KR102135954B1 - 바소프레신-2 수용체의 펩티드 길항제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치료, 진단, 의료 영상화, 약물 탐색 및 연구에 사용될 수 있는 바소프레신-2 수용체 길항제 활성을 갖는 신규한 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제에 관한 것이다.

Description

바소프레신-2 수용체의 펩티드 길항제 {PEPTIDE ANTAGONISTS OF THE VASOPRESSIN-2 RECEPTOR}

본 발명은 바소프레신-2 수용체의 펩티드 길항제에 관한 것이다.

본 발명은 치료, 진단, 의료 영상 (medical imaging), 약물 탐색 (drug screening) 및 연구에 사용될 수 있는 바소프레신-2 수용체 (vasopressin-2 receptor) 길항제 (antagonist) 활성을 갖는 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제 (snake venom basic protease inhibitors)에 관한 것이다.

G 단백질-연결-수용체 (G protein-coupled-receptors, GPCRs)는 내재성 막단백질 (integral membrane proteins)의 가장 큰 패밀리를 구성한다. 800종류 이상의 GPCRs이 밝혀졌으며, 그 기본이 되는 유전자는 인간 게놈에 있어서 코딩 서열의 2 내지 3%를 차지한다. 이들은 대부분의 생리학적 기능의 조절에 관여하며, 현재 판매되는 약물의 대략 30%의 표적이다. GPCRs 중, (바소프레신-2, 바소프레신 2, 바소프레신 타입 2 또는 V2 수용체 및 약어로 AVPR2 또는 V2R로도 알려진) 아르기닌-바소프레신 V2 수용체 서브타입 (arginine-vasopressin V2 receptor subtype)은 세포 내 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP) 신호전달 경로에 연결된 수용체의 원형 (prototype)으로 여겨진다. 이는 근본적이고 치료적인 모델을 대표한다.

항-이뇨 호르몬 (anti-diuretic hormone)으로도 알려진 아르기닌-바소프레신 (Arginine-vasopressin, AVP)은 시상하부 (hypothalamus)에서 생산되는 9-아미노산 사이클릭 펩티드이다. 이는 3개의 분리된 수용체 서브타입: 바소프레신 1a (V1aR), 바소프레신 1b (V1bR) 및 바소프레신 2 (V2R)를 통하여 그 작용을 발휘한다. V1aR 및 V1bR의 작용은 세포 내 칼슘 농도 증가를 야기하는 G 단백질 Gq와 그들의 상호작용을 통하여 매개된다. V1aR은 주로 간, 평활근 세포 (혈관수축), 혈소판, 뇌, 망막 및 생식기관에서 발현되는 반면, V1bR은 주로 그 자극이 스트레스에 반응하여 피질자극 축 (corticotropic axis)을 조절하는 뇌하수체 전엽 (anterior pituitary gland)에서 발현된다. V1bR는 또한 췌장과 글루카곤, 인슐린 및 카테콜아민의 분비를 제어하는 부신 (adrenal glands)에서 발현된다. V2R은 Gs 단백질에 연결된 신장수집관 (renal collecting duct)에 위치한다. Gs는 아데닐 시클라아제 (adenylate cyclase)를 활성화시키며, 이는 차례로 증가된 사이클릭 AMP 생산을 야기한다. cAMP는 신장에서의 수분 재흡수에 관여하는 아쿠아포린 (aquaporins)이라 불리는 수분 채널을 인산화 및 활성화시키는 단백질 키나아제 A를 활성화시킨다. V2R는 또한 V2R가 그 삼투압을 조절하는 내이 (inner ear)에서 발현된다.

V2R는 주요 생리학적 기능의 조절에 관여하며, 다양한 병증을 치료하기 위한 새로운 치료 약물의 개발에 대한 표적이다. 밥탄 (vaptans)으로 명명된 비-펩티드성 V2R 길항제가 개발되었고 수많은 임상 시도에서 테스트 되었으나, 그들 대부분은 그들의 간독성 (hepatotoxicity) 때문에 약물 허가 당국의 승인을 얻지 못했다. 현재, Tolvaptan (OPC-41061) 및 Conivaptan (YM-087)만이 FDA, 및/또는 EMEA에 의하여 승인되었다.

정상용량 (euvolemic) 또는 과다용량 (hypervolemic) 저나트륨혈증 (hyponatremia)이 특징인 병리적 증상

AVP의 과다분비는 저나트륨혈증과 같은 질병에 대한 주요한 병인성 (etiologic) 요소이며, SIADH (부적절한 항이뇨 호르몬 분비 증후군 (Syndrome of Inappropriate AntiDiuretic Hormone secretion)), 간경변증 (hepatic cirrhosis) 및 울혈성 심부전 (congestive heart failure)과 같은 정상용량 또는 과다용량 저나트륨혈증이 특징인 병리적 증상에 있어서 V2R 길항제의 사용이 왜 그렇게 효율적인지를 설명한다 (CHF; Ghali et al., Cardiology, 2008, 111, 147-157). SIADH는 과도한 수분 보유 및 및 그 결과 Na⁺ 농도의 감소와 폐 및 중추신경계에서의 부종을 유발하는 AVP의 과다분비에 의하여 야기된다. 이들의 항이뇨 효과에 의하여 V2R 길항제는 혈청 Na⁺ 수준을 증가시키거나 또는 정상화시킨다. Tolvaptan (OPC-41061) 및 Conivaptan (YM-087)는 정상용량 및 과다용량 저나트륨혈증, SIADH, 울혈성 심부전 및 간경변으로 진단된 환자에 있어서 FDA, 및/또는 EMEA에 의해 승인되었다 (Arai et al., Curr Opin Pharmacol., 2007, 7, 124-129; Manning et al., Prog. Brain Res., 2008, 170, 473-412). V2R 길항제는 뇌부종 (cerebral oedema)과 같은 정상용량 또는 과다용량 저나트륨혈증을 특징으로 하는 기타 병리적 증상에 잠재적으로 유익할 수 있다 (Walcott et al., Neurotherapeutics, 2012, 9, 65-72).

부적절한 항이뇨 신성증후군 (Nephrogenic Syndrome of Inappropriate Antidiuresis, NSIAD)

NSIAD는 수용체의 구성 활성 (constitutive activity)과 연관된 R137C 및 R137L와 같은 V2R 돌연변이에 기인한다. 환자들은 낮은 혈청 바소프레신 수준에도 불구하고 저나트륨혈증 및 높은 소변 삼투압 (urinary osmolality)을 나타낸다. V2R 길항제인 Satavaptan 및 Tolvaptan는 세포 배양물 (Tenenbaum et al., PLoS One, 2009, 4, e8333) 또는 NSIAD를 갖는 환자 (Decaux et al., JASN, 2007, 18, 606-612)에 있어서 이러한 구성 활성을 억제하지 못한다.

선천적 신성요붕증 (Congenital Nephrogenic Diabetes Insipidus, cNDI)

이러한 질병은 V2R의 불활성 돌연변이와 연관된다. 결함을 갖는 수용체는 세포 내부에서 차단되며 순환하는 AVP가 도달하지 못한다. 이는 특히 어린이에게 심각한 탈수를 갖는 다뇨증 (polyuria)을 야기한다. V2R 길항제 (밥탄)는 약학 샤페론 (pharmacochaperones)으로 행동하며, 이들은 세포를 관통할 수 있고 돌연변이 된 수용체를 구제할 수 있다 (Morello et al., J. Clin. Investigation, 2000, 105, 887-895). 어떤 경우, 이는 항이뇨 효과를 회복시키기 위하여 상기 수용체가 AVP에 의하여 자극되도록 허용한다 (Bernier et al., J. Am. Soc. Nephrol., 2006, 17, 232-243; Robben et al., Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 2007, 292, 253-260). 밥탄이 임상적 시도에서 테스트되었으나, 이들 대부분은 이들의 간독성 때문에 FDA에 의하여 승인되지 않았다 (Manning et al., Prog. Brain Res., 2008, 170, 473-512). 현재, Tolvaptan만이 FDA에 의하여 승인되었다.

다낭성 신장병 (Polycystic kidney disease)

다낭성 신장병은 대부분의 환자에 있어서 극단적으로 말기 신부전 (renal failure)을 야기하는 수많은 낭포 (cysts)의 출현을 특징으로 한다. PKD1 및 PKD2 유전자에 있어서 돌연변이를 갖는 환자는 혈액에 높은 바소프레신 농도를 가짐에도 불구하고 소변을 농축할 수 없게 된다. 이러한 병증에 대한 현존하는 가능한 치료법은 투석 (dialysis) 또는 이식 (transplantation)이다. V2R 길항제는 CD1^{pcy / pcy} 생쥐 모델을 포함하는 열성 및 우성 다낭성 신장병을 갖는 서로 다른 동물 모델에 있어서 상기 질병의 진행을 느리게 하는 것으로 나타났다 (Gattone et al., Nature Medicine, 2003, 9, 1323-1326; Torres, V.E., Clin. J. Am. Soc. Nephrol., 2008, 3, 1212-1218; Wang et al., J. Am. Soc. Nephr., 2008, 19, 102-108). 상기 CD1^pcy/pcy 생쥐는 신관 (renal tubular) 발달 및 기능에 연관된 단백질인 네프로시스틴-3 (nephrocystin-3)을 인코딩하는 NPHP3 유전자의 미스센스 돌연변이 (missense mutation)에 의해 유발되는 상염색체성 (autosomal) 열성 낭포성 신장병에 관한 모델이다. 이러한 돌연변이는 신장 낭포 형성 및 말기 신부전을 야기한다. 또한, 상염색체성 우성 다낭성 신장병을 갖는 환자에 대한 Ⅲ기 (phase Ⅲ) 임상 시도는 환자에게 Tolvaptan을 3년간 투여하는 것이 낭포가 존재하는 (cyst-lining) 상피세포의 증식을 감소시켰음을 나타내었다.

암 (Cancer)

아레스틴 (arrestin) V2R와 상호작용에 의한 자극은 cAMP 및 MAP 키나아제를 수반하는 신호전달 경로의 활성화를 야기하며, 이에 따라 증식 반응이 유리해진다. 예를 들어, 래트 내에 AVP의 주입은 V2R 길항제에 의해 억제될 수 있는 신관 상피세포의 증식을 유발한다 (Alonso et al., Endocrinology, 2009, 150, 239-250). 또한, V2R 길항제와 같은 이뇨제 (diuretics)는 신장암 세포 (Bolignano et al., Urol. Oncol., 2010, 28, 642-647) 및 폐암 (pulmonary cancer) 세포 (Pequeux et al., Endocr. Relat. Cancer, 2004, 11, 871-885.)의 증식을 억제할 수 있었다. 이러한 결과들은 V2R 길항제가 서로 다른 유형의 암에 대한 우수한 치료적 후보임을 나타낸다.

혈전증 (Thrombosis)

폰빌레브란드 인자 (Von Willebrand factor, VWF)는 1차 지혈 (primary hemostasis)과 연관된다. AVP와 또한 V2R 특이적 효능제 (agonist), dDAVP (minirin®)가 V2R와 이들의 상호작용을 통하여 VWF 및 인자 Ⅷ (factor Ⅷ)을 증가시킨다는 것이 증명되었다 (Kaufmann et al., J. Clin. Invest., 2000, 106, 107-116). 응고 (coagulation) 과잉은 V2R 길항제의 사용과 이에 따른 응고 인자의 분비 제한을 통해 치료될 수 있는 혈전증 (응혈)을 유발할 수 있다.

메니에르병 (Meniere disease)

프랑스에서, 메니에르병의 발생빈도는 1/13,300인 것으로 평가되었다. 그 병리는 거의 알려져 있지 않다. 내림프관 팽창 (endolymphatic swelling)이 질병특유적 신호 (pathognomonic sign)인 것으로 여겨진다. 이는 내림프 과다분비 (endolymph hypersecretion) 또는 불충분한 재흡수에 기인할 것이다. 내이의 메니에르 병증은 현기증, 메스꺼움, 이명 (tinnitus) 및 난청과 같은 증상에 대한 기원인 것으로 보인다. 달팽이관 (cochlea) 내의 증가된 압력은 섬모 세포 (cilial cells)가 정확하게 음파 또는 움직임을 탐지하는 능력을 타협하는 것으로 여겨진다 (Kitahara et al., J. Neuroendocrinol., 2008, 20, 1295-1300). 현재, 탄산 탈수효소 (carbonic anhydrase)를 억제하고 저칼륨 이뇨제 (hypokalemic diuretic)로 작용하는 아세타졸아미드 (acetazolamide) (diamox)를 이용한 치료가 사용되고 있다. 내이로의 삼투압을 감소시킴으로써, V2R는 메니에르병을 치료하기 위하여 사용될 수 있을 것이다.

밥탄 (vaptans)이 다양한 병증에 대한 V2R 길항제의 치료적 효과를 뚜렷하게 증명했을지라도, 몇몇 주요한 문제점에 의하여 이들의 치료적 사용이 제한된다.

- 밥탄은 시토크롬 CYP3A4에 대한 이들의 억제적 효과 때문에 간독성이다. 이러한 이유로, 이들의 사용은 환자에 대한 엄격한 관찰을 필요로 하며 이들의 장기적 투여가 제한된다. 이들 중 몇몇은 정맥 내로만 주입되며, 이는 입원한 환자에 대한 사용을 제한한다.

- 밥탄은 112 (Satavaptan) 내지 0.15 (Conivaptan)로 다양한 V2/V1a 선택 지수로 단지 V2R에 대하여만 약간의 선택성을 갖는다.

- 밥탄은 MAP 키나아제 활성에 대한 효능제이다. 따라서, 이들은 특이적인 V2R-연관 신호전달 경로를 완전히 차단할 수 없다.

- 밥탄은 생리 완충액에 거의 용해되지 않으며, 생물학적 이용가능성이 제한되었다 (Bernier et al., JASN, 2006, 17, 591-).

따라서, 특히 현재 사용가능한 비-펩티드성 V2R 길항제에 비하여 증가된 V2R 선택성 및 감소된 독성을 갖는 치료적 용도를 위한 개선된 특성을 갖는 신규한 V2R 길항제가 요구된다.

쿠니츠 도메인 (Kunitz domains)은 쿠니츠-타입 단백질분해효소 억제제의 활성 도메인이다. 이들은 약 50 내지 60 아미노산의 길이 및 이황화물이 풍부한 알파 및 베타 접힘 구조를 가지며 상대적으로 작다. 이러한 도메인을 갖는 서열의 대부분은 소 췌장 트립신 억제제 (BPTI 또는 염기성 췌장 억제제) 및 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제 유사 덴드로톡신 (dendrotoxins), 포유동물 인터-알파-트립신 억제제 (mammalian inter-alpha-trypsin inhibitors), 트립스타틴 (trypstatin), 알츠하이머 아밀로이드 단백질의 선택적으로 접합된 형태에 발견되는 도메인, 타입 Ⅵ 및 타입 Ⅶ 콜라겐의 알파-1 및 알파-3 사슬의 C-말단에 위치한 도메인, 조직 인자 경로 억제제 전구체 및 레귐 (legume) 씨앗에 함유된 쿠니츠 STI 단백질분해효소 억제제와 같은 수많은 다른 구성원을 포함하는 쿠니츠/소 (kunitz/bovine) 췌장 트립신 억제제 패밀리에 속한다.

덴드로톡신 (Dendrotoxins)은 블랙 맘바 (black mamba) (Dendroaspis polyepis polyepis) 및 동부 초록 맘바 (eastern green mamba) (Dendroaspis angusticeps)의 독으로부터 분리된 신경독소 그룹이며, 이는 신경에 있어서 신경근 접합부 (neuromuscular junctions)에서 아세틸-콜린 (acetyl-choline)의 방출을 증가시키는 전압-개폐 칼륨 통로 (voltage-gated potassium channels)의 특정 서브타입의 선택적 차단제이다. 칼륨 통로에 대한 이들의 높은 효능 및 선택성 때문에, 덴드로톡신은 이러한 이온 통로 단백질의 구조 및 기능 연구 및 인간 질병 치료에 대한 유용한 약리학적 제제를 대표한다 (WO 2007/019267). 덴드로톡신은 100개 미만의 아미노산, 일반적으로 57-60 아미노산의 쿠니츠 구조 즉, 1-6, 2-4, 3-5 연결을 갖는 3 개의 이황화 결합으로 구성되며 알파 나선에 이어 뒤틀린 이중쇄 역평행 베타 시트를 형성하기 위하여 배열된 이황화물 풍부 알파 및 베타 접힘으로 접히는 단일 펩티드 사슬을 구성하는 작은 단백질이다 (Berndt et al., J. Mol. Biol., 1993, 234, 735-750).

본 발명자들은 초록 맘바 독으로부터 신규한 독소를 분리하였으며, 쿠니츠/소 췌장 트립신 억제제 패밀리의 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제의 구성원이며, U-Da2a로 명명된 이러한 독소가 경쟁적 (competitive)이고 선택적 (selective)인 V2R 길항제임을 증명하였다. 본 발명자들은 또한 U-Da2a 서열의 15 내지 18 위치 내의 아미노산 모티프 (motif)가 V2R에 대한 U-Da2a의 경쟁적인 길항제 활성에 필수적이며, 이러한 모티프를 갖지 않는 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제는 V2R 길항제가 아니나, 이들 위치에 유사한 모티프를 갖는 기타 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제 또한 V2R 길항제임을 발견하였다. 이러한 결과들은 이러한 특이적인 아미노산 모티프를 갖는 신규 및 공지된 덴드로톡신을 포함하는, V2R 길항제 활성을 갖는 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제의 신규한 그룹을 정의하는 것을 허용한다.

V2R의 펩티드 길항제로서, 이러한 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제 그룹은 치료, 진단, 치료반응 예측, 의료 영상화, 약물 탐색 및 연구를 포함하는 다양한 응용에 사용될 수 있다. 특히, 이러한 단백질은 저나트륨혈증 및 다낭성 신장병과 같은 V2R 경로를 수반하는 병증에 대한 우수한 치료적 후보를 제공한다.

본 발명의 하나의 관점은 서열번호 1의 잔기 1 내지 57과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열 (Ⅰ)을 포함하고,

(ⅰ) X₁은 아스파라긴 (N), X₂는 글리신 (G)이고, X₃ 및 X₄는 소수성 아미노산이거나, X₁은 메티오닌 (M), X₂ 및 X₃는 페닐알라닌 (F)이고, X₄는 이소류신 (I)인 서열번호 1의 15 내지 18 위치 내의 모티프 X₁X₂X₃X₄, 및

(ⅱ) 두 개의 시스테인 잔기 간의 한 개 내지 세 개의 이황화 결합을 포함하며, V2R 경로를 수반하는 질병의 치료에 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 관점은 시험관 내에서 V2R 발현 수준의 증가 또는 감소를 수반하는 병증을 진단하기 위한 상기 분리된 단백질의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 V2R 리간드를 탐색하기 위한 상기 분리된 단백질의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 V2R 결정을 생산하기 위한 결정화제로서의 상기 분리된 단백질의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 서열번호 1의 잔기 1 내지 57과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ⅰ) X₁은 아스파라긴 (N), X₂는 글리신 (G)이고, X₃ 및 X₄는 소수성 아미노산인 서열번호 1의 15 내지 18 위치 내의 모티프 X₁X₂X₃X₄, 및 (ⅱ) 두 개의 시스테인 잔기 간의 한 개 내지 세 개의 이황화 결합을 포함하며, V2R 길항제 활성을 갖는 분리된 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터로 변형된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 적어도 (ⅰ) 상기 단백질, 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 (ⅱ) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 상기 표지된 단백질을 포함하는 진단 또는 영상화 제제를 제공하는 것이다.

도 1은 다른 공지된 독소와 U-Da2a의 서열 정렬을 나타낸다. a. 덴드로톡신-B (Dtx-B Ala 27 또는 Dtx-B-A27; SWISSPROT P00983.1; 서열번호 2); 덴드로톡신-E His55 (DTx-E-H55; SWISSPROT P00984.1; 서열번호 6); Mulgin-1 (GenBank AAT45400.1; 서열번호 4); Blackelin-3 (GenBank ABV64393; 서열번호 5); 덴드로톡신-K (Dtx-K; SWISSPROT P00981.2; 서열번호 8); 알파-덴드로톡신 (알파-Dtx; SWISSPROT P00980.1; 서열번호 9); 소 췌장 트립신 억제제 (BPTI; SWISSPROT P00974.2; 서열번호 10). 퍼센트 상동성은 오른쪽에 나타나 있다. b. 퍼센트 상동성 결정을 나타내는 Blackelin-3와 U-Da2a의 정렬.
도 2는 진핵 세포에서 발현된 상이한 바소프레신 수용체 서브타입 상에서 U-Da2a에 의한 ³H-AVP 결합 억제를 나타낸다. (○) V1aR. (◇) V1bR. (■) V2R.
도 3은 V2R를 안정적으로 발현하는 CHO 세포 상에 AVP에 의하여 유도된 cAMP 생산에 대한 U-Da2a 독소 영향을 나타낸다. a. 증가하는 U-Da2a 농도의 부존재 (_●) 또는 존재 하에서 AVP에 의해 V2R에 유도된 복용량-반응 곡선 (Dose-response curves): 20 nM (■); 60 nM (▲); 150 nM (○); 300 nM (□) 및 500 nM (◆). b. V2R에 대한 증가하는 AVP 농도에 의해 유도된 cAMP 생산에 대한 U-Da2a 독소 영향의 실더 표현 (Schild representation). 이들 누적 데이터는 3개의 독립된 실험을 통하여 획득된다.
도 4는 tsA 세포 내의 V2R-Rluc 수용체에 대한 AVP의 작용에 의하여 유도된 β-아레스틴-1-YFP 유동화에 대한 U-Da2a 영향을 나타낸다. a. U-Da2a의 증가하는 농도의 부존재 (_●) 또는 존재 하에서 V2R에 대한 AVP 복용량-반응 곡선: 100 nM (▲); 500 nM (■); 1 μM (▼); 5 μM (○) and 10 μM (△). b. 증가하는 AVP 농도에 의해 유도된 V2-Rluc 수용체로의 β-아레스틴-1-YFP 유동화에 대한 U-Da2a 독소 영향의 실더 표현. 이러한 누적 데이터는 3 개의 독립된 실험에 의하여 획득된다.
도 5는 tsA 세포 내에서 V2R에의 AVP의 작용에 의하여 유발되는 MAP 키나아제 인산화에 대한 UDa-2a 효과를 나타낸다. a. U-Da2a의 증가하는 농도의 부존재 (_●) 또는 존재 하에서 V2R에 대한 AVP 복용량-반응 곡선: 0.6μM (■);1μM (▲);3μM (◆);6μM (○);10μM (□); 30μM (△) 및 60μM (◇). b. V2R 수용체에 대하여 증가하는 AVP 농도에 의한 MAP 키나아제 인산화에 대한 U-Da2a 독소의 실더 표현. 이러한 누적 데이터는 3개의 독립된 실험으로부터 획득된다.
도 6은 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에서 U-Da2a 독소의 이뇨 효과를 나타낸다. U-Da2a를 1μmol/kg의 단일 복용량으로 생쥐에게 피하 및 복강 내로 주입하였다. 주입 후, 대사 케이지 (metabolic cages) 내에서 24시간 동안 소변을 수집하였으며, 소변량을 결정하였다. 기초상태 (빈 박스) 및 U-Da2a 주입 후 (검정색 박스)에서의 소변량.
도 7은 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에서 U-Da2a 독소의 삼투 효과를 나타낸다. U-Da2a를 1μmol/kg의 단일 복용량으로 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에게 피하 또는 복강 내로 주입하였다. 주입 후, 대사 케이지 (metabolic cages) 내에서 24시간 동안 소변을 수집하였으며, 소변량을 결정하였다. 기초상태 (빈 박스) 및 U-Da2a 주입 후 (검정색 박스)에서의 소변량.
도 8은 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에서 복강 내 투여에 의한 증가하는 U-Da2a 독소 복용량의 이뇨 효과를 나타낸다. U-Da2a를 1, 3 및 5일째에 0.01 (빈 박스), 0.1 (회색 박스) 및 1 (검정색 박스) μmole/kg의 복용량으로 복강 내로 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에게 주입하였다. 주입 후 24시간 동안 대사 케이지에서 소변을 수집하였으며 소변량을 결정하였다.
도 9는 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에서 복강 내 투여에 의하여 증가하는 U-Da2a 독소 복용량의 삼투 효과를 나타낸다. U-Da2a를 1, 3 및 5일째에 0.01 (빈 박스), 0.1 (회색 박스), 및 1 (검정색 박스)μmol/kg의 복용량으로 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에게 복강 내로 주입하였다. 주입 후, 대사 케이지 (metabolic cages) 내에서 24시간 동안 소변을 수집하였으며, 소변량을 결정하였다.
도 10은 최대 99일 동안 0.1μmol/kg로 U-Da2a를 매일 i.p. 주입한 후의 CD1^pcy/pcy 생쥐에서 U-Da2a의 이뇨 효과를 나타낸다. 0 (빈 박스), 30 (밝은 회색 박스), 70 (어두운 회색 박스) 및 99 (검정색 박스)일째, 대사 케이지 (metabolic cages) 내에서 24시간 동안 소변을 수집하였으며, 소변량을 결정하였다.
도 11은 최대 99일 동안 0.1μmol/kg로 U-Da2a를 매일 i.p. 주입한 후의 CD1^pcy/pcy 생쥐에서 U-Da2a의 삼투 효과를 나타낸다. 0 (빈 박스), 30 (밝은 회색 박스), 70 (어두운 회색 박스) 및 99 (검정색 박스)일째, 대사 케이지 내에서 24시간 동안 소변을 수집하였으며, 소변량을 결정하였다.
도 12는 신장 중량/체중, 신장 중량/심장 중량 및 심장 중량/체중의 비율표현에 의하여 0.1μmol/kg로 독소를 매일 i.p. 주입한 지 99일 후의 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에서 신장 중량에 대한 U-Da2a의 효과를 나타낸다. 상기 생쥐를 4% 파라포름알데히드/1×인산완충용액 (phosphate-buffered saline)으로 살포-고정 (perfusion-fixed)하였으며, 신장 및 심장을 꺼내어 무게를 측정하였다. 기초상태 (빈 박스). U-Da2a (검정색 박스).
도 13은 0.1 μmol/kg으로 i.p로 매일 독소를 주입한 지 99일 후의 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에서 낭포 (cyst) 숫자에 대한 U-Da2a의 영향을 나타낸다. 상기 생쥐를 4% 파라포름알데히드/1×인산완충용액 (phosphate-buffered saline)으로 살포-고정 (perfusion-fixed)하였으며, 신장을 꺼내어 파라핀에 넣었다. a. 횡단 신장 절편을 헤마톡실린 (hematoxylin) 및 에오신 (eosin)으로 염색하였다. b. 프로그램 ImageJ를 이용하여 낭포 숫자를 결정하였으며, 상기 절편의 크기와 연관지어 상대적인 낭포 숫자를 도출하였다. U-Da2a (회색 박스). 대조구 (0.9% NaCl; 검정색 박스).
도 14는 진핵세포에서 발현되는 바소프레신 V2 수용체 서브타입 (V2R)에 대한 U-Da2a 및 U-Da2a 변이체에 의한 ³H-AVP 결합 억제를 나타낸다. (●) AVP. (▲) U-Da2a WT. (□) U-Da2a-델타4-Nter. (◆) U-Da2a-델타2-Nter-델타2-Cter. (▼) U-Da2a-S3K. (○) U-Da2a-N15K, G16A.
도 15는 진핵세포에서 발현되는 바소프레신 V2 수용체 서브타입 (V2R)에 대한 U-Da2a, Dtx-B-A27S, Dtx-K, DTx-E-R55에 의한 ³H-AVP 결합 억제를 나타낸다.
도 16은 V2R에 대한 U-Da2a WT (개방 원) 및 U-Da2a C14S, C38S (채워진 원)에 의한 ³H-AVP의 결합 억제를 나타낸다. K_i U-Da2a WT = 1.03　nM. K_i U-Da2a C14S, C38S = 6200 nM.

본 발명의 하나의 관점은 서열번호 1의 잔기 1 내지 57과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열 (Ⅰ)을 포함하고,

(ⅰ) X₁은 아스파라긴 (N), X₂는 글리신 (G)이고, X₃ 및 X₄는 소수성 아미노산이거나, X₁은 메티오닌 (M), X₂ 및 X₃는 페닐알라닌 (F)이고, X₄는 이소류신 (I)인 서열번호 1의 15 내지 18 위치 내의 모티프 X₁X₂X₃X₄, 및

(ⅱ) 두 개의 시스테인 잔기 간의 한 개 내지 세 개의 이황화 결합을 포함하며, V2R 경로를 수반하는 질병의 치료에 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질에 관한 것이다.

이하, 표준 단일 문자 아미노산 코드가 사용된다. 소수성 아미노산은 M, W, F, A, V, L, I, Y 및 P를 의미한다.

자연적이거나, 재조합되거나 또는 합성된 것일 수 있는 본 발명에 따른 서로 다른 용도에 대한 단백질은 아미노산 서열 (Ⅰ)을 포함하거나 이로 구성된다. 상기 서열 (Ⅰ)은 단백질, 펩티드 또는 독소로 명명된 경쟁적인 V2R 길항제 활성을 갖는 약리학적으로 활성인 독소이다. 본 발명에 따른 서로 다른 용도를 위한 단백질은 알파 나선에 이어 뒤틀린 (twisted) 이중나선 역평행 베타 시트 (antiparallel beta sheet)이며, 상기 단백질을 안정화시키고 그 구조 형성에 기여하기 위한 하나 내지 세 개의 이황화 결합을 포함하는 덴드로톡신 (dendrotoxins)의 전형적인 쿠니츠-타입 (Kunitz-type) 구조를 갖는다.

이들 특성은 본 발명의 응용의 실시 예에 기술된 것들과 같이 통상의 기술자에게 알려진 기법에 의해 쉽게 확인될 수 있다.

본 발명은 아미노산(들) 및/또는 펩티드 결합(들)이 기능적 유사체 (functional analogues)로 치환된 단백질의 펩티드 유사체 (peptidomimetics)뿐만 아니라 펩티드 결합을 통해 연결된 자연적인 아미노산 (L- 및/또는 D-형상으로의 20 개의 유전자-인코딩된 아미노산)을 포함하거나 이로 구성되는 단백질의 용도를 포함한다. 이러한 기능적 유사체는 상기 20개의 유전자-인코딩된 아미노산 이외의 모든 공지의 아미노산을 포함한다. 코드화되지 않은 비-한정적인 아미노산의 목록이 여기에 참조로 포함된 US 2008/0234183의 표 1A에 나타나 있다. 본 발명은 또한 상기 V2R 길항제 활성이 변형된 단백질에서 유지되는 한, 하나 이상의 아미노산 잔기, 펩티드 결합, 상기 단백질의 N- 및/또는 C-말단 단부의 도입에 의하여 상기 단백질로부터 유래된 변형된 단백질을 포함한다. 통상의 기술자에게 공지된 전형적인 방법에 의하여 상기 단백질 내로 도입된 이러한 변형은 이에 한정되는 것은 아니나, 자연적인 아미노산을 비-단백질성 (non-proteinogenic) 아미노산 (D 아미노산 또는 아미노산 유사체)로 치환하는 것; 특히, 레트로 (retro) 또는 레트로-인버소 (retro-inverso) 타입의 결합 또는 상기 펩티드 결합과 상이한 결합으로 상기 펩티드 결합을 변형시키는 것; 화학작용기의 고리화 (cyclization) 및 특히, 관심 있는 제제를 본 발명의 단백질에 연결시키기 위한 상기 단백질의 측쇄 또는 말단(들)에 부가 (addition)하는 것을 포함한다. 이러한 변형들은 상기 단백질을 표지화하고, V2R에 대한 그 친화도 (affinity), 그 생물학적 이용가능성 (bioavailability), 및 그 안정성을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.

퍼센트 아미노산 서열 상동성 (identity)은 최대 서열 상동성을 달성하기 위하여 상기 서열의 정렬 및 필요에 따라, 편차 (gaps)를 도입한 후의 참조 서열 (Reference Sequence)인 서열번호 1과 동일한 비교 서열 (Compared Sequence) 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 그 후, 상기 퍼센트 상동성은 하기 공식에 따라 결정되며: 퍼센트 상동성=100×[1-(C/R)], 여기에서 C는 상기 참조 서열인 서열번호 1과 서열번호 1의 전체 길이 (즉, 서열번호 1의 위치 1 내지 57)에 대한 비교 서열 간의 차이 값이며, 여기에서 (ⅰ) 상기 비교 서열 내의 상응하는 정렬된 아미노산을 갖지 않는 상기 참조 서열 내의 각각의 아미노산, (ⅱ) 상기 참조 서열 내의 각각의 편차, 및 (ⅲ) 상기 비교 서열 내의 아미노산과 상이한 상기 참조 서열 내의 각각의 정렬된 아미노산이 차이를 구성하며, R은 아미노산으로 또한 계수된 참조 서열 내에 발생한 모든 편차로 상기 비교 서열에 따른 정열 길이에 대한 상기 참조 서열 내의 아미노산 숫자이다.

퍼센트 아미노산 서열 상동성을 결정하기 위한 목적에 따른 정렬은 예를 들어, BLAST와 같은 일반적으로 사용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법으로 달성될 수 있다 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). 이러한 소프트웨어를 사용할 때, 예를 들어, 편차 패널티 (gap penalty) 및 확장 패널티 (extension penalty)를 위한 초기값 파라미터 (default parameters)이 바람직하게 사용된다. 아미노산 서열을 위하여, 상기 BLASTP 프로그램은 초기값으로 3의 단어 길이 (word length, W) 및 10의 기대값 (expectation, E)를 사용한다.

예를 들어, U-Da2a (서열번호 1)로의 Blackelin-3 (서열번호 5; 83개 아미노산)의 정렬이 도 1b에 나타나 있으며, 참조 서열과 비교 서열간의 정렬 길이 즉, 서열번호 1의 전체길이 (서열번호 1의 1 내지 57 위치)에 대하여, 참조 서열에 편차가 없고, 비교 서열에 편차가 없으며, 비교 서열 내의 정렬된 아미노산 서열과 상이한 참조 서열 내의 23개의 아미노산이 있음을 나타낸다. 따라서, C = 23이고 R = 57이다. 퍼센트 상동성 = 100×[1-(23/57)]이다. Blackelin-3는 서열번호 1의 1 내지 57 위치에 대하여 60% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1의 잔기 1 내지 57에 대하여 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열 (Ⅰ)을 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게는, 상기 서열 (Ⅰ)은 서열번호 1의 잔기 1 내지 57에 대하여 적어도 60% 동일하다. 더욱 바람직하게는, 이는 서열번호 1의 잔기 1 내지 57에 대하여 적어도 65% 동일하다.

다른 구현 예에 있어서, 상기 서열 (Ⅰ)은 NGFF 및 NGLF로 이루어진 군으로부터 선택된 모티프 X₁X₂X₃X₄를 포함한다.

다른 구현 예에 있어서, 상기 서열 (Ⅰ)은 최대 100개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 60개의 아미노산을 가지며, 서열번호 1 및 하나 내지 다섯 개의 아미노산의 서열번호 1 내의 분포된 결실 및/또는 삽입, 및 또는 1 내지 30, 바람직하게는 1 내지 15, 1 내지 10 또는 1 내지 5 아미노산의 치환 및/또는 말단 결실(들)에 의한 서열번호 1과 상이한 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 결실(들) 및/또는 삽입(들)은 바람직하게는 (ⅰ) 서열번호 1 내에 분포된 하나 내지 다섯 개의 단일 아미노산 결실(들)/삽입(들), 및 (ⅱ) 서열번호 1의 일 또는 양 말단에서의 1 내지 5개의 아미노산의 말단 결실(들)로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 말단 결실(들)은 서열번호 1의 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기의 N-말단 결실 및/또는 1 또는 2개의 아미노산 잔기의 C-말단 결실로부터 선택된다.

서열번호 1 내의 치환(들)은 바람직하게는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5개의 보존적 치환 (conservative substitutions) 즉, 상기 단백질의 기능적 특성을 변화시키지 않고 하나의 아미노산을 유사한 화학적 또는 물리적 특성 (크기, 전하 또는 극성)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 상기 보존적 치환(들)은 하기 다섯 개의 그룹: 그룹 1-작은 지방족, 비-극성 또는 약한 극성 잔기 (A, S, T, P, G); 그룹 2-극성, 음전하 잔기 및 이들의 아미드류 (D, N, E, Q); 그룹 3-극성, 양전하 잔기 (H, R, K); 그룹 4-큰 지방족, 비극성 잔기 (M, L, I, V, C); 및 그룹 5-대형, 방향족 잔기 (F, Y, W) 중 하나 내에서 선택된다.

서열번호 1의 5 및 55, 14 및 38, 및/또는 30 및 51 위치 내의 시스테인 잔기는 바람직하게는 돌연변이 되지 않는다.

바람직하게는, 상기 단백질은 아미노산 서열 서열번호 1 내지 5, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기의 N-말단 결실 및/또는 1 또는 2개의 아미노산 잔기의 C-말단 결실을 포함하는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 변이체, 및 하나 내지 서른 개의 아미노산 잔기의 N-말단 결실 및/또는 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 C-말단 결실을 포함하는 서열번호 5 또는 6의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이와 같은 바람직한 단백질의 예시는 서열번호 11 내지 13이다.

다른 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 서열 (Ⅰ)은 하나 내지 세 개의 (하나, 둘 또는 세 개), 바람직하게는 세 개의 C1 내지 C6가 각각 상기 서열 (Ⅰ)의 N-말단으로부터 C-말단으로 번호 붙여진 시스테인 잔기인 C1과 C6, C2와 C4, 및 C3와 C5 간의 이황화 결합으로부터 선택되는 이황화 결합을 포함한다. 이러한 단백질의 예시로는 각각 세 개 및 두 개의 이황화 결합을 포함하는 서열번호 1 및 16을 들 수 있다. 바람직하게는, C1은 상기 서열 (Ⅰ)의 위치 1 내지 31, 더욱 바람직하게는 1 내지 15, 1 내지 10 또는 1 내지 5 (1, 2, 3, 4 또는 5)에 존재하며, C6로부터 50±2개의 아미노산에 의하여 분리되어 있고, C2 및 C4, C3 및 C5는 각각 25±2 및 20±2개의 아미노산으로 분리되어 있다. 더욱 바람직하게는, C1 내지 C6는 각각 서열번호 1의 위치 5, 14, 30, 38, 51 및 55에 존재한다. 또한, C1 및/또는 C6는 바람직하게는 각각 상기 단백질의 최초 및 마지막 잔기이다.

다른 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1의 네 개의 N-말단 및 두 개의 C-말단 잔기가 없는 변형된 단백질이며, 여기에서 예를 들어, 아세틸화에 의하여 C1의 NH2 기능이 화학적으로 차단되며, 예를 들어, 아미드화에 의하여 C6의 COOH 기능이 차단된다. 상기 펩티드는 엑소-단백질분해효소 (exo-proteases)에 더욱 저항성을 갖는 것으로 알려진 고리형 펩티드 (cyclic peptide)이다.

다른 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 엔도-단백질분해효소 (endoproteases)에 의한 표적이 되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 이들의 대응하는 비-자연적인 D-형태에 의하여 치환된 변형된 단백질이다. 예를 들어, 트립신에 대한 표적이 되는 하나 이상의 아르기닌 및/또는 리신 잔기는 이들의 대응하는 비-자연적인 형태로 치환될 수 있다.

다른 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 하나 이상의 이황화 결합이 비-자연적인 연결로 치환된 변형된 단백질이다. 바람직하게는, 상기 비-자연적인 연결은 예를 들어, 티아졸리딘 링커 (thiazolidine linker)와 같이 환원에 저항성을 갖는다. 이러한 링커들은 본 발명의 상기 단백질의 생물학적 액체에 존재하는 환원제에 대한 저항성을 증가시킨다.

다른 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 서열 (Ⅰ)의 일 말단에 융합된 서열 (Ⅱ) 및, 선택적으로, 상기 서열 (Ⅰ)의 다른 말단에 융합된 다른 서열 (Ⅲ)을 포함하는 융합 또는 키메릭 단백질이다. 상기 단백질의 길이는 상기 V2R 길항제 활성이 유지되는 한, 본 발명에 있어서 중요하지 않다. 상기 서열 (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 본 발명의 단백질의 정제, 검출, 부동화, 및/또는 세포 표적화를 가능하게 하고, 상기 답백질의 V2R에 대한 친화도, 생물학적 이용가능성, 발현 시스템에서의 생산 및/또는 안정성을 증가시키는 것들을 포함하는 하나 이상의 다른 단백질/펩티드 모이티 (moieties)를 포함한다. 이러한 모이티는 (ⅰ) 형광 단백질 (GFP 및 그 유도체, BFP 및 YFP)과 같은 표지 모이티, (ⅱ) 효소 태그 (루시페라아제, 알칼리 포스파타아제, 글루타티온-S-전이효소 (GST), β-갈락토시다아제)와 같은 리포터 모이티, (ⅱ) 에피토프 태그 (polyHis6, FLAG, HA, myc.), DNA-결합 도메인, 호르몬-결합 도메인, 지지체 상에서의 부동화를 위한 폴리-리신 태그와 같은 결합 모이티, (ⅲ) ZZ, DsBa 및 DsBb와 같은 안정화 모이티, 및 (ⅳ) 특정 세포 타입 또는 세포 분획에 대한 키메릭 단백질을 안내하기 위한 표적 모이티로부터 선택될 수 있다. 또한, 서열(들) (Ⅱ) 및/또는 (Ⅲ)은 바람직하게는 서열 (Ⅰ)과 서열 (Ⅱ) 및/또는 (Ⅲ)간의 억제 상호작용을 피하기에 충분히 긴 링커를 포함한다. 상기 링커는 또한 예를 들어, 친화도 태그 및 안정화 모이티를 본 발명에 따른 정제된 키메릭 단백질로부터 제거하기 위하여 단백질분해효소에 대한 인식 부위를 포함할 수 있다.

다른 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 그 생물학적 이용가능성을 증가시키고, 특히 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 그 소변 제거 (urinary elimination)를 감소시키는 제제에 연결된다.

본 발명은 발현가능한 형태로 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 용도를 포함한다. 단백질을 발현가능한 형태로 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 세포가 없는 시스템에서 기능적 단백질을 야기하는 핵산 분자를 의미한다.

본 발명에 따라, 상기 단백질, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터는 약제학적으로 허용가능한 담체 (carrier)를 더욱 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 이에 한정되는 것은 아니나, 경구, 비경구 및 국부적인 것을 포함하는 다양한 경로에 의한 투여용으로 제조된다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 전통적으로 사용되는 것들이다.

또한, 상기 단백질은 바람직하게는 이의 생리학적 특징을 변경시키고, 특히, 유기체에서 그 반감기 (당화: HAUBNER R. et al., J. Nucl. Med., 2001, 42, 326-36; PEG과의 접합: KIM TH. et al., Biomaterials, 2002, 23, 2311-7), 그 용해도 (알부민과의 혼성화: KOEHLER MF. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 2883-6), 단백질분해효소에 대한 그 저항성 (비자연적인 아미노산 (예를 들어, D 형태)), 및/또는 그 장내 흡수 (Lien et al., TIB, 2003, 21, 556-)를 개선하기 위하여 통상의 기술자에게 주지된 수단에 의하여 변형될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 예를 들어, 이들이 투여된 개개의 개체에 대한 이로움을 나타내기에 충분한, 치료적으로 효과적인 양의 단백질/폴리뉴클레오티드/벡터를 포함한다. 상기 약제학적으로 유효한 복용량은 사용된 조성물, 투여 경로, 치료될 포유동물의 타입 (인간 또는 동물), 고려되는 특정 포유동물의 물리적 특성, 공존하는 약물, 및 의료 분야의 통상의 기술자가 인식할 수 있는 기타 인자에 의존한다.

본 발명은 또한 치료적으로 효과적인 양의 단백질, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, V2R 경로를 수반하는 병증의 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

V2R 경로를 수반하는 병증은 이에 한정되는 것은 아니나, (ⅰ) 울혈성 심부전 (congestive heart failure, CHF), 간경변 (cirrhosis), 부적절한 항이뇨 호르몬 분비 증후군 (Syndrome of Inappropriate Antidiuretic Hormone secretion, SIADH) 및 뇌부종과 같은 정상용량 또는 과다용량 저나트륨혈증을 특징으로 하는 병적 질환, (ⅱ) 부적절한 항이뇨의 신성증후군 (Nephrogenic Syndrome of Inappropriate Antidiuresis, NSIAD), (ⅲ) 선천적 신성요붕증 (Congenital Nephrogenic Diabetes Insipidus, cNDI), (ⅳ) 다낭성 신장병 (Polycystic kidney disease), (ⅴ) 신장암 및 폐암을 포함하는 암, (ⅵ) 혈전증 (thrombosis), 및 (ⅶ) 메니에르병 (Meniere disease)을 포함한다.

본 발명의 다른 관점은 진단 또는 연구 목적으로 생리학적 또는 병적 질환 하에서 또는 내재적 또는 외래적 자극에 반응하여, V2R을 제자리에서 (in situ) (시험관 내 또는 생체 내에서) 검출하기 위한 광학적 영상화, 자기 공명 영상화 (magnetic resonance imaging, MRI) 및 양전자 방사 단층촬영 (positron emission tomography, PET)에 적용될 수 있는 상기 단백질의 진단 또는 영상화 제제로의 용도에 관한 것이다. 상기 단백질은 또한 V2R 효능제 (agonists) 및 길항제 (antagonists)를 포함하는 V2R 리간드를 탐색하기 위한 약물 탐색 도구로 사용된다.

바람직한 구현 예에 있어서, 상기 단백질은 검출 및/또는 정량가능한 신호, 특히, 방사능, 자기 또는 형광 (방사발광성 (radioluminescent), 화학발광성 (chemiluminescent), 생체발광성 (bioluminescent), 형광성 (fluorescent) 또는 인광성 (phosphorescent)) 제제를 생산하는 표지 (labeling) 제제에 연결된다. 상기 표지된 단백질은 통상의 기술자에게 주지된 표준 접합 기법을 이용하여 공유 또는 비공유 결합을 통하여 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 표지 제제의 예시로는 테크네튬-99 (Technetium-99, ⁹⁹Tc), 불소 18 (Fluorine 18, ¹⁸F), 삼중수소 (Tritium, ³H) 및 요오드 (Iodine, ¹²⁵I)와 같은 방사성 동위원소; AlexaFluor, FITC 및 시아닌 3 (cyanine 3)와 같은 발광 제제; 가돌리늄 (gadolinium) 화합물과 같은 상자성 콘트라스트 제제 (paramagnetic contrast agent); 및 산화철 나노입자와 같은 초상자성 (superparamagnetic) 콘트라스트 제제가 포함된다.

더욱 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 표지된 단백질은 방사성 또는 형광성 제제에 공유결합으로 연결된다.

상기 표지 제제, 예를 들어 형광 또는 방사성 제제의 상기 단백질에 대한 공유결합 연결은 (ⅰ) 상기 단백질의 화학적 합성 도중에 상기 표지 제제를 상기 단백질의 N- 또는 C-말단에 포함시키는 것, 또는 (ⅱ) 재조합 또는 합성 단백질 내에 반응기 (자유 시스테인,비오티닌 (biotinin), 아지도 (azido) 모이티)를 포함시키고, 그 후 상기 반응기를 상기 표지 제제에 공유결합으로 연결시키기 위하여 사용하는 것에 의하여 달성될 수 있다.

바람직하게는, 상기 표지 제제는 상기 단백질의 말단이 V2R에의 그 결합에 관여하지 않으면서 상기 단백질의 N- 또는 C- 말단에 공유결합으로 연결된다.

본 발명의 목적은 또한 시험관 내에서 V2R 발현 수준의 증가 또는 감소를 수반하는 병증을 진단하기 위한 상기 단백질의 용도이다.

본 발명의 다른 목적은 생체 내에서 V2R 발현 수분의 증가 또는 감소를 수반하는 병증의 진단에 사용하기 위한 단백질이다.

진단적 응용을 위하여, 상기 표지된 단백질은 환자로부터의 조직 내의 그 자리에서 (in situ) V2R 발현을 시각화하고, 건강한 개체로부터의 조직의 동일한 타입과 비교하여 그 발현 수준을 평가하기 위하여 사용된다. V2R 과잉발현은 암과 같은 병적 질환의 지표이며, V2R 발현저하는 선천적 신성요붕증 (cNDI)과 같은 병적 질환의 지표이다. 일단, 상기 진단이 확립되면, 예를 들어, 암 또는 cNDI를 치료하기 위한 V2R 길항제의 사용을 포함하는 진단된 환자에 대한 효과적인 치료를 결정하는 것이 가능하다.

본 발명의 목적은 또한 상기 단백질의 V2R 연구를 위한 연구 도구로의 용도이다.

본 발명의 다른 목적은 적어도 하기 단계:

-분석될 세포를 표지된 단백질과 접촉시키는 단계, 및

-표지된 세포를 검출하는 단계를 포함하는 시험관 내 또는 생체 내에서 V2R를 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 세포의 표지는 특히 기술분야 (형광 현미경, 유동 세포분석법 (flow cytometry), 자기 공명 영상화)의 통상의 기술자에게 공지된 모든 기법에 의하여 검출가능한 형광 표지 또는 자기 표지이다.

상기 수용체의 특히, 실시간으로 포유동물의 체내에서 생체 내 검출 (세포 영상화)하는 것은 상기 펩티드를 상기 포유동물에 투여 (비경구 주사, 경구 투여)하는 전단계를 포함한다.

본 발명의 다른 목적은 V2R 리간드를 탐색하기 위한 상기 단백질의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한,

- 테스트 분자 및 표지된 단백질과 함께 V2R를 배양하는 단계, 및

- 상기 테스트 분자의 존재 또는 부존재 하에서 획득된 신호를 측정하는 단계를 포함하며, 여기에서, 테스트 분자가 없는 대조구와 비교하여 상기 분자의 존재하에서 더 낮은 신호는 상기 테스트 분자가 V2R 리간드임을 나타내는 V2R 리간드를 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.

그 후, 본 발명의 응용의 실시 예에 개시된 것과 같은 기술분야에 주지된 약리학적 분석을 이용하여 V2R를 발현하는 세포 내에서 V2R에 대한 식별된 리간드의 상기 효능제, 길항제 효과가 테스트된다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질의 V2R 결정을 생산하기 위한 결정화 제제로의 용도이다. 그 후, V2R 결정이 V2R 삼차원 구조를 결정하기 위하여 X-선 회절분석으로 분석된다.

본 발명의 다른 관점은 서열번호 1의 잔기 1 내지 57과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열 (Ⅰ)을 포함하고, (ⅰ) X₁은 아스파라긴 (N), X₂는 글리신 (G)이고, X₃ 및 X₄는 소수성 아미노산인 서열번호 1의 15 내지 18 위치 내의 모티프 X₁X₂X₃X₄, 및 (ⅱ) 두 개의 시스테인 잔기 간의 적어도 한 개의 이황화 결합을 포함하며, V2R 길항제 활성을 갖는 분리된 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 단백질은 U-Da2a, U-Da2a 단백질, U-Da2a 펩티드 또는 U-Da2a 독소로 명명된 서열번호 1의 단백질을 포함한다.

본 발명의 단백질은 본 발명에 사용되는 단백질 그룹의 서브그룹에 속한다. 따라서, 본 발명의 단백질은 뱀독 염기성 단백질분해효소 억제제의 특징적인 쿠니츠 접힘 및 V2R 길항제 활성을 갖는다. 본 발명의 단백질은 변형되고, 키메릭이며, 또는 본 발명에 사용되는 상기 단백질을 위하여 전술된 바와 같이 표지된 자연적인, 재조합의 또는 합성의 단백질일 수 있다.

본 발명의 단백질은 공지된 비-펩티드 V2R 길항제에 비하여 하기 유리한 특징들을 갖는다.

- 이는 150개의 다른 GPCRs 및 8개의 심장 이온 채널과 비교하여 V2R에 대한 절대적인 선택성을 갖는 V2R의 매우 선택적인 리간드이다. 예를 들어, U-Da2a는 10,000에 대하여 우수한 V2R/V1a 선택성 지표를 갖는다. 결합된 높은 친화도 및 강한 선택성은 치료적 복용량을 감소시킬 수 있으며, 결과적으로 이차 부작용을 감소시킬 수 있을 것이다.

- 이는 V2R에 대한 나노몰의 (nanomolar) 친화도를 갖는다.

- 이는 V2R의 세 가지 주요 신호전달 경로, 즉, cAMP 축적, 아레스틴 모집 (recruitment) 및 MAP 키나아제 인산화를 차단할 수 있으며, 이에 따라 새로운 유형의 치료법을 야기할 수 있는 최초의 선택적이며 경쟁적인 길항제이다.

- 이는 적어도 90일간의 매일의 포화 복용량을 이용하여 생체 내에서 V2R 표적에 도달하고 어떠한 독성도 없이 강한 이뇨 효과를 생산할 수 있다.

- 펩티드로서, 이는 추가적인 흥미로운 특징들인 펩티드 분해 산물로 인한 독성이 없으며, 완벽한 수용성을 나타내며, 이는 혈액 뇌관문 (blood-brain barrier)을 가로지르지 않을 것이고, 이에 따라 중추 신경계에서 수용체의 기능에 영향을 미치지 않을 것이며, 이는 진단적 도구의 세대를 위한 선도적인 화학적 구조이다.

바람직한 구현 예에 있어서, 본 발명의 단백질은 서열번호 1의 잔기 1 내지 57과 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열 (Ⅰ)을 포함하거나 이로 이루어진다.

다른 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 서열 (Ⅰ)은 최대 75개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 60개의 아미노산을 가지며, 서열번호 1 및 1 내지 15, 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산의 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의한 서열번호 1과 상이한 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 결실(들) 및/또는 삽입(들)은 유리하게 (ⅰ) 서열번호 1에 분포된 하나 내지 다섯 개의 단일 아미노산 결실(들)/삽입(들), 및 (ⅱ) 서열번호 1의 일 또는 양 말단에서 1 내지 5개의 아미노산의 말단 결실(들)로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 말단 결실(들)은 서열번호 4의 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기의 N-말단 결실 및/또는 1 또는 2개의 아미노산 잔기의 C-말단 결실로부터 선택된다.

서열번호 1 내의 치환(들)은 유리하게 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5개의 보존적 치환으로부터 선택될 수 있다. 서열번호 1의 위치 5 및 55, 14 및 38, 및/또는 30 및 51 내의 시스테인 잔기는 바람직하게 돌연변이 되지 않는다.

바람직하게는, 본 발명의 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기의 N-말단 결실 및/또는 1 또는 2개의 아미노산 잔기의 C-말단 결실을 포함하는 서열번호 1의 변이체를 포함하거나 이로 구성된다. 이러한 바람직한 단백질의 예시는 서열번호 11 내지 13이다.

다른 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 서열 (Ⅰ)은 하나 내지 세 개의 (하나, 둘 또는 세 개), 바람직하게는 세 개의 C1 내지 C6가 각각 상기 서열 (Ⅰ)의 N-말단으로부터 C-말단으로 번호 붙여진 시스테인 잔기인 C1과 C6, C2와 C4, 및 C3와 C5 간의 이황화 결합으로부터 선택되는 이황화 결합을 포함한다. 이러한 단백질의 예시로는 각각 세 개 및 두 개의 이황화 결합을 포함하는 서열번호 1 및 16을 들 수 있다. 바람직하게는, C1은 상기 서열 (Ⅰ)의 위치 1 내지 5 (1, 2, 3, 4 또는 5)에 존재하며, C6로부터 50±2개의 아미노산에 의하여 분리되어 있고, C2 및 C4, C3 및 C5는 각각 25±2 및 20±2개의 아미노산으로 분리되어 있다. 더욱 바람직하게는, C1 내지 C6는 각각 서열번호 1의 위치 5, 14, 30, 38, 51 및 55에 존재한다. 또한, C1 및/또는 C6는 바람직하게는 각각 상기 단백질의 최초 및 마지막 잔기이다.

본 발명의 다른 관점은 본 발명의 단백질을 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 합성 또는 재조합 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 이들의 조합인 단일 및/또는 이중나선일 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 단백질이 그 안에서 발현되는 숙주에 최적화된 코딩 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 관점은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 포유동물, 세균 또는 진균 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염되거나 형질전환될 때, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 발현 벡터이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 발현을 위하여 상기 발현 벡터 내로 올바른 방향 및 정확한 해독 틀 (reading frame)로 삽입된다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 작동가능하도록 적어도 하나의 전사 조절 서열에, 선택적으로 적어도 하나의 번역 조절 서열에 연결된다. 재조합 벡터는 예를 들어 플라스미드 및 바이러스성 벡터를 포함하는 유전공학 및 유전자 치료에 사용되는 통상적인 벡터를 포함한다.

본 발명의 다른 관점은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포는 주지된 재조합 DNA 기법을 이용한 본 발명의 단백질의 생산에 유용하다.

본 발명의 다른 관점은 적어도 하나의 본 발명의 단백질, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 관점은 치료제로서의 본 발명의 단백질, 폴리뉴클레오티드, 및/또는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 다른 관점은 본 발명의 단백질, 바람직하게는 표지된 단백질을 포함하는 진단 제제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) 하나 이상의 본 발명의 단백질, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 변형된 숙주세포, 약제학적 조성물, 진단 또는 영상화 제제를 용액 또는 동결건조된 형태로 함유하는 용기; (b) 선택적으로, 동결건조 제형을 위한 희석 또는 재구성 용액을 함유하는 제2 용기; (c) 선택적으로 분리된 V2R 수용체 또는 V2R를 발현할 수 있는 숙주세포를 용액 또는 동결건조된 형태로 함유하는 제3 용기, 및 선택적으로 상기 용액(들)의 사용 및/또는 상기 동결건조된 제형(들)의 재구성 및/또는 사용을 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 V2R는 모든 포유류로부터 기인하는 것이다. 바람직하게는 이는 인간 V2R이다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 공지기술로 알려진 전통적인 방법에 의하여 제조된다. 예를 들어, 이는 PCR 또는 RT-PCR에 의한 핵산의 증폭에 의하여, 상동성 프로브로의 혼성화 (hybridization)에 의한 게놈 DNA 라이브러리를 탐색함으로써, 또는 전체 또는 부분적인 화학적 합성에 의하여 생산된다. 상기 재조합 벡터는 공지기술로 알려진 전통적인 재조합 DNA 및 유전공학 기법에 의하여 구축되고 숙주세포 내로 도입된다.

상기 단백질은 통상의 기술자에게 알려진 전통적인 기법, 특히 고상 (solid-phase) 또는 액상 (liquid-phase) 합성에 의하여 또는 적절한 세포 시스템 (진핵 또는 원핵) 내에서 재조합 DNA의 발현에 의하여 제조된다. 더욱 구체적으로, 상기 단백질 또는 그 유도체는 Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-)에 의하여 최초로 기술된 Fmoc 기법에 의하여 합성되고, 역상 (reverse-phase) 고성능 액체크로마토그래피에 의하여 정제된 고상일 수 있으며; 상기 단백질 및 그 유도체는 또는 통상의 기술자에게 알려진 모든 수단에 의하여 획득된 대응하는 cDNAs로부터 생산될 수 있으며; 상기 cDNA는 진핵 또는 원핵 발현 벡터 내로 클로닝되고 재조합 벡터로 변형된 상기 세포 내에서 생산된 단백질은 모든 적절한 수단, 특히 친화도 크로마토그래피에 의하여 정제된다.

달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 실시는 통상의 기술범위 내에 있는 전통적인 기법을 적용할 것이다. 이러한 기법들은 상기 문헌에 충실하게 설명되어 있다.

상기 구성에 부가하여, 본 발명은 또한 첨부된 도면을 참조하여 후술되는 설명으로부터 도출되며, 본 발명의 목적의 예시적 구현 예에 관한 다른 구성을 포함한다.

실시 예 1: U-Da2a 제조 및 생화학적 특성

1) 물질 및 방법

a) 단백질 추출 및 정제

1 그램의 Dendroaspis angusticep 독 (Latoxan, 프랑스)을 Akta 정제기 (Pfizer, 캐나다)상에서 2㎖/분으로 다-단계 NaCl 구배를 이용하여 Source 15S 상에서 이온 교환에 의해 13개의 분획 (fractions)으로 나누었다. 분획 F를 100분간 0 내지 100% 아세토니트릴 (acetonitrile) 및 0.1% 트리플루오르아세트산 (trifluoroacetic acid) 선형 구배를 이용하여 준비 칼럼 (C18, 15㎛, 20㎝, Vydac, 프랑스, 20㎖/분) 상에서 역-상 크로마토그래피 (Waters 600)에 의하여 더욱 정제하였다. 분획 D를 0.5% 아세토니트릴/분의 구배를 이용하여 C18 Vydac 칼럼 (4.6㎜, 5㎛, 15㎝ 1㎖/분)상에서 최종적으로 정제하였다.

b) 생화학적 특성화

에드먼 분해 (Edman degradation)에 의한 U-Da2a의 서열결정

Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)로부터 구입한 자동 서열분석기인 Procise Model 492 상에서 에드먼 화학을 이용하여 U-Da2a (Biobrene-코팅된 필터에 실린 200pmol)의 N-말단 서열결정을 수행하였다.

근원 감쇠 (In-Source Decay) MALDI-TOF에 의한 서열결정

15㎍의 정제된 U-Da2a를 이황화 결합을 제거하기 위하여 2㎕의 트리스(카르복실에틸)포스핀 (tris(carboxyethyl)phosphine) 100mM (Sigma-Aldrich, St Louis, USA)로 환원시켰다. 50℃에서 1시간 후에, 상기 혼합물을 제조자의 지침에 따라 Zip-Tip C₁₈ 마이크로칼럼 (Millipore, Billarica, MA, USA)상에서 정제하였다. 5㎕의 아세트로니트릴/포름산 (ACN/FA) 0.2% (50/50, v/v)로 상기 환원된 독소의 용출 (elution)을 수행하였다. 아세트로니트릴/포름산 0.1% 50/50 (v/v)로 포화된 1,5-디아미노나프탈렌 (1,5-Diaminonaphthalene) (Acros, Geel, 벨기에)를 근원 감쇠 (in-source decay) 실험에 대한 기질로 사용하였다. 1㎕의 독소 용액 및 1㎕의 상기 기질을 함께 혼합하였고 MALDI 플레이트 상에 점적 (spotted)하였다. 근원 감쇠 (In-Source-Decay, ISD) 파쇄 (fragmentation)를 Nd-YAG Smartbeam 레이저 (MLN 202, LTB)가 장착된 ULTRAFLEX Ⅱ MALDI-TOF/TOF (Bruker Daltonics, Bremen, 독일) 질량 분석계로 기록하였다. 55%로의 레이저 파워 세트로 m/z 900 내지 6500의 스펙트럼이 획득되었다.

U-Da2a의 분해, 펩티드 질량 핑거프린트 및 C-ter 특성화

300ng의 정제된 독소를 5㎕의 50mM NH₄HCO₃ (pH 8)에서 용해시켰다. 그 후, 모든 이황화 결합을 환원시키기 위하여 2㎕의 250mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol, DTT)을 첨가하였다 (56℃에서 30분간). 그 후, 설프히드릴기 (sulfhydryl groups)를 1시간 동안 실온 암실에서 2.2㎕의 500mM 요오드아세트아미드 (iodoacetamide, IAA)로 알킬화시켰다. DTT 및 IAA를 모두 50mM NH₄HCO₃에서 예비적으로 제조하였다. U-Da2a를 분해시키기 위하여 최종적으로 10ng의 소 트립신 (bovine trypsin) (1/30 비율)을 37℃에서 4시간 동안 첨가하였다. Zip-Tip C₁₈ 마이크로칼럼으로 결과적인 펩티드를 탈염시켰으며 10㎕의 ACN/FA 0.2% (50/50, v/v)로 용출시켰다. 1㎕의 이러한 샘플을 MALDI 플레이트 상에 점적시켰으며 기질로 사용된 1㎕의 2,5-디히드록시벤조산 (2,5-dihydroxybenzoic acid, 2,5-DHB)과 혼합하였다. ULTRAFLEX Ⅱ 분광계로 상기 펩티드를 분석하였다 (위 참고). 펩티드 질량 핑거프린트를 m/z 500 내지 3600으로 기록하였다. LIFT-TOF/TOF 기술 (Detlev et al., Suckau, Anal. Bioanal. Chem., 2003, 376, 952-965)을 이용하여 이중 질량 분석법 (tandem mass spectrometry) 실험을 수행하였다.

소프트웨어

모든 자료는 Flex Control 3.0를 이용하여 얻었다. 결과 스펙트럼을 Biotools 3.2 및 Sequence Editor 3.2를 이용하여 분석하였다. 상기 세 종류의 소프트웨어는 Bruker Daltonics로부터 구입하였다.

c) 단백질 합성 및 가공

U-Da2a를 Applied biosystems 433A 펩티드 합성기 (Foster City, CA, USA)에서 합성하였고, 무스카린 독소 (muscarinic toxin) MT1 (Mourier et al., Mol Pharmacol, 2003, 63, 26-35)에 대하여 기술된 방법에 따라 정제 및 폴딩하였다. 간략히, 이는 역상 칼럼 상에서 Fmoc 전략, 펩티드 절단 및 정제를 이용하여 고상 (solid-phase) 합성을 수반하였다. 그 후, 상기 선형 펩티드를 pH 8의 Tris 버퍼에서 글리세롤 (25%)과 산화 및 환원된 글루타티온 (1 mM)의 존재하에 24시간 동안 폴딩시켰다.

2) 결과

V2R에 결합할 수 있는 독소의 존재가 뱀 덴드로아스피스 안구스티셉스 (Dendroaspis angusticeps)로부터 추출된 독의 탐색에 의하여 검출되었다. 정제된 후, 이러한 독소를 두 개의 상보적인 과정인 에드만 분해 (Edman degradation) 및 질량 세분화 (mass fragmentation)로 서열결정하였으며, 생화학적으로 특징지었다.

U-Da2a로 명명된 독소는 3개의 이황화 결합 (Cys1-Cys6, Cys2-Cys4 및 Cys3-Cys5)를 갖고 쿠니츠 (Kunitz) 구조 패밀리에 속하는 57개의 아미노산 펩티드: RPSFCNLPVKPGPCNGFFSAFYYSQKTNKCHSFTYGGCKGNANRFSTIEKCRRTCVG (서열번호 1)이다. 가장 가까운 서열이 덴드로톡신 (dendrotoxins) E, B 및 K, Mulgin-1 및 Blakelin-3 (도 1)과 같은 기타의 뱀독소와 상응한다. 이러한 덴드로톡신은 전압-의존적 칼륨 채널을 차단하는 특성을 갖는다.

고상 펩티드 합성은 GMP 품질로 대량의 U-Da2a의 합성을 가능하게 한다. 그 후, 합성 펩티드를 이황화 결합이 형성되도록 가공하였다. 이러한 자연 산물과 비교하여 동일한 약리학적 특성을 갖는 합성 화합물은 하기 모든 실험에 사용되었다.

실시 예 2: U-Da2a 선택성 프로파일

1) 물질 및 방법

1.1 바소프레신 수용체를 이용한 결합분석

바소프레신 수용체를 발현하는 세포로부터 유래한 막을 PERKINELMER (Courtaboeuf, 프랑스)로부터 구입하였다. 96-웰 플레이트에서 ³H-AVP (PERKINELMER, Courtaboeuf, 프랑스)로 결합 실험을 수행하였다. 반응 혼합물은 최종 100㎕의 부피로 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 10mM MgCl₂ 및 1g/L BSA를 함유하였다. 플레이트를 실온에서 3시간 동안 배양하였다. 세포 수확기 (PERKINELMER, Courtaboeuf, 프랑스)상에서 0.5% 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine)에 미리 침지된 GF/C 필터를 통한 여과에 의하여 결합 반응 종결시켰으며 플레이트를 건조시켰다. Ultimagold O (25㎕; PERKINELMER)를 각각의 웰에 첨가하였고, TopCount 카운터 (PERKINELMER, Courtaboeuf, 프랑스)를 이용하여 샘플을 카운팅하였다 (55%의 카운팅 수율). 1μM AVP의 존재하에 비특이적 결합이 측정되었다. 일-위치 억제 질량 작용 곡선 (one-site inhibition mass action curve)을 Kaleidagraph (Synergy 소프트웨어, Reading, PA, USA)를 이용하여 억제 결합 데이터에 맞추었다. 경쟁 실험을 위하여 Cheng-Prusoff 방정식 (Cheng et al., Biochem. Pharmacol., 1973, 22, 3099-3108)를 이용하여 IC₅₀ 값을 K_i로 전환시켰다.

1.2 FLIPR 분석

상이한 G 단백질-결합-수용체 (GPCRs)에 대한 효능제 및 길항제 활성에 대하여 U-Da2a를 프로파일링하기 위하여 FLIPR 분석을 수행하였다.

퍼센트 활성 및 퍼센트 억제 값을 각각의 GPCR에 대하여 결정하였다. 퍼센트 활성 값을 1μM의 U-Da2a의 초기 첨가에 대하여 결정하였다. 또한, U-Da2a를 퍼센트 억제를 결정하기 전에 25℃에서 2분 동안 배양하였다. 퍼센트 억제 값을 예상 EC₈₀ 농도에서 참조 효능제의 추가에 따라 결정하였다. 모든 웰은 EMD Millipore's GPCRProfiler® Assay Buffer를 이용하여 준비하였다. 상기 GPCRProfiler® Assay Buffer는 HBSS가 20mM HEPES 및 2.5mM 프로베네시드를 pH7.4에서 보충된 변형된 Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)이다. 형광 기준선이 구축된 후 U-Da2a, 운반체 대조구, 및 참조 효능제의 Emax가 상기 분석 플레이트에 첨가된 FLIPR^TETRA 장비 상에서 효능제 분석을 수행하였다. 상기 효능제 분석은 전체 180초였으며, 각각의 분석된 GPCR를 활성화시키는 각각의 화합물의 능력을 평가하기 위하여 사용되었다. 이전에 결정된 EC₈₀ 효능 값 (potency values)을 이용하여 길항제 분석을 수행하였으며, 형광 기준선의 구축 후에 모든 미리 배양된 (2분) 샘플 화합물 웰을 참조 효능제의 EC₈₀ 농도와 비교하였다. 상기 길항제 분석은 상기 효능제 분석에 사용된 것과 동일한 분석 플레이트 및 동일한 기구를 이용하여 수행하였다. 모든 분석 플레이트 데이터는 적절한 기준선 교정을 위하여 제공되었다. 기준선 교정이 적용된 후, 최대 형광 값을 전달하였고 (exported), (Emax 참조 효능제 및 운반체 대조구 값에 상대적인) 백분율 활성, (EC₈₀ 및 운반체 대조구 값에 상대적인) 백분율 억제, 및 각각의 플레이트의 품질을 평가하기 위한 추가적인 통계적 수치 (즉, Z', 복제 데이터 값들 간의 백분율 차이 (variation))를 계산하기 위하여 데이터를 처리하였다. 분석 플레이트 데이터가 거부되었을 때, 추가적인 실험을 수행하였다.

1.3 전기 생리학적 분석

제조자의 지침에 따라 IonWorks Quattro 및 IonWorks HT 전기생리학적 플랫폼 (MOLECULAR DEVICES)으로 심장 이온 채널 (Nav1.5, Cav1.2, Kv4.3/KChIP2, Kv1.5, KCNQ1/mink, Kir2.1, hERG, HCN4) 에 대한 활성에 관하여 U-Da2a를 테스트하기 위한 전기 생리학적 분석을 수행하였다. U-Da2a를 물에 300μM 농도로 준비하였다. 저장물 용액을 마스터 플레이트 및 웰 당 2㎕의 상기 용액이 놓인 분석 플레이트로 옮겼다. 분석 수행일에, 적절한 DMSO농도를 함유하는 198㎕의 외부 용액을 첨가하였으며 완전히 혼합하였다. 이를 통하여 1:100 희석액을 제조하였다. IonWorks에서 상기 세포 상에 첨가하여 발생한 추가적인 1:3 희석액은 전체 1:300을 제공하였다. 각각의 분석 플레이트 상에서, 적어도 8개의 웰이 운반체 대조구 (0.3% DMSO)를 위하여 배정되었으며, 적어도 8개의 웰이 테스트된 세포주에 대하여 특이적인 각각의 양성 대조구에 대하여 배정되었다. 상기 양성 대조구는 최대 차단 및 대략적인 IC₅₀ 농도에서 테스트되었다. 양성 대조구로 사용된 화합물: Nav1.5 100μM 및 5mM 리도카인 (Lidocaine), Kv4.3/KChIP2 20μM 및 500μM 퀴니딘 (Quinidine), Cav1.2 1μM 및 100μM 니트레디핀 (Nitrendipine), Kv1.5 300μM 및 10mM 4-AP, KCNQ1/minK 10μM 및 100μM 크로마놀 (Chromanol) 293B, hERG 0.1μM 및 1μM 시사프리드 (Cisapride), HCN4 50μM 및 3mM 세슘 (Cesium), Kir2.1 20μM 및 500μM 바륨 (Barium).

2) 결과

방사능 표지된 리간드 ³H-AVP를 이용하여 세 종류의 바소프레신 수용체 서브타입에 대하여 평형 상태에서 결합 테스트를 수행하였다. U-Da2a는 V2R에 대하여 2 내지 5 nM 사이의 친화도를 갖는 반면, 1μM의 농도에서 조차도 상기 독소는 V1aR 및 V1bR에 대하여 ³H-AVP의 결합을 억제하지 않았다 (도 2).

157 GPCRs: M1, M2, M3, M4, M5, A1, A2B, A3, 알파1A, 알파1B, 알파1D (D2-79), 알파2A, 베타 1, 베타 2, 베타 3, C3aR, C5aR, AT1, APJ, BB1, BB2, BB3, 브라드키닌 (Bradykinin) B2, CGPR1, CaS, CB1, CB2, ChemR23, CCR1, CCR10, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5 히말라야 원숭이 (rhesus macaque), CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, XCR1/GPR5, CCK1, CCK2, CRF1, CRF2, D1, D2L, D4, D5, ETA, ETB, GPR41, GPR43, GABAB1b, GAL1, GAL2, 그렐린 수용체 (Ghrelin Receptor), GIP, GLP-1, GLP-2, 글루카곤 (glucagon), 분비 수용체 (secretin receptor), mGlu1, mGlu2, TSH, GnRH, H1, H2, H3, GPR99, GPR54, BLT1, CysLT1, CysLT2, LPA1, LPA3, LPA5 /GPR92, S1P1, S1P2, S1P3, S1P4, S1P5, MrgD, MRGX1, MRGX2, MCHR1, MCHR2, MC2, MC4, MC5, 모틸린 ㅅ수용체 (motilin receptor), NMU1, NMU2, NPBW1/GPR7, Y2, Y4, NTR1, FPR1, FPRL1, GPR109A, 델타, 카파, 뮤, NOP/ORL1, OX1, OX2, GPR39, OT, GPR103/QRFP, P2RY1, P2RY2, P2RY4, P2RY11, P2RY12, PAF, PK1, PK2, PRP, DP, EP1, EP2, EP3, EP4, FP, IP1, TP, 트립신-활성화된 PARs, 트롬빈-활성화된 PARs, PTH1, PTH2,5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT4B, 5-HT6, SST2, SST3, SST4, SST5, GPR68/OGR1, SUCNR1/GPR91, NK1, NK2, NK3, TRH, GPR14, V1A, V1B, V2, PAC1 장쇄 아형, VPAC1 및 VPAC2에 대한 효능제 및 길항제 활성에 대하여 U-Da2a를 프로파일링하기 위하여 FLIPR 분석을 수행하였다. U-Da2a 활성은 V2R에 대하여만 검출되었으며, 69%로 길항작용 (antagonized)되었고, 따라서 V2R 수용체에 대한 U-Da2a의 선택성을 증명하였다.

심장 이온 채널 Nav1.5, Cav1.2, Kv4.3/KChIP2, Kv1.5, KCNQ1/mink, Kir2.1, hERG 및 HCN4에 대한 활성에 대하여 U-Da2a를 테스트하기 위하여 전기 생리학적 분석을 수행하였다. U-Da2a는 1μM의 농도에서 어떠한 이온 채널에 대하여도 중대한 억제를 나타내는 것으로 나타나지 않았다. 이러한 결과는 U-Da2a가 심장 이온 채널에 대한 덴드로톡신의 알려진 활성과 상이하며 예상치 못한 V2R에 대한 특유의 활성을 갖는다는 것을 증명한다.

실시 예 3: U-Da2a 약리학적 효과의 시험관 내 특성화

1) 물질 및 방법

1.1 바소프레신으로 V2R의 활성화에 의한 cAMP 생산에 대한 경쟁적 길항 효과

인간 V2R를 발현하는 안정적으로 형질감염된 CHO 세포 (Cotte et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 29462-68; Phalipou et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 23316-23327)를 96 웰에 도포하였다. 24시간 후에 상기 세포를 cAMP-특이적 포스포디에스테라아제의 선택적 억제제인, DMEM, 5%BSA 및 0.1mM　 RO 201724 (CALBIOCHEM # 557502; MERCK-MILLIPORE)를 함유하는 50㎕ 부피의 배양 배지에서 증가된 농도의 U-Da2a의 부존재 (대조구 조건) 또는 존재 (억제조건)에서 증가된 농도의 AVP로 24시간 동안 자극하였다. cAMP Dynamic 2 키트 (Cisbio-International)를 이용하여 Cisbio-International에 의해 개발된 Homogeneous Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer 기술 (HTRF®)을 이용하여 cAMP 측정을 수행하였다. 37℃에서 30분간 자극 후에, 상기 배양 배지에 용해 버퍼 50 ㎕를 첨가함으로써 상기 세포를 용해시켰다. 상기 용해 버퍼는 665nm에서 발산하는 수용체 형광단 (cAMP-d2)으로 표지된 cAMP를 함유하였다. 그 후, 620nm에서 발산하는 공여자 형광단 (Anti-cAMP Europium Kryptate= AC-K)으로 표지된 항-cAMP 항체를 함유하는 50㎕의 용해 버퍼를 첨가하였다. 내재 cAMP의 부존재하에, FRET 비율 665/620는 cAMP-d2와 AC-K 간에 최대이다. 자극 후 세포에 의하여 내재 cAMP가 생산되자마자, 이는 cAMP-d2와 경쟁하며, 상기 비율 665/620는 감소한다. 내재 cAMP 농도는 실험적인 665/620 비율과 알려진 cAMP 농도로 구축된 표준곡선을 비교하여 결정된다. 이러한 측정을 Rubystar 소프트웨어를 갖는 레이저-기반 HTRF®판독기 Rubystar상에서 수행하였다.

1.2 바소프레신에 의한 V2R 활성화 후 β-아레스틴-1 유동화에 대한 독소 U-Da2a의 경쟁적 길항제 효과

2.5×10⁶ tsA 세포, SV40 온도 민감성 T 항원 (ECACC)을 안정적으로 발현하고, hV2Rluc (PHARMINGEN #556104, BD BIOSCIENCE; Terrillon et al., Mol. Endocrinol., 2003, 17, 677-691)에 대한 150ng의 pRK5 발현 플라스미드 및 β-아레스틴-1-YFP (pEYFP-N1 (CLONTECH) 내로 클로닝된 β-아레스틴; Scott et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 3552-3559)에 대한 1mg의 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 형질전환 인간 신장 (HEK293) 세포주를 6-웰 플레이트에 접종하였다. 형질감염 48시간 후에, 세포를 146mM NaCl, 4.2mM KCl, 0.5mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 10mM HEPES pH7.4, 1㎎/㎖ 글루코오스를 함유하는 KREBS 버퍼로 세척하였으며, 이러한 버퍼 1㎖에서 재현탁시켰다. 96-웰 플레이트에서 30㎕의 세포 현탁액 (75,000 세포), 10㎕의 KREBS 버퍼 (대조구 조건) 또는 증가하는 농도의 바소프레신 (자극된 대조구 조건) 또는 증가하는 농도의 독소의 존재 (억제제로 자극된 조건)의 어느 하나를 함유하는 리간드 혼합물을 함유하는 50㎕의 최종 부피로 V2-Rluc와 β-아레스틴-1-YFP 간에 생물발광 공명 에너지 전이 (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) (BRET^TM) 측정을 수행하였다. 그 후, 10㎕의 코엘렌테라진 h (Coelenterazine h) (Renilla luciferin; MOLECULAR PROBES C-6780, INVITROGEN, LIFE TECHNOLOGIES), 루시페라아제 기질을 상기 혼합물에 첨가하였고, MikroWin 2000 소프트웨어 (Mikrotek Laborsysteme, GmbH)를 이용하여 마이크로프레이트 발광측정기 (Mithras LB940 Berthold Technologies)에서 BRET 측정을 수행하기 전에 37℃에서 배양하였다.

1.3 AVP에 의한 활성화 후 독소 U-Da2a의 MAP 키나아제 인산화에 대한 경쟁적 길항제 효과

10×10⁶ tsA 세포, SV40 온도 민감성 T 항원 (ECACC)을 안정적으로 발현하고, 인간 V2R (PHARMINGEN #556104, BD BIOSCIENCE; Terrillon et al., Mol. Endocrinol., 2003, 17, 677-691)에 대한 500ng의 pRK5 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 형질전환 인간 신장 (HEK293) 세포주를 폴리-오르니틴-코팅된 96-웰 플레이트에 10% 혈청을 함유하는 DMEM 배지로 웰 당 75,000 세포로 도포하였다. 8시간 및 24시간 후에,상기 세포를 무-혈청 배지에서 굶겼으며 다시 27시간 후에 자극하였다. 형질감염된 세포를 DMEM (대조구 조건) 또는 증가된 투여량의 AVP (자극된 조건) 또는 AVP 및 독소의 혼합물 (억제제로 자극된 조건)으로 37℃에서 10분간 배양하였다. 그 후, 상기 배지를 Cellul'ERK 키트 (Cisbio International)의 용해 버퍼 50㎕로 대체하였고 상기 세포를 실온에서 30분간 배양하였다. 384 웰 플레이트에서, 16㎕의 용해된 세포에, 우선 수용체 형광단 (665nm에서 발산하는 AC-ERK-P-d2)로 표지된 인산화된 ERK에 대한 2㎕의 항체와 그 후, 공여자 형광단 (620nm에서 발산하는 AC-ERK-K)으로 표지된 전체 ERK에 대한 2㎕의 항체를 첨가하였다. ERK 인산화가 일어나면, 상기 공여자에 가까이 있는 수용체는 FRET 신호를 생산하며 665nm에서 발산할 수 있다. 665/620 비율의 증가는 MAP 키나아제 인산화의 증가에 상응한다. 두 시간 후, RT-FRET를 Rubystar 소프트웨어를 갖는 레이저-기반 HTRF®판독기 Rubystar상에서 수행하였다.

2) 결과

U-Da2a 약리학적 효과의 시험관 내 특성화는 U-Da2a는 -0.91±0.02의 실드 계수 (shild coefficient), 12.0±0.4nM의 K_inact 와 7.92±0.02의 PA2로 경쟁적 방법으로 V2R 활성화에 의해 유도된 cAMP생산을 억제할 수 있음을 증명한다 (도 3a 및 3b). U-Da2a는 또한 hV2-Rluc 수용체상에서 -0.9±0.2의 실드 계수 및 110±50nM의 K_inact 와 7.0±0.2의 PA2로 경쟁적인 방법으로 β-아레스틴-1-YFP 유동화를 억제할 수 있다 (도 4a 및 4b). 마지막으로, U-Da2a는 V2R의 AVP 자극 후 -0.9±0.2의 실드 계수 및 210±80nM의 K_inact 와 6.9±0.2의 PA2로 경쟁적인 방법으로 MAP 키나아제 인산화를 억제할 수 있다. 이러한 기능적인 세포 분석은 V2R의 세 가지 주요한 신호전달 경로 즉, cAMP 축적, 아레스틴 모집 (recruitment) 및 MAP 키나아제 인산화에 대한 U-Da2a의 경쟁적인 길항제 특성을 증명하였다.

실시 예 4: U-Da2a의 약리학적 효과의 생체 내 특성화

1) 물질 및 방법

1.1 약물-반응 실험

상기 독소를 1mg/ml의 농도로 0.9 % NaCl에서 용해시켰다. 성체 CD1^{pcy / pcy} (Takahashi et al., J. Urol., 1986, 135, 1280-1283, 및 J. Am. Soc. Nephrol., 1991, 1, 980-989 및 Olbrich et al., Nature Genetics, 2003, 34, 455-459)와 성체 C57BL/6 생쥐에 복강 내 및 피하로 상기 독소를 1, 0.1 및 0.01μmol 독소/체중kg의 복용량으로 주입하였다. 1, 3 및 5일 후 처음으로 주입한 생쥐를 24시간 동안 대사 케이지에 가두었다. 수집된 소변을 14,000rpm으로 30분간 원심분리시켰다. 소변 삼투압 (mOs/kg)을 Knauer 삼투압측정계로 결정하였고, 피펫으로 측정하였다.

1.2 장기 복용 실험

상기 독소를 1mg/ml의 농도로 0.9% NaCl에서 용해시켰으며 복강 내로 0.1μmol/kg/일의 복용량으로 성체 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에 투여하였다. 0, 30 70 및 99일째, 대사 케이지 내에서 소변을 24시간 동안 수집하고 소변 부피 및 소변 삼투압을 결정하였다.

2) 결과

상기 독소의 생체 내 효과를 다낭성 신장병의 동물 모델인 CD1^{pcy / pcy} 생쥐 주에서 테스트하였고, 여기에서 V2R 길항제는 이전에 낭포 형성을 억제하는 것으로 나타났다. U-Da2a가 V2R의 세 가지 신호전달 경로를 억제하는 V2R의 특이적이고 선택적이며 생물학적으로 이용가능한 길항제이므로, 이러한 독소는 다낭성 신장병에 대한 가치있는 치료적 약제임을 나타낸다.

첫 번째 세트의 실험에서, CD1^{pcy / pcy} 생쥐에 상기 독소를 0.1μmol/kg의 단일 투여량으로 복강 내 및 피하로 투여하였다. CD1^{pcy / pcy} 생쥐에 대한 기본 상태에서의 소변 부피는 높은 삼투압에 비하여 매우 적었다. 반면, 1μmol/kg에서의 복강 내 및 피하로의 U-Da2a 주입은 이뇨 효과를 야기하는 V2R에 대한 상기 독소의 길항제 효과에 기인하여 소변 부피의 현격한 증가를 야기했다 (도 6). 상기 이뇨 효과는 소변 부피의 증가에 기인하여 삼투압의 현격한 감소 즉, 염 농도의 감소와 관련이 있었다 (도 7). 이러한 결과들은 U-Da2a가 피하 또는 복강 내로 생체 내 그 표적인 V2R에 도달할 수 있음을 증명한다. 기술적인 이유로, 복강 내 경로로 용인된 (tolerated) 웰을 다음 테스트에 사용하였다.

두 번째 세트의 실험에서, CD1^{pcy / pcy} 생쥐에 상기 독소를 1, 0.1 및 0.01μmol 독소 /체중 kg의 복용량으로 복강 내로 투여하였다. 상기 독소의 주입 후에 복용량-의존적 이뇨 효과 및 소변 삼투압의 감소가 관찰되었다 (각각 도 8 및 9). 상기 독소의 최대 효과를 관찰하기 위하여 0.1μmol/kg의 복용량이 충분하다.

세 번째 세트의 실험에서, 상기 독소를 0.1μmol/kg/일의 복용량으로 99일간 투여하였다. 0, 30, 70 및 99일째, 소변 부피 및 소변 삼투압 (각각 도 10 및 11)을 결정하였다. 상기 독소의 장기간 (99일) 주입 후에 어떠한 독성 효과도 검출되지 않았다.

실시 예 5: pcy 생쥐에 있어서 낭포 형성에 대한 치료제로서 테스트되는 U-Da2a 효율에 대한 임상적 시도

1) 물질 및 방법

상기 독소를 1mg/ml의 농도로 0.9% NaCl에서 용해시켰다. 10주령의 CD1^pcy/pcy 생쥐에게 0.1μmol 독소/체중kg의 복용량으로 상기 독소를 99일간 복강 내로 주입하였다. 그 후, 상기 생쥐를 4% 파라포름알데히드/1x인산완충용액으로 살포-고정하였고, 신장 및 심장을 적출하여 무게를 측량하였다. 그 후, 낭포 형성에 대한 상기 독소의 효과를 평가하기 위하여 상기 체중당 신장 중량 또는 심장 중량과 심장 중량에 대한 신장 중량의 비율을 계산하였다. 신장은 파라핀에 묻었다. 횡단 신장 절편을 헤마톡실린 (hematoxylin) 및 에오신 (eosin)으로 염색하였다. 프로그램 ImageJ를 이용하여 낭포 숫자를 결정하였으며, 상기 절편의 크기와 연관지어 상대적인 낭포 숫자를 도출하였다.

2) 결과

0.1μmol/kg의 복용량으로 U-Da2a의 투여는 CD1^{pcy / pcy} 생쥐에서 신장 질량을 감소시킨다 (도 12). 또한, 상기 신장의 조직학적 분석은 U-Da2a로의 치료가 낭포의 숫자를 현저하게 감소시킨다는 것을 증명한다 (도 13).

실시 예 6: V2R 길항제 활성에 수반된 U-Da2a 아미노산 잔기의 결정

1) 물질 및 방법

실시 예 1에서 U-D2a에 대하여 기술된 프로토콜을 이용하여 상기 단백질을 제조하였으며, 실시 예 2에 기술된 바와 같이 V2R 결합 분석을 수행하였다.

2) 결과

하기 U-Da2a 변이체 및 공지된 덴드로톡신에 대하여 경쟁 결합 분석을 수행하였다.

- 4개 아미노산 잔기의 N-말단 결실을 갖는 U-Da2a 변이체 (U-Da2a-delta4 N-ter, 서엷번호 11),

- 2개의 아미노산 잔기의 N-말단 결실 및 2개의 아미노산 잔기의 C-말단 결실을 갖는 U-Da2a 변이체 (U-Da2a-delta2 N-ter/delta2 C-ter, 서열번호 12)

- 치환 S3K를 갖는 U-Da2a 변이체 (U-Da2a-S3K, 서열번호 15),

- 치환 N15K/G16A를 갖는 U-Da2a 변이체 (U-Da2a- N15K, G16A, 서열번호 14),

- Dtx-B A27S (서열번호 3)

- Dtx-K (서열번호 8),

- DtxE R55 (서열번호 7), 및

- 치환 C14S 및 C38S를 갖는 U-Da2a 변이체 (서열번호 16).

이러한 결과들은 N-말단 영역에서 N- 및/또는 C-말단 결실 또는 치환을 갖는 U-Da2a 변이체가 U-Da2a와 비교하여 V2R에 대한 유사한 친화도를 나타내기 때문에 U-Da2a의 N-말단 및 C-말단 영역이 V2R 결합 및 원래의 리간드인 AVP의 결합을 억제함으로써 그 활성을 차단하는 데 불필요하다는 것을 증명한다 (도 14 및 표 1).

대조적으로, 염기성 췌장 트립신 억제제 (BPTI)의 활성 부위의 위치에 대하여 상동 위치에 있으나, 상이한 아미노산 서열 (U-Da2a에 대하여는 N15, G16이며, BPTI에서는 K15 및 A16)에 상응하는, 잔기 N15 및 G16는 잔기 K 및 A로 치환된 위치 15 및 16에서 NG 잔기를 갖는 U-Da2a 변이체가 V2R에 대하여 1000배 낮은 친화도를 나타내기 때문에 V2R 결합 및 그 활성 억제에 필수적이다.

V2R에 대한 리간드의 결합 친화도

리간드	Ki (nM±SEM)
AVP	1.44±0.69
U-Da2a-WT	1.03±0.34
U-Da2a-delta4 N-ter	1.57±1.20
U-Da2a-delta2 N-ter/delta2 C-ter	3.23±2.31
U-Da2a-S3K	1.29±0.34
U-Da2a- N15K, G16A	8030±1300

이러한 결과들은 위치 15 및 16에 K 및 A를 갖는 DTx-E-R55가, BPTI와 같이, U-D2a로의 80% 억제를 얻기 위하여 요구되는 것보다 100배 높은 농도에서조차도 V2R를 차단할 수 없다는 것을 나타내는, 위치 15 및 16에 상이한 잔기를 갖는 덴드로톡신을 이용한 결합 분석에 의하여 확증되었다 (도 15). 유사하게, 위치 15 및 16에 K 및 R를 갖는 DTx-K로 어떠한 V2R 억제도 얻을 수 없었다. 대조적으로, 위치 15 및 16에 M 및 F를 갖는 Dtx-B A27S는 U-D2a의 경우와 유사하게 V2R 억제 능력을 갖는다 (도 15).

이러한 결과들은 U-Da2a 약물분자구조 (pharmacophore)는 BPTI의 활성 부위의 위치에 상응하는 위치, N 및 C-말단 영역에 의하여 정의된 것에 반대되는 상기 독소의 부분에 위치한 루프 내에 있음을 나타낸다. V2R 길항제 활성은 위치 15 및 16에 NG 또는 MF를 필요로 한다.

U-Da2a 활성에 있어서 이황화 결합의 중요성을 (C2와 C4 사이의) 제2 이황화 결합이 결여된 변이체 U-Da2a C14S, C38S로 테스트하였다. 단지 2 개의 이황화 결합을 갖는 독특한 쿠니츠 접힘 독소 Conkunitzin-S1 (Accession number UniProtKB/Swiss-Prot P0C1X2; SEQ ID NO: 17)의 존재의 관점에서, 이러한 이황화 결합을 제거하였다. 이러한 독소는 상기 제2 결합을 결여하며, 정규적인 3(10)-베타-베타-알파 쿠니츠 접힘을 채용하며, 칼륨 채널에 대한 활성을 나타낸다 (Buczek et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 2006, 62, 980-90).

V2R에 대한 결합 분석은 야생형 U-Da2a의 K_i는 1.03nM과 동일하며 C14S, C38S 변이체의 경우는 6200nM과 동일하다는 것을 나타낸다 (도 16). 이러한 결과는 본 발명의 단백질의 V2R 길항제 활성은 (C1과 C6, C2와 C4 및 C3와 C5 간의) 3개의 이황화 결합이 상기 단백질 내에 존재할 때 개선된다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES <120> PEPTIDE ANTAGONISTS OF THE VASOPRESSIN-2 RECEPTOR <130> 263EP518 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 57 <212> PRT <213> Dendroaspis angusticeps <400> 1 Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser 20 25 30 Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile 35 40 45 Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly 50 55 <210> 2 <211> 57 <212> PRT <213> Dendroaspis polylepis <400> 2 Arg Pro Tyr Ala Cys Glu Leu Ile Val Ala Ala Gly Pro Cys Met Phe 1 5 10 15 Phe Ile Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Lys Gly Ala Asn Lys Cys Tyr Pro 20 25 30 Phe Thr Tyr Ser Gly Cys Arg Gly Asn Ala Asn Arg Phe Lys Thr Ile 35 40 45 Glu Glu Cys Arg Arg Thr Cys Val Val 50 55 <210> 3 <211> 57 <212> PRT <213> Dendroaspis polylepis <400> 3 Arg Pro Tyr Ala Cys Glu Leu Ile Val Ala Ala Gly Pro Cys Met Phe 1 5 10 15 Phe Ile Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Lys Gly Ser Asn Lys Cys Tyr Pro 20 25 30 Phe Thr Tyr Ser Gly Cys Arg Gly Asn Ala Asn Arg Phe Lys Thr Ile 35 40 45 Glu Glu Cys Arg Arg Thr Cys Val Val 50 55 <210> 4 <211> 83 <212> PRT <213> Pseudechis australis <400> 4 Met Ser Ser Gly Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Thr Leu Trp 1 5 10 15 Glu Val Leu Thr Pro Val Ser Ser Lys Asp Arg Pro Arg Phe Cys Glu 20 25 30 Leu Pro Ala Asp Pro Gly Pro Cys Asn Gly Leu Phe Gln Ala Phe Tyr 35 40 45 Tyr Asn Pro Val Gln Arg Thr Cys Leu Lys Phe Arg Tyr Gly Gly Cys 50 55 60 Lys Gly Asn Pro Asn Thr Phe Lys Thr Ile Glu Glu Cys Lys Arg Thr 65 70 75 80 Cys Ala Ala <210> 5 <211> 83 <212> PRT <213> Pseudechis australis <400> 5 Met Ser Ser Gly Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Thr Leu Trp 1 5 10 15 Glu Val Leu Thr Pro Val Ser Ser Lys Asp Arg Pro Lys Phe Cys Glu 20 25 30 Leu Pro Ala Asp Pro Gly Pro Cys Asn Gly Leu Phe Gln Ala Phe Tyr 35 40 45 Tyr Asn Pro Val Gln Arg Lys Cys Leu Lys Phe Arg Tyr Gly Gly Cys 50 55 60 Lys Ala Asn Pro Asn Thr Phe Lys Thr Ile Glu Glu Cys Lys Arg Ile 65 70 75 80 Cys Ala Ala <210> 6 <211> 59 <212> PRT <213> Dendroaspis polylepis <400> 6 Leu Gln His Arg Thr Phe Cys Lys Leu Pro Ala Glu Pro Gly Pro Cys 1 5 10 15 Lys Ala Ser Ile Pro Ala Phe Tyr Tyr Asn Trp Ala Ala Lys Lys Cys 20 25 30 Gln Leu Phe His Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser 35 40 45 Thr Ile Glu Lys Cys Arg His Ala Cys Val Gly 50 55 <210> 7 <211> 59 <212> PRT <213> Dendroaspis polylepis <400> 7 Leu Gln His Arg Thr Phe Cys Lys Leu Pro Ala Glu Pro Gly Pro Cys 1 5 10 15 Lys Ala Ser Ile Pro Ala Phe Tyr Tyr Asn Trp Ala Ala Lys Lys Cys 20 25 30 Gln Leu Phe His Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser 35 40 45 Thr Ile Glu Lys Cys Arg Arg Ala Cys Val Gly 50 55 <210> 8 <211> 79 <212> PRT <213> Dendroaspis polylepis <400> 8 Ser Gly His Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Thr Leu Trp Ala Glu 1 5 10 15 Leu Thr Pro Val Ser Gly Ala Ala Lys Tyr Cys Lys Leu Pro Leu Arg 20 25 30 Ile Gly Pro Cys Lys Arg Lys Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Lys Trp Lys 35 40 45 Ala Lys Gln Cys Leu Pro Phe Asp Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Ala 50 55 60 Asn Arg Phe Lys Thr Ile Glu Glu Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly 65 70 75 <210> 9 <211> 59 <212> PRT <213> Dendroaspis angusticeps <400> 9 Gln Pro Arg Arg Lys Leu Cys Ile Leu His Arg Asn Pro Gly Arg Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Lys Ile Pro Ala Phe Tyr Tyr Asn Gln Lys Lys Lys Gln Cys 20 25 30 Glu Arg Phe Asp Trp Ser Gly Cys Gly Gly Asn Ser Asn Arg Phe Lys 35 40 45 Thr Ile Glu Glu Cys Arg Arg Thr Cys Ile Gly 50 55 <210> 10 <211> 100 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 10 Met Lys Met Ser Arg Leu Cys Leu Ser Val Ala Leu Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Gly Thr Leu Ala Ala Ser Thr Pro Gly Cys Asp Thr Ser Asn Gln Ala 20 25 30 Lys Ala Gln Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro 35 40 45 Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu 50 55 60 Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe 65 70 75 80 Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Ile Gly Pro 85 90 95 Trp Glu Asn Leu 100 <210> 11 <211> 53 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 11 Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly Phe Phe Ser Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser Phe Thr Tyr Gly 20 25 30 Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile Glu Lys Cys Arg 35 40 45 Arg Thr Cys Val Gly 50 <210> 12 <211> 53 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 12 Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly Phe Phe 1 5 10 15 Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser Phe Thr 20 25 30 Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile Glu Lys 35 40 45 Cys Arg Arg Thr Cys 50 <210> 13 <211> 51 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 13 Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly Phe Phe Ser Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser Phe Thr Tyr Gly 20 25 30 Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile Glu Lys Cys Arg 35 40 45 Arg Thr Cys 50 <210> 14 <211> 57 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 14 Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser 20 25 30 Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile 35 40 45 Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly 50 55 <210> 15 <211> 57 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 15 Arg Pro Lys Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser 20 25 30 Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile 35 40 45 Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly 50 55 <210> 16 <211> 57 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 16 Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Ser Asn Gly 1 5 10 15 Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser 20 25 30 Phe Thr Tyr Gly Gly Ser Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile 35 40 45 Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly 50 55 <210> 17 <211> 60 <212> PRT <213> Conus striatus <400> 17 Lys Asp Arg Pro Ser Leu Cys Asp Leu Pro Ala Asp Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Lys Ala Glu Lys Arg Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Arg Lys Gln Cys 20 25 30 Leu Arg Phe Asp Tyr Thr Gly Gln Gly Gly Asn Glu Asn Asn Phe Arg 35 40 45 Arg Thr Tyr Asp Cys Gln Arg Thr Cys Leu Tyr Thr 50 55 60

Claims (17)

1. 서열번호 1의 잔기 1 내지 57과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
   (ⅰ) X₁은 아스파라긴 (N)이고, X₂는 글리신 (G)이며, X₃ 및 X₄는 소수성 아미노산인 서열번호 1의 15 내지 18 위치 내의 모티프 X₁X₂X₃X₄, 및
   (ⅱ) 두 개의 시스테인 잔기 간의 한 개 내지 세 개의 이황화 결합을 포함하며, V2R 경로를 수반하는 질병의 치료에 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열;
   하나 내지 네 개의 아미노산 잔기의 N-말단 결실, 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 C-말단 결실, 또는 이들의 조합을 포함하는 서열번호 1의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
   상기 단백질은 정상용량 또는 과다용량 저나트륨혈증을 특징으로 하는 병적 질환, 부적절한 항이뇨 신성 증후군, 선천적 신성요붕증, 다낭성 신장병, 암, 혈전증, 및 메니에르병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 치료에 사용되는 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질.
4. 청구항 1 또는 2에 있어서,
   V2R 발현 수준의 증가 또는 감소를 수반하는 병증을 진단하기 위하여 생체 내에서 사용되는 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질.
5. 청구항 1 또는 2에 있어서,
   상기 단백질은 시험관 내에서 V2R 발현 수준의 증가 또는 감소를 수반하는 병증을 진단하기 위한 것인 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질.
6. 청구항 1 또는 2에 있어서,
   상기 단백질은 V2R 리간드를 탐색하기 위한 것인 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질.
7. 청구항 1 또는 2에 있어서,
   상기 단백질은 V2R 결정을 생산하기 위한 결정화제로서 사용하기 위한 것인 바소프레신-2 수용체 (V2R) 길항제로 사용하기 위한 분리된 단백질.
8. 서열번호 1의 잔기 1 내지 57과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
   (ⅰ) X₁은 아스파라긴 (N)이고, X₂는 글리신 (G)이며, X₃ 및 X₄는 소수성 아미노산인 서열번호 1의 15 내지 18 위치 내의 모티프 X₁X₂X₃X₄, 및
   (ⅱ) 두 개의 시스테인 잔기 간의 한 개 내지 세 개의 이황화 결합을 포함하며, V2R 길항제 활성을 갖는 분리된 단백질.
9. 청구항 8에 있어서,
   상기 서열은 서열번호 1의 하나 내지 네 개의 아미노산 잔기의 N-말단 결실, 서열번호 1의 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 C-말단 결실, 또는 이들의 조합을 포함하는 V2R 길항제 활성을 갖는 분리된 단백질.
10. 청구항 8에 있어서,
    상기 서열은 C1 내지 C6가 각각 상기 서열의 N-말단으로부터 C-말단으로 번호 붙여진 시스테인 잔기인 C1과 C6, C2와 C4, 및 C3와 C5 간의 이황화 결합으로부터 선택되는 하나 내지 세 개의 이황화 결합을 포함하는 V2R 길항제 활성을 갖는 분리된 단백질.
11. 청구항 10에 있어서,
    상기 C1 내지 C6는 각각 서열번호 1의 5, 14, 30, 38, 51 및 55위치에 존재하는 V2R 길항제 활성을 갖는 분리된 단백질.
12. 청구항 8에 있어서,
    상기 단백질은 서열번호 1 및 11 내지 13의 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되는 것인 V2R 길항제 활성을 갖는 분리된 단백질.
13. 청구항 8에 있어서,
    상기 단백질은 표지된 것인 V2R 길항제 활성을 갖는 분리된 단백질.
14. 청구항 8에 따른 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
15. 청구항 8 내지 12의 어느 한 항에 따른 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 14에 따른 벡터로 변형된 숙주세포.
16. 적어도 (ⅰ) 청구항 8 내지 12의 어느 한 항에 따른 단백질, 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 (ⅱ) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
    - 울혈성 심부전 (congestive heart failure, CHF), 간경변 (cirrhosis), 부적절한 항이뇨 호르몬 분비 증후군 (Syndrome of Inappropriate Antidiuretic Hormone secretion, SIADH) 또는 뇌부종을 포함하는 정상용량 또는 과다용량 저나트륨혈증을 특징으로 하는 병적 질환,
    - 부적절한 항이뇨의 신성증후군 (Nephrogenic Syndrome of Inappropriate Antidiuresis, NSIAD),
    - 선천적 신성요붕증 (Congenital Nephrogenic Diabetes Insipidus, cNDI),
    - 다낭성 신장병 (Polycystic kidney disease),
    - 신장암 및 폐암을 포함하는 암,
    - 혈전증 (thrombosis), 및
    - 메니에르병 (Meniere disease)을 포함하는 군으로부터 선택되는 V2R 경로를 수반하는 질병의 치료를 위한 약제학적 조성물.
17. 청구항 13에 따른 표지된 단백질을 포함하는,
    - 울혈성 심부전 (congestive heart failure, CHF), 간경변 (cirrhosis), 부적절한 항이뇨 호르몬 분비 증후군 (Syndrome of Inappropriate Antidiuretic Hormone secretion, SIADH) 또는 뇌부종을 포함하는 정상용량 또는 과다용량 저나트륨혈증을 특징으로 하는 병적 질환,
    - 부적절한 항이뇨의 신성증후군 (Nephrogenic Syndrome of Inappropriate Antidiuresis, NSIAD),
    - 선천적 신성요붕증 (Congenital Nephrogenic Diabetes Insipidus, cNDI),
    - 다낭성 신장병 (Polycystic kidney disease),
    - 신장암 및 폐암을 포함하는 암,
    - 혈전증 (thrombosis), 및
    - 메니에르병 (Meniere disease)을 포함하는 군으로부터 선택되는 V2R 경로를 수반하는 질병을 진단하기 위한 진단 또는 영상화 제제.

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