CN104053448A

CN104053448A - 一种蛛网膜下腔出血及局部缺血的治疗方法

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Publication number: CN104053448A
Application number: CN201280061924.1A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·蒂米安斯基
Original assignee: NoNO Inc
Current assignee: NoNO Inc
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2032-12-13
Also published as: IL233103A0; ZA201404636B; SG10201604676WA; EP2800575A4; KR20140108266A; AU2012354072A1; CN104053448B; JP6741642B2; KR102114490B1; MX2014007031A; JP2020128419A; AU2012354072B2; ES2731266T3; WO2013088382A1; MX364562B; EP2800575A1; JP2018052962A; KR20200057802A; JP6279483B2; SG11201403239UA

Abstract

本申请提供了来自PSD-95抑制剂的临床试验的数据，所述PSD-95抑制剂被施用于正在进行中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的动脉瘤的血管内修复的受试者。所述受试者根据其在执行所述血管内手术前所述动脉瘤是否破裂进行分类。所述试验证明，所述试验对于在执行所述血管内手术前所述动脉瘤是否破裂的受试者均有显著的益处。出人意料的是，从根据病理学和神经认知结果确定的治疗中获益最多的受试者，是那些导致蛛网膜下腔出血的动脉瘤破裂的受试者。这些数据构成证据表明，PSD-95抑制剂不仅在缺血性中风和出血性中风中有益，而且在中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的出血形式中有益，特别是对蛛网膜下腔出血有益。

Description

一种蛛网膜下腔出血及局部缺血的治疗方法

与相关申请的交叉引用

本申请是非临时专利申请，并享有申请日为2012年3月28日、专利号为US 61/617,001，申请日为2011年12月13日、专利号为US 61/570，264和申请日为2011年12月15日、专利号为CA 2762338的专利的优先权。上述每一项申请的全部内容以引用的方式并入本申请用作参考。

序列表

本申请包括一个以美国信息交换标准码(ASCII)格式提交给EFS网络在线提交系统的序列表，并由此将本申请全部内容以引用的方式并入用作参考。ASCII格式的副本已于2012年12月12日生成，文件名为427647SEQLIST.txt，大小为15kb。

背景技术

在美国每年大约有800,000人中风，带来的每年直接或间接的社会损失达到400亿美元。中风位列所有死亡原因的第三位。目前，只有脑局部缺血的再灌注疗法是广泛认可的针对急性中风的治疗手段(例如，阿替普酶(组织型纤溶酶原激活物或者重组组织型纤溶酶原激活剂)溶栓)。这些疗法平衡了改善的总体效果和严重并发症的潜在风险，而现在这些疗法并未被充分使用。安全药理神经保护，是一种通过增强大脑应对局部缺血的恢复力的脑救治方法，能够显著增加从急性中风治疗中受益的患者的数量。然而，几十年来，上千次的神经保护治疗并未使从细胞和啮齿动物上的发现转换为人类应用的研究获得成功，而且推定的神经保护剂的临床试验也失败了。这个科学危机导致了一个普遍思维定势，即药理神经保护在人体内是不可行的或者不具备可操作性的。因此，迫切需要判定药理神经保护在人体内是否可行。

中风可能是局部缺血或者出血导致的结果。出血性中风约占中风总数的17％，但是会导致高得不成比例的死亡和衰弱性损伤。经过只有批准的中风药物的治疗，如可恢复血液流通的组织型纤溶酶原激活剂，出血性中风只会恶化而不会缓解。大多情况下，将受试者带到医院、完成一个初步的诊断和实施脑扫描来判别是缺血性中风还是出血性中风所需要的时间可能使受试者错过组织型纤溶酶原激活剂的有效时限。因此，很多本可以从组织型纤溶酶原激活剂受益的缺血性中风受试者并未接受这种药物。

在中枢神经系统内部或者附近也可能发生并非由缺血性中风导致的出血，尤其是蛛网膜下腔出血，以及硬脑膜或硬膜血肿和大脑挫伤。这种出血可能是物理性创伤导致的，比如摔倒或者其他的头部撞击或者来自摇晃婴儿综合症。尽管这种出血当时的症状看似轻重不一，事实上都会迅速变得严重甚至威胁生命。这种出血是一种威胁生命的紧急情况，即使有最好最及时的治疗，也经常导致死亡和衰弱性损伤。

蛛网膜下腔出血(SAH)的特征在于所出血渗入蛛网膜下腔。蛛网膜下腔出血是一种严重的、急性的和威胁生命的情况，可以导致慢性衰弱性损伤。大约85％的自发性蛛网膜下腔出血病例是由颅内动脉瘤破裂导致的，被定义为动脉瘤蛛网膜下腔出血。动脉瘤蛛网膜下腔出血大多影响年龄从40到60岁的人群，女人更有可能发病。在美国每年动脉瘤蛛网膜下腔出血的发病率为每100，000人中有10人。蛛网膜下腔出血的其他的更为少见的原因包括诸如血管畸形的情况。已知的风险因素包括高血压、酗酒、药物滥用、吸烟和避孕。其他的风险因素包括其它血管中的动脉瘤、肌纤维发育不良和结缔组织疾病，以及多囊肾病史。

蛛网膜下腔出血是一个多阶段事件，开始出血时伴随有急性脑损伤，紧接着是第二阶段潜在损伤，比如脑动脉痉挛和脑积水导致的局部缺血。在急性的蛛网膜下腔出血诱导的损伤中，蛛网膜下腔的血液存在、颅内压升高、脑灌注压和脑血流量下降导致了急性级联损伤，造成短暂性脑缺血、由于颅内压突然升高产生神经刺激导致的脑外伤和某些情况下由于脑内形成血肿导致的脑损伤。另外，这些最初的情况可以导致直接的微血管损伤、血管堵塞和由于血小板聚集导致的血管活性物质释放。

第二阶段的缺血过程包括厌氧细胞呼吸、能量耗尽、蛋白质合成受损、兴奋性中毒、自由基攻击、神经紧张和DNA损伤、细胞凋亡和坏死，在一氧化氮\一氧化氮合酶路径中转化和脂质过氧化。尽管在蛛网膜下腔出血后可能参与造成脑损伤的第二阶段过程的范围已经被广泛认知，但是急性损伤时期单一机制的确切作用还是没有被完全了解。

蛛网膜下腔出血中，大脑局部缺血是脑动脉血管痉挛导致的结果，大约30％病例在临床过程中有并发症。蛛网膜下腔出血中与临床相关的血管痉挛最高发生几率出现在蛛网膜下腔出血后5到12天，这种并发症在蛛网膜下腔出血后前3天内发生的情况相当少见。在蛛网膜下腔出血后患者的最终临床结果很可能依赖于几个因素，包括人口因素诸如年龄和并存疾病、蛛网膜下腔出血的严重程度和蛛网膜下腔出血的多种并发症，诸如脑积水和血管痉挛。因此，作为瘤破裂后立即产生的症状，由血管痉挛导致的脑局部缺血不是导致蛛网膜下腔出血临床副反应的唯一因素。

现在针对中风和相应症状的另一种不同形式的治疗手段在临床试验阶段(参见WO2010144721和Aarts et al.,Science298,846-850(2002))。这种治疗方法使用了TAT-NR2B9C，也被称为Tat-NR2B9c(YGRKKRRQRRRKLSSIESDV；SEQ ID NO:6)，是一种抑制突触后致密物质-95(PSD-95)结合到天冬氨酸受体2(NMDAR2)族成员的药剂，可减少由于脑局部缺血诱导产生的兴奋性中毒。针对在缺血性中风和外伤性脑损伤中减小脑梗塞大小和减少功能性缺陷的治疗方法已有报道。

发明内容

本发明提供了一种治疗受试者体内蛛网膜下腔出血损伤效应的方法，包括对有蛛网膜下腔出血症状的受试者使用一种抑制突触后致密物质-95(PSD-95)与天冬氨酸受体2(NMDAR2)亚基结合的药剂。在某些方法中，蛛网膜下腔出血是物理性创伤导致的结果。在某些方法中，蛛网膜下腔出血是自发产生的。在某些方法中，蛛网膜下腔出血是由破裂的动脉瘤导致的。在某些方法中，蛛网膜下腔出血是由动静脉畸形导致的。在某些方法中，这种药剂可以抑制受试者体内神经认知缺陷的发展。在某些方法中，药剂可以抑制通过MRI成像可检测到的梗塞的发展。在某些方法中，受试者接受血管内手术以修复导致所述蛛网膜下腔出血的破裂血管。在某些方法中，这种药剂减轻所述血管内手术引起的疼痛。在某些方法中，疼痛是沿着被用于实施所述内窥镜手术的内窥镜穿过的路径产生的。在某些方法中，所述药剂是在导致所述蛛网膜下腔出血的破裂后的第4天施用的。在某些方法中，所述药剂是在导致所述蛛网膜下腔出血的破裂发生后的12天内多次施用的。在某些方法中，药剂每天施用两次至少施用两天，或每天施用一次至少施用三天。在某些方法中，药剂的剂量为1-3mg/kg。

本发明进一步提供了一种治疗受试者体内脑内出血的损伤效应的方法，包括对具有脑内出血症状的受试者使用一种抑制突触后致密物质-95(PSD-95)与天冬氨酸受体2(NMDAR2)亚基结合的药剂。在某些方法中，脑内出血是由高血压导致的。在某些方法中，脑内出血是由药物导致的。在某些方法中，这种药物为抗凝血剂。在某些方法中，这种药剂可以抑制受试者体内神经认知缺陷的发展。在某些方法中，这种药剂可以抑制通过MRI成像可检测到的梗塞的发展。在某些方法中，这种药剂是在以修复导致所述出血的血管为目的的手术之前、期间或之后施用的。在某些方法中，这种药剂是在施用另一种以减轻脑内出血的损伤效应为目的的药物之前、期间或之后施用的。

本发明进一步提供了一种能够抑制突触后致密物质-95(PSD-95)与天冬氨酸受体2(NMDAR2)亚基结合，用于减轻受试者中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的局部缺血或出血的损伤效应，以及用于减轻所述受试者接受治疗所述局部缺血或出血的手术时引起的疼痛。在某些方法中，该手术为血管内手术。在某些方法中，疼痛是沿着被用于实施所述内窥镜手术的内窥镜穿过的路径产生的。

本发明进一步提供了一种减轻疼痛的方法，包括对接受血管内手术的受试者施用抑制突触后致密物质-95(PSD-95)与天冬氨酸受体2(NMDAR2)亚基结合的药剂，所述药剂减轻所述受试者接受血管内手术时引起的疼痛。在某些方法中，疼痛是沿着被用于实施所述内窥镜手术的内窥镜穿过的路径产生的。

本发明进一步提供了一种抑制受试者中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的局部缺血或出血的损伤效应的方法，包括对受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2亚基结合的药剂的有效方案，所述受试者患有或被怀疑患有在中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的局部缺血或出血，其中，对所述受试者给予所述药剂时，所述受试者未曾接受扫描以区分局部缺血和出血。在某些方法中，受试者有中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的出血的症状。在某些方法中，受试者未经受接受再灌注治疗。

本发明进一步提供了一种治疗中枢神经系统局部缺血或出血的损伤效应的方法，包括对患有或对局部缺血或出血有患病风险的受试者施用一种抑制突触后致密物质-95(PSD-95)与天冬氨酸受体2(NMDAR2)亚基的结合的药剂。在某些方法中，该药剂与再灌注治疗联合施用。某些方法治疗出血性中风的损伤效应。在某些方法中，药剂是在所述出血的血管内修复之前、期间或之后施用的。在某些方法中，药剂是在施用其他药物治疗影响中枢神经系统的出血之前、期间或之后施用的。

本发明进一步提供了一种抑制突触后致密物质(PSD-95)与天冬氨酸受体2(NMDAR2)亚基结合的药剂，用于治疗由于再灌注而转化为出血性中风的缺血性中风，其中该药剂抑制了缺血性中风和出血性中风的损伤效应。

本发明进一步提供了一种治疗呈现一种或多种局部缺血迹象和/或症状的受试者群体的方法，包括施用一种药剂，该药剂能够抑制突触后致密物质-95(PSD-95)抑制剂与天冬氨酸受体2(NMDAR2)亚基或神经元型—氧化氮合酶nNOS结合；其中，对所述受试者进行再灌注治疗的副作用的不可接受风险分析，没有副作用的不可接受风险的受试者接受再灌注治疗，而有副作用的不可接受风险的受试者不接受再灌注治疗，可选地，其中所述药剂为抑制PSD-95与NMDAR2亚基或nNOS结合的肽，且所述肽与内化肽连接或所述肽被脂化从而便于其穿过细胞膜或血脑屏障。

在上述任意一项方法或药剂中，所述药剂是具有包含X₁tSX₂V(SEQ ID NO:7)或由X₁tSX₂V(SEQ ID NO:7)组成的氨基酸序列的肽，其中，t和S 为可替代的氨基酸，X₁选自E、Q、A和它们的类似物，X₂选自A、Q、D、N、(N-甲基)-A、(N-甲基)-Q、(N-甲基)-D、(N-甲基)-N和它们的类似物，并且所述肽的N端氨基酸与内化肽连接。在上述任意一项方法或药剂中，所述药剂具有包含YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO:6)或YGRKKRRQRRRKLSSIETDV(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列，或为具有由YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO:6)或YGRKKRRQRRRKLSSIETDV(SEQ ID NO:37)组成的氨基酸序列。在上述任意一项方法中，所述肽或其它药剂可以被连接到内化肽或被脂化，从而促进所述肽穿过细胞膜或血脑屏障。部分肽或其他药剂被豆蔻酰化。优选的，所述肽在其N端被豆蔻酰化。

本发明进一步提供了一种筛选化合物以获得益于治疗或有效预防在中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的中风或出血的活性的方法，所述方法包括：对正在经受影响所述中枢神经系统的血管内修复操作的人施用所述化合物，以及与阴性对照相比，确定所述化合物是否减少了磁共振成像(MRI)观察到的梗塞数量。在一些方法中，磁共振成像(MRI)包括磁共振弥散加权成像(DWIMRI)。在另一些方法中，磁共振成像(MRI)包括液体衰减翻转恢复磁共振成像(FLAIR MRI)。还有一些方法中，磁共振成像(MRI)包括磁共振弥散加权成像(DWIMRI)和液体衰减翻转恢复磁共振成像(FLAIR MRI)，且血管内操作造成的梗塞是通过识别在DWI成像和FLAIRMRI成像两者上显示的梗塞来确定的。

本发明进一步提供了一种具有包含X1tSX2V(SEQ ID NO:7)或由X1tSX2V(SEQ ID NO:7)组成的氨基酸序列的分离的肽，其中t和S为可替代氨基酸，X₁选自E、Q和A，X₂选自A、Q、D、N、(N-甲基)-A、(N-甲基)-Q、(N-甲基)-D和(N-甲基)-N，其中所述肽在其氨基酸的N端被脂化。部分肽具有包含KLSSIESDV或KLSSIETDV的氨基酸序列，或具有由KLSSIESDV或KLSSIETDV组成的氨基酸序列。

附图说明

图1A表示单个患者的采样DWI成像及LAIR MRI成像的扫描图，分别拍摄于患者登记时(操作前)和进行血管内操作第2天后(操作后)。箭头表示的DWI-阳性栓塞性中风(黄色：上图)的例子与他们的FLAIR-阳性相对应(红色：下图)。最右边的区域(ROIs)显示了用于计算损伤数目和计算缺血性损伤体积的可供选择的感兴趣区域。

图1B、C表示通过DWI MRI成像检测到的损伤数目和损伤体积的分布情况，一个是对接受第2-4天(day2-4)MRI成像检查(B；n＝184)的所有随机患者的检测结果的分布情况，另一个是对脑出血量<10cc’s的(C；n＝182)中风患者的检测结果的分布情况。由于数据的极端偏态分布，它们的标准偏差预计会受到异常值的高度影响。图B中提供了具有代表性的两名患者的DWI MRI成像扫描图切片，所述两名患者曾经历因手术并发症所致的严重中风(大中风large strokes)(其脑出血量>10cc’s)。由于损伤数目(counts of leisons)不依赖损伤体积，故严重中风(大中风large strokes)患者对损伤数目的反应不敏感。

图2表示经筛选、被随机分配到一个研究小组、并被纳入符合方案(per-protocol)的群体中的患者的数目。改进后的意向性治疗群体被定义为登记并随机分配到研究组的和接受研究药物(TAT-NR2B9C或安慰剂)的全部患者。符合方案的群体被定义为接受TAT-NR2B9C或安慰剂的和因重大的协议违规而未被排除的随机分配的患者，其中包括未能完成血管内操作后MRI成像扫描的患者(1例，患者在扫描完成前死亡)，或因死亡或拒绝后续跟进而未参与第30天研究结束访问(the30day end-of-study visit)的患者。然而，在随机的185名患者中，有184名患者完成了他们第2-4天的操作后的MRI成像扫描，而这些都被纳入分析。

定义

“嵌合肽”是一种具有双组分的肽，该双组分的肽不是通过自然方式相互连接的融合蛋白或化学键。

“融合”的蛋白或肽是指复合肽，例如，一个单独的连续氨基酸序列，由两个(或多个)不同的序列组成，异源肽通常不是以单独的肽序列方式融合的。

术语“PDZ结构域”指的是大约90个氨基酸的模块化蛋白质区域，对脑突触蛋白PSD-95具有显著的序列同源性(例如，至少60％)。果蝇的间璧连接蛋白Discs-Large(DLG)，及上皮的紧密连接蛋白ZO1(ZO1)，PDZ结构域也被称为Discs-Large的同源重复序列(“DHRs”)和GLGF(SEQ ID NO：68)的重复序列。PDZ结构域通常表现出持有核心共有序列(Doyle,D.A.,1996,Cell85:1067-76)。典型的包含氨基酸的PDZ结构域蛋白和PDZ结构域序列已在美国被公开。其申请号为10/714,537，在此将其通过整体引用并入文中。

术语“PL蛋白”或“PDZ配体蛋白”是指自然产生的蛋白质，所述蛋白质由分子复合PDZ结构域形成，或至蛋白质的羧基末端，当将全长蛋白单独表达时(例如，作为残基的肽片段3-25，例如3，4，5，8，9，10，12，14或16个残基)，即形成这样的分子复合物。采用如美国申请号10/714537中描述的“A测定法”或“G测定法”，分子复合物可以在体外或体内被观察到。

术语“NMDA受体”或“NMDAR”是指与蛋白结合的膜，该与蛋白结合的膜被已知与包括下面描述的各种形式的亚基的NMDA相互作用。这样的受体可以是人或非人(例如，小鼠，大鼠，兔，猴)。

“PL基序”是指PL蛋白的C端氨基酸序列(例如，C端3，4，5，6，7，8，9，10，12，14，16，20或25相邻的残基)(“C端PL序列”)或已知的结合PDZ结构域(“内部PL序列”)的内部序列。

“PL肽”是含有与PDZ结构域特异性结合的PL基序的肽，或由与PDZ结构域特异性结合的PL基序组成的肽，或以其他基于与PDZ结构域特异性结合的PL基序的肽。

术语“分离的”或“纯化的”表示该对象种类(例如，肽)已经从存在于样品中的污染物中纯化，例如从包含该对象种类的天然来源中获得的样品。如果一个对象种类被分离或纯化，其主要的大分子(例如，肽)物质存在于样品中(即，以摩尔计它比任何其它单个物种的组合物更丰富)，并且优选地，所述对象种类包含至少约50％(以摩尔计)的大分子物质。一般来说，分离的、纯化的或基本上纯的组合物包含超过80％至90％的大分子物质。最优选地，该对象种类纯化至基本上同质(即，通过常规的检测方法，不能在组合物种中检测到污染物质)，所述组合物本质上是由单一的大分子种类组成。术语“分离的”或“纯化的”并非一定排除其它存在的旨在充当与所分离种类相结合的组分。例如，内化肽可以被描述为分离的，尽管它被连接到活性肽或与药学上可接受的赋形剂相结合。

“拟肽”是指合成的化合物，其具有与天然氨基酸组成的肽基本相同的结构和/或功能特征。拟肽含有完全合成的非天然的氨基酸类似物，也可以是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。拟肽也包含保守置换任意量的天然氨基酸的情况，只要这样的置换大体上不改变该模拟物的结构和/或抑制性或结合活性即可。

个别拟肽残基可以通过肽键、其它化学键或者偶联方式连接，诸如，例如，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，双马来酰亚胺，NjN-二环己基碳二亚胺NjN-dicyclohexylcarbodiimide(DCC)或N₅N-二异丙基碳二亚胺N₅N-diisopropylcarbodiimide(DIC)。可替代传统的酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括如下，比如，酮亚甲基(例如，-C(＝O)-CH₂-替换为-C(＝O)-NH-))，氨基亚甲基(CH₂-NH)，乙烯，烯烃(CH＝CH)，醚(CH₂-O)，硫醚(CH₂-S)，四唑(CN₄.-)，噻唑，逆酰胺(retroamide)，硫代酰胺或酯(参见，例如，Spatola(1983)in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,pp 267-357,A Peptide Backbone Modifications,Marcell Dekker,NY)。

芳香族氨基酸的类似物可以通过替代物来生成，例如D-或L-萘基丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸；D-或L-I、-2、3-或A-芘基；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-对氟苯丙氨酸；D-或L-对-二苯基苯基丙氨酸；K-或L-对-甲氧苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L- 丙氨酸烷基，其中烷基可以是替代的或未替代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异丁基、异戊基或者非酸性氨基酸。一个非天然氨基酸的芳香环包括，例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。

酸性氨基酸的类似物可以通过替代物而生成，例如，通过保持一个负电荷的非羧酸氨基酸；(膦)丙氨酸；硫酸化苏氨酸。羧基侧基(例如，门冬氨酰或谷氨酰)也可以通过与碳二亚胺(R-N-C-N-R＝)反应来选择性地改良，所述碳二亚胺(R-N-C-N-R＝)诸如1-环己基-3、2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或者1-乙基-3(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。门冬氨酰或者谷氨酰也可以通过与铵离子反应转化为天冬酰胺和谷氨酰胺酰残基。

碱性氨基酸的类似物可以由例如以下物质的替代物生成：(除了赖氨酸和精氨酸之外)氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸，或者(胍基)-乙酸，或者(胍基)-烷-乙酸，其中烷于上文所定义。腈衍生物(例如，在羧基COOH处包含CN部分的)可以由天冬酰胺或谷氨酰胺所替换。天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基可以脱氨基成为相应的天冬氨酰残基或谷氨酰残基。

精氨酸残基类似物可以由精氨酸与例如一种或多种常规试剂反应生成，所述常规试剂包括例如苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮或者茚三酮，优选在碱性条件下进行反应。

酪氨酸残基类似物可以由酪氨酰与例如芳香族重氮化合物或者四硝基甲烷反应生成。N-乙酰咪唑和四硝基甲烷可以用来分别形成O-乙酰基酪氨酰类和3-硝基衍生物。

半胱氨酸残基类似物可以由半胱氨酰残基与例如α-卤代乙酸盐反应生成以提供羧甲基衍生物或者羧氨甲基衍生物，所述α-卤代乙酸盐诸如2-氯乙酸或者氯乙酰氨及相应的氨类。半胱氨酸残基类似物也可以由半胱氨酰残基与例如以下物质反应生成：溴-三氟丙酮，α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸；氯磷酸，N-烷基马来酰亚胺，3-硝基-2-吡啶基的二硫化物；甲基2-吡啶基的二硫化物；对氯高汞苯甲酸；2-氯汞基-4的硝基苯酚；或者氯-7-硝基苯-乙二酸-1,3-二唑。

赖氨酸类似物可以由赖氨酰和例如琥珀酸或者其他羧酸酐反应生成(氨基末端残基可以由赖氨酰和例如琥珀酸或者其他羧酸酐反应而发生改变)。赖氨酸和其他含有α-氨基的残基类似物也可以由与亚氨酸酯反应生成，诸如甲基吡啶亚胺甲酯，吡哆醛磷酸，吡哆醛，氯硼氢化物，三硝基苯磺酸，邻甲基异脲，2,4-戊二酮，以及与乙醛酸盐的转酰胺酶催化反应。

蛋氨酸类似物可以由与例如蛋氨酸亚砜反应生成。脯氨酸类似物包括例如哌啶酸，噻唑烷羧酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸，脱羟脯氨酸(dehydroproline)，3-甲基脯氨酸，4-甲基脯氨酸，或者3,3-二甲基脯氨酸。组氨酸残基类似物可以由组氨酰基与例如焦碳酸二乙酯或者对溴苯甲酰甲基溴反应生成。

其他类似物包括例如由脯氨酸的羟化和赖氨酸的羟化生成的物质；丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸，精氨酸和组氨酸的α-氨基的甲基化；N-末端胺的乙酰化；主链酰胺残基的甲基化或者N-甲基氨基酸的替代物；或者C-末端羧基的酰胺化。

本发明的拟肽也包括结构类似的残基，尤其是包括或模拟二级结构的残基，例如β转弯，β折叠，α螺旋结构，γ转弯等等。举个例子，用D-氨基酸作为天然氨基酸残基的替代物；N-α-甲基氨基酸；C-α-甲基氨基酸；或者肽内脱氢氨基酸可以引起或者稳定β转弯，γ转弯，β折叠或者α-螺旋构象。β转弯模拟结构已有描述，例如by Nagai(1985)Tet.Lett.26:647-650；Feigl(1986)J.Amer.Chem.Soc.108:181-182；Kahn(1988)J.Amer.Chem.Soc.110:1638-1639；Kemp(1988)Tet.Lett.29:5057-5060；Kahn(1988)J.Molec.Recognition1:75-79。Β折叠模拟结构已有描述，例如by Smith(1992)J.Amer.Chem.Soc.114:10672-10674。举个例子，由酰胺顺式代理及1,5-二取代四唑诱发的VI型β转弯在Beusen(1995)Biopolymers36:181-200中有描述。非手性的ω-氨基酸残基作为酰胺键的替代物掺入聚甲烯生成单元在Banerjee(1996)Biopolymers39:769-777'中有描述。多肽的二级结构可以通过例如高能.sup.IH核磁共振或者二维核磁共振谱得到分析，可参见例如Higgins(1997)J.Pept.Res.50:421-435。也可以参见Hruby(1997)Biopolymers 43:219-266,Balaji,et al.,U.S.Pat.No.5,612,895。

拟肽可以包含非天然结构组件的任意组合，典型的是以下三个结构基团：a)不同于天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团；b)非天然的残基替代天然存在的氨基酸残基；或者c)诱导二级结构模拟的残基，即引起或稳定诸如β转弯，γ转弯，β折叠，α-螺旋构象等等的二级结构。在嵌合包括活性肽和内化肽的拟肽物中，要么活性成分要么内化部分或者两者一起成为肽。

术语“特异性结合”是指两个分子之间的结合，例如，配体和受体，其特征在于一个分子(配体)关联另一个特定分子(受体)的能力，即使存在其他许多不同的分子，即展示一个分子在分子的异种混合中对另一个分子的优先结合。配体对受体的特异性结合也被可检测标记的配体在存在过量未标记配体的情况下对受体结合有所缩减这一情形所证实(即结合竞争试验)。

兴奋性毒性是病理过程，通过由受体对兴奋性神经递质谷氨酸的过度激活而使得神经元受损及被杀死，诸如NMDA受体，如NMDAR2B。

术语“受试者”包括人类和兽医动物，比如哺乳动物和实验室动物模型，如在临床研究中使用的小鼠或老鼠。

术语“试剂”包括任何含有具备或不具备药物活性的化合物、天然化合物、综合化合物、小分子、多肽和拟肽的混合物。

术语“药理剂”意指一种具有药理活性的试剂。药理剂包括已知的药物混合物，以及药理活性已被确定但是正在动物模型和临床试验中接受进一步的治疗评估的混合物。嵌合试剂包括连接内化肽的药理剂。如果制剂在筛选系统中呈现活性，表明该活性剂是或可能在疾病的预防或治疗中是有用的，那么可以说该制剂具有药理活性。该筛选系统可以在体外，在细胞内，在动物体上或者人体上。尽管需要进行进一步的测试来建立疾病治疗中实际预防或治疗用途，试剂仍可以被称为具有药理活性。

tat肽意为包括GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)或由GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)组成的肽，在tat肽中有不超过5个残基被删除、取代或插入序列内，该tat肽保留着利于连接肽或其他试剂摄取到细胞内的能力。优选地，任何氨基酸变化都是保守性代替。优选地，在聚集体中任何替换、删除或内部的插入给肽留下了净阳离子电荷，优选类似于上述序列。如此一来不替换或者删除R残基和K残基就可以完成。可以利用生物素或相似分子实现tat肽的氨基酸的衍生化，以减少炎症反应。

药理剂的共同施用意为以试剂的可检测量在足够接近的时间内施用不同的试剂，以同时呈现在血浆中，和/或该不同试剂对相同的一段疾病产生治疗效果，或者在治疗相同的一段疾病中各种试剂共同操作地或以协同方式地进行反应。举例来说，当以下两种试剂在足够接近的时间施用时，抗炎剂配合着一种含有tat肽的试剂反应，通过内化肽(internationalization peptide)，该抗炎剂可以抑制炎症反应诱导。

统计学上的重大意义指的是p值<0.05，优选地p值<0.01，最优选为p值<0.001。

一段疾病意为在一个时间段内疾病的迹象和/或症状在前后在更长的时间段内出现，在所述更长的时间段内迹象和/或症状消失或较少出现。

通常，中枢神经系统控制着大脑和/或脊髓。如果局部缺血或出血发生在中枢神经系统，则会影响中枢神经系统，立即影响中枢神经系统近端如蛛网膜下腔出血，或影响中枢神经系统更远端的血管出血。局部缺血或出血影响中枢神经系统，如果是这种症状而没有及时治疗，则会导致在中枢神经系统中的可检测到的症状或神经认知缺陷。

在一些情况下，例如由破裂引起的蛛网膜下腔出血，且该破裂发生的那天被认为是第一天。因此，例如，如果破裂是发生在周一，且在破裂后的四天内进行治疗，即截止周五之前进行治疗。发生在破裂后第5-12天的治疗是指周六到下周五期间内。

本发明还提供了治疗受试者群体的蛛网膜下腔出血的损伤效应的方法，包括：对有蛛网膜下腔出血症状的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2亚基结合的药剂，其中，与没有接受所述药剂的对照受试者相比，施用所述药剂的群体的损伤效应减轻。所述得到减轻的损伤效应为神经细胞死亡或认知缺陷。

具体实施方式

I.基本内容

本发明提供的数据是将PSD-95抑制剂应用在在临床试验中，受试者经受中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的动脉瘤腔内修复的损伤。受试者被分为在血管内手术前动脉瘤破裂和在血管内手术前动脉瘤未破裂两组。即使受试者存活下来，破裂也会导致更高的死亡率或更严重的虚弱。梗塞的数量和体积以及神经认知功能的评价用来对结果进行评估。不管动脉瘤是否在血管内手术前破裂，试验结果证明所述试验对患有颅内动脉瘤需要进行血管内修复的受试者具有非常显著的好处，并且副作用最小。然而，令人惊讶的是，从根据病理学和神经认知结果确定的治疗方案中获益最多的受试者，是那些导致蛛网膜下腔出血的血管内操作之前动脉瘤就已破裂的人。这些数据结果表明，PSD-95抑制剂不仅在治疗局部缺血性和出血性中风方面有益，而且在治疗中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的出血形式有益，而无论所述出血是否由中风导致，所述出血形式包括脑出血、脑内出血、颅内出血(ICH)、神经创伤、创伤性脑损伤、硬膜下和硬膜外出血，特别是蛛网膜下腔出血。施用PSD-95抑制剂的治疗在中枢神经系统的局部缺血性和出血性损伤上有效，并且副作用最小，这就意味着这种抑制剂可以给任何有中风或影响中枢神经系统的出血的迹象的受试者，而且对受试者的第一次仔细的诊断没有延误，该诊断一般是脑部扫描诊断来识别是局部缺血还是出血。试验还表明，PSD-95抑制剂可以有效减少疼痛，疼痛是沿着被用于实施腹股沟穿刺的血管内手术的血管内导管插入动脉系统和穿过其作用部位的路径产生的，在这种情况下，则与从腹股沟到大脑区域(例如，腿，腹股沟，腹部，胸部，颈部，头部)相关。虽然先前已有报道PSD-95抑制剂在治疗某些疼痛上有效，但结果是施用相同的PSD-95抑制剂具有双重作用，即可以抑制由动脉瘤血管内手术修复引起的损坏，也可以抑制由血管内手术本身产生的疼痛。

II.PSD-95抑制剂

这些试剂抑制PSD-95与一种或多种NMDARs之间相互作用，例如通过特异性结合PSD-95。优选地，抑制PSD-95与一种NMDAR2之间相互作用(例如，2A，2B，2C或2D)。参照这些试剂时，可以单独参考所述试剂或更通常地参考肽试剂，这些连接到内化肽的试剂作为一种嵌合肽。这种试剂对于降低一种或多种损坏效应是有效果的，该一种或多种损坏效应包括中风和通过至少部分由NMDAR兴奋毒性引起的其他神经疾病。这种试剂包括具有下述氨基酸序列的肽，包括或基于NMDARs或PSD-95的PDZ结构域的PL基序肽。这种肽还可以抑制PSD-95，nNOS和其他谷氨酸受体(例如，钾盐镁矾受体或AMPA受体)之间的相互作用，如KV1-4和GluR6之间的相互作用。优选的肽抑制突触后密度-95蛋白(PSD-95)(human amino acid sequence provided by Stathakism,Genomics44(1):71-82(1997))的PDZ结构域1和2与一种或多种NMDARs2亚基的C末端PL序列之间的相互作用，该一种或多种NMDARs2亚基包括神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR2B亚基(Mandich et al.,Genomics22,216-8(1994))。NMDAR2B具有基因数据库登记号4099612，有一个C末端20氨基酸FNGSSNGHVYEKLSSIESDV(SEQ ID NO：11)和一个PL基序ESDV(SEQ ID NO：12)。优选的肽抑制人PSD-95和人NMDARs。然而，抑制作用也可以从蛋白质的物种变体中显示出来。如下所示，为一个可以使用NMDA和谷氨酸受体的列表。

表1：有PL序列的NMDARs

一些肽抑制PSD-95和多个NMDAR亚基之间的相互作用。在这些实例中，对所述肽的使用不必需要了解不同的NMDARs对兴奋性神经传递的各自影响。对于一个单个NMDARs，其他肽是明确的。

肽可以包含或基于来自任意上述亚基的C末端的PL基序且具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包括[S/T]-X-[V/L]。优选地，所述序列位于本发明肽的C末端。优选的肽具有一个氨基酸序列，包括在序列[E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L](SEQ ID NO：38)的C末端。实施例中的肽包括：ESDV(SEQ ID NO：12)，ESEV(SEQ ID NO：29)，ETDV(SEQ ID NO：39)，ETEV(SEQ ID NO：40)，DTDV(SEQ ID NO：41)，和DTEV(SEQ ID NO：42)作为C末端氨基酸。两个特别优选的肽具有一个氨基酸序列包括或仅由KLSSIESDV(SEQ ID NO：5)，和KLSSIETDV(SEQ ID NO：43)组成。这些肽通常有3-25个氨基酸(无内化肽)，肽的长度为5-10个氨基酸，优选为9个氨基酸(也无内化肽)。在某些这种肽中，所有的氨基酸来自于NMDARs(不包括来自于内化肽的氨基酸)的C末端。本发明还包括本文所公开的这些肽和其他肽的拟肽。

抑制PDS95与NDMARs之间的相互作用的其它肽，包括来自于PSD-95的PDZ结构域1和/或2或任意这些肽的亚片段，所述亚片段抑制PSD-95与NMDARs之间的相互作用，例如NR2B。这种活性肽包含来自于PSD-95的PDZ结构域1和/或结构域2的至少50、60、70、80或90个氨基酸，65-248页中PSD-95 provided by Stathakism，Genomics 44(1):71-82(1997)(人序列)或NP_031890.1，GI：6681195(小鼠序列)或其他物种变体相应的区域。

本发明的肽和拟肽可包含修饰的氨基酸残基，例如，残基是N-烷基化。N末端烷基修饰可以包括，例如，N-甲基，N-乙基，N-丙基，N-丁基，N- 环己基甲基，N-环己基乙基，N-苄基，N-苯基乙基，N-苯基丙基，N-(3，4-二氯苯基)丙基，N-(3,4-二氟苯基)丙基，和N-(萘-2-基)乙基。

Bach,J.Med.Chem.51,6450-6459(2008)和WO 2010/004003描述了一系列NR2B9c的类似物。PDZ结合活性是由仅有3个C末端氨基酸(SDV)的肽显示。Bach还报道类似物具有氨基酸序列，其包含或由X₁tSX₂V(SEQ ID NO：7)，其中t和S为可替代的氨基酸，X₁是从E，Q和A或其中一种类似物中选择，X₂是从A，Q，D，N，(N-甲基)-A，(N-甲基)-Q(N-甲基)-D和(N-甲基)-N或其中一种类似物中选择。任选的肽是在位置P3的N-烷基化的位置(从C末端的第三个氨基酸，即被tS占据的位置)。所述肽可以是有一个环己烷或芳族取代基的N-烷基化的肽，并且还包括在该取代基与肽或肽类似物的末端氨基之间的连接基团，其中所述连接基团为烷基，优选地，从亚甲基，乙烯，丙烯和丁烯中选择。所述芳族取代基可以是一个萘-2-基部分或由一个或两个卤素和/或烷基取代的芳环。

其他修饰也可掺入且对活性没有不利影响，这些修饰包括一个或多个氨基酸的在天然的L-异构体形式中有D-异构体形式的氨基酸的取代。因此，任何氨基酸的L-构型(也可简称为R或S，取决于化学实体的结构)的天然存在可以被替换为具有相同的化学结构式的氨基酸或拟肽，但是具有相反手性的，通常被称为D-氨基酸，但它也可以被称为R-或S-型。因此，一种拟肽可以包括1，2，3，4，5，至少50％，或所有D-氨基酸残基。含有一些或所有D残基的拟肽有时被称为一种“变型”肽。

拟肽还包括反转肽。反转肽具有反向的氨基酸序列。拟肽还包括反转-变型肽，其中氨基酸的顺序被颠倒，最初的C末端氨基酸出现在N末端和被用来替代L-氨基酸的D-氨基酸。WO 2008/014917描述了具有氨基酸序列vdseisslk-rrrqrrkkrgyin(SEQ ID NO：8)(表示D氨基酸小写字母)的Tat-NR2B9c的一个反转-变型肽，并报道抑制脑局部缺血是有效的。本文描述的另一个实施例是肽RV-Tat-NR2B9(RRRQRRKKRGYKLSSIESDV；SEQ ID NO：9)。

一种连接物，例如，聚乙二醇连接体，可以作为二聚化肽或拟肽的活性部分，以提高向含有串联PDZ结构域的蛋白质的亲和力和选择性。例如，参见Bach et al.，Angew.Chem.Int.Ed.48:9685-9689and WO 2010/004003。一个含PL基序的肽被很好地二聚化，通过加入两个这种分子的N末端，留下C末端游离。Bach进一步报道了一种来自于NMDAR2B的C末端的五聚体肽IESDV(SEQ ID NO：10)有效地抑制NMDAR2B与PSD-95的结合。任选地，约2-10份的PEG可以串联加入作为连接体。

肽、拟肽或其他试剂合适的药理学活性可以根据需要进行测试，在本申请中描述的灵长类动物和临床试验中测试之前，用之前所描述的大鼠模型的中风进行确认合适的药理学活性。肽、拟肽或其它试剂也可进行筛选，其能抑制PSD-95和如美国20050059597中描述的试验中的NMDAR2B之间的相互作用。有用的肽、拟肽或其它试剂典型地具有小于50μM，25μM，10μM，0.1μM或0.01μM的IC 50值。优选的肽典型地具有0.001～1μM之间的IC 50值，更优选为0.05～0.5μM，或0.05至0.1μM。当肽、拟肽或其他试剂的特征为抑制一相互作用的结合时，例如，抑制PSD-95与NMDAR2B的相互作用，这样的描述并不排除该肽或试剂也抑制另一相互作用，例如，抑制PSD-95与nNOS的结合。

如上述的肽可任选地被衍生化(例如乙酰化，磷酸化和/或糖基化)，以提高抑制剂的结合亲和力，提高待传输到细胞膜的抑制剂的能力或提高其稳定性。作为其中一个具体的实施例，对于抑制剂来说，来自于C末端的第三个残基是S或T，所述抑制剂可以在利用该肽之前磷酸化所述残基。

药剂还包括抑制PSD-95和NMDAR2B之间的相互作用，和/或与上述其它小分子的相互作用，合适的小分子抑制剂在WO/2009/006611中描述。合适的实施例的化合物分子式如下所示：

其中R¹为选自由被0-4R⁷取代的环己基，被0-4R⁷取代的苯基，-(CH₂)_u-(CHR⁸R⁹)，支链C_1-6烷基(异丙基，异丁基，1-异丙基-2-甲基-丁基，1乙基-丙基)和-NH-C(O)-(CR 10R 11)VH组成的基团；

每个R⁷作为一个独立的基团，选自由C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，-C(O)R¹²，OH，COOH，-NO，N-取代的二氢吲哚和细胞膜异位肽组成的基团；

每个R⁸和R⁹独立地选自由H，OH，环己烷，环戊烷，苯基，取代苯基和环戊二烯基组成的基团；

每个R¹⁰和R¹¹独立地选自由H，环己烷，苯基和细胞膜异位肽组成的基团；

R¹²选自由C_1-6烷基和芳基组成的基团；和每个u和v都独立地选自为0至20；R²，R³，R⁴，R⁵和R⁶的其中一个为-COOH的，并且其中R²，R³，R⁴，R⁵和R⁶的残基各独立地选自由F，H，OCH₃和CH₃组成的基团中。

一种这种化合物是0620-0057，它的结构是：

一种药剂可以被连接到一种内化肽上，以促进吸收入细胞和/或穿过血脑屏障。任一上述药剂可连接到任一下述的内化肽上。内化肽是一类公知的相对较短的肽，该内化肽允许许多细胞或病毒蛋白穿过细胞膜。内化肽，也被称为细胞膜转导肽或细胞穿透肽，其可以有5-30个氨基酸。这些肽通常有来自于精氨酸和/或赖氨酸残基的超过正常值的阳离子电荷(相对于总蛋白质)，这被认为有利于其穿过细胞膜。一些这种肽具有至少5个，6个，7个或8个精氨酸和/或赖氨酸残基。实施例包括触角足蛋白(Bonfanti,Cancer Res.57,1442-6(1997))(及其变体)，人免疫缺陷病毒的tat蛋白，即VP22蛋白，是下述分子的产物，单纯疱疹病毒1型的UL49基因，穿膜肽，SynB1和3，转运酶，两亲性分子，gp41NLS，聚精氨酸和多个植物与细菌蛋白质毒素，如蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，蒴莲根毒素，白喉毒素，霍乱毒素，炭疽毒素，不耐热毒素，绿脓杆菌外毒素A(ETA)。其他实施例是在下列参考文献中描述(Temsamani，Drug Discovery Today，9(23):1012-1019，2004；DeCoupade，Biochem J.,390:407-418,2005；Saalik Bioconjugate Chem.15: 1246-1253,2004；Zhao,Medicinal Research Reviews24(1):1-12,2004；Deshayes,Cellular and Molecular Life Sciences62:1839-49,2005,Gao,ACS Chem.Biol.2011,6,484–491,SG3(RLSGMNEVLSFRWL)(通过合并引用)。

一种优选的内化肽是来自于HIV病毒的tat肽。在之前的报道中tat肽包括或由被发现在HIV Tat蛋白的标准氨基酸序列YGRKKRRQRRR的(SEQ ID NO：2)。因此，有两种优选的试剂掺入该tat肽，分别是包含或由该氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV，SEQ ID NO：6(也称为Tat-NR2B9c或TAT-NR2B9C)或YGRKKRRQRRRKLSSIETDV(SEQ ID NO：37)。如果这种Tat基序的另一残基可以是目前(在药剂旁)例如天然氨基酸侧翼部分来源于一个tat蛋白，连接子或一种通常用于连接两个肽结构域的连接氨基酸，例如，甘氨酸(SER)₄(SEQ ID NO：44)，TGEKP(SEQ ID NO：45)，GGRRGGGS(SEQ ID NO：46)或LRQRDGERP(SEQ ID NO：47)(参见，例如，Tang et al.(1996),J.Biol.Chem.271,15682-15686；Hennecke et al.(1998),Protein Eng.11,405-410))，或者可以是任何其它在没有侧翼的残基时吸入变体的能力没有明显降低的氨基酸。优选地，侧翼氨基酸除了活性肽的数量在YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：2)的任一边没有超过十个。一种合适的tat肽包含侧接于YGRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO：48)的C-末端的额外氨基酸残基侧翼上。然而，优选地，存在无侧翼氨基酸。其它可用的Tat肽包括GRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO：4)和GRKKRRQRRRP(SEQ ID NO：26)。

WO/2008/109010描述了上述具有降低的结合到N型钙离子通道的容量的tat肽的变异体。这样的变异体可能含有氨基酸序列XGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:49)或由该序列组成，其中X是除酪氨酸(Y)之外的氨基酸或不存在(在这种情况下，G是游离的N末端残基)。优选的tat肽的N末端Y残基被F替代。因此，含有FGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:3)或由该序列组成的tat肽为优选。另一优选的tat肽由GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)组成。另一优选的tat肽含有RRRQRRKKRG或RRRQRRKKRGY(SEQ ID NO:9的第1-10或第1-11个氨基酸)或由该序列组成。其他促进药物吸收而不抑制N型钙离子通道的tat衍生肽含有如下表2所示的序列。

表2

X-FGRKKRRQRRR(F-Tat)(SEQ ID NO:69)
	X-GKKKKKQKKK(SEQ ID NO:50)
X-RKKRRQRRR(SEQ ID NO:51)
	X-GAKKRRQRRR(SEQ ID NO:52)
X-AKKRRQRRR(SEQ ID NO:53)
	X-GRKARRQRRR(SEQ ID NO:54)
X-RKARRQRRR(SEQ ID NO:55)
	X-GRKKARQRRR(SEQ ID NO:56)
X-RKKARQRRR(SEQ ID NO:57)
	X-GRKKRRQARR(SEQ ID NO:58)
X-RKKRRQARR(SEQ ID NO:59)
	X-GRKKRRQRAR(SEQ ID NO:60)
X-RKKRRQRAR(SEQ ID NO:61)
	X-RRPRRPRRPRR(SEQ ID NO:62)
X-RRARRARRARR(SEQ ID NO:63)
	X-RRRARRRARR(SEQ ID NO:64)
X-RRRPRRRPRR(SEQ ID NO:65)
	X-RRPRRPRR(SEQ ID NO:66)
X-RRARRARR(SEQ ID NO:67)

X可能代表游离的氨基末端、一个或多个氨基酸或缀合部分(conjugated moiety)。内化肽(Internalization peptides)可以以翻转(inverso)、反向(retro)或翻转-反向(inverso retro)形式使用，在这些形式中有或没有连接肽或拟肽(peptidomimetic)。例如，优选的嵌合肽具有含有RRRQRRKKRGY-KLSSIESDV(SEQ ID NO:9)或由该序列组成的氨基酸序列，或具有含有RRRQRRKKRGY-KLSSIETDV(SEQ ID NO:37)或由该序列组成的氨基酸序列。

内化肽可以通过常规的方法连接到药物上。例如，药物可以通过化学连接(例如，耦合剂或缀合剂)与内化肽连接。可以在市场上买到多种这样的试剂，可参考S.S.Wong,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press(1991)。交联剂的一些实施例包括3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)或N,N'-间苯撑双马来酰亚胺(N,N'-(1,3-phenylene)bismaleimide)；N,N'-乙撑双硬脂酰胺(N,N'-ethylene-bis-iodoacetamide)或其他具有6～11个碳亚甲基桥(carbon methylene bridges)的试剂(对于巯基具有相对特异性)；以及1,5-二氟-2,4-二硝基苯(与氨基和酪氨酸基团形成不可逆连接)。其他的交联剂包括P,P′-二氟-m,m′-二硝基二苯砜(与氨基和酚基形成不可逆交联连接)；二甲基亚氨酸酯(对氨基基团具有特异性)；苯酚-1,4-二磺酰氯(主要与氨基基团反应)；六亚甲基二异氰酸酯、二异硫氰酸或苯偶氮基-p-二异氰酸酯(主要与氨基基团反应)；戊二醛(与几种不同的侧链反应)；以及二偶氮联苯胺(disdiazobenzidine)(主要与酪氨酸和组氨酸反应)。

对于连接有内化肽的肽药物，可以通过产生融合蛋白来实现，所述融合蛋白含有与内化肽融合的肽序列，优选地，所述肽序列位于融合蛋白的N末端。

除了连接抑制PSD-95的肽(或其他试剂)到内化肽，抑制PSD-95的肽可以被连接到脂质上(脂化，lipidation)，以增加与该肽相关的缀合物的疏水性，从而有利于联合肽穿过细胞膜和/或脑屏障。脂化优选在N末端氨基酸上进行，但也可以在内部氨基酸上进行，只要肽抑制PSD-95和NMDAR 2B相互作用的能力没有降低到50％以上。优选地，脂化是在除了C末端最后四个氨基酸的氨基酸上进行的。脂质是溶于乙醚不溶于水的有机分子，包括脂肪酸、甘油脂和固醇类。合适的脂化形式包括豆蔻酰化、棕榈酰化或添加其他脂肪酸(优选具有10～20个碳原子的长链，例如月桂酸和硬脂酸)以及香叶基化(geranylation)、耗牛儿基化(geranylgeranylation)和异戊二烯化。发生在天然蛋白翻译后修饰中的脂化类型为优选。将脂肪酸通过氨基连接到肽N末端氨基酸的α-氨基基团的脂化同样是优选的。脂化也可能是通过含有预脂化(prelipidated)氨基酸的肽合成进行的(在体外酶促进行)，或通过重组表达、化学交联或肽化学衍生进行。被豆蔻酰化和其他脂质修饰的氨基酸可以商业获取。

脂化优选促进联合肽(例如，KLSSIESDV(SEQ ID NO:5)或KLSSIETDV (SEQ ID NO:43))穿过细胞膜和/或血脑屏障，而不引起血压的瞬间下降，如与标准tat肽被高剂量给药时(例如，等于或大于3mg/kg)出现的血压瞬间下降情况一样，或至少比连接到标准tat肽的相同肽引起更轻微的血压下降。

可以通过固相合成法或重组方法合成药物肽(可选地，与tat肽融合)。可以用描述于科学和专利文献，例如Organic Syntheses Collective Volumes,Gilman et al.(Eds)John Wiley&Sons,Inc.,NY,al-Obeidi(1998)Mol.Biotechnol.9:205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1:114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.3:17-27；Ostresh(1996)Methods Enzymol.267:220-234中的多种流程和方法合成拟肽。

III.再灌注(reperfusion)试剂和方法

用PSD-95抑制剂处理缺血中风可以与再灌注治疗结合。再灌注治疗可以利用血栓溶解剂(例如tPA、溶栓酶或尿激酶)动脉内或静脉内给药，通过机械方法重新打开堵塞的血管或通过其他方法增强缺血脑区域的侧支循环来实现。通过给予PSD-95抑制剂，有更多有效时间进行脑部扫描，以确定存在缺血中风，然后在适当情况下给予tPA或进行另一种再灌注治疗。因此，更多的缺血中风受试者可以从tPA治疗或另一种增强脑再灌注疗法中受益，同时也从PSD-95抑制剂治疗中受益。

引起缺血的斑块、血凝块或任何其他颗粒物(统称为栓子)既可以通过药物方式也可以通过物理方式溶解、去除或消除。栓子或其他血流阻碍物的溶解、去除以及随后的血流恢复被称为“再灌注”。其中一类试剂通过血栓溶解起作用。这些试剂通过血纤维蛋白溶酶与组织纤溶酶原激活物(tPA)融合刺激纤维蛋白溶解而起作用。血纤维蛋白溶酶清除交联的血纤蛋白网(凝块的骨架)，使得凝块可溶，随后进一步被其他酶蛋白酶解，以及恢复堵塞血管中的血流。血栓溶解剂的实施例包括组织纤溶酶原激活物(tPA)、阿替普酶瑞替普酶替奈普酶阿尼普酶链激酶和尿激酶

另一种能够用于再灌注的药物是血管舒张药。血管舒张药通过放松和打开血管，从而使得血液流过阻碍物而起作用。血管舒张药的一些实施例包括 α-肾上腺素受体拮抗剂(α-阻滞剂)、血管紧张素受体阻滞剂(ARBs)、β2-受体激动剂(β2-拮抗剂)、钙离子通道阻滞剂(CCBs)、中枢作用交感神经阻滞剂、直接作用血管扩张剂、内皮素受体拮抗剂、神经节阻滞剂、硝基血管扩张剂(nitrodilators)、磷酸二酯酶抑制剂、离子通道开放剂以及肾素抑制剂。

再灌注的机械方法包括血管成形术、导管插入术和动脉搭桥术、支架术、栓子切除术或动脉内膜切除术。这些方法通过机械去除斑块、保持血管打开的方式恢复斑块流动，从而使得血液流过斑块或绕过斑块。其他增强再灌注的方法包括将血液的心输出量转移到脑循环的辅助设备，例如，主动脉内气囊(CoAxia NeuroFlo^TM)，从而增强对缺血区域的侧支灌注(参考clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00119717)。

IV.中风

无论何种原因，中风是由CNS区域血流量受损引起的症状。潜在的原因包括栓塞、脑出血和血栓形成。由于血流量受损，一些神经细胞立即死亡。这些细胞释放包括谷氨酸在内的组分分子，谷氨酸进而激活NMDA受体，导致细胞内钙水平和胞内酶水平增加，从而导致进一步的神经细胞死亡(兴奋性中毒级联，excitotoxicity cascade)。CNS组织的死亡被称为梗塞(infarction)。梗塞体积(即，大脑中由中风所导致的死亡神经细胞的体积)可作为由中风所引起的病理损伤程度的一项指标。在某些情况下，中风可能由多个栓子或由一般的动脉病引起。对于前者，栓子可能在心脏产生，例如，在心内膜炎心房房颤或心脏瓣膜疾病的情况下。对于后者，动脉病可能包括动脉炎(一种动脉传染性或自身免疫性炎症)。在这种情况下，脑部可能出现多次中风，有时是由于许多小栓子引起的。在这种情况下，另一种衡量由中风所导致的病理损害程度的方法是计算缺血性病变(ischemic lesions)的数量。这种方法尤其适用于手术引起的(procedurally-induced)中风情况，例如，在大脑动脉瘤血管修复后发生的中风。在这种情况下，血管内手术可能释放了多个栓子，这些栓子可能在脑部产生多次中风。症状结果取决于梗塞体积、梗塞的数目以及它们在脑部的位置。残疾指数可用于衡量症状损伤，如Rankin中风结果量表(Rankin,Scott Med J；2:200-15(1957))和Barthel指数。Rankin量表是基于直接评估受试者的整体状况，如下：

表3

0 毫无症状

1 尽管有症状，但无明显残疾；能够进行所有平常的活动

2 轻微的残疾；无法进行所有之前的活动，但是生活能够自理

3 中度残疾；需要一些帮助，但走路不需要帮助

4 中度到重度残疾；没有帮助时无法行走,没有帮助时生活无法自理

5 重度残疾；卧床不起，大小便失禁，需要持续的护理和照看

Barthel指数是基于一系列关于受试者是否有能力进行10项基本日常生活活动的问题，在0～100之间打分，得分越低表明残疾越严重(Mahoney et al.,Maryland State Medical Journal14:56-61(1965))。

可选地，中风严重程度/结果也可以利用NIH中风量表进行评估，该量表可以在万维网ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf.获取。

该量表是基于受试者进行11项功能的能力，包括评估受试者的意识、运动、感官和语言能力水平。

更确切地说，缺血性中风是指一类由于流向大脑的血液堵塞引起的中风。这种类型的堵塞的根本情况是最常见的在血管壁形成脂肪沉积。这种情况被称为动脉粥样硬化。这些脂肪沉积会导致两种类型的梗阻。脑血栓症是指血栓(血块)在血管阻塞部分的形成。“脑栓塞”通常是指在循环系统另一个位置形成的血凝块，通常是心脏、上胸部大动脉和颈部。一部分血凝块随后脱落，进入血液中，穿过大脑的血管，直到到达太小而无法让其通过的血管。栓塞的第二个重要原因是不规则的心跳，被称为动脉颤动。动脉颤动创造了条件，凝块可以在心脏形成，排出，移动到脑部。缺血性中风的其他潜在原因是脑出血、血栓形成、动脉或静脉解剖、心脏骤停、任何原因(包括脑出血)的休克以及医源性原因，例如，脑部血管或流向脑部的血管的直接手术损伤或心脏手术)。缺血性中风约占所有中风病例的83％。血凝块的另一个原因是由于血管病变(例如脑动脉瘤)，在血管内引入血管内工具引起的血管内血瘀，或由于在血管内引入血管内工具导致血栓形成而引起的血管内血瘀。

短暂性脑缺血发作(TIAs)是轻微或警告性中风。TIA指示有缺血性中风的状况存在以及典型的中风警告信号出现。但是，堵塞(血凝块)出现的时间很短，趋向于通过正常的机制溶解自身。经历过心脏手术的受试者具有短暂性脑缺血发作的特别风险。

出血性中风约占中风病例的17％。出血性中风源自变弱的血管破裂，血流到周围的大脑。血液聚集，压迫周围的脑组织。两类典型的出血性中风是脑内出血和蛛网膜下腔出血。出血性中风来源于变弱的血管破裂。变弱的血管破裂的可能原因包括高血压脑出血，在高血压脑出血中，高血压引起血管破裂，或变弱的血管破裂(例如，破裂的脑血管畸形)的另一个根本原因包括脑动脉瘤、动静脉畸形(AVM)或海绵畸形。出血性中风也可能源于缺血性中风的出血性转化，其削弱了梗塞中的血管，或源自CNS中原发性或转移性肿瘤出血，这些肿瘤含有异常脆弱的血管。由于再灌注，缺血性中风也可能转变成出血性中风。出血性中风也可能是由于医源性的原因，例如，对大脑血管的直接手术损伤。动脉瘤是血管变弱区域膨胀。如果不及时治疗，动脉瘤继续变弱，直至破裂，血流进入大脑。动静脉畸形(AVM)是一簇异常形成的血管。海绵状畸形是静脉异常，可以引起变弱的静脉结构出血。这些血管的任何一种均可能破裂，导致血流进入大脑。由于在出血性中风中损失的血液短缺，大脑一部分区域的出血性中风可能导致另一区域的缺血性中风

对于颅内动脉瘤未破裂的受试者，手术相关(procedurally-related)的中风要么是由于血管内手术导致栓子脱落(最常见)引起的，要么是由于血管内手术其他并发症引起的，例如，动脉瘤穿孔(产生出血性中风)或因血管内线圈或支架的误放导致的载瘤动脉偶然闭塞,或因可导致血栓形成、剥离或穿孔的血管损伤导致的载瘤动脉偶然闭塞。

对于动脉瘤破裂的受试者，其动脉瘤通过血管内治疗手段进行了治疗，手术相关的中风产生的原因可能与颅内动脉瘤未破裂的受试者一样。但是，动脉瘤破裂的受试者还可能持续额外的缺血性或出血性脑损伤，因为破裂的动脉瘤比未破裂的动脉瘤更脆弱，所以在手术之前或之中，动脉瘤破裂的风险更高。额外的损伤可能源自于颅内压增加或由“血管痉挛”现象导致的延迟缺血，颅内压增加是由原始动脉瘤破裂引起脑肿胀(水肿)引起的，或由颅内渗透的血聚集引起的，或两者兼有。对于蛛网膜下腔出血，在动脉瘤破裂后5～12天内血管痉挛的风险是最高的，是大脑动脉周围的血凝块正在释放的血管活性物质作用的结果。血管痉挛可能是该类病人延迟的缺血中风的原因。由于对颅内压突然上升缺乏脑血管自身调节，损伤也可以来自破裂之后脑血流量的改变。

V.适合接受治疗的受试者

临床试验提供了证据，即PSD-95抑制剂对减少经历过未破裂的和破裂的动脉瘤血管内修复的受试者的梗塞和神经认知障碍是有效果的。动脉瘤未破裂的受试者主要面临缺血性中风或蛛网膜下腔出血的风险。动脉瘤破裂的受试者也同样面临缺血性中风的风险，但面临更严重的出血性中风的风险，特别是蛛网膜下腔出血的风险。由于更严重的出血性中风的风险，动脉瘤破裂的受试者面临着由动脉瘤引起的死亡或严重损伤风险最大。令人惊讶的是，经过病理学(梗塞的数量和体积)和神经认知测试分析，目前的数据表明这些受试者从PSD-95抑制剂中获益最大。这些结果不仅表明PSD95抑制剂可以用于治疗缺血性或出血性中风，还证明了此类抑制剂可以用于治疗CNS中的或影响CNS的出血，不管其是否引起中风。这是令人惊讶的，因为PSD-95抑制剂通常被认为通过减少缺血而起作用，从而导致更好的结果。对于SAH，PSD-95抑制剂(例如Tat-NR2B9c)在破裂72小时内给药，一般当无出血存在时，显示良好效果。SAH受试者的出血通常在血管痉挛之后发生，且通常在破裂后5到12天内出现。Tat-NR2M9c在血浆内的半衰期很短(约20分钟)，在大脑中的半衰期也很短(约5小时)，表明TAT-NR2B9c在某种程度上至少通过不同的机制起作用，除了以下实施例观察到的减少缺血让受试者受益。但是，本发明的实际应用并不依赖于对机制的理解。

最常见的在CNS中的或影响CNS的出血是脑(cerebral)出血、脑内(intracerebral)出血、颅内(intracranial)出血(ICH)(每一种都是在大脑内部发生)，硬膜外和硬膜下出血、以及蛛网膜下腔出血(SAH)(每一种都是头骨内但是本身在大脑之外发生)。当动脉瘤破裂或因高血压或药物(如抗凝剂或可卡因)引起血管泄漏时，如果这些出血自发地发生，那这类出血被称为出血性中风，但如果这些出血来源于物理创伤(如跌倒、打击或摇晃婴儿综合症)，那这类仅简称为出血。目前的方法特别适用于治疗蛛网膜下腔出血，因为这种形式的出血出现在临床试验受益最大的受试者中。

适合接受治疗的受试者包括在CNS中或接近CNS的区域中出现缺血或出血迹象和/或症状的受试者，如在蛛网膜下腔、硬膜下、硬膜外出血或身体其它对CNS区域有影响的部位出血的情况下，如对血管有影响时，这些受试者的堵塞可能阻碍血液流经大脑，或在这些区域中，出血可能通过水肿，聚集血液的压力或其他方式引起损伤。这些受试者包括出现中风、心肌缺血、肺栓塞、肢体缺血、肾或视网膜缺血或脑部或接近脑部区域出血(如蛛网膜下腔出血)的迹象和/或症状的受试者。这些受试者包括被怀疑患有这类疾病但不能排除其他疾病的受试者，以及根据公认的诊断标准(如DSM IV TR)被诊断的受试者。

适合接受治疗的受试者还包括具有缺血或出血风险，但缺血或出血还没有发生的受试者。如果他或她比对照人群有更高的风险患缺血或出血，即认为受试者有风险。对照人群可能包括一个或多个从一般人群(例如，与年龄、性别、种族和/或民族相当)中随机选择的个体，这些个体没有被诊断出或具有紊乱(disorder)家族史。如果发现与紊乱相关的“风险因素”，该受试者可能被认为具有紊乱风险。风险因素可能包括与定义的紊乱相关的任何活动、特性、事件或属性，例如，通过对受试者人群的统计学或流行病学研究。受试者可能被归类为具有紊乱风险，即使确定基本风险因素研究没有特别包括该受试者。例如，经历过心脏手术的受试者具有短暂性脑缺血发作的风险，因为与没有经历过心脏手术的人群相比，短暂性脑缺血发作的概率在经历过心脏手术的人群中有增加。

具有在CNS中的或影响CNS的缺血风险的受试者包括那些脑部或CNS区域经历过外科手术的受试者，如血管内手术、剪裁、支架或微导管插入术。这样的受试者也包括那些影响供应大脑的血管的身体其它部位(即，连接大脑和心脏的部位，例如，颈动脉和颈静脉)或供应血液到视网膜、肾脏、脊髓或四肢的动脉经历过外科手术的受试者。具有影响CNS的出血的风险的受试者也包括那些脑部经历过外科手术的受试者。其他的风险受试者包括那些头部受伤(如跌倒或打击)或经历过速度突然改变(如摇晃婴儿综合症或交通事故)的受试者。其他具有出血风险的受试者是那些具有高血压、凝血障碍、动静脉畸形或动脉瘤的受试者。优选的受试者群是那些经历过血管内手术以治疗破裂或没有破裂的脑动脉瘤的受试者。

VI.联合治疗方法

对于缺血性迹象，适合接受治疗的受试者可以被给予PSD-95抑制剂和再灌注形式(参考US 61/501117，提交日为2011年6月24日，出于各种目的，该专利以引用的方式并入本文)。PSD-95抑制剂和再灌注可以按顺序先后给予也可以同时给予。通常，PSD-95抑制剂和再灌注是同时被给予的，在时间上重叠或非常接近(即，在15分钟的时间间隔内)，或PSD-95抑制剂先被给予。

对于无法提前预测的缺血的治疗，PSD-95抑制剂可以在缺血发作后尽快给药。例如，PSD-95抑制剂可以在0.5、1、2、3、4、5、6、12或24小时或等其他时间段内给药，只要缺血发作后，还有足够的侧支循环维持缺血半影区。对于可以提前预测或潜在的症状原因的缺血或出血，PSD-95抑制剂可以在缺血发作之前、发作之时或发作之后给药。例如，对于手术造成的缺血或出血，PDS95有时在开始手术前30分钟或手术结束后一小时内常规给药，不管缺血是否发生或即将发生。由于PSD-95抑制剂没有严重的副作用，根据本领域制定的已认可的标准诊断怀疑有中风、出血或其他缺血性症状但没有确诊时，PSD-95抑制剂也可以被给药。例如，PSD-95抑制剂可以在救护车运送受试者到医院的途中给药。对于具有中风、其他出血性症状或缺血性症状风险的受试者，PSD-95抑制剂也可以在发作前安全地给药，受试者实际上可能会也可能不会患上这些病。PSD-95抑制剂还可以在手术室或血管内套件(suite)中给药给初步诊断为正在发生或即将发生脑缺血或其他损伤的麻醉病人。

在PSD-95抑制剂给药后或有时在给药之前，出现缺血迹象和/或症状的受试者可以进行进一步的诊断评估，以确定受试者是否具有CNS中的或影响CNS的缺血，以及确定受试者是否出血或容易出血。尤其对于出现中风或其他影响CNS的急性紊乱症状的受试者，需要检测以区分受试者是否出血。诊断测试可能包括一个或多个器官扫描，例如CAT扫描、MRI或PET成像扫描。扫描的器官包括任何疑似缺血的位点(例如，大脑、心脏、四肢、脊柱、肺、肾、视网膜)以及任何其他可疑的出血源头。大脑扫描是区分缺血和出血症状的常规方法。诊断评估还可能包括获取或审查受试者的病史以及进行其他检测。以下任一因素的单独出现或联合出现可用于评估再灌注治疗是否存在不可接受的风险：受试者的症状是轻微的或迅速改善；受试者在中风发作时具有癫痫；受试者在过去3个月内发生了中风或严重的头部外伤；受试者在过去14天内进行了重大手术；受试者有已知的颅内出血历史；受试者的持续收缩压大于185mmHg；受试者的持续舒张压大于185mmHg；需要进行积极治疗以降低受试者的血压；受试者有暗含蛛网膜下腔出血的症状；受试者在过去21天内有胃肠道或尿路出血；受试者在过去7天在不可压缩位点进行了动脉穿刺；受试者在过去48小时内摄入了肝素且PTT升高；受试者的凝血酶原时间测定(PT)大于15秒；受试者的血小板数目小于100000μL；受试者的血清葡萄糖小于50mg/dL或大于400mg/dL；受试者患有血友病或其他凝血不足疾病。

根据已认可的标准进一步诊断调查或在调查前至少有很大可能性确定受试者是否具有缺血症状，以及受试者是否出血，是否有不可接受的出血风险，或是否由于不可接受的副作用风险而排斥接受再灌注治疗。诊断在CNS中或可能影响CNS区域中具有缺血症状且确认没有不可接受的副作用风险的受试者可以接受再灌注治疗。优选地，再灌注治疗在完成任何诊断操作后尽快执行。对于某些受试者，再灌注治疗在缺血发作后1、2、3、4、4.5、5、6、7、8、10、12、15、18、24小时后开始。对于某些受试者，再灌注治疗在缺血发作后1～6、1～12、1～18、1～24小时后开始。对于某些受试者，再灌注治疗通常在3～4.5小时后开始，在这个时间段内，再灌注治疗到目前为止被认为是有效的。例如，对于某些受试者，再灌注治疗在缺血发作后3小时后或4.5小时后开始，直到缺血发作后24小时或48小时。对于某些受试者，再灌注治疗在缺血发作后5、6、7、8、9或10小时后开始，直到缺血发作后24小时或48小时。对于某些受试者，再灌注治疗在缺血发作后275～390分钟内开始。

再灌注的时间也可以从PSD-95抑制剂给药后计算。间隔可能是，例如，5分钟到24小时。间隔可能是，例如，30分钟到6小时或1～3小时。

没有被证实患有缺血性疾病或被认为不太可能患有缺血性疾病的受试者通常不给予再灌注治疗，尤其是药理学再灌注治疗。被证实患有缺血性疾病或被认为很有可能患有缺血性疾病但被认为具有不可接受的副作用风险的受试者不给予药理学再灌注治疗。这样的受试者有可能从PSD-95抑制剂中受益，但幸免于再灌注治疗不可接受的副作用风险。

单独使用PSD-95抑制剂和再灌注治疗均可以减少由于缺血引起的梗塞尺寸和功能性缺乏。在可比较的情况下，当两者结合使用时，梗塞尺寸和/或功能性缺乏减少的程度更优于这两者单独使用。更优选的是，在可比较的情况下，当两者结合使用时，梗塞尺寸和/或功能性缺乏的减少程度至少是叠加的或更优于这两者单独使用时减少程度的叠加。在某些情况下，在缺血发作一段时间后(例如，4.5小时后)，再灌注治疗在减少梗塞尺寸和/或功能性缺乏方面是有效的，而在与PSD-95抑制剂同时给予或在PSD-95抑制剂给药之前给予时，再灌注治疗有可能是无效的。换句话说，当受试者被给予PSD-95抑制剂和再灌注治疗时，再灌注治疗至少与它在没有PSD-95抑制剂之前被给予时的效果一样。因此，在再灌注治疗起作用之前或起作用之时，PSD-95抑制剂通过减少一种或多种缺血损伤效果而有效地增加了再灌注治疗的效果。因此，PSD-95抑制剂可以弥补再灌注治疗给药时的延迟，不管这种延迟是受试者认识到他或她初期症状危险的延迟，还是将受试者转运到医院或其他医疗机构的延迟，还是进行诊断操作以确定缺血和/或出血或其不可接受的风险是否存在时的延迟。临床试验人群或临床前研究的动物模型群体可以证明PSD-95抑制剂和再灌注治疗的联合效果(包括叠加效果或协同效果)的统计显著性。

被证实CNS中的或影响CNS的出血的受试者，或不能被排除对医师有可接受的把握的受试者通常不给予药理性的再灌注治疗，而能够进行其他的手术或药理性联合治疗。抗PSD-95抑制剂也可以与其他药物、治疗或有利于与CNS中的或影响CNS的出血(包括SAH和ICH)相关迹象的干预措施联合用于治疗。CNS中的或影响CNS的出血建议通过手术干预治疗，取决于诊断、疗效或治疗，例如，抗高血压药物、FactorVIIa或其他凝血或凝固因子、甘露醇或其他提高颅内压的药物、对乙酰氨基酚或其他减少头痛和避免高热的非甾体抗炎药(NSAIDs)、冷冻血浆、维生素K、鱼精蛋白、血小板输血、磷苯妥英(fosphenytoin)，或如果癫痫发作或大叶性出血时的抗惊厥药物，H2拮抗剂或用于ICH相关的应激性溃疡预防的质子泵抑制剂，或减少肿胀的糖皮质激素。因为在PSD-95抑制剂Tat-NR2B9c的人类临床试验中，没有观察到安全或药物相互作用问题，因此联合治疗应该是有效的。

对于其他方法，对于具有在CNS中的或影响CNS的缺血症状或具有缺血的风险的受试者，受试者被给予PSD95抑制剂，不与治疗或有效预防缺血的其他药理性治疗联合给予。在某些方法中，这样的受试者被给予PSD95抑制剂，而不给予治疗或有效预防缺血的其他药理性治疗，且也不进行机械性的再灌注治疗。在某些方法中，具有在CNS中的或影响CNS的缺血症状或缺血风险的受试者被给予PSD95抑制剂，而不给予治疗或有效预防缺血的任何其他药理性治疗。

VI.给药的有效规范

PSD-95抑制剂以一定的剂量、频率和途径给药，以有效地减少、抑制或延迟CNS中的缺血或出血损伤效应，以及减少与缺血、出血或其手术治疗相关的疼痛。除非特别说明，抑制剂(也就是包括与内化肽相连的药剂的嵌合剂)的剂量是指整体剂量，而不仅仅指嵌合剂的药剂组分的剂量。有效剂量是指使用本发明的试剂治疗患有该疾病的受试者群体(或动物模型)时，相对于没有使用该试剂治疗的患有该疾病的对照受试者群体(或动物模型)，足以有效减少、抑制或延迟缺血或出血发作或更多损伤效应以及疼痛的剂量。对照群体可能使用安慰剂进行同步治疗，也可能是病史对照。如果与没有使用本发明方法治疗的类似受试者的对照群体相比，被治疗的受试者个体达到了更佳的效果，该剂量即给认为是有效剂量。有效规范涉及到以一定频率和给药途径有效剂量地给药以实现预期目标。

影响CNS的中风或出血的治疗结果可以通过梗塞大小、梗塞数目或残疾指数确定。如果被治疗的受试者个体在Rankin量表上显示两级或更小级别的残疾以及在Barthel量表上显示大于或等于75(参考Lees et a.,N.Engl.J.Med.354:588-600(2006))；或者相对于未治疗的群体，如果被治疗的受试者群体在任何一种中风、残疾或其他合适的量表上显示了显著改善的得分分布(参考Barthel,Rankin,NIH Stroke Scale)；或者相对于类似群体，被治疗的受试者群体显示出显著减小的梗塞大小和数目，那么该规范即被认为是有效的。试剂的单次剂量足以治疗中风。

临床试验或受试者个体的梗塞优选用MRI评估，尤其是FLAIR(液体衰减反转回复技术，fluid attenuated inversion recovery)和/或DWI(弥散加权成像，diffusion weighted imaging)。FLAIR更敏感，但是DWI对于新的梗塞更具有特异性。用FLAIR和DWI确定位于同一空间位置的梗塞可以对来源于当前中风或出血的新梗塞进行敏感性和选择性检测。其他的MRI序列(sequences)也可以单独使用或与FLAIR和/或DWI联合使用。

根据试剂不同，可以注射、静脉注射、鼻腔、口腔、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹腔内、局部、鼻腔或肌内给药。对于肽试剂，静脉注射给药为优选。

对于包括内化肽，尤其是含有氨基酸序列的HIV tat肽的嵌合试剂，该试剂可能与也可能不与消炎药一起给药，以减少释放组胺以及与高含量内化肽相关的下游效应。优选的共给药药物是肥大细胞脱粒抑制剂，例如，色甘酸或洛度沙胺(lodoxamide)或任何在此列出的其他药物。抗组胺剂或者糖皮质激素也可以使用，特别是联合使用或高剂量使用(参考WO2009/076105和WO2010/14474261)。

对于给药给人类，嵌合试剂Tat-NR2B9c的优选剂量是2-3mg/kg，更优选为2.6mg/kg。参考剂量应该被理解为包括了在典型的医院设备上计量时固有的误差精度。该剂量是优选的，因为这是在大部分受试者中不会释放大量的组胺和引起后遗症的最大给药剂量。尽管高剂量时，组胺的释放可以通过与前述讨论过的消炎药共给药而控制，且在任何情况下均通常自发溶解而没有不良反应，但是最好保持剂量在3mg/kg，优选为2～3mg/kg，更优选为2.6mg/kg以下，以避免这种情况。另一优选的剂量水平是1～3mg/kg，例如1.5mg/kg。这些剂量可以是单次给药剂量，例如，每次疾病发作时的一次剂量，也可以是多次给药的剂量。

上述参考剂量是针对嵌合试剂Tat-NR2B9c(YGRKKRRQRRRKLSSIESDV；SEQ ID NO:6)。可以通过几种方法来确定达到相同效果时的其他试剂的等同剂量。对于上述试剂的近似变异体(其中，一个或几个氨基酸被取代、插入或删除，但是分子量仍然保持在±25％的范围内)，上述剂量仍然是良好的参考。但是，通常来讲，对于其他试剂，等同剂量可能随着该试剂(有或没有内化肽存在)的分子量、针对目标的Kd值以及它的药物动力学和药效动力学参数而变化。对于某些试剂来说，等同剂量可能以释放等分子量的药剂来计算。对于其他试剂，可能需要进一步调整，因为Kd值或药物动力学或药效动力学参数不同。对于某些试剂，等同剂量根据动物模型或临床试验中达到相同终点的剂量的经验性决定。

肽试剂，例如Tat-NR2B9c优选通过输注方式(infusion)转运到血管中，更优选为通过静脉输注的方式。对于嵌合试剂Tat-NR2B9c，优选的平衡各注意事项的输注时间是5～15分钟，更优选为10分钟。参考时间应该被理解为包括了±10％的误差。输注时间不包括任何清洗输注(wash out diffusion)或从已经完成的主要输注(initial diffusion)中清洗剩下滴液的额外时间。Tat-NR2B9c的输注时间也可以作为其他药剂(可选择地与内化肽相连)，尤其是Tat-NR2B9c的近似变异体的参考。

也可以使用Tat-NR2B9c或其他PSD95抑制剂的多剂量规范。例如，多剂量规范可用于治疗蛛网膜下出血或CNS的其他出血。多剂量规范可能涉及到从出血开始算起的12天内PSD95抑制剂一天(或多天)给药一次或两次。对于一种优选的规范，抑制剂是一天给药一次，至少给药三天。对于另一种规范，在破裂4天之内(例如，从破裂那天开始算起的第4天或第4天之前)至少给药一个剂量。在某些规范中，在破裂的第5天或第5天之后给药一个剂量。在某些规范中，在1～4天内的任何一天或所有天内给药一个剂量，在5～12天内的任何一天或所有天内给药另一个剂量。某些规范中，在1～4天内给药一个剂量，在5～12天内给药其他剂量。

PSD-95抑制剂可以以药物组合物的形式给药。药物组合物是在GMP条件下典型生产的。注射用的药物组合物优选为无菌的(例如，肽的过滤除菌)和无致热源的。药物组合物可以以单位剂型形式提供(即，单次给药的剂量)。药物组合物使用常规的方式制备，可以使用能够用于药物的促进嵌合试剂加工成制剂的一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂。正确的制备方法取决于所选择的给药途径。

嵌合剂Tat-NR2B9c示例性的制备含有在常规盐水(0.8～1.0％，最好是0.9％生理盐水)或磷酸缓冲盐中浓度为10～30mg/ml，例如16～20或18mg/ml的肽。当冷冻存储时，这样的组合物在两年或更长的时间内是稳定的(肽没有明显降解或凝集)。尽管可以加入额外的赋形剂，常规的没有这些赋形剂的盐水或磷酸盐缓冲液足以获得这样的稳定性。实际应用时，该组合物被解冻和稀释到更大体积的常规盐水中，输注进入血管。

在临床使用中，有多种用于再灌注的药剂实施例。这样的试剂可以依照其常规配方、剂量、给药途径、给药频率(见医生案头参考和使用包装说明书)用于目前的联合方法。同样地，再灌注机械方法可以按照常规做法应用。

实施例

实施例1：在缺血性中风或脑出血后通过TAT-NR2B9C进行神经保护

实验设计

我们进行了随机、双盲、安慰剂对照试验，其中受试者从2008年9月到2011年3月在加拿大和美国的14家医院受试。这项试验是地方和国家机构审查委员会批准的，受试者或其合法代理人知情并同意。纳入和排除标准如表4所概括。依照当地机构治疗实践，所有受试者接受了动脉瘤治疗，以及在动脉瘤破裂情况，接受了蛛网膜下腔出血治疗。

临床和MRI评估

所有的临床和MRI评估是由不知道治疗任务的个人进行的。每一个参加的受试者在血管内手术前两周内和手术后24～96小时内均在1.5T扫描仪接受了MRI扫描(最低)。每次扫描包括以下最少序列：轴向FLAIR:3mm，无间隙，轴向DWI:3mm，无间隙，轴向3D T1加权梯度回波序列2.0mm(例如，在GE机器上的FSPGR)。

如表5所示，在参加时、手术后以及研究期间30天内对受试者进行评估。主要的评估包括身体检查，神经成像，基于美国国立卫生研究院中风量表(NIHSS)和调整后的Rankin量表(mRS)进行打分，以及神经认知测试(如表6所示)。对于动脉瘤破裂的受试者，神经认知测试打分被省略，蛛网膜下腔出血(SAH)被指定Fisher等级(Fisher grade)，其临床严重程度根据世界神经外科学会联合会(WFNS)评分系统打分。NIHSS是一个15项的量表，衡量神经功能障碍的程度。得分范围为0～42分，得分越高，表明中风越严重。mRS用于衡量残疾，分为0(根本没有任何症状)到6(死亡)分；5分表示严重的残疾(病人卧床不起和失禁，需要持续的护理和照看)。WFNS系统(1～5级)根据格拉斯哥昏迷记分法(GCS)对SAH病人的临床情况进行分级，其中1级是正常的，5级是GCS<7。Fisher分级系统对CT上蛛网膜下腔出血情况进行归类，以预测脑动脉痉挛的风险。检测者被训练使用所有量表且有证书。手术和药物输注后的临床评估主要集中在心肺安全、神经功能和神经认知。对于动脉瘤破裂的受试者，神经认知研究仅在第30天进行。

¹1-4小时后从血管造影套间(angiography suite)中离开

²忽略动脉瘤破裂的病人在登记时和给药后第2天到第4天的评估(仅在给药后第30天进行)

³给药后。

⁴心脏监测是从给药后第一天的0小时到2小时进行。

⁵血压，心率，体温，血氧饱和度。

⁶给药后每4个小时测定神经生命体征一次直到24小时，然后视治疗医生而定。血压、心率和氧饱和度在操作前(pre-procedure)(即麻醉诱导前)和操作后(post-procedure)(给药后立刻)测定。血压和心率：给药后0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时、16小时、20小时和24小时时测定。给药后12到24小时测量体温一次。氧饱和度：给药后0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时时测定，但是在麻醉结束和从麻醉中恢复后测定可能被停止，给药后6小时后是不需要测定的。

⁷血压，心率，体温。

⁸测定所有病人在登记时和给药后第2天到第4天的体重。至于动脉瘤破裂的患者的体重在登记时不得不被估计(根据临床实践)，实际体重需要在第2-4天测定。

⁹给药前、给药后4-6小时时和给药后12小时时的十二导联心电图。如果登记日和给药后第一天出现在同一天，那么一个十二导联心电图可以同时作为登记时和给药后第一天的心电图使用。从给药开始直到给药后至少2小时，通过麻醉师和/或手术后恢复室职员进行三导联心电图检测。

¹⁰给药后24小时时的十二导联心电图。

¹¹两个样品在给药前和药物输注研究结束后10分钟时采集

¹²用于PK分析的两个连续样品在药物输注研究开始后的5到10分钟之间采集

¹³在血管内治疗后脑动脉瘤患者治疗过程中按照制度实践模式

¹⁴仅对于可能分娩的女人，尿测试或血清测试可以在给药前第一天进行。更多详情参见8.5.2节。

¹⁵给药前

表6：第30天的神经认知结果

*□↑评分越高试验表现越好

↓评分越低试验表现越好

研究干预

患者通过电脑生成编码系统被随机分配接受TAT-NR2B9C或安慰剂静脉输注。所述研究药物通过包含20mg/ml TAT-NR2B9C的药物小瓶供应，TAT-NR2B9C给药是以2.6mg/kg在100cc生理盐水中稀释，静脉输注10min以上。通过对处理分配不知情的个人执行输注，一旦治疗神经干预研究者认为动脉瘤修补完成就开始输注，但是要在麻醉结束前。这个时间选择的基本原理是ENACT的目的是去检验在发生中风后人类神经保护是否是可行的，不仅仅在预处理范例(pre-treatment paradigm)中。

中风数量和体积评定

新局部缺血损伤被定义为第2-4天DWI MRI上显示的新的高信号(图1A-C；黄色箭头；被称为DWI损伤)。新的DWI损伤体积由每个DWI损伤周围示踪的兴趣区(ROIs)的表面积乘上层面厚度(3mm)确定(图1A-C)。如果FLAIR成像上的损伤属于新FLAIR损伤位置并且没有先存在于登记时的MRI上，那么它们可以被视为新的(图1A-C)。新FLAIR损伤体积被确定类似于新DWI损伤体积。所有计算都是运用Osirix软件进行。

结果测定

ENACT的主要目的是检验神经保护假设，因此主要兴趣是TAT-NR2B9C对于可检测的新损伤数量和体积的影响。然而，以前ENACT范例还没有被实施，MRI评价提供了4个相同目的的措施(DWI损伤数量，DWI损伤体积，FLAIR损伤数量和FLAIR损伤体积)。我们选择TAT-NR2B9C单一静脉给药减少在手术后24-96小时由DWI和FLAIR MRI成像测量的栓塞性中风体积的能力作为主要有效结果。主要兴趣的另一个目的是确定在当前患者群体中TAT-NR2B9C的安全性和耐受性。第二个效果包括TAT-NR2B9C在减少栓塞性中风数量上的功效，使患者维持很小中风(<10cc’s)的功效，在减少后续30天中操作上诱发的认知障碍(procedurally-induced cognitive impairment)上，在减少大中风(>10cc中风)频率上，在改善动脉瘤破裂和动脉瘤未破裂患者子群结果(新中风，神经学上的和神经认知)上的功效。

统计分析

数据是根据改良的意向性治疗原则、意向性治疗原则和每个方案总体来分析的。在改良的意向性治疗原则下，可评估的样本包括所有随机的和接受任何数量研究药物的受试者。在漏掉已知活着的患者临床结果数据情况下，最坏的可能结果分数被分配。P值呈现未校正，在这里显示对于影响结果测量的变量的校正。

结果

研究患者

图2提供了所有研究患者的性情。在2008年9月和2011年3月之间，来自11个加拿大站点和3个美国站点的212名患者依照Trail包含/排除标准(表4)被筛选出。这里有12个随机化失败(随机化患者，但没有接受研究药物)：5名归因于没有能力实行血管内动脉瘤修复，3名归因于没有能力获得流程前MRI(根据流程在同一天计划)，2名归因于流程前展示QTc间期>450ms的ECG(排除标准)，1名归因于流程期间和药物输注前致命的动脉瘤破裂，1名归因于麻醉医师拒绝给患严重慢性阻塞性肺疾病的病人实施研究药物。因此总计185名患者被随机化接受研究药物(mITT群体)，这样92名患者随机地被分配接受TAT-NR2B9C，93名患者被分配接受安慰剂(图2)。在TAT-NR2B9C组中，1名患者在第2-4天MRI扫描前死亡，2名拒绝参加随后的第30天研究。在安慰剂组中，2名受试者在第2-4天MRI扫描后死亡，三分之一没有参加随后的第30天研究(图2)。

两组的基线人口统计学特征和临床特征是相似的(表7)。血管内操作(endovascular procedures)平均持续约2小时(表7)。大约一半的动脉瘤修复仅使用可拆分的铂线圈(detachable platinum coils)进行，然后在剩余部分中，附加的辅助技术或设备被使用，它们包含气球或支架辅助卷绕(stent-assisted coiling)或使用流动转移支架修复。除了接受安慰剂的动脉瘤破裂患者具有较高的高血压发生率外，动脉瘤破裂或动脉瘤未破裂的患者子群在TAT-NR2B9C和安慰剂组之间基线和临床特征没有区别(表7)。

*P值使用T检验或费歇尔精确检验获得

+美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分范围为0到42，值越高反映神经损伤越严重(＜5，轻微损伤；≥25，非常严重损伤)。

MRI结果

在185名随机受试者中，184名完成了操作后(第2-4天)MRI扫描。在血管内操作后使用TAT-NR2B9C治疗的患者体内由DWI MRI检测的新的局部缺血损伤数量减少了43％(表8；P＝0.005)。这个也在FLAIR MRI扫描中反映，其中使用TAT-NR2B9C治疗的患者体内新的局部缺血损伤数量减少了39％(表8；P＝0.026)。在使用TAT-NR2B9C治疗的患者体内由FLAIR和DWI MRI测量的中位中风体积也减少了(表8；对于DWI和FLAIR体积P值都<0.001[在Stata中使用有序排列(Rank-Ordered)逻辑回归])。然而，由于体积数据的偏态(skewed)分布和广泛分散分布(表8)，梗塞体积平均值通过表现大中风(被定义为>10cc’s)的患者而被显著扭曲(distorted)。具体地，2名被分配到TAT-NR2B9C组的患者在动脉瘤修复操作期间遭受了引起大中风(10.7cc和49.2cc)的并发症。这在治疗组之间产生了在中风体积平均值上的不显著的整体差异。

正负值是指±SD；*P值反映中值之间区别的检验。**校正后的P值代表治疗效果，校正是对于变量年龄、动脉瘤破裂、附加设备的使用、程序持续时间和抗血小板药剂的使用(阿司匹林或氯吡格雷)；由DWI体积定义；校正的值不能计算归因于少量患者

ENACT中的随机患者中，由于动脉瘤破裂，37名呈现出蛛网膜下腔出血。这个子组被预选用于子组分析是因为蛛网膜下腔出血可能对遭受新的局部缺血损伤可能性有影响。另外，相比于针对未破裂动脉瘤经受可选的手术的患者，由于蛛网膜下腔出血，这些患者可能遭受更严重的神经和神经感知障碍。在这个患者子组中，使用TAT-NR2B9C治疗的患者体内由DWI MRI或FLAIR MRI检测的新的局部缺血损伤数量减少了64％(分别对于DWI和FLAIR,P＝0.027和P＝0.046；表8)。而且，使用TAT-NR2B9C治疗的患者体内由DWI MRI检测的新梗塞体积减少了80％(p＝0.015)，由FLAIR MRI检测的新梗塞体积减少了87％(P＝0.023)。在动脉瘤未破裂患者子组(n＝147)中，MRI结果显示的TAT-NR2B9C治疗效果与全部患者群体趋近于相同方向(表8)。

额外的子组分析在无大中风(large stroke)患者中进行(184名患者中的182名)。这个分析的基本原理是ENACT范例旨在检验小梗塞中风治疗效果，类似于非人类灵长类试验中(这里新的局部缺血损伤是一直很小的)的建模。然而，在这种范例中，受制于梗塞变形扭曲，梗塞体积的算术均值远超过观测到的体积中值(中位体积，median volumes)。中风体积在10cc’s以下的患者中，使用TAT-NR2B9C治疗的患者体内由DWI和FLAIR MRI检测的新局部缺血损伤数量和体积减少，与TAT-NR2B9C在小的、操作上诱发的中风(procedurally-induced strokes)中所起的神经保护效果一致。因此，这里描述的MRI方法对于筛选用于局部缺血中风、出血性中风和蛛网膜下腔出血的其他药物的神经保护也是有用的。

ENACT中的第二个目的是确定TAT-NR2B9C治疗是否降低大中风(>10cc)频率。然而，2个大中风的出现不足以保证统计学分析。

神经学上的结果

参加ENACT的患者不是经历可选的动脉瘤修复就是经历WFNS分数为I-III(Glascow Coma Score昏迷评分13-15)的蛛网膜下腔出血。所以，在血管内操作时它们表现出低水平神经障碍(NIHSS中值和mRS为0；表7)。在操作后第30天，所有使用TAT-NR2B9C治疗的患者中93.5％和使用安慰剂的患者中89.2％都有令人满意的NIHSS分数(NIHSS0-1，p＝0.434；表9)。mRS分值(0-2)在93.5％的TAT-NR2B9C组和安慰剂组是令人满意的(表9)。然而，在登记为动脉瘤破裂的受试者中，当与使用安慰剂处理的患者中的68.4％相比时，使用TAT-NR2B9C治疗的100％的受试者在操作后第30天有令人满意的NIHSS(p＝0.020；表4)。使用TAT-NR2B9C治疗的蛛网膜下腔出血受试者，相比于使用安慰剂处理的受试者，也倾向有更令人满意的mRS分数(对于TAT-NR2B9C和安慰剂分别为94.4％和73.7％；p＝0.180；表9)。由于操作中的并发症(procedural complications)导致承受大中风(>10cc)的患者是在TAT-NR2B9C组。在第30天，一位受试者有2分的NIHSS和2分的mRS，其受试者有2分的NIHSS和1分的mRS。

神经认知结果

来自一组神经认知测试的结果在补充的表7中详细给出。经TAT-NR2B9C治疗的患者在TAT-NR2B9C治疗后表现出神经认知益处(benefits)，包括在神经精神病问卷调查表中的显著改善。出人意料地，尽管针对动脉瘤破裂组中的统计分析的患者数量很少，但是使用TAT-NR2B9C治疗的患者在认知和神经精神测试中有显著改善趋势。

安全性

总共有3名患者死亡。一名登记为未破裂的动脉瘤，已经接受TAT-NR2B9C，但在第三天死亡，原因是来自由腹股沟穿刺诱导的腹膜后血肿的出血性休克。2名接受安慰剂。1名在先前动脉瘤未破裂的患者由于在手术中动脉瘤破裂后带来的神经并发症在第13天死亡。另一个登记为动脉瘤破裂的患者由于蛛网膜下腔出血的神经并发症在第12天死亡。

一系列不良事件(AEs)，包括剧烈的和严重的不良事件，在表5中被提供。总的来说，不良事件在治疗组之间是很平衡的。在安慰剂组中总计有388个不良事件，在TAT-NR2B9C组中有336个不良事件。然而仅有2个不良事件被认为可能与药物相关，2个都是在几分钟内可以解决的短暂低血压。在所有严重不良事件中(导致死亡的不良事件是威胁生命的，需要一个新的住院治疗或者延长当前住院治疗，或者导致持久的或显著的残疾或无能)，24个发生在14名接受安慰剂的患者身上，11个发生在9名接受TAT-NR2B9C的患者身上(表10)。都跟TAT-NR2B9C无关。

另一个意外发现是接受TAT-NR2B9C的患者有显著较少的报道与手术相关的疼痛事件。尽管报道与动脉瘤修复手术相关的疼痛的患者数量是不高的，但是效果是足够大的(P值<0.02)。因此，TAT-NR2B9C可以减少人手术中和手术后疼痛，可能减少无动脉瘤修复手术中疼痛或另一个具有与手术相关的作为副作用的疼痛的手术中疼痛。由于PSD-95和NMDAR2亚基在动物中是高度保守的，PSD-95抑制剂很可能对于动物疼痛也是有效果的。

*剧烈的不良事件被定义为使无能力的阻碍正常生理机能的不良事件。

**严重的不良事件被定义为导致死亡的不良事件，是威胁生命的，需要一个新的住院治疗或者延长当前住院治疗，导致持久的或显著的残疾或无能，或先天缺陷。

讨论

TAT-NR2B9C在操作上诱导的中风(procedurally induced strokes)中的试验显示了TAT-NR2B9C在减少颅内动脉瘤破裂和未破裂患者体内梗塞中风(embolic strokes)数量和体积中值方面的好处。在先前规定的子组分析中，受益最大的是登记为由动脉瘤破裂引起的蛛网膜下腔出血的患者，在这里使用TAT-NR2B9C治疗的患者体内中风数量减少了64％，中风体积减少了约80％。此外，这个子组的患者在NIHSS神经学上的结果上有改善，倾向于在mRS神经学上的结果和认知结果上改善。尽管这个动脉瘤破裂受试者的子组的规模小(37名患者)，但是TAT-NR2B9C的效果是如此大以至于产生了统计上显著的结果。考虑到TAT-NR2B9C的益处被认为主要通过局部缺血减少产生，并且在蛛网膜下腔出血中局部缺血在第5天以前是是很少见的，这是令人惊讶的。

ENACT总的结果的有效性由试验的几个特征支持。ENACT是在双盲方式下进行的，这样患者、研究者、分析试验结果的人都不清楚治疗分配。可能影响来自中风或蛛网膜下腔出血结果的人口统计学特征是平衡的，显示与治疗效果没有相互作用。

ENACT中大部分受试者(80％)的动脉瘤没有破裂，由于这个第30天的死亡率和血管内修复的发病率(包括神经的和认知的缺陷)的是小于10％的。相反，蛛网膜下腔出血患者在承受神经和/或认知功能损伤方面有更大的风险。尽管如此，在少部分蛛网膜下腔出血患者体内有改善的趋势是令人惊讶的，因为ENACT目的在于主要运用MRI标准、在主要有小梗塞中风风险的受试者和相对少的患者人群中对神经保护假设进行检验。在蛛网膜下腔出血(SAH)患者中，登记时的神经状态是好的(在安慰剂组和TAT-NR2B9C组中mRS中值和NIHSS为0)。未使用TAT-NR2B9C治疗的SAH患者在处理后第30天的恶化显示了在它们初步评价后它们的临床状态恶化。这种恶化可能是由这种易受神经或认知的血管内栓塞并发症影响引起的，或因为SAH启动了一连串临床有害事件。在任一事件中，接受TAT-NR2B9C的SAH患者比没有接受TAT-NR2B9C的SAH患者具有更好的临床结果。

蛛网膜下腔出血中脑局部缺血讨论

蛛网膜下腔出血患者是处于遭受各种不同SAH并发症的风险中的。这些并发症可能独立对脑引起损害，影响临床结果。这些并发症包括由动脉瘤破裂引起颅内压突然升高招致的原始脑损害，还有更多延迟并发症如脑积水或脑动脉痉挛引起的大脑局部缺血。

蛛网膜下腔出血中大脑局部缺血是大脑动脉血管痉挛导致的，使大约30％实例的临床过程复杂化。在蛛网膜下腔出血中有临床意义的血管痉挛发生率在蛛网膜下腔出血后第5天到第12天之间时很高的。然而，这个并发症在蛛网膜下腔出血后第一个三天中是很不寻常的。一个患者在蛛网膜下腔出血后的最终临床结果可能取决于几个因素，包括人口统计学因素如年龄和合并症，蛛网膜下腔出血严重程度，各种SAH并发症如脑积水和血管痉挛。很多证据证明血管痉挛引起的大脑局部缺血对于来自SAH的不良临床结果不是唯一贡献者(MacDonald,2007；Kaptain et al.,2000)。

考虑到SAH受试者在SAH发作后的72小时内使用TAT-NR2B9C，考虑到在蛛网膜下腔出血中大脑局部缺血在蛛网膜下腔出血后的第一个三天是极其罕见的，在ENACT试验中SAH患者体内观察到的TAT-NR2B9C有益效果不太可能是因为抗局部缺血作用，因为TAT-NR2B9C没有在能阻止SAH中大脑局部缺血的时间窗内(time-frame)被实施。血浆峰浓度出现在给药结束后的5分钟内，通常在30-40分钟时从血浆中消失。TAT-NR2B9C的半衰期似乎是约5小时。因此TAT-NR2B9C不太可能在第5天还存在于患者中枢神经系统中，在这个时间血管痉挛是更常见的。此外，TAT-NR2B9C已经被表明不改变脑血流量(Bratane et al.,Stroke.2011Nov；42(11):3265-70)，所以在任何情况下都没有被期待去阻止血管痉挛。

因此TAT-NR2B9C通过作用于大脑局部缺血来改善SAH患者神经学上的结果是不太可能的，因为1)它不是作用于血管的(not vasoactive)，2)它没有在当大脑局部缺血是SAH并发症时的时间窗(time frame)内实施。不如说，TAT-NR2B9C可能在明显大脑局部缺血已经发展之前通过定位蛛网膜下腔出血后出现的主脑损伤来改善神经学结果。它的功效可能归因于细胞信号通路破坏引起的细胞损伤的减少，细胞信号通路破坏导致在SAH后出现的ICP快速短暂升高招致的主脑损伤。所以，TAT-NR2B9C是定位于对蛛网膜下腔出血后的患者临床结果有贡献的多种因素中的另一种因素，但不是血管痉挛或大脑局部缺血。

虽然本发明已被详细描述为便于清楚理解，这将是显而易见的，某些修改可以在所附权利要求的范围内实施。本申请中引用的所有出版物，登录号和专利文献在此为了所有目的以其整体引入作为参考，其程度就如同每个是分别指明的。在某种程度上一个以上的序列在不同的时间与同一登录号相关联，与该登录号相关的这些序列是指到本申请有效申请日为止。有效申请日是最早披露有关登记号的优先权申请的日期。除非上下文中明显不同，否则本发明的实施方案、步骤、特征或方面可以结合任何其他进行。

Claims

1.一种治疗受试者体内蛛网膜下腔出血的损伤效应的方法，其中所述方法包括：

对具有蛛网膜下腔出血症状的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2亚基结合的药剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛛网膜下腔出血是物理性创伤导致的结果。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛛网膜下腔出血是自发产生的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛛网膜下腔出血是由破裂的动脉瘤导致的。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛛网膜下腔出血是由动静脉畸形导致的。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制受试者体内神经认知缺陷的发展。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制通过MRI可检测到的梗塞的发展。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者接受血管内手术以修复导致所述蛛网膜下腔出血的破裂血管。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述药剂减轻所述血管内手术引起的疼痛。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述疼痛是沿着被用于实施所述内窥镜手术的内窥镜穿过的路径产生的。

11.一种治疗受试者体内脑内出血的损伤效应的方法，所述方法包括：

对具有脑内出血症状的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2亚基结合的药剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述脑内出血是由高血压导致的。

13.根据权利要求13所述的方法，其中所述脑内出血是由药物导致的。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述药物为抗凝血剂。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制受试者体内神经认知缺陷的发展。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制通过MRI可检测到的中枢神经系统中梗塞的发展。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂是在以修复导致所述出血的血管为目的的手术之前、期间或之后施用的。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂是在施用另一种以减轻脑内出血的损伤效应为目的的药物之前、期间或之后施用的。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂是在导致所述蛛网膜下腔出血的破裂后的第4天施用的。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂是在导致所述蛛网膜下腔出血的破裂发生后的12天内多次施用的。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂每天施用两次至少施用两天，或每天施用一次至少施用三天。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂的剂量为1-3mg/kg。

23.一种药剂，其抑制PSD-95与NMDAR2亚基结合，从而用于减轻受试者中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的局部缺血或出血的损伤效应，以及用于减轻所述受试者在接受治疗所述局部缺血或出血的手术时引起的疼痛。

24.根据权利要求23所述的药剂，其中所述手术为血管内手术。

25.根据权利要求23所述的药剂，其中所述疼痛是沿着被用于实施所述内窥镜手术的内窥镜穿过的路径产生的。

26.一种减轻疼痛的方法，所述方法包括对接受血管内手术的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2亚基结合的药剂，其中所述药剂减轻由所述血管内手术导致的受试者体内的疼痛。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述疼痛是沿着被用于实施所述内窥镜手术的内窥镜穿过的路径产生的。

28.一种抑制受试者中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的局部缺血或出血的损伤效应的方法，所述方法包括：

对受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2亚基结合的药剂的有效方案，所述受试者患有或被怀疑患有在中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的局部缺血或出血，其中，对所述受试者给予所述药剂时，所述受试者未曾接受扫描以区分局部缺血和出血。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述受试者患有在中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的出血。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述受试者未经受再灌注治疗。

31.一种治疗中枢神经系统局部缺血或出血的损伤效应的方法，所述方法包括：对患有局部缺血或出血的受试者或有患局部缺血或出血风险的受试者施用药剂，所述药剂抑制PSD-95与NMDAR2亚基或nNos的结合。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述药剂与再灌注治疗联合施用，其中所述药剂与再灌注治疗治疗中枢神经系统局部缺血的损伤效应。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者具有中枢神经系统局部缺血的症状或风险。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法治疗出血性中风的损伤效应。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述药剂是在所述出血的血管内修复之前、期间或之后施用的。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述药剂是在使用其他药物来治疗影响中枢神经系统的出血的治疗之前、期间或之后施用的。

37.一种药剂，其抑制PSD-95与NMDAR2亚基的结合从而用于治疗由于再灌注而转化为出血性中风的缺血性中风，其中所述药剂抑制所述缺血性中风和出血性中风的损伤效应。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法或药剂，其中所述药剂是具有包含X₁tSX₂V(SEQ ID NO:7)或由X₁tSX₂V(SEQ ID NO:7)组成的氨基酸序列的肽，其中，t和S为可替换的氨基酸，X₁选自E、Q和A，X₂选自A、Q、D、N、(N-甲基)-A、(N-甲基)-Q、(N-甲基)-D和(N-甲基)-N。

39.根据权利要求38所述的药剂，其中所述肽与内化肽连接或所述肽被脂化，从而促进所述肽穿过细胞膜或血脑屏障。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法或药剂，其中所述药剂是具有包含YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO:6)或YGRKKRRQRRRKLSSIETDV(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的肽，或是具有由YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO:6)或YGRKKRRQRRRKLSSIETDV(SEQ ID NO:37)组成的氨基酸序列的肽。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法或药剂，其中所述药剂为豆蔻酰化肽。

42.根据权利要求41所述的方法或药剂，其中所述肽具有包含KLSSIESDV或KLSSIETDV的氨基酸序列，或具有由KLSSIESDV或KLSSIETDV组成的氨基酸序列。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述豆蔻酰化位于所述肽的N端。

44.一种筛选化合物以获得益于治疗或有效预防在中枢神经系统中的或影响中枢神经系统的中风或出血的活性的方法，所述方法包括：

对正在经受影响所述中枢神经系统的血管内修复手术的人施用所述化合物，以及

与阴性对照相比，确定所述化合物是否减少了MRI观察到的梗塞数量。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述MRI成像包括DWI MRI。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述MRI成像包括FLAIR MRI。

47.根据权利要求44所述的方法，其中所述MRI成像包括DWI MRI和FLAIR MRI，并且所述血管内手术造成的梗塞是通过识别在DWI MRI和FLAIR MRI两者上显示的梗塞来确定的。

48.一种治疗呈现一种或多种局部缺血迹象和/或症状的受试者群体的方法，所述方法包括：对所述受试者施用抑制PSD-95抑制剂与NMDAR2亚基或nNOS结合的药剂；其中，对所述受试者进行再灌注治疗的副作用的不可接受风险分析，没有副作用的不可接受风险的受试者接受再灌注治疗，而有副作用的不可接受风险的受试者不接受再灌注治疗，可选地，其中所述药剂为抑制PSD-95与NMDAR2亚基或nNOS结合的肽，且所述肽与内化肽连接或所述肽被脂化从而便于其穿过细胞膜或血脑屏障。

49.一种具有包含X₁tSX₂V(SEQ ID NO:7)或由X₁tSX₂V(SEQ IDNO:7)组成的氨基酸序列的分离的肽，其中，t和S为可替换的氨基酸，X₁选自E、Q和A，X₂选自A、Q、D、N、(N-甲基)-A、(N-甲基)-Q、(N-甲基)-D和(N-甲基)-N。

50.根据权利要求49所述的分离的肽，其中所述肽具有包含KLSSIESDV或KLSSIETDV的氨基酸序列，或所述肽具有由KLSSIESDV或KLSSIETDV组成的氨基酸序列。

51.一种治疗受试者群体中蛛网膜下腔出血的损伤效应的方法，所述方法包括：

对患有蛛网膜下腔出血的受试者施用抑制PSD-95与NMDAR2亚基结合的药剂，其中，与没有接受所述药剂的对照受试者相比，被施用所述药剂的群体的损伤效应减轻。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述得到减轻的损伤效应为神经元细胞死亡或认知缺陷。