MX2009001095A

MX2009001095A - Peptido de fusion para inhibir la interaccion del receptor de nmda (nmdar)/ neuronal y proteinas que interactuan con nmdar.

Info

Publication number: MX2009001095A
Application number: MX2009001095A
Authority: MX
Inventors: Thomas Meyer
Original assignee: Xigen Sa
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2009-02-10
Also published as: EP2046821A1; KR20090033868A; HRP20080648A2; US20090281036A1; ATE509948T1; EP2046821B1; AU2007280717A1; JP2009545543A; CN101490081A; IL195536A0; RU2009106710A; NO20090875L; EP1884521A1; BRPI0714783A2; WO2008014917A1; CA2653438A1

Abstract

La presente invención proporciona un péptido de fusión que comprende por lo menos un componente (I), en donde el componente (I) comprende un péptido transportador, y un componente (II) que se selecciona de un péptido que inhibe la interacción del receptor N-metil-D-aspartato neuronal (NMDAR) con proteínas que interactúan con NMDAR, en donde el componente (II) consiste por completo de aminoácidos D-enantioméricos. La presente invención además proporciona una composición farmacéutica de la invención que comprende péptido de fusión de la invención y métodos para administrar al mismo así como equipos y usos que utilizan el péptido de fusión de la invención.

Description

PEPTIDO DE FUSION PARA INHIBIR LA INTERACCION DEL RECEPTOR DE NMDA ÍNMDAR)/ NEURONAL Y PROTEINAS QUE INTERACTUAN CON NMDAR DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona un péptido de fusión que comprende por lo menos un componente (I), en donde el componente (I) comprende un péptido transportador y un componente (II) que se selecciona de un péptido que inhibe la interacción del receptor neuronal de N-metil-D-aspartato (NMDAR) con proteínas que interactúan con NMDAR, en donde el componente (II) consiste completamente de aminoácidos D-enantioméricos. La presente invención, además proporciona una composición farmacéutica de invención que comprende un péptido de fusión de invención y métodos para administrar el mismo así como equipos y usos que utilizan el péptido de fusión de la invención. Los daños isquémicos o traumáticos al cerebro o médula espinal tal como apoplejía cerebral isquémica son problemas de salud mayores dado que se presenta con frecuencia y de manera continua producen daño reversible a las neuronas del sistema nervioso central (SNC) y a sus procesos. Dado que el daño con frecuencia es grave, actualmente se realizan gastos mayores por autoridades de salud cada año para el tratamiento de pacientes quienes padecen de las consecuencias de dichos daños. No obstante, actualmente no existen tratamientos farmacológicos eficaces para aquellos casos de daños agudos al SNC. Clínicamente, los daños isquémicos o traumáticos al cerebro o la médula espinal tales como apoplejía cerebral isquémica se manifiestan así mismo como deterioro agudo en la capacidad neurológica que varía desde defectos focales pequeños hasta disfunción global catastrófica o incluso puede generar la muerte del paciente que es tratado. Si actualmente se considera que la magnitud final de la deficiencia está determinada por la naturaleza y grado del ataque físico primario y por una secuencia de procesos de evolución de fenómenos secundarios los cuales provocan muerte adicional de las células neuronales involucradas. Dado que la relación de estos procesos no es instantánea, existe un intervalo de tiempo teórico de una duración aún no determinada en el cual una intervención oportuna puede interrumpir los eventos que provocan neurotoxicicad retrasada. Aunque se sabe mucho acerca de los mecanismos celulares que activan y mantienen los procesos de muerte neuronal isquémica o traumática, por ej emplo inversión del transportador glutamato, actualmente no hay estrategias de prevención prácticas o protocolos de tratamiento eficaces. En consecuencia, actualmente no hay tratamientos farmacológicos clínicamente útiles y eficaces disponibles para las enfermedades anteriores que incluyan apoplejía cerebral o daño a la médula espinal . Desde un punto de vista científico, la reducción local en la irrigación del tejido del SNC media la muerte neuronal en daños al SNC tanto epóxicos como traumáticos in vivo . Dicha hipoirrigación local habitualmente es causada por una disrupción física de la vasculatura local, trombosis de los vasos, vasoespasmos y oclusión de la luz por una masa embólica. Sin importar su etiología, se considera que la isquemia resultante daña neuronas susceptibles al perjudicar una diversidad de mecanismos homeostáticos celulares. Aunque se entiende poco acerca de la naturaleza de las alteraciones exactas, una característica común de muchos modelos experimentales de daño neuronal es un incremento en la concentración de calcio intracelular libre ([Ca2+]¡). Las neuronas poseen mecanismos múltiples para confinar [Ca2+] ¡ a concentraciones baj as, de aproximadamente 1 00 mM, necesarias para la función fisiológica. Se considera de manera amplia que un incremento prolongado en [Ca 2 -t- ] ¡ ya no 2 + regula los procesos que dependen de Ca , controlados estrechamente lo que provoca la generación de productos de reacción excesivos, para activar vías enzimáticas normalmente en reposo o para inactivar mecanismos citoprotectores reguladores. A su vez, esto resulta en la creación de destrucción de células observable experimentalmente tal como lipólisis, proteólisis, descomposición citoesquelética, alteraciones de pH, formación de radicales libres, disfunción mitocondrial, expansión de las células, pérdida de la integridad del plasma y picnosis nuclear. Una causa fundamental de las concentraciones dañinas de entrada de Ca2+ durante un episodio isquémico es mediante la liberación excesiva de las EAA. Así, la solución clásica para evitar la neurotoxicidad por Ca2+ ha sido mediante el bloque farmacológico de la entrada de Ca2+ a través de canales de Ca2+ que se abren por voltaj e y/o de canales que se abre por EAA de aminoácidos excitadores. Las variaciones en esta estrategia con frecuencia disminuyen la muerte celular inducida por EAA o anóxica in vitro, lo que ha establecido la creencia de la hipótesis de neurotoxicidad de Ca2+. No obstante, una diversidad de antagonistas tanto del canal de Ca2+ como de EAA no protegen contra el daño neuronal in vivo, particularmente en daño a la médula espinal (SCI), daño a la cabeza o isquemia cerebral global. Se desconoce si esto se debe a concentraciones 2 + insuficientes de medicamento, bloqueo inapropiado de la entrada de Ca o 2 + a una contribución de procesos neurotóxicos que no dependen de Ca . No 2 + obstante, es probable que la neurotoxicidad por Ca se active mediante vías diferentes en diferentes tipos de neuronas del SNC. Por lo tanto, un bloque 2 _|_ exitoso de Ca típicamente requiere un enfoque polifarmacéutico. Se debe hacer notar que se han desarrollado muchos antagonistas de NMDAR. No obstante, estos antagonistas han tenido éxito en modelos animales in vivo solo cuando se administra el medicamento antes de traumatismo y por lo tanto no se puede extrapolar a un escenario clínico típico, en donde el tratamiento típicamente se lleva a cabo después de, por ejemplo, una apoplejía. Además, los antagonistas de NMDAR típicamente sin poco tolerados in vivo en humanos, lo que demuestra un intervalo de concentración terapéutica pequeño o algunas veces inexistente, lo que reflej a el papel importante de NMDAR en fisiología normal así como en fisiología patológica. 2 + Respecto a los procesos neurotóxicos que dependen de Ca se ha observado en el sistema nervioso de mamíferos que la eficiencia mediante la cual la actividad del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) activa las vías de señalización intracelulares determina la plasticidad neuronal, el desarrollo, la senescencia y la enfermedad. Al estudiar la señalización NMDAR excitotóxica al suprimir la expresión de la proteína de peldaños de NMDAR, PSD-95 , muestra una excitotoxicidad de NMDAR atenuada de manera selectiva, no obstante, pero sin excitotoxicidad por 2 + otros canales de glutamato o de Ca (véase, por ej emplo el documento US 20030050243 ) . De esta manera, la función de NMDAR no es afectada, como expresión de receptor, mientras que las corrientes de NMDA y la carga de 45Ca por medio de los NMDAR permanece sin cambio. Además, suprimir PSD-95 bloquea de manera selectiva la producción de óxido nítrico activada por Ca2+ por el NMDAR, pero no por otras vías, sin que afecte la expresión o la función de la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS). De esta manera, se considera a PSD-95 como necesario para un acoplamiento eficiente de la actividad de NMDAR a la toxicidad de óxido nítrico e imparte especificidad 2 + a la señalización de Ca excitotóxica. De manera adicional, se sabe que la entrada calcio a través de NMDAR juega un papel clave en la mediación de la transcripción sináptica, en desarrollo neuronal y la plasticidad (véase, por ej emplo, Ghosh and Greenberg, Science 268. 239 ( 1 995); Bliss and Collingridge, Nature 361 , 3 1 24* ( 1993 )) . En exceso, la entrada de Ca activa la excitotoxicidad (véase, por ejemplo, Olney, Kainic acid as a tool in neurobiology., McGeer, Olney and McGeer, Eds. (Raven Press, New York. 1978). p. 95.; Rothman and Olney, TINS 10.299 (1987); Choi, Ann NY Acad Sci 747. 162 (1994)), un proceso que daña neuronas en trastornos neurológicos que incluyen apoplejía, epilepsia en condiciones neurodegenerativas crónicas (véase, por ejemplo, Lipton and Rosenberg, New Eng J med 330, 613 (1994)). Debe hacerse notar que una neurotoxicidad rápida dependiente de Ca2+ se activa de manera más eficaz cuando la entrada de Ca2+ se produce a través de los NMDAR y no se puede reproducir al cargar neuronas con cantidades equivalentes de Ca a través de canales diferentes de NMDAR o canales de Ca2+ sensibles a voltaje (VSCC) (véase, por ejemplo, Sattler et al., J. Neurochem 71.2349 (1998).; Tymianski et al, J Neurosci 13, 2085 (1993)). La observación indica que la entrada de Ca2+ a través de los canales NMDAR se puede acoplar funcionalmente a vías de señalización neurotóxica. Así, sin que se una a teoría alguna, se sugiere que una señalización de Ca mortal por los NMDAR se puede determinar por las moléculas con las cuales interactúa físicamente. Por ejemplo, las subunidades NR2 de NMDAR, a través de sus dominios de C terminal intracelulares, que se unen a PSD-95/SAP90 (véase Cho et al., Neuron 9, 929 (1992)), capsina-110/PSD-93 y otros miembros de la familia guanilato cinasa asociados a membrana (MAGUK) (véase, por ejemplo, Kornau et al., Science 269, 1737 (1995).; Bremman et al., J neurosci 16, 7407 (1996); Muller et al., Neuron 17, 255 (1996). Las MAGUK unidas a NMDAR generalmente son distintas de aquellas asociadas a moléculas diferentes de NMDAR (véase Dong et al . , Nature 386, 279 ( 1997); Brakeman et al. , Nature 386. 284 ( 1997)). Se ha encontrado que la activación preferencial de señales de Ca neurotóxicas por NMDAR se determina por lo distintivo de las MAGU unidas a NMDAR o de las proteínas intracelulares que unen. PSD-95 es una molécula de peldaño de submembrana que se une y agrupa los NMDAR de manera preferencia y, a través de interacciones de proteína-proteína adicionales, se puede unir a moléculas de señalización intracelular (véase, por ej emplo Craven and Bredt. Cell 93 , 495 ( 1 998); Niethammer et al. , Neuron 20. 693 ( 1 998); Kim et al . , Neuron 20, 683 ( 1 998); Tezuka et al. , Proc Nati Acad Sci USA 96. 435( 1999).). La alteración de PSD-95 por lo tanto se sugiere que tiene un tacto sobre la señalización neurotóxica de Ca2+ a través de NMDAR. En general, las interacciones proteína-proteína controlan las señales involucradas en el crecimiento y diferenciación celulares y las comunicaciones intercelulares a través de asociaciones dinámicas entre dominios de proteína modular y sus asociados de unión afines (véase Pawson and J. D. Scott, Science 278 , 2075-2080 ( 1997)). De manera más particular, los receptores glutamato ionotrópicos se organizan en sinapsis excitadoras de neuronas centrales en complej os de señalización de proteínas múltiples dentro de la densidad post-sinática (PSD) (véase Sheng, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S . A. 98 , 7058-7061 (2001 )). Una proteína organizadora prominente dentro de PSD es PSD-95 , un miembro de la familia de guanilato cinasa asociada a membrana (MAGUK). PSD-95 contiene dominios múltiples que acoplan proteínas transmembranales tales como el subtipo de N-metil-D-aspartato de receptores de glutamato (NMDAR) a una variedad de enzimas de señalización intracelulares. A través de su segundo dominio PDZ (PDZ2), PSD-95 une tanto la subunidad 2B de NMDAR (NR2B) como la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) (véase Brenman et al. , Cell 84, 757-767 ( 1996)). Esta interacción acopla la actividad de NMDAR a la producción de óxido nítrico (NO), una molécula de señalización que media la excitotoxicidad dependiente de NMDAR (véase Dawson et al. , Proc. Nati. Acad Sci USA 88, 6368-6371 ( 1991 ). NR2 puede interactua ya sea con PDZ 1 o PDZ2 de PSD-95. No obstante, si el dominio PDZ 1 de PSD-95 interactúa con la parte COOH terminal del receptor NMDA, PDZ2 es libre de unirse a la región NH2-terminal de nNOS (Cao et al. , 2005 , J. Cell Biol 168 , 1 17- 126; y Christopherson et al. , 2005 J. Biol. Chem. 274 : 27467-27473 ). Aunque los NMDAR juega un papel neurotóxico importante en el daño hipóxico/isquémico del cerebro (véase Simón et al. , Science 226, 850-852 ( 1984)), el bloqueo de la función de NMDAR puede ser perjudicial en animales y humanos (véase Fix et al. , Exp Neurol 123 , 204-21 5 ( 1993); Davis et al. , Stroke 3 1 , 347-354 (2000); Morris et al ., J . Neurosurg. 91 , 737-743 ( 1 999)). Los antagonistas de NMDAR activan la apoptosis en el cerebro en desarrollo. Además, los antagonistas de NMDAR, cuando se administran durante un período crítico después de daño cerebral traumático durante neurodegeneración que progresa lentamente exacerba la pérdida neuronal en el cerebro adulto (Ikonomidou et al. , 2000, Proc Nati Acad Sci U S A 97, 12885- 12890; Olney et al. , 2002, Brain Pathology 12, 488-498). Además, el bloqueo de la función de NMDAR mediante la utilización de antagonistas de NMDAR puede generar otros efectos secundarios indeseables tales como daño cognitivo y psicosis. El dirigirse a la proteína PSD-95 por lo tanto representa un enfoque terapéutico alternativo para enfermedades que involucran excitotoxicidad y que pueden evitar las consecuencias negativas de bloqueo de la función de NMDAR. No obstante, la mutación o supresión de PSD-95 ha demostrado ser poco práctico como tratamiento para daño cerebral y no se puede aplicar después de que se ha producido un daño. Por lo tanto, en vez de alterar la expresión de PSD-95, se cuestiona si una interferencia con la interacción entre NMDAR/PDS-95 puede suprimir la excitotoxicidad in vitro y el daño a cerebro isquémico in vivo. En vista de lo anterior, se ha desarrollado una solución en la técnica (documento de E.U.A. 20030050243) para reducir el efecto dañino por tratamiento de células de mamífero con compuestos que reducen o inhiben la interacción de los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) y proteínas que interactúan con NMDAR. El método de acuerdo con el documento de E.U.A. 20030050243 utiliza compuestos peptídicos capaces de interrumpir la interacción de los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDAR) neuronales y las proteínas de interacción de NMDAR, por ej emplo proteínas neuronales. Este enfoque elimina las desventaj as que resultan del bloqueo de la función de NMDAR. El método de acuerdo con el documento de E.U.A. 20030050243 se basa principalmente en el hallazgo de que la interacción de la proteína de densidad post-sináptica-95 (PSD-95) a los receptores neuronales de N-metil-D-aspartato (NMDAR) genera vías que median la excitotoxicidad y por lo tanto el daño cerebroisquémico se puede curar utilizando péptidos selectivos que interrumpan esta interacción particular. De manera más particular, la ruptura de la interacción se lleva a cabo de acuerdo con lo descrito en el documento de E.U.A. 20030050243 al introducir péptidos en las neuronas que se unen a los dominios modulares de ambos lados del complej o de interacción PSD-95/NMDAR. Este tratamiento atenúa la señalización NMDAR posterior sin bloquear la actividad de NMDAR, protege a las neuronas corticales cultivas de ataques excitotóxicos y reducen el volumen de infarto cerebral en ratas sometidas a isquemia cerebral focal transitoria. El método de tratamiento de acuerdo con el documento de E.U.A. 20030050243 es eficaz cuando se aplica antes o una hora posterior al inicio de excitotoxicidad in vitro y de la isquemia cerebral in vivo. Este enfoque por lo tanto ha demostrado proporcionar una buena base para evitar complicaciones negativas relacionadas con el bloqueo de la actividad de NMDAR. No obstante, es bien sabido que los compuestos peptídicos administrados in vivo dirigidos a sitios intracelulares, por ej emplo para el tratamiento de una enfermedad específica así como para el tratamiento de células in vitro, típicamente comprende poca biodisponibilidad en las células que van a ser tratadas. Esta biodisponibilidad pobre se debe principalmente a una dirección subóptima de estos compuestos peptídicos a sus células obj etivo. Esto puede ser provocado, por ej emplo, por una carencia de sistemas transportadores adecuados o para el uso de sistemas transportadores no adecuados, los cuales no funcionan eficazmente in vivo en la ubicación de una o varias de las células obj etivos deseadas, por ej emplo las cuales no se dirigen eficazmente al citoplasma celular o a un destino celular específico. Aunque este efecto puede superarse al administrar una cantidad aumentada de los compuestos peptídicos o por administración repetida de los mismos, las concentraciones aumentadas de compuestos peptídicos in vivo puede generar efectos secundarios no deseados cuando se administren. Además, la administración repetida de compuestos peptídicos típicamente requiere la presencia continua de un doctor en medicina y, como consecuencia, en la mayor parte de los casos hospitalización continua. Incluso si dichos efectos pierden su potencia por administración aumentada o repetida de los compuestos peptídicos o mediante el uso de sistemas transportadores más adecuados (véase, por ej emplo el documento de E.U.A. 20030050243 utilizando TAT como un péptido transportador), de manera adicional pueden experimentar una degradación predeterminada y como consecuencia mostrar, de nuevo, biodisponibilidad pobre in vivo . En parte, este efecto se debe a procesos intracelulares, por ej emplo procesos de degradación por descomposición de enzimas como proteasas o peptidasas o se puede deber a la inestabilidad in vivo de estos péptidos o degradación proteolítica en suero, líquido cefalorraquídeo (lcr), etc. No obstante, las inestabilidades peptídicas no se suprimen por administración ni aumentada ni repetida de los compuestos peptídicos. En base en lo anterior, un obj etivo de la presente invención es proporcionar una alternativa para reducir el efecto dañino de un ataque a células de mamífero, de manera más particular proporcionar compuestos que inhiban interacción del receptor neuronal de N-metil-D-aspartato (NMDA) y proteínas que interactúan con NMDAR, por lo que se resuelve por lo menos parte de las limitaciones de la técnica anterior, por ej emplo como se ejemplifica por compuestos de acuerdo con el documento de E.U.A. 20030050243. Este objetivo se resuelve de acuerdo con la presente invención por un péptido de fusión que comprende por lo menos un componente (I), en donde el componente (I) comprende un péptido transportador, y un componente (II), que se selecciona de un péptido que inhibe la interacción del receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) neuronal con proteínas que interactúan con NMDAR, en donde el componente (II) consiste por completo de aminoácidos D-enantioméricos. Para el propósito de la presente invención, los aminoácidos D-enantioméricos están indicados por minúsculas en una secuencia, como se indica en la presente, mientras que los aminoácidos L-enantioméricos se indican por mayúsculas.

El péptido de fusión de la invención, como se define en lo anterior comprende, como componente (I) un péptido transportador. Dicho péptido transportador se puede seleccionar de cualquier péptido transportador que dirij a el péptido de fusión de la invención al interior del citoplasma celular o, además, a un destino intracelular específico . El péptido transportador utilizado como componente (I) puede, por ej emplo, dirigir el péptido de fusión de la invención a un lugar deseado dentro de la célula, por ejemplo el núcleo, el ribosoma, el retículo endoplásmico, los lisosomas o los peroxisomas. En consecuencia, en una modalidad preferida, el péptido transportador del péptido de fusión de la invención dirige la molécula conjugada a una ubicación celular definida. En cualquier caso, el péptido transportador utilizado como componente (I) del péptido de fusión de la invención preferiblemente dirige al péptido de fusión de la invención a través de la membrana plasmática, por ej emplo desde el ambiente de la célula extracelular a través de la membrana plasmática dentro del citoplasma, por lo que se incrementa la captación celular del péptido de fusión de la invención, en particular, al incrementar su permeabilidad celular o al aumentar su tiempo de retención intracelular. De manera más preferible, el componente (I) del péptido de fusión como se define en lo anterior se puede seleccionar de péptidos que penetran en la membrana celular que comprenden, sin que se limiten a estos, (a) dominios de transducción de proteína (PTD) y los CPP derivados de proteína tales como las secuencias derivadas de Antennapedia, por ej emplo pAntp (43 -58) que comprende las secuencias RQIKIWFQNRRM WKK (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 ) o RQIKIWFQNRRMKWKK-amida (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 2); o secuencias derivadas del virus de inmunodeficiencia humana 1 (HIV- 1 ), por ej emplo TAT, de manera más preferible la región 37 a 72, la región 37 a 60, la región 48 a 60 o la región 49 a 57 de TAT, por ej emplo que comprende las secuencias GRKKRRQRRR (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 3 ), YGRKKRRQRRR (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 4), CGRKKRRQRRRPPQC (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 5) o CGRKKRRQRRRPPQCC (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 6); hCT(9-32), que comprende la secuencia LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 7); pVEC, que comprende la secuencia LLIILRRRIRKQAHAHSK-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 8); pISL, que comprende la secuencia RVIRVWFQNKRCKDKK-NH2, (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 9); PRP de ratón ( 1 -28), que comprende la secuencia MANGLYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 0) o sus homólogos humanos, Ems ( 1 94-220) que comprende la secuencia RQGAARVTSWLGLQLRIAGKRLEGRSK-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 1 ); Restricocin 13 (60-73), que comprende la secuencia KLI GRTPIKFGK-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 12); etcétera, (b) péptido modelo tal como VT5 que comprende la secuencia DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD-NH2, (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 13 ), MAP que comprende la secuencia KLALKLALKALKAALKLA-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 14), tramos de arginina que incluyen RRRRRRR-C, es decir (Arg)7 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 5) o RRRRRRR-NH2, es decir (Arg)7-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 6) o RRRRRRR-C, es decir (Arg)7-C (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 7) o RRRRRRRR, es decir (Arg)8 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 8), o RRRRRRRR-NH2 es decir (Arg)8-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 19), RRRRRRRRR, es decir (Arg)9 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 20) o RRRRRRRRR-NH2, es decir (Arg)9-NH2, (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 21 ), etcétera o (c) CPP designadas tales como MPG que comprende la secuencia GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 22) o GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cisteamida (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 23), Transportano, que tiene la secuencia GWTLNSAGYLLG INLKALAALAKKIL-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 24), Transportano 1 0 que comprende la secuencia AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 25), Pep- 1 , que comprende la secuencia KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 26) o KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cisteamida (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 27), etcétera o se puede seleccionar del péptido KALA que comprende la secuencia WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 28), a partir de Bulforina 2 que comprende la secuencia TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 29), etcétera. Los péptidos utilizados como el componente (I) del péptido de fusión de la invención además se pueden seleccionar de una secuencia peptídica que tenga una densidad de secuencia de aproximadamente 60, 70, 80, 90, 95 o incluso 99% con una secuencia peptídica de acuerdo con las SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMEROS : 1 a 29, como se define en lo anterior, con la condición de que el componente (I) aún retenga su actividad biológica, es decir, que dirij a al péptido de fusión de la invención a través de la membrana plasmática. La selección de un péptido de penetración como se define en lo anterior como componente (I) del péptido de fusión de la invención típicamente se llevará a cabo en base en los requerimientos específicos del sistema celular al cual se va a administrar el péptido de fusión de la invención, por ej emplo la eficacia de transporte en el sistema celular específico, membranas, etcétera. La actividad biológica de un péptido transportador, como se muestra en lo anterior o como se conoce en la técnica, se puede determinar fácilmente por una persona experta mediante el uso de análisis convencionales o estándar.

Por ej emplo, se puede fusionar un péptido transportador a una proteína tal como GFP o se puede marcar con una marca radioactiva, enzima o fluoróforo, etcétera, el cual se puede detectar fácilmente en una célula. Después, el péptido transportador fusionado se transfecta en una célula o se agrega a un sobrenadante de cultivo y la permeación de las membranas celulares se puede monitorear mediante el uso de métodos convencionales biofísicos. El componente (I) del péptido de fusión, como se define en lo anterior, puede estar constituido de aminoácidos como se encuentra de manera natural, es decir, L-aminoácidos o de D-aminoácidos, es decir, de una secuencia de aminoácidos que comprenda D-aminácidos en orden retro-inverso, en comparación con la secuencia nativa. El término "retro-inverso" se refiere a un isómero de un péptido lineal en el cual la dirección de la secuencia se invierte y se invierte también la quiralidad de cada residuo aminoácido. Así, cualquier secuencia en la presente, que se encuentre en la forma L, también se describe de manera inherente como una secuencia peptídica D-enantiomérica (retro-inverso). Las secuencias peptídicas D-enantiomérica (retro-inverso) de acuerdo con la invención se pueden construir, por ej emplo, al sintetizar el inverso de una secuencia de aminoácidos por la secuencia de L-aminácidos nativos correspondientes. En los péptidos enantioméricos D-retro-inverso, por ej emplo, un componente del péptido de fusión de la invención, las posiciones de los grupos carbonilo y amino en cada enlace amida único se cambian mientras que la posición de los grupos de cadena lateral en cada carbono se conserva. Los péptidos retro-inversos, si se utilizan como un componente del péptido de fusión de la invención, poseen una diversidad de propiedades útiles. Por ej emplo, entran a las células más eficazmente, son más estables (especialmente in vivo) y muestran menor inmunogenicidad que los L-péptidos correspondientes. En contraste, las proteínas como se encuentran de manera natural típicamente contienen L-aminoácidos. Por lo tanto, casi la totalidad de las enzimas de descomposición, como proteasas o peptidasas, rompen enlaces peptídicos entre L-aminoácidos adyacentes. En consecuencia, los péptidos de fusión de la invención constituidos de aminoácidos D-enantioméricos en orden retro-inverso, particularmente para el componente (II) y, opcionalmente, para el componente (I), son principalmente resistentes a la descomposición proteolítica. La preparación de un componente del péptido de fusión de la invención como se define en lo anterior que tiene aminoácidos D-enantioméricos se puede obtener al sintetizar químicamente una secuencia de aminoácidos inversa de la secuencia de aminoácidos de la forma L que se encuentran de manera natural, correspondientes o por cualquier otro método adecuado conocido por las personas expertas en la técnica. Esta síntesis preferiblemente se lleva a cabo por enlace de síntesis en fase sólida de D-aminoácidos a la secuencia retro-inverso deseada. Además de los D aminoácidos utilizados y la síntesis de aminoácidos en el orden retro-inverso, la síntesis en fase sólida de las secuencias de D aminoácidos de la invención es químicamente idéntica a la síntesis de péptidos en base en los L aminoácidos. Un método general para la construcción de cualquier secuencia de ADN deseada se proporciona, por ej emplo en Brown J. et al. ( 1979), Methods in Enzymology, 68 : 1 09; Sambrook J. Maniatis T ( 1 989), supra. De manera alternativa, la forma D-retro-inverso-enantiomérica de un péptido de fusión de la invención o un componente del mismo se puede preparar utilizando síntesis química como se describe en lo anterior utilizando una forma L de un péptido de fusión de la invención o un componente del mismo como una matriz para la síntesis química de la forma D-retro-inverso-enantiomérica. El componente (II) del péptido de fusión de la invención, como se define en lo anterior, se selecciona de cualquier péptido capaz de inhibir la reacción del receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) neuronal con proteínas que interactúan con NMDAR (tal como una proteína asociada, por ej emplo las proteínas neuronales P SD-95, etcétera). Dichos péptidos típicamente atrapan a una o varias de las proteínas que interactúan con NMDAR y por lo tanto inhibe la interacción del receptor de NMDA con estas proteínas o viceversa. Además, estos péptidos no bloquean al receptor de NMDA y por lo tanto evitan los inconvenientes relacionados con el bloqueo del receptor de NMDA. De manera más particular, el componente (II) del péptido de fusión de la invención, como se define en lo anterior, se puede seleccionar de cualquier péptido diseñado para interrumpir las interacciones entre NMDAR y su proteína asociada (por ej emplo las interacciones PSD-95-NR2) ya sea al imitar el dominio de interacción de NMDAR (por ejemplo el dominio de interacción PDZ C-terminal de NR2) o al imitar el dominio de interacción de la proteína asociada (por ej emplo el dominio PDZ 1 de PSD-95). Los péptidos adecuados como componentes (II) del péptido de fusión de la invención se pueden seleccionar (sin que se limiten a estos) de subunidades receptoras de NMDA NR 1 y NR2. Las subunidades NR 1 y NR2 del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) son codificadas por genes distintos. En el cerebro de rata, cuatro variantes de la parte C terminal de la subunidad NR 1 (NR 1 - 1 - a NR 1 -4) son codificadas por un solo gen y son generadas por empalme alternativo de los casetes de exones C l y C2, mientras que cuatro genes diferentes codifican para las subunidades NR2 (NR2 A-D). Los receptores NMDA funcionales que resultan del ensamblado heteromultimérico de las variantes de RN 1 con distintas subunidades NR2. Las subunidad NR2B interactúa con proteína de densidad post-sináptica 95 (PSD-95), SAP97, etcétera y los miembros de la familia de proteínas de guanilato-similar a cinasa asociadas a membrana (MAGUK). Estas interacciones se producen a través de la unión de la parte C terminal del motivo intracelular tSXnV de la subunidad NR2B a PDZ N-terminal (PSD-95 , disco-grande, ZO- 1 ) y los dominios de PSD 95 y las proteínas SAP97. Tanto NR 1 -3 como NR 1 -4 también muestran un motivo tSXnV de la parte C terminal de consenso. Por lo tanto, los péptidos utilizados como componente (II) del péptido de fusión de la invención se pueden seleccionar de péptidos que contienen un motivo tSXnV en donde S es serina, Xn es cualquier aminoácido (en donde n es por lo menos 1 , 2, 3 , 4, 5 , etcétera) y V es valina. Los péptidos particularmente preferidos utilizados como componente (II) del péptido de fusión de la invención se pueden seleccionar de péptidos derivados de NMDAR, capaces de unirse a proteínas de densidad postsináptica-95 , a PSD-95 , P SD-93 o a SAP 1 02, de manera más preferible de péptidos que se unen al dominio de unión PDZ tales como el polipéptido que contiene el dominio PDZ2, que preferiblemente corresponde a los residuos 65-248 de P SD-95 que codifica para el primero y segundo dominios PDZ (PDZ 1 -2) o PSD-95. Típicamente, dichos péptidos utilizados como componente (II) del péptido de fusión de la invención comprenden una longitud de 5 a 40 aminoácidos, preferiblemente una longitud de 5 a 30 o de 5 a 20 aminoácidos y de manera más preferible una longitud de 5 a 1 5, incluso de 5 a 1 0 aminoácidos. De manera incluso más preferible, los péptidos adecuados como componente (II) del péptido de fusión de la invención se pueden seleccionar de una secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos D-enantiomérica vdseisslk (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 3 1 ) o una secuencia que muestra una identidad de secuencia de aproximadamente 60, 70, 80, 90, 95 o de manera más preferible 99% con una secuencia de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 3 1 ) o cualquiera de las secuencias mencionadas en lo anterior. El término "identidad de secuencia", como se define en la presente, significa que las secuencias se comparan como sigue. Para determinar el porcentaj e de identidad de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se pueden alinear para propósitos de comparación óptima (por ej emplo se pueden introducir separaciones en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos) . Los aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes después se pueden comparar. Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaj e de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, por ejemplo, cuando un péptido particular se afirma que tiene porcentaje de identidad específico con un polipéptido de referencia de una longitud definida, el porcentaj e de identidad es en relación al péptido de referencia. De esta manera, un péptido que es 50% idéntico al polipéptido de referencia, esto es de 1 00 aminoácidos de longitud puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de 50 aminoácidos de longitud del polipéptido de referencia. También puede ser un polipéptido de 100 aminoácidos de longitud, el cual es 50% idéntico al polipéptido de referencia sobre su longitud completa. Por lo tanto, se afirma que el péptido particular tiene un por ciento de identidad específico el cual se seleccionará, por ej emplo, sin que se limite a esto, de un péptido concreto, de acuerdo con cualquiera de las SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMEROS : 1 a 29 para el componente (I) y a partir de un péptido concreto, por ej emplo de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 3 1 para el componente (II) o a partir de péptidos, por ej emplo, de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 33 a 35 para la totalidad del péptido de fusión. Por supuesto, otros polipéptidos también satisfacen los mismos criterios. Dicha determinación de porcentaj e de identidad de dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin et al. ( 1993 ), PNAS, USA, 90 : 5873 -5877. Dicho algoritmo se incorpora en el programa NBLAST el cual se puede utilizar para identificar secuencias que tengan la identidad deseada con una secuencia de aminoácidos de la invención. P ara obtener alineaciones con separaciones para propósitos de comparación, se puede utilizar BLAST con separaciones, como se describe por Altschul et al. ( 1997). Nucleic Acids Res, 25 :3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con separaciones, los parámetros implícitos en los programas respectivos (por ej emplo NBLAST) son los que se pueden utilizar. Las secuencias además se pueden alinear utilizando la Versión 9 de Genetic Computing Group ' s GAP (programa de alineación global) utilizando la matriz implícita (BLOSUM62) (valores-4 + 1 1 ) con un castigo por separación abierta de -12 (para los primeros nulos de una separación) y un castigo por expresión de separación de -4 (por cada nulo consecutivo adicional en la separación). Después de la alineación, se calcula el porcentaj e de identidad al expresar el número de coincidencias como el porcentaj e del número de aminoácidos en la secuencia que se reclama. Los métodos descritos de determinación del porcentaj e de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede aplicar, de manera correspondiente, a secuencias de ácidos nucleicos. El componente (II) del péptido de fusión de la invención, como se define en lo anterior, está constituido por completo de aminoácidos D-enantioméricos, es decir, de una secuencia de aminoácidos que comprende D-aminoácidos en orden retro-inverso como se define en lo anterior y se pueden preparar como se indica antes. Los péptidos retro-inversos, como se utilizan para el componente (II) de los péptidos de fusión de la invención poseen una diversidad de propiedades útiles como ya se han descrito para el componente (I) anterior, por ejemplo, una biodisponibilidad más prolongada del componente que forma una sección del péptido de fusión de la invención debido a una carencia de degradación proteolítica de este componente, etcétera. Ambos componentes (I) y (II) del péptido de fusión de la invención se pueden unir directamente o por medio de un enlazante. Un "enlazante" en el presente contexto, preferiblemente es un oligopéptido o polipéptido y se puede utilizar para enlazar los componentes () y (II) como se define en lo anterior. Preferiblemente, un enlazante tiene una longitud de 1 - 1 0 aminoácidos, de manera más preferible una longitud de 1 a 5 aminoácidos y de manera más preferible una longitud de 1 a 3 aminoácidos.

Ventajosamente, el enlazante no tiene ninguna estructura secundaria que forme propiedades, es decir, no tiene estructura de hélice o lámina ß que forme tendencia, por ej emplo, si el enlazante está constituido de por lo menos 35% de residuos glicina. Típicamente, un enlazante puede ser una secuencia totalmente de glicina, por ej emplo GG, GGG, GGGG, GGGGG, etc. El uso de una secuencia oligopeptídica o polipeptídica que se pueda separar intracelular/endógenamente como un enlazante permite que el componente (II) se separe del componente (I) después del suministro en la célula obj etivo. Las secuencias oligopeptídicas o polipeptídicas separables en este contexto también incluyen secuencias oligopeptídicas o polipeptídicas separables por proteasa, en donde el sitio de separación de proteasa típicamente se selecciona en base en la proteasa expresada de manera endógena por la célula tratada. El enlazante, como se define en lo anterior, está presente como una secuencia oligopeptídica o polipeptídica y puede estar constituida de D-aminoácidos o de aminoácidos como se encuentran de manera natural, es decir, L-aminoácidos. Como una alternativa a lo anterior, el acoplamiento de los componentes (I) y (II) del péptido de fusión de la invención se puede llevar a cabo por medio de un acoplamiento o agente de conjugación, por ej emplo, un reactivo reticulante. Existen varios reactivos reticulantes intermoleculares los cuales se pueden utilizar, véase, por ej emplo, Means and Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1 974, pp. 39-43. Entre estos reactivos están, por ej emplo, 3 -(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) o ?,?'- ( 1 ,3 -fenileno)bismaleimida; N,N'-etileno-bis-(yodoacetamida) u otro de dichos reactivos que tienen puentes metileno de 6 a 1 1 carbonos; y 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno . Otros reactivos reticulantes útiles para este propósito incluyen: p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfona; adipimidato de dimetilo; fenol- 1 ,4-disulfonilcloruro; diisocianato o diisotiocianato de hexametileno o azofenil-p-diisocianato; glutaraldehído y disdiazobenzidina. Los reactivos de reticulación pueden ser homobifuncionales, es decir, tener dos grupos funcionales que experimentan la misma reacción. Un reactivo de reticulación homobifuncional preferido es bismaleimidohexano (BMH). BMH contiene dos grupos funcionales maleimida, los cuales reaccionan de manera específica con compuestos que contienen sulfhidrilo bajo condiciones ligeras (pH 6.5-7.7). Los dos grupos maleimida se conectan por una cadena hidrocarburo. Por lo tanto, BMH es útil para el reticulado irreversible de proteínas (o polipéptidos) que contienen residuos cisteína. Los reactivos reticulantes también pueden ser heterobifuncionales. Los reactivos de reticulado heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ej emplo un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol, que se reticularán con dos proteínas que tengan aminas y tioles libres, respectivamente. Los ej emplos de reactivos de reticulación heterobifuncionales son 4-(N-maleimidometil)ciclohexano- l -carboxilato de succinimidilo (SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MB S) y 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimida (SMPB), un análogo de cadena extendida de MB S . El grupo succinimidilo de estos reactivos reticulantes con una amina primaria y la maleimida reactiva con tiol forman un enlace covalente con el tiol de un residuo ci steína. Debido a que los reactivos de reticulación con frecuencia tienen baj a solubilidad en agua, una porción hidrofílica tal como un grupo sulfonato se puede agregar al reactivo reticul ante para mej orar su hidrosolubilidad. Sulfo-MB S y sulfo-SMCC son ej emplos de reactivos reticulantes modificados para hidrosolubilidad. Mucho s reactivos reticulantes proporcionan un conjugado que es esencialmente no separable baj o condiciones celul ares . Por lo tanto, algunos reactivos reticulantes contienen un enlace covalente tal como un disulfuro que es separabl e baj o condiciones celulares. Por ej emplo , el reactivo de Traut, ditiobis (succinimidilpropionato) (D SP) y 3 -(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) son reticulantes separables bien conocidos . El uso de un reactivo reticulante separable permite que el componente (II) se separe del componente (I) después de suministro en la célula obj etivo, con la condición de que la célula sea capaz de separar una secuenci a particular del reactivo reticul ante. P ara este propósito, también puede ser útil el enlace di sul furo directo . El reticulado químico también puede incluir el uso de brazo s separadores. Los brazos separadores proporcionan flexibilidad intramolecular o aj ustan las distancias intramoleculares entre porciones conjugadas y de esta manera pueden ayudar a conservar la actividad biológica. Un brazo separador puede estar en forma de una porción de proteína (o polipéptido) que incluye aminoácidos separadores, por ej emplo prolina. De manera alternativa, un brazo separador puede ser parte de un reactivo reticulante, tal como el " SPDP de cadena larga" (Pierce Chem. Co. , Rockford, III, cat. No. 21 65 1 H). Están disponibles comercialmente numerosos reactivos reticulantes, que incluyen los descritos en lo anterior. Las instrucciones detalladas de su uso están disponibles fácilmente de proveedores comerciales. Una referencia general de reticulado de proteínas y preparación de conjugados es: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press ( 1991 ). El péptido de fusión de la invención, como se define en lo anterior, opcionalmente puede contener un componente (III) adicional. Dicho componente (III) preferiblemente es una etiqueta para purificación del péptido de fusión subsecuente a síntesis. Una "etiqueta para purificación" en el contexto de la presente invención, puede ser cualquiera de una diversidad de etiquetas adecuadas para purificación de proteínas recombinantes, tal como la etiqueta hexahistidina (etiqueta his, etiqueta polihistidina), una etiqueta de estreptavidina (etiqueta strep), una etiqueta SBP (etiqueta de unión de estreptavidina), una etiqueta GST (glutation-S-transferasa), una etiqueta dansilo, etc., o por medio de un epítopo de anticuerpo (es decir, una etiqueta que se une anticuerpo) por ejemplo una etiqueta myc, un epítopo Swal l , una etiqueta FLAG, etc. Las etiquetas como se mencionan en lo anterior preferiblemente se localizan en la parte C terminal del péptido de fusión (completo), como se define en lo anterior constituido de componentes (I), (II) y, opcionalmente, del componente (III) . Por ej emplo, las etiquetas como se mencionan en lo anterior preferiblemente se localizan en la parte C terminal del componente (I), si el componente (I) se localiza en el extremo C terminal del péptido de fusión, o de manera más preferible en la parte C terminal del componente (II), si el componente (II) se localiza en el extremo C terminal del péptido de fusión. Además, un componente (III) como se menciona en lo anterior preferiblemente se selecciona de manera que no interfiera con la funcionalidad biológica del componente (I) o (II), por ejemplo la capacidad del componente (I) del péptido de fusión de la invención para penetrar en la membrana celular y la capacidad del componente (II) para inhibir la interacción de NMDAR y proteínas que interactúan con NMDAR. De esta manera las etiquetas que no son voluminosas se seleccionan preferiblemente como el componente (III), tal como una etiqueta de hexahistidina, una etiqueta de estreptavidina (etiquetas strep), una etiqueta SBP (una etiqueta que une estreptavidina) o un epítopo de anticuerpo, por ej emplo una etiqueta myc, un epítopo Swa l l , una etiqueta FLAG, etc. Además, el componente (III) como se define en lo anterior, si está presente como un oligopéptido o polipéptido, puede estar constituido de D-aminoácidos como se define en lo anterior o de aminoácidos como se presentan de manera natural, es decir, L-aminoácidos. En consecuencia, la totalidad del péptido de fusión, que comprende los componentes (I), (II) y opcionalmente el componente (III) así como los enlazantes como se definen en lo anterior pueden estar constituidos de D-aminoácidos como se define en lo anterior. Si la totalidad del péptido de fusión de la invención, que comprende los componentes (I), (II) y opcionalmente el componente (III) así como en enlazante como se define en lo anterior, está constituido de D-aminoácidos, el péptido de fusión en su totalidad se puede preparar como se describe en lo anterior para componentes D-enantioméricos del péptido de fusión de la invención, por ej emplo utilizando métodos de síntesis química o cualquier otro método adecuado. De manera general, los componentes (I), (II) y opcionalmente (III) del péptido de fusión de la invención, como se definen en lo anterior, se pueden distribuir adecuadamente, es decir, en cualquier orden que permita que el componente (I) dirij a el péptido de fusión de la invención a través de la membrana plasmática cuando se distribuye en el péptido de fusión de la invención. Además, el componente (II) aún será capaz de inhibir la interacción de los receptores N-metil-D-aspartato y las proteínas que interactúan con NMDA . De acuerdo con una modalidad preferida, el componente (I) se puede localizar en el extremo N-terminal del péptido de fusión de la invención y el componente (II) se puede localizar en el extremo C terminal del péptido de fusión de la invención. Además, si un componente (III) como se define en lo anterior está contenido en el péptido de fusión de la invención, el componente (III) se puede localizar muy hacia el extremo C terminal del péptido de fusión de la invención completo. Una distribución preferida del péptido de fusión de la invención por lo tanto puede mostrar desde la parte N a C terminal el componente (I), el componente (II) y opcionalmente el componente (III) . No obstante, se pueden seleccionar también otras distribuciones, por ejemplo de la parte N a C terminal el componente (II), el componente (I) y opcionalmente, el componente (III). Si es adecuado, se pueden insertar enlazadores entre los componentes (I) y (II) como se definen en lo anterior. El péptido de fusión de la invención también puede contener un "derivado " de un componente (I), y/o de un componente (II) como se define en lo anterior. Un derivado de un componente (I) y/o (II) de acuerdo con la invención está diseñado para indicar una secuencia de un componente (I) o (II), el cual se deriva de una secuencia (L-aminoácido) como se encuentra de manera natural de un componente (I) o (II) como se define en lo anterior por medio de una o varias instituciones de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la secuencia de aminoácidos por medio de una o varias supresiones de uno o más aminoácidos en cualquier sitio de la secuencia como se encuentra de manera natural, y/o por medio de una o varias inserciones de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la secuencia peptídica como se encuentra de manera natural. Los "derivados" retendrán su actividad biológica si se utilizan como componente (I) o (II) del péptido de fusión de la invención, por ej emplo, un derivado del componente (I) será capaz de dirigir el péptido de fusión de la invención en el citoplasma celular o, aún más, a un destino celular específico, como se define en lo anterior mientras un derivado del componente (I) será capaz de inhibir la interacción de los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDAR) neuronales y las proteínas que interactúan con NMDAR. Los derivados en el contexto de la presente invención también se pueden presentar en forma de sus secuencias de L- o D-aminoácidos, como se define en lo anterior, o ambas. Si una o varias sustituciones de uno o varios aminoácidos se llevan a cabo para la preparación del derivado de componente (I) y/o del componente (II) del péptido de fusión de la invención, se prefieren las sustituciones conservadoras (de aminoácidos). Las sustituciones conservadoras (de aminoácidos) típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos : glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. De esta manera, los grupos de sustitución conservadora preferidos son aspartato-glutamato; asparagina-glutamina; valina-leucina-isoleucina; alanina- valina; fenilalanina-tirosina y lisina-arginina. Mediante dichas mutaciones, por ej emplo la estabilidad y/o la eficacia de los componentes (I) y (II) del péptido de fusión de la invención se puede incrementar. Si se introducen mutaciones en los componentes (I) y (II) del péptido de fusión de la invención, estos componentes (I) y (II) permanecerán (funcionalmente) homólogos, por ej emplo en secuencia, en función y en carácter antigénico u otra función con una proteína que tenga una secuencia de origen correspondiente. Dichos componentes mutados (I) y (II) del péptido de fusión de la invención pueden poseer propiedades alteradas las cuales puedan ser ventajosas con respecto a secuencias no alteradas de los componentes (I) y (II) para ciertas aplicaciones (por ej emplo pH óptimo aumentado, estabilidad a temperatura aumentada, etc.). Un derivado de componente (I) o un derivado de componente (II), respectivamente, del péptido de fusión de la invención se define que tiene una identidad sustancial con secuencias no modificadas del componente (I) o del componente (II), respectivamente, del péptido de fusión de la invención como se define en lo anterior por ej emplo con una secuencia de transposición de proteína TAT de VIH si se utiliza como el componente (I) . Las secuencias particularmente preferidas de aminoácidos son aquellas que tienen por lo menos 30% de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 50% de identidad de secuencia, incluso de manera preferible por lo menos 60% de identidad de secuencia, incluso de manera preferible por lo menos 75% de identidad de secuencia, incluso de manera más preferible por lo menos 80%, aún de manera más preferible 90% de identidad de secuencia y de manera mucho más preferible por lo menos 95% o incluso 99% de identidad de secuencia con un análogo como se encuentra de manera natural . Los métodos apropiados para la síntesis o aislamiento de un derivado funcional de componentes (I) y (II) del péptido de fusión de la invención así como para la determinación del porcentaj e de identidad de dos secuencias de aminoácidos se describen en lo anterior. De manera adicional, los métodos para la producción de derivados de los componentes (I) y (II) del péptido de fusión de la invención como se describe en lo anterior son bien conocidos y se pueden llevar a cabo siguiendo métodos estándar o convencionales los cuales son bien conocidos por una persona experta en la técnica (véase, por ej emplo, Sambrook J. Maniatis T ( 1989) supra). Como una modalidad adicional, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido de fusión de la invención como se define en lo anterior. Preferiblemente, dichas composiciones farmacéuticas comprenden el péptido de fusión de la invención con componentes (I) y (II) y opcionalmente, el componente (III) así como un enlazante opcional, como se define en lo anterior. Adicionalmente, dicha composición farmacéutica puede comprender un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Un "portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable" de acuerdo con la invención se refiere a un portador, adyuvante o vehículo no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del péptido de fusión de la invención con el cual se formula. Los portadores, adyuvante o vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden utilizar en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero no se limitan a intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero tales como albúmina sérica humana, sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, fosfato ácido disódico, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por vía oral, parenteral, por inhalación, aspersión, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o por medio de un depósito implantado . El término parenteral, como se utiliza en la presente incluye la administración subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e inyección intracraneal o técnicas de infusión. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía oral, intraperitoneal o intravenosa. Las formas inyectables estériles de las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en el arte utilizando agentes adecuados de dispersión o humedecimiento y agentes que mejoren la suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1 ,3 -butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden utilizar están agua, solución Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos y estériles se utilizan convencionalmente como un solvente o medio de suspensión.

Para este propósito, cualquier aceite fijo blando se puede utilizar que incluye monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tal como ácido oleico y sus derivados de glicérido son útiles en la preparación de sustancias inyectables y son aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes de dispersión similares que comúnmente se utilizan en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables que incluyen emulsiones o suspensiones. Otros tensioactivos utilizados comúnmente tales como Tween, Spans y otros agentes emulsificantes o mejoradores de biodisponibilidad, los cuales son utilizados comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas o de otro tipo, farmacéuticamente aceptables, también se pueden utilizar para los propósitos de la formulación. Las composiciones farmacéuticamente aceptables en la presente se pueden administrar por vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable que incluye, pero que no se limita a cápsulas, comprimidos (tabletas), suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los portadores utilizados comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se agregan típicamente agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. Para administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco . Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsificantes y que mejoran la suspensión. Si se desea también se puede agregar ciertos agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes. De manera alternativa, la composición farmacéutica de la invención, como se define en la presente, se puede administrar en forma de supositorio para administración rectal. Dicho supositorio se puede preparar al mezclar el agente con un excipiente adecuado, no irritante, que sea sólido a temperatura ambiente pero líquido a temperatura rectal y por lo tanto que se funda en el recto para liberar el medicamento . Dichos materiales incluyen manteca de cacao, cera de abej as y polietilenglicoles. La composición farmacéutica de la invención, como se define en la presente, también se puede administrar tópicamente, en especial cuando el objetivo de tratamiento incluye áreas u órganos accesibles con facilidad por aplicación tópica, que incluyen enfermedades de los ojos, la piel o el tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior se puede llevar a cabo en una formulación de supositorio rectal (véase antes) o en una formulación de enema adecuada. También se pueden utilizar parches transdérmicos tópicos. Para aplicaciones tópicas, la composición farmacéutica de la invención, como se define en la presente, se puede formular en un ungüento adecuado que contiene el péptido de fusión de la invención como se identifica en lo anterior, suspendido o disuelto en uno o más portadores. Los portadores para administración tópica del péptido de fusión de la invención incluyen, pero no se limitan a aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsificante y agua. De manera alternativa, la composición farmacéutica de la invención, como se define en la presente, se puede formular en una loción o crema adecuadas que contenga el péptido de fusión de la invención suspendido o disuelto en uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a aceite mineral, monoestearato de sorbitano, polysorbate 60, cetilésteres de cera, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. Para uso oftálmico, la composición farmacéutica de la invención se puede formular como suspensiones micronizadas en solución isotónico, solución salina estéril ajustada a pH o preferiblemente como una solución en solución salina estéril ajustada en pH e isotónica ya sea con o sin un conservador tal como cloruro de bencilalconio . De manera alternativa, para usos oftálmicos, la composición farmacéuticamente aceptable se puede formular en un ungüento tal como petrolato. La composición farmacéutica de la invención, como se define en la presente, también se puede administrar por aerosol nasal o inhalación.

Dicha composición se puede preparar de acuerdo con técnicas bien conocidas en el arte de formulación farmacéutica y se pueden preparar como soluciones en solución salina, utilizando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de absorción para incrementar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales. De manera más preferible, la composición farmacéuticamente aceptable en la presente se formula para administración oral o parenteral, por ej emplo por inyección. Para propósitos de tratamiento, una cantidad eficaz, reductora de daño, no tóxica del péptido de fusión de la invención se puede utilizar para preparación de una composición farmacéutica de la invención como se define en lo anterior. Por lo tanto, una cantidad del péptido de fusión de la invención se puede combinar con uno o varios materiales portadores para producir una composición como se define en lo anterior. La composición farmacéutica de la invención típicamente se prepara en una forma de dosificación única (o múltiple) la cual variará en base en el hospedador tratado y el modo de administración particular. Habitualmente, la composición farmacéutica de la invención se formula de manera que el intervalo de dosificación por dosis de entre 0.001 - 1 00 mg/kg de peso corporal/día del péptido de fusión se puede administrar a un paciente que recibe la composición farmacéutica de la invención. Los intervalos de dosificación preferidos por dosis varían de 0.01 -50 mg/kg de peso corporal/día, incluso intervalos de dosificación más preferidos por dosis varían de 0. 1 -25 mg/kg de peso corporal/día. No obstante, los intervalos de dosificación y regímenes de tratamiento como se mencionan en lo anterior se pueden adaptar adecuadamente para cualquier paciente particular en base en una diversidad de factores que incluyen la actividad del péptido de fusión de la invención específico que se utilice, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, hora de administración, velocidad de excreción, combinación con otros medicamentos, el juicio del médico que realiza el tratamiento y la gravedad de la enfermedad particular que es tratada. En este contexto, la administración se puede llevar a cabo en un intervalo de dosificación inicial el cual puede variar con respecto al tiempo de tratamiento, por ej emplo al incrementar o disminuir el intervalo de dosificación inicial dentro del intervalo establecido en lo anterior. De manera alternativa, la administración se puede llevar a cabo de una manera continua por administración de un intervalo de dosificación específico por lo que se mantiene el intervalo de dosificación inicial sobre todo el tiempo de tratamiento. Ambas formas de administración de manera adicional se pueden combinar, por ej emplo, si el intervalo de dosificación se va a adaptar (aumentar o disminuir) entre varias sesiones de tratamiento pero se mantiene constante dentro de una sola sesión de manera que los intervalos de dosificación de las diversas sesiones difieren entre sí. La composición farmacéutica de la invención se puede utilizar para tratamiento, disminución o prevención de enfermedades relacionadas con un efecto dañino de un daño a una célula de mamífero, como se describe en la presente, en particular para el tratamiento de apoplej ía cerebral o daños a la médula espinal, daños isquémicos o traumáticos al cerebro o médula espinal y daños a neuronas del si stema nervio so central (SNC) que incluyen, sin que se limiten a daños agudos al SNC , apoplej ía cerebral i squémica o daños a la médula espinal así como anoxia, i squemia, daño mecánico, dolor neuropático, particularmente dolor neuropático rel acionado con P SD-95 y/o interacción con NMDAR, etc. Además, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar para suministrar efecto neuroprotector contra, o para tratami ento de daño excitotóxico e isquémico, excitotoxicidad, carencia de soporte neurotrófico, desconexión, daño a neuronas que incluyen, por ej emplo , epilepsia, condiciones neurodegenerativas crónicas, etc. En este contexto, l a excitotoxicidad puede estar involucrada parcialmente en daño traumático al cerebro por apoplej ía y en enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central (SNC) tal como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), fibromialgia, enfermedad de Parkinson y corea de Huntington, los cuales se pueden tratar en l a presente. Otras condiciones comunes que provocan concentraciones excesivas de glutamato alrededor de las neuronas y las cuales se pueden tratar en la presente son hipoglucemia y estado epil éptico, glaucoma/deterioro de l as células de los ganglio s de la retina, etc. El tratamiento, disminución o prevención de enfermedades relacionadas con efectos dañinos de daño a células de mamífero como se define en lo anterior así como enfermedades o trastornos adicionales como se mencionan en la presente típicamente se llevan a cabo al administrar una composición farmacéutica de la invención como se define aproximadamente en un intervalo de dosificación como se define en lo anterior. La administración de la composición farmacéutica de la invención se puede llevar a cabo ya sea antes del inicio de excitotoxicidad y/o daños cerebral (isquémico), es decir, el efecto dañino de un daño a células de mamífero o de manera concurrente o subsecuente al mismo; por ej emplo, la administración de la composición farmacéutica de la invención se puede llevar a cabo dentro de un tiempo de (hasta) 1 hora (0- 1 horas), hasta 2 horas, hasta 3 -5 horas o hasta 24 horas o más subsecuente al daño por apoplejía cerebral o daño a la médula espinal, daños isquémicos o traumáticos al cerebro o médula espinal y, en general, a daños a las neuronas del sistema nervioso central (SNC). La presente invención además proporciona equipo que comprende la composición farmacéutica de la invención definida en lo anterior (en uno o más recipientes) en por lo menos una de las formulaciones anteriores y un manual de instrucciones o folleto de información respecto a las instrucciones y/o información con respecto a la aplicación de la composición farmacéutica de la invención. Aunque la descripción se ha descrito e ilustrado en algunas modalidades preferidas de la invención, debe entenderse que la invención no se limita a dichas modalidades particulares. Más bien, la invención incluye todas las modalidades las cuales son equivalencia funcional o mecánica de las modalidades específicas y características que se han descrito e ilustrado. DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras se muestran para ilustrar adicionalmente la presente invención sin limitar el alcance de la invención para las mismas. La figura 1 muestra la duración de eficacia de los péptidos de fusión de acuerdo con las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS : 32 y 33 en presencia de NMDA 20 µ?, particularmente los péptidos TAT-NR2B9c en forma L (L-TAT-L-NR2B9c, secuencia YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 32), idéntica a la del documento de E.U.A. 20030050243 ) en comparación con su forma D (D-TAT-D-NR2B9c, secuencia vdseisslk-rrrqrrkkrgy (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 33 )). En este experimento (así como en los experimentos siguientes), se mide la tasa de muerte celular de manera paralela a la adición de péptidos capaces de inhibir la muerte celular por interacción con el receptor NMDA. Como se puede ver en la figura 1 , en cualquier experimento único D-TAT-D-NR2B9c, de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 33 muestra una eficacia por lo menos igual, pero de manera predominante aumentada significativamente en comparación con el compuesto comparativo L-TAT-L-NR2B9c, de acuerdo con la S ECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 32, es decir, disminuye de manera significativa la tasa (%) de muerte celular de células neuronales; * la figura 1 indica P<0.05, @ P < 0.07 (prueba t pareada, que compara neuronas tratadas con péptido y neuronas control). En particular, D-TAT-D-NR2B9c describe su efecto positivo, si la separación entre la incubación peptídica y la adición de NMDA es > 8 horas. Esto muestra la actividad farmacológica prolongada de la forma D. El intervalo de tratamiento más eficaz se observa entre 4 y 48 horas, particularmente 8 y 24 horas. La figura 2 muestra la duración de eficacia de péptidos de fusión de acuerdo con las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS : 32 y 33 en presencia de NMDA 40 µ?, particularmente los péptidos TAT-NR2B9c en forma L (L-TAT-L-NR2B9c secuencia YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 32), idéntica a la descrita en el documento de E.U.A. 20030050243 ) en comparación con su forma D (D-TAT-D-NR2B9c, secuencia vdseisslk-rrrqrrkkrgyin (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 33)). Como se puede ver en la figura 2, en cualquier experimento único, D-TAT-D-NR2B9c de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 33 muestra una eficacia por lo menos igual, pero predominantemente aumentada de manera significativa versus el compuesto comparativo L-TAT-L-NR2B9c, de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 32, es decir, una tasa (%) de muerte celular disminuida de manera significativa de células neuronales. * en la figura 2 indica P < 0.05, @ P < 0.07 (prueba t pareada, que compara neuronas tratadas con péptido con neuronas control). El efecto positivo notable del péptido de fusión de la invención se vuelve evidente si el intervalo de tiempo es menor de 24 horas. La figura 3 muestra la duración de eficacia de los péptidos de absorción de acuerdo con las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS : 34 y 35 en presencia de NMDA 20 µ?, particularmente péptidos (Arg)8-NR2B 9c en la forma L (L-(Arg)8-L-NR2B9c secuencia RRRRRRRR-KLS SIESDV (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 34)) en comparación con su forma D (D-(Arg)8-D-NR2B9c, secuencia vdseisslk-rrrrrrrr (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 35)). Como se puede ver en la figura 3 , en cualquier experimento único, el péptido de fusión de la invención D-(Arg)8-D-NR2B9c de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 35 muestra una eficacia por lo menos igual, pero de manera predominante aumentada significativamente en comparación con el compuesto comparativo L-(Arg)8-L-NR2B9c de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 34, es decir, una tasa (%) de muerte celular disminuida significativamente de células neuronales; * en la figura 3 indica P < 0.005 , @ P < 0.07 (prueba t pareada, que compara las neuronas tratadas con péptido con las neuronas control). La figura 4 muestra la duración de eficacia de los péptidos de fusión con las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS : 34 y 35 ante la presencia de NMDA 40 µ?, particularmente los péptidos (Arg)8- NR2B9c en la forma L (L-(Arg)8-L-NR2B9c, secuencia RRRRRRRR-KLS SIESDV (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 34)) en comparación con su forma D (D-(Arg)8-D-NR2B9c, secuencia vdseisslk-rrrrrrrr (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 35)). Como se puede ver en la figura 4, en cualquier experimento único hasta un punto en el tiempo de 8 h el péptido de fusión de la invención D-(Arg)8-D-NR2B9c de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 35 muestra eficacias por lo menos iguales, pero predominantemente aumentadas de manera significativa en comparación con el compuesto comparativo L-(Arg)8-L-NR2B9c, de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 34, es decir, tasas (%) de muerte celular disminuida significativamente de células neuronales; * en la figura 4 indica P<0.05 , @ P<0.07 (prueba t pareada, que compara las neuronas tratadas con péptido con las neuronas control).

EJEMPLOS Los siguientes ej emplos se diseñan para ilustrar adicionalmente la presente invención sin limitar el alcance de la invención de estos ej emplos.

Ejemplo 1 Síntesis de péptidos de fusión de la invención Se sintetizan péptidos TAT-NR2B9C manualmente sobre resina MBHA (Novabiochem, Merck) por medio de la química N"-Boc SPPS, de acuerdo con procedimientos convencionales o estándar. Todos los acoplamientos se monitorean por la prueba de color TNB SA. Los péptidos se separan y se desprotegen simultáneamente de la resina por tratamiento con HF 90% con eliminadores apropiados 1 h a 0°C. Los péptidos crudos se captan en una solución acuosa de ácido acético 20% diluida a una solución de ácido acético 5% con agua bidestilada y los eliminadores remanentes se extraen con un lavado de dietiléter. Las soluciones que contienen los péptidos después se liofilizan para eliminar el ácido acético. Los péptidos L/D-NR2B9C se purifican por RP-CLAP preparativa en una columna Atlantis (Waters) dC 1 8 ( 1 5 - 45% de amortiguador B durante 45 min a 1 5 ml/min) y se caracterizan por ESI-EM. Los péptidos (Arg)8-NR2B9C se sintetizan manualmente. La síntesis se llevó a cabo en un soporte sólido utilizando una estrategia Fmoc en una resina Fmoc-Val-NovaSyn TGA de Novabiochem, con una carga de 0.22 mmol/g. La síntesis se realizó en un robot ACT, en un pozo que corresponde a 145 /¿mol utilizando 4 equivalentes de aminoácidos, 4 equivalentes de agente de acoplamiento HOBt y 4 equivalentes de DIPCDI. Debido a los requerimientos de síntesis el acoplamiento dobles se realizan cada 3 aminoácidos: - el primer acoplamiento con 4 equivalentes de aminoácidos, 4 equivalentes de HOBt y 4 equivalentes de DIPCDI. - el segundo acoplamiento con 4 equivalentes de aminoácidos, 4 equivalentes de HATU y 4 equivalentes de DIEA.

Después de cada acoplamiento, se lleva a cabo una etapa de rematado con anhídrido acético 10% en DMF (durante 1 5 minutos). Las etapas de desprotección se llevaron a cabo con piperidina 20% en DMF (2 x 20 minutos) . El Fmoc en la posición "n" se mantiene hasta el final de la síntesis. La separación se llevó a cabo en una solución de TFA a 86% en presencia de eliminadores. El péptido se precipita en éter. Después el péptido se purifica en una columna en fase inversa C- 1 8 utilizando un gradiente de 0 a 60% de acetonitrilo durante 60 minutos, con detección por UV a 220 nm (para enlaces peptídicos) y a 300 nm (para protección de Fmoc). Subsecuentemente, el péptido se liofiliza con un grupo protector Fmoc el cual se retira posteriormente por tratamiento con una solución de 20 equivalentes de DEA. El péptido después se purifica nuevamente (utilizando las mismas condiciones a las descritas en lo anterior) antes de que se liofilice, analice y utilice en los experimentos subsecuentes.

E jemplo 2 Prueba de duración de neuroprotección proporcionada por TAT-NR2B9c frente a ataques excitotóxicos Procedimiento : Se cultivaron neuronas de corticales de rata, que se extrajeron de ratas E2 1 durante 7-9 días in vitro en medio neurobasal-A + suplemento B-27 (ambos de Invitrogen), glutamina 1 mM + 50 unidades/ml de penicilina, y 500 g/ml de estreptomicina. 1 . En momentos variables antes de la exposición del compuesto se extrae neuronas de medios de cultivo basado en Neurobasal-A y se colocan en "medio de transfección) (TM; B ading et al. ( 1 993 ), Science 260, 1 8 1 - 1 86) : 1 0% (medio esencial mínimo, Invitrogen (21090022), que contiene sal Earles, pero sin L-glutamina), medio 90% sal/glucosa-glicina (SGG) SGG: NaCl 1 14 mM, NaHC03 0.2 19%, KC1 5.292 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, HEPES 10 mM, glicina 1 mM, glucosa 30 mM, piruvato de sodio 0.5 mM, rojo de fenol 0. 1 %, suplemento de insulina transferrinaselenita (Sigma, 7.5 µg, insulina/ml; 7.5 µg transferrina/ml y 7.5 ng de selenita de sodio/ml); osmolaridad final, 325 mosm/1). Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo en TM. 2. Las neuronas después se expusieron a los péptidos de fusión de la invención a 10 µ? durante 1 hora (particularmente los péptidos TAT-NR2B9c en la forma L (L-TAT-L-NR2B9c secuencia YGRKKRRQRRR-KLS S IESDV (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 32), idéntica a los descrito en E.U.A- 20030050243 ) y su forma D (D-TAT-D-NR2B9c, secuencia vdseisslr-rrrqrrkkrgyin (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 33))) . 3. Después de 1 hora, las neuronas se lavan una vez en TM para separar el péptido. 4. Después de un período de tiempo variable, se expone a las neuronas a NMDA a 20 ó 40 µ? durante 1 hora, después de lo cual las neuronas se colocan en TM durante 24 horas. 5. Se fij an las neuronas (paraformaldehído 3 %) y se tiñen (DAPI, 4 ' ,6-diamidino-2-fenilindol). Se cuenta el número de núcleos picnóticos como % del total. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Resultados Ambas formas, D y L de TAT-NR2B9c (L-TAT-L-NR2B9c, secuencia YGRKKRRQRRR-KLS SIESDV (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 32), idéntico a lo descrito en el documento de E.U.A. 20030050243 ), D-TAT-D-NR2B9c, secuencia vdseisslk-rrrqrrkkrgyin (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 33)) proporciona protección hasta por 4 horas después del lavado del péptido frente a NMDA (20 y 40 µ?) . No obstante, la protección por la forma D se extiende hasta 48 horas después del lavado para la dosis más baj a de NMDA (figura 1 ) lo que indica que este es un candidato más promisorio como un medicamento terapéutico. También proporciona protección significativa hasta por 24 horas frente a NMDA 40 µ? mientras que la neuroprotección obtenida con la forma L sólo es significativa en 1 hora (figura 2) .

Ej emplo 3 Prueba de duración de neuroprotección proporcionada por (Arg)s-NR2B9c frente a ataques excitotóxicos Procedimiento Se cultivan neuronas corticales de rata, extraídas de ratas E21 , durante 7-9 días in vitro en medio Neurobasal-A + suplemento B-27 (ambos de Invitrogen), glutamina 1 mM + 50 unidades/ml de penicilina, y 500 g/ml de estreptomicina. 1 . En momentos variables antes de la exposición al péptido se extraen las neuronas de medios de cultivo basado en Neurobasal-A y se colocan en TM (véase antes) con la inclusión de un suplemento de insulina-transferrina-selenita (Sigma) . Todas las etapas subsecuentes se llevan a cabo en TM (véase antes). 2. Las neuronas después se exponen a péptidos de fusión de la invención a 10 µ? durante 1 hora (particularmente los péptidos (Arg)g-NR2B9c en la forma D (D-TAT-D-NR2B9c secuencia vdseisslr-rrrrrrrr (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 35)) y también la forma L (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 34)). 3. Después de 1 h, las neuronas se lavan una vez en TM para eliminar el péptido. 4. Después de un período de tiempo variable, se exponen a las neuronas a NMDA durante 1 h, después del cual las neuronas se colocan en TM durante 24 h. 5. Se fij an las neuronas (paraformaldehído 3 %) y se tiñen (DAPI, 4 ' ,6-diamidino-2-fenilindol). Se cuenta el número de núcleos picnóticos como un % del total . Los experimentos se realizan por triplicado .

Resultados La forma D de (Arg)g-NR2B9c (D-(Arg)8-D-NR2B9c (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 35)) proporciona neuroproteccion superior hasta por 8 horas después del lavado del péptido frente a NMDA (20 µ?) en comparación con la forma D (figura 3). A una dosis mayor de NMDA (40 µ?), la forma D también muestra efectos protectores iguales o mejores (figura 4). Estos resultados sugieren que la forma D es un candidato más promisorio como un medicamento terapéutico . En general, D-(Arg)8-D-NR2B9c (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 35) funciona similar a D-TAT-D-NR2B9c (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 33), aunque con una duración más corta de actividad neuroprotectora, lo cual puede sugerir una capacidad de penetración en célula más pronunciada de D-TAT que D-(Arg)8.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un péptido de fusión caracterizado porque comprende por lo menos un componente (I), en donde el componente (I) comprende un péptido transportador, y un componente (II) que se selecciona de un péptido que inhibe la interacción del receptor de N-metil-D-aspartato neuronal (NMDAR) con proteínas que interactúan con NMDAR, en donde el componente (II) consiste completamente de aminoácidos D-enantioméricos.

2. El péptido de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el componente (I) se selecciona de péptidos que penetran en la célula que incluyen: (a) dominios de transducción de proteína (PTD) y los CPP derivados de proteína que incluyen secuencias derivadas de Antennapedia, pAntp (43 -58) que comprende las secuencias RQIKIWFQNRRMKWKK (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 ) o RQI IWFQNRRMKWKK-amida (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 2); que incluye las secuencias derivadas de TAT del virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH- 1 ), región 37 a 72, región 37 a 60, región 48 a 60 o región 49 a 57 de TAT, secuencias GRKKRRQRRR (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 3 ), YGRKKRRQRRR (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 4), CGRKKRRQRRRPPQC (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 5) o CGRKKRRQRRRPPQCC (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 6) ; que incluye hCT(9-32), que comprende la secuencia LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 7); pVEC, que comprende la secuencia LLIILRRRIRKQAHAHSK-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 8); pIS L, que comprende la secuencia RVIRVWFQNKRCKDKK-NH2, (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 9); PRP de ratón ( 1 -28), que comprende la secuencia MANGLYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 0) y homólogos para la misma que incluyen homólogos humanos, Ems ( 194-220) que comprende la secuencia RQGAARVTSWLGLQLRIAGKRLEGRSK-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 1 ); Restricocina L3 (60-73 ), que comprende la secuencia KLIKGRTPIKFGK-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 2), o (b) péptidos modelo que incluyen VT5 que comprende la secuencia DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD-NH2, (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 13 ), MAP que comprende la secuencia KLALKLALKALKAALKLA-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 14), tramos de arginina que incluyen RRRRRRR, es decir (Arg)7 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 5) o RRRRRRR-NH2, es decir (Arg)7-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 16) o RRRRRRR-C, es decir (Arg)7-C (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 17) o RRRRRRRR, es decir (Arg)8 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 1 8), o RRRRRRRR-NH2 es decir (Arg)8-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 19), RRRRRRRRR, es decir (Arg)9 (S ECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 20) o RRRRRRRRR-NH2, es decir (Arg)9-NH2, (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 21 ), o (c) los CPP designados que incluyen MPG que comprenden la secuencia GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKS RKV (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 22) o GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKR V-cisteamida (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 23), Transportano, que tiene la secuencia GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 24), Transportano 10 que comprende la secuencia AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 25), Pep- 1 , que comprende la secuencia KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 26) o KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cisteamida (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 27), o se puede seleccionar del péptido KALA que comprende la secuencia WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 28), a partir de Bulforina 2 que comprende la secuencia TRS SRAGLQFPVGRVHRLLRK (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 29), o un isómero retro-inverso de las SECUENCIAS DE IDENTIFICION NUMEROS : 1 -29 constituido de D aminoácidos.

3. El péptido de fusión de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el componente (I) se selecciona de péptidos que penetra en la célula que muestran una identidad de secuencia de aproximadamente 60, 70, 80, 90, 95 o incluso 99% con una secuencia de acuerdo con cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NUMEROS : 1 a 29 como se definen en la reivindicación 2, con la condición de que el componente (I) aún retenga su actividad biológica, es decir, que dirige el péptido de fusión de la invención a través de la membrana plasmática.

4. El péptido de fusión de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque el componente (II) se selecciona de las subunidades NR l y NR2 del receptor NMDA, péptidos que comprenden del dominio de unión PDZ, péptidos que contienen un motivo tSXnV o a partir de proteínas de densidad post-sináptica -95, PSD-95 , PDS-93 , SAP 1 02.

5. El péptido de fusión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el componente (II) comprende una longitud de 5 a 40 aminoácidos, de manera más preferible una longitud de 5 a 30 o 5 a 20 aminoácidos e incluso de manera más preferible una longitud de 5 a 1 5 o incluso de 5 a 10 aminoácidos.

6. El péptido de fusión de conformidad con la reivindicación 4 ó 5 , caracterizado porque el componente (II) se selecciona de una secuencia que comprende una secuencia de acuerdo con vdseisslk (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 3 1 ).

7. El péptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el componente (II) se selecciona de una secuencia que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente 60, 70, 80, 90, 95 o incluso 99% con una secuencia de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 3 1 .

8. El péptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el componente (I) consiste por completo de L-aminoácidos, D-aminoácidos o ambos.

9. El péptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los componentes (I) y (II) están unidos por un enlazante.

1 0. El péptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende adicionalmente un componente (III), en donde el componente (III) es una etiqueta para purificación.

1 1 . Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un péptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 0 y opcionalmente un portador farmacéutico.

12. El uso de un péptido de fusión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10 para preparar una composición farmacéutica, para tratamiento, disminución o prevención de enfermedades relacionadas con el efecto a un daño a células de mamífero, que se selecciona de apoplejía cerebral o daños a la médula espinal, daños isquémicos o traumáticos al cerebro o médula espinal y daños a las neuronas del sistema nervioso central (SNC) que incluyen daños agudos al SNC, apoplejía cerebral isquémica o daños a la médula espinal así como anoxia, isquemia, daño mecánico, o para proporcionar un efecto neuroprotector, o el tratamiento de excitotóxico e isquémico, excitotoxicidad, carencia de soporte neurotrófico, desconexión, daño a neuronas que incluye epilepsia, condiciones neurodegenerativas crónicas, y dolor neuropático que incluye dolor neuropático relacionado con interacción PSD-95 y/o NMDAR.

13. Un equipo caracterizado porque comprende una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 1 y un manual de instrucción o un folleto de información con instrucciones y/o información para aplicación de la composición farmacéutica.