JP2009545543A - ニューロン性nmdaレセプターとnmdaレセプター相互作用タンパク質との相互作用を阻害するための融合ペプチド - Google Patents
ニューロン性nmdaレセプターとnmdaレセプター相互作用タンパク質との相互作用を阻害するための融合ペプチド Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、少なくとも成分(I)および成分(II)を含む融合ペプチドを提供する。成分(I)は、トランスポーターペプチドを含み、成分(II)は、ニューロン性N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)とNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を阻害するペプチドより選択され、成分(II)は、もっぱらD−エナンチオマーアミノ酸からなる。本発明はさらに、上記融合ペプチドを含む薬学的組成物、および該薬学的組成物を投与する方法、ならびに該融合ペプチドを使用するキットおよび使用方法を提供する。
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本発明は、少なくとも成分(I)および成分(II)を含む融合ペプチドを提供する。成分(I)は、トランスポーターペプチドを含み、成分(II)は、ニューロン性N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)とNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を阻害するペプチドより選択され、成分(II)は、もっぱらD−エナンチオマー(enantiomeric)アミノ酸からなる。本発明はさらに、上記融合ペプチドを含む薬学的組成物、および該薬学的組成物を投与する方法、ならびに該融合ペプチドを使用するキットおよび使用方法を提供する。
脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害(例えば、虚血性脳卒中)は、頻繁に生じ、そして中枢神経系(CNS)ニューロンおよびその作用(process)にしばしば不可逆的な損傷を生成するので、主要な健康問題である。この損傷はしばしば重篤であるので、このような傷害の帰結に罹患している患者の処置のために、現在のところ、健康に関する当局によって、毎年多大な費用が費やされている。しかし、これら急性のCNS傷害についての効果的な薬学的処置は、現在まだ存在しない。
臨床的には、脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害(例えば、虚血性脳卒中)は、小さな局所的な欠損から悲劇的で広範な機能不全までにわたる、ニューロンの能力の急激な低下として自身を明らかにするか、処置されるべき患者を死に至らしめ得る。この欠損の最終的な規模(magnitude)は初期の物理的損傷の性質および程度によって決定され、そして、関連するニューロン細胞の死をさらに引き起こす二次的な現象が展開する一連のプロセスによって決定されると、現在考えられている。これらのプロセスの係り合いは即座におこるのではないので、まだ決定されていない持続時間の理論的な時間窓(time−wiodow)が存在する。ここで、タイムリーな干渉が、遅延した神経毒性を生じるこれらの事象を妨害する。虚血性または外傷性のニューロン死の過程を引き起こしそして維持する細胞内機構(例えば、グルタミン酸トランスポーターの逆転)について多くが知られているが、実用的な予防戦略または処置プロトコルとして効果的なものは現在存在しない。したがって、上記疾患(脳卒中または脊髄傷害)に利用可能な、臨床的に有用な薬学的処置として効果的なものは現在存在しない。
科学的な見地から、CNS組織還流における局所的な縮小(reduction)は、インビボでの低酸素性および外傷性の両方のCNS傷害においてニューロン死を媒介する。このような局所的な低還流(hypoperfusion)は、通常、局所的な脈管構造の物理的な崩壊、血栓症、血管痙攣、または塞栓の塊による内腔閉塞によって生じる。病因にかかわらず、生じた虚血は、細胞の種々の恒常性機構に悪影響を及ぼすことによって、感受性のニューロンを傷害すると考えられている。正確な障害(disturbance)の性質はほとんどわかっていないが、ニューロン傷害の多くの実験モデルに共通する特徴は、遊離した細胞内カルシウムの濃度([Ca2+]i)に起因する。ニューロンは、[Ca2+]iを生理学的機能に必要な低レベル(約100nM)に制限する複数の機構を有している。[Ca2+]iの延長した上昇は、しっかりと制御されたCa2+依存的プロセスを緩和し、これらのプロセスが過剰な反応産物を生成させ、正常には静止している酵素学的経路を活性化するか、または調節性の細胞保護機構を不活性化すると広く考えられている。このことは、実験的に観察可能な細胞破壊(例えば、脂肪分解、タンパク質分解、細胞骨格崩壊、pH変動、フリーラジカル形成、ミトコンドリア機能不全、細胞膨潤、血漿高潔(integrity)の喪失、および細胞核凝縮)の生成を、次々と生じさせる。
虚血事象(episode)の間の有害なレベルのCa2+流入の主要な要因は、EAAの過剰な放出を介する。よって、Ca2+の神経毒性を防ぐための古典的な手法は、電圧ゲートのCa2+チャネル、および/または興奮性アミノ酸EAAゲートのチャネルを介するCa2+流入の薬学的なブロックを介していた。この戦略のバリエーションは、しばしばEAA誘導性または低酸素性の細胞死をインビトロで減少させる。このことは、Ca2+神経毒性の仮説を信用させる。しかし、種々のCa2+チャネルアンタゴニストおよびEAAアンタゴニストは、ニューロン傷害、特に、実験的な脊髄傷害(SCI)、頭部傷害、および広範な脊髄虚血に対してインビボで保護しない。このことが不十分な薬物濃度、不適切なCa2+流入ブロック、またはCa2+依存的ではない神経毒性プロセスの寄与に起因するのか否かは知られていない。しかし、Ca2+神経毒性は、種々のCNSニューロンタイプにおいて種々の経路を介して引き起こされるようである。よって、首尾よくCa2+ブロックすることは、典型的には多くの薬学的アプローチを必要とする。NMDARの多くのアンタゴニストが開発されていることに注目すべきである。しかし、これらのアンタゴニストは、傷害の前に薬物を投与する時のみにインビボで動物モデルに効果的であり、よって典型的な臨床的筋書き(ここで、処置は典型的には例えば発作に引き続いて行われる。)に活用され得ない。また、NMDARアンタゴニストは、典型的には、インビボでヒトにおいてほとんど寛容性ではなく、治療的な濃度ウインドウが小さいかまたは時々存在しない。このことは、正常な生理学および病理学におけるNMDARの重要な役割を反映する。
Ca2+依存性の神経毒性プロセスに関して、N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)活性が細胞内シグナル伝達経路の引き金となり、ニューロンの可塑性、発達、老化および疾患を支配することが、哺乳動物ニューロン系において観察される。NMDARの足場となるタンパク質であるPSD−95の発現を抑制することによる興奮毒性のNMDARシグナリングの研究は、選択的に減弱されたNMDAR興奮毒性を示したが、他のグルタミン酸チャネルまたはCa2+チャネルによって興奮毒性は示されなかった(例えば、US20030050243参照)。これにより、NMDAR機能は、レセプター発現として影響を受けなかったが、NMDARを介するNMDAカレントおよび45Caローディングは変化しなかった。さらに、PSD−95の抑制は、ニューロン性一酸化窒素シンターゼ(nNOS)の発現または機能に影響を与えることなく、NMDARによるCa2+活性化一酸化窒素の産生を選択的にブロックしたが、他の経路による一酸化窒素の産生をブロックしなかった。従って、PSD−95は、NMDAR活性の一酸化窒素毒性への効果的な結合に必要であり、神経毒性Ca2+シグナリングに対する特異性を付与すると認識されている。
さらに、NMDARを介するカルシウム流入はシナプス伝達、ニューロン発達および可塑性を媒介するに重要な役割を担うということが知られている(例えば、Ghosh and Greenberg, Science 268, 239 (1995); Bliss and Collingridge, Nature 361, 31 (1993)参照)。過度には、Ca2+流入は興奮毒性(例えば、Olney, Kainic acid as a tool in neurobiology., McGeer, Olney and McGeer, Eds. (Raven Press, New York, 1978), p. 95.; Rothman and Olney, TINS 10, 299 (1987); Choi, Ann NY Acad Sci 747, 162 (1994)参照)、神経学的障害(発作、てんかん、および慢性の神経変性状態)においてニューロンを損傷するプロセス(例えば、Lipton and Rosenberg, New Eng J Med 330, 613 (1994)参照)を引き起こす。Ca2+流入がNMDARを介して生じる場合に、迅速なCa2+依存的神経毒性が最も効果的に引き起こされ、非NMDARまたは電位感受性Ca2+チャネル(VSCC)を介する等価量のCa2+でニューロンをローディングすることにより再生され得ないということに注意すべきである(例えば、Sattler et al., J Neurochem 71, 2349 (1998).; Tymianski et al., J Neurosci 13, 2085 (1993)参照)。この観察は、
NMDARチャネルを介するCa2+流入が神経毒性シグナル伝達経路に機能的に結合し得ることを示す。よって、理論と関連付けられることなく、NMDARによる致死的なCa2+シグナリングは物理的に相互作用する分子(例えば、細胞内C末端ドメインを介してPSD−95/SAP90に結合するNR2 NMDARサブユニット(Cho et al., Neuron 9, 929 (1992)参照)、chapsyn−110/PSD−93、および膜結合グアニル酸キナーゼ(MAGUK)ファミリー(例えば、Kornau et al., Science 269, 1737 (1995).; Brenman et al., J Neurosci 16, 7407 (1996); Muller et al., Neuron 17, 255 (1996) 参照))によって決定され得るということが示唆される。NMDAR結合MAGUKは、一般に非NMDARと結合するものとは異なる(Dong et al., Nature 386, 279 (1997); Brakeman et al., Nature 386, 284 (1997)参照)。NMDARによる神経毒性Ca2+シグナリングの選択的な活性化が、NMDAR結合MAGUKまたは結合する細胞内タンパク質の識別力によって決定されることが見出された。PSD−95は膜直下の足場分子であり、NMDARを選択的に結合しかつクラスタリングし、さらなるタンパク質−タンパク質相互作用を介して細胞内シグナル伝達分子に連結され得る(例えば、Craven and Bredt, Cell 93, 495 (1998); Niethammer et al., Neuron 20, 693 (1998); Kim et al., Neuron 20, 683 (1998); Tezuka et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 435(1999)参照)。よって、PSD−95を混乱させることによって、NMDARを介する神経毒性Ca2+シグナリングに対して影響があることが示唆される。
NMDARチャネルを介するCa2+流入が神経毒性シグナル伝達経路に機能的に結合し得ることを示す。よって、理論と関連付けられることなく、NMDARによる致死的なCa2+シグナリングは物理的に相互作用する分子(例えば、細胞内C末端ドメインを介してPSD−95/SAP90に結合するNR2 NMDARサブユニット(Cho et al., Neuron 9, 929 (1992)参照)、chapsyn−110/PSD−93、および膜結合グアニル酸キナーゼ(MAGUK)ファミリー(例えば、Kornau et al., Science 269, 1737 (1995).; Brenman et al., J Neurosci 16, 7407 (1996); Muller et al., Neuron 17, 255 (1996) 参照))によって決定され得るということが示唆される。NMDAR結合MAGUKは、一般に非NMDARと結合するものとは異なる(Dong et al., Nature 386, 279 (1997); Brakeman et al., Nature 386, 284 (1997)参照)。NMDARによる神経毒性Ca2+シグナリングの選択的な活性化が、NMDAR結合MAGUKまたは結合する細胞内タンパク質の識別力によって決定されることが見出された。PSD−95は膜直下の足場分子であり、NMDARを選択的に結合しかつクラスタリングし、さらなるタンパク質−タンパク質相互作用を介して細胞内シグナル伝達分子に連結され得る(例えば、Craven and Bredt, Cell 93, 495 (1998); Niethammer et al., Neuron 20, 693 (1998); Kim et al., Neuron 20, 683 (1998); Tezuka et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 435(1999)参照)。よって、PSD−95を混乱させることによって、NMDARを介する神経毒性Ca2+シグナリングに対して影響があることが示唆される。
一般に、タンパク質−タンパク質相互作用は、細胞増殖、分化、および、モジュラータンパク質ドメインとその同族の結合パートナーとの間のダイナミックな結合を介する細胞間コミュニケーションに関連するシグナリングを支配する(Pawson and J. D. Scott, Science 278, 2075-2080 (1997) 参照)。より詳細には、イオノトロピー(ionotropic)グルタミン酸レセプターは、興奮性シナプスにて、シナプス後肥厚(PSD)内での複数のタンパク質シグナリングの複合体へ組織化される(Sheng, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 98, 7058-7061 (2001) 参照)。PSD内で特に組織化されているタンパク質は、膜結合グアニル酸キナーゼ(MAGUK)ファミリーのメンバーであるPSD−95である。PSD−95は、N−メチル−D−アスパラギン酸サブタイプのグルタミン酸レセプター(NMDAR)ような膜貫通タンパク質を種々の細胞内シグナリング酵素に結合させる複数のドメインを含んでいる。PSD−95は、その第二のPDZドメイン(PDZ2)を介して、NMDAR 2Bサブユニット(NR2B)およびニューロン性一酸化窒素シンターゼ(nNOS)の両方を結合する(Brenman et al., Cell 84, 757-767 (1996)参照)。この相互作用は、NMDAR活性を一酸化窒素(NO)の産生に結合させ、このシグナリング分子はNMDAR依存的な興奮毒性を媒介する(Dawson et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 6368-6371 (1991)参照)。NR2は、PSD−95のPDZ1またはPDZ2のいずれかと相互作用し得る。しかし、PSD−95のPDZ1ドメインはNMDAレセプターのCOOH末端と相互作用する場合、PDZ2はnNOSのNH2末端を結合しない(Cao et al., 2005, J.Cell Biol 168, 117-126; and Christopherson et al, 2005, J. Biol. Chem. 274:27467-27473.参照)。
NMDARは、低酸素/虚血脳傷害において神経毒性での重要な役割を担う(Simon et al., Science 226, 850-852 (1984)参照)が、NMDAR機能のブロックは、動物およびヒトにおいて有害であり得る(Fix et al., Exp Neurol 123, 204-215 (1993); Davis et al., Stroke 31, 347-354 (2000); Morris et al., J. Neurosurg. 91, 737-743 (1999)参照)。NMDARアンタゴニストは発生段階の脳におけるアポトーシスを引き起こす。また、NMDARアンタゴニストは、外傷性の脳傷害の後の臨床期間または神経変性の緩やかな進行期間に投与された場合、成人の脳におけるニューロンの喪失を悪化させる(Ikonomidou et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 12885-12890; Olney et al., 2002, Brain Pathology 12, 488-498)。さらに、NMDARアンタゴニストを用いることによるNMDAR機能のブロックは、所望しない他の副作用(例えば、認識傷害および精神疾患)を導き得る。従って、PSD−95タンパク質を標的化することは、興奮毒性を含む疾患に対する代替的な治療アプローチを提示し、NMDAR機能をブロックすることによるネガティブな帰結を回避し得る。しかし、PSD−95の変異または抑制は、脳傷害に対する治療として現実的ではないこと、および傷害が生じた後に適用され得ないことが証明されている。従って、PSD−95発現を変更する以外に、NMDAR/PSD−95相互作用を干渉することが、インビトロでの興奮毒性およびインビボでの虚血性脳障害を抑制し得るか否かは疑問である。
上記の観点から、当該分野において、N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)とNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を減弱または阻害する化合物を用いる哺乳動物細胞の処置によって、障害効果を低減させるアプローチが開発されている(US20030050243)。US20030050243に記載の方法は、ニューロン性N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)とNMDAR相互作用タンパク質(例えば、ニューロンタンパク質)との相互作用を崩壊し得るペプチド化合物を使用する。このアプローチは、NMDAR機能のブロックによって生じる不利益を回避する。US20030050243に記載の方法は、主に、シナプス後肥厚−95タンパク質(PSD−95)のニューロン性N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)に対する相互作用が、興奮毒性を媒介する経路につながり、よって、この特定の相互作用を崩壊させる選択的ペプチドを使用して、虚血性脳障害が治療され得るという知見に基づいている。より詳細には、この相互作用の崩壊は、US20030050243に従って、PSD−95/NMDAR相互作用複合体のいずれかの部位上のモジュラードメインに結合するペプチドをニューロンに導入することによって達成される。この処置は、NMDAR活性をブロックすることなくNMDARシグナリングの下流を減弱させ、大脳皮質培養ニューロンを興奮毒性の損傷から保護し、一過性の局所的な脳虚血に供したラットにおける脳梗塞の量を低減させた。US20030050243に従った処置法は、インビトロでの興奮毒性およびインビボでの脳虚血の前、または開始後1時間のいずれかで適用された場合に、効果的であった。従って、このアプローチは、NMDAR活性をブロックすることに関連するネガティブな合併症(complication)を防ぐための、よい基礎を提供することを示している。
しかし、インビボで細胞内部位を標的化するために(例えば、特定の疾患を処置するために)およびインビトロでの細胞処置のために投与されるペプチド化合物は、典型的には、処置されるべき細胞内でバイオアベイラビリティをほとんど有していない。このバイオアベイラビリティがほとんどないことは、主に、これらのペプチド化合物のその標的細胞への指向が最適状態には及ばないことに起因している。これは、例えば、好適なトランスポーターシステムがないこと、またはふさわしくない(所望の標的細胞のインビボでの局在化に効果的に作用しない(例えば、細胞質または細胞内での特定の目的地を効果的に標的化しない)トランスポーターシステムを使用したことによって生じ得る。この効果は漸増量のペプチド化合物を投与することによって、またはその投与を反復することによって達成されるが、インビボでの漸増レベルのペプチド化合物は、投与の際に所望しない副作用を導き得る。さらに、ペプチド化合物の反復投与は、典型的には、医者が継続して存在することを必要とし、その帰結としてほとんどの場合において連続的に通院することを必要とする。このような効果は、ペプチド化合物の増加または反復した投与によって、またはより好適なトランスポーターシステム(例えば、US20030050243参照)を使用することによって、非現実的にされ得るとはいえ、これらはさらに、早期の分解を被り得、その帰結として、インビボでほとんどバイオアベイラビリティがないことを再度示し得る。この効果は、部分的に、細胞内プロセス(例えば、プロテアーゼまたはペプチドアーゼのような酵素の分解による分解プロセス)に起因しており、これらのペプチドのインビボでの不安定性、または血清、髄液(cerobospinal fluid)(CSF)などにおけるタンパク質分解性の分解に起因し得る。しかし、ペプチドの不安定性は、そのペプチド化合物の投与の増加または反復のいずれによっても達成されない。
上述に起因して、本発明は、哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果を低減するための代替策を提供することを目的とし、より詳細には、ニューロン性N−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA)レセプターとNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を阻害する化合物を提供し、これにより、従来技術における制限の少なくともいくつか(例えば、US20030050243に従う化合物によって例示されるようなもの)を克服することを目的としている。
本発明の目的は、少なくとも成分(I)および成分(II)を含む融合ペプチドであって、成分(I)は、トランスポーターペプチドを含み、成分(II)は、ニューロン性N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)とNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を阻害するペプチドより選択され、成分(II)は、もっぱらD−エナンチオマーアミノ酸からなる、融合ペプチドによって解決される。本発明の目的のために、D−エナンチオマーアミノ酸は、本明細書中に示されるように、配列中にて小文字で示され、ここで、L−エナンチオマーアミノ酸は大文字で示される。
上述した本発明の融合ペプチドは、トランスポーターペプチドを成分(I)として含んでいる。このようなトランスポーターペプチドは、本発明に係る融合ペプチドを細胞質または特定の細胞内での目的地へ指向する任意のトランスポーターペプチドより選択され得る。成分(I)として使用されるトランスポーターペプチドは、例えば、本発明の融合ペプチドを所望の細胞内局在(例えば、核、リボソーム、小胞体、リソソーム、またはペルオキシソーム)に指向し得る。その結果として、好ましい実施形態において、本発明の融合ペプチドのトランスポーターペプチドは、結合した分子を規定された細胞内局在に施行する。いくつかの場合において、本発明の融合ペプチドの成分(I)として使用されるトランスポーターペプチドは、好ましくは、細胞膜を超えて(例えば、細胞外環境から形質膜を通って細胞質へ)本発明の融合ペプチドを指向し、これにより、本発明の融合ペプチドの細胞内への取り込みを、特に、細胞透過性を増強することによって、またはその細胞内での持続時間を延長することによって増強する。
より詳細には、上述した融合ペプチドの成分(I)は、以下のような細胞膜を透過するペプチド(細胞膜透過ペプチド)より選択され得るが、これらに限定されない:(a)以下より選択されるタンパク質伝達(transduction)ドメイン(PTD)およびCPP由来タンパク質:RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号1)またはRQIKIWFQNRRMKWKK−アミド(配列番号2)を含む、Antennapedia由来の配列(例えば、pAntp(43−58));ヒト免疫不全ウイルス1(HIV−1)(例えば、TAT、より好ましくは、TATからの領域37〜72、領域37〜60、領域48〜60または領域49〜57)に由来する配列であり、配列GRKKRRQRRR(配列番号3)、YGRKKRRQRRR(配列番号4)、CGRKKRRQRRRPPQC(配列番号5)またはCGRKKRRQRRRPPQCC(配列番号6)を含む配列;配列LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP−NH2(配列番号7)を含むhCT(9−32);配列LLIILRRRIRKQAHAHSK−NH2(配列番号8)を含むpVEC;配列RVIRVWFQNKRCKDKK−NH2(配列番号9)を含むpISL;配列MANGLYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP−NH2(配列番号10)を含むマウスPRP(1−28)またはそのヒトホモログ;配列RQGAARVTSWLGLQLRIAGKRLEGRSK−NH2(配列番号11)を含むEms(194−220);配列KLIKGRTPIKFGK−NH2(配列番号12)を含むRestricocin L3(60−73);など、(b)モデルペプチド(例えば、配列DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD−NH2(配列番号13)を含むVT5;配列KLALKLALKALKAALKLA−NH2(配列番号14)を含むMAP)、アルギニンストレッチ(RRRRRRR((Arg)7;配列番号15)、RRRRRRR−NH2((Arg)7−NH2;配列番号16)、RRRRRRR−C((Arg)7−C;配列番号17)、RRRRRRRR((Arg)8;配列番号18)、RRRRRRRR−NH2((Arg)8−NH2;配列番号19)、RRRRRRRRR((Arg)9;配列番号20)またはRRRRRRRRR−NH2((Arg)9−NH2;配列番号21)を含む)など、あるいは(c)設計されたCPP(例えば、配列GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV(配列番号22)または配列GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV−システアミド(cysteamide)(配列番号23)を含むMPG;配列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL−NH2(配列番号24)を含むトランスポゾン、配列AGYLLGKINLKALAALAKKIL−NH2(配列番号25)を含むトランスポゾン10;配列KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(配列番号26)またはKETWWETWWTEWSQPKKKRKV−システアミド(配列番号27)を含むPep−1など。あるいは、上述した融合ペプチドの成分(I)は、配列WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(配列番号(SEQ ID NO:)28)を含むKALAペプチド、または配列TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(配列番号29)を含むBulforin 2などより選択され得る。本発明の融合ペプチドの成分(I)として使用されるペプチドは、さらに、上述した配列番号1〜29のいずれかの配列と、約60%、70%、80%、90%、95%または99%の配列同一性を有するペプチド配列より選択され得る。成分(I)は、なおその生物学的活性を維持しており、すなわち、該融合ペプチドが形質膜を超えることを指向する。本発明の融合ペプチドの成分(I)として、上記のような細胞膜透過ペプチドの選択は、典型的には、本発明の融合ペプチドが投与されるべき細胞システム、膜などの特定の要求に基づいて行われ得る。上記にて示したようなまたは当該分野において知られているトランスポーターペプチドの生物学的活性は、当業者によって、標準的なアッセイを使用することによって容易に決定され得る。例えば、トランスポーターペプチドは、GFPのようなタンパク質に融合されても、放射標識、酵素または蛍光団などを用いてラベルされてもよく、これらは細胞内で容易に検出され得る。次いで、融合されたトランスポーターペプチドは、細胞内にトランスフェクトされるか、または培養上清に添加され、細胞膜の浸透は、標準的な生物物理的方法を使用することによってモニタリングされ得る。
上記の融合ペプチドの成分(I)は、天然に存在するアミノ酸(すなわち、L−アミノ酸)またはD−アミノ酸(すなわち、ネイティブ配列と比較してRetro−Inversoな順番にあるD−アミノ酸を含むアミノ酸配列)のいずれかから構成され得る。用語「Retro−Inverso」は、線状ペプチドのアイソマーをいい、ここで、この配列の方向は逆転しており、各アミノ酸残基のキラリティーは反転している。よって、L−型で示されている本明細書中の任意の配列が、D−エナンチオマー(Retro−Inverso型)ペプチド配列としてもまた潜在的に開示される。本発明に係るD−エナンチオマー(Retro−Inverso型)ペプチド配列は、例えば、対応するネイティブL−アミノ酸配列についての逆転したアミノ酸配列を合成することによって構築され得る。D−Retro−Inverso型エナンチオマーペプチド(例えば、本発明の融合ペプチドの成分)において、各α炭素でのカルボニル基およびアミノ基の位置が交換されており、各α炭素の側鎖基の位置が保存されている。Retro−Inverso型ペプチドは、本発明の融合ペプチドの成分として使用される場合、種々の有用な特定を有している。例えば、これらのペプチドは、細胞へより効率的に侵入し、(特にインビボにて)より安定であり、対応するL−ペプチドよりも低い免疫原性を示す。対照的に、ほとんど全ての分解酵素(例えばプロテアーゼまたはペプチダーゼ)は、隣接するL−アミノ酸の間でペプチド結合を切断する。よって、本発明の融合ペプチドは、特に成分(II)について、そして必要に応じて成分(I)について、Retro−Inversoな順序でのD−エナンチオマーアミノ酸から構成され、タンパク質分解性の崩壊に対して大いに耐性である。
D−エナンチオマーアミノ酸を有する、上述した本発明の融合ペプチドの成分の調製は、対応する、天然に存在するL−型アミノ酸配列の逆のアミノ酸配列を化学的に合成するか、あるいは当業者に公知の任意の他の適切な方法によって達成され得る。この合成は、好ましくは、所望のRetro−Inverso配列にDアミノ酸を連結する固相合成によって行われる。使用されるDアミノ酸およびRetro−Inversoな順序でのアミノ酸の合成とは異なり、本発明のDアミノ酸配列の固相合成は、Lアミノ酸に基づくペプチドの合成と化学的には同一である。任意の所望のDNA配列の構築のための一般的な方法は、例えば、Brown J. et al. (1979), Methods in Enzymology, 68: 109; Sambrook J, Maniatis T (1989) (前出)に提供される。
あるいは、本発明の融合ペプチドのD−Retro−Inverso−エナンチオマー型またはその成分は、本発明の融合ペプチドのL型またはその成分を、D−Retro−Inverso−エナンチオマー型の化学合成のマトリクスとして使用する、上述したような化学合成を使用して調整され得る。
上述したような本発明の融合ペプチドの成分(II)は、ニューロン性N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)のNMDAR相互作用タンパク質(例えば、結合タンパク質(例えば、PSD−95)、ニューロン性タンパク質など)との相互作用を阻害し得る任意のペプチドより選択される。このようなペプチドは、典型的には、NMDAR相互作用タンパク質をトラップし、その結果、NMDAレセプターとこれらのタンパク質との相互作用を阻害する。あるいはその逆も同様である。さらに、これらのペプチドは、NMDAレセプターをブロックせず、その結果、NMDAレセプターのブロックに関連する不利益を回避する。より詳細には、上述したような本発明の融合ペプチドの成分(II)は、NMDARの相互作用ドメイン(例えばNR2のC末端PDZ相互作用ドメイン)を模倣することによって、あるいは、結合タンパク質の相互作用ドメイン(例えば、PSD−95のPDZ1ドメイン)を模倣することによって、NMDARとその結合タンパク質との間の相互作用(例えば、PSD−95−NR2相互作用)を破壊するように設計された任意のペプチドより選択される。本発明の融合ペプチドの成分(II)として適切なペプチドは、NMDAレセプターサブユニットNR1およびNR2より選択され得るが、これらに限定されない。N−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA)レセプターのNR1サブユニットおよびNR2サブユニットは異なる遺伝子によってコードされる。ラット脳において、NR1サブユニットのC末端バリアント4つ(NR1−1〜NR1−4)は、単一の遺伝子によってコードされ、C1およびC2のエクソンカセットの選択的スプライシングによって生成されるが、4つの異なる遺伝子が、NR2サブユニット(NR2A〜D)をコードする。機能的NMDAレセプターは、NR1バリアントと種々のNR2サブユニットのヘテロ多量体アセンブリを生じる。NR2Bサブユニットは、シナプス後肥厚タンパク質95(PSD−95)、SAP97など、および膜結合グアニル酸様キナーゼ(MAGUK)ファミリータンパク質のメンバーと相互作用する。この相互作用は、NR2BサブユニットのC末端tSXnV細胞内モチーフと、PSD−95タンパク質およびSAP97タンパク質のN末端PDZ(PSD−95、discs−large、ZO−1)ドメインとの結合を介して生じる。NR1−3とNR1−4の両方もまた、連続するC末端tSXnVモチーフを示す。よって、本発明の融合ペプチドの成分(II)として使用されるペプチドは、tSXnVモチーフを含むペプチドより選択され得、ここで、Sはセリンであり、Xnは任意のアミノ酸(nは少なくとも1、2、3、4、5などである)であり、Vはバリンである。特に好ましくは、本発明の融合ペプチドの成分(II9として使用されるペプチドは、NMDARに由来しかつシナプス後肥厚−95タンパク質、PSD−95、PSD−93、またはSAP102に結合し得るペプチド、より詳細には、PDZ結合ドメイン(例えばPDZ2ドメイン含有ポリペプチド(好ましくはPSD−95の残基65〜248に対応し、PSD−95の第1および第2のPDZドメイン(PDZ1〜2)をコードする。))を結合するペプチドより選択され得る。典型的には、本発明の融合ペプチドの成分(II)として使用されるこのようなペプチドは、5〜40アミノ酸長を含み、好ましくは、5〜30アミノ酸長もしくは5〜20アミノ酸長、より好ましくは、5〜15アミノ酸長または5〜10アミノ酸長を含む。さらにより好ましくは、本発明の融合ペプチドの成分(II)として適切なペプチドは、D−エナンチオマーアミノ酸配列vdseisslk(配列番号31)、または配列番号31に記載の配列と約60、70、80、90、95、99%の配列同一性を示す配列を含む配列より選択され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「配列同一性」は、配列が以下のように比較されることが意図される。2つのアミノ酸配列の同一性%を決定するために、これらの配列が最適な組成目的のために整列され得る(例えば、ギャップが第1のアミノ酸配列中に導入され得る。)。対応するアミノ酸位でのアミノ酸は、次いで比較され得る。第1の配列中の位置が第2の配列中の対応する位置で同一のアミノ酸に占められている場合、これらの分子はその位置で同一である。2つの配列間での同一性%は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の機能である。例えば、特定のペプチドが規定された長さの参照ポリペプチドに対して特定の同一性%を有しているといわれる場合、同一性%は参照ペプチドに関連する。よって、100アミノ酸長である参照ポリペプチドに対して50%同一であるペプチドは、参照ポリペプチドの50アミノ酸長部分に完全に同一である50アミノ酸ポリペプチドであり得る。また、参照ポリペプチドの全長にわたって50%同一な100アミノ酸長のポリペプチドでもあり得る。よって、特定の同一性%を有しているといわれる特定のペプチドが、例えば、成分(I)について明確に示した(例えば配列番号1〜29の何れかに記載の)ペプチド、成分(II)について明確に示した(例えば配列番号31に記載の)ペプチド、あるいはその全長融合ペプチドについて例えば配列番号33および35に示したペプチドより選択されるが、これらに限定されない。もちろん、他のポリペプチドも同一の基準を満たす。2つの配列の同一性%のこのような決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。2つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの、好ましい、非限定的な例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、NBLASTプログラムに組み込まれており、これは、本発明のアミノ酸配列に対して所望の同一性を有する配列を同定するために使用され得る。Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402に記載されているようなギャップBLASTが、利用され得る。BLASTプログラムおよびギャップBLASTプログラムを利用する際に、個々のプログラム(例えばNBLAST)のデフォルトパラメータが使用され得る。配列はさらに、Version 9 of the Genetic Computing Group's GAP (global alignment program)を使用して、デフォルト(BLOSUM62)マトリクス(バリュー−4〜11)を、(ギャップの第一のヌルに対する)−12のギャップオープンペナルティ、および(ギャップにおけるさらなる連続的なヌルごとあたり)−4のギャップエクテンションペナルティにて使用して整列され得る。整列後、要求された配列におけるアミノ酸数のパーセントとしてマッチ数を示すことによって同一性%が算出される。2つのアミノ酸配列の同一性%の決定のために記載された方法は、核酸配列に対応して適用され得る。
上述したような本発明の融合ペプチドの成分(II)は、全体がD−エナンチオマーアミノ酸、すなわち、上述したようなRetro−Inversoな順序でD−アミノ酸を含んでいるアミノ酸配列から構成され、上述したように調製され得る。本発明の融合ペプチドの成分(II)に使用されるようなRetro−Inversoペプチドは、成分(II)についてすでに上述しているような種々の有用な特性(例えば、この成分のタンパク質分解性崩壊を欠くことに起因した、本発明の融合ペプチドの部分を形成する成分の、より長いバイオアベイラビリティなど)を有している。
本発明の融合ペプチドの成分(I)および(II)の両方が直接的にかまたはリンカーを介して連結され得る。本明細書中において、「リンカー」は、好ましくはオリゴペプチドまたはポリペプチドであり、上記のように成分(I)および(II)を連結するために使用され得る。好ましくは、リンカーは、1〜10アミノ酸長を有しており、より好ましくは、1〜5アミノ酸長を有しており、最も好ましくは、1〜3アミノ酸長を有している。有利には、リンカーは、二次構造を形成させる任意の特性を有していない。すなわち、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成する傾向はない。例えば、リンカーは、少なくとも35%のグリシン残基から構成される。リンカーは、典型的には、例えば、GG、GGG、GGGG、GGGGGなどの全てグリシンからなる配列であり得る。細胞内の(内因性の)切断可能なオリゴペプチド配列またはポリペプチド配列をリンカーとして使用することによって、標的細胞へ送達した後に成分(II)を成分(I)から分離することができる。切断可能なオリゴペプチド配列またはポリペプチド配列はまた、本明細書において、プロテアーゼで切断可能なオリゴペプチド配列またはポリペプチド配列が挙げられ、ここで、プロテアーゼ切断可能な部位は、典型的には、処置される細胞によって内因性に発現されているプロテアーゼに依存して選択される。上記のようなリンカーは、オリゴペプチド配列またはポリペプチド配列として存在する場合、D−アミノ酸または天然の存在するアミノ酸(すなわちL−アミノ酸)の何れかから構成され得る。上記の代替として、本発明の融合ペプチドの成分(I)および(II)の結合は、結合剤または複合体化剤(例えば、架橋試薬)を介して達成され得る。利用可能な分子間架橋試薬がいくつか存在する。例えば、Means and Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp. 39-43参照。これらの試薬としては、例えば、N−スクシニミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)またはN,N’−(1,3−フェニレン)ビスマレイミド;N,N’−エチレン−ビス−(イオドアセタミド)または6〜11個のメチレン基を有する他の試薬;および1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼンが挙げられる。本目的に有用な他の架橋試薬としては、p,p’−ジフルオロ−m,m’−ジニトロジフェニルスルホン;ジメチルアジピミデート;フェノール−1,4−ジスルホニルクロリド;ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネート、あるいはアゾフェニル−p−ジイソシアネート;グルタルアルデヒドおよびジスジアゾベンジジンが挙げられる。架橋試薬は、ホモ二官能性であり得る。すなわち、同一の反応を行う2つの官能基を有していてもよい。好ましいホモ二官能性の課教師役は、ビスマレイミドヘキサン(BMH)である。BMHは、マレイミド官能基を2つ含んでいる。これは、穏やかな条件(pH6.5〜7.7)においてスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。2つのマレイミド官能基は、炭化水素鎖によって連結されている。よって、BMHは、システイン残基を含むタンパク質(またはポリペプチド)の不可逆的な架橋に有用である。架橋試薬はまた、ヘテロ二官能性であり得る。ヘテロ二官能性の架橋試薬は、異なる2つの官能基(例えば、アミノ反応性基およびチオール反応性基)を有しており、それぞれ遊離アミンおよび遊離チオールを有する2つのタンパク質を架橋する。ヘテロ二官能性の架橋試薬の例としては、スクシニミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシニミドエステル(MBS)、およびスクシニミド4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)(MBSの伸張鎖アナログ)が挙げられる。一級アミンを有するこれらの架橋試薬のスクシニミジル基、およびチオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。架橋試薬はしばしば水溶性が低いので、親水性部分(例えば、スルホネート基)が、架橋試薬に添加されてその水溶性を改善し得る。sulfo−MBSおよびsulfo−SMCCは、水溶性について改変された架橋試薬の例である。多くの架橋試薬が、細胞内条件下で実質的には切断されない複合体を生成する。よって、いくつかの架橋試薬は、細胞内条件下で切断可能な共有結合(例えばジスルフィド)を含んでいる。例えば、Traut試薬、ジチオニス(スクシニミジルプロピオネート)(DSP)およびN−スクシニミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)が、切断可能な架橋リンカー(cross−linker)としてよく知られている。切断可能な架橋試薬は、標的細胞への送達の後に、この細胞が架橋リンカー試薬の特定の配列を切断し得る場合に、成分(I)からの成分(II)の分離を可能にする。この目的のために、直接的なジスルフィド結合もまた、有用であり得る。化学的な架橋はまた、スペーサーアームの使用を含み得る。スペーサーアームは、細胞内可撓性を提供するか、または複合体化した部分の間の細胞内での距離を調整し、これにより、生物学的活性の維持を補助し得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸(例えば、プロリン)を含むタンパク質(またはポリペプチド)部分の形態であり得る。あるいは、スペーサーアームは、架橋試薬の一部(例えば、「長鎖SPDP」(Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., cat. No. 21651 H)であり得る。多数の架橋試薬(上記下ものを含む。)は市販されている。それらの使用のための詳細な指示書が供給業者から容易に利用可能である。タンパク質架橋および複合体調製についての一般的な参考文献は、Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991)である。
上記したような本発明の融合ペプチドは、必要に応じて、さらなる成分(III)を含み得る。このような成分(III)は、好ましくは、合成の後の、融合ペプチド精製のためのタグである。本明細書において、「精製のためのタグ」は、リコンビナントタンパク質の精製に好適な任意の種々のタグ(例えば、6ヒスチジンタグ(hisタグ、ポリヒスチジンタグ)、ストレプトアビジンタグ(strepタグ)、SBPタグ(ストレプトアビジン結合タグ)、GST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)タグ、ダンシルタグなど)、あるいは抗体エピトープ(抗体結合タグ)(例えば、mycタグ、Swa11エピトープ、FLAGタグなど)であり得る。上述したタグは、好ましくは、成分(I)、(II)、必要に応じて成分(III)から構成される、上述したような(完全な)融合ペプチドのC末端に位置される。例えば、上述したように、タグは、好ましくは、成分(I)が融合ペプチドのC末端に位置される場合、成分(I)のC末端に位置され、より好ましくは、成分(II)が融合ペプチドのC末端に位置される場合、成分(II)のC末端に位置される。さらに、上述したように、成分(III)は、好ましくは、成分(I)または(II)の生物学的機能性(例えば、本発明の融合ペプチドを細胞膜透過させる成分(I)の能力、およびNMDARとNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を阻害する成分(II)の能力)を干渉しないように選択される。よって、かさばらないタグ(例えば、6ヒスチジンタグ、ストレプトアビジンタグ(strepタグ)、SBPタグ(ストレプトアビジン結合タグ)、または抗体エピトープ(例えば、mycタグ、Swa11エピトープ、FLAGタグなど)が、成分(III)として好ましく選択される。
さらに、上記のような成分(III)は、オリゴペプチドまたはポリペプチドとして存在する場合、上記のようなDアミノ酸または天然に存在するアミノ酸(すなわちLアミノ酸)の何れかから構成され得る。よって、融合ペプチド全体は、成分(I)、(II)、必要に応じて成分(III)、および上記したようなリンカーを含み、上記したようなDアミノ酸から構成され得る。本発明の融合ペプチド全長が、成分(I)、(II)、必要に応じて成分(III)、および上記したようなリンカーを含み、上記したようなDアミノ酸から構成され得る場合、融合ペプチドは全体として、本発明の融合ペプチドのD−エナンチオマー成分のために、例えば、化学合成法または任意の他の適切な方法を使用して上記したように調製され得る。
一般に、上記したような本発明の融合ペプチドの成分(I)、(II)、必要に応じて成分(III)は、適切に配列され得る。すなわち、本発明の融合ペプチドにおいて整列される場合、任意の順番において、成分(I)が、形質膜を超えるように本発明の融合ペプチドを指向することを可能にする。さらに、成分(II)は、N−メチル−D−アスパラギン酸レセプターとNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を阻害し得る。好ましい実施形態において、成分(I)は、本発明の融合ペプチドのN末端に位置され、成分(II)は、本発明の融合ペプチドのC末端に位置される。さらに、上記のような成分(III)が本発明の融合ペプチドに含まれる場合、成分(III)は、本発明の融合ペプチド全体のまさにC末端に位置され得る。よって、本発明の融合ペプチドの好ましい配列は、N末端からC末端へ、成分(I)、成分(II)、必要に応じて成分(III)を示し得る。しかし、他の整列(例えば、N末端からC末端へ、成分(II)、成分(I)、必要に応じて成分(III))もまた選択され得る。好適には、上述したように、リンカーが、成分(I)と成分(II)との間に挿入され得る。
本発明の融合ペプチドはまた、上記のような成分(I)および/または成分(II)の「誘導体」を含み得る。本発明における成分(I)および/または(II)の誘導体は、アミノ酸配列の1つ以上の部位で1つ以上のアミノ酸が置換されることによって、天然に存在する配列の任意の部位で1つ以上のアミノ酸が欠失されることによって、および/または天然に存在するペプチド配列の1つ以上の部位で1つ以上のアミノ酸が挿入されることによって、上記のような成分(I)または成分(II)の天然に存在する(Lアミノ酸)配列に由来した、成分(I)または(II)の配列を意味することが意図される。「誘導体」は、本発明の融合ペプチドの成分(I)または(II)として使用される場合、それらの生物学的活性を維持している。例えば、成分(I)の誘導体は、上述したように、本発明の融合ペプチドを細胞質内へ、さらには特定の細胞内での位置へ指向し得、成分(II)の誘導体は、ニューロンのN−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)とNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を阻害し得る。本明細書において、誘導体はまた、上述したように、L−アミノ酸配列またはD−アミノ酸配列、あるいはその両方の形態で生じ得る。
アミノ酸の置換が、本発明の融合ペプチドの成分(I)および/または成分(II)の誘導体の調製のために行われ、保存的(アミノ酸)置換が好ましい。保存的(アミノ酸)置換としては、典型的には、以下の群に含まれる置換が挙げられる:グリシンおよびアラニン;バリン、イソロイシンおよびロイシン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギンおよびグルタミン;セリンおよびトレオニン;リジンおよびアルギニン;ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。よって、好ましい保存的置換の群は、アスパラギン酸−グルタミン酸;アスパラギン−グルタミン;バリン−ロイシン−イソロイシン;アラニン−バリン;フェニルアラニン−チロシンおよびリジン−アルギニンである。このような変異によって、例えば、本発明の融合ペプチドの成分(I)および(II)の安定性および/または効果が増強され得る。本発明の融合ペプチドの成分(I)および(II)に変異が導入される場合、これらの成分(I)および(II)は、例えば、配列において、機能において、および抗原性特性または他の機能において、対応する親配列を有するタンパク質と(機能的な)相同性を維持する。本発明の融合ペプチドのこのように変異された成分(I)および(II)は、改変された特性を有し得、特定の適用(例えば、増加したpH最適性、増加した温度安定性など)に対して、改変されていない成分(I)oyobi(II)の配列よりも有利であり得る。
本発明の融合ペプチドの成分(I)の誘導体または成分(II)の誘導体は、それぞれ上記のような本発明の融合ペプチドの、成分(I)または成分(II)の修飾されていない配列(例えば、成分(I)として使用される場合のHIV TATタンパク質転座配列)と実質的同一性を有している。特に好ましくは、天然に存在するアナログに対して、
少なくとも30%の配列同一性を有しているアミノ酸配列であり、好ましくは、少なくとも50%の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも60%の配列同一性、より好ましくは、少なくとも75%の配列同一性、よりさらに好ましくは、少なくとも80%の配列同一性、なおさらに好ましくは、少なくとも90%の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも95%または99%以上の配列同一性を有しているアミノ酸配列である。本発明の融合ペプチドの成分(I)および(II)の機能的な誘導体の合成または単離、ならびに2つのアミノ酸配列の同一性%の決定のために適切な方法は、上述したとおりである。さらに、上記のように、本発明の融合ペプチドの成分(I)および(II)の誘導体の生産法は周知であり、そして当業者に周知の標準法(Sambrook J, Maniatis T (1989)、前出)が実施され得る。
少なくとも30%の配列同一性を有しているアミノ酸配列であり、好ましくは、少なくとも50%の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも60%の配列同一性、より好ましくは、少なくとも75%の配列同一性、よりさらに好ましくは、少なくとも80%の配列同一性、なおさらに好ましくは、少なくとも90%の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも95%または99%以上の配列同一性を有しているアミノ酸配列である。本発明の融合ペプチドの成分(I)および(II)の機能的な誘導体の合成または単離、ならびに2つのアミノ酸配列の同一性%の決定のために適切な方法は、上述したとおりである。さらに、上記のように、本発明の融合ペプチドの成分(I)および(II)の誘導体の生産法は周知であり、そして当業者に周知の標準法(Sambrook J, Maniatis T (1989)、前出)が実施され得る。
さらなる実施形態として、本発明は、上記のような本発明の融合ペプチドを含む薬学的組成物を提供する。このような薬学的組成物は、上記のような成分(I)、(II)、必要に応じて成分(III)、および任意のリンカーを有する本発明の融合ペプチドを含む。さらに、このような薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルを含み得る。本発明における「薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクル」は、処方された際に、本発明の融合ペプチドの薬学的活性を破壊しない、非毒性のキャリア、アジュバント、またはビヒクルをいう。本発明の薬学的組成物において使用され得る薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レクチン、血清タンパク質(例えば、ヒト結成アルブミン)、緩衝化物質(例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム)、植物性の飽和脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、塩、または電解質(例えば、硫酸プロ多民、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム)、亜鉛塩、シリカコロイド、マグネシウム三シリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂。
本発明の薬学的組成物は、経口的に、非経口的に(吸入スプレーによって、局所的に、経直腸にて、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、または移植容器を介して)投与され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「非経口」としては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、基質内、髄膜内、肝臓内、病変内および頭蓋内への注射技術または注入技術が挙げられる。好ましくは、薬学的組成物は、経口的に、腹腔内へまたは静脈内へ投与される。本発明の薬学的組成物の滅菌された注入可能な形態は水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて当該分野で公知の技術に従って処方され得る。滅菌された注入可能な調製物はまた、非毒性の非経口受容可能な希釈剤または溶剤(例えば、1,3−ブタンジオール)中の、滅菌された注入可能な溶液または懸濁液であり得る。利用可能である受容可能なビヒクルおよび溶剤は水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌された不揮発性油が、溶剤または懸濁媒体として慣用的に利用されている。
本目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油が使用され得る。天然の薬学的に受容可能な油(例えば、オリーブ油またはカストロール油)と同様に、脂肪酸(例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体(特にこれらのポリオキシエチル化型))は、注入可能な調製物に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈物または分散物(例えば、カルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤)を含み得る。これは薬学的に受容可能な投薬形態(エマルジョンおよび懸濁物を含む。)の処方物に一般に使用されている。一般的に使用される他の界面活性剤(例えば、Tween、Spansおよび他の乳化剤)、または薬学的に受容可能な固体、液体または他の投薬形態の製造に一般に使用されるバイオアベイラビリティ増強剤(enhancer)もまた、処方物の目的に使用され得る。
本明細書中において、薬学的に受容可能な組成物は、任意の経口受容可能な投薬形態(カプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液が挙げられるが、これらに限定されない。)で経口的に投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用されるキャリアとしては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム)もまた、典型的に添加される。カプセル形態での経口投与のために有用な希釈材としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口使用に求められる場合、活性成分が、潤滑剤および懸濁剤と組み合わされる。所望されるならば、特定の甘味料、香料または着色剤もまた添加され得る。
あるいは、上記のような本発明の薬学的組成物は、直腸投与のための座剤の形態で投与され得る。このような座剤は、薬剤を、室温では固体であるが直腸温で液体になり、これにより、直腸で薬物を放出するために溶解する適切な無刺激の賦形剤と混合されることによって調製され得る。このような材料としては、ココアバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
本明細書中で規定される、本発明の薬学的組成物はまた、特に、処置の標的が局所適用に容易に受容可能な領域および器官(目、皮膚、または下部腸管)を含む場合、局所的に投与され得る。適切な局所的処方物は、これらの領域または器官の各々のために容易に調製される。
下部腸管のための局所適用は、直腸への座剤形態(上記参照)または適切な浣腸形態でもたらされ得る。局所的経皮パッチもまた使用され得る。
局所適用のために、上記のような本発明の薬学的組成物は、1つ以上のキャリアに懸濁または溶解された、上記のような本発明の融合ペプチドを含む適切な軟膏に処方され得る。本発明の融合ペプチドの局所投与のためのキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:鉱油、液体ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水。あるいは、上記のような本発明の薬学的組成物は、1つ以上の薬学的に受容可能なキャリアに懸濁または溶解された、本発明の融合ペプチドを含む適切なローションまたはクリームに処方され得る。適切なキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:鉱油、ソルビタン一ステアリン酸、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
眼用途のために、本発明の薬学的組成物は、等張性の、pH調整された滅菌生理食塩水中の微粉懸濁液、または好ましくは、防腐剤(例えばベンジルアルコニウムクロリド)を含むかまたは含まない、等張性の、pH調整された滅菌生理食塩水中の溶液として処方され得る。あるいは、眼用途のために、薬学的に受容可能な組成物は、軟膏(例えば、ペトロラタム)中に処方され得る。
上記のような本発明の薬学的組成物はまた、鼻内エアロゾルまたは吸入器によって投与され得る。このような組成物は、薬学的処方物の技術分野において周知の技術に従って調製され得、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを増強する吸収プロモータ、フルオロカーボン、および/または他の慣用的な可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
最も好ましくは、本発明において、薬学的に受容可能な組成物は、経口投与または非経口投与(例えば注射によって)のために処方される。
処置目的のために、非毒性の、損傷を低減する、有効量の本発明の融合ペプチドが、上記のような本発明の薬学的組成物の調製のために使用され得る。よって、本発明の融合ペプチドの量は、上記のような組成物を生産するために、キャリア材料と結合され得る。本発明の薬学的組成物は、典型的には、単一(または複数の)投与形態にて調製され得る。これは、処置されるホストおよび投与の特定の様式に依存して変更される。通常、本発明の薬学的組成物は、0.001〜100mg/kg体重/日の間の、投薬あたりの投与量範囲が、本発明の薬学的組成物を受ける患者に投与され得るように処方される。好ましい投薬あたりの投与量範囲は、0.01〜50mg/kg体重/日を変動し、さらに好ましい投薬あたりの投与量範囲は、0.1〜25mg/kg体重/日を変動する。しかし、上述したような投与量範囲および処置レジメンは、種々の因子(使用される本発明の融合ペプチドの比活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、排出速度、薬物の組合せ、処置する臨床医の判断、および処置されるべき特定疾患の重篤度)に依存して、任意の特定の患者に好適に適合され得る。本明細書において、投与は、初期投薬量範囲で行われ得、これは、例えば、上記の範囲内の初期投薬量範囲を増加または減少することによって、処置時間にわたって変化し得る。例えば、投薬量範囲が処置の種々のセクションの間で適合(増加または減少)されるが単一のセクション内では一定に保たれる場合、両方の投与形態が、さらに組み合わされ、その結果、種々のセクションでの投薬量範囲は互いに異なる。
本発明の薬学的組成物は、本明細書中に開示されたような哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果に関する疾患の処置、改善または予防のために使用され得る。上記疾患としては、特に、脳卒中または脊髄傷害、脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害、および中枢神経系(CNS)ニューロンに対する損傷が挙げられ、急性のCNS傷害、虚血性の脳卒中または脊髄傷害、ならびに無酸素症、虚血、機械的傷害、神経障害性の痛み(特にPSD−95および/またはNMDAR相互作用に関連する痛み)などを含む。さらに、本発明の薬学的組成物は、興奮毒性および虚血性の傷害、興奮毒性損傷、神経栄養性の支持の欠落などに対する神経保護作用またはこれらの処置を提供するために使用され得る。本明細書において、興奮毒性は、脳卒中、外傷性傷害、および中枢神経系(CNS)の神経変性疾患(例えば、本明細書において処置され得る多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、線維筋肉痛、パーキンソン病およびハンチントン病)に特に関与し得る。ニューロン周辺に過剰なグルタミン酸濃度を引き起こす他の一般的な状態であり本明細書において処置されるものは、低血糖症および癇癪重積症/網膜神経節細胞の変質などである。
上記のような哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果に関する疾患ならびに本明細書中にて言及したようなさらなる疾患または障害の処置、改善または予防は、典型的には、上述した投薬量範囲でおおよそ規定された本発明の薬学的組成物を投与することによって行われる。本発明の薬学的組成物の投与は、興奮毒性および/または(虚血性)脳損傷(すなわち、哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果)の開始前、あるいはこれらと同時または引き続いて行われ得る。例えば、本発明の薬学的組成物の投与は、脳卒中または脊髄傷害、脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害、および一般に中枢神経系(CNS)ニューロンに対する損傷の、1時間まで(0〜1時間)、2時間まで、3〜5時間まで、あるいは24時間以上経過した後に行われ得る。
本発明はさらに、少なくとも1つ以上の上記処方物中の、上記の本発明の薬学的組成物(1つ以上のキャリア中の)、および本発明の薬学的組成物の適用に関する指示および/または情報に関する指示マニュアルまたは情報カタログを備えているキットを提供する。
本明細書の開示は、本発明の特定の好ましい実施形態を記載しかつ例証しているが、本発明が特定の実施形態に限定されないことは理解されるべきである。さらに、本発明は、本明細書中に記載および例証された特定の実施形態および特徴の機能的または機械的な等価物である実施形態の全てを含む。
(図面の記載)
添付の図面は、本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに例証することが意図される。
添付の図面は、本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに例証することが意図される。
図1は、20μM NMDAの存在下での、配列番号32および33(特定には、TAT−NR2B9cペプチドのL型(L−TAT−L−NR2B9c配列YGRKKRRQRRR−KLSSIESDV(配列番号32);US20030050243と同一)対そのD型(D−TAT−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrqrrkkrgy(配列番号33))に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す。本実験において(および以下の実験において)、NMDAレセプターと相互作用することによって細胞死を阻害し得るペプチドの添加と平行して細胞死の割合を測定した。図1に示されるように、任意の単一の実験において、配列番号33に記載のD−TAT−D−NR2B9cは、配列番号32に記載のL−TAT−L−NR2B9c(比較化合物)に対して、少なくとも等価な、しかし優勢に顕著に増加された効果、すなわち、ニューロン細胞の顕著に低減された細胞死の割合(%)を示した。図1において、*はP<0.05を示し、@はP<0.07を示す(対t検定;ペプチド処理したニューロンのコントロールニューロンとの比較)。特に、D−TAT−D−NR2B9cは、ペプチドインキュベーションとNMDA添加との間のギャップが≧8時間である場合に、その陽性効果を示した。このことは、D型の延長された薬学的活性を示す。最も効果的な治療ウインドウを、4時間〜48時間(特に8〜24時間)の間で観察した。
図2は、40μM NMDAの存在下での、配列番号32および33(特定には、TAT−NR2B9cペプチドのL型(L−TAT−L−NR2B9c配列YGRKKRRQRRR−KLSSIESDV(配列番号32);US20030050243と同一)対そのD型(D−TAT−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrqrrkkrgyin(配列番号33))に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す。図2に示されるように、任意の単一の実験において、配列番号33に記載のD−TAT−D−NR2B9cは、配列番号32に記載のL−TAT−L−NR2B9c(比較化合物)に対して、少なくとも等価な、しかし優勢に顕著に増加された効果、すなわち、ニューロン細胞の顕著に低減された細胞死の割合(%)を示した。図2において、*はP<0.05を示し、@はP<0.07を示す(対t検定;ペプチド処理したニューロンのコントロールニューロンとの比較)。時間ウインドウが24時間未満の場合に、本発明の融合ペプチドの顕著に陽性な効果が明らかになった。
図3は、20μM NMDAの存在下での、配列番号34および35(特定には、(Arg)8−NR2B9cペプチドのL型(L−(Arg)8−L−NR2B9c配列RRRRRRRR−KLSSIESDV(配列番号34))対そのD型(D−(Arg)8−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrrrrrr(配列番号35))に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す。図3に示されるように、任意の単一の実験において、配列番号35に記載のD−(Arg)8−D−NR2B9cは、配列番号34に記載のL−(Arg)8−L−NR2B9c(比較化合物)に対して、少なくとも等価な、しかし優勢に顕著に増加された効果、すなわち、ニューロン細胞の顕著に低減された細胞死の割合(%)を示した。図3において、*はP<0.05を示し、@はP<0.07を示す(対t検定;ペプチド処理したニューロンのコントロールニューロンとの比較)。
図4は、40μM NMDAの存在下での、配列番号34および35(特定には、(Arg)8−NR2B9cペプチドのL型(L−(Arg)8−L−NR2B9c配列RRRRRRRR−KLSSIESDV(配列番号34))対そのD型(D−(Arg)8−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrrrrrr(配列番号35))に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す。図4に示されるように、8時間までの任意の単一の実験において、配列番号35に記載のD−(Arg)8−D−NR2B9cは、配列番号34に記載のL−(Arg)8−L−NR2B9c(比較化合物)に対して、少なくとも等価な、しかし優勢に顕著に増加された効果、すなわち、ニューロン細胞の顕著に低減された細胞死の割合(%)を示した。図4において、*はP<0.05を示し、@はP<0.07を示す(対t検定;ペプチド処理したニューロンのコントロールニューロンとの比較)。
(実施例)
以下の実施例は、本発明の範囲をこれらの実施例に限定することなく本発明をさらに例証することが意図される。
以下の実施例は、本発明の範囲をこれらの実施例に限定することなく本発明をさらに例証することが意図される。
(実施例1:融合ペプチドの合成)
TAT−NR2B9Cペプチドを、標準的な手順に従って、MBHA樹脂(Novabiochem, Merck)上にNα−BocケミストリーSPPSによって手動で合成した。全てのカップリングを、TNBSAカラー試験によってモニタリングした。ペプチドを切断し、同時に、適切なスカベンジャーとともに90%HFを用いて0℃で1時間処理することによって、樹脂から脱保護した。粗ペプチドを、20%水性酢酸溶液に取り出し、二重の蒸留水で5%酢酸溶液に希釈し、残存するスカベンジャーを、ジエチルエステル洗浄によって抽出した。次いで、ペプチドを含む溶液を凍結して酢酸を除去した。ペプチドL/D−NR289Cを、Atlantis (Waters) dC18 カラム(流速15mL/分で45分間にわたる15〜45%の緩衝液B)での予備RP−HPLCによって精製し、ESI−MSによって特徴付けた。
TAT−NR2B9Cペプチドを、標準的な手順に従って、MBHA樹脂(Novabiochem, Merck)上にNα−BocケミストリーSPPSによって手動で合成した。全てのカップリングを、TNBSAカラー試験によってモニタリングした。ペプチドを切断し、同時に、適切なスカベンジャーとともに90%HFを用いて0℃で1時間処理することによって、樹脂から脱保護した。粗ペプチドを、20%水性酢酸溶液に取り出し、二重の蒸留水で5%酢酸溶液に希釈し、残存するスカベンジャーを、ジエチルエステル洗浄によって抽出した。次いで、ペプチドを含む溶液を凍結して酢酸を除去した。ペプチドL/D−NR289Cを、Atlantis (Waters) dC18 カラム(流速15mL/分で45分間にわたる15〜45%の緩衝液B)での予備RP−HPLCによって精製し、ESI−MSによって特徴付けた。
(Arg)8−NR2B9Cペプチドを手動で合成した。Novabiochem からのFmoc-Val-NovaSyn TGA 樹脂にてFmocストラテジーを用いる固相支持体上で合成を行った(ローディング0.22mmol/g)。ACTロボットにて、145μmolに対応するウェルにて、4等量のアミノ酸、4等量のカップリング試薬HOBtおよび4等量のDIPCDIを用いて、合成を行った。合成の要求に起因して、二重カップリングを3アミノ酸ごとに行った。
・4等量のアミノ酸、4等量のHOBtおよび4等量のDIPCDIとの第1のカップリング
・4等量のアミノ酸、4等量のHATUおよび4等量のDIEAとの第2のカップリング。
・4等量のアミノ酸、4等量のHOBtおよび4等量のDIPCDIとの第1のカップリング
・4等量のアミノ酸、4等量のHATUおよび4等量のDIEAとの第2のカップリング。
各カップリングの後、DMF中10%酢酸無水物を用いてキャッピング工程を行った(15分間)。脱保護工程を、DMF中20%ピペリジンを用いて行った(20分間)。部位「n」でのFmocを、合成の終了まで維持した。切断を、スカベンジャーの存在下で86%TFA溶液中にて行った。ペプチドをエーテル中に沈降させた。次いで、60分間で0〜60%の勾配のアセトニトリルを用いて、ペプチドをC−18逆相カラムにて精製した。ペプチド結合について220nm、Fmoc保護について300nmのUV照射を用いた。続いて、ペプチドを、Fmoc保護基とともに凍結した。Fmoc保護基はDEAの20棟梁溶液での処理によって後に除去された。次いで、ペプチドを、凍結前に(上記と同じ条件を用いて)再度精製し、分析し、そして引き続く実験に用いた。
(実施例2:興奮毒性損傷に接したTAT−NR2B9cによって生成される神経保護の持続の試験)
(プロトコル)
ラット大脳皮質ニューロンをE21ラットより取り出し、Neurobasal-A mediumおよびB-27 supplement(いずれもInvitrogen)、1mMグルタミン、および50ユニット/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン中で,7〜9日間インビトロで培養した。
1.化合物の曝露前の種々の時点で、ニューロンをNeurobasal-Aベースの培養培地から取り出し、「トランスフェクション培地」((TM; Bading et al. (1993), Science 260, 181-186):10%(Earles salt を含むがL−グルタミンを含まないMinimum Essential Medium, Invitrogen (21090022))、90%塩−グルコース−グリシン(SGG)培地SGG、114mM NaCl,0.219% NaHCO3,5.292mM KCl,1mM MgCl2,2mM CaCl2,10mM HEPES,1mM グリシン,30mM グルコース,0.5mM ピルビン酸ナトリウム,0.1% フェノールレッド、インスリントランスフェリンセレナイト補充物(Sigma,7.5μg インスリン/ml;7.5μg トランスフェリン/mlおよび7.5ng セレナイトナトリウム/ml));saishuu sinntouatu 325mosm/l)中に置いた。引き続く全ての工程をTM中にて行った。
2.次いで、ニューロンを、本発明のペプチドに曝露した(10μMで1時間)。用いたペプチドは、TAT−NR2B9cペプチドのL型(L−TAT−L−NR2B9c配列YGRKKRRQRRR−KLSSIESDV(配列番号32);US20030050243と同一)およびそのD型(D−TAT−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrqrrkkrgyin(配列番号33)である。
3.1時間後、ニューロンをTMで一度洗浄し、ペプチドを除去した。
4.種々の時間の後、ニューロンを、20μMまたは40μMのいずれかで1時間NMDAに曝露し、その後にニューロンをTM中に24時間置いた。
5.ニューロンを、3%パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)で染色した。染色された(pyknotic)核の数を、全体の%として計数した。実験を三連で行った。
(プロトコル)
ラット大脳皮質ニューロンをE21ラットより取り出し、Neurobasal-A mediumおよびB-27 supplement(いずれもInvitrogen)、1mMグルタミン、および50ユニット/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン中で,7〜9日間インビトロで培養した。
1.化合物の曝露前の種々の時点で、ニューロンをNeurobasal-Aベースの培養培地から取り出し、「トランスフェクション培地」((TM; Bading et al. (1993), Science 260, 181-186):10%(Earles salt を含むがL−グルタミンを含まないMinimum Essential Medium, Invitrogen (21090022))、90%塩−グルコース−グリシン(SGG)培地SGG、114mM NaCl,0.219% NaHCO3,5.292mM KCl,1mM MgCl2,2mM CaCl2,10mM HEPES,1mM グリシン,30mM グルコース,0.5mM ピルビン酸ナトリウム,0.1% フェノールレッド、インスリントランスフェリンセレナイト補充物(Sigma,7.5μg インスリン/ml;7.5μg トランスフェリン/mlおよび7.5ng セレナイトナトリウム/ml));saishuu sinntouatu 325mosm/l)中に置いた。引き続く全ての工程をTM中にて行った。
2.次いで、ニューロンを、本発明のペプチドに曝露した(10μMで1時間)。用いたペプチドは、TAT−NR2B9cペプチドのL型(L−TAT−L−NR2B9c配列YGRKKRRQRRR−KLSSIESDV(配列番号32);US20030050243と同一)およびそのD型(D−TAT−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrqrrkkrgyin(配列番号33)である。
3.1時間後、ニューロンをTMで一度洗浄し、ペプチドを除去した。
4.種々の時間の後、ニューロンを、20μMまたは40μMのいずれかで1時間NMDAに曝露し、その後にニューロンをTM中に24時間置いた。
5.ニューロンを、3%パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)で染色した。染色された(pyknotic)核の数を、全体の%として計数した。実験を三連で行った。
(結果)
D型およびL型のTAT−NR2B9c(L−TAT−L−NR2B9c配列YGRKKRRQRRR−KLSSIESDV(配列番号32);US20030050243と同一、およびそのD型(D−TAT−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrqrrkkrgyin(配列番号33))の両方が、NMDA(20μMおよび40μM)に接した際に、ペプチドの洗浄4時間後までに保護を提示した。しかし、D型による保護はより低い濃度のNMDAについて洗浄48時間時間まで延長した(図1)。このことは、D型が治療薬物としてより有望な候補であることを示している。また、40μM NMDAに接した際の24時間までの顕著な保護が提供されたが、L型で得られた神経保護は、1時間で顕著であったのみであった(図2)。
D型およびL型のTAT−NR2B9c(L−TAT−L−NR2B9c配列YGRKKRRQRRR−KLSSIESDV(配列番号32);US20030050243と同一、およびそのD型(D−TAT−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrqrrkkrgyin(配列番号33))の両方が、NMDA(20μMおよび40μM)に接した際に、ペプチドの洗浄4時間後までに保護を提示した。しかし、D型による保護はより低い濃度のNMDAについて洗浄48時間時間まで延長した(図1)。このことは、D型が治療薬物としてより有望な候補であることを示している。また、40μM NMDAに接した際の24時間までの顕著な保護が提供されたが、L型で得られた神経保護は、1時間で顕著であったのみであった(図2)。
(実施例3:興奮毒性損傷に接した(Arg)8−NR2B9cによって生成される神経保護の持続の試験)
(プロトコル)
ラット大脳皮質ニューロンをE21ラットより取り出し、Neurobasal-A mediumおよびB-27 supplement(いずれもInvitrogen)、1mMグルタミン、および50ユニット/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン中で,7〜9日間インビトロで培養した。
1.化合物の曝露前の種々の時点で、ニューロンをNeurobasal-Aベースの培養培地から取り出し、インスリン−トランスフェリン−セレナイト補充物(Sigma)を含むTM(上述)に置いた。引き続く全ての工程をTM中にて行った。
2.次いで、ニューロンを、本発明のペプチドに曝露した(10μMで1時間)。用いたペプチドは、(Arg)8−NR2B9cペプチドのD型(D−(Arg)8−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrrrrrr(配列番号35))およびそのL型(配列番号34)である。
3.1時間後、ニューロンをTMで一度洗浄し、ペプチドを除去した。
4.種々の時間の後、ニューロンを、1時間NMDAに曝露し、その後にニューロンをTM中に24時間置いた。
5.ニューロンを、3%パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)で染色した。染色された(pyknotic)核の数を、全体の%として計数した。実験を三連で行った。
(プロトコル)
ラット大脳皮質ニューロンをE21ラットより取り出し、Neurobasal-A mediumおよびB-27 supplement(いずれもInvitrogen)、1mMグルタミン、および50ユニット/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン中で,7〜9日間インビトロで培養した。
1.化合物の曝露前の種々の時点で、ニューロンをNeurobasal-Aベースの培養培地から取り出し、インスリン−トランスフェリン−セレナイト補充物(Sigma)を含むTM(上述)に置いた。引き続く全ての工程をTM中にて行った。
2.次いで、ニューロンを、本発明のペプチドに曝露した(10μMで1時間)。用いたペプチドは、(Arg)8−NR2B9cペプチドのD型(D−(Arg)8−D−NR2B9c配列vdseisslk−rrrrrrrr(配列番号35))およびそのL型(配列番号34)である。
3.1時間後、ニューロンをTMで一度洗浄し、ペプチドを除去した。
4.種々の時間の後、ニューロンを、1時間NMDAに曝露し、その後にニューロンをTM中に24時間置いた。
5.ニューロンを、3%パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)で染色した。染色された(pyknotic)核の数を、全体の%として計数した。実験を三連で行った。
(結果)
D型の(Arg)8−NR2B9c(D−(Arg)8−D−NR2B9c配列(配列番号35))は、NMDA(20μM)に接した際に、L型と比較して、ペプチドの洗浄8時間後までに保護を提示した。しかし、D型による保護はより低い濃度のNMDAについて洗浄48時間時間まで延長した(図3)。より高いNMDA濃度(40μM)では、D型はまたよりよい保護効果を示した(図4)。これらの結果は、D型が治療薬物としてより有望な候補であることを示唆している。全体的には、D−(Arg)8−D−NR2B9c配列(配列番号35)は、神経保護活性の持続がより短いにもかかわらず、D−TAT−D−NR2B9c(配列番号33)と同様に機能した。このことは、D−TATよりもD−(Arg)8の方がより著しい細胞透過能を有していることを示唆し得る。
D型の(Arg)8−NR2B9c(D−(Arg)8−D−NR2B9c配列(配列番号35))は、NMDA(20μM)に接した際に、L型と比較して、ペプチドの洗浄8時間後までに保護を提示した。しかし、D型による保護はより低い濃度のNMDAについて洗浄48時間時間まで延長した(図3)。より高いNMDA濃度(40μM)では、D型はまたよりよい保護効果を示した(図4)。これらの結果は、D型が治療薬物としてより有望な候補であることを示唆している。全体的には、D−(Arg)8−D−NR2B9c配列(配列番号35)は、神経保護活性の持続がより短いにもかかわらず、D−TAT−D−NR2B9c(配列番号33)と同様に機能した。このことは、D−TATよりもD−(Arg)8の方がより著しい細胞透過能を有していることを示唆し得る。
Claims (13)
- 少なくとも成分(I)および成分(II)を含む融合ペプチドであって、
成分(I)は、トランスポーターペプチドを含み、
成分(II)は、ニューロン性N−メチル−D−アスパラギン酸レセプター(NMDAR)とNMDAR相互作用タンパク質との相互作用を阻害するペプチドより選択され、
成分(II)は、もっぱらD−エナンチオマーアミノ酸からなる
融合ペプチド。 - 成分(I)が以下の(a)〜(c)に挙げられる細胞浸透ペプチドより選択されるか、あるいは配列WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(配列番号(SEQ ID NO:)28)を含むKALAペプチド、または配列TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(配列番号29)を含むBulforin 2より選択され得るか、あるいはDアミノ酸から構成される配列番号1〜29のRetro−Inverso型アイソマーである、請求項1に記載の融合ペプチド:
(a)以下より選択されるタンパク質伝達ドメイン(PTD)およびCPP由来タンパク質:RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号1)またはRQIKIWFQNRRMKWKK−アミド(配列番号2)を含む、Antennapedia由来の配列であるpAntp(43−58);ヒト免疫不全ウイルス1(HIV−1)、TAT、TATからの領域37〜72、領域37〜60、領域48〜60または領域49〜57に由来する配列である、配列GRKKRRQRRR(配列番号3)、YGRKKRRQRRR(配列番号4)、CGRKKRRQRRRPPQC(配列番号5)またはCGRKKRRQRRRPPQCC(配列番号6);配列LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP−NH2(配列番号7)を有するhCT(9−32)、配列LLIILRRRIRKQAHAHSK−NH2(配列番号8)を含むpVEC、配列RVIRVWFQNKRCKDKK−NH2(配列番号9)を含むpISL、配列MANGLYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP−NH2(配列番号10)を含むマウスPRP(1−28)およびヒトホモログを含むそのホモログ、配列RQGAARVTSWLGLQLRIAGKRLEGRSK−NH2(配列番号11)を含むEms(194−220)、配列KLIKGRTPIKFGK−NH2(配列番号12)を含むRestricocin L3(60−73)、
(b)配列DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD−NH2(配列番号13)を含むVT5;配列KLALKLALKALKAALKLA−NH2(配列番号14)を含むMAP;RRRRRRR((Arg)7;配列番号15)、RRRRRRR−NH2((Arg)7−NH2;配列番号16)、RRRRRRR−C((Arg)7−C;配列番号17)、RRRRRRRR((Arg)8;配列番号18)、RRRRRRRR−NH2((Arg)8−NH2;配列番号19)、RRRRRRRRR((Arg)9;配列番号20)またはRRRRRRRRR−NH2((Arg)9−NH2;配列番号21)を含むアルギニンストレッチ、あるいは
(c)以下を含む、設計されたCPP:配列GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV(配列番号22)または配列GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV−システアミド(cysteamide)(配列番号23)を含むMPG;配列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL−NH2(配列番号24)を含むトランスポゾン、配列AGYLLGKINLKALAALAKKIL−NH2(配列番号25)を含むトランスポゾン10;配列KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(配列番号26)またはKETWWETWWTEWSQPKKKRKV−システアミド(配列番号27)を含むPep−1。 - 成分(I)が、配列番号1〜29のいずれかの配列と、約60%、70%、80%、90%、95%または99%以上の配列同一性を示す細胞浸透ペプチドより選択され、かつなおその生物学的活性を維持して、該融合ペプチドが形質膜を超えることを指向する、請求項2に記載の融合ペプチド。
- 成分(II)が、NMDAレセプターサブユニットNR1およびNR2、PDZ結合ドメインを含むペプチド、tSXnVモチーフを含むペプチド、あるいはシナプス後肥厚95タンパク質、PSD−95、PSD−93、SAP102より選択される、請求項3に記載の融合ペプチド。
- 成分(II)が、5〜40個、より好ましくは、5〜30個または5〜20個、さらにより好ましくは5〜15個または5〜10個の長さのアミノ酸を含む、請求項4に記載の融合ペプチド。
- 成分(II)が、配列vdseisslk(配列番号31)を含む配列より選択される、請求項4または5に記載の融合ペプチド。
- 成分(II)が、配列番号31に記載の配列と、約60%、70%、80%、90%、95%または99%以上の配列同一性を有する配列を含む配列より選択される、請求項4〜6のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
- 成分(I)がもっぱらL−アミノ酸、D−アミノ酸、またはその両方からなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
- 成分(I)および(II)がリンカーによって連結されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
- 精製のためのタグである成分(III)をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の融合ペプチド、および必要に応じて薬学的キャリアを含む、薬学的組成物。
- 哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果に関する疾患を処置、改善または予防する薬学的組成物を調製するための、あるいは、興奮毒性および虚血性の傷害、興奮毒性損傷、神経栄養性の支持の欠落、分離(disconnection)、てんかんを含むニューロンに対する障害、慢性の神経変性状態、ならびに、PSD−95および/またはNMDAR相互作用に関連する痛みを含む神経障害性の痛みに対する神経保護作用を提供するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載の融合ペプチドの使用であって、
該疾患が、脳卒中または脊髄傷害、脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害、および急性の中枢神経系(CNS)傷害を含むCNSニューロンに対する損傷、虚血性の脳卒中または脊髄傷害、ならびに無酸素症、虚血、機械的傷害より選択される、使用。 - 請求項11に記載の薬学的組成物、ならびに該薬学的組成物の適用についての指示および/または情報を示す指示マニュアルまたはカタログを含む、キット。
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