EA044400B1 - Пептидная композиция для лечения повреждений, связанных с возбуждающей нейротоксичностью - Google Patents
Пептидная композиция для лечения повреждений, связанных с возбуждающей нейротоксичностью Download PDFInfo
- Publication number
- EA044400B1 EA044400B1 EA202090802 EA044400B1 EA 044400 B1 EA044400 B1 EA 044400B1 EA 202090802 EA202090802 EA 202090802 EA 044400 B1 EA044400 B1 EA 044400B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- peptide
- buffer
- trehalose
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 125
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 81
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 title description 13
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 title description 13
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 title description 13
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 title description 13
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 title description 13
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 73
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 73
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 69
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 claims description 43
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 43
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 41
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 40
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 38
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 28
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 25
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 24
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims description 20
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid group Chemical group C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 9
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 108700000788 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (47-57) Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 5
- RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 4
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- CVOQYKPWIVSMDC-UHFFFAOYSA-L dipotassium;butanedioate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O CVOQYKPWIVSMDC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 claims description 3
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 55
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 48
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 26
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 26
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 23
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 21
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 101100240646 Scheffersomyces stipitis (strain ATCC 58785 / CBS 6054 / NBRC 10063 / NRRL Y-11545) NMA111 gene Proteins 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 18
- XWQVQFBTSBCKLI-FKXNDIMNSA-N dnc008987 Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 XWQVQFBTSBCKLI-FKXNDIMNSA-N 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 16
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 16
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 15
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 13
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 13
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 13
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 13
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 13
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 12
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 11
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 11
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 10
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 10
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 10
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 10
- 206010008089 Cerebral artery occlusion Diseases 0.000 description 9
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 9
- 108700019745 Disks Large Homolog 4 Proteins 0.000 description 9
- 102000047174 Disks Large Homolog 4 Human genes 0.000 description 9
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 201000007309 middle cerebral artery infarction Diseases 0.000 description 9
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 9
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000014649 NMDA glutamate receptor activity proteins Human genes 0.000 description 8
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 8
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 8
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 8
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 6
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 6
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 6
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 6
- 208000001738 Nervous System Trauma Diseases 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 description 6
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 5
- 102000000470 PDZ domains Human genes 0.000 description 5
- 108050008994 PDZ domains Proteins 0.000 description 5
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 5
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 5
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 208000028412 nervous system injury Diseases 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 102100022630 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 2B Human genes 0.000 description 4
- 101710195187 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 2B Proteins 0.000 description 4
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 4
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 4
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 208000016988 Hemorrhagic Stroke Diseases 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 3
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- AJXONGJARXYRDO-YVNDNENWSA-N (4s)-4-amino-5-[[(2s)-1-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(1s)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AJXONGJARXYRDO-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- UUDAMDVQRQNNHZ-UHFFFAOYSA-N (S)-AMPA Chemical compound CC=1ONC(=O)C=1CC(N)C(O)=O UUDAMDVQRQNNHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 210000000269 carotid artery external Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 2
- -1 dimethyl diethylamine hexanoate Chemical compound 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 2
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 2
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=C(F)C=C1F VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZZPYUKWXDLMGI-UHFFFAOYSA-N 1,6-diisothiocyanatohexane Chemical compound S=C=NCCCCCCN=C=S VZZPYUKWXDLMGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940008841 1,6-hexamethylene diisocyanate Drugs 0.000 description 1
- KHAWDEWNXJIVCJ-UHFFFAOYSA-N 1-fluoro-4-(4-fluoro-3-nitrophenyl)sulfonyl-2-nitrobenzene Chemical compound C1=C(F)C([N+](=O)[O-])=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(C(F)=CC=2)[N+]([O-])=O)=C1 KHAWDEWNXJIVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZGCFXINYYAKJB-UHFFFAOYSA-N 2-iodo-N-[1-[(2-iodoacetyl)amino]ethyl]acetamide Chemical compound C(C)(NC(CI)=O)NC(CI)=O DZGCFXINYYAKJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJBUBXIDMQBSQW-UHFFFAOYSA-N 4-(4-diazoniophenyl)benzenediazonium Chemical compound C1=CC([N+]#N)=CC=C1C1=CC=C([N+]#N)C=C1 HJBUBXIDMQBSQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 206010003173 Arterial rupture Diseases 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 206010003658 Atrial Fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008088 Cerebral artery embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010008132 Cerebral thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010069729 Collateral circulation Diseases 0.000 description 1
- 102000010970 Connexin Human genes 0.000 description 1
- 108050001175 Connexin Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034347 Faecal incontinence Diseases 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 1
- 201000001429 Intracranial Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000805948 Mus musculus Harmonin Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000003443 Unconsciousness Diseases 0.000 description 1
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001627 cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N dipyridamole Chemical compound C=12N=C(N(CCO)CCO)N=C(N3CCCCC3)C2=NC(N(CCO)CCO)=NC=1N1CCCCC1 IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001037 epileptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000968 fibrocartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003883 furosemide Drugs 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N gamma-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000000848 glutamatergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- RRAMGCGOFNQTLD-UHFFFAOYSA-N hexamethylene diisocyanate Chemical compound O=C=NCCCCCCN=C=O RRAMGCGOFNQTLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 201000010849 intracranial embolism Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007654 ischemic lesion Effects 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 210000003977 optic chiasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940090007 persantine Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 208000018655 severe necrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящая заявка в целом относится к области медицины. В частности, в настоящей заявке предложены композиции для лечения повреждений центральной нервной системы и их применение.
Предшествующий уровень техники
Инсульты представляют собой распространенные острые цереброваскулярные болезни у людей среднего возраста и пожилых людей, и имеется тенденция к повреждению более молодых. В современном мире цереброваскулярные болезни относятся к трем самым опасным для людей заболеваниям (раковые заболевания, кардио-цереброваскулярные болезни и диабету). По оценкам, ежегодно в Китае от цереброваскулярных болезней умирает около трех миллионов человек. Это число от 4 до 5 раз выше, чем в США и европейских странах, в 3,5 раза выше, чем в Японии, и даже выше, чем в некоторых развивающихся странах, таких как Таиланд и Индия. Коэффициент заболеваемости этой болезни увеличивается на 8,7% в год. Частота рецидивов превышает 30%, а частота рецидивов в течение пяти лет достигает 54%. Из оставшихся в живых после инсульта 75% утрачивают свою трудоспособность в большей или меньшей степени, а 40% становятся инвалидами.
Инсульты можно условно подразделить на две категории, а именно, ишемические инсульты и геморрагические инсульты, и пациенты с ишемическими инсультами составляют 85% от общего числа пациентов с инсультами. В настоящее время терапевтические лекарственные средства для лечения ишемических инсультов включают главным образом вазодилататоры (такие как персантин), лекарственные средства, улучшающие микроциркуляцию и увеличивающие объем крови (такие как низкомолекулярный декстран), тромболитические лекарственные средства (такие как урокиназа), антикоагулянтные лекарственные средства, лекарственные средства, предотвращающие агрегацию тромбоцитов (такие как аспирин), средства китайской медицины, нейропротекторные агенты и так далее. Однако, поскольку большинство из этих лекарственных средств имеют недостатки, такие как значительные побочные эффекты, возможные риски или недостаточная терапевтическая эффективность, исследование патогенеза инсульта и разработка лекарственных средств, направленных на устранение причин патогенеза, имеют важное социальное значение для предупреждения и лечения возникновения и развития цереброваскулярных болезней.
Инсульты характеризуются гибелью нервных клеток в участках локальной ишемии, церебральной геморрагии и/или травмы. Гибель или повреждения нейронов, вызываемые церебральной ишемией, протекает(ют) в виде каскадного процесса повреждений, т.е. после возникновения церебральной ишемии происходит снижение перфузии тканей кровью, повышение уровня возбуждающих нейромедиаторов, что в свою очередь активирует К-метилЮ-аспартатные (NMDA) рецепторы и рецепторы а-амино-3гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA), вызывает открытие ионных каналов и приток ионов кальция и далее активирует большое количество ферментов для запуска сигнального каскада, что приводит к повреждению нервных клеток многочисленными путями. Расположенный далее в сигнальном каскаде белок 95 постсинаптического уплотнения (PSD-95) запускает серию ишемических повреждений посредством взаимодействия с различными белками и ввиду этого является критическим фактором для повреждений, вызываемых церебральной ишемией, а также перспективной мишенью для лекарственной терапии. Поэтому разработка ингибиторов PSD-95 имеет большое медицинское значение с точки зрения повреждений нервной системы, вызываемых различными видами возбуждающей нейротоксичности, включая инсульт.
Кроме того, исследования показали, что возбуждающий нейротрансмиттер NMDA играет важную роль при тревожном расстройстве, эпилепсии и различных нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (ALS), болезнь Паркинсона или болезнь Гентингтона. Например, исследования показали, что чрезмерное возбуждение центральной глутаматергической системы может вызывать тревожное расстройство, поскольку NMDA-рецептор (NMDAR) является главным элементом, отвечающим за возбуждаемую глутаминовой кислотой нейротоксичность. Приступ эпилепсии включает три различных, но длительных патофизиологических процесса, включая инициирование, поддержание и развитие судорожного разряда, а также подавление судорожного разряда. Во время этого процесса важную роль играют возбуждающие нейромедиаторы, такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота. При болезни Альцгеймера в механизм нейротоксичности данного заболевания вовлечен PSD-95 посредством пути GluR6-PSD-95-MLK3 (глутаматный рецептор 6-PSD-95-киназа 3 смешанного происхождения). Кроме того, при болезни Гентингтона PSD-95 является медиатором нейротоксичности, вызываемой NMDA-рецепторами и мутантными гентингтинами. Поэтому разработка ингибиторов PSD-95 также важна для лечения, облегчения симптомов и предупреждения указанных выше заболеваний.
Пептидные лекарственные средства имеют ограничения, обусловленные условиями хранения лекарственных средств, и характеризуются ограниченной способностью противостоять воздействию окружающей среды. При хранении пептидов в условиях высоких температур и в течение длительных периодов времени могут происходить изменения pH, что может приводить к разложению, снижению чистоты, существенным изменениям внешнего вида и к сокращению срока годности при хранении, что тем самым влияет на эффективность лекарственного средства. Кроме того, существуют высокие требования к транспортировке пептидных лекарственных средств, что ограничивает крупномасштабное коммерческое
- 1 044400 применение пептидных лекарственных средств. Таким образом, существует потребность в технических усовершенствованиях пептидных лекарственных средств.
Краткое описание сущности изобретения
Согласно первому аспекту в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая пептид, регулирующий pH агент и наполнитель, где пептид содержит аминокислотную последовательность YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) или ее функциональный вариант.
В некоторых воплощениях функциональный вариант представляет собой вариант, образуемый посредством одной или более чем одной консервативной замены в сегменте LDTEI в SEQ ID NO: 1, предпочтительно консервативной замены, выбранной из группы, состоящей из замены между D и E, замены среди L, V и I и замены между T и S.
В некоторых воплощениях функциональный вариант представляет собой вариант, образуемый посредством замены сегмента LDTEI в SEQ ID NO: 1 на последовательность, выбранную из группы, состоящей из LDTEL, LDTEV, LDTDI, LDTDL, LDTDV, LDSEI, LDSEL, LDSEV, LDSDI, LDSDL, LDSDV, LETEI, LETEL, LETEV, LETDI, LETDL, LETDL, LETDL, LETDL, LETDL, LETDL, LETDL, IDTEI, IDTEL, IDTEV, IDTDI, IDTDL, IDTDV, IETEI, IETEL, IETEV, IETDI, IETDL, IETDL и IETDV.
В некоторых воплощениях пептид представляет собой химерный пептид, содержащий аминокислотную последовательность YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) или ее функциональный вариант, и участвующий в интернализации пептид, где участвующий в интернализации пептид облегчает захват химерного пептида клеткой.
В некоторых воплощениях участвующий в интернализации пептид содержит аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2).
В некоторых воплощениях химерный пептид содержит аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRRYEKLTTLDTGGV (SEQ ID NO: 3).
В некоторых воплощениях регулирующий pH агент выбран из группы, состоящей из гистидинового буфера, аргининового буфера, буфера на основе сукцината натрия, буфера на основе сукцината калия, буфера на основе цитрата натрия, глюконатного буфера, ацетатного буфера, фосфатного буфера, трисбуфера и любой их комбинации, предпочтительно регулирующий pH агент представляет собой буфер на основе лимонной кислоты/двузамещенного фосфата натрия или гистидиновый/аргининовый буфер и более предпочтительно регулирующий pH агент представляет собой гистидиновый/аргининовый буфер.
В некоторых воплощениях pH композиции составляет от примерно 5,5 до 8, предпочтительно от примерно 6 до 7,5, более предпочтительно от примерно 6 до 7, еще более предпочтительно от примерно 6,5 до 7 и наиболее предпочтительно составляет примерно 6,5.
В некоторых воплощениях количество гистидина/аргинина в гистидиновом/аргининовом буфере составляет, по массе, от примерно 1 до 10%, предпочтительно от примерно 3 до 10%.
В некоторых воплощениях наполнитель выбран из группы, состоящей из трегалозы, маннита, глюкозы, лактозы, циклодекстрина, декстрана-40, сорбита, сахарозы, глицина и любой их комбинации, предпочтительно наполнитель выбран из группы, состоящей из трегалозы, маннита, глюкозы, лактозы и любой их комбинации, и более предпочтительно наполнитель представляет собой трегалозу.
В некоторых воплощениях соотношение масс пептида и трегалозы составляет от примерно 1:0,05 до 1:10, предпочтительно от примерно 1:0,5 до 1:5, более предпочтительно от примерно 1:0,8 до 1:3 и наиболее предпочтительно составляет примерно 1:1.
В некоторых воплощениях наполнитель представляет собой трегалозу, а регулирующий pH агент представляет собой гистидиновый/аргининовый буфер.
В некоторых воплощениях соотношение масс пептида и трегалозы составляет примерно 1:1.
В некоторых воплощениях pH композиции составляет примерно 6,5±0,5.
В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит криопротектор и/или поверхностно-активное вещество, предпочтительно, криопротектор представляет собой полиэтиленгликоль, и/или поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат, предпочтительно полисорбат 20 или полисорбат 80.
В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит ингибитор дезамидирования.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция находится в форме предварительно лиофилизированной композиции, или в форме лиофилизированной композиции, или в форме восстановленной композиции, приготовленной путем объединения лиофилизированной композиции с водным раствором.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция предназначена для использования в лечении, уменьшении интенсивности симптомов или предупреждении заболевания, выбранного из группы, состоящей из повреждения нервной системы, заболевания или боли, ассоциированного(ой) с повреждением нервной системы, нейродегенеративного заболевания, тревожного расстройства и эпилепсии, у млекопитающего либо для использования в качестве нейропротекторного агента.
Согласно второму аспекту в настоящей заявке предложен способ лечения, облегчения симптомов или предупреждения заболевания, выбранного из группы, состоящей из повреждения нервной системы, заболевания или боли, ассоциированного(ой) с повреждением нервной системы, нейродегенеративного заболевания, тревожного расстройства и эпилепсии, у млекопитающего, включающий введение субъек- 2 044400 ту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции согласно первому аспекту.
Согласно третьему аспекту в настоящей заявке предложено применение фармацевтической композиции согласно первому аспекту в приготовлении лекарственного средства для лечения, облегчения симптомов или предупреждения заболевания, выбранного из группы, состоящей из повреждения нервной системы, заболевания или боли, ассоциированного(ой) с повреждением нервной системы, нейродегенеративного заболевания, тревожного расстройства и эпилепсии, у млекопитающего либо в приготовлении нейропротекторного агента.
В некоторых воплощениях любого из вышеупомянутых аспектов заболевание представляет собой инсульт или повреждение нервной системы, вызываемое инсультом.
В некоторых воплощениях любого из вышеупомянутых аспектов инсульт включает ишемический инсульт, геморрагический инсульт и геморрагический инсульт, преобразованный из ишемического инсульта. Предпочтительно, инсульт представляет собой ишемический инсульт.
В некоторых воплощениях любого из вышеупомянутых аспектов повреждение нервной системы представляет собой повреждение нервной системы, вызываемое возбуждающей нейротоксичностью.
В некоторых воплощениях любого из вышеупомянутых аспектов повреждение или боль локализуется в периферической нервной системе или центральной нервной системе.
В некоторых воплощениях любого из вышеупомянутых аспектов повреждение нервной системы, вызываемое возбуждающей нейротоксичностью, включает повреждение, выбранное из группы, состоящей из инсульта, повреждения спинного мозга, ишемического или травматического повреждения головного мозга или спинного мозга, нейронального повреждения в центральной нервной системе (ЦНС), в том числе острого повреждения ЦНС, ишемического инсульта или повреждения спинного мозга, гипоксии, ишемического или механического повреждения и повреждения, вызываемого нейродегенеративным заболеванием, тревожным расстройством, эпилепсией или инсультом.
В некоторых воплощениях нейродегенеративное заболевание включает болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (ALS), болезнь Паркинсона или болезнь Гентингтона.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны результаты анализа методом аффинной адсорбции с целью обнаружения взаимодействия между P5 и доменом PDZ1/2. На дорожке M представлены маркеры молекулярной массы белков; на дорожке 1 показан образец His+PDZ1/2+P5; на дорожке 2 показан только один P5; на дорожке 3 показан образец His+P5; на дорожке 4 показан образец His+PDZ1/2. Как показано на дорожке 1, элюированная фракция содержит как P5, так и PDZ1/2, что является подтверждением способности P5 связываться с доменом PDZ1/2.
На фиг. 2 показаны изображения окрашенных хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия (TTC) срезов головного мозга крыс в модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO), подвергнутых лечению полипептидом P5: a) группа нормальных животных; b) группа имитации; c) группа модельных животных; d) группа, получающая положительное контрольное лекарственное средство (раствор для инъекций Enbipu); e) NA-1 в дозе 10 мг/кг массы тела; f) YE-NA-1 в дозе 10 мг/кг массы тела; g) P5 в дозе 10 мг/кг массы тела; h) P5 в дозе 3 мг/кг массы тела; i) P5 в дозе 1 мг/кг массы тела; j) профилактическое введение Р5 в дозе 10 мг/кг массы тела; k) профилактическое введение Р5 в дозе 3 мг/кг массы тела; 1) профилактическое введение Р5 в дозе 1 мг/кг массы тела.
Фиг. 3 представляет собой гистограмму, демонстрирующую статистические данные для объема церебрального инфаркта после терапевтического и профилактического введения полипептида Р5 в различных дозах крысам в модели MCAO. **p<0,01.
На фиг. 4 показано распределение полипептида Р5 в образцах головного мозга крыс.
На фиг. 5 показаны изображения TTC-окрашенных образцов головного мозга крыс.
На фиг. 6 показаны изображения окрашенных гематоксилином и эозином (HE) парафиновых срезов образцов головного мозга крыс. A) группа нормальных животных; B) группа имитации; C) группа модельных животных; D) группа, получающая положительное контрольное лекарственное средство; E) группа, получающая NA-1; F) группа, получающая YE-NA-1; G) группа, получающая Р5; H) группа, получающая Р5 в профилактических целях.
На фиг. 7 показано влияние разных наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных композиций на основе Р5 (№ 0, № 1 и № 2) в 0-е сутки.
На фиг. 8 показано влияние разных наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных композиций на основе Р5 (№ 3, № 4 и № 5) в 0-е сутки.
На фиг. 9 показано влияние разных наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных композиций на основе Р5 (№ 0, № 1 и № 2) через 1 неделю.
На фиг. 10 показано влияние разных наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных композиций на основе Р5 (№ 3, № 4 и № 5) через 1 неделю.
На фиг. 11 показаны полученные через 1 неделю результаты использования гистидина/аргинина для подведения pH композиции (т.е. в эксперименте II по скринингу диапазона pH).
На фиг. 12 показаны полученные через 2 недели результаты использования гистидина/аргинина для подведения pH композиции (т.е. в эксперименте II по скринингу диапазона pH).
- 3 044400
Подробное описание изобретения
Авторы настоящего изобретения разработали пептиды для лечения повреждений центральной нервной системы. Для лучшего применения этих пептидов в промышленной практике авторы изобретения на основании обширных исследований разработали композиции, содержащие пептид, наполнитель и буфер для регулирования pH. Такие композиции могут обладать по меньшей мере одним из перечисленных далее преимуществ.
1. Композиции представляют собой белую рыхлую лиофилизированную массу с фармацевтически привлекательным внешним видом. Наличие наполнителя оказывает благоприятное действие с точки зрения улучшения температуры разложения (белой рыхлой лиофилизированной массы), обеспечивая защиту при лиофилизации и повышая стабильность белков в процессе долгосрочного хранения.
2. Стабильность пептида повышается посредством предоставления аморфной стеклообразной матрицы, связывающейся с белком водородными связями, для замены молекул воды, которые должны быть удалены во время сушки. Это облегчает поддержание конформации пептида, сводит к минимуму разложение пептида в ходе цикла лиофилизации и улучшает долговременную устойчивость конечного продукта.
3. Данные композиции устойчивы к воздействию окружающей среды и не разлагаются в течение относительно длительного периода хранения. Внешний вид композиций, чистота композиций и содержание в них примесей могут соответствовать требованиям для клинического применения.
Определения
Если не указано иное, термины, использованные в настоящей заявке, имеют значение, как оно обычно понимается специалистом средней квалификации в данной области техники.
Однобуквенные или трехбуквенные сокращения для аминокислот, использованные в настоящей заявке, согласуются с международными правилами.
Термин химерный пептид означает пептид, имеющий два пептидных компонента, которые в естественных условиях не связаны друг с другом. Эти два пептидных компонента могут образовывать слитый белок или могут быть соединены посредством химической связи.
Термин домен PDZ относится к модульному белковому домену, состоящему приблизительно из 90 аминокислот, характеризующемуся высокой идентичностью последовательности (например, по меньшей мере на 60%) с синаптическим белком PSD-95, с Discs-Large (DLG) белком коннексином из дрозофиллы и эпителиальным белком плотных контактов Z01. Домен PDZ также известен как гомологичные повторы Discs-Large белка (DHR) и повторы GLGF. В домене PDZ обычно сохраняется коровая консенсусная последовательность (Doyle, D. A., 1996, Cell, 85: 1067-76). Типичные содержащие домен PDZ белки и последовательности домена PDZ описаны в заявке США № 10/714,537.
Термин NMDA-рецептор или NMDAR относится к мембрано-ассоциированному белку, который, как известно, взаимодействует с NMDA. Эти рецепторы могут быть у человека или у не являющегося человеком животного (например, у мышей, крыс, кроликов или обезьян).
Термин специфическое связывание относится к связыванию двух молекул (например, лиганда и рецептора), характеризующемуся тем, что одна молекула (например, лиганд) способна связываться с другой конкретной молекулой (например, рецептором) даже в присутствии многих других различных молекул, т.е. к способности одной молекулы предпочтительно связываться с другой молекулой в смеси гетерогенных молекул. Специфическое связывание лиганда с рецептором также может быть подтверждено, если связывание детектируемого меченого лиганда с рецептором ослабляется в присутствии избытка немеченых лигандов (т.е. при проведении анализа конкурентного связывания).
Термин статистически значимый означает значение p<0,05, предпочтительно <0,01, наиболее предпочтительно <0,001.
Термин функциональный вариант относится к варианту, имеющему такую(ое) же или схожую(ее) биологическую(ое) функцию и свойство, что и исходный вариант. В качестве неограничивающего примера, функциональный вариант может быть получен посредством выполнения одной или нескольких консервативных замен в исходном варианте.
Термин участвующий в интернализации пептид, также известный как облегчающий проникновение в клетку пептид, широко используется в области белковых лекарственных средств, и его действие направлено на облегчение захвата и поглощения клетками активного пептида, связанного с участвующим в интернализации пептидом. В качестве неограничивающего примера, участвующим в интернализации пептидом может быть пептид Tat (трансактиватор транскрипции). Одним из неограничивающих примеров пептидов Tat является YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2).
Согласно первому аспекту в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая пептид, регулирующий pH агент и наполнитель, где пептид содержит аминокислотную последовательность YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) или ее функциональный вариант. В данном описании пептид также обозначается как активный пептид, который действует в качестве активной группировки в химерных пептидах по настоящему изобретению для лечения повреждений центральной нервной системы или для использования в качестве нейропротекторного агента.
Согласно существующим исследованиям, некоторые активные пептиды, которые ингибируют взаимодействие между NMDAR и PSD-95, имеют в своей основе структуру NMDAR. Например, NMDAR2B
- 4 044400 (идентификационный номер (ID) в GenBank 4099612) имеет 20 аминокислот FNGSSNGHVYEKLSSLESDV на своем C-конце и мотив PL (связывающийся с лигандом домена PDZ), состоящий из ESDV. Некоторые известные активные пептиды содержат на C-конце часть аминокислотной последовательности из NMDAR2B, тем самым конкурентно ингибируя взаимодействие PSD-95 с NMDAR2B. На основании исследований высказано предположение, что сегмент ESDV или LESDV в упомянутых выше пептидах играет важную роль в ингибировании взаимодействия между NMDAR и PSD-95. Не будучи связанными с какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения неожиданным образом обнаружили, что активный пептид YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1), описанный в настоящей заявке (который не содержит двух остатков SS после KL по сравнению с C-концевой аминокислотной последовательностью описанного выше NMDAR2B и имеет аминокислотную последовательность YEKL, простирающуюся от N-конца мотива PL), усиливает взаимодействие активного пептида с доменом PDZ1/2. В то же время сегмент LDTEI на C-конце пептида по сравнению с мотивом YEKL может быть модифицирован, и ожидается, что такая модификация не затронет активности активного пептида или даже может повысить его активность. Соответственно, в некоторых воплощениях функциональный вариант, предложенный в данном изобретении, представляет собой вариант, образуемый посредством одной или более чем одной консервативной замены в сегменте LDTEI в SEQ ID NO: 1.
В некоторых воплощениях консервативная замена выбрана из группы, состоящей из замены между D и E, замены среди L, V и I и замены между T и S.
В некоторых конкретных воплощениях функциональный вариант представляет собой вариант, образуемый посредством замены сегмента LDTEI в SEQ ID NO: 1 на последовательность, выбранную из группы, состоящей из LDTEL, LDTEV, LDTDI, LDTDL, LDTDV, LDSEI, LDSEL, LDSEV, LDSDI, LDSDL, LDSDV, LETEI, LETEL, LETEV, LETDI, LETDL, LETDL, LETDL, LETDL, LETDL, LETDL, LETDL, IDTEI, IDTEL, IDTEV, IDTDI, IDTDL, IDTDV, IETEI, IETEL, IETEV, IETDI, IETDL, IETDL и IETDV.
В некоторых воплощениях функциональные варианты, описанные в настоящей заявке, также содержат аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или даже больше пептидам, которые упомянуты выше. В данной области техники известно, что идентичность между двумя белками может быть определена путем выравнивания аминокислотной последовательности первого белка с последовательностью второго белка, который содержит консервативные аминокислотные замены по сравнению с первым белком. Уровень идентичности между двумя белками можно определить, используя компьютерные алгоритмы и способы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Идентичность двух аминокислотных последовательностей предпочтительно определяют, используя алгоритм BLASTP (средство поиска основного локального выравнивания для пептидов).
В некоторых воплощениях функциональные варианты, описанные в настоящей заявке, включают варианты, имеющие замены, делеции, добавки и/или вставки аминокислотных остатков в 1, 2, 3, 4, 5 или более положениях по сравнению с пептидами, которые упомянуты выше, отличаясь тем самым от конкретных пептидов, описанных выше.
Как описано выше, функциональный вариант может отличаться от конкретного описанного выше пептида одной или несколькими заменами, делециями, добавками и/или вставками. Такие варианты могут иметь природное происхождение или могут быть получены путем синтеза. Например, одну или более чем одну из описанных выше пептидных последовательностей, раскрытых в настоящей заявке, можно модифицировать, и ее биологические активности можно оценить с использованием любого из разнообразных методов, хорошо известных в данной области техники, которые описаны в настоящей заявке.
В некоторых воплощениях пептид представляет собой химерный пептид, содержащий аминокислотную последовательность YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) или ее функциональный вариант, и участвующий в интернализации пептид, где участвующий в интернализации пептид способен облегчать захват химерного пептида клеткой.
Специалистам в данной области техники следует понимать, что основная цель включения активного пептида и участвующего в интернализации пептида в химерный пептид заключается в улучшении доставки активного пептида к мишени, на которую он действует. Поэтому участвующие в интернализации пептиды, подходящие для настоящей заявки, не ограничиваются конкретными типами при условии достижения цели, заключающейся в проникновении в клетку или интернализации. Специалистам в данной области техники также следует понимать, что поскольку мишени действия активного пептида расположены главным образом внутри нервных клеток, предпочтительно, чтобы участвующий в интернализации пептид подходил в особенности для нервных клеток. В некоторых воплощениях участвующим в интернализации пептидом может быть пептид Tat. В некоторых воплощениях аминокислотной последовательностью пептида Tat является YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2). В некоторых воплощениях химерный пептид содержит аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (SEQ ID NO: 3).
Должно быть очевидно, что участвующий в интернализации пептид может быть присоединен к активному пептиду через амидную связь с образованием слитого пептида, но они также могут быть соединены другим подходящим способом, например, в результате которого образуется химическая связь. Ре
- 5 044400 акция сочетания двух компонентов может быть осуществлена с применением агента сочетания или конъюгирующего агента. В продаже имеется большое количество таких реагентов и информацию о них можно найти в S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991). Некоторые примеры реагентов для перекрестного сшивания включают N-суkцинимид-3-(2пиридиндитио)пропионат (SPOP) или N,N'-(1,3-фенuлен)бuсмалеuмuд; N,N'-этилиден-бис-(иодацетамид) или другие подобные реагенты, имеющие от 6 до 11 углеродных метиленовых мостиков, (которые относительно специфичны к тиоловым группам) и 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (который образует необратимым образом связь, взаимодействуя с аминогруппой и с тирозиновой группировкой). Другие реагенты для перекрестного сшивания включают P,P'-дифтор-m,m'-динитродифенилсульфон (который образует необратимым образом поперечную связь, взаимодействуя с аминогруппой и фенольной группой); диметил-диэтиламингексаноат (специфичный к аминогруппе); фенол-1,4-дисульфонилхлорид (который взаимодействует главным образом с аминогруппой); 1,6-гексаметилендиизоцианат или -диизотиоцианат либо фенилазо-п-диизоцианат (который взаимодействует главным образом с аминогруппой); глутаровый альдегид (который взаимодействует с некоторыми различными боковыми цепями) и бис-диазотированный бензидин (который взаимодействует главным образом с тирозином и гистидином).
Кроме того, описанные выше пептиды возможно могут быть модифицированными (например, ацетилированными, фосфорилированными и/или гликозилированными) для повышения их аффинности к ингибиторам, усиления способности ингибиторов пересекать клеточные мембраны или повышения их стабильности.
Активный пептид и слитый пептид, в котором активный пептид сшит с участвующим в интернализации пептидом по настоящему изобретению, могут быть синтезированы методами твердофазного синтеза или рекомбинантными методами. Пептидомиметики могут быть синтезированы с использованием ряда протоколов и методов, описанных в научной и патентной литературе, как например, в Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (ed.) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol., 9: 205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol., 1: 114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers., 3: 17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol., 267:220-234.
В некоторых воплощениях регулирующий pH агент выбран из группы, состоящей из гистидинового буфера, аргининового буфера, буфера на основе сукцината натрия, буфера на основе сукцината калия, буфера на основе цитрата натрия, глюконатного буфера, ацетатного буфера, фосфатного буфера, трисбуфера и любой их комбинации. В некоторых воплощениях регулирующий pH агент выбран из группы, состоящей из буфера на основе лимонной кислоты/двузамещенного фосфата натрия и гистидинового/аргининового буфера. В некоторых воплощениях регулирующий pH агент выбран из группы, состоящей из гистидинового/аргининового буфера.
В некоторых воплощениях pH композиции составляет от примерно 5,5 до 8 (например, примерно 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8). В некоторых воплощениях pH композиции составляет от примерно 6 до 7,5. В некоторых воплощениях pH композиции составляет от примерно 6 до 7. В некоторых воплощениях pH композиции составляет от примерно 6,5 до 7. В некоторых воплощениях pH композиции составляет примерно 6,5.
В некоторых воплощениях количество гистидина/аргинина в гистидиновом/аргининовом буфере составляет от примерно 1 до 10% по массе (например, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10%). В некоторых воплощениях количество гистидина/аргинина в гистидиновом/аргининовом буфере составляет от примерно 3 до 10%.
В некоторых воплощениях наполнитель выбран из группы, состоящей из трегалозы, маннита, глюкозы, лактозы, циклодекстрина, декстрана-40, сорбита, сахарозы, глицина и любой их комбинации. В некоторых воплощениях наполнитель выбран из группы, состоящей из трегалозы, маннита, глюкозы, лактозы и любой их комбинации. В некоторых воплощениях наполнитель представляет собой трегалозу.
В некоторых воплощениях соотношение масс пептида и трегалозы составляет от примерно 1:0,05 до 1:10. В некоторых воплощениях соотношение масс пептида и трегалозы составляет от примерно 1:0,5 до 1:5. В некоторых воплощениях соотношение масс пептида и трегалозы составляет от примерно 1:0,8 до 1:3. В некоторых воплощениях соотношение масс пептида и трегалозы составляет примерно 1:1.
В некоторых воплощениях наполнитель представляет собой трегалозу, а регулирующий pH агент представляет собой гистидиновый/аргининовый буфер.
В некоторых воплощениях соотношение масс пептида и трегалозы составляет примерно 1:1.
В некоторых воплощениях pH композиции составляет примерно 6,5±0,5.
В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит криопротектор и/или поверхностно-активное вещество, предпочтительно криопротектор представляет собой полиэтиленгликоль, и/или поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат, предпочтительно полисорбат 20 или полисорбат 80.
В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит ингибитор дезамидирования.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция находится в форме предварительно лиофилизированной композиции, или в форме лиофилизированной композиции, или в форме восстановленной композиции, приготовленной путем объединения лиофилизированной композиции с водным раствором.
В некоторых воплощениях введение композиции может представлять собой парентеральное, внут- 6 044400 ривенное, подкожное, интраартериальное введение, введение в интракраниальное пространство, интратекальное, внутрибрюшинное, местное, интраназальное или внутримышечное введение. Внутривенное введение является предпочтительным.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция для парентерального введения предпочтительно является стерильной и по существу изотонической. В случае инъекций, композиция, содержащая активный пептид или химерный пептид, может быть приготовлена в водном растворе, предпочтительно в физиологически совместимом буфере, таком как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический раствор, или в ацетатном буфере (для уменьшения дискомфорта в местах инъекций). Раствор может содержать такие формирующие композицию агенты, как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
Помимо описанных выше композиций композиция, содержащая активный пептид или химерный пептид, также может быть приготовлена в виде препарата резервуарного типа. Такие длительно действующие композиции можно вводить путем имплантации (например, под кожу или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Так, например, данное соединение может быть приготовлено в композиции с подходящим полимерным или гидрофобным материалом (например, приготовлено в виде эмульсии в приемлемом масле) либо с ионообменной смолой или приготовлено в виде умеренно растворимого производного, например, умеренно растворимой соли.
В некоторых воплощениях, поскольку активные пептиды или химерные пептиды, описанные в настоящей заявке, могут содержать заряженные боковые цепи или концы, они могут быть включены в любую из упомянутых выше композиций в виде свободной кислоты или основания либо в виде фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемые соли могут представлять собой соли, которые по существу сохраняют биологическую активность свободного основания и которые образуются в результате взаимодействия с неорганическими кислотами. Как правило, фармацевтические соли более растворимы в воде и других протонных растворителях, чем соответствующие формы свободного основания.
Активный пептид или химерный пептид используют в количестве, эффективном для осуществления предусмотренного назначения (например, для уменьшения повреждающего эффекта в результате повреждений, вызванных инсультом, и связанных с ними состояний). Терапевтически эффективное количество означает количество активного пептида или химерного пептида, достаточное для значительного ослабления повреждений, вызванных инсультами у пациентов (или в популяции модельных животных), получающих лечение активным пептидом или химерным пептидом, раскрытых в настоящей заявке, по сравнению с повреждением центральной нервной системы в контрольной популяции пациентов (или модельных животных), не подвергаемых лечению активным пептидом или химерным пептидом, раскрытых в настоящей заявке. Если подвергаемый лечению пациент достигает лучшего результата по сравнению со средним результатом (определяемым по объему инфаркта или степени утраты трудоспособности) в сопоставимой контрольной популяции пациентов, не подвергаемых лечению способами, описанными в настоящей заявке, то это количество также считается терапевтически эффективным. Терапевтически эффективным количеством также считается количество, если у подвергнутого лечению пациента отмечают степень утраты трудоспособности по шкале Рэнкина, составляющую 2 балла или меньше, а также 75 баллов или больше по шкале Бартел. Если у популяции подвергнутых лечению пациентов отмечают значительно улучшенное распределение баллов по шкале утраты трудоспособности (т.е. меньшую утрату трудоспособности) по сравнению с сопоставимыми не подвергнутыми лечению популяциями, то такая доза также считается терапевтически эффективной, см. Lees et al., N. Engl. J. Med., 2006, 354: 588-600. Терапевтически эффективный режим приема представляет собой сочетание терапевтически эффективной дозы и частоты введения, необходимых для осуществления указанного выше назначения. Обычно может быть достаточно однократной дозы.
В некоторых воплощениях предпочтительный диапазон доз содержит от 0,001 до 20 мкмоль активного пептида или химерного пептида на кг массы тела пациента в интервале 6 часов после приступа инсульта, возможно от 0,03 до 3 мкмоль активного пептида или химерного пептида на кг массы тела пациента. В некоторых способах вводят 0,1-20 мкмоль активного пептида или химерного пептида на кг массы тела пациента в интервале 6 часов. В некоторых способах вводят 0,1-10 мкмоль активного пептида или химерного пептида на кг массы тела пациента вводят в интервале 6 часов и более предпочтительно вводят примерно 0,3 мкмоль активного пептида или химерного пептида на кг массы тела пациента в интервале 6 часов. В других случаях диапазон доз составляет от 0,005 до 0,5 мкмоль активного пептида или химерного пептида на кг массы тела пациента. Дозу для крыс, рассчитанную на один кг массы тела, можно пересчитать для людей, путем деления на 6,2, чтобы адаптировать к разным соотношениям площади поверхности и массы. Выраженная в граммах подходящая доза активного пептида или химерного пептида для применения на людях может составлять от 0,01 до 100 мг/кг массы тела пациента, или, более предпочтительно, от 0,01 до 30 мг/кг массы тела пациента, или от 0,01 до 10 мг/кг, или от 0,01 до 1 мг/кг.
В некоторых воплощениях вводимое количество активного пептида или химерного пептида зависит от подвергаемого лечению субъекта, массы субъекта, выраженности боли, режима введения и корректировок, назначаемых лечащим врачом. Лечение может быть повторено, когда симптомы обнаруживаются или даже не обнаруживаются. Лечение может быть предоставлено в виде монотерапии или в виде ком- 7 044400 бинации с другими лекарственными средствами.
В некоторых воплощениях терапевтически эффективная доза активного пептида или химерного пептида, описанного в настоящей заявке, способна обеспечить терапевтическую пользу, не вызывая значительной токсичности. Токсичность химерного пептида можно определить на клеточных культурах или экспериментальных животных, используя стандартные фармацевтические методики, например, путем определения LD50 (дозы, вызывающей гибель 50% объектов в популяции) или LD1oo (дозы, вызывающей гибель 100% популяции). Соотношение доз для получения токсического эффекта и терапевтического эффекта представляет собой терапевтический индекс. Предпочтительны химерные пептиды или пептидомиметики, демонстрирующие высокие терапевтические индексы (см., например, Fingl и др., 1975, в The Pharmacological Basis of Therapeutics, часть 1, страница 1).
В некоторых воплощениях фармацевтическую композицию используют для лечения, облегчения симптомов или предупреждения повреждения нервной системы либо заболевания или боли, вызванного(ой) повреждением нервной системы, или используют в качестве нейропротекторного агента. В некоторых воплощениях повреждение нервной системы представляет собой повреждение, вызванное возбуждающей нейротоксичностью, при этом такое повреждение локализуется в периферической нервной системе или центральной нервной системе.
В некоторых воплощениях повреждение нервной системы, вызванное возбуждающей нейротоксичностью, включает повреждение, выбранное из группы, состоящей из инсульта, повреждения спинного мозга, ишемического или травматического повреждения головного мозга или спинного мозга, повреждения нейрона в центральной нервной системе (ЦНС), в том числе острого повреждения ЦНС, ишемического инсульта или повреждения спинного мозга, гипоксии, ишемического или механического повреждения и повреждения, вызванного нейродегенеративным заболеванием, тревожным расстройством, эпилепсией или инсультом. В некоторых воплощениях фармацевтическую композицию используют для лечения, облегчения симптомов или предупреждения повреждения нервной системы, вызванного ишемическим инсультом.
Инсульт представляет собой состояние, вызванное нарушением кровотока в ЦНС. Возможные причины включают эмболию, кровоизлияние и тромбоз. Некоторые нервные клетки отмирают сразу вследствие нарушения кровотока. Эти клетки высвобождают составляющие их молекулы (включая глутаминовую кислоту), которые в свою очередь активируют NMDA-рецептор, что повышает уровни внутриклеточного кальция и уровни внутриклеточных ферментов, и это приводит к гибели большего числа нервных клеток (каскадному усилению возбуждающей нейротоксичности). Отмирание тканей ЦНС называется инфарктом. Объем инфаркта (т.е. объем погибших нервных клеток в головном мозге, гибель которых вызвана инсультом) можно использовать в качестве индикатора степени патологических повреждений, вызванных инсультом. Симптоматические эффекты зависят как от объема инфаркта, так и от места локализации инфаркта в головном мозге. Индекс утраты трудоспособности можно использовать в качестве показателя симптоматических повреждений, например, показатель исходов инсульта по шкале Рэнкина (Rankin, Scott. Med. J., 2: 200-15 (1957)) и индекс Бартел.
Шкала Рэнкина основана на непосредственной оценке системного состояния пациента и выглядит следующим образом:
0: полностью отсутствуют симптомы;
1: симптомы имеются, но наблюдается несущественная утрата трудоспособности; пациент способен выполнять всю повседневную работу и все обычные действия;
2: незначительная утрата трудоспособности; пациент не в состоянии выполнять все предыдущие действия, но способен ухаживать за собой без посторонней помощи;
3: умеренная утрата трудоспособности, требующая некоторой помощи, но пациент в состоянии ходить без посторонней помощи;
4: умеренно тяжелая утрата трудоспособности, пациент не в состоянии ходить без посторонней помощи и не способен удовлетворять свои собственные телесные потребности без посторонней помощи;
5: тяжелая утрата трудоспособности; пациент прикован к постели, имеет недержание мочи и кала, а также требует постоянного ухода и внимания.
Определение индекса Бартел основывается на ряде вопросов о способности пациента выполнять 10 основных видов повседневной жизнедеятельности, которые оцениваются в баллах от 0 до 100, при этом более низкие баллы указывают на большую степень утраты трудоспособности (Mahoney et al., Maryland State Medical Journal, 14: 56-61 (1965)).
Альтернативно, степень тяжести/исход инсульта можно измерить, используя шкалу оценки инсульта Национального института здравоохранения (NIH), которая доступна во всемирной компьютерной сети по адресу ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf. Эта шкала основана на способности пациента выполнять 11 наборов функций и включает оценку уровней осознания, двигательных функций, ощущений и речевых функций пациента.
Ишемический инсульт более четко определяется как тип инсульта, вызываемого блокированием кровотока в головном мозге. Возможная патология таких закупорок чаще всего связана с появлением жировых отложений вдоль стенок кровеносных сосудов. Это состояние называется атеросклерозом. Та
- 8 044400 кие жировые отложения могут быть причиной двух типов обструкции. Церебральный тромбоз относится к образованию тромба в закупоренной части кровеносного сосуда. Термин эмболия головного мозга обычно означает, что в мозговую артерию вместе с кровотоком попадают различные циркулирующие в крови эмболы (такие как пристеночный тромб в сердце, атеросклеротическая бляшка, жир, опухолевые клетки, волокнистая хрящевая ткань или воздух), что блокирует кровеносные сосуды. Когда для компенсации недостаточно коллатерального кровообращения, это вызывает ишемический некроз ткани головного мозга, которую артерия снабжает кровью, и очаговое неврологическое нарушение. Второй важной причиной эмболии является нерегулярное сердцебиение, называемое фибрилляцией предсердий. Оно вызывает состояние, при котором в сердце может образоваться сгусток крови, а затем он смещается и переносится в головной мозг. Другими возможными причинами ишемического инсульта являются кровоизлияние, тромбоз, разрыв артерий или вен, остановка сердца, шок по любым причинам (включая кровоизлияние) и причины, обусловленные ятрогенными факторами, такие как повреждения кровеносных сосудов головного мозга или кровеносных сосудов, идущих в головной мозг, в результате непосредственного хирургического вмешательства, или операция на сердце. На ишемический инсульт приходится приблизительно 83% от всех случаев инсульта.
Некоторые другие неврологические расстройства также могут вызывать гибель нейронов через NDMAR-опосредуемую возбуждающую нейротоксичность. Эти расстройства включают нейродегенеративные заболевания, тревожное расстройство, эпилепсию, гипоксию, повреждение ЦНС, нерелевантное инсульту, такое как травматическое повреждение головного мозга и повреждение спинного мозга. Соответственно, в некоторых воплощениях фармацевтическую композицию используют для лечения, облегчения симптомов или предупреждения нейродегенеративных заболеваний, тревожного расстройства или эпилепсии, при этом нейродегенеративные заболевания могут включать болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (ALS), болезнь Паркинсона или болезнь Гентингтона.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция находится в форме предварительно лиофилизированной композиции, или лиофилизированной композиции, или восстановленной композиции, полученной путем объединения лиофилизированой композиции с водным раствором.
Согласно второму аспекту в настоящей заявке предложен способ лечения, облегчения симптомов или предупреждения повреждения нервной системы и заболевания или боли, ассоциированного(ой) с повреждением нервной системы, нейродегенеративного заболевания, тревожного расстройства или эпилепсии, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, как она описана в первом аспекте.
В некоторых воплощениях повреждение нервной системы, вызываемое возбуждающей нейротоксичностью, включает повреждение, выбранное из группы, состоящей из инсульта, повреждения спинного мозга, ишемического или травматического повреждения головного мозга или спинного мозга, повреждения нейрона в центральной нервной системе (ЦНС), в том числе острого повреждения ЦНС, ишемического инсульта или повреждения спинного мозга, гипоксии, ишемического или механического повреждения и повреждения, вызываемого нейродегенеративным заболеванием, тревожным расстройством, эпилепсией или инсультом.
В некоторых воплощениях нейродегенеративное заболевание включает болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (ALS), болезнь Паркинсона или болезнь Гентингтона.
В некоторых воплощениях субъектом является субъект, страдающий от ишемического инсульта. В некоторых воплощениях введение фармацевтической композиции, которая описана в первом аспекте, может уменьшать объем участка церебрального инфаркта, вызываемого церебральной ишемией.
Согласно третьему аспекту в настоящей заявке предложено применение фармацевтической композиции, которая описана в первом аспекте, в изготовлении лекарственного средства для лечения, облегчения симптомов или предупреждения повреждения нервной системы и заболевания или боли, ассоциированного(ой) с повреждением нервной системы, нейродегенеративного заболевания, тревожного расстройства или эпилепсии, либо в изготовлении нейропротекторного агента.
В некоторых воплощениях повреждение нервной системы, вызываемое возбуждающей нейротоксичностью, включает повреждение, выбранное из группы, состоящей из инсульта, повреждения спинного мозга, ишемического или травматического повреждения головного мозга или спинного мозга, повреждения нейрона в центральной нервной системе (ЦНС), в том числе острого повреждения ЦНС, ишемического инсульта или повреждения спинного мозга, гипоксии, ишемического или механического повреждения и повреждения, вызываемого нейродегенеративным заболеванием, тревожным расстройством, эпилепсией или инсультом.
В некоторых воплощениях нейродегенеративное заболевание включает болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (ALS), болезнь Паркинсона или болезнь Гентингтона.
В некоторых воплощениях лекарственное средство используют для лечения, облегчения симптомов или предупреждения повреждения нервной системы, вызываемое ишемическим инсультом.
Следует понимать, что приведенное выше подробное описание ставит своей целью только помочь специалистам в данной области техники более четко понять настоящую заявку, но оно не предназначено для ограничения каким-либо образом настоящей заявки. Специалисты в данной области техники могут
- 9 044400 выполнить различные модификации и изменения к описанным воплощениям.
Примеры
Следующие примеры приведены только для иллюстрации некоторых воплощений настоящего изобретения без какой-либо цели ограничения сущности изобретения.
Пример 1. Скрининг молекул активного пептида.
На основании описанных результатов исследования был выбран трансмембранный пептид Tat YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), и его лигировали с различным количеством аминокислот, получая библиотеку пептидов. Молекулы химерных пептидов в библиотеке пептидов тестировали на предмет взаимодействия с доменом PDZ1/2, экспрессированным и очищенным in vitro, и проводили предварительный скрининг полипептидов в отношении силы взаимодействия.
Присоединенная к неподвижной фазе молекула (лиганд) представляла собой белок PDZ1/2 с молекулярной массой приблизительно 20 кДа в концентрации 2 мг/мл. Молекула подвижной фазы (аналит) представляла собой предназначенный для скрининга полипептид с молекулярной массой приблизительно 2 кДа в концентрации 10 мг/мл. Для фиксации применяли чип CM5 (чип с карбоксиметилированным декстраном), используя прибор Biacore 3000. В качестве буфера для электрофореза использовали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 0,005% твина 20. Фиксацию осуществляли с применением метода аминосочетания. Концентрация лиганда составляла 10 мкг/мл. Буфером для фиксации служил буфер на основе 10 мМ раствора ацетата натрия, pH 4,0. Количество, которое фиксировали в проточной ячейке 2, составляло 1400 RU. Используемая скорость потока составляла 10 мкл/мл, и лиганд загружали в течение 1 минуты. Для регенерации использовали 10 мМ раствор Gly при pH 2,0-2,5. Регенерацию проводили при скорости потока 30 мкл/мин. Время загрузки составляло 30 с.
Кинетический анализ проводили, используя следующие условия:
контрольный канал: проточная ячейка 1;
буфер для электрофореза: PBS;
режим: кинетический анализ Wizard;
градиенты концентрации: 6,25 нМ, 12,5 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ, 400 нМ;
время загрузки: 1 мин;
время диссоциации: 2 мин; и скорость потока: 30 мкл/мин.
Аппроксимацию данных осуществляли, используя программное обеспечение для аппроксимации Biaevaluation 4.1. Аппроксимационная модель представляла собой модель связывания в отношении 1:1. Значение константы диссоциации (KD) обратно пропорционально силе взаимодействия.
В результате проведения скрининга получен химерный пептид, проявляющий сильную способность к взаимодействию с доменом PDZ1/2 и получивший название Р5. Последовательность химерного пептида показана ниже:
Чтобы провести непосредственное сравнение с аналогичным химерным пептидом из приведенных исследований, применяли контрольный химерный пептид NA-1 со следующей последовательностью:
NA-1: YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ Ш NO: 4).
Помимо этого, с целью сравнения Р5 с NA-1 в отношении их структурных различий, дополнительно применяли химерный пептид YE-NA-1, имеющий два остатка YE, добавленные к N-концу активного пептида в составе химерного пептида NA-1, и его последовательность показана ниже:
Химерные пептиды NA-1, YE-NA-1 и Р5 подвергали параллельному тестированию на предмет взаимодействия с доменом PDZ1/2, как упомянуто выше, и результаты показаны ниже в табл. 1.
Таблица 1
Детектирование силы взаимодействия каждого из трех химерных пептидов с доменом PDZ1/2
Химерные пептиды | NA-1 | YE-NA-1 | Р5 |
KD (М) | 7,53Е-08 | 5,44Е-08 | 2,99Е-08 |
Как показано в табл. 1, химерные пептиды YE-NA-1 и Р5 с большей силой взаимодействовали с доменом PDZ1/2, чем контрольный химерный пептид NA-1, и лучшими оказались показатели у Р5. Таким образом, авторы изобретения предположили, что два дополнительных аминокислотных остатка YE на Nконце активного пептида оказывали определенное улучшающее действие на взаимодействие полипептида с доменом PDZ1/2. Кроме того, в Р5 отсутствовали два остатка серина (SS), обладающие слабой гидрофобностью по сравнению с карбоксильным концом YE-NA-1. Основываясь на этом, авторы изобретения предположили, что это может дополнительно усиливать взаимодействие полипептида с доменом PDZ1/2.
Для дальнейшего тестирования в последующих экспериментах был выбран химерный пептид Р5, и в некоторых экспериментах в качестве контролей использовали NA-1 и YE-NA-1.
- 10 044400
Пример 2. Анализ с соосаждением для проверки взаимодействия Р5 с доменом PDZ1/2.
Для подтверждения того, что Р5 может взаимодействовать с доменом PDZ1/2, проводили анализ анализом с соосаждением.
Колонку уравновешивали 100 мкл His-гранул и 1 мл буфера для металл-хелатной аффинной хроматографии (MCAC)-0 в течение 5 мин и встряхивали при 4°C. Смесь центрифугировали при 5000 g в течение 1 минуты при 4°C и супернатант отбрасывали. К смеси добавляли 1 мг белка PDZ1/2 и добавляли буфер до достижения объема 1 мл. Смесь вращали в течение 1 часа при 4°C для осуществления связывания. Смесь центрифугировали при 5000 g в течение 1 минуты при 4°C и супернатант отбрасывали. Смесь промывали три раза, каждый раз используя 1 мл буфера MCAC-0, в течение 5 минут (при 4°C, промывая со встряхиванием). К смеси добавляли 1 мг белка Р5 и добавляли буфер до достижения объема 1 мл. Смесь вращали в течение 2 часов при 4°C для осуществления связывания. Смесь центрифугировали при 5000 g в течение 1 минуты при 4°C и супернатант отбрасывали. Смесь промывали три раза, каждый раз используя 1 мл буфера для лизиса, в течение 5 минут (при 4°C, промывая со встряхиванием). После промывки добавляли 20 мкл MCAC-300. После центрифугирования отбирали элюат для анализа посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Результаты эксперимента показаны на фиг. 1.
Как показано на фиг. 1, и Р5, и домен PDZ1/2 содержались в единой элюированной фракции, соответствующей химерному пептиду Р5, что тем самым является подтверждением способности химерного пептида Р5 связываться с доменом PDZ1/2.
Пример 3. Терапевтический эффект химерного пептида в крысиной модели MCAO.
Метод подготовки и стандарт оценки MCAO.
Модель очаговой церебральной ишемии-реперфузии получали в соответствии с методом перевязывания для создания обратимой окклюзии средней мозговой артерии (MCAO), предложенным Лонги с модификациями, учитывающими анатомическую структуру головного мозга крыс. Крыс подвергали анестезии посредством внутрибрюшинного введения 10%-ного хлоральгидрата в дозе 0,3 мл/кг. После анестезирования делали разрез по средней линии шейной области и открывали доступ к общей сонной артерии (CCA), наружной сонной артерии (ECA) и птеригопалатиновой артерии. Рабочую часть (0,5 см) моноволоконной нейлоновой лески (0,26 мм) покрывали парафином и на расстоянии 20 мм делали отметку. Всем крысам леску вставляли через разрез правой CCA, а птеригопалатиновую артерию временно пережимали для предотвращения неправильной вставки. Длина применяемой для окклюзии лески составляла примерно 18-20 мм от места раздвоения CCA в зависимости от массы животного, тем самым осуществляли окклюзию средней мозговой артерии с правой стороны. Затем кожу зашивали, и самый конец применяемой для окклюзии лески частично фиксировали на коже. По окончании периода ишемии продолжительностью 2 часа применяемую для окклюзии леску осторожно извлекали для осуществления реперфузии. Стадии данной процедуры для контрольной группы имитации были такими же, что и группе с хирургическим вмешательством, за исключением введения нейлоновой лески. Температуру тела поддерживали при 37 ± 0,5°C в продолжение периода ишемии и в течение 2 ч после реперфузии. Показателем успешного выполнения данной модели является то, что крысы после пробуждения от анестезии демонстрировали парализованную левую конечность, неустойчивость в стоячем положении и разворачивание в одну сторону при подъеме их хвостов вверх.
Признаки неврологической патологии оценивали по 5-бальному методу Лонги и Бедерсона через 24 ч после пробуждения животных от анестезии:
0: отсутствие какого-либо симптома повреждения нервов;
1: неспособность полностью вытягивать противоположную переднюю лапу;
2: разворачивание в противоположную сторону;
3: опрокидывание в противоположную сторону;
4: неспособность к самостоятельному хождению и потеря сознания.
Чем более высоким был балл, тем более тяжелой была форма поведенческого расстройства у животного.
Экспериментальные животные и материалы.
В качестве животных использовали самцов взрослых крыс Sprague Dawley (SD; Vittalia) массой тела 220-250 г со статусом беспатогенности (SPF).
Используемые инструменты включали одни прямые ножницы, двое ножниц для глазной хирургии, четыре изогнутых зажима, хирургические нити №4, №5, трехгранные иглы размером 6x17, применяемая для окклюзии леска (диаметром 0,26 мм) и одноигольные держатели. Используемые агенты включали Enbipu-содержащий раствор хлорида натрия для инъекций (Shijiazhuang Group NBP Pharmaceutical Co., Ltd.), хлоральгидрат, фуросемид (20 мг/флакон), гентамицина сульфат (80 мг/флакон), ватные тампоны и медицинские поддоны. Тестируемые пептиды синтезировали в Kingsray Biotech Inc..
Разделение на экспериментальные группы.
Экспериментальных животных разделяли на группу отрицательного контроля, группу имитации, группу модельных животных, группу, получающую положительное контрольное лекарственное средство
- 11 044400
Enbipu, группу NA-1, группу YE-NA-1 и группу Р5. Физиологический раствор, положительное лекарственное средство Enbipu, NA-1 (10 мг/кг), YE-NA-1 (10 мг/кг) и Р5 (10 мг/кг, 3 мг/кг и 1 мг/кг), соответственно, вводили инъекцией каждой отдельной группе крыс через хвостовую вену через 1 ч после ишемии.
Группе нормальных животных и группе имитации никакого лекарственного средства не вводили.
Расчет объема инфаркта.
После подсчета баллов крыс умерщвляли путем декапитации. Ткани головного мозга быстро извлекали и помещали в холодильник при -20°C. Через 10 мин ткани помещали в условия комнатной температуры. Образцы головного мозга помещали в форму для получения срезов головного мозга крыс. После извлечения обонятельной луковицы, мозжечка и нижнего отдела ствола головного мозга в образцах головного мозга делали по 5 фронтальных разрезов, получая шесть прилегающих друг к другу необработанных фронтальных срезов толщиной 2 мм в профиле. Далее эти секции головного мозга быстро помещали в 5 мл раствора, содержащего 2% TTC, и инкубировали при 37°C в течение 30 мин в темноте, в течение которых срезы головного мозга переворачивали один раз каждые 5 минут. При окрашивании с использованием TTC ткань нормальных животных будет становиться розово-красной, а поврежденная инфарктом ткань не будет окрашиваться и будет оставаться белой. Каждую группу срезов головного мозга аккуратно расставляли и фотографировали. Фотографии обрабатывали, используя системное программное обеспечение для анализа изображений, и проводили статистический анализ. Рассчитывали площадь зоны инфаркта для каждого среза головного мозга и умножали ее на толщину каждого среза головного мозга (2 мм). Результаты, полученные при умножении площади зоны инфаркта индивидуального среза головного мозга на толщину, суммировали, получая объем церебрального инфаркта для каждого животного. Объемы выражали в процентном отношении с учетом каждого полушария головного мозга для устранения эффектов отека головного мозга.
Результаты эксперимента.
Результаты эксперимента показаны на фиг. 2. Статистическую гистограмму данных объема церебрального инфаркта, показанную на фиг. 3, строили на основании статистического анализа данных объема церебрального инфаркта на фиг. 2, и конкретные статистические данные объема церебрального инфаркта приведены ниже в табл. 2. Эти результаты показали, что терапевтическое введение и профилактическое введение пептида Р5 в самой высокой дозе (10 мг/кг) может значительно уменьшать объем церебрального инфаркта у крыс, перенесших церебральную ишемию, примерно на 50% (p<0,01), в то время как в группе, получающей положительное лекарственное средство Enbipu, наблюдали уменьшение только примерно на 16% (p<0,01), в группе NA-1 наблюдали уменьшение примерно на 16% (p<0,01) и в группе YE-NA-1 наблюдали уменьшение примерно на 26% (p<0,01). Терапевтическое введение и профилактическое введение пептида Р5 во второй высокой дозе (3 мг/кг) также необходимым образом снижало объем церебрального инфаркта. Помимо этого, данные показали, что величина объема инфаркта снижалась при увеличении дозы пептида Р5, что указывает на то, что терапевтический эффект положительно коррелировал с дозой лекарственного средства. Терапевтический эффект полипептида YE-NA-1 был значительно сильнее эффекта, наблюдаемого для NA-1. Основываясь на этом, авторы изобретения предполагают, что добавление двух аминокислот YE может приводить к более сильному терапевтическому эффекту по сравнению с эффектом NA-1 за счет улучшения взаимодействия полипептида с доменом PDZ1/2.
Таблица 2
Терапевтический эффект полипептида Р5 на крысах в модели MCAO
Г руппы | Среднее значение объема инфаркта в процентном отношении (%) | Стандартное отклонение | Уменьшение объема инфаркта в процентном отношении по сравнению с группой модельных животных | t-критерий по сравнению с группой модельных животных | tкритерий по сравн. с Р5 в дозе 10 мг/кг |
Г руппа нормальных животных | 0 | 0 | |||
Г руппа имитации | 0 | 0 |
- 12 044400
Г руппа модельных животных | 45,96 | 3,35 | |||
Группа, получающая положительное лекарственное средство Enbipu | 38,61 | 3,21 | 15,99 | р<0,01 | |
ΝΑ-l в дозе 10 мг/кг | 38,56 | 2,25 | 16,10 | р<0,01 | р<0,01 |
YE-NA-1 в дозе 10 мг/кг | 33,96 | 2,40 | 26,11 | р<0,01 | р<0,01 |
Р5 в дозе 10 мг/кг | 24,84 | 2,90 | 45,95 | р<0,01 | |
Р5 в дозе 3 мг/кг | 36,54 | 2,35 | 20,50 | р<0,01 | |
Р5 в дозе 1 мг/кг | 43,22 | 3,12 | 5,96 | 0,061 | |
Профилактич. введение Р5 в дозе 10 мг/кг | 19,54 | 2,30 | 57,48 | р<0,01 | |
Профилактич. введение Р5 в дозе 3 мг/кг | 35,66 | 1,50 | 22,41 | р<0,01 | |
Профилактич. введение Р5 в дозе 1 мг/кг | 44,23 | 2,20 | 3,76 | 0,082 |
Пример 4. Распределение Р5 в головном мозге крыс.
Нормальным контрольным крысам и крысам в модели MCAO, соответственно, вводили инъекцией в хвостовую вену физиологический раствор, содержащий флуоресцентно меченый полипептид, FITC-P5, (10 мг/кг) через 1 час после создания модели. Крыс умерщвляли через 12 часов после введения. Быстро извлекали ткани головного мозга и помещали в систему визуализации для мелких живых животных для детектирования флуоресценции. По завершении детектирования флуоресценции ткани головного мозга помещали в раствор с красителем TTC для окрашивания с целью определения корреляции между площадью ишемии и распределением лекарственного средства. Как показано на фиг. 4 и 5, головной мозг нормальных крыс полностью окрашивался TTC, и никакого распределения флуоресцентно меченого полипептида обнаружено не было, в то время как поврежденный ишемией участок головного мозга крыс с ишемией не окрашивался TTC, и по затронутому ишемией участку был распределен флуоресцентно меченый полипептид, при этом основным поврежденным ишемией участком оказывался участок средней артерии, что являлось подтверждением того, что полипептид Р5 может направленно воздействовать на затронутый ишемией участок и оказывать терапевтический эффект, и его количественное распределение положительно коррелировало со степенью ишемии.
Пример 5. Окрашивание с использованием HE для обнаружения гистологических изменений.
Крыс в каждой группе подвергали декапитации через 24 ч после ишемии и в полученном образце головного мозга вблизи хиазмы зрительного нерва делали фронтальные разрезы, получая срезы толщиной примерно 4 мм. Срезы фиксировали, используя 10%-ный раствор формалина, и обезвоживали спиртом с градиентом концентрации от 70 до 100%. Секции дважды подвергали пермеабилизации в ксилоле и погружали в парафин. Парафиновый блок осторожно подрезали, закрепляли в станке для получения па- 13 044400 рафиновых срезов и готовили срезы толщиной 4 мкм. Парафиновые срезы полностью разворачивали, прикрепляли к чистой и сухой стеклянной пластинке и хранили в холодильнике при 4°C. Выполняли традиционное окрашивание с использованием HE и результаты окрашивания наблюдали с применением световой микроскопии.
Результаты эксперимента показаны на фиг. 6. Нервные клетки ткани головного мозга нормального животного демонстрировали четкое ядро, сферическую ядерную и неповрежденную ядерную мембрану. Ткани с поврежденной ишемией стороны головного мозга крыс с ишемией из группы модельных животных демонстрировали тяжелый некроз нервных клеток, набухание клеток, конденсацию ядер, рыхлую и слегка окрашенную цитоплазму и вакуолизацию. В случае группы с терапевтическим введением и группы с профилактическим введением пептида Р5 в дозе 10 мг/кг наблюдали значительное улучшение вышеупомянутых патологических изменений, и результаты были значительно лучше, чем у групп с введением положительного лекарственного средства - раствора Enbipu для инъекций, NA-1 и YE-NA-1 (10 мг/кг).
Пример 6. Оценка острой токсичности.
Тестирования острой токсичности проводили на крысах. Полученные результаты показали, что Р5 не оказывал никакого летального эффекта и других явных токсических побочных эффектов на крыс в дозе 200 мг/кг массы тела.
Пример 7. Приготовление лиофилизированных композиций на основе Р5.
Ниже описан способ приготовления лиофилизированных композиций с использованием трегалозы в качестве типичного наполнителя и раствора аргинина в качестве типичного регулирующего pH агента. Другие лиофилизированные композиции готовили аналогичным образом.
Приготовление лиофилизированной композиции на основе Р5 включало следующие стадии:
приготовление 5%-ного раствора аргинина для использования;
взвешивание требуемых количеств трегалозы и пептида Р5, соответственно, и добавление 80% общего количества воды для инъекций с перемешиванием до полного растворения;
добавление раствора аргинина и подведение pH до 6,5±0,5;
добавление воды до полного объема при равномерном перемешивании;
проведение фильтрования с использованием фильтров с диаметром пор 0,45 мкм и 0,22 мкм, соответственно;
внесение фильтрата во флакон с частичной укупоркой;
проведение вакуумной лиофилизации, включающей в себя предварительное замораживание при 30°C в течение 3 ч; сублимацию при -20°C в течение 3 ч, -10°C в течение 5 ч и 5°C в течение 10 ч; и повторную сушку при 30°C в течение 5 ч;
проведение вакуумной герметизации; и наложение комбинированной алюминиевой-пластиковой крышки.
Пример 8. Влияние разных наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных композиций на основе Р5.
Метод тестирования.
Для оценки влияния наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных композиций на основе Р5 были выбраны разные наполнители. Образцы помещали в камеру для испытаний на стабильность при 60°C на 2 недели и в конце первой и второй недель, соответственно, отбирали пробу для детектирования. В качестве наполнителей использовали трегалозу, циклодекстрин, маннит, лактозу и глюкозу, соответственно, и оценивали свойства, прозрачность и цвет раствора, pH, примеси и содержание Р5 в различных образцах.
Таблица 3
Наполнители и используемые количества
Номер теста | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Р5 | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г |
Наполнитель | / | Трегалоза 1,0 г | Циклодекстрин 1,0 г | Маннит 1,0 г | Лактоза 1,0 г | Глюкоза 1,0 г |
Вода | 20 мл | 20 мл | 20 мл | 20 мл | 20 мл | 20 мл |
Объем/флакон | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл |
- 14 044400
Таблица 4
Информация относительно реагентов, использованных в примере 8
Серия | Название | Степень чистоты | Производитель | № партии |
1 | Р5 | Степень чистоты «для инъекций» | Синтезировали и получали в Hangzhou Zhongtai | CQ-0400317 |
2 | Трегалоза | Фармацевтическая степень чистоты | Pfanstiehl | 38540A |
3 | Г идроксипропилбетациклодекстрин | Фармацевтическая степень чистоты | Binzhou City Zhiyuan, Shandong Province | 20160309- 1 |
4 | Маннит | Фармацевтическая степень чистоты | Nanning Chemical Pharmaceutical | F431C |
5 | Лактоза | Фармацевтическая степень чистоты | Zhenjiang fukang Biology | 20160510 |
6 | Глюкоза | Фармацевтическая степень чистоты | Xiwang Pharmaceutical Industry | 201605133 |
7 | Ацетонитрил | Степень чистоты «для хроматографии» | Mereda | |
8 | Трифторуксусная кислота | Степень чистоты «для хроматографии» | Mereda |
Метод оценки.
Внешний вид - проводили визуальное обследование образцов, и ожидается, что они будут представлять собой белые рыхлые лиофилизированные массы или порошки.
Прозрачность и цвет раствора - образец растворяют, используя 1 мл воды.
Ожидается, что раствор будет прозрачным и бесцветным. Если раствор мутный, то его сравнивают с раствором стандарта мутности № 1 (метод 1 Общего правила 0902), и он не должен быть более мутным, чем раствор стандарта. Если раствор имеет окраску, то его сравнивают с раствором стандарта желтого цвета № 1 (Китайская фармакопея IV, первый метод), и он не должен быть окрашен в большей степени, чем раствор стандарта.
pH - измерение для раствора, удовлетворяющего требованиям по прозрачности и окраске, выполняют со ссылкой на метод 0631 Определение концентрации раствора Китайской фармакопеи IV.
Примеси - измерение выполняют с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в следующих условиях хроматографирования:
колонка: Agilent C18 (4,6 мм x 150 мм, 5 мкм);
подвижная фаза: A: 0,065% TFA - вода; B: 0,05% TFA - ацетонитрил;
элюирование: градиентное элюирование, от 0 до 30 мин 5-65% В;
скорость потока: 1,0 мл/мин;
температура колонки: 36°C;
длина волны для детектирования: 220 нм;
вводимый объем: 10 мкл.
Навеску пептида Р5 растворяют в воде, получая раствор, содержащий примерно 2 мг пептида Р5 в 1 мл, в качестве контрольного раствора.
Образец растворяют в воде и разбавляют, получая раствор, содержащий примерно 2 мг в 1 мл, в качестве тестируемого образца. 10 мкл этого раствора вводят в жидкостной хроматограф и регистрируют хроматограмму Содержание рассчитывают исходя из площади пика внешнего стандарта для прибора, а количество примесей рассчитывают методом нормализации площадей.
Наконец, прозрачность тестируемого образца определяют путем сравнения с результатом измерения прозрачности раствора стандарта мутности.
- 15 044400
Результаты эксперимента.
Таблица 5
Влияние разных наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных композиций на основе Р5 (в 0-е сутки)
Скрининг наполнителей (в 0-е сутки) | ||||||
Номер теста | Наполнитель | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | pH | Содержание Р5 (%) | Примеси |
0 | / | Белая рыхлая лиофилизир. | Прозрачный и бесцветный | 5,88 | 109,27% | Не определены |
масса | ||||||
1 | Трегалоза | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,83 | 105,34% | Не определены |
2 | Циклодекстрин | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,98 | 103,97% | Не определены |
3 | Маннит | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,90 | 111,40% | Не определены |
4 | Лактоза | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,70 | 107,60% | Не определены |
5 | Глюкоза | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 5,73 | 100,88% | Не определены |
Таблица 6
Влияние разных наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных композиций на основе Р5 (через 1 неделю)
Скрининг наполнителей (при 60°С в течение 1 недели) | |||||||
Номер теста | Наполни- тель | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
0 | / | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слегка слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,07 | 107,91 | 0,53 | 1,04 |
1 | Трегалоза | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,76 | 105,35 | 0,21 | 0,30 |
- 16 044400
2 | Циклодекстрин | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,89 | 102,42 | 0,89 | 1,36 |
3 | Маннит | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 6,09 | 103,05 | 1,34 | 3,91 |
4 | Лактоза | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,57 | 64,89 | 10,47 | 38,82 |
5 | Глюкоза | Желтая масса (значительно слежавшаяся) | Прозрачный, а окраска темнее желтого №10 | 4,62 | 57,58 | 75,28 | 75,51 |
Таблица 7
Влияние разных наполнителей на форму и стабильность лиофилизированных ________________композиций на основе Р5 (через 2 недели)_____________________
Скрининг наполнителей (при 60°С в течение 2 недель) | |||||||
Номер теста | Наполни- тель | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
0 | / | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слегка слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 5,77 | 106,97 | 0,72 | 1,34 |
1 | Трегалоза | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,97 | 105,63 | 0,19 | 0,25 |
2 | Циклодекстрин | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 6,30 | 101,04 | 1,01 | 1,72 |
3 | Маннит | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 6,29 | 102,05 | 1,61 | 4,66 |
В 0-е сутки в каждом из образцов (образцов от № 0 до № 5) примеси обнаружены не были. Через 1 неделю максимальное содержание отдельной примеси в образце № 1 (с трегалозой) составляло 0,21%, а содержание всех примесей составляло 0,3%, что было значительно меньше, чем в контрольном образце (№ 0), указывая на то, что трегалоза проявляла значительное защитное действие.
Одновременно, что касается содержания всех примесей в образце №№ 2-5, то было обнаружено, что максимальное содержание отдельной примеси и содержание всех примесей было выше, чем в образце № 1 (с трегалозой), указывая на то, что циклодекстрин, маннит, лактоза и глюкоза уступали трегалозе с точки зрения защитного действия.
Что касается свойств, то все хранимые образцы с трегалозой, циклодекстрином, маннитом или лактозой через 1 неделю представляли собой белые рыхлые лиофилизированные массы, в то время как контрольный образец был слегка слежавшимся, а образец № 5 (с глюкозой) был сильно слежавшимся, имея вид желтой массы. Оставленные для дальнейшего хранения образцы с трегалозой, циклодекстрином или
- 17 044400 маннитом через 2 недели представляли собой белые рыхлые лиофилизированные массы, в то время как контрольный образец был слегка слежавшимся.
Что касается pH, то не наблюдали никакого существенного изменения в значении pH для образцов с №№ 0 и 1 через 1 и 2 недели, в то время как значения pH для образцов с №№ 4 и 5 снижались через 1 неделю, а значения pH для образцов с №№ 2 и 3 повышались через 2 недели.
Что касается прозрачности и цвета, то через 1 неделю все образцы с №№ 0-4 выглядели прозрачными и бесцветными, в то время образец № 5 выглядел прозрачным, но имел желтый цвет. Через 2 недели все образцы с №№ 0-3 выглядели прозрачными и бесцветными.
Принимая во внимание приведенные выше оценки с точки зрения внешнего вида, прозрачности и цвета раствора, значения pH, содержания примесей и лекарственного средства, в качестве наполнителя для дальнейших тестирований была выбрана трегалоза.
Пример 9. Влияние количества трегалозы на форму и стабильность лиофилизированной композиции на основе Р5.
Оценивали форму лиофилизированных композиций на основе Р5, используя разные количества трегалозы. В качестве методов детектирования применяли методы, описанные в примере 8.
Таблица 8
Состав образцов из эксперимента I по скринингу количества трегалозы, в котором соотношение Р5:трегалоза составляет 1:0, 1:0,25, 1:0,5, 1:0,75 и 1:1
Номер теста | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
Р5 | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г |
Трегалоза | / | 50 мг | 0,10 г | 0,15 г | 0,20 г |
Вода | 2 мл | 2 мл | 2 мл | 2 мл | 2 мл |
Объем/флакон | 100 мкл | 100 мкл | 100 мкл | 100 мкл | 100 мкл |
Таблица 9
Состав образцов из эксперимента II по скринингу количества трегалозы, в котором соотношение Р5:трегалоза составляет 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:4 и 1:5
Номер теста | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
Р5 | 0,10 г | 0,10 г | 0,10 г | 0,10 г | 0,10 г |
Трегалоза | 0,15 г | 0,20 г | 0,30 г | 0,40 г | 0,50 г |
Вода | 2 мл | 2 мл | 2 мл | 3 мл | 4 мл |
Объем/флакон | 100 мкл | 100 мкл | 100 мкл | 150 мкл | 200 мкл |
Каждый образец помещали в камеру для испытаний на стабильность при 60°C на 2 недели и в конце первой и второй недель, соответственно, отбирали пробу для детектирования. Свойства, прозрачность и цвет раствора, pH, содержание примесей и лекарственного средства для разных образцов оценивали применительно к разным соотношениям Р5:трегалоза.
Таблица 10
Результаты эксперимента I по скринингу количества трегалозы (в 0-е сутки), при этом вносимое количество составляет 10 мг/флакон и используют флаконы емкостью 7 мл
Эксперимент I по скринингу количества трегалозы (в 0-е сутки) | |||||||
Номер теста | Р5: трегалоза | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
- 18 044400
0 | / | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,92 | 91,19 | 0,10 | 0,10 |
1 | 1:0,25 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,89 | 88,15 | 0,10 | 0,10 |
2 | 1:0,5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,73 | 89,68 | 0,10 | о,и |
3 | 1:0,75 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,89 | 87,18 | 0,09 | 0,10 |
4 | 1:1 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,93 | 88,84 | 0,08 | 0,10 |
Таблица 11
Результаты эксперимента I по скринингу количества трегалозы (через 1 неделю)
Эксперимент I по скринингу количества трегалозы (при 60°С в течение 1 недели) | |||||||
Номер теста | Р5: трегалоза | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
0 | / | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,10 | 87,68 | 0,65 | 1,78 |
1 | 1:0,25 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,53 | 85,34 | 0,51 | 1,27 |
2 | 1:0,5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,40 | 89,56 | 0,23 | 0,48 |
3 | 1:0,75 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,22 | 89,87 | 0,18 | 0,21 |
4 | 1:1 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,16 | 87,61 | 0,17 | 0,17 |
- 19 044400
Таблица 12
Результаты эксперимента I по скринингу количества трегалозы (через 2 недели)
Эксперимент I по скринингу | количества трегалозы (при 60°С в течение 2 недель) | ||||||
Номер теста | Р5: трегалоза | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
Белая рыхлая | |||||||
0 | / | лиофилизир. масса (слежавшаяся) Белая рыхлая | Прозрачный и бесцветный | 6,88 | 87,91 | 0,88 | 2,74 |
1 | 1:0,25 | лиофилизир. масса (слежавшаяся) Белая рыхлая | Прозрачный и бесцветный | 6,97 | 87,48 | 0,51 | 1,15 |
2 | 1:0,5 | лиофилизир. масса (слежавшаяся) Белая рыхлая | Прозрачный и бесцветный | 6,89 | 92,77 | 0,37 | 0,88 |
3 | 1:0,75 | лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,77 | 90,66 | 0,29 | 0,52 |
Белая рыхлая | |||||||
4 | 1:1 | лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,81 | 91,10 | 0,26 | 0,47 |
- 20 044400
Таблица 13
Результаты эксперимента II по скринингу количества трегалозы, при этом вносимое количество составляет 5 мг/флакон и используют флаконы емкостью 7 мл
Эксперимент II по скринингу количества трегалозы (в 0-е сутки) | |||||||
Номе Р теста | Трегалоза :Р 5 | Внешний вид | Прозрачност ь и цвет раствора | Значе -ние pH | Содержа -ние Р5 (%) | Максим. содержани е отдельной примеси (%) | Все примес и (%) |
5 | 1:1,5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,98 | 106,63 | 0,03 | 0,03 |
6 | 1:2 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,89 | 97,19 | 0,05 | 0,05 |
7 | 1:3 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,92 | 94,95 | 0,05 | 0,05 |
8 | 1:4 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,83 | 99,88 | 0,03 | 0,03 |
9 | 1:5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,86 | 101,34 | 0,04 | 0,04 |
- 21 044400
Эксперимент II по скринингу количества трегалозы (при 60°С в течение 1 недели) | |||||||
Номе Р теста | Трегалоза :Р 5 | Внешний вид | Прозрачност ь и цвет раствора | Значе -ние pH | Содержа -ние Р5 (%) | Максим, содержани е отдельной примеси (%) | Все примес и (%) |
5 | 1:1,5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 6,18 | 98,13 | 0,23 | 0,30 |
6 | 1:2 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,95 | 90,87 | 0,19 | 0,35 |
7 | 1:3 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,64 | 87,27 | 0,17 | 0,30 |
8 | 1:4 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,78 | 93,75 | 0,22 | 0,33 |
9 | 1:5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 6,33 | 95,45 | 0,23 | 0,31 |
Эксперимент II по скринингу количества трегалозы (при 60°С в течение 2 недель) | |||||||
Номе Р теста | Трегалоза :Р 5 | Внешний вид | Прозрачност ь и цвет раствора | Значе -ние pH | Содержа -ние Р5 (%) | Максим. содержани е одной примеси (%) | Все примес и (%) |
5 | 1:1,5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса(слежавшаяся ) | Прозрачный и бесцветный | 6,83 | 94,59 | 0,30 | 0,59 |
- 22 044400
6 | 1:2 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,99 | 91,89 | 0,26 | 0,55 |
7 | 1:3 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 7,20 | 86,25 | 0,27 | 0,52 |
8 | 1:4 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,88 | 92,82 | 0,23 | 0,46 |
9 | 1:5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 6,95 | 94,42 | 0,23 | 0,47 |
Каждый образец помещали в камеру для испытаний на стабильность при 40°С на 3 месяца и в конце первого и третьего месяца, соответственно, отбирали пробу для детектирования. Свойства, прозрачность и цвет раствора, pH, содержание примесей и лекарственного средства для разных образцов оценивали применительно к разным соотношениям Р5:трегалоза.
Таблица 14
Результаты эксперимента I по скринингу количества трегалозы (40°С), при этом вносимое количество составляет 0,1 мл (10 мг/флакон) и используют флаконы емкостью 7 мл
Скрининг количества наполнителя (при 40°С в течение 1 месяца) | |||||||
Номер теста | Р5: трегалоза | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
0 | 1:0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 7,05 | 91,52 | 0,98 | 1,09 |
1 | 1:0,25 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 7,08 | 86,94 | 1,07 | 1,16 |
2 | 1:0,5 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 7,07 | 91,43 | 0,85 | 0,92 |
3 | 1:0,75 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,99 | 90,36 | 0,84 | 0,92 |
4 | 1:1 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачный и бесцветный | 6,94 | 90,36 | 0,80 | 0,88 |
Выводы.
Что касается примесей, то содержание примесей (максимальное содержание отдельной примеси и
-23 044400 содержание всех примесей) в образцах с №№ 1-9 после хранения при 60°C в течение 1 или 2 недель было значительно меньше, чем таковое в контрольном образце (№ 0), указывая на то, что трегалоза проявляла значительное защитное действие.
Что касается эксперимента I (Р5:трегалоза составляет от 1:0,25 до 1:1), то с увеличением количества трегалозы содержание примесей постепенно уменьшалось, указывая на то, что защитное действие трегалозы постепенно усиливалось.
Что касается эксперимента II (Р5:трегалоза составляет от 1:1,5 до 1:5), то было обнаружено, что нет никакой значимой разницы в содержании примесей в образцах с №№ 5-9 и образце № 4 (где Р5:трегалоза составляет 1:1) в конце первой или второй недели, указывая на то, что защитное действие трегалозы больше не усиливалось.
Таким образом, подходящим оказалось соотношение Р5 и трегалозы, составляющее 1:1.
Что касается pH, то наблюдали изменение в значении pH для каждого образца и контрольного образца, которые хранили при 60°C в течение 2 недель или при 40°C в течение одного месяца, т.е. увеличение от примерно 6,0 до примерно 7,0, что указывало на то, что целесообразно добавить в композицию буфер для поддержания pH с целью стабилизирования значения pH.
Пример 10. Влияние разных pH на прозрачность раствора и содержание примесей в лиофилизированных композициях.
Оценивали влияние разных значений pH на прозрачность раствора и содержание примесей в лиофилизированных композициях. В качестве методов детектирования использовали методы, описанные в примере 8.
Эксперимент I. Регулирование pH композиций с использованием лимонной кислоты и двузамещенного фосфата натрия.
Таблица 15
Состав образцов из эксперимента I по скринингу диапазона pH, когда pH композиции подводили до примерно 4, 5, 6, 7 и 8, используя лимонную кислоту и двузамещенный фосфат натрия
Номер теста | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Значение pH | 5,43 | 4,10 | 5,00 | 6,04 | 6,92 | 7,84 |
Р5 | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г |
Трегалоза | 1,0 г | 1,0 г | 1,0 г | 1,0 г | 1,0 г | 1,0 г |
0,1 М раствор лимонной кислоты | / | 9,71 мл | 11,3 мл | 12,63 мл | 16,47 мл | 23,45 мл |
0,2 М раствор двузамещенного фосфата натрия | / | 12,29 мл | 9,7 мл | 7,37 мл | 3,53 мл | 0,55 мл |
Вода | 20 мл | / | / | / | / | / |
Вносимый объем/флакон | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл |
Результаты и анализ эксперимента I.
Таблица 17
Результаты эксперимента I по скринингу диапазона pH (в 0-е сутки)
Скрининг диапазона pH (в 0-е сутки) | |||||||
Номер теста | pH | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение рн | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
0 | Не подводили | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,73 | 102,46 | 0,10 | 0,11 |
- 24 044400
1 | 4,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 4,32 | 102,31 | 0,13 | 0,13 |
2 | 5,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность = № 2 и бесцветный | 5,36 | 102,12 | 0,12 | 0,12 |
3 | 6,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 3 и бесцветный | 6,52 | 99,22 | 0,09 | 0,09 |
4 | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 3 и бесцветный | 7,37 | 100,05 | 0,03 | 0,03 |
5 | 8,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 2 и бесцветный | 8,20 | 98,39 | 0,05 | 0,05 |
Номер теста 0 | Результат! С pH Не подводили | я эксперимента 'крининг диапа. Внешний вид Белая рыхлая лиофилизир. масса | I по скрининг зона pH (при 6( Прозрачность и цвет раствора Прозрачный и бесцветный | /диапа )°С в те Значение pH 5,87 | зона pH (че чение 1 не; Содержание Р5 (%) 101,28 | Таб рез 1 неделю) 1ели) Максим. содержание одной примеси (%) 0,18 | лица 18 Все примеси (%) 0,23 |
1 | 4,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 4,31 | 98,72 | 0,79 | 1,72 |
- 25 044400
2 | 5,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 5,52 | 100,62 | 0,46 | 0,90 |
3 | 6,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность = № 1 и бесцветный | 6,65 | 97,39 | 0,28 | 0,36 |
4 | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 7,48 | 98,37 | 0,15 | 0,23 |
5 | 8,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 3 и бесцветный | 8,40 | 96,66 | 0,15 | 0,15 |
Таблица 19
Результаты эксперимента I по скринингу диапазона pH (через 2 недели)
Скрининг диапазона pH (при 60° С в течение 2 недель) | |||||||
Номер теста | pH | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
0 | Не подводили | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,76 | 102,81 | 0,22 | 0,28 |
1 | 4,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 4,36 | 97,13 | 1,16 | 3,40 |
-26044400
2 | 5,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 5,46 | 99,21 | 0,74 | 1,69 |
3 | 6,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 6,46 | 97,87 | 0,39 | 0,58 |
4 | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 7,27 | 98,99 | 0,17 | 0,32 |
5 | 8,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса (слежавшаяся) | Прозрачность <№ 3 и бесцветный | 8,20 | 95,76 | 0,24 | 0,33 |
В случае эксперимента I по скринингу использовали буферную систему на основе лимонной кислоты и двузамещенного фосфата натрия, с помощью которой подводили pH в диапазоне от 4,0 до 8,0. Значения pH контрольного образца (№ 0) и образцов от № 1 до № 5 оставались постоянными в процессе хранения при 60°C в течение 2 недель. Как можно видеть по результатам наблюдений прозрачности, контрольный образец (№ 0) имел хорошую прозрачность, а образцы от № 1 до № 4 демонстрировали незначительную мутность. Через 1 неделю или через 2 недели свойства контрольного образца (№ 0) не изменялись, в то время как образцы с подведенным pH оказывались значительно слежавшимися. Кроме того, также было обнаружено, что при увеличении pH содержание примесей в образцах постепенно уменьшалось. Поэтому авторы изобретения провели эксперимент II в диапазоне более высоких значений pH, используя разные регулирующие pH агенты.
Эксперимент II. Подведение pH композиций с использованием гистидина/аргинина.
Таблица 16
Состав образцов из эксперимента II по скринингу диапазона pH, когда pH композиции подводили до примерно 6, 7, 8, 9 и 10, используя гистидин/аргинин
Номер теста | НО | Н1 | Н2 | нз | Н4 | Н5 |
Значение pH | 5,5 | 7,1 | 7,0 | 7,9 | 8,9 | 9,5 |
Р5 | 0,10 г | 0,10 г | 0,10 г | 0,10 г | 0,10 г | 0,10 г |
Трегалоза | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г | 0,20 г |
3%-ный раствор гистидина | / | 2,7 мл | / | / | / | / |
10%-ный раствор аргинина | / | / | 80 мкл | 100 мкл | 250 мкл | 800 мкл |
Вода | 2,7 мл | / | 2,7 мл | 2,7 мл | 2,7 мл | 2,4 мл |
Вносимый объем/флакон | 150 мкл | 150 мкл | 150 мкл | 150 мкл | 150 мкл | 160 мкл |
- 27 044400
Результаты и анализ эксперимента II.
Таблица 20
Результаты эксперимента II по скринингу диапазона pH (в 0-е сутки)
Скрининг диапазона pH (в 0-е сутки) | ||||||||
Номер теста | Регулирующий pH агент | pH | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
НО | / | / | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 5,90 | 101,13 | 0,22 | 0,26 |
Н1 | 3% гистидина | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность = № 2 и бесцветный | 7,14 | 102,94 | 0,06 | 0,06 |
Н2 | 10% аргинина | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 6,84 | 98,39 | 0,07 | 0,07 |
НЗ | 10% аргинина | 8,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 7,26 | 100,94 | 0,05 | 0,05 |
Н4 | 10% аргинина | 9,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 2 и бесцветный | 8,42 | 92,63 | 0,05 | 0,05 |
Н5 | 10% аргинина | 10,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 2 и бесцветный | 9,08 | 95,46 | 0,07 | 0,07 |
- 28 044400
Таблица 21
Результаты эксперимента II по скринингу диапазона pH (через неделю)
Скрининг диапазона pH (при 60°С в течение 1 недели) | ||||||||
Номер теста | Регулирующий pH агент | pH | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
НО | / | / | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 6,06 | 100,37 | 0,32 | 0,37 |
Н1 | 3% гистидина | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность = № 2 и бесцветный | 7,19 | 96,95 | 0,07 | 0,07 |
Н2 | 10% аргинина | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 6,91 | 98,20 | 0,09 | 0,09 |
НЗ | 10% аргинина | 8,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 7,42 | 99,06 | 0,09 | 0,09 |
Н4 | 10% аргинина | 9,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 3 и бесцветный | 8,63 | 93,39 | 0,07 | 0,07 |
Н5 | 10% аргинина | 10,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность = № 3 и бесцветный | 9,15 | 94,33 | 0,24 | 0,30 |
- 29 044400
Таблица 22
Результаты эксперимента II по скринингу диапазона pH (через 2 недели)
Скрининг диапазона pH (при 60°Св течение 2 недель) | ||||||||
Номер теста | Регулирующий pH агент | pH | Внешний вид | Прозрачность и цвет раствора | Значение pH | Содержание Р5 (%) | Максим. содержание отдельной примеси (%) | Все примеси (%) |
НО | / | / | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачный и бесцветный | 6,47 | 100,89 | 0,31 | 0,38 |
Н1 | 3% гистидина | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 3 и бесцветный | 7,22 | 103,64 | 0,09 | 0,09 |
Н2 | 10% аргинина | 7,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 1 и бесцветный | 7,10 | 101,57 | о,и | о,и |
НЗ | 10% аргинина | 8,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 2 и бесцветный | 7,61 | 100,86 | 0,10 | 0,10 |
Н4 | 10% аргинина | 9,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 3 и бесцветный | 8,64 | 91,40 | 0,21 | 0,29 |
Н5 | 10% аргинина | 10,0 | Белая рыхлая лиофилизир. масса | Прозрачность <№ 4 и бесцветный | 9,18 | 90,51 | 0,36 | 0,44 |
Для эксперимента по скринингу II была выбрана буферная система на основе гистидина/аргинина, с помощью которой pH подводили в диапазоне от 7 до 10. Через 2 недели значение pH для контрольного образца (H0) изменилось (т.е. от 5,9 до 6,5), в то время как значения pH для образцов от H1 до H5 оставались постоянными. Содержания примесей в контрольном образце (H0) существенно повышались по сравнению с таковыми в 0-е сутки, в то время как содержания примесей в образцах H1, H2 и H3 не увеличивались. Прозрачность контрольного образца (H0) была удовлетворительной, в то время как образцы от H1 до H5 были мутными, при этом образец H2 имел наибольшую мутность. Таким образом, желательно поддерживать pH в диапазоне 6,5±0,5.
Помимо этого, в отсутствие регулирующего pH агента изменения pH разных образцов также были различными. Например, значение pH образца № 2 в эксперименте по скринингу наполнителей изменялось незначительно в случае хранения при 60°C в течение 2 недель. Значение pH образца № 0 в эксперименте II по скринингу диапазона pH изменялось незначительно в случае хранения при 60°C в течение 2 недель. Значение pH образца H0 в эксперименте II по скринингу диапазона pH изменялось незначительно в случае хранения при 60°C в течение 2 недель, при этом диапазон изменения составлял 0,5. Зна-
Claims (12)
- чения pH образцов с №№ 1-5 в эксперименте II по скринингу количества трегалозы изменялись значительно в случае хранения при 60°C в течение 2 недель, при этом диапазон изменения составлял 1,0.Все публикации и патентные документы, упомянутые в настоящей заявке, включены в данное описание посредством ссылки, как если бы каждая публикация или каждый патент были конкретно и по отдельности указаны внесением посредством ссылки. Различные изменения и эквивалентные замены могут быть внесены в различные воплощения, описанные в настоящей заявке, без отклонения от истинной сущности и объема изобретения. Любые признак, стадию или вариант воплощения настоящего изобретения можно использовать в комбинации с любыми другими признаком, стадией или вариантом, если в контексте не указано иное.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество пептида, регулирующий pH агент и трегалозу в качестве наполнителя, где пептид содержит аминокислотную последовательность YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) или ее функциональный вариант и где указанный функциональный вариант представляет собой вариант, имеющий одну или более чем одну консервативную замену в YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1), где указанная консервативная замена выбрана из группы, состоящей из замены между D и E, замены среди L, V и I и замены между T и S, и где pH фармацевтической композиции составляет от примерно 6,5 до 7,5, где соотношение масс пептида и трегалозы составляет от примерно 1:0,5 до 1:1.
- 2. Фармацевтическая композиция по п.1, где функциональный вариант представляет собой вариант, образуемый посредством одной или более чем одной консервативной замены в сегменте LDTEI в SEQ ID NO: 1, и консервативная замена выбрана из группы, состоящей из замены между D и E, замены среди L, V и I и замены между T и S.
- 3. Фармацевтическая композиция по п.2, где функциональный вариант представляет собой вариант, образуемый посредством замены сегмента LDTEI (SEQ ID NO: 6) в SEQ ID NO: 1 на последовательность, выбранную из группы, состоящей из LDTEL (SEQ ID NO: 7), LDTEV (SEQ ID NO: 8), LDTDI (SEQ ID NO: 9), LDTDL (SEQ ID NO: 10), LDTDV (SEQ ID NO: 11), LDSEI (SEQ ID NO: 12), LDSEL (SEQ ID NO: 13), LDSEV (SEQ ID NO: 14), LDSDI (SEQ ID NO: 15), LDSDL (SEQ ID NO: 16), LDSDV (SEQ ID NO: 17), LETEI (SEQ ID NO: 18), LETEL (SEQ ID NO: 19), LETEV (SEQ ID NO: 20), LETDI (SEQ ID NO: 21), LETDL (SEQ ID NO: 22), LETDV (SEQ ID NO: 23), VDTEI (SEQ ID NO: 24), VDTEL (SEQ ID NO: 25), VDTEV (SEQ ID NO: 26), VDTDI (SEQ ID NO: 27), VDTDL (SEQ ID NO: 28), VDTDV (SEQ ID NO: 29), IDTEI (SEQ ID NO: 30), IDTEL (SEQ ID NO: 31), IDTEV (SEQ ID NO: 32), IDTDI (SEQ ID NO: 33), IDTDL (SEQ ID NO: 34), IDTDV (SEQ ID NO: 35), IETEI (SEQ ID NO: 36), IETEL (SEQ ID NO: 37), IETEV (SEQ ID NO: 38), IETDI (SEQ ID NO: 39), IETDL (SEQ ID NO: 40) и IETDV (SEQ ID NO: 41).
- 4. Фармацевтическая композиция по п.1, где пептид представляет собой химерный пептид, содержащий аминокислотную последовательность YEKLLDTEI (SEQ ID NO: 1) или ее функциональный вариант и участвующий в интернализации пептид, где участвующий в интернализации пептид облегчает захват указанного химерного пептида клеткой.
- 5. Фармацевтическая композиция по п.4, где участвующий в интернализации пептид содержит аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), и предпочтительно химерный пептид содержит аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (SEQ ID NO: 3).
- 6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, где регулирующий pH агент выбран из группы, состоящей из гистидинового буфера, аргининового буфера, буфера на основе сукцината натрия, буфера на основе сукцината калия, буфера на основе цитрата натрия, глюконатного буфера, ацетатного буфера, фосфатного буфера, трис-буфера и любой их комбинации, предпочтительно регулирующий pH агент представляет собой буфер на основе лимонной кислоты/двузамещенного фосфата натрия или гистидиновый/аргининовый буфер, и более предпочтительно регулирующий pH агент представляет собой гистидиновый/аргининовый буфер.
- 7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, где pH композиции составляет примерно 6,5.
- 8. Фармацевтическая композиция по п.6, где регулирующий pH агент представляет собой гистидиновый/аргининовый буфер и количество гистидина/аргинина в гистидиновом/аргининовом буфере, по массе, составляет от примерно 1 до 10%, предпочтительно от примерно 3 до 10%.
- 9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-8, где соотношение масс пептида и трегалозы составляет примерно 1:0,5.
- 10. Фармацевтическая композиция по п.9, где соотношение масс пептида и трегалозы составляет примерно 1:1.
- 11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, которая находится в форме предварительно лиофилизированной композиции, или в форме лиофилизированной композиции, или в форме восстановленной композиции, полученной путем объединения лиофилизированной композиции с водным раствором.
- 12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-11 для лечения, уменьшения интенсивности-
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044400B1 true EA044400B1 (ru) | 2023-08-24 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107312069A (zh) | 兴奋性神经毒性相关损伤的治疗肽 | |
CN110799522B (zh) | 用于治疗、改善或预防脑出血的肽及其用途 | |
US11541098B2 (en) | Peptide composition for treating excitatory neurotoxicity related injuries | |
CN110799547B (zh) | 用于治疗、改善或预防神经系统相关病症的化合物及其用途 | |
CN110809579B (zh) | 多肽的药学可接受的盐及其应用 | |
KR102253900B1 (ko) | 흥분성 신경독성 관련 손상 치료용 펩타이드 | |
CN107312071B (zh) | 兴奋性神经毒性相关损伤的治疗方法 | |
EA044400B1 (ru) | Пептидная композиция для лечения повреждений, связанных с возбуждающей нейротоксичностью | |
US20190134150A1 (en) | Therapeutic methods for excitatory neurotoxicity-related injuries |