KR20090033868A

KR20090033868A - 신경 세포 ｎｍｄａ 수용체와 ｎｍｄａ 수용체 상호작용성 단백질 사이 상호작용을 억제하는 융합 펩티드

Info

Publication number: KR20090033868A
Application number: KR1020097000709A
Authority: KR
Inventors: 토마스 마이어
Original assignee: 자이겐 에스.에이.
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2009-04-06
Also published as: CN101490081A; WO2008014917A1; NO20090875L; EP1884521A1; RU2009106710A; CA2653438A1; JP2009545543A; ATE509948T1; AU2007280717A1; HRP20080648A2; MX2009001095A; US20090281036A1; EP2046821A1; IL195536A0; EP2046821B1; BRPI0714783A2

Abstract

본 발명은 운반체 펩티드(transporter peptide)를 포함하는 성분 I과, 신경 세포 N-메틸-D-아스파르트산 수용체(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)와 NMDAR 상호작용성 단백질(NMDAR interacting protein) 사이의 상호작용을 억제하는 펩티드로서 D-거울상 이성질 아미노산만으로 이루어진 펩티드들로부터 선택하는 성분 II를 적어도 하나 포함하는 융합 펩티드를 제공한다. 본 발명은 나아가 상기 본 발명의 융합 펩티드를 포함하는 약학 조성물과 이 조성물을 투여하는 방법 및 키트, 그리고 상기 본 발명의 융합 펩티드의 용도를 제공한다.

Description

신경 세포 ＮＭＤＡ 수용체와 ＮＭＤＡ 수용체 상호작용성 단백질 사이 상호작용을 억제하는 융합 펩티드{Fusion Peptide for Inhibiting Interaction of Neuronal NMDA Receptor(NMDAR) and NMDAR Interacting Proteins}

본 발명은 운반체 펩티드를 포함하는 성분 I과, 신경 세포 N-메틸-D-아스파르트산 수용체(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)와 NMDAR 상호작용성 단백질(NMDAR interacting protein) 사이의 상호작용을 억제하는 펩티드로서 D-거울상 이성질 아미노산만으로 이루어진 펩티드로부터 선택되는 성분 II를 적어도 포함하는 융합 펩티드를 제공한다. 본 발명은 나아가 상기 본 발명의 융합 펩티드를 포함하는 약학 조성물과 이 조성물을 투여하는 방법 및 키트, 그리고 상기 본 발명의 융합 펩티드의 용도를 제공한다.

허혈성 뇌중풍(ischemic cerebral stroke) 등의 허혈성 또는 외상성(ishchemic or traumatic) 뇌손상 또는 척수 손상은 자주 일어나고 중추신경계 신경 세포들과 이들의 기능에 돌이킬 수 없는 피해를 주기 때문에 중요한 건강 문제가 된다. 이러한 피해는 종종 심각하기 때문에 현재 이러한 손상으로 고생하는 환자를 치료하는데 보건 당국이 매년 상당한 비용을 치르고 있다. 그러나 현재 이러한 급성 중추신경 손상에 대한 효과적인 치료 방법은 없다.

임상적으로 허혈성 뇌중풍 등의 허혈성 또는 외상성 뇌손상 또는 척수 손상은 소규모 국소적 장애부터 파국적(catastrophic) 전부 기능 장애(global dysfunction)에 이르는 급성 신경학적 기능 황폐화로 나타나거나, 치료할 환자의 죽음으로 이어질 수 있다. 이러한 기능 결손의 최종적 규모는 1차적인 물리적 손상의 성격과 정도, 그리고 관련된 신경 세포의 추가적 사멸을 가져오는, 전개될 2차적 현상의 진행 과정에 의하여 정해지는 것으로 현재 인식하고 있다. 이러한 진행 과정으로의 진입은 순간적으로 일어나지 않기 때문에, 적시에 개입할 경우 지연성 신경독성(delayed neurotoxicity)을 일으키는 사건을 차단할 수 있는 기간이, 어느 정도 길이인지는 아직 모르지만 이론적으로는 있을 수 있다. 허혈성 또는 외상성 신경 세포사를 일으키고 유지하는 세포 메커니즘, 예를 들어 글루탐산 운반체의 반전(reversal of the glutamate transporter)에 대해서는 많은 것이 알려져 있지만, 실용적인 예방책으로서 유효한 것이나, 효과적인 치료법은 현재 존재하지 않는다. 따라서 뇌중풍 또는 척수 손상을 비롯한 상기 질환에 대하여 효과적이고 임상적으로 쓸모 있는 약리 치료법은 아직 없는 실정이다.

과학적인 관점에서 볼 때, 중추 신경 조직 관류의 국소적인 감소는 생체내의 저산소성과 외상성 중추신경 손상 모두에서 신경 세포사를 매개한다. 이러한 국소적 관류 저하는 대개 해당 국소 혈관계의 손상, 혈관의 혈전증, 혈관 경련 수축 또는 색전의 덩어리에 의한 관강 폐색(管腔閉塞 luminal occlusion) 때문에 일어난다. 병인이 무엇이건 간에, 생기는 허혈은 여러가지 세포 항상성 기전에 악영향을 끼쳐 취약한 신경 세포를 손상하는 것으로 생각하고 있다. 정확한 장애의 특성은 잘 알고 있지 못하지만, 여러 신경 세포 손상의 실험적 모형들에 공통되는 요소는 세포내 자유 칼슘 농도([Ca²⁺]_i)의 상승이다. 신경 세포는 [Ca²⁺]_i을 낮은 값, 즉 생리적 기능에 필요한 대략 100 nM로 제한하는 다양한 메카니즘을 가지고 있다. 널리 받아들이고 있는 견해에 따를 때, 장기간 [Ca²⁺]_i가 상승하면 엄밀한 통제를 받던 Ca²⁺-의존적 생체 과정에 대한 규제가 풀려 과잉 반응 생성물을 낳고, 정상적으로는 정지 상태인 효소 경로가 작동하게 하거나, 세포 보호 조절 메커니즘을 불활성화한다. 이는 이어서 실험적으로 관측 가능한 세포 파괴, 예를 들어 지질 분해, 단백질 분해, 세포 골격 붕괴, pH 변화, 자유 라디칼 형성, 미토콘드리아 기능 장애, 세포 팽창, 세포질막의 구조적 완전성 상실과 핵 농축로 나타난다.

허혈성 삽화(ischemic episode)에서 유해한 농도로 Ca²⁺이 유입되는 중요한 원인은 EAA의 과도한 방출이다. 따라서 Ca²⁺ 세포 독성을 막는 고전적인 방법은 전압작동성 Ca²⁺ 통로(voltage-gated Ca²⁺channel) 및/또는 흥분성 아미노산 EAA-작동성 통로(excitatory amino acid EAA-gated channel)를 거쳐 Ca²⁺이 유입하는 것을 약리학적으로 봉쇄하는 것이다. 이러한 방법은 변형에서는 종종 시험관내의 EAA-유발성 또는 무산소성 세포사를 줄여주어, Ca²⁺신경 독성 가설의 근거를 높여준다. 그러나 수많은 Ca²⁺ 통로 길항제와 EAA 길항제는 생체내 신경 세포 손상, 특히 실험 적 척수 손상(experimental spinal cord injury), 머리 손상 및 광범위 뇌경색(global cerebral ischemia)으로부터 지켜주지 못한다. 이것이 약물의 농도 부족 때문인지 Ca²⁺ 유입의 봉쇄가 부적절한 탓인지 혹은 비Ca²⁺ 의존성 신경 도성 과정이 기여하기 때문인지는 알지 못한다. 그러나 Ca²⁺ 신경 독성은 서로 다른 중추신경 세포 형태에서 서로 다른 경로를 통하여 유발될 가능성이 높다. 따라서 성공적인 Ca²⁺ 봉쇄에는 다중 약물 요법적인 접근이 필요한 것이 전형적인 경우일것이다. NMDAR의 길항제가 여러 종 개발되었다는 점은 주목할 만하다. 그러나 이들 길항제는 외상 전에 해당 약물을 투여한 경우에만 동물 모형의 생체내에서 성공적이었기 때문에 예를 들어 뇌졸중 후에 치료가 이루어지는 전형적 임상 시나리오에서는 적용이 어렵다. 또한 NMDAR 길항제는 사람의 생체내에서 내약성이 떨어지는 것이 전형적이기 때문에 적정 약물 농도가 좁거나 심지어는 존재하지 않을 수도 있는데, 이는 정상 생리는 물론 병태 생리하에서 NMDAR이 중요한 구실을 한다는 것을 반영한다.

Ca²⁺ 의존성 신경 독성 과정과 관련하여, 포유류 신경계에서 N-메틸-D-아스파르트산 수용체(NMDAR) 활성이 세포내 신호 경로를 유발하는 효율에 따라 신경 세포의 형성성(plasticity), 발생, 노화와 질환이 제어된다는 것을 관측하였다. NMDAR 골격 단백질(scaffolding protein)인 PSD-95의 발현을 억제하여 흥분 독성(exitotoxic) NMDAR 신호 전달을 연구한 결과, NMDAR 흥분 독성이 선택적으로 완 화된다는 것이 드러났지만 다른 글루탐산 또는 Ca²⁺ 통로를 통한 흥분 독성도 완화되지는 않았다(미국 특허 US 20030050243 참조). NMDAR 기능은 그에 따라 수용체 발현에 영향을 받지 않았고, NMDA 전류와 NMDAR를 통한 ⁴⁵Ca 부하량도 변화가 없었다. 더욱이 PSD-95를 선택적으로 억제하면 신경 세포 산화질소 합성 효소(nNOS)의 발현이나 기능에 영향을 미치지는 않은채, Ca²⁺-활성화 산화질소의 합성 중 NMDAR에 의한 경로는 봉쇄하였지만 다른 경로는 막지 않았다. 따라서 PSD-95는 NMDAR 활성을 산화질소 독성에 효과적으로 결부시키고 흥분독성 Ca²⁺ 신호 전달에 특이성을 부여하는데 필수적이라고 여기고 있다.

한편 NMDAR를 통한 칼슘 유입은 시냅스 전파, 신경 세포 발생과 형성성을 매개하는데 주요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다(예를 들어 Ghosh와 Greenberg의 Science 268, 239 (1995); Bliss와 Collingridge의 Nature 361, 31 (1993)를 참조하라). 과잉의 Ca²⁺ 유입은 흥분독성을 야기하는데(예를 들어 Olney의 Kainic acid as a tool in neurobiology., McGeer, Olney와 McGeer 편집. (Raven Press, New York, 1978), p. 95.; Rothman과 Olney의 TINS 10, 299 (1987); Choi, Ann NY Acad Sci 747, 162 (1994)을 참조하라), 흥분독성은 뇌졸중, 간질 및 만성 신경 변성 질환을 비롯한 신경학적 질환에서 신경 세포를 손상한다(예를 들어 Lipton과 Rosenberg의 New Eng J Med 330, 613 (1994)를 보라). 급격한 Ca²⁺ 의존성 신경 독 성은 Ca²⁺ 유입이 NMDAR를 거칠 때 가장 잘 촉발되며, 非NMDAR 수용체나 전압 감응성 칼슘 통로(voltage-sensitive Ca²⁺ channel, VSCC)를 통하여 같은 양의 Ca²⁺을 신경 세포에 부하할 때는 신경 독성을 재현할 수 없다(예를 들어 Sattler 외, J Neurochem 71, 2349 (1998).; Tymianski 외, J Neurosci 13, 2085 (1993)를 보라). 이러한 관찰 결과는 NMDAR 통로를 거치는 Ca²⁺ 유입이 신경 독성 신호전달 경로와 기능적으로 결합하고 있을 수 있다는 것을 가리킨다. 즉 특정 이론에 구애되고자 하는 바는 아니지만, NMDAR에 의한 치명적인 Ca²⁺ 신호 전달은 NMDAR과 물리적으로 상호작용하는 분자들에 의하여 결정될 수 있다고 제시된 바 있다. 예를 들어 NR2 NMDAR 소단위체(subunit)는 그들의 세포내 C-말단 영역(domain)을 통하여 PSD-95/SAP90(Cho 외, Neuron 9, 929 (1992)를 보라), 챕신-110/PSD-93(chapsyn-110/PSD-93) 및 세포막 결합형(membrane-associated) 구아닐산 키나아제 (MAGUK) 단백질군의 기타 구성 요소들(예를 들어 Kornau 외, Science 269, 1737 (1995).; Brenman 외, J Neurosci 16, 7407 (1996); Muller 외, Neuron 17, 255 (1996)을 보라)와 결합한다. NMDAR과 결합한 MAGUK은 일반적으로 非NMDAR과 결합한 MAGUK과는 구별이 된다 (Dong 외, Nature 386, 279 (1997); Brakeman 외, Nature 386, 284 (1997)를 보라). NMDAR이 신경 독성인 Ca²⁺ 신호를 선택적으로 활성화하는 것은 NMDAR과 결합한 MAGUK 또는 이들과 결합하는 세포내 단백질의 구조적 차별성에 의하여 정해진다는 것이 밝혀졌다. PSD-95는 세포막하 골격 분자(submembrane scaffolding molecule)로서 NMDAR과 선택적으로 결합하여 이들을 응집시키며 또 다른 단백질-단백질 상호작용을 통하여 NMDAR을 세포내 신호 전달 분자에 연결할 수도 있는 것으로 보인다(예를 들어 Craven과 Bredt, Cell 93, 495 (1998); Niethammer 외, Neuron 20, 693 (1998); Kim 외, Neuron 20, 683 (1998); Tezuka 외, Proc Natl Acad Sci USA 96, 435(1999)를 보라). 이 때문에 PSD-95를 교란하면 신경 독성 Ca²⁺ 신호 전달에 영향을 줄 수 있다는 견해가 나왔다.

일반적으로 단백질-단백질 상호작용은 세포 성장, 분화와 모듈 형태의 단백질 영역과 이 영역들이 인식하는 결합 상대 사이의 동적인 결합을 통한 세포내 통신에 관련된 신호들을 다스린다(Pawson과 J. D. Scott, Science 278, 2075-2080 (1997)를 보라). 특히 이온투과성(ionotropic) 글루탐산 수용체는 중추 신경 세포들 사이 흥분성 시냅스의 연접후 치밀질(postsynaptic density, PSD)내에서 다중 단백질 신호 전달 복합체로 조직된다(Sheng, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 98, 7058-7061 (2001)을 보라). PSD 내의 두드러진 조직화 단백질은 PSD-95인데, 이 단백질은 세포막 결합형 구아닐산 키나아제(MAGUK) 단백질군의 구성 요소이다. PSD-95는 N-메틸-D-아스파르트산 아형(subtype)의 글루탐산 수용체(NMDAR) 등의 막통과(transmembrane) 단백질과 다양한 세포내 신호 전달 효소를 연결하는 영역을 여러 개 가지고 있다. PSD-95는 그 두번째 PDZ 영역(PDZ2)를 통하여 NMDAR 2B 소단위체(NR2B)와 신경 세포 산화질소 합성 효소(nNOS)를 모두 결합한다(Brenman 외, Cell 84, 757-767 (1996)를 보라). 이 상호작용은 NMDAR 활성과 NMDAR 의존성 흥 분독성을 매개하는 신호 전달 분자인 산화질소(NO)의 생성을 맺어준다(Dawson 외, Proc Natl Acad Sci USA 88, 6368-6371 (1991)를 보라). NR2는 PSD-95의 PDZ1이나 PDZ2와 상호작용할 수 있다. 그러나 만약 PSD-95의 PDZ1 영역이 NMDA 수용체의 COOH 말단과 상호작용할 때는 PCZ2는 nNOS의 NH₂ 말단과 자유로이 결합한다(Cao 외, 2005, J.Cell Biol 168, 117-126;과 Christopherson 외, 2005, J. Biol. Chem. 274:27467-27473).

NMDAR이 비록 저산소/허혈성 뇌손상에 있어서 중요한 신경 독성 역할을 맡지만(Simon 외, Science 226, 850-852 (1984)를 보라), NMDAR 기능을 차단하는 것은 사람과 동물에게 유해할 수 있다(Fix 외, Exp Neurol 123, 204-215 (1993); Davis 외, Stroke 31, 347-354 (2000); Morris 외, J. Neurosurg. 91, 737-743 (1999)를 보라). NMDAR 길항제는 발생 중인 뇌에 세포 자멸사를 촉발한다. 아울러 외상성 뇌손상 후 결정적인 시기에 혹은 서서히 진행 중인 신경 변성 과정에 NMDAR 길항제를 투여하면 성체 뇌에서 신경 세포 손실을 악화시킨다(Ikonomidou 외, 2000, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 12885-12890; Olney 외, 2002, Brain Pathology 12, 488-498). 더욱이 NMDAR 길항제로 NMDAR를 차단하면 인지 장애와 정신병 등의 다른 바람직하지 않은 부작용에 이를 수 있다. PSD-95 단백질을 표적으로 삼는 것은 따라서 흥분독성에 관련된 질환에 대한 치료적 대안이 될 수 있는데, 이는 NMDAR 기능을 차단해서 생기는 부정적 결과들을 피하는 길이 될 수 있다. 그러나 PSD-95의 돌연변이화 또는 억제는 뇌손상의 치료법으로서 실용성이 없다고 판명난 바 있고, 손상이 일어난 다음에는 쓸 수 없다. 그러므로 PSD-95 발현을 바꾸기보다는 NMDAR/PSD-95 상호작용에 간섭하면 시험관내에서 흥분독성, 그리고 생체내에서 허혈성 뇌 피해를 억제할 수 있는지를 궁구하였다.

이와 같은 관점에서, 종래 기술(미국 공개 공보 20030050234)에서는 상기 피해를 줄이기 위하여 N-메틸-D-아스파르트산(NMDA) 수용체와 NMDAR 상호작용성 단백질 사이의 상호작용을 줄이거나 억제하는 화합물로 포유류 세포를 처리한다. 미국 공보 20030050243에 따른 이 방법은 NMDAR 상호작용성 단백질, 예를 들어 신경 세포 단백질과 신경 세포 NMDAR 사이의 상호작용을 깨뜨릴 수 있는 펩티드 화합물을 이용한다. 이 방법은 NMDAR 기능을 차단함으로써 생기는 불리한 효과를 우회한다. 미국 공보 20030050243에 따른 이 방법은 연접후 치밀질-95 단백질(PSD-95)과 신경 세포 N-메틸-D-아스파르트산 수용체의 상호작용이 흥분독성을 매개하는 경로로 이어지고, 그렇기 때문에 바로 이 상호작용을 무너뜨리는 선택적펩티드를 써서 허혈성 뇌 파괴를 치료할 수 있을 것이라는 발견에 주로 바탕을 두고 있다. 더 구체적으로 미국 공보 20030050243에 따르면 PSD-95/NMDAR 상호작용 복합체의 두 측면 중 어느 쪽에서라도 모듈성 영역에 결합할 수 있는 펩티드를 신경 세포에 도입함으로써 이러한 상호작용을 무너뜨릴 수 있었다. 이러한 펩티드 처리는 NMDAR 활성의 차단 없이 하류의 NMDAR 신호 전달을 약화하였고, 흥분독성 발작시 배양한 피질 신경 세포를 보호하였으며, 일시적 국소 뇌 허혈에 처한 래트에서 뇌 경색 부피를 줄여주었다. 미국 공보 20030050243의 치료 방법은 시험관내 흥분독성과 생체내 뇌 허혈이 발병 전 또는 그 후 한 시간에 적용하였을 경우 효과적이었다. 따라서 이 방법은 NMDAR 활성 차단에 관련된 부정적인 합병증을 방지하기 위한 좋은 기초가 된다.

그러나 예를 들어 어떤 질병을 치료하려고 세포내 표적을 향하여 생체내 투여하거나 세포 처치를 위하여 시험관내 투여한 펩티드 화합물은 그 처리한 세포에서 생체 이용률이 낮은 것이 전형적인 경우라고 이 분야에 잘 알려져 있다. 이 저조한 생체 이용률의 주 원인은 이 펩티드 화합물이 그 표적 세포를 향하여 최적에 미달하는 효율로 전달되기 때문이다. 이는 예를 들어 적절한 전달체 시스템이 없기 때문이거나 생체내 원하는 표적 세포의 위치에서 효율적으로 작동하지 못하는 부적절한 전달체 시스템, 예를 들어 세포질 또는 특정 세포내 목적지를 효과적으로 표적삼지 못하는 시스템을 사용한 까닭일 수 있다. 이러한 효과는 펩티드 화합물을 더 많이 투여하거나 반복 투여함으로써 극복할 수 있지만 생체내 펩티드 화합물의 농도가 올라가면 투여시 원하지 않는 부작용으로 이어질 수 있다. 나아가 펩티드 화합물 투여를 거듭하려면 의사가 계속 곁에 있어야 하는 것이 전형적이므로, 결국 계속 입원을 하여야 한다. 설령 이러한 부작용을 펩티드 화합물의 다량 투여, 반복 투여 또는 더 적절한 전달 시스템(예를 들어 TAT를 전달 펩티드로 사용하는 미국 공개 공보 20030050243을 보라) 사용으로 누그러뜨린다고 하여도, 이 펩티드 화합물은 종래에는 정해진 분해 과정을 겪을 것이고 그 결과 다시 생체내 이용률이 저조하게 될 것이다. 이러한 효과는 부분적으로는 세포내 과정, 예를 들어 단백질 분해 효소 또는 펩티드 분해 효소 등의 분해 효소에 의한 파괴 또는 이들 펩티드의 생체내 불안정성 또는 혈청이나 뇌척수액 등의 환경에서 일어나는 단백질 분해성 파괴 때문일 수 있다. 그러나 펩티드 불안정성은 이들 펩티드 화합물의 투여량 증가나 반복 투여로 없앨 수 없다.

이러한 문제점에서 출발한 본 발명의 목적은 따라서 손상이 포유류 세포에 끼치는 피해를 줄이기 위한 대안, 더 구체적으로 신경 세포 N-메틸-D-아스파르트산(NMDA) 수용체와 NMDAR 상호작용성 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 화합물을 제공하는 것인데, 그럼으로써 종래 기술의 한계, 예를 들어 미국 공보 US 20030050243에 따른 화합물이 예시하는 한계를 일부라도 극복할 수 있다.

이러한 본 발명의 목적은 운반체 펩티드(transporter peptide)를 함유하는 성분 (I)과, 신경 세포 N-메틸-D-아스파르트산 수용체(NMDAR)와 NMDAR 상호작용성 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 펩티드로부터 선택한 성분 (II)를 적어도 하나씩 가지는 융합 펩티드에 의하여 이룩할 수 있는데, 여기서 성분 (II)는 D-거울상이성질 아미노산으로만 이루어진다. 본 발명 출원서에서는 D-거울상이성질 아미노산은 서열 속에서 소문자로 나타내고, L-거울상이성질 아미노산은 대문자로 나타낸다.

앞서 정의한 본 발명의 융합 펩티드는 성분 (I)로서 전달 펩티드를 함유한다. 이러한 전달 펩티드는 본 발명의 융합 펩티드를 세포질 또는 더 나아가 세포내 특정 목적지로 인도할 수 있는 모든 전달 펩티드들 중에서 선택할 수 있다. 성분 (I)로 사용되는 이 전달 펩티드는 예를 들어 본 발명의 융합 펩티드를 세포 내 원하는 장소, 예를 들어 핵, 리보솜, 소포체, 리소좀 또는 퍼옥시좀으로 인도할 수 있다. 그에 따라 바람직한 한 실시 태양에서 본 발명 융합 펩티드의 전달 펩티드는 짝지어진 분자(conjugate molecule)를 정해진 세포내 장소로 인도한다. 어느 경우이건 본 발명의 융합 펩티드의 성분 (I)로 쓰이는 이 전달 펩티드는 본 발명의 융합 펩티드가 세포막을 관통하도록, 예를 들어 세포외 환경에서 세포막을 거쳐 세포질로 인도하여 본 발명의 융합 펩티드가 세포에서 흡수되도록 하는 것이 바람직한데, 그렇게 함으로써 상기 융합 펩티드의 세포 흡수를 향상시키며, 특히융합 펩티드의 세포막 투과성 또는 세포내 보류 시간을 향상시킴으로써 세포 흡수를 향상시킨다.

더욱 바람직하게, 앞서 정의한 융합 펩티드의 성분 (I)은 다음 펩티드들로 제한되는 것은 아니지만, 이하를 포함하는 세포막 관통 펩티드(cell membrane penetrating peptide, CPP)들로부터 선택할 수 있다. (a) 단백질 도입 영역(protein transduction domain, PTD)과 단백질 유래 CPP. 예를 들어 안테나페디아(antennapedia) 유래 서열인 pAntp(43~58)로서 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 1) 또는 RQIKIWFQNRRMKWKK-아미드 (서열번호 2)를 함유하는 것; 혹은 사람 면역결핍바이러스 1(HIV-1) 유래의 서열, 예를 들어 Tat, 더 바람직하게는 Tat의 지역(region) 37 내지 72, 37 내지 60, 48 내지 60 또는 49 내지 57로서, 예를 들어 서열 GRKKRRQRRR(서열번호 3), YGRKKRRQRRR(서열번호 4), CGRKKRRQRRRPPQC(서열번호 5) 또는 CGRKKRRQRRRPPQCC(서열번호 6)를 함유하는 것; LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH₂ (서열번호 7) 서열을 함유하는 hCT(9~32); LLIILRRRIRKQAHAHSK-NH₂(서열번호 8) 서열을 함유하는 pVEC; RVIRVWFQNKRCKDKK-NH₂ (서열번호 9) 서열을 함유하는 pISL; MANGLYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP-NH₂ (서열번호 10) 서열을 함유하는 마우스 PRP(1~28) 또는 그 사람 동족체; RQGAARVTSWLGLQLRIAGKRLEGRSK-NH₂ (서열번호 11) 서열을 함유하는 E^ms(194~220); KLIKGRTPIKFGK-NH₂ (서열번호 12) 서열을 함유하는 레스트리코신(Restricocin) L3(60~73) 등이다.

(b) 모형 펩티드로서 다음과 같은 것들, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD-NH₂ (서열번호 13) 서열을 함유하는 VT5; KLALKLALKALKAALKLA-NH₂ (서열번호 14) 서열을 함유하는 MAP; RRRRRRR, 즉 (Arg)₇ (서열번호 15), 또는 RRRRRRR-NH₂, 즉 (Arg)₇-NH₂ (서열번호 16), 또는 RRRRRRR-C, 즉 (Arg)₇-C (서열번호 17), 또는 RRRRRRRR, 즉 (Arg)₈ (서열번호 18), 또는 RRRRRRRR-NH₂, 즉 (Arg)₈-NH₂ (서열번호 19), 또는 RRRRRRRRR, 즉 (Arg)₉ (서열번호 20), 또는 RRRRRRRRR-NH₂, 즉 (Arg)₉-NH₂, (서열번호 21)를 비롯한 아르기닌 반복부 등이 있으며,

(c) 인위적으로 설계한 CPP로서 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (서열번호 22) 또는 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-시스테아미드 (서열번호 23)를 함유하는 MPG, GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH₂ (서열번호 24) 서열을 함유하는 트랜스포탄(Transportan), AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH₂ (서열번호 25) 서열을 함유하는 트랜스포탄 10, KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(서열번호 26) 또는 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-시스테아미드(서열번호 27) 서열을 함유하는 펩-1(Pep-1)이 있다. 혹은 성분 (I)은 WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (서열번호 28) 서열을 함유하는 KALA 펩티드나, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (서열번호 29) 서열을 함유하는 불포린(Bulforin) 2로부터 선택할 수도 있다. 본 발명의 융합 펩티드 성분 (I)로서 쓰이는 펩티드는 나아가 앞서 정의한 서열번호 1~29의 펩티드 서열과 대략 60, 70, 80, 90, 95 또는 99%로 일치하는 펩티드 서열 중에서 선택할 수도 있는데, 다만 성분 (I)이 생물학적 활성, 즉 본 발명의 융합 펩티드를 세포막을 통하여 인도할 수 있다는 것을 전제로 한다. 앞서 정의한 세포막 관통 펩티드를 본 발명의 융합 펩티드 성분 (I)로 고르는 작업은 본 발명의 융합 펩티드를 투여할 세포 시스템에 필요한 구체적 필요 조건, 예를 들어 해당 세포 시스템, 세포막 등의 전달 효율을 바탕으로 정하는 것이 전형적인 경우이다. 전술한 전달 펩티드나 공지된 전달 펩티드의 생물학적 활성은 표준적인 분석 방법을 통하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어 전달 펩티드를 GFP 같은 단백질과 융합하거나 방사능 표지, 효소 또는 형광 발색단 등으로 표지할 수 있고, 이는 세포 내에서 쉽게 검출할 수 있다. 이어서 그 융합된 전달 펩티드로 세포를 형질전환(transfection)하거나 세포 배양 상층액에 더할 수 있고, 세포막 투과는 표준적인 생물리학적 방법으로 관찰할 수 있다.

앞서 정의한 융합 펩티드 성분 (I)은 자연적으로 존재하는 아미노산, 즉 L-아미노산으로 구성될 수도 있고, D-아미노산으로, 즉 그 자연 서열과 비교했을 때 역순 거울상(retro-inverso)인 D-아미노산으로 구성될 수 있다. "역순 거울상(retro-inverso)"이란 용어는 선형 펩티드에서 서열의 방향이 역순이이고 각 아미노산 잔기의 키랄성이 뒤집힌 한 이성질체를 가리킨다. 따라서 이 명세서에 L-형으로 나타낸 모든 서열은 자연스레 본 명세서에서 D-거울상이성질(역순 거울상) 펩티드 서열으로 제시한 것이 된다. 본 발명에 따른 D-거울상이성질(역순 거울상) 펩티드 서열은 예를 들어 대응하는 천연 L-아미노산 서열의 역서열을 합성함으로써 이룰 수 있다. D-역순 거울상 거울상이성질 펩티드, 예를 들어 본 발명의 융합 펩티드의 성분에서 개별 아미드 결합의 카르보닐과 아미노기 위치는 뒤바뀌지만, 각 알파 탄소에서 잔기의 위치는 보존된다. 역순 거울상 펩티드가 본 발명의 융합 펩티드 성분으로 쓰일 때는 여러가지 쓸모 있는 기능을 발휘한다. 예를 들어 역순 거울상 펩티드는 세포에 더 효율적으로 침입하며 더 안정적(특히 생체내에서)이며 해당 L-펩티드에 비하여 면역원성이 덜하다. 이와 대조적으로 천연적으로 존재하는 단백질은 L-아미노산을 전형적으로 함유하므로 단백질 분해 효소나 펩티드 분해 효소오 k같은 모든 분해 효소가 이웃하는 L-아미노산 사이의 펩티드 결합을 끊는다. 그 결과 역순 거울상 D-아미노산으로 이루어진 본 발명의 융합 펩티드, 특히 성분 (II) 및 선택적으로 성분 (I)은 단백질 분해성 파괴에 대부분 저항력이 있다.

D-거울상이성질 아미노산을 가지는, 전술한 본 발명의 융합 펩티드는 천연적으로 존재하는 대응 L-형 아미노산 서열을 역순으로 화학 합성하거나 이 분야 기술자에게 알려진 다른 모든 적절한 수단을 써서 제조할 수 있다. 이 합성은 고상 합성을 통하여 D 아미노산을 원하는 역순 거울상 서열로 연결하는 것이 바람직하다. D 아미노산이 쓰이고 아미노산 합성이 역순 거울상이라는 것을 빼고는 본 발명에 따른 D 아미노산 서열의 고상 합성은 L 아미노산 기반의 펩티드 합성과 화학적으로 동일하다. 원하는 어떠한 DNA 서열도 제조할 수 있는 일반적인 방법에 대해서는 예를 들어 Brown J. 외(1979), Methods in Enzymology, 68:109; Sambrook, J., Maniatis T.(1989), 상기 참조.

한편으로 D-역순 거울상이성질 형태의 본 발명에 따른 융합 펩티드 또는 그 성분은 L-형태의 본 발명 융합 펩티드 또는 그 성분을 상기 D-역순 거울상이성질 형태를 화학 합성용 매트릭스로 사용하는 전술한 방식의 화학 합성을 통하여 얻을 수 있다.

앞서 설명한 본 발명 융합 펩티드의 성분 (II)는 신경 세포 N-메틸-D-아스파르트산 수용체(NMDAR)와 NMDAR 상호작용성 단백질(예를 들어 PSD-95 등의 결합성 단백질, 신경 세포 단백질 등등) 사이의 상호작용을 억제할 수 있는 모든 펩티들로부터 선택할 수 있다. 그러한 펩티드는 NMDAR 상호작용성 단백질을 포착함으로써 NMDA 수용체와 상호작용하는 것을 막거나 거꾸로 NMDAR을 포착함으로써 상호작용을 마찬가지로 억제한다. 나아가 이들 펩티드는 NMDA 수용체를 차단하지 않으므로 NMDA 수용체 차단과 결부된 단점들을 피할 수 있다. 특히 전술한 본 발명의 융합 펩티드 성분 (II)는 NMDAR의 상호작용 영역(interaction domain, 예를 들어 NR2의 C-말단 PDZ 상호작용 영역)을 모방하거나 NMDAR 결합성 단백질의 상호작용 영역(예를 들어 PSD-95의 PDZ 영역)을 모방함으로써 NMDAR과 그 결합성 단백질 사이의 상호작용(예를 들어 PS-95-NR2 상호작용)을 교란하도록 설계된 모든 펩티드들로부터 선택할 수 있다. 본 발명의 융합 펩티드 성분 (II)로 적절한 펩티드는 NMDA 수용체 소단위체 NR1과 NR2로부터 선택할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. N-메틸-D-아스파르트산 수용체의 NR1과 NR2 소단위체는 별도의 유전자들에 의하여 암호화된다. 래트의 뇌에서 C-말단에 변이가 있는 4 종류의 NR1 소단위체(NR1-1 내지 NR1-4)는 하나의 유전자가 암호화하며, 그 C1과 C2 엑손 카세트의 대체적 이어맞추기(alternative splicing)에 의하여 4 종류의 변이체를 생성한다. 반면에 NR2 소단위체들(NR2 A 내지 D)은 4 개의 서로 다른 유전자가 암호화한다. 기능적으로 작동하는 NMDA 수용체는 NR1 변이체가 각각 다른 NR2 소단위체와 맺은 헤테로다중 조립체(assembly)를 형성한 결과물이다. NR2B 소단위체는 연접후 치밀질 단백질 95(PSD-95), SAP97 등 및 세포막 결합형 구아닐산 키나아제(MAGUK) 단백질군의 구성 요소들과 상호작용한다. 이 상호작용은 NR2B 소단위체의 C-말단 tSX_nV 세포내 구조 요소(intracelluar motif)가 PSD-95와 SAP97 단백질의 N-말단 PDZ(PSD-95, discs-large와 ZO-1) 영역에 결합하여 이루어진다. NR1-3과 NR1-4은 양쪽 모두 C-말단 tSX_nV 구조 요소의 공통 서열을 나타낸다. 그러므로 본 발명 융합 펩티드의 성분 (II)로 쓰이는 펩티드를 tSX_nV 구조 요소를 갖춘 펩티드들로부터 선택할 수 있는데, 여기서 S는 세린이고, X_n은 아무 아미노산(또한 n이 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 등)이라도 좋으며, V는 발린이다. 바람직하게는 본 발명 융합 펩티드의 성분(II)로 쓰이는 펩티드를 NMDAR에서 유래하는, 연접후 치밀질-95 단백질과, PSD-95와, PSD-93과 또는 SAP102와 결합할 수 있는 펩티드들, 더 바람직하게는 PDZ2-영역 함유 폴리펩티드와 같이 PDZ-결합 영역(binding domain)에 결합할 수 있는 펩티드, 바람직하게는 PSD-95의 첫째와 둘째 PDZ 영역(PDZ 1~2)을 암호화하는, PSD-95의 잔기 65~248에 대응하는 서열로부터 선택한다. 전형적으로 본 발명의 융합 펩티드 성분 (II)로 쓰이는 이러한 펩티드들은 5 내지 40 개 길이의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 30 또는 5 내지 20개 길이의 아미노산, 더 바람직하게는 5 내지 15, 심지어는 5 내지 10 개의 아미노산을 함유한다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 융합 펩티드 성분 (II)에 적절한 펩티드는 D-거울상이성질 아미노산 서열 vdseisslk(서열번호 31)를 함유하는 서열이거나, 서열번호 31(또는 전술한 모든 서열들)과 대략 60, 70, 80, 90, 95 또는 가장 바람직하게 99%의 서열 일치도를 나타내는 서열을 함유하는 펩티드 서열들로부터 선택한다.

본 명세서에서 정의하는 "서열 일치도(sequence identity)"란 서열들을 다음과 같이 비교하는 것을 뜻한다. 두 아미노산 서열의 퍼센트 일치도(percent identity)를 정하려면 이 서열들을 최적 비교를 위하여 정렬(예를 들어 첫째 아미노산 서열이 결실부(gap)를 포함할 수도 있다)한다. 이어서 대응하는 자리의 아미노산을 비교한다. 첫째 서열의 어느 자리가 둘째 서열의 대응하는 자리에서 동일한 아미노산으로 채워져 있으면, 두 분자는 그 자리에서 일치한다. 두 서열 사이의 퍼센트 일치도는 두 서열이 공유하는 일치하는 자리수의 함수로서, 예를 들어 어느 한 펩티드가 정해진 길이의 비교 기준 폴리펩티드에 대하여 어떤 값의 퍼센트 일치도를 가진다고 할 때 그 퍼센트 일치도는 비교 기준 펩티드에 상대적인 값이다. 따라서 100 아미노산 길이의 어느 비교 기준 폴리펩티드에 대하여 50% 일치하는 펩티드는 이 비교 기준 펩티드의 한 50 아미노산 길이 부분과 완전하게 일치하는 50 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다. 또한 이 펩티드는 100 아미노산 길이의 폴리펩티드로서, 이 비교 기준 폴리펩티드 전체 길이에 대하여 50% 일치하는 것일 수도 있다. 따라서 어떠한 퍼센트 일치도를 가진다고 할 특정 펩티드를 선택할 수 있는데, 성분 (I)을 구체적인 펩티드들로부터, 예를 들어 서열번호 1 내지 29 중 어느 것에서라도 택할 수 있고, 그리고 성분 (II)를 구체적인 펩티드들로부터, 예를 들어 서열번호 31로 뽑을 수 있고, 이밖에 서열번호 33과 35로 전체 융합 펩티드를 선택할 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 물론 다른 폴리펩티드들도 같은 기준을 만족할 수 있다. 이렇게 두 서열의 퍼센트 일치도를 결정하는 것은 수학적 알고리듬을 이용하여 이루어질 수 있다. 두 서열의 퍼센트 일치도 비교에 쓰이는 수학적 알고리듬의 바람직하지만, 비제한적인 예로는 Karlin 외(1993), PNAS UsA, 90:5873~5877의 알고리듬을 들 수 있다. 이 알고리드음은 NBLAST 프로그램에 결합되어 있는데, 이 프로그램을 이용하여 본 바령의 아미노산 서열과 원하는 수준으로 일치하는 서열을 찾을 수 있다. 결실부 포함 정렬을 위한 비교 용도로는, Gapped BLAST를 Altschul 외(1997), Nucleic Acids Res, 25:3389~3402에 기술한 것과 같이 쓸 수 있다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때 각각의 프로그램(예를 들어 NBLAST)의 기본 파라미터를 사용할 수 있다. Genetic Computing Group의 GAP 프로그램 9판을 이용하여 서열을 추가로 정렬할 수 있는데, 이때 기본(BLOSUM62) 매트릭스(-4 내지 +11의 값으로)와 열린 결실부 벌점(gap open penalty)값을 -12(결실부의 첫 공란(nuyll)에 대해서)로 결실부 연장 벌점(gap extension penalty) 값을 -4(결실부의 매 후속 공란마다)로 하여 정렬할 수 있다. 정렬 후 퍼센트 일치도는 후보로서 찾은 서열의 아미노산의 수 중에서 일치하는 자리수를 백분율로 나타냄으로써 계산할 수 있다. 두 아미노산 서열의 퍼센트 일치도를 정하는 데에 대하여 설명한 이 방법은 핵산 서열에도 마찬가지로 사용할 수 있다.

전술한 본 발명 융합 펩티드의 성분 (II)는 D-거울상이성질 아미노산, 즉 D-아미노산을 전술한 역순 거울상으로 함유하는 아미노산 서열로만 이루어지고, 앞서 개시한 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 융합 펩티드 성분 (II)로 쓰이는 역순 거울상 펩티드는 앞서 성분 (I)에 대하여 설명한 여러가지 유용한 특성을 가지는데, 예를 들어 단백질 분해가 없기 때문에 본 발명의 융합 펩티드를 이루는 이 성분이 더 오래 가는 생체 이용률을 가진다는 것 등이다.

본 발명의 융합 펩티드 성분 (I)과 (II)는 직접 연결되거나 연결부를 통하여 이을 수 있다. 본 발명에서 "연결부(linker)"란 올리고펩티드 또는 폴리펩티드가 바람직하며 전술한 성분 (I)과 (II)를 연결하는데 쓸 수 있다. 바람직하게는 연결부가 1~10 아미노산 길이이고, 더 바람직하게는 1~5 아미노산 길이며, 가장 바람직하게는 1 내지 3 아미노산 길이이다. 유리한 특징으로서 예를 들어 이 연결부가 적어도 35% 이상의 글리신 잔기로 이루어졌을 때는, 연결부에 2차 구조를 형성하는 특성, 즉 α-나선과 β-병풍 구조를 형성하는 경향이 없다. 연결부는 글리신만으로 된 서열, 예를 들어 GG, GGG, GGGG, GGGGG 등인 것이 전형적인 경우이다. (세포내에서 혹은 내재적으로) 끊어질 수 있는(cleavable) 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 연결부로 사용하면 표적 세포로 전달 후 성분 (II)가 성분 (I)로부터 떨어져 나가도록 할 수 있다. 본 명세서에서 끊어질 수 있는 올리고- 또는 폴리펩티드 서열에는 단백질 분해 효소로 끊을 수 있는 올리고- 또는 폴리펩티드 서열이 포함되는데, 여기서 상기 단백질 분해 효소 절단 자리는 처리할 세포에서 내재적으로 발현하는 단백질 분해 효소에 맞추어 선택하는 것이 전형적인 경우이다. 전술한 연결부가 만약 올리고- 또는 폴리펩티드 서열로 존재할 경우, D-아미노산으로 이루어지거나 혹은 자연적으로 존재하는 아미노산, 즉 L-아미노산으로 이루어질 수 있다. 한편 이 같은 방식에 대한 대안으로서, 본 발명의 융합 펩티드 성분 (I)과 (II)를 결합제(coupling or conjugating agent), 예를 들어 가교제를 이용하여 결합할 수 있다. 이용할 수 있는 분자간 가교제에는 몇 가지가 있는데, 예를 들어 Means와 Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp. 39~43을 보라. 이들 시약들로는 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산(SPDP) 또는 N, N'-(1,3-페닐렌)비스말레이미드, N, N'-에틸렌-비스(요오드아세트아미드) 또는 6 내지 11 개의 탄소 메틸렌 연결부를 가지는 기타 시약과 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠이 있다. 본 발명의 용도에 쓸모 있는 다른 가교제에는 p,p'-디플루오로-m,m-디니트로페닐술폰, 아디프이미드산디메틸(dimethyl adipimidate), 염화페놀-1,4-디술폰일, 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 디이소티오시아네이트 또는 아조페닐-p-디이소시아네니트, 글루타르알데히드와 디스디아조벤지딘(disdiazobenzidine)이 포함된다. 가교제는 동일이중작용기(homobifunctional), 즉 같은 반응을 일으키는 작용기를 두 개 가질 수 있다. 바람직한 동일이중 작용기 가교제로는 비스말레이미도헥산(bismaleimidohexane, BMH)이 있다. BMH는 두 개의 말레이미드 작용기를 가지는데, 이들은 황화수소기 함유 화합물과 온화한 조건(pH 6.5~7.7)에서 특이적으로 반응한다. 이 두 말레이미드 작용기는 탄화수소 사슬로 이어져 있다. 그러므로 BMH는 시스테인 잔기를 함유하는 단백질(또는 폴리펩티드의) 비가역적 가교에 쓸모가 있다. 가교제는 이종이작용기(heterobifunctional)일 수 있다. 이종이작용기 가교제는 두 개의 다른 작용기, 예를 들어 자유 아민과 티올을 각각 가지는 두 단백질을 가교하는 아민-반응성 작용기와 티올-반응성 작용기를 가진다. 이종이작용기 가교제의 예로는 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복시산(SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드로숙신이미드 에스테르(MBS)와 MBS의 긴 사슬 유사체(anlaog)인 숙신이미드 4-(p-말레이미도페닐)부티르산(SMPB)을 들 수 있다. 이들 가교제의 숙신이미딜기는 1급 아민과 가교하고, 티올 반응성 말레이미드는 시스테인 잔기의 티올과 공유결합을 이룬다. 가교제는 종종 물에 대한 용해도가 낮기 때문에 술폰산기와 같은 친수성 부위를 가교제에 덧붙여 물 용해도를 개선할 수 있다. 술포-MBS와 술포-SMCC는 물 용해도를 위하여 개질한 가교제의 일례이다. 많은 가교제는 세포 환경에서 실질적으로 절단되지 않는 접합체(conjugate)를 낳는다. 그 때문에 일부 가교제는 세포 환경에서 절단될 수 있는 이황화기와 같은 공유결합을 지니기도 한다. 예를 들어 Tarut 시약, 디티오비스(숙신이미딜프로피온산)(DSP)와 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피온산(SPDP)는 잘 알려진 절단 가능한 가교제이다. 절단 가능한 가교제를 사용하면 표적 세포로 전달 이후 성분 (II)를 성분 (I)로부터 분리할 수 있는데, 다만 상기 세포가 가교제의 특정 서열을 절단할 수 있는 것을 전제로 한다. 이 용도로 직접 이황화물 연결부 또한 쓸 모 있을 수 있다. 화학적 가교시 간격자(spacer arm)를 이용할 수도 있다. 간격자는 분자내 유연성을 제공하거나, 접합 부위 사이의 분자내 거리를 조절함으로써 생물학적 활성을 보존하는 것을 도울 수 있다. 간격부는 간격부 아미노산, 예를 들어 프롤린을 포함하는 단백질(또는 폴리펩티드) 형태를 취할 수 있다. 한편으로, 간격부는 "긴 사슬 SPDP"(Pierce Chem.사, 미국 일리노이주 Rockford, 카탈로그 번호 21651H)처럼 가교제의 일부분일 수 있다. 앞서 설명한 것들을 비롯하여 수많은 가교제가 시판되고 있다. 이들의 자세한 사용 방법은 그 상업 공급원들로부터 쉽게 얻을 수 있다. 단백질 가교와 접합물 제조에 관한 일반적인 참조 문헌은 Wong의 Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(CRC Press(1991))이다.

전술한 본 발명의 융합 펩티드는 추가 성분 (III)을 선택적으로 함유할 수 있다. 이러한 성분 (III)은 바람직하게는 이 융합 펩티드의 합성 후 정제용 표지이다. 본 발명에서 "정제용 표지"란 재조합 단백질의 정제에 적절한 모든 다양한 표지로서 예를 들어 헥사히스티딘 표지(his-tag, 폴리히스티딘 표지), 스트렙트아비딘 표지(strep-tag), SBP 표지(streptavidine binding tag), 글루타티온-S-전달효소 표지(GST tag), 단실 표지(dansyl-tag) 또는 myc 표지, Swa11 항원결정인자, FLAG 표지 등의 항체의 항원 결정 인자(antibody epitope, 즉 항체 결합 표지)를 이용한 수단이 있다. 이러한 표지들은 성분 (I)과 (II) 및 선택적으로 성분 (III)으로 이루어진 전술한 상기 (전체) 융합 펩티드의 C-말단에 자리잡는 것이 바람직하다. 예를 들어 전술한 표지는 성분 (I)의 이 융합 펩티드의 C-말단에 위치한 경우, 성분 (I)의 C-말단에 자리잡는 것이 바람직하며, 성분 (II)가 C-말단에 위치한 경우, 성분 (II)위 C-말단에 자리잡는 것이 더욱 바람직하다. 나아가 전술한 성분 (III)은 성분 (I) 또는 (II)의 생물학적 기능, 가령 본 발명의 융합 펩티드가 세포막을 관통하도록 하는 성분 (I)의 효능과 NMDAR과 NMDAR 상호작용성 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 성분 (II)의 효능을 방해하지 않는 것이 바람직하다. 따라서 부피가 크지 않은 표지를 성분 (III)으로 선택하는 것이 바람직한데, 예를 들어 헥사히스티딘 표지, 스트렙트아비딘 표지(strep-tag), SBP 표지, 또는 myc 표지, Swa11 항원결정인자, FLAG 표지 등의 항체의 항원 결정 인자가 있다.

나아가 전술한 성분 (III)이 올리고- 또는 폴리펩티드로 포함된 경우는 전술한 D-아미노산 또는 천연적으로 존재하는 아미노산, 즉 L-아미노산으로 이루어질 수 있다. 따라서 성분 (I), (II) 및 선택적 성분인 (III)과 전술한 연결부를 포함하는 전체 융합 펩티드는 전술한 D-아미노산으로 이루어질 수 있다. 만일 성분 (I), (II) 및 선택적 성분 (III)과 전술한 연결부를 포함하는 본 발명의 융합 펩티드 전체가 D-아미노산으로 이루어진 경우는 본 발명 융합 펩티드의 D-거울상이성질 성분들에 관하여 앞서 설명한 방법, 예를 들어 화학적 합성법 또는 기타 적절한 방법을 이용하여 이 융합 펩티드 전체를 제조할 수 있다.

일반적으로, 전술한 본 발명 융합 펩티드의 성분 (I), (II) 및 선택적 성분 (III)을 적절한 순서로 정렬할 수 있는데, 즉 성분 (I)이 본 발명 융합 펩티드로 하여금 세포막을 통과하도록 인도할 수 있게 해 주는 어떠한 순서로라도 융합 펩티드 속에서 정렬할 수 있다. 나아가 성분 (II) 역시 N-메틸-D-아스파르트산 수용체와 NMDAR 상호작용성 단백질의 상호작용을 억제할 수 있어야 한다. 본 발명의 한 바람직한 태양에서는 성분 (I)이 본 발명 융합 펩티드의 N-말단에 자리잡으며, 성분 (II)가 융합 펩티드의 C-말단에 자리잡을 수 있다. 나아가 앞서 설명한 성분 (III)이 융합 펩티드에 들어 있는 경우, 성분 (III)을 본 발명 융합 펩티드 전체에서 C-말단 자리에 놓을 수 있다. 본 발명 융합 펩티드의 바람직한 정렬 순서는, 따라서, N-말단에서 C-말단 순으로 보았을 때, 성분 (I), 성분 (II) 및 선택적으로 성분 (III)이 될 것이다. 그러나 다른 정렬 순서, 예를 들어 N-말단에서 C-말단 순으로 성분 (II), 성분 (I) 및 선택적으로 성분 (III)을 택할 수도 있다. 적당한 경우, 앞에서 설명한 것처럼 성분 (I)과 (II)사이에 연결부를 둘 수도 있다.

본 발명의 융합 펩티드는 전술한 성분 (I) 및/또는 (II)의 "유도체"를 함유할 수 있다. 본 발명에서 성분 (I) 및/또는 (II)의 유도체란 전술한 바 있는, 천연적으로 존재하는 성분 (I) 또는 성분 (II)의 (L-아미노산) 서열로부터 유래한 서열로서, 이 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상의 자리에 하나 또는 더 많은 수의 아미노산을 치환하거나, 상기 천연적으로 존재하는 서열의 어느 자리에서라도 하나 이상의 아미노산을 삭제하거나, 상기 천연적으로 존재하는 펩티드 서열의 하나 또는 그 이상의 자리에 하나 또는 더 많은 수의 아미노산을 삽입함으로써 얻은 성분 (I) 또는 (II)의 서열을 뜻한다. "유도체"는 본 발명 융합 펩티드의 성분 (I) 또는 (II)로 쓰였을 때 그 생물학적 활성을 유지할 수 있어야 하는데, 즉 성분 (I)의 유도체는 전술한 바와 같이 본 발명의 융합 펩티드를 세포질 속으로, 나아가 특정 세포내 목적지로 인도할 수 있어야 하며, 한편 성분 (II)의 유도체는 신경 세포 NMDAR과 NMDAR 상호작용성 단백질 사이의 상호작용을 억제할 수 있어야 한다. 본 발명에서 유도체는 L-아미노산 또는 전술한 D-아미노산 형태, 또는 양쪽 모두로 나타날 수 있다.

본 발명 융합 펩티드 성분 (I) 및/또는 (II)의 유도체 제조를 위하여 아미노산 치환을 하는 경우, 보존적인 (아미노산) 치환을 하는 것이 바람직하다. 보존적인 (아미노산) 치환은 다음 각 치환군 내의 치환을 포함하는 것이 전형적인 경우이다: 글리신 대 알라닌, 발린 대 이소류신 대 류신, 아스파르트산 대 글루탐산, 아스파라긴 대 글루타민, 세린 대 트레오닌, 리신 대 아르기닌, 페닐알라닌 대 티로신. 따라서 바람직한 보존적인 치환군은 아스파르트산-글루탐산, 아스파라긴-글루타민, 발린-류신-이소류신, 알라닌-발린, 페닐알라닌-티로신과 리신-아르기닌이다. 예를 들어 이러한 돌연변이에 의하여 본 발명 융합 펩티드의 성분 (I)과 (II)의 안정성 및/또는 효능이 향상될 수 있다. 만약 본 발명 융합 펩티드의 성분 (I)과 (II)에 돌연변이를 도입하면, 그러한 성분 (I)과 (II)는 예를 들어 부모 서열에 해당하는 단백질과 예를 들어 서열, 기능, 항원성 또는 기타 기능에 있어서 (기능적으로) 동족성(homologous)을 유지해야 한다. 본 발명 융합 펩티드의 이런 돌연변이된 성분 (I)과 (II)는 어떤 응용 분야에 따라서는 변형되지 않은 성분 (I)과 (II)보다 더 유리한 변형된 특성(예를 들어 pH 최적성 증가, 온도 안정성 증가)을 지닐 수 있다.

전술한 본 발명 융합 펩티드의 성분 (I) 또는 성분 (II)의 유도체는 각각 전술한 본 발명 융합 펩티드의 변형되지 않은 성분 (I) 또는 성분 (II) 서열, 예를 들어, 성분 (I)로 쓰이는 HIV TAT 단백질 전위(translocation) 서열에 대해서 각각 상당한 정도의 일치도를 가진다. 특히 바람직한 서열로는 상기 천연적으로 존재하는 유사 서열(naturally occuring analogue)에 대하여 적어도 50% 서열 일치도, 더 바람직하게 적어도 60% 서열 일치도, 더 바람직하게 적어도 75% 서열 일치도, 더 바람직하게 적어도 80% 서열 일치도, 더더욱 바람직하게 적어도 90% 서열 일치도, 그리고 가장 바람직하게 적어도 95% 또는 심지어 99% 서열 일치도를 가지는 서열이 있다. 본 발명 융합 펩티드 성분 (I)과 (II)의 기능적 유도체를 합성하고 제조하는 방법, 그리고 두 아미노산 서열의 퍼센트 일치도를 정하는 방법 역시 앞서 기술하였다. 덧붙여, 앞서 개시한 본 발명 융합 펩티드의 성분 (I)과 (II)의 유도체를 생산하는 방법도 잘 알려진 것들이며 당업자가 잘 알고 있는 표준적인 방법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들어 상기 Sambrook J., Maniatis T(1989)를 보라).

한층 더 나아가, 본 발명에서는 다른 태양으로서 전술한 본 발명의 융합 펩티드를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게 이러한 약학 조성물은 성분 (I)과 (II) 및 선택적으로 전술한 성분 (III)과 선택적인 연결부를 갖춘 본 발명의 융합 펩티드를 함유한다. 추가적으로 그러한 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 보강제(adjuvant) 또는 매개체(vehicle)를 함유할 수 있다. "약학적으로 허용되는 담체, 보강제 또는 매개체"란 본 발명에서 함께 제제화되는 본 발명 융합 펩티드의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 무독성 담체, 보강제 또는 매개체를 가리킨다. 본 발명의 약학 조성물에 쓰일 수 있는 약학적으로 허용되는 담체, 보강제 또는 매개체로는 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 사람 혈청 알부민 등의 혈청 단백질, 인산 등의 완충제, 글리신, 소르브산(sorbic acid), 소르브산칼륨, 포화 식물 지방산의 부분 글리세리드화 혼합물, 물, 황산프로타민 등의 염 또는 전해질, 인산수소2나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드상 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 기반 물질, 폴리에틸렌글리콜, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리아크릴산, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 폴리에틸렌글리콜과 양모지(羊毛脂)를 들 수 있지만 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 흡입 분무, 국소 투여, 직장 투여, 콧속 투여, 볼 속 투여, 질내 투여 또는 삽입한 약물 저장소를 통하여 경구 투여 또는 비경구 투여할 수 있다. 본 명세서에서 비경구 투여란 피하, 정맥하, 근육, 관절, 윤활막내(intrasynovial), 복장내(intrasternal), 수막공간내(intrathecal), 간내(intrahepatic), 병변내(intralesional), 두개내(intracranial) 주사 또는 주입법을 포함한다. 이 약학 조성물은 경구, 복강 또는 정맥 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명 약학 조성물의 멸균 주사 형태는 수용성 또는 유질(油質) 현탁액일 수 있다. 이 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제, 현탁제를 이용하는 이 분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 이 멸균 주사제는 비경구 투여에 허용되는 무독성 희석제 또는 용매 속 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 용액일 수 있다. 매개체와 용매로 허용되는 것 중 사용할 수 있는 것으로는 물, 링거액과 등장 염화나트륨 용액이 있다. 덧붙여서 멸균한 비휘발유(fixed oil)도 용매 또는 현탁 매질로 통상적으로 쓰인다.

이러한 용도로는 합성 모노- 또는 디글리세리드를 비롯한 모든 무자극성 고정유를 쓸 수 있다. 올레산과 그 글리세리드 유도체 등의 지방산을 비롯하여 올리브유 또는 피마자유 등의 약학적으로 허용되는 천연 오일은 특히 폴리옥시에틸화된 형태로 주사제 제조에 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 또한 긴 사슬 알코올 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있는데, 그 예로 카르복시메틸셀룰로스 또는 유탁액, 현탁액을 포함하여 약학적으로 허용되는 투여 형태의 제조에 흔히 쓰이는 유사 분산제들이 있다. 약학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 기타 투여 형태의 제조에 흔히 쓰이는 트윈(Tween), 스팬(Span) 등의 흔히 쓰이는 계면활성제, 기타 유화제 또는 생체 이용률 향상제 또한 제제 제조에 쓸 수 있다.

본 출원의 약학 조성물은 캡슐, 정제, 물 현탁액 또는 수용액을 비롯한 모든 경구 투여에 허용되는 투여 형태로서 경구 투여할 수 있고, 이들 투여 형태에 한정되는 것은 아니다. 경구용 정제의 경우, 흔히 쓰이는 담체로 락토오스와 옥수수 전분을 들 수 있다. 스테아르산마그네슘 같은 윤활제를 보태는 것이 전형적인 경우이다. 캡슐 형태의 경구 투여에 유용한 희석제는 락토오스와 건조 옥수수 전분을 들 수 있다. 경구 투여에 물 현탁액이 필요할 때에는 그 유효 성분을 유화제 및 현탁화제와 혼합한다. 원할 경우, 소정의 감미제, 조미료 또는 착색제를 더할 수도 있다.

한편으로, 여기서 앞서 설명한 본 발명의 약학 조성물은 직장 투여용 좌약 형태로 투여할 수도 있다. 이러한 좌약은 적절한 비자극성 부형제로서, 실온에서 고체이지만 직장 온도에서 액체인 것, 그 때문에 직장 속에서 녹아 약물을 방출할 수 있는 부형제와 유효 성분을 섞어 줌으로써 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 코코아 버터, 밀랍과 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있다.

여기서 앞서 설명한 본 발명의 약학 조성물을 특히 치료 대상이 국소 투여로 쉽게 접근할 수 있는 장소나 기관, 예를 들어 눈, 피부 또는 하부(lower) 장관(腸管)의 질병을 포함하는 경우에 국소적으로 투여할 수 있다. 이들 각 장소 또는 기관에 대하여 적절한 국소 투여 제형을 쉽게 제조할 수 있다.

하부 장관에 대한 국소 투여는 직장 내 좌약 제제(전술한 내용을 보라) 또는 적절한 관장 제형으로 이룰 수 있다. 국소적 경피 패치(topically-transdermal patch) 또한 쓰일 수 있다.

국소 투여에 있어서, 하나 이상의 담체 속에 현탁되거나 용해되어 있는 본 발명의 융합 펩티드를 함유하는 적당한 연고 제형으로 전술한 본 발명의 약학 조성물을 만들 수도 있다. 본 발명 융합 펩티드의 국소 투여용 담체에는 광유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화제 왁스와 물이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 한편으로, 하나 이상의 담체 속에 현탁되거나 용해되어 있는 본 발명의 융합 펩티드를 함유하는 적당한 로션 또는 크림 제형으로 전술한 본 발명의 약학 조성물을 만들 수도 있다. 적절한 담체에는 광유, 모노스테아르산소르비탄, 폴리소르브산 60(polysorbate 60), 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴(cetearyl) 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올과 물이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

안과 용도로 본 발명의 약학 조성물을 등장, pH 조절 멸균 식염수 속 마이크화(micronized) 현탁액으로 혹은 바람직하게는 등장, pH 조절 멸균 식염수 속 용액으로, 염화벤질알코늄 등의 보존제를 포함하여 또는 포함하지 않고 제제화할 수 있다. 한편으로 안과 용도로는 상기 약학적으로 허용되는 조성물이 바셀린 같은 연고로 제형화될 수 있다.

전술한 본 발명의 약학 조성물을 에어로졸 또는 흡입에 의하여 콧속으로 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약학적 제형 분야에 잘 알려진 방법으로 제조할 수 있는데, 벤질 알코올이나 기타 적절한 보존제, 생체 이용률을 높이기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 통상적인 용해제 또는 분산제를 이용하여 식염수 용액 제형으로 만들 수 있다.

더 바람직하게 본 명세서의 약학적으로 허용되는 조성물은 경구 또는 주사 등의 비경구 투여를 위한 제형으로 만들 수 있다.

치료를 위해서는, 독성이 없고, 피해를 줄일 수 있는 유효량으로 본 발명의 융합 펩티드를 전술한 본 발명의 약학 조성물을 제조하는데 쓸 수 있다. 그러므로 소정량의 본 발명 융합 펩티드를 담체 재료와 혼합하여 전술한 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단일 (또는 복수) 투여 형태로 제조하는 것이 전형적이며인데, 이는 치료할 환자와 구체적인 투여 방법에 따라 달라진다. 보통 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 약학 조성물을 투여받는 환자가 하루에 체중 1 kg 당 상기 융합 펩티드를 0.001~100 m 범위의 용량으로 1회 투여하게끔 제조한다. 1회 투여량으로 바람직한 용량 범위는 하루에 체중 1 kg 당 0.01~50 mg으로, 더 바람직하게는 하루에 체중 1 kg 당 0.1~25 mg으로 달라질 수 있다. 그러나 치료에 사용된 본 발명에 따른 특정 융합 단백질의 활성, 나이, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식단, 투여 시간, 분비률, 약물 조합, 담당 의사의 판단과 치료할 특정 질병의 심각성을 비롯한 여러 가지 요소들을 고려하여 어느 환자에게라도 앞서 서술한 투여 용량 범위와 치료법을 적당하게 조절할 수 있다. 이러한 맥락에서, 초기 투여 용량으로 투여를 시작한 다음 치료 경과에 따라 바꿔줄 수 있는데, 예를 들어 초기 투여 용량을 앞서 서술한 용량 범위내에서 늘리거나 줄일 수 있다. 한편으로 특정 투여 용량으로 꾸준하게 투여를 지속하여 전체 치료 기간 동안 초기 용량을 고수할 수 있다. 나아가 이 두 가지 투여 방식을 겨합할 수도 있는데, 예를 들어 치료 도중 여러 분기별로 투여 용량을 조절(늘리거나 줄이거나)하되 매 분기 내에서는 투여 용량을 유지하여 서로 다른 분기끼리는 용량 범위가 다르도록 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 본 명세서에서 개시한 바와 같이 포유류 세포의 외상에 의한 피해와 관련된 질병의 치료, 완화 또는 예방에 쓰일 수 있는데, 특히 뇌중풍(cerebral stroke) 또는 척수 손상, 뇌 또는 척수에 대한 허혈성 또는 외상성 손상 그리고 급성 중추신경 손상, 허혈성 뇌중풍 또는 척수 손상 뿐 아니라 무산소증, 허혈, 기계적 손상, 신경병증의 통증, 특히 PSD-95 및/또는 NMDAR 상호작용과 관련된 신경병증 통증 등을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 중추신경 세포에 대한 피해에 관련된다. 나아가 본 발명의 약학 조성물은 흥분독성 손상, 허혈성 손상, 흥분독성, 신경영양성 지지의 소실(lack of neurotrophic support), 신경 분리(disconnection), 간질 등의 신경 세포 손상, 만성 신경 변성 질환 등에 대항하는데 혹은 이들을 치료하는데 쓰여 신경 보호 효과를 제공할 수 있다. 이러한 맥락에서 흥분독성은 특히 뇌졸중의 외상성 뇌 손상과 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭경화증(ALS), 섬유 근육통, 파킨슨병과 헌팅턴병 등의 중추신경계의 신경 변성 질환과 관련이 있는데, 본 발명으로 이들을 치료할 수 있다. 기타 신경 세포 주위에 글루탐산 농도 과다를 불러오는 증상 중 흔한 것으로서, 저혈당증, 간질 지속증, 녹내장/망막 신경절 세포의 악화 등이 있다.

전술한 포유류 세포의 외상에 의한 피해와 관련된 질병을 치료, 완화 또는 예방하고 본 명세서에서 언급한 질병 또는 장애 치료를 진전시키는 일은 상기 설명한 본 발명의 약학 조성물을 전술한 용량 범위에서 투여함으로써 이루어지는 것이 전형적인 경우이다. 본 발명의 약학 조성물 투여는 흥분독성 및/또는 (허혈성) 뇌 손상, 즉 포유류 세포에 손상 피해의 발현 전에 혹은 그와 동시에 혹은 그 이후에 이루어질 수 있는데, 예를 들어 본 발명 약학 조성물의 투여를 뇌중풍 또는 척수 손상, 뇌나 척수의 허혈성 또는 외상성 손상 및 일반적으로 중추신경계에 대한 손상이 일어난 후 1시간 이내(0~1 시간), 2시간 이내, 3~5시간 이내 또는 24시간 이내 혹은 그보다 더 오랜 시간 이내에 할 수 있다.

본 발명은 나아가 전술한 본 발명의 약학 조성물을 적어도 하나의 전술한 제형으로 (하나 또는 그 이상의 용기 속에) 함유하고 사용 설명서 또는 사용법 및/또는 본 발명 약학 조성물의 적용에 관한 정보 안내 책자를 포함하는 키트를 제공한다.

비록 본 명세서에서는 본 발명의 몇몇 바람직한 태양에 관하여 기술하고 예시하였으나, 본 발명은 이들 일부 태양에 한정되지 않는다는 것을 밝혀 둔다. 오히려 본 발명은 여기서 기술하고 예시한 구체적 태양과 기능적 또는 기계적으로 균등물인 모든 실시 태양들을 포함한다.

이하의 도면은 본 발명을 예시하여 더 상술하기 위함이지, 본 발명의 범위를 여기에 제한하려는 의도가 아니다.

도 1은 20 μM NMDA 존재하에서 서열번호 32와 33에 따른 융합 펩티드의 효능 지속 시간을 나타내는 그래프이다. 특히 TAT-NR2B9c 펩티드의 L-형태(L-TAT-L-NR2B9c, 서열은 YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV(서열번호 32)로 미국 공보 US 20030050243와 동일)와 그 D-형태(D-TAT-D-NR2B9c, 서열은 vdseisslk-rrrqrrkkrgy (서열번호 33))를 비교한다. 이 실험에서(그리고 이하의 실험에서도 마찬가지로), 세포사 비율은 NMDA 수용체와 상호작용하여 세포사를 억제할 수 있는 펩티드 첨가와 병행하여 측정하였다. 도 1에서 볼 수 있는 것처럼, 서열번호 33에 따른 D-TAT-D-NR2B9c는 모든 개별 실험에서 서열번호 32에 따른 비교 화합물 L-TAT-L-NR2B9c보다 적어도 같거나, 압도적인 유의한 효능 증가를 보였는데, 즉 신경 세포의 세포사 비율(%)을 현저하게 떨어뜨렸다; 도 1에서 * 표시는 P<0.05, @는 P<0.07인 것을 나타 낸다(짝지은 t-검정(Paired t-test)으로서 펩티드 처리한 신경 세포와 대조군 신경 세포를 비교한다). 특히 D-TAT-D-NR2B9c는 펩티드 배양과 NMDA 첨가 사이 시간 간격이 8 시간 이상일 때 긍정적인 효과를 나타낸다. 이는 D-형태의 장기적인 약리 효과를 드러낸다. 치료 기간으로서 가장 효과적인 구간은 4에서 48 시간 사이, 특히 8에서 24 시간 사이로 관측되었다.

도 2는 40 μM NMDA 존재하에서 서열번호 32와 33에 따른 융합 펩티드의 효능 지속 시간을 나타내는 그래프이다. 특히 TAT-NR2B9c 펩티드의 L-형태(L-TAT-L-NR2B9c, 서열은 YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV(서열번호 32)로 미국 공보 US 20030050243와 동일)와 그 D-형태(D-TAT-D-NR2B9c, 서열은 vdseisslk-rrrqrrkkrgy (서열번호 33))를 비교한다. 도 2에서 볼 수 있는 것처럼, 서열번호 33에 따른 D-TAT-D-NR2B9c는 모든 개별 실험에서 서열번호 32에 따른 비교 화합물 L-TAT-L-NR2B9c보다 적어도 같거나, 압도적인 유의한 효능 증가를 보였는데, 즉 신경 세포의 세포사 비율(%)을 현저하게 떨어뜨렸다. 도 2에서 * 표시는 P<0.05, @는 P<0.07인 것을 나타낸다(짝지은 t-검정(Paired t-test)으로서 펩티드 처리한 신경 세포와 대조군 신경 세포를 비교한다). 본 발명 융합 펩티드의 특기할만한 긍정적 효과는 시간 구간이 24시간에 못 미칠 때 명확해진다.

도 3은 20 μM NMDA 존재하에서 서열번호 34와 35에 따른 융합 펩티드의 효능 지속 시간을 나타내는 그래프이다. 특히 (Arg)₈-NR2B9c 펩티드의 L-형태(L-(Arg)₈-L-NR2B9c, 서열은 RRRRRRRR-KLSSIESDV(서열번호 34))와 그 D-형태(D-(Arg)₈- D-NR2B9c, 서열은 vdseisslk-rrrrrrrr(서열번호 35))를 비교한다. 도 3에서 볼 수 있는 것처럼, 서열번호 35에 따른 본 발명의 융합 펩티드 D-(Arg)₈-D-NR2B9c는 모든 개별 실험에서 서열번호 34에 따른 비교 화합물 L-(Arg)₈-L-NR2B9c보다 적어도 같거나, 압도적인 유의한 효능 증가를 보였는데, 즉 신경 세포의 세포사 비율(%)을 현저하게 떨어뜨렸다; 도 3에서 * 표시는 P<0.05, @는 P<0.07인 것을 나타낸다(짝지은 t-검정(Paired t-test)으로서 펩티드 처리한 신경 세포와 대조군 신경 세포를 비교한다).

도 4는 40 μM NMDA 존재하에서 서열번호 34와 35에 따른 융합 펩티드의 효능 지속 시간을 나타내는 그래프이다. 특히 (Arg)₈-NR2B9c 펩티드의 L-형태(L-(Arg)₈-L-NR2B9c, 서열은 RRRRRRRR-KLSSIESDV(서열번호 34))와 그 D-형태(D-(Arg)₈-D-NR2B9c, 서열은 vdseisslk-rrrrrrrr(서열번호 35))를 비교한다. 도 4에서 볼 수 있는 것처럼, 서열번호 35에 따른 본 발명의 융합 펩티드 D-(Arg)₈-D-NR2B9c는 모든 개별 실험에서 서열번호 34에 따른 비교 화합물 L-(Arg)₈-L-NR2B9c보다 적어도 같거나, 압도적인 유의한 효능 증가를 보였는데, 즉 신경 세포의 세포사 비율(%)을 현저하게 떨어뜨렸다; 도 4에서 * 표시는 P<0.05, @는 P<0.07인 것을 나타낸다(짝지은 t-검정(Paired t-test)으로서 펩티드 처리한 신경 세포와 대조군 신경 세포를 비교한다).

이하의 실시예는 본 발명을 예시하여 더 상술하기 위함이지, 본 발명의 범위를 여기에 제한하려는 의도가 아니다.

실시예 1 본 발명의 융합 펩티드 합성

TAT-NR2B9C 펩티드는 표준적인 방법에 따라 수동으로 MBHA 수지(Novabiochem, Merck) 위에 N^α-Boc 화학 방식의 고상 펩티드 합성법으로 합성하였다. 모든 커플링은 TNBSA 비색 시험(color test)으로 확인하였다. 펩티드를 0℃에서 1시간 동안 90% HF와 적절한 스캐빈져로 절단함과 동시에 수지에 대하여 탈보호기 처리를 하였다. 이 미정제 펩티드를 20% 아세트산 수용액에 담그고 이중 증류한 물을 가하여 5% 아세트산 용액으로 묽힌 다음, 남아 있는 스캐빈져를 디에틸에테르 세척으로 추출해 내었다. 이 펩티드를 함유하는 용액을 이어서 동결건조하여 아세트산을 제거하였다. L-NR2B9C와 D-NR2B9C 펩티드를 Atlantis (Waters) dC₁₈컬럼을 이용한 제조용 역상 HPLC(preparative RP-HPLC)로 정제(15~45% 완충액 B를 45분에 걸쳐 분당 15 mL씩)하고 ESI-MS로 분석하였다.

(Arg)₈-NR2B9C 펩티드는 수동으로 합성하였다. 합성은 고상 지지체에 Fmoc 합성법을 적용하였는데, Novabiochem사의 Fmoc-Val-NovaSyn TGA 수지에 탑재율을 0.22 mmol/g로 하여 수행하였다. 합성은 ACT 로봇을 이용하였는데, 145 μL에 해당하는 웰 속에서 4 당량의 아미노산, 4 당량의 커플링제 HOBt와 4 당량의 DIPCDI를 써서 이루어졌다. 합성상 필요성 때문에 매 세 개째 아미노산마다 2중 커플링(double coupling)을 하였다.

- 첫번째 커플링은 4 당량의 아미노산, 4 당량의 HOBt와 4 당량의 DIPCDI,

- 두번째 커플링은 4 당량의 아미노산, 4 당량의 HATU와 4 당량의 DIEA를 이용하였다.

각 커플링 후, DMF 속 10% 아세트산 무수물로 (15분 동안) 캡 부가(capping) 단계를 실행하였다. 탈보호기 처리는 DMF 속 20% 피페리딘(2×20 분)으로 수행하였다. "n" 자리의 Fmoc기는 합성 마지막까지 그대로 놓아두었다. 펩티드는 스캐빈져 존재하에 86% TFA로 절단하였다. 이 펩티드를 에테르 속에서 침전시켰다. 이어서 이 펩티드를 60분 동안 0에서 60%까지의 아세토니트릴 농도구배에서 C-18 역상 컬럼으로 정제하였고, 자외선으로 220 nm(펩티드 결합용)와 300 nm(Fmoc 보호기용)에서 검출하였다. 이어서 이 펩티드를 상기 Fmoc 보호기와 함께 동결건조한 다음, 20 당량의 DEA 용액으로 처리하여 보호기를 제거하였다. 이 펩티드를 다시 정제(전술한 것과 똑같은 조건으로)하고 이어서 동결건조하여 후속 실험에서 이용하고 분석하였다.

실시예 2 흥분독성 발작시 TAT-NR2B9c에 의한 신경 보호 지속 시험

실험 방법:

E21 래트에서 뽑아낸 래트 피질 신경 세포를 Neurobasal-A 배지 + B-27 보충액(모두 Invitrogen사제), 1 mM 글루타민, 50 단위/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신 속에서 7~9일 동안 시험관내 배양하였다.

1. 화합물에 노출하기 전에 신경 세포를 서로 다른 시간에 Neurobasal-A 기반 배양 배지에서 꺼내어 "형질전환 배지(transfection medium, TM)"(Bading 외(1993), Science 260, 181~186) 속에 넣었다. 배지 구성은 10% (최소 필수 배지, Invitrogen사(21090022), Earles 염을 함유하지만 L-글루타민은 없음), 90% 염-글루코스-글리신(SGG) medium SGG: 114 mM NaCl, 0.219 % NaHCO₃, 5.292 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 1 mM 글리신, 30 mM Glucose, 0.5 mM 피루브산나트륨, 0.1 % 페놀레드, 인슐린-트랜스퍼린-아(亞)셀렌산 보충액(Sigma사, 인슐린 7.5 ㎍/mL; 트랜스퍼린 7.5 ㎍/mL와 아셀렌산나트륨 7.5 ng/mL); 최종 삼투압 325 mosm/L). 모든 이후 단계는 TM 속에서 진행되었다.

2. 신경 세포를 본 발명의 융합 펩티드에 10 μM로 1시간 동안 노출하였다(특히 TAT-NR2B9c 펩티드의 L-형태(L-TAT-L-NR2B9c, 서열은 YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV(서열번호 32), 미국 공보 US 20030050243과 동일)과 그 D-형태(D-TAT-D-NR2B9c, 서열은 vdseisslk-rrrqrrkkrgyin(서열번호 33))).

3. 1시간 뒤 신경 세포를 TM으로 한 차례 세척하여 펩티드를 제거하였다.

4. 실험군별로 다른 시간이 지난 다음, 신경 세포를 1시간 동안 20 μM 또는 40 μM로 NMDA에 노출시켰고, 그 후에 신경 세포를 24시간 동안 TM 속에 놓아 두었다.

5. 신경 세포를 (3% 파라포름알데히드로) 고정하고 염색(DAPI, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌)하였다. 전체 중 농축된 핵 수를 % 비율로 세었다. 실험은 3 중 반복하였다.

결 과

TAT-NR2B9c의 L-형태(L-TAT-L-NR2B9c, 서열은 YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV(서열번호 32), 미국 공보 US 20030050243와 동일)와 D-형태(D-TAT-D-NR2B9c, 서열은 vdseisslk-rrrqrrkkrgyin(서열번호 33)) 양쪽 모두는 펩티드 세척 후 NMDA 존재 하(20 μM과 40 μM)에서 4시간까지 보호해 주었다. 그러나 D-형태에 의한 신경 보호는 NMDA 농도가 낮았을 때는 펩티드 세척 후 48시간까지 지속되었는데(도 1), 이는 D-형태가 치료 약물로서 더 가망 있는 후보라는 것을 가리킨다. D-형태는 또한 40 μM 농도의 NMDA 하에서도 24시간까지 유의미한 수준으로 신경 보호를 해 주었지만, L-형태에 의한 신경 보호는 단지 1시간까지 유의미한 수준이었다(도 2).

실시예 3 흥분독성 발작시 (Arg) ₈ -NR2B9c에 의한 신경 보호 지속 시험

실험 방법:

1. 화합물에 노출하기 전에 신경 세포를 서로 다른 시간에 Neurobasal-A 기반 배양 배지에서 꺼내어 인슐린-트랜스퍼린-아셀렌산 보충액(Sigma사)를 포함하는 형질전환 배지(TM) 속에 넣었다. 모든 이후 단계는 TM 속에서 진행되었다.

2. 신경 세포를 본 발명의 융합 펩티드에 10 μM로 1시간 동안 노출하였 다(특히 (Arg)₈-NR2B9c 펩티드의 L-형태(서열번호 34)와 그 D-형태(D-TAT-D-NR2B9c, 서열은 vdseisslk-rrrqrrkkrgyin(서열번호 35))).

4. 실험군별로 다른 시간이 지난 다음, 신경 세포를 1시간 동안 NMDA에 노출시켰고, 그 후에 신경 세포를 24시간 동안 TM 속에 놓아 두었다.

5. 신경 세포를 (3% 파라포름알데히드로) 고정하고 염색(DAPI, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌)하였다. 전체 중 농축된 핵 수를 % 비율로 세었다. 실험은 3중 반복하였다.

결 과

(Arg)₈-NR2B9c의 D-형태(D-(Arg)₈-D-NR2B9c(서열번호 35))는 펩티드 세척 후 NMDA 존재 하(20 μM)에서 8시간까지 L-형태보다 우수한 신경 보호를 제공해 주었다(도 3). 더 높은 NMDA 용량(40 μM)에서 D-형태는 같거나 더 뛰어난 보호 효과를 나타내었다(도 4). 이 결과는 D-형태가 치료 약물로서 더 가망 있는 후보라는 것을 가리킨다. 비록 신경 보호 활성이 더 짧게 지속되었지만, 전체적으로 D-(Arg)₈-D-NR2B9c(서열번호 35)는 D-TAT-D-NR2B9c(서열번호 33)과 유사한 효능을 보였는데, 이는 D-TAT의 세포 투과능이 D-(Arg)₈보다 더 두드러진다는 것을 뜻할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Xigen S.A. <120> Fusion peptide for inhibiting interaction of neuronal NMDA receptor (NMDAR) and NMDAR interacting proteins <130> AI02P003WO <160> 35 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: transporter peptide pAntp (43-58) from Antenna pedia <400> 1 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: transporter peptide pAntp from Antennapedia (43-58) <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> AMIDATION <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: transporter peptide derived from (HIV) TAT <400> 3 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: transporter peptide derived from (HIV) TAT <400> 4 Tyr 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Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: transporter peptide MPG <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> cysteamide modification <400> 23 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: transporter peptide MPG-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> AMIDATION <400> 24 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: transporter peptide Transportan 10 <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> AMIDATION <400> 25 Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ile Leu 20 <210> 26 <211> 21 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Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg

Claims

운반체 펩티드(transporter peptide)를 포함하는 성분 (I)과,

신경 세포 N-메틸-D-아스파르트산 수용체(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)와 NMDAR 상호작용성 단백질(NMDAR interacting protein) 사이의 상호작용을 억제하는 펩티드들로부터 선택하는 성분 (II)를 적어도 하나 포함하되,

상기 성분 (II)는 전체가 D-거울상이성질 아미노산으로 이루어진 융합 펩티드.
제1항에 있어서,

상기 성분 (I)은 아래 세포막 관통 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)들:

(a) RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 1) 또는 RQIKIWFQNRRMKWKK-아미드(서열번호 2) 서열을 함유하는 pAntp(43~58)를 비롯한 안테나페디아(Antennapedia) 유래 서열,

Tat, Tat의 37 내지 72 지역(region), 37 내지 60 지역, 48 내지 60 지역 또는 49 내지 57 지역, 서열 GRKKRRQRRR(서열번호 3), YGRKKRRQRRR(서열번호 4), CGRKKRRQRRRPPQC(서열번호 5) 또는 CGRKKRRQRRRPPQCC(서열번호 6)를 비롯한 사람 면역결핍바이러스 1(HIV-1) 유래의 서열,

LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH₂(서열번호 7) 서열을 함유하는 hCT(9~32), LLIILRRRIRKQAHAHSK-NH₂(서열번호 8) 서열을 함유하는 pVEC, RVIRVWFQNKRCKDKK-NH₂(서열번호 9) 서열을 함유하는 pISL, MANGLYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP-NH₂(서열번호 10) 서열을 함유하는 마우스 PRP(1~28) 및 그 사람 동족체(homolog)를 포함하는 동족체들, RQGAARVTSWLGLQLRIAGKRLEGRSK-NH₂(서열번호 11) 서열을 함유하는 E^ms(194~220), KLIKGRTPIKFGK-NH₂(서열번호 12) 서열을 함유하는 레스트리코신 L3(Restricocin L3, 60~73)

을 포함하는 단백질 도입 영역(protein transduction domain, PTD)과 단백질 유래 세포막 관통 펩티드(CPP) 또는

(b) DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD-NH₂(서열번호 13) 서열을 함유하는 VT5, KLALKLALKALKAALKLA-NH₂(서열번호 14) 서열을 함유하는 MAP, RRRRRRR, 즉 (Arg)₇ (서열번호 15), 또는 RRRRRRR-NH₂, 즉 (Arg)₇-NH₂ (서열번호 16), 또는 RRRRRRR-C, 즉 (Arg)₇-C (서열번호 17), 또는 RRRRRRRR, 즉 (Arg)₈ (서열번호 18), 또는 RRRRRRRR-NH₂, 즉 (Arg)₈-NH₂ (서열번호 19), 또는 RRRRRRRRR, 즉 (Arg)₉ (서열번호 20), 또는 RRRRRRRRR-NH₂, 즉 (Arg)₉-NH₂, (서열번호 21)를 비롯한 아르기닌 반복부를 포함하는 모형 펩티드(model peptide) 또는

(c) GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV(서열번호 22) 또는 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-시스테아미드(서열번호 23)를 함유하는 MPG를 비롯한 인위적으로 설계한 CPP,

GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH₂ (서열번호 24) 서열을 함유하는 트랜스포탄(Transportan),

AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH₂ (서열번호 25) 서열을 함유하는 트랜스포탄 10,

KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(서열번호 26) 서열 또는 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-시스테아미드(서열번호 27) 서열을 함유하는 펩-1(Pep-1)

을 포함하는 군에서 선택하는 펩티드이거나

서열 WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(서열번호 28)를 포함하는 KALA 펩티드 또는 서열 TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(서열번호 29)를 포함하는 불포린 2(Bulforin 2)에서 선택하는 펩티드이거나,

D-아미노산으로 이루어진, 서열번호 1 내지 29의 역순 거울상(retro-inverso) 이성질체인 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제2항에 있어서,

상기 성분 (I)이 생물학적 활성, 즉 상기 융합 펩티드의 세포막 투과를 인도하는 활성을 유지한다는 전제하에,

상기 성분 (I)을 제2항에서 정의한 서열번호 1 내지 29 중 어느 한 서열에 대해서 대략 60, 70, 80, 90, 95 또는 심지어 99%의 서열 일치도를 가지는 세포막 관통 펩티드들로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제3항에 있어서,

상기 성분 (II)를 N-메틸-D-아스파르트산 수용체 소단위체(subunit)인 NR1과 NR2, PDZ-결합 영역(PDZ-binding domain)을 포함하는 펩티드, tSX_nV 모티프 함유 펩티드, 연접후 치밀질-95 단백질들, PSD-95, PSD-93 및 SAP102로 이루어진 군에서 선택하는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제4항에 있어서,

상기 성분 (II)는 5 내지 40개 길이의 아미노산, 더 바람직하게는 5 내지 30 또는 5 내지 20개 길이의 아미노산, 더더욱 바람직하게는 5 내지 15 또는 심지어 5 내지 10개 길이의 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제4항 또는 제5항에 있어서,

상기 성분 (II)를 vdseisslk(서열번호 31) 서열을 함유하는 서열들 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 성분 (II)를 상기 서열번호 31에 따른 서열에 대하여 대략 60, 70, 80, 90, 95 또는 심지어 99%의 서열 일치도를 지니는 서열을 함유하는 서열들 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 성분 (I)이 전부 L-아미노산만으로 또는 D-아미노산만으로, 혹은 양쪽 모두로 이루어지는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 성분 (I)과 (II)는 연결부(linker)로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 융합 펩티드는 정제용 표지(purification tag)인 성분 (III)을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 펩티드와

선택적으로 약학적 담체를 함유하는 약학 조성물.
뇌중풍, 척수 손상, 허혈성 또는 외상성 뇌 또는 척수 손상 그리고 급성 중 추신경계 손상, 허혈성 뇌중풍 또는 척수 손상, 무산소증, 허혈, 기계적 손상을 포함하는 중추신경계 신경 세포 손상으로 이루어지는 군에서 선택하는, 포유류 세포에 대한 손상 피해에 관련된 질병을 치료,개선 또는 예방하거나

흥분독성(excitotoxic) 또는 허혈성 손상, 흥분독성, 신경영양성 지지의 소실(lack of neurotrophic support), 신경 분리(disconnection), 간질을 비롯한 신경 세포 손상, 만성 신경 변성 질환 및 PSD-95 및/또는 NMDAR 상호작용에 관련된 신경병증의 통증을 비롯한 신경병증의 통증에 대항하는 혹은 이들을 치료하는 신경 보호 효과를 제공하는

약학 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 펩티드의 용도.
제11항에 따른 약학 조성물과

상기 약학 조성물의 사용에 관한 설명 및/또는 정보를 적은 설명서 또는 안내 책자를 포함하는 키트.