CN107312071B

CN107312071B - 兴奋性神经毒性相关损伤的治疗方法

Info

Publication number: CN107312071B
Application number: CN201610269426.6A
Authority: CN
Inventors: 芦颖; 韩化敏; 童威; 葛平菊; 景波
Original assignee: Bai Si O J (beijing) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Bai Si O J (beijing) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2036-04-27
Also published as: CN107312071A

Abstract

本申请提供了包含氨基酸序列YEKLTTLDTGGV(SEQ ID NO:1)或其功能性变体的肽，所述肽为治疗中枢神经系统损伤的活性肽。本申请还提供了包含活性肽和内化肽的嵌合肽。本申请还提供了包含活性肽或嵌合肽的药物组合物以及活性肽或嵌合肽的医学应用。

Description

兴奋性神经毒性相关损伤的治疗方法

技术领域

本申请大体上涉及医学领域，具体而言，本申请提供了用于治疗中枢神经系统损伤的肽、组合物和方法。

发明背景

脑卒中是中老年常见的急性脑血管病，并出现年轻化的趋势。它是当今世界对人类危害最大的三种疾病(癌症，心脑血管疾病，糖尿病)之一。我国每年死于脑血管疾病近300万人，高于欧美国家4到5倍，是日本的3.5倍，甚至高于泰国、印度等发展中国家；发病率以每年8.7％的速率上升，复发率超过30％，5年内再次发生率达54％；脑卒中患者幸存者中75％不同程度丧失劳动能力，40％重残。

脑卒中大致可以分为两大类，即缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占脑卒中病人总数的85％。目前，缺血性脑卒中的治疗药物主要分为如下几类：血管扩张药(如潘生丁等)、改善微循环、扩充血容量的药物(如低分子右旋糖酐等)、溶解血栓的药物(如尿激酶等)、抗凝治疗、防止血小板凝聚的药(如阿司匹林等)、中药、神经元保护剂等，但是由于这些药物大多存在副作用大、具有潜在的危险性或疗效不显著等问题，因此研究脑卒中的发病机制并针对其机制进行药物研发，对防治脑血管病发生和发展具有重要的社会意义。

脑卒中的特征是局部缺血区域、脑出血区域和/或创伤区域的神经元细胞死亡。而由于脑缺血引起的神经元死亡或损伤是一个损伤级联反应过程，脑缺血后组织血液灌注下降，兴奋性神经递质增加，激活NMDA和AMPA受体，引起离子通道开放，钙离子内流，激活大量的酶引发信号级联反应，造成多途径的神经细胞损伤。其下游的突触后密度95蛋白(PSD-95)通过与多种蛋白的相互作用，引发一系列缺血性损伤，是脑缺血损伤的关键性位点，同时也是药物治疗的潜在靶点，因此PSD-95抑制剂的研发对于包括脑卒中在内的多种兴奋性神经毒性引起的神经系统损伤具有很大的药用意义。

此外，研究显示兴奋性神经递质NMDA在焦虑，癫痫和多种神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病或亨廷顿氏病等中都发挥重要作用。例如，研究显示中枢的谷氨酸能系统过度兴奋可引发焦虑，而NMDA受体(NMDAR)负责谷氨酸兴奋性神经毒性的主要部分。癫痫的发作包含起动、发作性放电的维持与扩展以及发作性放电的抑制3个不同而连续的病理生理过程，在该过程中兴奋性神经递质如谷氨酸、天门冬氨酸起重要作用。在阿尔兹海默症中，PSD-95通过GluR6-PSD-95-MLK3通路参与导致其的神经毒性机制。此外，在亨廷顿氏病中，PSD-95是NMDA受体和huntingtin突变体神经毒性的介体。因此PSD-95抑制剂的研发对于上述疾病的治疗、改善和预防也具有重要意义。

发明概述

第一方面，本申请提供了肽，其包含氨基酸序列YEKLTTLDTGGV(SEQ ID NO:1)或其功能性变体。

在一些实施方案中，功能性变体为SEQ ID NO:1中的LDTGGV部分发生一处或多处保守型取代后产生的变体。在一些实施方案中，LDTGGV部分中的GG不发生取代。

在一些实施方案中，保守型取代选自D和E之间的取代，L、V和I之间的取代以及T和S之间的取代。

在一些实施方案中，功能性变体为SEQ ID NO:1中的LDTGGV部分被替换为下述任一序列后产生的变体：VDTGGV、VDTGGI、VDTGGL、VDSGGV、VDSGGI、VDSGGL、VETGGV、VETGGI、VETGGL、VESGGV、VESGGI、VESGGL、LDTGGV、LDTGGI、LDTGGL、LDSGGV、LDSGGI、LDSGGL、LETGGV、LETGGI、LETGGL、LESGGV、LESGGI、LESGGL，IDTGGV、IDTGGI、IDTGGL、IDSGGV、IDSGGI、IDSGGL、IETGGV、IETGGI、IETGGL、IESGGV、IESGGI、IESGGL。

第二方面，本申请提供了嵌合肽，其包含活性肽和内化肽，其中所述活性肽为第一方面所述的肽，所述内化肽能促进所述嵌合肽被细胞摄取。

在一些实施方案中，内化肽包含氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)。

在一些实施方案中，嵌合肽包含氨基酸序列YGRKKRRQRRR YEKLTTLDTGGV(SEQ IDNO:3)。

第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的肽或第二方面所述的嵌合肽，以及药学可接受的载体。

在一些实施方案中，药物组合物用于治疗中枢神经系统损伤或用作神经元保护剂。

在一些实施方案中，药物组合物用于治疗缺血性脑卒中导致的神经系统损伤。

第四方面，本申请提供了治疗中枢神经系统损伤的方法，包括向有需要的个体给予第一方面所述的肽，或第二方面所述的嵌合肽，或第三方面所述的药物组合物。

在一些实施方案中，个体为经历缺血性脑卒中的个体。

第五方面，本申请提供了第一方面所述的肽，或第二方面所述的嵌合肽，或第三方面所述的药物组合物在制备用于治疗中枢神经系统损伤的药物或神经元保护剂中的用途。

在一些实施方案中，所述药物用于治疗缺血性脑卒中导致的神经系统损伤。

附图简要描述

图1显示了Pull-down实验检测P6与PDZ1/2结构域的相互作用。M代表蛋白质分子量标识；泳道1为His+PDZ1/2+P6；泳道2为His+PDZ1/2；泳道3为单独的P6；泳道4为His+P6。泳道1所示的洗脱条带包含P6与PDZ1/2两者，证实P6能够结合PDZ1/2结构域。

图2显示了多肽P6对大鼠MCAO模型的脑切片TTC染色图。a.正常组；b.假手术组；c.模型组；d.阳性对照药恩必普注射液组；e.NA-1，10mg/kg体重；f.YE-NA-1，10mg/kg体重；g.P6-10mg/kg体重；h.P6-3mg/kg体重；i.P6-1mg/kg体重；j.预防给药组P6-10mg/kg体重；k.预防给药组P6-3mg/kg体重；l.预防给药组P6-1mg/kg体重。

图3显示了多肽P6的不同剂量组对大鼠MCAO模型治疗及预防给药脑梗死体积数据统计图。**p<0.01。

图4显示了多肽P6在大鼠脑中的分布。

图5显示了大鼠脑TTC染色。

图6显示了大鼠脑石蜡切片HE染色的结果。A:正常组，B：假手术组，C:模型组，D:阳性对照给药组，E：NA-1，F：YE-NA-1组，G：P6组，H：P6预防给药组。

发明详细描述

本申请的发明人研究了本领域已报道的能降低至少部分由NMDAR兴奋性神经毒性介导的神经学病症的损伤效应的肽。不希望受任何理论的束缚，据信这类肽至少部分通过抑制NMDAR与突触后密度95蛋白(PSD-95)之间的相互作用来发挥作用(即PSD-95抑制剂)。在此基础上，本申请的发明人对缺血性脑卒中治疗的多个靶点进行了深入思考，通过体内外的药理药效实验，进行了多肽类神经元保护剂的设计和筛选，并筛选得到了具有理想性质的肽。

定义

除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常理解的含义。

本申请中对于氨基酸使用的单字母或三字母缩写遵循国际惯例。

术语“嵌合肽”表示具有两个天然不彼此结合的组件肽的肽，所述两个组件肽可以作为融合蛋白或通过化学键彼此结合。

术语“PDZ结构域”是指约90个氨基酸的模块蛋白质结构域，其特征是对脑突触蛋白PSD-95、果蝇(Drosophila)分隔连接蛋白Discs-Large(DLG)和上皮紧密连接蛋白Z01(Z01)具有显著(例如至少60％)的序列同一性。PDZ结构域也称作Discs-Large同源性重复(“DHRs”)和GLGF重复。PDZ结构域通常显示保留核心共有序列(Doyle,D.A.,1996,Cell 85：1067-76)。示例性的含PDZ结构域的蛋白质和PDZ结构域序列在美国申请No.10/714,537中公开。

术语“NMDA受体”或“NMDAR”是指已知与NMDA相互作用的膜关联蛋白。这些受体可以是人或非人的(例如小鼠、大鼠、兔子和猴子等)。

术语“特异性结合”是指两个分子(例如配体和受体)之间的结合，其特征是甚至在存在许多其他不同分子时，一种分子(配体)与另一种特异分子(受体)结合的能力，即在分子的异质混合物中显示一种分子对另一分子的优先结合的能力。配体与受体的特异性结合也如下被证明：存在过量未标记的配体时，经可检测标记的配体与受体的结合降低(即结合竞争实验)。

统计学显著的是指p值<0.05，优选地<0.01，最优选地<0.001。

术语“功能性变体”是指与母体具有相同或相近的生物学功能和性质的变体。作为非限制性的实例，“功能性变体”可以通过在母体中进行一处或多处保守型取代获得。

术语“内化肽”也可称为穿膜肽，在蛋白质药物领域被广泛使用，其功能是促进与其结合的活性肽被细胞摄取和吸收。作为非限制性的一个实例，内化肽可以为Tat肽，其中Tat肽的一个非限制性实例为YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)。

第一方面，本申请提供了肽，其包含氨基酸序列YEKLTTLDTGGV(SEQ ID NO:1)或其功能性变体。所述肽在本申请中也被称为“活性肽”，其在本申请的嵌合肽中作为治疗中枢神经系统损伤或作为神经元保护剂的活性部分。

根据已有的研究，一些抑制NMDAR与PSD-95之间的相互作用的活性肽是基于NMDAR的结构。例如，NMDAR2B具有GenBank ID4099612，C末端20个氨基酸为FNGSSNGHVYEKLSSLESDV和PL基序ESDV。已有的一些活性肽选取了NMDAR2B的C末端的部分氨基酸序列，从而与NMDAR2B产生对PSD-95的竞争性抑制。有研究认为上述肽中的ESDV或LESDV区段在抑制NMDAR与PSD-95蛋白之间的相互作用中发挥重要作用。在不受任何理论束缚的情况下，本申请的发明人出人意料地发现，本文公开的活性肽YEKLTTLDTGGV(SEQ IDNO:1)中，其对PL基序进行了改变(包括增加了两个疏水性较强的甘氨酸(GG))，同时相对于PL基序增加了N端方向的YEKL氨基酸序列，本申请证实这样的改变能够增强活性肽与PDZ1/2结构域的相互作用。同时相对于YEKL基序，其C端的LDTGGV可以进行变化，预期不影响活性肽的活性或有可能增加其活性。因此，在一些实施方案中，本申请提供的功能性变体为SEQID NO:1中的LDTGGV部分发生一处或多处保守型取代后产生的变体。

在一些实施方案中，保守型取代选自D和E之间的取代，L、V和I之间的取代以及T和S之间的取代。在一些实施方案中，LDTGGV部分中的GG不发生取代。

在更具体的一些实施方案中，功能性变体为SEQ ID NO:1中的LDTGGV部分被替换为下述任一序列后产生的变体：VDTGGV、VDTGGI、VDTGGL、VDSGGV、VDSGGI、VDSGGL、VETGGV、VETGGI、VETGGL、VESGGV、VESGGI、VESGGL、LDTGGV、LDTGGI、LDTGGL、LDSGGV、LDSGGI、LDSGGL、LETGGV、LETGGI、LETGGL、LESGGV、LESGGI、LESGGL，IDTGGV、IDTGGI、IDTGGL、IDSGGV、IDSGGI、IDSGGL、IETGGV、IETGGI、IETGGL、IESGGV、IESGGI、IESGGL。

在一些实施方案中，本文所公开的功能性变体还包括与以上提到的肽具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、甚至更高的同一性的氨基酸序列。本领域已知，两种蛋白之间的“同一性”通过将一种蛋白的氨基酸序列和它的保守氨基酸取代的第二种蛋白的序列进行比对来确定。使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定两种蛋白之间的同一性程度。两个氨基酸序列之间的同一性优选地通过利用BLASTP算法确定。

在一些实施方案中，本文所公开的功能性变体包括与以上提到的肽相比，具有1、2、3、4、5或更多处的氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入区别于上述公开的具体的肽。

如上所述，功能性变体可以通过一个或多个取代、缺失、添加和/或插入区别于上述公开的具体的肽。这些变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本文公开的上述肽序列并按照本文所述用本领域内公知的多种技术中的任何一种评估其生物活性。

本领域技术人员应当理解，将活性肽和内化肽嵌合的目的主要在于使活性肽更好地到达作用靶点，因此，适用于本申请的内化肽并不局限于特定种类，只要能实现穿膜、内化的目的即可。本领域技术人员还应当理解，由于活性肽的作用靶点主要位于神经元细胞内部，因此能特异性地适合于神经元细胞的内化肽是优选的。在一些实施方案中，内化肽可以为Tat肽。在一些实施方案中，Tat肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，嵌合肽包含氨基酸序列YGRKKRRQRRRYEKLTTLDTGGV(SEQ ID NO:3)。

应当理解，内化肽可以与活性肽通过酰胺键连接而作为融合肽，但是也可以通过其他合适的方式进行接合，例如化学键接合。两种组分的偶联可以通过偶联剂或缀合剂实现。大量这类试剂是可商业获得的，并可以参见S.S.Wong，Chemistry of ProteinConjugation and Cross-Linking,CRC Press(1991)。交联试剂的一些例子包括J-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(SPOP)或N，N'-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺；N，N’-亚乙基-双-(碘乙酰胺)或具有6到11个碳亚甲基桥的其他这类试剂(其它巯基相对特异)；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基形成不可逆的连接)。其他交联试剂包括P，P’-二氟-m，m’-二硝基二苯砜(其与氨基和酚基形成不可逆的交联)；二乙胺代己酸二甲酯(其对氨基是特异的)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；1，6-己二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或苯基偶氮-对-二异氰酸酯(其主要与氨基反应)；戊二醛(其与若干不同的侧链反应)和双重氮基联苯胺(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)。

此外，前文所述的肽能够任选地被衍生化(例如乙酰化、磷酸化和/或糖基化)以促进与抑制剂的亲合力，促进抑制剂跨越细胞膜被转运的能力，或促进稳定性。

可通过固相合成或重组方法合成本申请的活性肽以及与内化肽融合的融合肽。可使用科学文献和专利文献中所述的多种方案和方法合成拟肽，所述科学文献和专利文献例如为Organic Syntheses Collective Volumes,Gilman等(编)John Wiley&Sons,Inc.,NY,al-Obeidi(1998)Mol.Biotechnol.9:205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1：114-119；0stergaard(1997)Mol.Divers.3:17-27；0stresh(1996)Methods Enzymol.267:220-234。

在一些实施方案中，本文公开的活性肽或嵌合肽可以以药物组合物的形式被施用。药物组合物可以通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包封、捕获或冻干方法制造。

可以使用一种或多种生理学可接受的便于将活性肽或嵌合肽加工成可药用制剂的载体、稀释剂、赋形剂或辅料，以常规方式配制药物组合物。适当的配制依赖于选择的施用途径。

在一些实施方案中，施用可以是肠胃外、静脉内、经口、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内的。优选静脉内施用。

在一些实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物优选地是无菌和基本等渗的。对注射而言，可以将活性肽或嵌合肽配制进水溶液中，优选地配制进生理学兼容的缓冲液例如Hank’s溶液、Ringer’s溶液，或生理盐水或乙酸缓冲液中(以减轻注射位点处的不适)。溶液可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

或者，活性肽或嵌合肽可以是用于在使用前用合适的运载体(例如无菌无热源水)构建的粉末形式。

对跨粘膜施用而言，在配制物中使用适合要穿透的屏障的穿透剂。该施用途径可被用于将化合物递送至鼻腔或用于舌下施用。

在一些实施方案中，对经口施用而言，可以将活性肽或嵌合肽与可药用的载体一起配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆体、悬浮液等，用于由被治疗的患者经口摄入。对于口服固体配制物例如粉末、胶囊和片剂而言，合适的赋形剂包括填充剂例如糖，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚维酮(PVP)；制粒剂和粘合剂。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。如果需要，可以使用标准技术对固体剂型进行糖包裹或肠溶衣包裹。对于口服液体制剂例如悬浮液、酏剂和溶液而言，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、甘油、油、醇。另外，可以添加调味剂、防腐剂、着色剂等。

除了先前所述的配制物以外，也可以将活性肽或嵌合肽配制成储存制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用这类长效配制物。因此，例如可将化合物与合适的多聚体材料或疏水材料(例如配制为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制在一起，或配制为略溶的衍生物，例如配制为略溶的盐。

或者，可以使用其他药物递送系统。可使用脂质体和乳剂递送嵌合肽。也可以使用某些有机溶剂例如二甲基亚砜。另外，可以使用持续释放的系统(例如含有治疗剂的固体聚合物的半渗透性基质)递送化合物。

根据其化学性质，持续释放胶囊可释放嵌合肽数周直至超过100天。根据治疗试剂的化学性质和生物稳定性，可以使用用于蛋白质稳定的其他策略。

在一些实施方案中，因为本文公开的活性肽或嵌合肽可含有带电的侧链或末端，所以它们可以作为游离酸或碱或作为可药用的盐包含在任何上述配制物中。可药用的盐是基本保留游离碱的生物活性并通过与无机酸反应而制备的盐。药物盐倾向于比相应的游离碱形式更易溶于水和其它质子溶剂。

活性肽或嵌合肽以有效达到预期目的(例如减轻损伤性脑卒中和相关病症的损伤效果)的量使用。治疗有效量表示：相对于未用本文公开的活性肽或嵌合肽治疗的患者(或动物模型)对照群体中的中枢神经系统损伤而言，在用本文公开的活性肽或嵌合肽治疗的患者(或动物模型群体)中，足以显著降低脑卒中引起的损伤的活性肽或嵌合肽的量。如果与未通过本文公开的方法治疗的可比较的患者对照群体中的平均输出(通过梗死体积或残疾指数测定)相比，个体经治疗的患者达到更良好的输出，则该量也被认为是治疗上有效的。如果个体被治疗的患者在Rankin标度中显示2或更少的残疾以及在Barthel标度中显示75或更多，则所述量也被认为是治疗上有效的量。如果与可比较的未治疗群体相比，被治疗的患者群体在残疾标度上显示显著改进(即更少残疾)的分值分布，则剂量也被认为是治疗上有效的，见Lees等，N Engl J Med 2006；354:588-600。治疗上有效的方案表示治疗上有效的剂量和达到上述预期目的所需的施用频率的组合。通常单一施用就足够了。

在一些实施方案中，优选的剂量范围包括脑卒中后6小时内每kg患者体重0.001到20μmol活性肽或嵌合肽，任选地每kg患者体重0.03到3μmol活性肽或嵌合肽。在一些方法中，在6小时内施用每kg患者体重0.1-20μmol活性肽或嵌合肽。在一些方法中，在6小时内施用每kg患者体重0.1-10μmol活性肽或嵌合肽，更优选在6小时内施用每kg患者体重约0.3μmol活性肽或嵌合肽。在其他情况下，剂量范围是每kg患者体重0.005到0.5μmol活性肽或嵌合肽。可以通过除以6.2来补偿不同的表面积：质量比，将每kg体重的剂量从大鼠转化为人。以克计，用于人的活性肽或嵌合肽的合适剂量可包括0.01到100mg/kg患者体重，或更优选0.01到30mg/kg患者体重或0.01到10mg/kg，或0.01到1mg/kg。

在一些实施方案中，施用的活性肽或嵌合肽的量取决于被治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重性、施用方式和开处方的医师的调节。在症状可检测时或甚至不可检测时可重复治疗。治疗可单独提供或者与其他药物组合提供。

本文公开的活性肽或嵌合肽的治疗上有效的剂量能够提供治疗益处而不引起重大的毒性。可以通过标准药物步骤在细胞培养物或实验动物中测定嵌合肽的毒性，例如通过测定LD50(使50％群体致死的剂量)或LD100(使100％群体致死的剂量)来实现。毒性效应和治疗效应的剂量比例是治疗指数。优选显示高治疗指数的嵌合肽或拟肽(见例如Fingl等，1975,In:The Pharmacological Basis of Therapeutics,第1章，第1页)。

在一些实施方案中，药物组合物用于治疗、改善或预防神经系统损伤或该损伤引起的疾病或疼痛，或者用作神经元保护剂。在一些实施方案中，所述神经系统损伤为兴奋性神经毒性引起的神经系统损伤，其中所述损伤位于外周神经系统或中枢神经系统。

在一些实施方案中，兴奋性神经毒性引起的神经系统损伤包括选自脑卒中或脊髓损伤、脑或脊髓的缺血性或创伤性损伤以及中枢神经系统(CNS)神经元的损伤，包括急性CNS损伤、缺血性脑卒中或脊髓损伤，以及缺氧、缺血、机械损伤和神经退行性疾病、焦虑、癫痫、脑卒中引起的损伤。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗、改善或预防缺血性脑卒中导致的神经系统损伤。

脑卒中是由CNS中受损的血流导致的病症。可能的原因包括栓塞、出血和血栓形成。一些神经元细胞由于受损的血流而立即死亡。这些细胞释放其组分分子(包括谷氨酸)，所述组分分子随后活化NMDA受体，所述NMDA受体提高细胞内钙水平和胞内酶水平，导致更多的神经元细胞死亡(兴奋性神经毒性级联放大)。CNS组织的死亡被称作梗死。梗死体积(即脑中由脑卒中导致的死亡的神经元细胞的体积)可以被用作脑卒中导致的病理学损伤程度的指标。症状性效果既取决于梗死体积，也取决于梗死在脑中位于何处。残疾指数可被用作症状性损伤的度量，例如Rankin中风输出标度(Rankin Stroke Outcome Scale,Rankin,Scott MedJ；2:200-15(1957))和Barthel指数(Barthel Index)。Rankin标度以如下直接评价患者的全局病症为基础：

0 完全没有症状。

1 尽管有症状但是没有显著的残疾；能够进行所有日常工作和活动。

2 轻微残疾；不能进行所有先前的活性，但是能够照顾自己的事务而不需要帮助。

3 需要一些帮助的中度残疾，但是能够行走而不需要帮助。

4 中度到严重的残疾，不受帮助时不能行走，并且不受帮助时不能照顾自身的身体需要。

5 严重残疾；卧床不起，失禁，并需要持久的护理和关注。

Barthel指数以关于患者进行10种基本日常生活活动的能力的一系列问题为基础，所述问题得到0和100之间的分数，较低的分数表示较多的残疾(Mahoney等,MarylandState Medical Journal 14:56-61(1965)。

或者可使用NIH脑卒中标度测量脑卒中严重性/输出，所述NIH脑卒中标度可在万维网ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf上获得。该标度以患者实行11组功能的能力为基础，所述功能包括评价患者的意识、运动、感受和语言功能水平。

缺血性脑卒中更明确地表示由于通向大脑的血流被堵塞而引起的一类脑卒中。这类堵塞的潜在病症最常见地是沿血管壁的脂肪沉着物的发生。该病症被称作动脉粥样硬化。这些脂肪沉着物能够引起两种梗阻。脑血栓形成是指在血管的阻塞部分产生的血栓(血块)。“脑栓塞”通常是指血液中的各种栓子(如心脏内的附壁血栓、动脉粥样硬化的斑块、脂肪、肿瘤细胞、纤维软骨或空气等)随血流进入脑动脉而阻塞血管，当侧枝循环不能代偿时，引起该动脉供血区脑组织缺血性坏死，出现局灶性神经功能缺损。栓塞的第二个重要原因是不规则的心博，称作动脉肌纤维震颤。其引起下述病症，其中血块可在心中形成，移动并转移至脑。缺血性脑卒中的其他潜在原因是出血、血栓形成、动脉或静脉的切割、心脏停博、任何原因(包括出血)引起的休克，和医源性原因，如对脑血管或导向脑的血管的直接手术损伤或心脏手术。缺血性脑卒中构成所有脑卒中病例的约83％。

若干种其他神经病学病症也可以通过NDMAR介导的兴奋性神经毒性导致神经死亡。这些病症包括神经退行性疾病、焦虑、癫痫、缺氧、与脑卒中无关的对CNS的创伤如创伤性脑损伤和脊髓损伤。因此，在一些实施方案中，药物组合物用于治疗、改善或预防神经退行性疾病、焦虑或癫痫，其中所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病或亨廷顿氏病。

第四方面，本申请提供了治疗、改善或预防神经系统损伤及该损伤相关的疾病或疼痛、神经退行性疾病、焦虑或癫痫的方法，包括向有需要的个体给予第一方面所述的肽，或第二方面所述的嵌合肽，或第三方面所述的药物组合物。

在一些实施方案中，兴奋性神经毒性引起的神经系统损伤包括选自脑卒中或脊髓损伤、脑或脊髓的缺血性或创伤性损伤以及中枢神经系统(CNS)神经元的损伤，包括急性CNS损伤、缺血性脑卒中或脊髓损伤，以及缺氧、缺血、机械损伤和神经退行性疾病、焦虑、癫痫、脑卒中引起的损伤。

在一些实施方案中，神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病或亨廷顿氏病。

在一些实施方案中，个体为经历缺血性脑卒中的个体。在一些实施方案中，给予本申请第一方面所述的肽，或第二方面所述的嵌合肽，或第三方面所述的药物组合物能够降低脑缺血导致的脑梗塞部分的体积。

第五方面，本申请提供了第一方面所述的肽，或第二方面所述的嵌合肽，或第三方面所述的药物组合物在制备用于治疗、改善或预防神经系统损伤及该损伤相关的疾病或疼痛、神经退行性疾病、焦虑或癫痫，的药物或神经元保护剂中的用途。

在一些实施方案中，所述药物用于治疗、改善或预防缺血性脑卒中导致的神经系统损伤。

应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。

实施例

提供以下实施例是仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。

实施例1：活性肽分子的筛选

根据已报道的研究结果，选取Tat穿膜肽YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)，并将其与不同数目的氨基酸相连接，形成肽库。将肽库中的嵌合肽分子，分别与体外表达并纯化的PDZ1/2结构域相互作用，根据相互作用力的强弱，对多肽进行初步筛选。

固定的分子(配体)为PDZ1/2蛋白，分子量：～20kD，浓度：2mg/ml；流动相的分子(分析物)：待筛选多肽，分子量：～2kD，浓度：10mg/ml。使用Biacore 3000仪器，CM5芯片进行固定。电泳缓冲液为PBS+0.005％吐温20。使用氨基偶联方法进行固定。配体的浓度为10μg/ml。固定缓冲液为10mM醋酸钠，pH 4.0。固定量：1400RU，固定至流动细胞2。使用的流速为10μl/ml，配体进样1分钟。使用PH2.0+2.5的10mM Gly作为再生液，以30μl/分钟的流速进行再生。进样时间为30s。

使用下述条件进行动力学分析：对照通道：流动细胞1；电泳缓冲液为PBS；使用Kinetic Analysis Wizard模式，浓度梯度为6.25n、12.5n、25n、50n、100n、200n、400nM；进样时间为1分钟；解离时间为2min；流速为30μl/分钟。

用拟和软件BIAevaluation 4.1软件对数据进行拟合。拟和模型为1：1结合模型。解离常数KD值与作用力呈反比。

通过筛选，获得了与PDZ1/2结构域具有较强相互作用能力的嵌合肽，将其命名为P6，序列如下：

P6:YGRKKRRQRRRYEKLTTLDTGGV(SEQ ID NO:3)

为了直接与已报道的研究中的类似嵌合肽进行比较，引入了对照嵌合肽NA-1，序列如下：

NA-1：YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO:4)

此外，通过比较P6与NA-1的结构差异，另外引入了在嵌合肽NA-1的活性肽的N端加入YE两个残基的嵌合肽YE-NA-1，序列如下：

YE-NA-1：YGRKKRRQRRRYEKLSSIESDV(SEQ ID NO:5)

将嵌合肽NA-1、YE-NA-1和P6同时进行上文所述的与PDZ1/2结构域相互作用的测试，结果如下文表1所示：

表1.三种嵌合肽与PDZ1/2结构域相互作用力检测

嵌合肽	NA-1	YE-NA-1	P6
				KD(M)	7.53E-08	5.44E-08	3.42E-08

如表1所示，相比于对照嵌合肽NA-1，嵌合肽YE-NA-1及P6与PDZ1/2结构域相互作用力更强，并且P6的作用性质更佳。因此，据发明人的推测，活性肽的N端额外的YE两个氨基酸残基对多肽与PDZ1/2结构域的相互作用有一定的增强作用。此外，P6相对于YE-NA-1羧基端减少了一个疏水性较弱的天冬氨酸(D)并增加了两个疏水性较强的甘氨酸(GG)，据发明人的推测，这可能因此进一步增加了多肽与PDZ1/2结构域的相互作用。

以下实验中选取嵌合肽P6进行进一步地测试，并在部分实验中将NA-1和YE-NA-1作为对照。

实施例2：Pull-down实验检测P6与PDZ1/2结构域的相互作用

为证明P6能与PDZ1/2结构域相互作用，进行Pull-down实验。

用100μl的His珠子和1ml的MCAC-0缓冲液将柱子平衡5min。在4℃震荡。将混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。向混合物中加入1mg PDZ1/2蛋白，并用缓冲液补齐至1ml。在4℃，将所述混合物旋转结合1小时。将所述混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。用1ml的MCAC-0缓冲液清洗3次，每次5分钟(在4℃，震荡洗涤)。向混合物中加入1mg P6蛋白，并用缓冲液补齐至1ml。在4℃，将所述混合物旋转结合2小时。将所述混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。用1ml裂解液进行清洗3次，每次5分钟(在4℃，震荡洗涤)。清洗之后加入20μl MCAC-300。离心，取洗脱液进行SDS-PAGE检测。实验结果显示于图1。

如图1所证实，嵌合肽P6的洗脱条带中同时包含P6和PDZ1/2结构域两者，由此证实嵌合肽P6能够结合PDZ1/2结构域。

实施例3:嵌合肽对大鼠MCAO模型的治疗效果

MCAO制备方法及评分标准：

局灶性脑缺血再灌注模型的制备根据longa提出的可逆性大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓法并根据大鼠脑解剖结构图加以改进制作局灶性脑缺血再灌注模型，以10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔麻醉，颈正中切口，暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及翼腭动脉，将0.26mm单丝尼龙鱼线头端0.5cm用石蜡包被,并于20mm长处标记，全部大鼠均通过右侧CCA切口处插入，翼腭动脉短暂夹闭以防误插，栓线长度自CCA分叉处约18～20mm，根据动物体重而定，栓塞右侧大脑中动脉，然后缝合皮肤，栓线尾端部分固定于皮肤上。缺血达到2h后小心抽出栓线，即形成再灌注。假手术对照只是不插入尼龙鱼线，其余步骤同手术组。在缺血期间及再灌注后2h保持体温在(37±0.5)℃。模型成功的标志为以大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪，站立不稳，提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。

神经功能缺失体征评分参考Longa及Bederson的5分制法，在动物麻醉清醒后24h进行评分。0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。分值越高，说明动物行为障碍越严重。

实验用动物及材料

动物：采用成年SD大鼠(维通利华)，SPF级，体重220-250g，雄性。

器械和药品：线剪1把、眼外科剪2把、弯镊4把、4#，5#手术缝线、6×17三角形缝针、0.26mm直径的栓线、持针钳1把。恩比普氯化钠注射液(石药集团恩必普药业有限公司)，水合氯醛、速尿(20mg/支)、硫酸庆大霉素(80mg/支)，棉签，医用托盘等。多肽由金斯瑞生物科技公司合成。

实验分组

实验分阴性对照组，假手术组，模型组，阳性药物恩必普组，NA-1组，YE-NA-1组，P6组。在缺血后1h，分别将生理盐水，阳性药恩必普，NA-1组(10mg/kg)，YE-NA-1(10mg/kg)组，P6(10mg/kg)，P6(3mg/kg)，P6(1mg/kg)经尾静脉注射给予各组大鼠。正常组与假手术对照组不给予任何药物。

梗死体积计算

评分后大鼠断头处死，迅速将取出的脑组织置于-20℃冰箱，10min后置室温环境，将脑置于大鼠脑切片模具中，切除嗅球、小脑和低位脑干后按图谱所示间隔2mm冠状切五刀，切成6个大脑连续冠状粗切片。然后迅速将脑片置于5ml含2％TTC的溶液中，37℃恒温、避光孵育30min，期间每隔5min将脑片翻动一次。经TTC染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存，应用图像分析系统软件处理并作统计，计算每张脑片的梗塞面积，乘以每片脑片的厚度2mm，每只动物所有脑片梗塞面积乘以厚度相加，即为脑梗塞体积。体积以所占大脑半球的百分率表示，以消除脑水肿的影响。

实验结果

实验结果如图2所示。根据对图2中的脑梗死体积的数据进行统计分析作出如图3所示的脑梗死体积数据统计的直方图，同时脑梗死体积的具体统计数据在如下表2中给出。结果显示最高剂量(10mg/kg)的P6的治疗给药和预防给药均能将脑缺血大鼠的脑梗死体积显著减少约50％(p＜0.01)，而阳性药物恩必普注射组仅减少了约16％(p＜0.01)，NA-1组减少了约16％(p＜0.01)，以及YE-NA-1组减少了约26％(p＜0.01)。次高剂量(3mg/kg)的P6的治疗给药和预防给药也较好地减少脑梗死体积。此外，数据显示减少梗死体积的数值随而P6的剂量增加而减少，治疗效果与药物浓度呈正相关。其中多肽YE-NA-1的治疗效果要显著优于NA-1，据发明人的推测，YE两个氨基酸的加入可能通过增加了多肽与PDZ1/2结构域的相互作用，从而比NA-1表现出更好的治疗效果。

表2.多肽P6对大鼠MCAO模型的治疗效果

实施例4:P6在大鼠脑内分布

将正常对照大鼠与MCAO模型造模后1h，分别经尾静脉注射生理盐荧光标记的多肽FITC-P6，10mg/kg，在给药后12h小时处死大鼠，迅速取出脑组织，放置在小动物活体成像系统装置中，进行荧光检测。荧光检测完毕后，将脑组织放入TTC染液中进行染色，判断缺血区域与药物分布的相关性。如图4和5所示，正常鼠脑可完全被TTC染色，其中并无荧光标记的多肽分布，而缺血鼠脑的缺血部位不能被TTC染色，且荧光标记的多肽分布在以中动脉区域为核心缺血区的缺血部位，提示多肽P6能够靶向分布于缺血部位，发挥治疗作用，并且其分布量与缺血程度呈正相关。

实施例5：HE染色观察组织学变化

各组大鼠均于缺血24h断头取脑，以视交叉附近冠状切片，切片厚度约为4mm，以10％福尔马林溶液固定切片，70％至100％的酒精浓度梯度脱水，然后于二甲苯中透明两次，再入石蜡中进行包埋，仔细修好蜡块后固定于石蜡切片机上进行切片，片厚为4μm，将蜡片完全展开并贴附在清洁干燥的载玻片上，4℃冰箱保存，进行常规HE染色，光镜观察染色结果。

实验结果如由图6所示：正常脑组织神经细胞核仁清晰、核圆形，核膜完整；而缺血模型组大鼠缺血侧脑组织出现严重的神经细胞坏死，细胞肿胀，胞核浓缩，胞浆疏松淡染及空泡化；P6，10mg/kg治疗及预防给药组上述病理变化明显改善，且结果优于阳性药物恩必普注射液，NA-1及YE-NA-1，10mg/kg。

实施例6：急性毒性试验

用大鼠进行急性毒性试验。结果表明：在200mg/kg体重的给药剂量下，P6对大鼠无致死作用和其它明显的毒副作用。

本说明书中引用的所有出版物和专利文献引入本文作为参考，如同每个出版物或专利被分别明确指明引入本文作为参考。在不偏离本申请公开的真实思想和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和用等同物替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。

Claims

1.肽，其由氨基酸序列YEKLTTLDTGGV (SEQ ID NO: 1)组成。

2.嵌合肽，其由活性肽和内化肽组成，其中所述活性肽为权利要求1所述的肽，所述内化肽能促进所述嵌合肽被细胞摄取。

3.如权利要求2所述的嵌合肽，其中所述内化肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRR(SEQ IDNO: 2)。

4.如权利要求3所述的嵌合肽，其中所述嵌合肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRYEKLTTLDTGGV (SEQ ID NO: 3)。

5.药物组合物，其包含权利要求1所述的肽或权利要求2-4中任一项所述的嵌合肽，以及药学可接受的载体。

6.权利要求1所述的肽，或权利要求2-4中任一项所述的嵌合肽，或权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗、改善或预防哺乳动物中的神经系统损伤的药物中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述神经系统损伤为脑卒中导致的神经系统损伤。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述脑卒中选自缺血性卒中和出血性卒中。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述脑卒中为由缺血性卒中转化成的出血性卒中。

10.如权利要求6所述的用途，其中所述神经系统损伤为兴奋性神经毒性引起的神经系统损伤。

11.如权利要求6所述的用途，其中所述神经系统损伤位于外周神经系统或中枢神经系统。

12.如权利要求10所述的用途，其中所述兴奋性神经毒性引起的神经系统损伤为脑卒中或脊髓损伤。

13.如权利要求10所述的用途，其中所述兴奋性神经毒性引起的神经系统损伤为脑或脊髓的缺血性或创伤性损伤。

14.如权利要求10所述的用途，其中所述兴奋性神经毒性引起的神经系统损伤为中枢神经系统神经元的损伤。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述中枢神经系统神经元的损伤为急性中枢神经系统损伤。

16.如权利要求14所述的用途，其中所述中枢神经系统神经元的损伤为缺血性脑卒中或脊髓损伤。

17.如权利要求14所述的用途，其中所述中枢神经系统神经元的损伤为缺血或机械损伤。

18.如权利要求14所述的用途，其中所述中枢神经系统神经元的损伤为缺氧损伤。

19.如权利要求14所述的用途，其中所述中枢神经系统神经元的损伤为焦虑引起的损伤。

20.如权利要求14所述的用途，其中所述中枢神经系统神经元的损伤为癫痫引起的损伤。

21.权利要求1所述的肽，或权利要求2-4中任一项所述的嵌合肽，或权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗、改善或预防哺乳动物中的神经退行性疾病的药物中的用途。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏病或亨廷顿氏病。

23.权利要求1所述的肽，或权利要求2-4中任一项所述的嵌合肽，或权利要求5所述的药物组合物在制备神经元保护剂中的用途。