年中)，从而概括了最常患急性缺血性中风的患者群体的年龄范围。如上所讨论，绝大多数人中出现至少一个小的梗死。此外，动脉瘤患者的护理标准通常包括麻醉医师的持续监护、以ECG进行的心脏监测、和侵入性监测，需要动脉管进行持续的血压监测和中心(右心房)导管(如果认为必要)，持续监测血氧饱和度和定期测量动脉血气(O2，PCO2，pH)、以及如果需要，血清葡萄糖和电解质。可以在气管内插管和人工通气的情况下给药，提供在心肺功能受损的情况下最大程度的安全，以及能够最大程度地控制所有心脏和通气参数。可以在患者接受来自麻醉医师和其它医疗和医辅人员(包括护理)的1∶1监护的环境下，进行给药和恢复。在临床试验中增加监测和其它安全措施的可行性可以造成更多的机会来检测和处理任何不良反应而不终止临床试验。

可以对在脑供血血管(即连接脑和心脏的血管，例如颈动脉和颈静脉)上或在脑或CNS自身上接受手术操作的任何患者群体进行临床试验，其中所述手术与可测量的梗死形成相关，例如上述描述的手术。也可以对在向视网膜、肾、脊髓或四肢供血的动脉上接受血管内手术的患者进行临床试验。优选的一类患者为经历血管内手术以治疗脑动脉瘤的患者。血管内手术可能需要例如将线圈置入到动脉瘤中或将支架置入与动脉瘤连接的血管中。可以在血管内手术完成之前、之中或之后施用药剂。优选的施用窗口是在完成血管内手术之前30分钟至手术完成之后1小时内。例如，可以在手术完成的0至30分钟内施用药剂。临床试验优选为设有对照的试验，其中一些患者接受药剂，其它患者接受安慰剂或不含药剂的媒介物。可以通过与对照群体相比较在治疗患者中梗死的数量和/或体积上的减少，对药剂的治疗效果进行评估。可以在脑或其它组织(例如，视网膜、肾、脊髓和四肢)中对梗死进行评估(例如，通过MRI)并与以安慰剂处理的患者相比较。也可以通过行为特征来评估神经病学缺陷。也可以测定药代动力学参数，例如测试药物的最大血清浓度、血清半衰期、血清曲线下面积、以及药物的CSF浓度。

在这样的临床试验中进行测试的一些药剂已经在中风或其它脑缺血性疾病的动物模型中进行过先前的测试。动物模型可以是低等动物模型，例如大鼠，或灵长类动物模型，如以上所讨论的。一些药剂也已经在I期人临床试验中经历了安全性评估，例如描述于实施例中。如果药剂在动脉瘤患者中显示出有用活性的证据，则可以在急性中风患者的临床试验中对其进行测试，或可以按常规的临床应用对这样的患者用药。可以进行测试的药剂的种类包括以上所描述的以及在本领域中在中风或脑缺血疾病的动物模型中或在以前的临床试验中进行了测试的药剂。

V.疾病

本发明的药剂可以用于治疗多种疾病，特别是神经疾病，以及尤其是部分由兴奋性神经毒性介导的疾病。这样的疾病和状况包括中风、癫痫、缺氧症、不与中风相关的对CNS的创伤性损伤(例如创伤性脑损伤和脊髓损伤)、其它脑缺血，阿尔茨海默病和帕金森病。其它可用本发明药剂治疗的、未发现与兴奋性神经毒性相关的神经疾病包括焦虑症和疼痛。

中风是由不管什么原因导致的CNS中血液流动受损而引起的疾病。潜在的原因包括栓塞、失血和血栓形成。由于血液流动受损，一些神经元细胞立即死亡。这些细胞释放出它们的组分分子，包括谷氨酸，该组分分子又激活NMDA受体，从而增加了细胞内钙的水平和细胞内酶的水平，结果导致更多的神经元细胞死亡(兴奋性毒性级联放大)。CNS组织的死亡被称为梗死。梗死体积(即由于脑部中风导致死亡的神经元细胞的体积)可以用作由中风引起的病理学损伤程度的指示。症状反应取决于梗死的体积和其在脑中的位置。可以使用残障指数作为有症状的损伤的量度，例如Rankin中风量表(Rankin，Scott Med J；2：200-15(1957))和巴氏指数(Barthel index)。Rankin量表基于如下对患者的总体状况直接进行评估。

表3

巴氏指数基于一系列关于患者执行10项基本日常生活活动的能力的问题，产生0到100的得分，较低的分值表示更大程度的残障(Mahoney等，Maryland State Medical Journal 14：56-61(1965))。

可选地，可以使用NIH中风量表对中风的严重性/结果进行量度，所述NIH中风量表可以从万维网ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf获得。

该量表基于患者执行11类功能的能力，包括对患者的意识，运动、感知和语言功能的水平进行评估。

缺血性中风更具体地是指一类由血液流向脑部受到阻塞所引起的中风。引起这类阻塞的情况最普遍地是在血管内壁上脂肪沉积物的形成。该情况被称为动脉粥样硬化。这些脂肪沉积物可以导致两类梗阻。脑血栓是指在血管阻塞的部位形成的血栓(血块)。“脑栓塞”通常是指在循环系统中别的位置(通常是心脏以及上胸和颈的大动脉)形成的血块。一部分血块随后破碎松散，进入血流并流经脑部血管，直到其到达的血管太小而不能使其通过。栓塞的第二个重要原因是不规律心跳，被称为心房颤动。它造成血块能够在心脏中形成、脱落并移动到脑部的状况。导致缺血性中风的另外潜在原因是失血、血栓形成、动脉或静脉的剥离、心脏停搏、任何原因(包括失血)的休克、和医源性起因，例如，对脑血管或通向脑部的血管的直接手术损伤或心脏手术。所有中风病例中，缺血性中风占约83％。

短暂性缺血发作(TIAs)是较轻微或警示性中风。在TIA中，存在指示缺血性中风的情况，并出现典型的中风警示信号。然而，梗死(血块)短时间存在，并趋于通过正常机制而自身溶解。经历心脏手术的患者尤其具有短暂性脑缺血发作的风险。

出血性中风占约17％的中风病例。其由破裂并导致血液流进周围脑部的脆弱血管引起。血液积累并压迫周围的脑组织。两类通常的出血性中风为脑内出血和蛛网膜下出血。出血性中风由脆弱血管的破裂引起。导致脆弱血管破裂的潜在原因包括高血压性出血，其中高的血压导致血管破裂；或其他导致脆弱血管的原因，例如破裂的脑血管的畸形，包括脑动脉瘤、动静脉畸形(AVM)或海绵状血管畸形。出血性中风也可以由缺血性中风的出血性转化而引起，所述缺血性中风弱化了梗死中的血管；或由包含异常弱的血管的CNS中的原发性或转移性肿瘤的出血引起。出血性中风也可以由医原性原因引起，例如对脑部血管的直接手术伤害。动脉瘤是弱化的血管区域的膨胀。如果不进行治疗，动脉瘤将继续弱化直至其破裂并流血入脑部。动静脉畸形(AVM)是一串异常形成的血管。海绵状血管畸形是静脉畸形，能够导致从弱化的静脉结构的出血。这些血管的任何一个都可能破裂，也导致血液流进脑部。出血性中风也可以由物理创伤引起。在脑的一个部分中的出血性中风可以通过血液的缺乏(在出血性中风中流失)而引起另一个部位的缺血性中风。

一类易于接受治疗的患者为经历手术的患者，所述手术涉及或可能涉及供应脑部、或位于脑部或CNS中的血管。一些例子为经历心肺转流术、颈动脉支架置入术、脑部或主动脉弓冠状动脉的诊断性血管造影术、血管手术或神经手术的患者。这样的患者的更多例子已在以上第IV部分讨论过。特别适合的是患有脑动脉瘤的患者。可以通过多种手术对这样的患者进行治疗，所述手术包括剪掉动脉瘤以阻断血液，或进行血管内手术以小线圈来封闭动脉瘤、或向出现动脉瘤的血管中植入支架、或置入微导管。血管内手术比剪掉动脉瘤具有较小的侵入性，与较好的患者结果相关，但该结果仍然包括高发生率的小梗死。可以用PSD95与NMDAR2B相互作用的抑制剂、特别是以上所描述的化学剂，包括肽YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6，也被称为Tat-NR2B9c)，对这样的患者进行治疗。相对于实施手术的用药时间可以按以上在临床试验中所描述的进行。

VI.有效用药方案

按在患有所治疗疾病的患者中对治愈、减轻疾病的至少一个病征或症状或抑制其进一步恶化有效的用药量、用药频率和施用途径，施用可选地连接到内化肽的药剂。除非另有说明，否则包括连接到内化肽的药剂的嵌合剂的剂量是针对该整个化学剂而不只是针对嵌合剂的药剂组分。治疗有效量意指化学剂的量，与在患有所述疾病或病症而没有以本发明化学剂治疗的患者(或动物模型)对照群体中的损伤相比较，所述量在患有疾病并以本发明化学剂治疗的患者(或动物模型)群体中足以显著地治愈、减轻所治疗疾病或病症的至少一个病征或症状，或抑制其进一步恶化。如果治疗的患者个体获得的结果比没有以本发明方法治疗的可比患者对照群体中的平均结果更有利，则该量也被视为治疗有效的。治疗有效的方案包括按达到预期目的所需要的用药频率和途径来施用治疗有效的剂量。

对于患有中风或其它缺血性病症的患者，化学剂的施用方案包括对降低中风或其它缺血性病症的损伤效应有效的施用量、频率和途径。当需治疗的疾病是中风时，可以通过梗死的体积或残障指数，对结果进行确定，如果治疗的患者个体的残障在Rankin量表上表现为2或以下以及在巴氏量表上表现为75或以上，或如果治疗患者群体比相当的未经治疗的群体在残障量表上显示出显著改善的分值分布(即，较少的残障)，则剂量被视为治疗上有效的，见Lees等，N Engl J Med 2006；354：588-600。单剂的化学剂通常足以治疗中风。

本发明也提供用于在具有失调危险的受试者中预防该失调的方法和组合物。通常，与对照群体相比较，这样的受试者出现失调(例如，病态、不适、失调或疾病)的可能性增加。对照群体例如可以包括随机选自一般群体(例如，按年龄、性别、人种和/或种族进行匹配)、没有被诊断的或具有该失调的家族史的一个或多个个体。如果发现受试者和失调相关“危险因素”间具有联系，则受试者可以被认为具有失调的危险。危险因素可以包括，例如通过对受试者群体进行统计学或流行病学研究而得到的、与给定的失调相关的任何活动、性状、事件或特性。即使鉴别潜在危险因素的研究没有特别地包括该受试者，受试者也可以因此被分类为具有失调风险。例如，经历心脏手术的受试者具有短暂性脑缺血发作的风险，因为与没有经历心脏手术的受试者群体相比较，经历了心脏手术的受试者群体中短暂性脑缺血发作的频率增加。

其它常见的中风危险因素包括年龄，家族史，性别，先前发生过中风，短暂性缺血发作或心脏病发作，高血压，吸烟，糖尿病，颈动脉或其它动脉疾病，心房颤动，其它心脏疾病(例如心脏病、心力衰竭、扩张型心肌病、心脏瓣膜疾病和/或先天性心脏病)，高血胆固醇，以及高饱和脂肪、反式脂肪或胆固醇的饮食。

按足以防止、延缓或抑制疾病的至少一种病征或症状发展的量、频率和途径，给具有患病风险但还没有患病的患者施用可选地连接到内化肽的药剂。在预防上有效的量意思是，与具有患病风险而没有以本发明的嵌合剂进行治疗的对照患者(或动物模型)群体相比较，在具有患病风险并以该化学剂治疗的患者(或动物模型)群体中足以显著防止、抑制或延缓疾病的至少一种病征或症状的化学剂的量。如果治疗患者个体获得的结果比没有以本发明方法治疗的可比患者对照群体中的平均结果更有利，则该量也被视为预防有效。预防有效的方案包括按达到预期目的所需要的用药频率和途径来施用预防有效的剂量。为在有中风的迫切危险的患者(例如，经历心脏手术的患者)中预防中风，单剂的化学剂通常足够了。

随化学剂而定，施用可以是肠胃外的、静脉内的、鼻的、口服的、皮下的、动脉内的、颅内的、鞘内的、腹膜内的、局部的、鼻内的或肌内的。静脉内用药为肽剂优选的。

对于包括内化肽(特别是包含氨基酸序列的HIV tat肽)的嵌合剂，该化学剂的施用可以与或可以不与抗炎药联合(以减少与高水平的内化肽相关的组胺的释放及其下游效应)。用于共施用优选的化学剂为肥大细胞脱粒的抑制剂，例如色甘酸(cromolyn)或洛度沙胺(lodoxamide)或其它列于本文中的抑制剂。也可以使用抗组胺药或皮质类固醇，特别是联合地或以更高剂量使用(见WO2009/076105，61/185,943；提交日：2009年6月10日，以及同此一并提交的代理人卷号026373-000920PC)。

对于人类用药，嵌合剂Tat-NR2B9c的优选剂量为2-3mg/kg，更优选地为2.6mg/kg。所示剂量应被理解为包括在典型的医院条件下可测定的剂量在精度上所固有的误差幅度。该剂量是优选的，因为它是该化学剂可以被施用而在大多数患者中没有显著量的组胺释放和继发后遗症的最大剂量。尽管在更高剂量下的组胺的释放可以通过如以上所讨论的与抗炎药的共施来进行控制而且在任何情况下该组胺的释放通常会自动消退而不产生不良事件，但最好还是通过将剂量保持在3mg/kg以下以避免组胺的释放，优选剂量为2-3mg/kg，更优选地为2.6mg/kg。这样的量为用于单剂施用，即，每疾病发作期一剂。

最好避免组胺的释放不仅是因为众所周知的后遗症(例如血压降低、肿胀和发红)，也因为据报道，在中风的动物模型中控制组胺的释放也能够抑制梗死的形成(WO 04/071531)。相反，尽管较低剂量在具有较慢性的病程的适应症(例如，焦虑、疼痛、阿尔茨海默病、帕金森病)中可以是完全有效的并且甚至是优选的，但是，如果第一次用药被证明是不足或不够的，中风及类似的病症的极度急性的性质可能留给第二次用药的余地极小。因此，在治疗急性表现中，优选在于大多数患者中发生显著的组胺释放之前的水平上或接近该水平，进行单剂用药。

以上所示剂量是针对嵌合剂Tat-NR2B9c(YGRKKRRQRRRKLSSIESDV；SEQ ID NO：6)。可以通过几种方法测定其它化学剂达到同样效果的等效剂量。对于该化学剂中一个或几个氨基酸被替换、插入或删除且分子量维持在约+/-25％以内的近缘变体，上述剂量仍然是合适的指导。然而，通常，对于其它化学剂，等效剂量可以根据含或不含内化肽的化学剂的分子量、如果内化肽存在的话其对靶标的Kd、以及其药代动力学和药效参数而不同。对于一些化学剂，可以计算等效剂量以递送等摩尔量的药剂。对于其它化学剂，进行进一步的调整以考虑在Kd或药物动力学或药效参数上的差异。对于一些化学剂，根据在动物模型或临床试验中达到相同终点所用剂量来凭经验确定等效剂量。

肽剂，例如Tat-NR2B9c，优选通过输注到血管中来进行递送，更优选地通过静脉输液。输液的时间可以影响副作用(例如由于肥大细胞脱粒和组胺的释放)和功效。通常，对于给定的剂量水平，较短的输液时间更有可能会导致组胺的释放。然而，较短的输液时间也可能导致改良的功效。尽管本发明的实施不依赖于对机制的理解，但后一种结果可以解释为：相对于患者病状的发展，延迟将是显著的，以及相对于嵌合剂的血浆半衰期，延迟将是显著的，由此嵌合剂达不到最佳的治疗水平。对于嵌合剂Tat-NR2B9c，在这些因素之间提供平衡的优选输液时间为5-15分钟，更优选为10分钟。所示时间应被理解为包括+/-10％的误差。输液时间不包括任何用于洗脱输注(洗脱已经完成的最初输液的任何残留液滴)的额外时间。用于Tat-NR2B9c的输液时间也可以充当其它药剂的指导，所述其它药剂可选地连接到内化肽，特别是如上所讨论的Tat-NR2B9c近缘变体。

VII.药物组合物

可以以药物组合物的形式施用本发明的嵌合剂或其它化学剂。药物组合物典型地在GMP条件下生产。用于肠胃外给药的药物组合物优选是无菌的(例如，对肽进行过滤除菌)和无致热原的。可以以单位剂量形式(即，用于单次给药的剂量)提供药物组合物。可以使用利于嵌合剂加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂，按常规方式配制药物组合物。合适的配制取决于所选择的给药途径。

嵌合剂Tat-NR2B9c的示例性制剂包括于生理盐水(0.8-1.0％，优选0.9％盐水)中的肽，其浓度为10-30mg/ml(例如18-20mg/ml)。当进行冷冻保存时，这样的组合物在两年或更多年的时间内是稳定的(肽没有显著的降解或聚集)。尽管可以添加额外的赋形剂，不含这样的赋形剂的生理盐水也足以获得该稳定性。为了使用这样的组合物，将其融化并稀释至更大体积的生理盐水中以用于输注到血管中。可以通过对于含或不含赋形剂的生理盐水中浓度为1-50mg/ml的嵌合剂Tat-NR2B9c进行冻干来制备另一种组合物。这样的赋形剂可以包括增加稳定性或抑制细菌、病毒或其它病原体(会降解药物)的生长的物质。冻干的组合物在-20℃或室温下是稳定的。冻干的组合物可以复原于生理盐水中。

实施例

实施例1：缺血性中风的灵长类动物模型

以下实施例在10只猕猴(分为5只测试受试者和5只对照)中进行。使每只动物经历2轮操作程序，其中第一轮中的测试动物在第二轮中充当对照，而第一轮中的对照动物在第二轮中进行测试。

将20个100微米的聚苯乙烯球体递送到每只动物的脑内血管中以诱导栓塞性中风。在导入球体后1小时，以Tat-NR2B9c(2.6mg/kg)或媒介物对照来处理动物。然后，在球体导入后4小时、24小时和14天，对动物进行MRI脑部分析和神经病学检查。

在14-28天后，以测试动物作为对照和以对照作为测试动物来重复该程序。

图1显示与接受了血管内手术来置入线圈以修复动脉瘤的人相比较，在对照动物中球体注射后24小时，梗死的MRI扫描。在人和动物之间，相对于脑大小的梗死数量、大小和外观是相当的。

图2比较了治疗和对照动物中MRI可见的梗死数量和体积。以Tat-NR2B9c治疗显著减少了整个脑部中梗死数量和体积。图3显示了皮层中梗死的类似数据。梗死数量和体积的减少在皮层中比在整个脑部中甚至更大。在皮层中的减少特别重要，因为脑的这个区域主要负责认知功能。

实施例2：输注时间

以50mg/kg的Tat-NR2B9c对大鼠进行给药，输液时间为3分钟或60分钟。图4显示了给药后血压的改变。在输液3分钟的大鼠中，血压降低了约50％，之后经90分钟的时间恢复。对于输液1小时的大鼠，仅有轻微的血压下降，该血压下降也经1小时得到恢复。

也在中风的大鼠模型中比较了不同输液时间的功效，其中成年Sprague Dawley大鼠(10-12周大小)(雄性约300克，雌性约250克)禁食12-18小时，之后在胡须体觉皮层上行大脑中动脉的3个末端分支的永久性软膜血管闭塞(P3VO)。用于该大鼠模型分析的操作程序已描述于WO/2008/008348中。与媒介物相比较，在血管闭塞后，以7.6mg/kg的Tat-NR2B9c进行静脉内给药。比较了两个输液时间，5分钟和1小时。图5显示，在使用5分钟输液而非使用1小时输液时，与盐水安慰剂比较，治疗后24小时测定的梗死大小显著减小。

实施例3：I期临床试验

我们在人中进行了Tat-NR2B9c的安全性、耐受性和药物动力学研究。受试者是最小年龄为18岁的正常的、健康的、不吸烟的男性或绝经后的或手术绝育的女性。对受试者施用Tat-NR2B9c(Lot#：124-134-001B)或给予安慰剂(磷酸缓冲盐水)(Lot#：124-134-001A)，以静脉输液进行给药(10±1分钟)。在组1至3的每一组中对4位受试者用药，在组4至8之每一组中对10位受试者用药。所有62位受试者均完成了研究。

方法

抽血时间点：

在研究期间，在以下时间点从每位受试者收集11份血液样品用于药物动力学分析：0.00(给药前)，给药后0.08(5分钟)，0.17至0.25(10至15分钟，精确地在每个体药物输注结束时)，0.33(20分钟)，0.50，0.75，1.00，2.00，6.00，12.00和24.00小时。此外，在以下时间点从每位受试者收集8份血液样品用于组胺分析：0.00(给药前)，以及给药后0.08(5分钟)，0.17(10分钟)，0.25，0.50，1.00，2.00和24.00小时。

安全性评估

对在研究期间接受了至少一剂药的所有受试者进行安全性评估。按治疗和受试者编号将所有不良事件(AEs)的发生列成表格。也对生命体征的绝对值、心电图(ECG)参数、实验室参数和身体检查结果进行记录，并标出超出正常范围的值。将自基准值的偏移列成表格。利用调查者和药事管理医学词典(MedDRA)术语，对AEs进行记录。

A.结果

在NA 1给药开始后10分钟，在3.75mg/kg剂量组的8位受试者中7位具有高于10nmol/L(平均24.3nmol/L；最高39.8nmol/L)的组胺水平，在NA 1给药开始后15分钟，这些受试者中的3位仍然具有高于10nmol/L(平均15.3nmol/L；最高20.3nmol/L)的组胺水平。

除了3.75mg/kg剂量组以外，没有其它治疗组表现出组胺水平显著异常。安慰剂组和0.375mg/kg剂量组各有一位受试者在1个时间点表现出升高的组胺水平，但是这些结果分别在筛查时以及在用药后2.00小时。在用药24.00小时内，所有异常的组胺结果均回复到正常范围。

在研究期间，参加研究的40位受试者经历了总计168次不良反应。大多数AEs在严重性上是轻微的。46位积极治疗受试者中的34位(73.9％)经历了至少一次AE，而16位安慰剂治疗受试者中的6位(37.5％)经历了至少一次AE。2.60和3.75mg/kg剂量组中的受试者比较低剂量组中的受试者经历显著更多的AEs。没有严重不良反应(SAEs)的报道。接受Tat-NR2B9c的受试者所经历的最普遍的AEs是感觉热(13/46；28.3％)、瘙痒(12/46；26.1％)、潮红(10/46；21.7％)、和口干(9/46；19.6％)。除了血糖增加的2例(由于受试者失访)以外，所有其它AEs均得到消退。

在2.60和3.75mg/kg剂量组中，AEs的发生率高于在安慰剂、0.02、0.08、0.20、0.375、0.75和1.50mg/kg剂量组中的AE的发生率。在Tat-NR2B9c的剂量≥2.60mg/kg时，有几类AEs被频繁报道。它们包括：(1)血压降低，(2)麻刺感(感觉异常)，(3)麻木(感觉减退)，(4)发红(红斑)，(5)发疹，(6)发痒(瘙痒)，(7)口干，(8)恶心，(9)感觉热，和(10)潮红。这些AEs的发作与所研究的药物的施用一致并可能与所研究的药物相关。

在以Tat-NR2B9c对大鼠、狗和灵长类动物进行的临床前试验中，在高剂量组中观察到了升高的组胺水平，这可能是包括肿胀、发红和低血压的副作用的来源。在当前的研究中，在静脉内用药开始后10分钟，在最高剂量组(3.75mg/kg)的8位受试者的7位中，组胺水平升高了，并在用药后15分钟，在这些受试者的3位中保持升高的水平，在此时间后，组胺水平回复到正常范围。在组胺水平升高的相同时段中，在3.75mg/kg剂量组中的大多数AEs被观察到。这表明，升高的组胺水平是最频繁报道的AEs(包括血压降低、麻刺感、麻木、发红、发疹、发痒、口干、恶心、感觉热和潮红)的来源。

实施例4：Tat-NR2B9c在经历神经介入性动脉瘤修复手术的患者中 的临床试验

对功效主要的衡量是MRI可检测的DWI和FLAIR序列——在血管内介入后的阳性损伤——的总体积。如果一些患者中风体积较大，则将这些体积异常值截至最大值10cc，以允许体积更接近正态分布和以标准参数统计进行检测。主要的分析是t检验，其中无效假设为两个处理组(药物对安慰剂)中平均值相等，备择假设为治疗组的平均损伤总体积小于安慰剂组。试验的最大样本量是400，每个处理组为200。

基于来自DWI/FLAIR MRI序列的中风计数，确定静脉内单剂化学剂在减少由血管内处理诱导的栓塞性中风数量上的功效。在治疗组和安慰剂组中，每位患者的中风数量分为如下5类：0(没有中风)、1、2、3和4或更多个中风。

采用来自成套神经认知测验的加权综合分值来测定化学剂在减小手术诱导的血管性认知损害上的能力。

为了确定化学剂在降低大(体积大于10cc)中风的频率上的功效，采用如上的列联表分析，对治疗和安慰剂组中大中风的数量进行比较。

将经历血管内手术的患者中的改良Rankin分值(mRS；范围0至5，其中0表示没有残留症状；5表示卧床不起、需要持续护理)对分为mRS 0至2(表示独立行使功能)和mRS 3或更高(表示死亡或依赖)。将NIH中风量表(NIHSS；分值范围0至42，其中较高的分值表示严重性增加)的数据对分为NIHSS 0-1对2或更高，采用卡方或Fisher精确检验来进行评估。根据患者是否存在蛛网膜下出血，对该分析进行进一步分层。

一旦脑血管瘤的血管内修复完成(典型地在最后一个线圈或支架置入后)和最后的血管造影成像结束后就开始给药。给药时间开始于滴注开始的时间。通过插入到上肢静脉中的静脉导管并使用输液泵[例如FLO-GARD Volumetric输液泵6201或其等同物]，将100毫升袋中的内容物施与受试者来进行给药。在将IV袋中的内容物施用给受试者时，在10±1分钟期间均匀地进行给药。施用IV小型袋中的所有内容物(治疗剂量)。在给药后，使用输液泵施与最少10毫升(不超过15毫升)的盐水以冲洗任何残留在IV管内的药物。

实施例5：剂量准备

将装有于生理(0.9％)盐水中的Tat-NR2B9c或安慰剂的注射小瓶在每个诊所的药房于-20℃保存。在研究受试者入选后，基于药物：安慰剂随机化编码，在药房选择一个或多个(取决于所需总量)Tat-NR2B9c药物或安慰剂注射小瓶并在使用前融化。以受试者编号对用于每一位受试者给药的注射器进行标记，并按以下公式计算从注射小瓶抽取的体积：[2.60mg/kg x受试者的体重(公斤)]/[药物功效(mg/ml)]。这确定了抽取到注射器内的毫升量。将装有Tat-NR2B9c或安慰剂的注射器递送到给药地点并在那儿注射进100毫升0.9％生理盐水滴注袋的IV塞内。

尽管为了理解清楚目的，对本发明进行了详细的描述，但明显的是，可以在所附权利要求的范围内进行某些修改。本申请中引用的所有出版物、登录号和专利文献基于任何目的就其全部内容通过参考引用并入本文，其程度如同逐个地引用。如果有一条以上的序列在不同时间与一个登录号相关，则意味着截止于本申请有效申请日前与该登录号相关的序列。有效申请日是公开所述登录号的最早优先权申请的日期。除非上下文另有说明，本发明的任何元素、实施方案、步骤、特征或方面都可以与任何其它组合起来执行。

Claims (48)

1.治疗或预防由兴奋性神经毒性介导的疾病的方法，所述方法包括给患病或具有患病风险的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR 2B的结合和/或PSD-95与nNOS的结合的药剂，其中当药剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6)的肽时，剂量为2-3mg/kg，如果药剂不是具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽，则剂量递送与2-3mg/kg  具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽等效的有效浓度的该药剂。

2.权利要求1的方法，其中药剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6)的肽，剂量为2.6mg/kg。

3.权利要求1的方法，其中每疾病发作期，该剂量施用一次。

4.权利要求1的方法，其中施用该剂量，不共施用抗炎药。

5.治疗或预防由兴奋性神经毒性介导的疾病的方法，所述方法包括给患病或具有患病风险的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR 2B的结合和/或PSD-95与nNOS的结合的药剂，其中药剂与内化肽连接，且通过静脉内输注5-15分钟来施用该药剂。

6.权利要求5的方法，其中与内化肽连接的药剂为具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6)的肽，且输注时间为5分钟。

7.权利要求6的方法，其中药剂的剂量为1mg/kg以上。

8.权利要求6的方法，其中药剂的剂量为2-3mg/kg。

9.权利要求6的方法，其中药剂的剂量为2.6mg/kg。

10.权利要求6的方法，其中剂量不超过50mg/kg，条件是如果剂量大于3mg/kg，则与抗炎药共施用该剂量。

11.权利要求5的方法，其中施用该剂量，不共施用抗炎药。

12.权利要求5的方法，其中受试者患有中风。

13.权利要求5的方法，其中受试者正经历手术。

14.权利要求13的方法，其中受试者正经历血管内手术以治疗动脉瘤。

15.抑制缺血性损伤的方法，所述缺陷性损伤来自对连接脑和心脏或向肢体、肾脏、视网膜或脊髓供血的血管进行的血管内手术或神经手术，所述方法包括对经历血管的血管内手术或神经手术的受试者按有效方案施用抑制PSD-95与NMDAR 2B的结合的化学剂。

16.权利要求15的方法，其中缺血性损伤来自神经手术，所述神经手术为诊断性脑血管造影术。

17.权利要求15的方法，其中缺血性损伤来自神经手术，所述神经手术为治疗动脉瘤的血管内手术。

18.权利要求15的方法，其中化学剂在血管内手术之前施用。

19.权利要求15的方法，其中化学剂在血管内手术完成的1小时内施用。

20.权利要求15的方法，其中血管内手术包括将线圈置入动脉瘤中。

21.权利要求15的方法，其中血管内手术包括将支架置入有动脉瘤的血管中。

22.权利要求15的方法，其中血管内手术包括插入微导管。

23.对药剂进行临床试验的方法，所述方法包括给在脑血管上或在连接脑和心脏或向肢体、视网膜、肾脏或脊髓供血的血管上接受血管内手术的受试者的群体施用药剂；并将这些受试者中手术的损伤效应的频率与接受血管内手术而没有施用药剂的对照受试者进行比较，以确定药剂是否降低了损伤效应。

24.权利要求23的方法，其中受试者正经历脑动脉瘤的血管内手术。

25.权利要求23的方法，其中通过脑梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。

26.权利要求23的方法，其中通过视网膜、肾脏、脊髓或肢体中梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。

27.权利要求23的方法，所述方法还包括在中风的动物模型中测试药剂。

28.权利要求23的方法，所述方法还包括在患有中风的人受试者中测试药剂。

29.权利要求23的方法，所述方法还包括对用于治疗中风的药剂进行标记。

30.权利要求23的方法，其中药剂抑制PSD95与NMDAR 2B的结合和/或PSD-95与nNOS的结合。

31.测试药剂的方法，包括：

a.将微粒置入灵长类动物的脑血管中；

b.给灵长类动物施用药剂；

c.将步骤(a)中灵长类动物的损伤效应与没有以化合物治疗的对照灵长类动物进行比较。

32.权利要求31的方法，其中通过梗死的数量和/或大小来评估损伤效应。

33.权利要求31的方法，其中通过MRI或CAT扫描来确定梗死。

34.权利要求31的方法，其中通过与对照灵长类动物比较该灵长类动物的行为症状来评估损伤效应。

35.权利要求31的方法，所述方法还包括在恢复期后对相同灵长类动物重复步骤(a)-(c)，条件是在重复步骤(a)-(c)中测试的药剂可以与在之前实施步骤(a)-(c)时的相同或不同。

36.权利要求31的方法，所述方法还包括重复步骤(a)-(c)，但对照灵长类动物接受药剂，以前接受药剂的动物为对照动物。

37.权利要求31的方法，其中药剂抑制PSD-95与NMDAR 2B的结合和/或PSD-95与nNOS的结合。

38.权利要求31的方法，所述方法还包括对人中风受试者施用药剂。

39.权利要求31的方法，所述方法还包括对经历动脉瘤的血管内手术的人受试者施用药剂。

40.权利要求31的方法，其中在向脑血管中置入微粒之后施用药剂。

41.权利要求31的方法，其中在向脑血管中置入微粒之前施用药剂。

42.权利要求31的方法，其中微粒为100微米的聚苯乙烯球体。

43.权利要求42的方法，其中对灵长类动物施用20个球体。

44.权利要求31的方法，其中灵长类动物为猕猴。

45.冻干的组合物，所述组合物包含具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6)的肽，其从在GMP条件下制备的肽于生理盐水中的溶液冻干而来。

46.储存药物组合物的方法，所述方法包括将包含具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO：6)的肽的药物组合物，以于生理盐水中10-30mg/ml的浓度，在GMP条件下于低于0℃储存至少2年的时间。

47.权利要求46的方法，其中浓度为18-20mg/ml。

48.权利要求46或47的方法，所述方法还包括对受试者施用药物组合物。

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