ES2308847T3 - Peptidos de conotoxinas ciclizadas. - Google Patents
Peptidos de conotoxinas ciclizadas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2308847T3 ES2308847T3 ES99947111T ES99947111T ES2308847T3 ES 2308847 T3 ES2308847 T3 ES 2308847T3 ES 99947111 T ES99947111 T ES 99947111T ES 99947111 T ES99947111 T ES 99947111T ES 2308847 T3 ES2308847 T3 ES 2308847T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- peptide
- conotoxin
- baselineskip
- linear
- linker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Un péptido ciclizado de conotoxina que tiene una columna vertebral ciclizada de amida de tal manera que el péptido no tiene N o C-terminal libre.
Description
Péptidos de conotoxinas ciclizadas.
Esta invención se relaciona con nuevos péptidos
(conotoxinas), en particular con un rango de péptidos cíclicos
útiles en el tratamiento terapéutico de humanos. La invención
también se relaciona con composiciones farmacológicas que contienen
a estos péptidos, métodos para la elaboración de los péptidos y el
uso de estos péptidos en la profilaxis o el tratamiento de
condiciones o enfermedades en humanos.
Los caracoles marinos del género Conos
(caracoles cono) utilizan una estrategia bioquímica sofisticada
para capturar sus presas. Como predadores ya sea de peces, gusanos o
de otros moluscos, los caracoles cono inyectan a sus presas con un
veneno que contiene un coctel de péptidos bioactivos pequeños. Estas
moléculas de toxina, que se denominan conotoxinas, interfieren con
la neurotransmisión enfocándose en una variedad de receptores y
canales de iones. Ellas contienen típicamente 12-30
aminoácidos dispuestos en una secuencia lineal. El veneno de
cualquier especie única de Cono puede contener más de 100
péptidos diferentes. Las conotoxinas están divididas en clases con
base en sus objetivos fisiológicos. Hasta la fecha, se han descrito
diez clases. La clase de la \omega-conotoxina de
péptidos reconoce y bloquea a los canales de Ca^{2+} sensibles al
voltaje inhibiendo la liberación del neurotransmisor. Las
\alpha-conotoxinas y las
\psi-conotoxinas reconocen y bloquean a los
receptores nicotínicos ACh, causando el bloqueo neuromuscular y
gangliónico. Los péptidos de la clase de la
\mu-conotoxina actúan sobre los canales de
Na^{+} sensibles al voltaje y bloquean las potenciales acciones
musculares y nerviosas. Las \delta-conotoxinas
reconocen y retrasan la inactivación de los canales de Na^{+}
sensibles al voltaje que mejoran la excitabilidad neuronal. La clase
de péptidos de las \kappa-conotoxinas reconocen y
bloquean a los canales de K^{+} sensibles al voltaje, y estos
pueden provocar también una excitabilidad neuronal mejorada. Las
conopresinas son antagonistas del receptor de vasopresina y las
conantoquinas son antagonistas del receptor NMDA. Recientemente, se
describió el prototipo de una nueva clase de
\gamma-conotoxina, que reconoce a un canal de un
catión no específico sensible al voltaje, y de una nueva clase de
\sigma-conotoxina, que antagoniza al receptor
5HT_{3}. Los péptidos lineales de conotoxina están divulgados en
WO 96/33206.
La mayoría de los péptidos de conotoxina
contienen ya sea cuatro (4) o seis (6) residuos de cisteína que
están enlazados en pares para formar ya sea dos (2) o tres (3)
enlaces de disulfuro respectivamente. Como se indicó anteriormente,
ellos se enlazan a un rango de diferentes canales de iones en
mamíferos, y por lo tanto tienen diferentes aplicaciones
terapéuticas potenciales, incluyendo alivio del dolor y
neuroprotección en humanos. Sin embargo, en general, los péptidos
tienen varias dificultadas asociadas con su uso como medicamentos,
incluyendo generalmente pobre biodisponibilidad, susceptibilidad a
la escisión por proteasas, y efectos secundarios no
deseados.
deseados.
Una conotoxina, MVIIA, está actualmente en
ensayos clínicos para el tratamiento del dolor intratable y para
neuroprotección después de un ataque fulminante. En la indicación
anterior la ruta de administración está restringida a infusión
intratecal dentro de la médula espinal debido a algunas de las
dificultades anteriormente mencionadas.
La presente invención se basa en el hallazgo de
que la ciclización de la columna vertebral del péptido de las
conotoxinas para producir análogos no naturales resulta en nuevas
moléculas que pueden retener la actividad terapéutica del péptido no
ciclizado.
Por lo tanto, en un primer aspecto la presente
invención provee un péptido ciclizado de conotoxina.
Estas conotoxinas ciclizadas tienen propiedades
mejoradas relacionadas con sus contrapartes "lineales" de
conotoxina. Las propiedades mejoradas pueden incluir lo
siguiente:
- 1.
- Resistencia a la escisión por proteasas.
- 2.
- Gran estabilidad química.
- 3.
- Una "manipulación" adicional sobre la molécula que no interfiere con el efecto biológico primario de la conotoxina, pero proporciona un lugar para funcionalizar la molécula para mejorar las propiedades biofísicas o, en algunos casos, reducir los efectos secundarios.
- 4.
- Mejorar la biodisponibilidad.
El péptido de la conotoxina puede ser cualquier
péptido de conotoxina que pueda ser ciclizado. Puede ser un péptido
de conotoxina de ocurrencia natural. Preferiblemente, el péptido de
la conotoxina es uno que, en su forma no ciclizada, tiene una
actividad asociada con el tratamiento terapéutico de mamíferos, tal
como los humanos. Ya que la ciclización del péptido tiene el
potencial de alterar la actividad del péptido, o de introducir
nuevas actividades, es posible que algunos péptidos ciclizados de la
conotoxina puedan tener propiedades terapéuticas mejoradas
relacionadas con conotoxinas "lineales".
Los ejemplos de conotoxinas lineales adecuadas
de ocurrencia natural que pueden ser ciclizadas de acuerdo con la
presente invención incluyen a aquellas descritas en Olivera, B.M. y
colaboradores, 1991; Myers, R.A. y colaboradores, 1993; Hopkins, C.
y colaboradores, 1995; Olivera, B.M. y colaboradores, 1990.
Preferiblemente, las conotoxinas se seleccionan de la clase
\omega, que tienen tres enlaces disulfuro característicos que
forman un "nudo de cistina", aunque también pueden ser
ciclizadas otras clases de conotoxinas.
Los ejemplos de péptidos adecuados de
\omega-conotoxina de ocurrencia natural incluyen
MVIIA, GVIA, SVIB, SVIA, TVIA, MVIIC, GVIIA y GVIIB.
Los péptidos de conotoxina tienen un patrón de
plegado característico que se basa en el número de enlaces
disulfuro, y en la ubicación sobre el péptido de los residuos de
cisteína que participan en el patrón de enlazamiento de disulfuro.
Donde existen tres enlaces disulfuro existe el potencial para que el
péptido forme un nudo de cistina. Un nudo de cistina se presenta
cuando un enlace disulfuro pasa a través de un lazo cíclico cerrado
formado por dos enlaces disulfuro y aminoácidos en la cadena
peptídica. La ciclización de una conotoxina que tiene un nudo de
cistina produce una estructura de péptido particularmente estable.
Así como está presente en la clase de
omega-conotoxinas, Nielson, y colaboradores, 1996,
el nudo de cistina existe en otras clases incluidos, los
bloqueadores del canal de K^{+} (por ejemplo la conotoxina PVIIA;
Scanlon y colaboradores, 1997) y los bloqueadores del canal de Na
(por ejemplo la conotoxina GS; Hill y colaboradores, 1997).
Los péptidos preferidos de conotoxina son
aquellos en los cuales, en su forma plegada, tienen terminales N y
C que están ubicados en forma contigua. La proximidad de los
terminales está ilustrada más arriba para MVIIA y PVIIA. En la
conotoxina GS los terminales N y C están más apartados, pero el
terminal C contiene una cola flexible que puede alterar fácilmente
la conformación para aproximar el terminal N.
Los péptidos de la conotoxina cíclica de acuerdo
con la presente invención consistirán generalmente de un péptido de
conotoxina en el cual los terminales N y C están enlazados a través
de una fracción enlazante, aunque en algunos casos puede ser
posible conectar directamente los terminales N y C de un péptido de
conotoxina de ocurrencia natural o un derivado del mismo sin la
necesidad de una fracción enlazante. La fracción enlazante, si está
presente, puede ser un péptido enlazador de tal manera que la
ciclización produce una columna vertebral peptídica ciclizada de
amida. Estos péptidos no tendrán terminales N o C libres.
Por lo tanto, en este aspecto de la presente
invención hay siempre un péptido ciclizado de conotoxina que
contiene un péptido lineal de conotoxina y un enlazador de péptido,
en donde los terminales N y C del péptido lineal están enlazados a
través del enlazador de péptido para formar una columna vertebral
peptídica ciclizada de amida.
No se han descrito previamente ejemplos en la
literatura de conotoxinas cíclicas, pero en principio es posible
elaborar moléculas que tienen una columna vertebral cíclica, parte
de la cual incorpora la secuencia natural y conexiones de enlace de
disulfuro de conotoxinas lineales.
La ciclización se puede lograr también
utilizando otras fracciones enlazantes, tales como aquellas que
incluyen enlazadores orgánicos, enlaces peptídicos no nativos tales
como los enlaces tioéter y una cadena lateral para ciclización de
terminales N o C.
Una variación considerable en la secuencia
peptídicas de la fracción enlazante es posible. Ya que esta región
enlazante no se enlaza al sitio activo primario de la conotoxina
puede ser modificada para alterar las propiedades fisicoquímicas, y
potencialmente reducir los efectos secundarios de las
conotoxinas.
En el enlazamiento de los terminales N y C de la
conotoxina, puede ser necesario en algunos casos o deseable remover
uno o más de los residuos N o C terminales. Tal modificación de la
secuencia lineal de la conotoxina está dentro del alcance de la
presente invención.
La fracción enlazante será necesariamente de
longitud diferente para abarcar la distancia entre los terminales N
y C del péptido de la conotoxina. En el caso de enlazadores
peptídicos la longitud será generalmente del orden de 2 a 15
aminoácidos. En algunos casos se pueden requerir enlazadores
peptídicos más cortos o más largos.
Los ejemplos de enlazadores peptídicos posibles
incluyen:
Es posible, de acuerdo con la presente
invención, modificar o potenciar la actividad de un péptido de
conotoxina por medio de la selección de un tamaño particular y/o
tipo de enlazador peptídico. Los cambios pequeños en la
conformación de la conotoxina causados por la introducción de un
grupo de enlazamiento pueden alterar las afinidades de enlazamiento
de los péptidos por sus sitios de enlazamiento particulares. Por el
contrario, donde la actividad es tan cercana como sea posible a la
actividad del péptido de conotoxina progenitor, se seleccionará un
enlazador que minimice cualquier cambio en conformación.
Existen varias formas en las cuales se pueden
sintetizar conotoxinas tóxicas. Estas incluyen lo siguiente:
En esta aproximación se sintetiza primero un
péptido lineal extendido "sobre resina" utilizando métodos de
síntesis de péptidos en fase sólida. Este péptido lineal extendido
comprende a la secuencia nativa que inicia con un residuo de
cisteína en, o cerca a, el N-terminal y a una
extensión C-terminal que comprende a la nueva
fracción enlazante. La síntesis de la fase sólida realmente se
inicia en orden inverso-esto es, en el
C-terminal del péptido lineal extendido, Después de
la escisión de la resina, se cicliza la conotoxina extendida hasta
un tioéster intermedio que después de reordena hasta un péptido
ciclizado de amida. Este péptido reducido es luego oxidado para
formar los enlaces disulfuro. En la Figura 2 se muestra un diagrama
esquemático de la reacción involucrada en la ciclización. Se
escinde el péptido lineal de la resina con el enlazador para la
resina (R) aún unida. R corresponde al enlazador entre el péptido y
la resina y es diferente de la fracción enlazante utilizada en la
ciclización. La primera reacción involucra la formación de un
tioéster entre el tiol de la cisteína N-terminal y
el carboxilo terminal. Este sufre entonces una migración acílica de
S, N para formar el péptido cíclico con el enlace peptídico
nativo.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta aproximación se ensambla un péptido
extendido utilizando síntesis de péptidos en fase sólida. El péptido
lineal extendido comprende a la secuencia extendida de la
conotoxina con residuos extra añadidos en los terminales N y/o C.
Los (nuevos) terminales N y C deben ser preferiblemente residuos de
glicina. El péptido se pliega, y en el caso de los péptidos del
tipo de la conotoxina, los terminales de la molécula plegada están
generalmente más juntos en el espacio. Esto facilita la ciclización
del péptido en solución utilizando química estándar. Las
complicaciones pueden ocurrir cuando están presentes grandes
cantidades de residuos de lisina, ácido glutámico o ácido aspártico
en la secuencia y es preferible entonces el método 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En este método el material de partida es una
conotoxina madura. Se sintetiza y se liga un enlazador peptídico con
la conotoxina utilizando procedimientos publicados para la ligación
de péptidos. El péptido extendido es luego ciclizado y oxidado.
Por lo tanto, en un aspecto adicional de la
invención existe un proceso para preparar una conotoxina cíclica que
comprende:
- A (i)
- sintetizar un péptido lineal de conotoxina sobre un soporte en fase sólida, dicho péptido lineal extendido de conotoxina comprende un péptido lineal de conotoxina que tiene una fracción enlazadora unida al menos a un extremo del mismo,
- (ii)
- escindir dicho péptido lineal extendido del soporte,
- (iii)
- ciclizar dicho péptido lineal extendido de conotoxina, y
- (iv)
- oxidar dicho péptido ciclizado para formar enlaces disulfuro, o
- B (i)
- sintetizar un péptido lineal extendido de conotoxina sobre un soporte en fase sólida, comprendiendo dicho péptido lineal extendido de conotoxina un péptido lineal de conotoxina que tiene una fracción enlazadora unida al menos a un extremo del mismo,
- (ii)
- escindir dicho péptido lineal extendido del soporte sólido,
- (iii)
- someter dicho péptido extendido a condiciones tales que el péptido se pliegue y forme los enlaces disulfuro requeridos, y
- (iv)
- ciclizar el péptido plegado, o
- C (i)
- hacer reaccionar un péptido de conotoxina con una fracción enlazadora para formar un péptido lineal extendido de conotoxina que tiene dicha fracción enlazadora unida a un extremo del mismo, y
- (ii)
- ciclizar dicho péptido lineal extendido y oxidarlo para formar enlaces disulfuro, si se requiere.
\vskip1.000000\baselineskip
En el proceso descrito anteriormente, las etapas
se pueden llevar a cabo en cualquier orden, siempre que el producto
sea una conotoxina cíclica que tiene los enlaces disulfuro
requeridos. Por ejemplo, en el proceso A las etapas de escisión y
ciclización pueden ser llevadas a cabo simultáneamente o en
cualquier orden.
También es posible formar los enlaces disulfuro
selectivamente utilizando grupos de protección sobre los residuos
de cisteína. La protección selectiva de los residuos de cisteína en
esta forma permite la producción de un patrón particular de enlace
de disulfuro. Los ejemplos de grupos capaces de proteger los
residuos de cisteína incluyen acetamidometilo (Acm),
4-metilbencilo (MeBzl) y
4-metoxibencilo (Mob).
También, en vista de la naturaleza cíclica de
los productos finales, los procedimientos de síntesis pueden
involucrar permutación cíclica de los procedimientos anteriores. Por
ejemplo, los diseños del péptido lineal extendido para
\alpha-conotoxinas podría comenzar por medio de la
adición de un enlazador al residuo C-terminal de la
\alpha-conotoxina, permutando cíclicamente
al(los) residuos(s)
N-terminal(es) por el
C-terminal, para proveer una cisteína
N-terminal, y ciclizar como se describió.
Algunos ejemplos de conotoxinas lineales que son
actualmente conocidas y a las cuales se puede aplicar la
aproximación de ciclización están enlistados en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El término "derivado" como se lo utiliza
aquí en conexión con péptidos de conotoxina de ocurrencia natural,
tales como MVIIA, se refieren a un péptido que difieren de los
péptidos de ocurrencia natural por una o más supresiones,
adiciones, sustituciones, o modificaciones de cadenas laterales de
aminoácidos.
Las sustituciones abarcan alteraciones de
aminoácidos en las cuales un aminoácido es reemplazado con un
residuo aminoácido diferente no convencional o de ocurrencia
natural. Tales sustituciones se pueden clasificar como
"conservadora", en cuyo caso un residuo aminoácido contenido en
un polipéptido es reemplazado con otro aminoácido de ocurrencia
natural de carácter similar ya sea en relación con la polaridad, la
funcionalidad de la cadena lateral, o el tamaño, por ejemplo
Ser\leftrightarrowThr\leftrightarrowPro\leftrightarrowHyp\leftrightarrowGly\leftrightarrowAla,
Val\leftrightarrowIle\leftrightarrowLeu,
His\leftrightarrowLys\leftrightarrowArg,
Asn\leftrightarrowGln\leftrightarrowAsp\leftrightarrowGlu o
Phe\leftrightarrowTrp\leftrightarrowTyr. Se entiende que algunos
aminoácidos no convencionales pueden ser reemplazados en forma
conveniente por aminoácidos de ocurrencia natural. Por ejemplo la
ornitina, homoarginina y dimetil lisina están relacionadas con His,
Arg y Lys.
Las sustituciones abarcadas por la presente
invención pueden ser también "no conservadoras", en las cuales
un residuo aminoácido que está presente en un polipéptido es
sustituido con un aminoácido que tiene propiedades diferentes,
tales como un aminoácido de ocurrencia natural de un grupo diferente
(por ejemplo, sustituyendo un aminoácido cargado o hidrófobo con
alanina), o alternativamente, en las cuales un aminoácido de
ocurrencia natural es sustituido con un aminoácido no
convencional.
Las sustituciones de aminoácidos son típicamente
de residuos sencillos, pero pueden ser de múltiples residuos, ya
sean agrupados o dispersos.
Preferiblemente, las sustituciones de
aminoácidos son conservadoras.
Las adiciones abarcan la adición de uno o más
residuos de aminoácidos de ocurrencia natural o no convencionales.
La supresión abarca la supresión de uno o más residuos de
aminoácidos.
Como se estableció anteriormente, la presente
invención incluye péptidos en los cuales uno o más de los
aminoácidos han sufrido modificaciones en la cadena lateral. Los
ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contempladas por la
presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tales
como por medio de alquilación reductiva por reacción con un
aldehído seguida por reducción con NaBH_{4}; amidinación con
metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación
de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con
ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS);
acilación de grupos amino con anhídrido succínico y
anhídridotetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con
piridoxal-5-fosfato seguida por
reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidina de los residuos de arginina
puede ser modificado por medio de la formación de productos de
condensación heterocíclica con reactivos tales como
2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo puede ser modificado por
medio de activación de carbodiimida a través de la formación de
O-acilisoúrea seguido por derivatización posterior,
por ejemplo, hasta una amida correspondiente.
Los grupos sulfhidrilo pueden ser modificados
por métodos tales como carboximetilación con ácido iodoacético o
yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico hasta ácido cistéico;
formación de disulfuros mezclados con otros compuestos tiol;
reacción con maleimida, anhídrido maléico u otra maleimida
sustituida; formación de derivados de mercurio utilizando
4-cloromercuribenzoato, ácido
4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de
fenilmercurio,
2-cloromercuri-4-nitrofenol
y otros compuestos de mercurio; carbamoilación con cianato a pH
alcalino. Cualquier modificación de los residuos de cisteína no
debe afectar la habilidad del péptido para formar los enlaces
disulfuro necesarios. También es posible reemplazar los grupos
sulfhidrilo de cisteína con equivalentes de selenio de tal manera
que el péptido forme un enlace de diselenio en lugar de uno o más de
los enlaces disulfuro.
Los residuos de triptófano pueden ser
modificados por medio de, por ejemplo, oxidación con
N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de
indol con bromuro de
2-hidroxi-5-nitrobencilo
o haluros de sulfenilo. Los residuos de tirosina por otro lado,
pueden ser alterados por medio de nitración con tetranitrometano
para formar un derivado de 3-nitrotirosina.
La modificación del anillo de imidazol de un
residuo de histidina se puede lograr por medio de alquilación con
derivados del ácido iodoacético o N-carbetoxilación
con dietilpropilcarbonato.
Los residuos de prolina pueden ser modificados
por medio de, por ejemplo, hidroxilación en la posición 4.
En la Tabla 2 se muestra una lista de algunos
aminoácidos que tienen cadenas laterales modificadas y otros
aminoácidos no naturales.
\newpage
(Continuación)
\newpage
(Continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
Estos tipos de modificaciones pueden ser
importantes para estabilizar al péptido si se lo administra a un
individuo o para uso como un reactivo diagnóstico.
Otros derivados contemplados por la presente
invención incluyen un rango de variantes de glicosilación de una
molécula completamente no glicosilada hasta una molécula glicosilada
modificada. Los patrones de glicosilación alterados pueden resultar
de la expresión de moléculas recombinantes en diferentes células
huésped.
Los péptidos cíclicos de conotoxina
preferiblemente retendrán a los residuos de Cys y al patrón de
enlazamiento de disulfuro característico. Los derivados pueden
incluir residuos adicionales de Cys con tal que ellos estén
protegidos durante la formación de los enlaces de disulfuro.
Preferiblemente, los péptidos de conotoxina de
acuerdo con la invención tienen de 12 a 40 aminoácidos, más
preferiblemente de 15 a 30.
Las conotoxinas de ocurrencia natural son
ampliamente utilizadas como sondas neurofarmacológicas. Ellas se
enlazan muy firmemente y muy selectivamente a receptores de canal
iónico. En estas aplicaciones se las incuba con una preparación
relevante de tejido y se miden sus enlaces, o efectos biológicos. Su
acción se reducirá o destruirá si ellas son metabolizadas por
enzimas endógenas. El desempeño óptimo de sondas farmacológicas
requiere por lo tanto de resistencia a rompimiento químico o
enzimático. Ya que los péptidos cíclicos de conotoxina poseen las
propiedades deseables descritas anteriormente, ellas pueden ser
mejores sondas farmacológicas en algunos casos que los péptidos de
conotoxina de ocurrencia natural.
También se describen anticuerpos para los
péptidos cíclicos de acuerdo con la invención. Tales anticuerpos
pueden monoclonales o policlonales y se pueden seleccionar de
anticuerpos de ocurrencia natural para los péptidos o se pueden
elevar específicamente para los péptidos utilizando técnicas
estándar. En el caso de este último, los péptidos pueden necesitar
primero estar asociados con una molécula portadora. Los anticuerpos
de la presente invención son particularmente útiles como agentes
terapéuticos o de diagnóstico.
En este sentido, se pueden utilizar anticuerpos
científicos para seleccionar los péptidos de acuerdo con la
invención. Las técnicas para tales ensayos son bien conocidas en el
arte e incluyen, por ejemplo, ensayos tipo sándwich y ELISA. El
conocimiento de los niveles de péptidos puede ser importante para
monitorear ciertos protocolos terapéuticos.
Los péptidos cíclicos de conotoxina de acuerdo
con la presente invención son útiles como agentes terapéuticos.
Por lo tanto, la presente invención provee un
método para el tratamiento o profilaxis de condiciones o
enfermedades en mamíferos, preferiblemente humanos, incluyendo la
etapa de administrar un péptido cíclico de conotoxina.
En particular, las
omega-conotoxinas que bloquean los canales de calcio
tipo N pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos
neurológicos tales como dolor agudo y crónico, ataque fulminante,
lesión cerebral traumática, migraña, epilepsia, enfermedad de
Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y
depresión. Las \alpha-conotoxinas se enlazan a
receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Tales receptores
han sido implicados en la patofisiología de varios desordenes
neurosiquiátricos incluidos esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson y síndrome de Tourette, y por lo tanto las
\alpha-conotoxinas tienen indicaciones
terapéuticas potenciales para estas enfermedades. Las
\mu-conotoxinas dirigen los canales de sodio.
Aquellas \mu-conotoxinas que interactúan con
canales neuronales (por ejemplo PIIIA) tienen aplicaciones
terapéuticas potenciales en el tratamiento de dolor crónico y
neuropático.
Los análisis útiles para evaluar a los
compuestos con la actividad anteriormente mencionada pueden ser
in vitro o in vivo y son conocidos por aquellos
capacitados en el arte. Por ejemplo, los ensayos útiles para
evaluar la actividad en los canales de calcio tipo N incluyen a
aquellos descritos o referenciados en WO91/07980, WO93/13128, US
5.824.645, WO97/04797, Drugs of the Future (1994 y 1998), Drug Data
Report (1993), o Heading (1999). Los péptidos cíclicos de acuerdo
con la invención, o derivados marcados de los mismos, pueden ser
útiles también en tales análisis.
Preferiblemente, el mamífero necesita de tal
tratamiento aunque el péptido pueda ser administrado en un sentido
profiláctico.
La invención también provee una composición que
contiene un péptido cíclico de conotoxina, y un portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente la composición es en la forma de
una composición farmacéutica.
También se provee el uso de un péptido cíclico
de conotoxina en la elaboración de un medicamento para el
tratamiento o profilaxis de enfermedades o condiciones de
mamíferos, preferiblemente de humanos.
Como lo apreciarán fácilmente aquellos
capacitados en el arte, la ruta de administración y la naturaleza
del portador farmacéuticamente aceptable dependerán de la
naturaleza de la condición y del mamífero que va a ser tratado. Se
cree que la escogencia de un portador particular o sistema de
suministro, y la ruta de administración los podría determinar
fácilmente una persona capacitada en el arte. En la preparación de
cualquier formulación que contenga los péptidos activos, se debe
tener cuidado en garantizar que la actividad del péptido no se
destruya en el proceso y que el péptido sea capaz de alcanzar su
sitio acción sin ser destruido. En algunas circunstancias puede ser
necesario proteger al péptido por un medio conocido en el arte, tal
como, por ejemplo, microencapsulación. En forma similar, la ruta de
administración escogida debe ser de tal manera que el péptido
alcance su sitio de acción. En vista de la estabilidad mejorada de
los péptidos cíclicos con relación a sus contrapartes
"lineales" está disponible un rango más amplio de tipos de
formulaciones y de rutas de administración. Las conotoxinas
conocidas generalmente únicamente pueden ser administradas
exitosamente en forma intratecal lo cual significa que el paciente
debe ser hospitalizado. La administración de los péptidos cíclicos
de acuerdo con la presente invención no está sometida a la misma
restricción.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso
inyectable incluyen soluciones estériles inyectables o dispersiones,
y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones
estériles inyectables. Ellos deben ser estables bajo las
condiciones de fabricación y almacenamiento y pueden ser preservados
contra la acción contaminante de microorganismos tales como
bacterias u hongos. El medio solvente o de dispersión para la
solución inyectable o dispersión puede contener cualquiera de los
sistemas solventes o portadores convencionales para péptidos
activos, y puede contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo, glicerol, propilén glicol y polietilén glicol líquido, y
similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La
fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso
de un recubrimiento tal como lecitina, por medio del mantenimiento
del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y por
medio del uso de tensoactivos. La prevención de la acción de
microorganismos se puede llevar a cabo cuando sea necesario por
medio de la inclusión de diferentes agentes antibacteriales y
contra los hongos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido
sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible
incluir agentes para ajustar la osmolaridad, por ejemplo, azúcares
o cloruro de sodio. Preferiblemente, la formulación para la
inyección será isotónica con sangre. La absorción prolongada de las
composiciones inyectables puede ser lograda por medio del uso en las
composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo,
monoestearato de aluminio y gelatina. Las formas farmacéuticas
adecuadas para uso inyectable pueden ser suministradas por medio de
cualquier ruta adecuada incluida inyección intravenosa,
intramuscular, intracerebral, intratecal o por infusión.
Las soluciones estériles inyectables se preparan
por medio de la incorporación de los compuestos activos en la
cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros
ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido
por esterilización filtrante. Generalmente, las dispersiones se
preparan por medio de la incorporación de los diferentes
ingredientes activos esterilizados dentro de un vehículo estéril que
contiene el medio básico de dispersión y los otros ingredientes
requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el
caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles
inyectables, los métodos preferidos de preparación son, secado al
vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del
ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de la
solución previamente filtrada en forma estéril del mismo.
Cuando el ingrediente activo es protegido en
forma adecuada, puede ser administrado en forma oral, por ejemplo,
con un diluyente inerte o con un excipiente comestible asimilable, o
puede ser incluido en una cápsula de gelatina de caparazón dura o
blanda, o puede ser comprimido en tabletas, o puede ser incorporado
directamente en el alimento de la dieta. Para administración
terapéutica oral, se puede incorporar el compuesto activo con
excipientes y usarlo en la forma de tabletas que se pueden ingerir,
tabletas bucales, comprimidos, cápsulas, elíxires , suspensiones ,
jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones
contienen preferiblemente al menos 1% en peso del compuesto activo.
El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, desde
luego, ser variado y puede estar convenientemente aproximadamente
entre 5 y aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de
compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es
tal que se obtendrá una dosis adecuada.
Las tabletas, comprimidos, píldoras, cápsulas y
similares pueden contener también a los componentes como los
enlistados más adelante: Un aglutinante tal como goma, acacia,
almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato
dicálcico; un agente de desintegración tal como almidón de maíz,
almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal
como estearato de magnesio; y se puede añadir un agente edulcorante
tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente saborizante tal
como menta, aceite de gaulteria, o sabor a cereza. Cuando la forma
unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de
los materiales del tipo anterior, un portador líquido. Pueden estar
presentes diferentes otros materiales como recubrimientos o bien
modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo,
las tabletas, píldoras, o cápsulas pueden estar recubiertas con
laca, azúcar o por ambas. Un jarabe o elíxir puede contener al
compuesto activo, sacarosa como un agente edulcorante, metilo y
propilparabenos como preservantes, un colorante y saborizante tal
como sabor a cereza o sabor a naranja. Desde luego, cualquier
material utilizado en la preparación de cualquier forma unitaria de
dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no
tóxico en las cantidades empleadas. Además, el(los)
compuesto(s) activo(s) puede(n) ser
incorporado(s) dentro de las preparaciones y formulaciones de
liberación continuada.
La presente invención también se extiende a
cualquier otra de las formas adecuadas para administración, por
ejemplo aplicación tópica tal como cremas, lociones y geles, o
composiciones adecuadas para inhalación o suministro intranasal, por
ejemplo soluciones o polvos secos.
Se prefieren las formas de dosificación
parenteral, incluidas aquellas adecuadas para suministro
intravenoso, intratecal, o intracerebral.
Los portadores y/o diluyentes farmacéuticamente
aceptables incluyen a cualquiera y a todos los solventes, medios de
dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y contra los
hongos, agentes isotónicos y de absorción sostenida y similares. El
uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente
activas es bien conocido en el arte. Excepto porque cualquier medio
convencional o agente sea incompatible con el ingrediente activo,
el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas está
contemplado. Los ingredientes activos suplementarios pueden ser
también incorporados dentro de las composiciones.
Es especialmente ventajoso formular
composiciones parenterales en forma unitarias de dosificación para
fácil administración y uniformidad de la dosis. La forma unitaria
de dosificación como la utilizada aquí se refiere a unidades
físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias ara los
individuos mamíferos que van a ser tratados; cada unidad contiene
una cantidad predeterminada de material activo calculada para
producir el efecto terapéutico deseado junto con el excipiente
farmacéutico requerido. La especificación para las nuevas formas
unitarias de dosificación de la invención está dictada por, y
depende directamente de (a) las características únicas del material
activo y del efecto terapéutico particular a ser logrado, y (b) las
limitaciones inherentes en el arte de la elaboración de compuestos
tal como un material activo para el tratamiento de enfermedades en
individuos vivos que tengan una condición de enfermedad en la cual
la salud física está deteriorada como se describe aquí en
detalle.
El ingrediente activo principal está compuesto
por la administración conveniente y efectiva, en cantidades
efectivas con un excipiente farmacéuticamente adecuado en una forma
unitaria de dosificación. Una forma unitaria de dosificación puede,
por ejemplo, contener al compuesto activo principal en cantidades en
el rango desde 0,25 \mug hasta aproximadamente 2000 mg. Expresado
en proporciones, el compuesto activo está generalmente presente
aproximadamente desde 0,25 \mug hasta aproximadamente 2000 mg/ml.
En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos
suplementarios, las dosis se determinan por referencia a la dosis
usual y a la forma de administración de dichos ingredientes.
La invención será descrita ahora con referencia
a los ejemplos acompañantes y a las figuras que describen la
producción de algunos péptidos cíclicos de conotoxina y su actividad
biológica e ilustra las estructuras de algunos péptidos lineales de
conotoxina que pueden ser sometidos a ciclización. Sin embargo, se
entiende que la particularidad de la siguiente descripción no es
para reemplazar la generalidad de la descripción precedente de la
invención.
Con referencia a las figuras:
La Figura 1 es una representación de las
estructuras tridimensionales de las conotoxinas PVIIA, MVIIA y GS.
Las estructuras se determinaron por medio de espectroscopía de RMN.
Los átomos de la columna vertebral están desplegados como líneas y
los enlaces disulfuro están resaltados como bolas y barras. Todas
las tres conotoxinas, aunque de diferentes clases y por lo tanto
teniendo diferentes acciones, tienen estructuras similares que
contienen un motivo de un nudo de cistina.
La figura 2 es un esquema para la ciclización de
péptidos a través de un tioéster C-terminal. El
azufre libre de una cisteína N-terminal interactúa
con el tioéster C-terminal para formar un
intermediario que sufre una migración acílica de S, N para formar un
péptido cíclico con un enlace peptídico nativo.
La Figura 3 es una representación de las
estructuras tridimensionales de las conotoxinas PVIIA, MVIIA, SVIB,
GI e IMI. Se determinaron las estructuras por medio de
espectroscopía de RMN. Los átomos de la columna vertebral se
muestran como líneas y los terminales N y C están conectados por
medio de una línea punteada que tiene la distancia interviniente
mostrada anteriormente. Las \alpha-conotoxinas, GI
e IMI, tienen terminales ligeramente más cercanos que las
conotoxinas mostradas en la parte superior de la figura, lo que
sugiere que sería más factible una ciclización para esta clase de
conotoxinas y puede incluso ocurrir más fácilmente que aquella
mostrada para MVIIA.
Se ha sintetizado un análogo cíclico de MVIIA
(ciclo-MVIIA 1) con la secuencia:
Los residuos en negrilla representan la
secuencia de MVIIA. Aquellos que no están en negrilla son la
fracción enlazante (TRNGLPG). Se ha utilizado un método de tioéster
en la síntesis de este péptido que fue realizado sobre una resina
Gly PAM. Se unió un enlazador -SCH_{2}CH_{2}-CO-
a la resina Gly-PAM tratando la resina con ácido
bromopropanóico durante 30 minutos, lavando con DMF y luego tratando
la resina con ácido tioacético al 10%, DIEA al 10% en DMF durante 2
x 20 minutos. Se lavó nuevamente la resina con DMF y se la trató con
\beta-mercaptoetanol al 10%, DIEA al 10% en DMF
durante 2 x 20 minutos. Después de un lavado final con DMF, se
acopló el primer residuo, Boc-glicina, a la resina
utilizando HBTU y DIEA. Se ensambló el resto del péptido por medio
de síntesis manual utilizando HBTU con una neutralización in
situ (Schnölzer, M., y colaboradores, 1992).
El enlazador no es estable bajo condiciones
básicas, de este modo no fue removido el grupo formilo del
triptófano con etanolamina antes de la escisión con HF. Se
utilizaron cresol (800 \muL) y tiocresol (200 \muL) como
depuradores durante la escisión con HF que fue llevada a cabo
durante 2 horas a -2 hasta 0ºC. El péptido reducido crudo, fue
purificado utilizando HPLC preparativa en fase reversa sobre una
columna Vydac C18. Se emplearon gradientes de TFA acuoso al 0,1% y
acetonitrilo al 90%/TFA al 0,09% con una velocidad de flujo de 8
mL/min y se monitoreó el eluyente a 230 nm. Se ciclizó el péptido
reducido en fosfato sódico 0,1 M (pH 7,4), con un exceso de seis
veces de TCEP a temperatura ambiente durante 30 minutos. Todo el
material lineal fue ciclizado dentro de este tiempo como se juzgó
por medio de HPLC analítica en fase reversa y espectrometría de
masas. El análisis de masas fue realizado en un espectrómetro de
masas de cuadrupolo triple marca Sciex (Thornhill, Ontario)
utilizando ionización de muestras por medio de electrospray. Se
oxidó ciclo-MVIIA a una concentración de 0,5 mg/mL
en (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M, NH_{4}OAc 0,1 M (pH 8) y
glutationa reducida 1 mM a 4ºC durante 24 horas. Se purificó el
producto utilizando HPLC preparativa en fase reversa.
Se ha sintetizado un análogo cíclico ligeramente
más pequeño de MVIIA (ciclo-MVIIA 2) con la
secuencia:
Una vez más los residuos en negrilla
corresponden a la secuencia de MVIIA, (todo excepto TRNG). Este
péptido se sintetizó utilizando los procedimientos bosquejados en
el Ejemplo 1. Después de la ciclización, se oxidó
ciclo-MVIIA 2 con una concentración de 0,5 mg/mL en
(NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M, NH_{4}OAc 0,1 M (pH 8) y
glutationa reducida 1 mM a 4ºC durante 24 horas. Estuvieron
presentes tres componentes principales en la oxidación y fueron
todos purificados utilizando una columna semipreparativa C18 (3
mL/min) con monitoreo a 230 nm. Los tres componentes representan
formas completamente cíclicas enlazadas con disulfuro de
ciclo-MVIIA 2.
- a)
- Los antagonistas específicos para los canales de calcio sensibles al voltaje tipo N están siendo utilizados como protagonistas en el desarrollo de medicamentos. Los ejemplos de estos son las \omega-conotoxinas GVIA y MVIIA. Se ha establecido previamente un ensayo para determinar la habilidad de un compuesto para desplazar a ^{125}I-GVIA de los receptores en membrana de rata. Se preparó membrana de rata de acuerdo con el procedimiento de Wagner y colaboradores, 1988. Las ratas fueron sacrificadas por medio de dislocación cervical y se removieron sus cerebros y se los congeló inmediatamente en nitrógeno líquido. Se almacenaron los cerebros congelados a -78ºC hasta que se los necesitó. Se descongelaron tres cerebros (peso húmedo, 6,25 g) (HEPES 50 mM, pH 7,4) y se los homogenizó con un homogenizador Ultraturrex (IKA, 170 vatios) en 125 ml de HEPES 50 mM pH 7,4. Se centrifugó el cerebro homogenizado a 16.000 rpm (35.000 x g) durante 20 min a 4ºC y se descartó el sobrenadante. Se resuspendió el precipitado por medio de homogenización adicional en HEPES 50 mM, pH 7,4, EDTA 10 mM y se incubó a 4ºC durante 30 min. Se repitió la centrifugación como anteriormente y se descartó el sobrenadante. Se resuspendió el precipitado en 125 ml de HEPES 50 mM, pH 7,4 (dilución 1:20) y se almacenó a -78ºC.
- Se preparó ^{125}I-[Tyr22]GVIA d acuerdo con el procedimiento de Cruz y Olivera (1986) y se aisló por medio de HPLC en fase reversa sobre una columna C18 Vydac. Se equilibró la columna en amortiguador A (H_{2}O, TFA al 0,1%) seguido por un gradiente lineal para amortiguador B al 67% (acetonitrilo al 90%, 10% de H_{2}O y TFA al 0,09%) en 100 min. Los picos fueron detectados a 214 nm y la velocidad de flujo fue de 1 ml/min. Se contaron los picos marcados en forma radioactiva utilizando un contador gama y se almacenó a 4ºC.
- Los ensayos fueron realizados en tubos de cultivo de borosilicato de 12 x 75 mm a temperatura ambiente y se incubó durante 1 hora. Cada tubo contenía 100 \mul de solución de la solución del ensayo, el ligando iodado (7 fmol) y membrana de rata (16 \mug) añadidos en este orden. Este amortiguador del ensayo contenía HEPES 20 mM, pH 7,2, NaCl 75 mM, EDTA 0,1 mM, EGTA 0,1 mM, BSA al 0,1% e inhibidores de proteasa, leupeptina 2 mM y aprotinina 0,5 U. Se determinó el enlazamiento no específico en presencia de GVIA 17 nM. Los ensayos fueron terminados por medio de filtración al vacío sobre un sistema de filtración múltiple de Millipore utilizando filtros de fibra de vidrio (Whatman GFB) prerremojados en polietilenimina al 0,6%. Cada tubo fue lavado 3 veces con 3 ml de amortiguador de lavado enfriado con hielo (HEPES 20 nM, pH 7,2, NaCl 125 mM y BSA al 0,1%). Se hizo recuento de los filtros sobre un contador gama. Se utilizó un Graphpad Prism para generar curvas de enlazamiento y calcular valores de EC_{50}. Los valores de EC_{50} son una medida de la habilidad de un compuesto para desplazar ^{125}I-GVIA; el valor de EC_{50} para MVIIA es 4,4 x 10^{-11} M. Las fracciones aisladas de la oxidación de los residuos de cisteína en ciclo-MVIIA 1 cíclico reducido fueron analizadas en este ensayo. Como se esperaba, no todos los isómeros de disulfuro tuvieron el mismo nivel de actividad. El isómero más activo exhibió un EC_{50} de 8,5 x 10^{-8} M. Las tres formas cíclicas oxidadas de ciclo-MVIIA 2 fueron analizadas también en este ensayo y el isómero más activo exhibió un EC_{50} de 5 x 10^{-10} M. Como se esperaba, no todos los isómeros de disulfuro tuvieron el mismo nivel de actividad.
- b)
- Para analizar la especificidad de los derivados cíclicos de conotoxina para el canal de Ca tipo N con relación a los canales tipo P/Q se hicieron estudios de enlazamiento adicionales utilizando ^{125}I-MVIIA como el ligando desplazado. Este se enlaza selectivamente a los canales de Ca tipo P/Q.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis fue llevado a cabo como se describió
en el Ejemplo 3a, excepto porque se utilizaron canales
^{125}I-MVIIC (selectivos para el tipo P/Q) como
el ligando desplazado en vez de ^{125}I-MVIIC
(selectivo para canales del tipo N). Se preparó y se purificó
^{125}I-MVIIC como se describe en Nielsen y
colaboradores, 1999.
La forma más activa de
ciclo-MVIIA 2 no mostró ninguna habilidad para
desplazar a ^{125}I-MVIIC cuando se lo administró
en concentraciones hasta de 630 nM. Cuando se combinó con los datos
descritos anteriormente por desplazamiento de
^{125}I-GVIIA de los canales tipo N, esto
demuestra selectividad por el canal tipo N sobre el canal tipo
P/Q.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han determinado las estructuras
tridimensionales de varios péptidos de conotoxina por medio de
espectroscopía de RMN para confirmar la factibilidad de la
elaboración de conotoxinas cíclicas que no alteran
significativamente la conformación de la mayoría de las partes de
las moléculas de conotoxina. Una comparación de cinco estructuras de
conotoxina determinadas por RMN es presentada en la figura 3.
Únicamente los átomos de la columna vertebral
están desplegados y los terminales amino y carboxilo están marcados
como N y C, respectivamente. Las distancias en angstroms entre los
terminales han sido medidas y están marcadas también sobre el
diagrama. Las tres estructuras en la mitad superior del diagrama
representan a PVIIA (Scanlon y colaboradores, 1997), MVIIA (Nielsen
y colaboradores, 1996) y SVIB (Nielsen y colaboradores, 1996). Es
claro que en todos los tres péptidos la estructura completa es muy
similar, ya que es la distancia entre los terminales. MVIIA y SVIB
son ambos clasificados como conotoxinas omega y tienen alguna
homología de secuencia (Tabla 1), sin embargo PVIIA pertenece a la
clase kappa y tiene poca homología de secuencia con MVIIA y SVIB
excepto por los residuos conservados de cisteína. Se ha mostrado
ahora que MVIIA puede ser ciclizado e incluso retenido en nivel
alto de actividad (Ejemplos 1-3). Dada la similitud
estructural entre los péptidos mencionados anteriormente, la
ciclización es factible para otras conotoxinas, tales como PVIIA y
SVIB.
Las alfa conotoxinas tienen una estructura
diferente que los péptidos mencionados anteriormente, sin embargo
los terminales están aún cercanos, como se muestra para GI (Gehrmann
y colaboradores, 1998) e IMI (datos no publicados) más arriba. La
cercana proximidad de los terminales sugiere que la ciclización se
puede lograr sin afectar significativamente la actividad biológica.
Por lo tanto, el concepto de ciclización de conotoxinas es
aplicable no únicamente a las omega conotoxinas sino a péptidos de
otras clases de conotoxinas, incluyendo las conotoxinas alfa y
kappa, y se extiende a todas las conotoxinas que tienen terminales
localizados cercanos entre sí, especialmente aquellos dentro de una
distancia de aproximadamente 13 Ả (esto es, la distancia
presente en MVIIA).
En el caso de mu-conotoxinas los
terminales están en general apartados, pero la ciclización es
fácilmente posible utilizando secuencias más largas de péptidos
como enlazadores. En el caso de conotoxinas del canal de Na como
las GS, el péptido contiene una extensión del terminal C más allá
del residuo final de cisteína que puede formar parte del enlazador
de ciclización.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ejemplificar los principios involucrados en
el método 2 de síntesis descrito anteriormente, se ha sintetizado
un análogo de MVIIA utilizando síntesis de péptidos en fase sólida
con química Boc. El péptido sintetizado tiene la secuencia:
El péptido tiene tanto una extensión terminal
N(GLPU) como una C(TRG) y los residuos restantes (en
negrilla) representan a MVIIA. Se purificó el péptido reducido
utilizando las condiciones dadas en los Ejemplos 1 y 2. Se logró la
oxidación utilizando acetato de amonio 0,1 M, sulfato de amonio 2 M,
pH 7,7, glutationa reducida 1 mM y dejando la reacción a 4ºC
durante dos días. Se purificó el péptido oxidado y se analizó la
actividad como en el Ejemplo 3. Se encontró un valor de EC_{50}
de 1,081 x 10^{-9} para este análogo, ilustrando que la extensión
de los terminales N y C del péptido, que puede ser necesaria antes
de la ciclización, no elimina la actividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una
\alpha-conotoxina cíclica con base en la secuencia
de \alpha-conotoxina MII. El precursor lineal
para esta síntesis está diseñado para añadir primero una fracción
enlazadora a la secuencia nativa como se muestra más abajo. Los
residuos en negrilla corresponden a la secuencia nativa de MII y los
residuos que no están en negrilla son la fracción enlazadora
(TNG).
Se diseña luego un derivado cíclicamente
permutado de esta secuencia moviendo el residuo de glicina
N-terminal hasta el terreno de C para producir la
secuencia:
Este péptido es sintetizado utilizando el método
del tioéster descrito anteriormente en el cual la glicina
C-terminal se une a una resina Gly PAM a través de
un enlazador -SCH_{2}CH_{2}CO-. El enlazador se une a la resina
Gly PAM tratando la resina con ácido bromopropanóico durante 30
minutos, lavando con DMF y luego tratando la resina con ácido
tioacético al 10%, DIE A al 10% en DMF durante 2 x 20 minutos. Se
lava la resina nuevamente con DMF y se la trata con
\beta-mercaptoetanol al 10%, DIEA al 10% en DMF
durante 2 x 20 minutos. Después de un lavado final con DMF, el
primer residuo (esto es, C-terminal) de la secuencia
lineal del péptido se acopla a la resina utilizando HBTU y DIEA. El
resto de la secuencia del péptido se ensambla por medio de síntesis
utilizando HBTU con neutralización in situ. La escisión de la
resina, ciclización y oxidación se logran utilizando los métodos
descritos en los Ejemplos
1 y 2.
1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analiza la biodisponibilidad de conotoxinas
cíclicas ya sea por medio de administración oral o de administración
intravenosa en ratas. Se mantienen ratas derivadas de
Sprague-Dawley macho (aproximadamente de 325 g)
sobre portacebos estándar para ratas hasta la cirugía, y se las
prepara luego, bajo anestesia de isoflurano, con un catéter en la
vena yugular externa derecha. Se colocan luego las ratas en forma
suelta en jaulas de metabolismo y se les permite recuperarse antes
de la dosis. Se utiliza una aguja de dosificación oral de 75 mm
(alimentación forzada) para dosificar a las ratas conscientes y se
utiliza el catéter de la yugular para dosificación intravenosa.
Después de la dosificación, se toman muestras de plasma en períodos
de tiempo entre 0 y 180 minutos. Se retira una muestra de sangre
(aproximadamente de 500 mL), se la centrifuga y se la coloca luego
sobre hielo hasta el procesamiento. Se transfiere el sobrenadante
(200 mL) y se añade acetonitrilo grado HPLC (300 mL) para
precipitar las proteínas, sin embargo los péptidos del análisis
permanecen en solución. Se centrifuga luego la muestra y se
trasfiere el sobrenadante para análisis adicionales. Se diluye el
sobre nadante con TFA al 0,1% y se lo inyecta a una columna
analítica C18 de fase reversa utilizando gradientes de TFA al
0,1%/TFA al 0,9% en acetonitrilo al 90%: 10% de agua. Se monitorea
el eluyente a 214 nm. Este análisis permite el cálculo de la vida
media para el péptido de interés.
Se llevan a cabo estudios adicionales para
producir índices de estabilidad de conotoxinas cíclicas en medio
biológico y por lo tanto una indicación de biodisponibilidad. Se
utilizan un medio biológico tal como suero fetal de ternera y jugos
gástricos de rata. Se diluye la solución de conotoxina cíclica (10
mL, 1 mg/mL) con PBS 0,1 M, pH 7,6 (\sim 50 mL) y se añade suero
fetal de ternera (\sim 50 mL) a la muestra. Se incuba luego la
muestra a 37ºC durante \sim 1-5 horas. Se remueve
una alícuota (\sim 40 mL) y se diluye con TFA al 0,1% y se inyecta
sobre una columna analítica C18 de HPLC en fase reversa con
gradientes de TFA al 0,1%/TFA al 0,9% en acetonitrilo. Se monitorea
la muestra a 214 nm. Se utiliza la solución patrón de péptido,
apropiadamente diluida, como control y permite calcular el desglose
porcentual en un período de tiempo particular. Se aplica un
protocolo similar para los jugos gástricos de rata. Sin embargo, no
se diluye el péptido en amortiguador pero se incuba a 37ºC durante
1-5 horas y se analizan las alícuotas por medio de
HPLC en fase reversa. La realización de estaos estudios sobre
conotoxinas cíclicas y lineales muestra una mayor estabilidad de las
conotoxinas cíclicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Cruz, L. J. y Olivera, B. M.
(1986). Calcium channel antagonists.
Omega-conotoxin defines a new high affinity site
J. Biol. Chem. 261, 6230-6233.
Gehrmann J., Alewood P. F., &
Craik D. J. (1998) Structure determination of the
three disulfide bond isomers of alpha-conotoxin
GI-A model for the role of disulfide bonds in
structural stability. J. Mol. Biol. 278,
401-415.
Hill J M, Alewood P F,
Craik D J: Solution structure of the sodium channel
antagonist conotoxin GS: a new molecular caliper for probing sodium
channel geometry. Structure (1997) 5,
571-583.
Hopkins, C., Grilley, M.,
Miller, C., Shon, K., Cruz, L. J., Gray,
W. R., Dykert, J., Rivier, J., Yoshikami, D.
& Olivera, B. M. (1995). A new family of Conus
peptides targeted to the nicotinic acetylcholine receptor. J.
Biol. Chem. 270, 22361-22367.
Myers, R. A., Cruz, L. J.,
Rivier, J. E. & Olivera, B. M. (1993).
Conus peptides as chemical probes for receptors and ion channels.
Chem. Rev. 93, 1923-1936.
Myers, R. A., McIntosh, J. M.,
Imperial, J., Williams, R. W., Oas, T.,
Haack, J. A., J., H., Rivier, J., Cruz, L. J
& Olivera, B. M. (1990). Peptides from Conus
venoms which affect Ca++ entry into neurons. J. Toxicol.-Toxin
Reviews. 9, 179-202.
Nielsen K J, Adams D,
Thomas L, Bond T, Alewood P F, Craik D
J, Lewis R J: Structure-activity
relationships of wconotoxins MVIIA, MVIIC and 14 loop splice hybrids
at N- and P/Q-type calcium channels. J Mol
Biol (1999) 289, 1405-1421.
Nielsen K. J., Thomas K.,
Lewis R. J., Alewood P. F., & Craik D. J.
(1996) A consensus structure for
omega-conotoxins with different selectivities for
voltage-sensitive calcium channel
subtypes-comparison of MVIIA, SVIB AND
SNX-202. J. Mol. Biol. 263,
297-310.
Olivera, B. M., Rivier, J.,
Clark, C., Ramilo, C. A., Corpuz, G. P.,
Abogadie, F.C., Mena, E. E., Woodward, S. R.,
Hillyard, D. R. & Cruz, L. J. (1990).
Diversity of Conus neuropeptides. Science. 249
248-263.
Olivera, B. M., Rivier, J.,
Scott, J. K., Hillyard, D. R. & Cruz, L. J.
(1991). Conotoxins J. Biol. Chem. 266,
22067-22070.
Scanlon M. J., Naranjo D.,
Thomas L., Aleqood P. F. Lewis R. J., &
Craik D. J. (1997) Solution structure and proposed
binding mechanism of a novel potassium channel toxin
kappa-conotoxin PVIIA. Structure 5,
1585-1597.
Schnolzer, M., Alewood, P.,
Jones, A., Alewood, D. & Kent, S. B. H.
(1992). In situ neutralization in
Boc-chemistry solid phase peptide synthesis. Int.
J. Pept. Prot. Res. 40, 180-193.
Wagner, J. A., Snowman, A. M.,
Biswas, A., Olivera, B. M. y Snyder, S. H.
(1988). Omega-conotoxin GVIA binding to a
high-affinity receptor in brain: characterization,
calcium sensitivity, and solubilization. J. Neuroscience
8,3343-3359.
\vskip1.000000\baselineskip
A través de esta descripción y de las
reivindicaciones que vienen después, a menos que el contexto
requiera otra cosa, la palabra "comprende" y variaciones tales
como "que comprende" y "comprendiendo", se entenderá que
implica la inclusión de un entero establecido o etapa o grupo de
enteros o de etapas, pero no la exclusión de ningún otro entero o
etapa o grupo de enteros o etapas.
Aquellos capacitados en el arte apreciarán que
la invención descrita aquí es susceptible de variaciones y de
modificaciones diferentes a aquellas específicamente descritas. Se
entiende que la invención incluye a todas aquellas variaciones y
modificaciones. La invención también incluye todas las etapas,
características, composiciones y compuestos mencionados o indicados
en estas especificaciones, en forma individual o colectiva, y
cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera dos o más de
dichas etapas o características.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
- \bullet WO 9633206 A [0002]
- \bullet US 5824645 A [0055]
- \bullet WO 9107980 A [0055]
- \bullet WO 9704797 A [0055]
\bullet WO 9313128 A [0055]
\bulletCRUZ, L.J.; OLIVERA,
B.M. Calcium channel antagonists. Omega-conotoxin
defines a new high affinity site. J. Biol. Chem.,
1986, vol. 261, 6230-6233 [0093]
\bulletGEHRMANN J.; ALEWOOD
P.F.; CRAIK D.J. Structure determination of the three
disulfide bond isomers of alpha-conotoxin
GI-A model for the role of disulfide bonds in
structural stability. J. Mol. Biol., 1998, vol. 278,
401-415 [0093]
\bulletHILL J M; ALEWOOD P F;
CRAIK D J. Solution structure of the sodium channel
antagonist conotoxina GS: a new molecular caliper for probing sodium
channel geometry. Structure, 1997, vol. 5,
571-583 [0093]
\bulletHOPKINS, C.; GRILLEY,
M.; MILLER, C.; SHON, K.; CRUZ, L. J.;
GRAY, W. R.; DYKERT, J.; RIVIER, J.;
YOSHIKAMI, D.; OLIVERA, B. M. A new family of Conus
peptides targeted to the nicotinic acetylcholine receptor. J.
Biol. Chem., 1995, vol. 270, 22361-22367
[0093]
\bulletMYERS, R.A.; CRUZ, L.J.;
RIVIER, J. E.; OLIVERA, B. M. Conus peptides as
chemical probes for receptors and ion channels. Chem. Rev.,
1993, vol. 93, 1923-1936 [0093]
\bulletMYERS, R. A.; MCINTOSH,
J.M.; IMPERIAL, J.; WILLIAMS, R. W.; OAS, T.;
HAACK, J. A., J., H.; RIVIER, J.; CRUZ, L. J;
OLIVERA, B. M. Peptides from Conus venoms which affect Ca++
entry into neurons. J. Toxicol.-Toxin Reviews, 1990,
vol. 9, 179-202 [0093]
\bulletNIELSEN K J; ADAMS D;
THOMAS L; BOND T; ALEWOOD P F; CRAIK D
J; LEWIS R J. Structure-activity
relationships of w-conotoxins MVIIA, MVIIC and 14
loop splice hybrids at N- and P/Q-type calcium
channels. J Mol Biol, vol. 289, 1405-1421
[0093]
\bulletNIELSEN K. J.; THOMAS
K.; LEWIS R.J.; ALEWOOD P.F.; CRAIK D.J. A
consensus structure for omega-conotoxins with
different selectivities for voltage-sensitive
calcium channel subtypes-comparison of MVIIA, SVIB
AND SNX-202. J. Mol. Biol., 1996, vol.
263, 297-310 [0093]
\bulletOLIVERA, B.M; RIVIER,
J.; CLARK, C.; RAMILO, C.A.; CORPUZ, G.P.;
ABOGADIE, F.C.; MENA, E.E.; WOODWARD, S.R.;
HILLYARD, D.R.; CRUZ, L.J. Diversity of Conus
neuropeptides. Science, 1990, vol. 249,
248-263 [0093]
\bulletOLIVERA, B.M.; RIVIER,
J.; SCOTT, J.K.; HILLYARD, D.R.; CRUZ, L.J.
Conotoxins J. Biol. Chem., 1991, vol. 266,
22067-22070 [0093]
\bulletSCANLON M. J.; NARANJO
D.; THOMAS L.; ALEQOOD P.F.; LEWIS R.J.;
CRAIK D.J. Solution structure and proposed binding mechanism
of a novel potassium channel toxin kappa-conotoxin
PVIIA. Structure, 1997, vol. 5,
1585-1597 [0093]
\bulletSCHNOLZER, M.; ALEWOOD,
P.; JONES, A.; ALEWOOD, D.; KENT, S. B. H.
situ neutralization in Boc-chemistry solid
phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Prot. Res,
1992, vol. 40, 180-193 [0093]
\bulletWAGNER, J.A.; SNOWMAN,
A.M.; BISWAS, A.; OLIVERA, B.M.; SNYDER, S.H.
Omega-conotoxin GVIA binding to a
high-affinity receptor in brain: characterization,
calcium sensitivity, and solubilization. J. Neuroscience,
1988, vol. 8, 3343-3359 [0093]
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: La Secuencia Sintética es cíclica con aminoácidos
terminales unidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: La Secuencia Sintética es cíclica con aminoácidos
terminales unidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: La Secuencia Sintética es cíclica con aminoácidos
terminales unidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: La Secuencia Sintética es cíclica con aminoácidos
terminales unidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: La Secuencia Sintética es cíclica con aminoácidos
terminales unidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
Claims (24)
1. Un péptido ciclizado de conotoxina que tiene
una columna vertebral ciclizada de amida de tal manera que el
péptido no tiene N o C-terminal libre.
2. Un péptido de acuerdo a la reivindicación 1
que tiene una actividad asociada con el tratamiento terapéutico de
mamíferos.
3. Un péptido de acuerdo a la reivindicación 1 o
a la reivindicación 2 que contiene co consiste de la secuencia de
aminoácidos presente en un péptido de conotoxina de ocurrencia
natural.
4. Un péptido de acuerdo a la reivindicación 3
en donde el péptido de conotoxina de ocurrencia natural se
selecciona de MVIIA, GVIA, SVIB, SVIA, TVIA, MVIIC, GVIIA, GVIIB,
PVIIA, GS, GI, IMI, PNIA, PNIB, SII, MII, GIIIA, GIIIB, GIIIC y
PIIIA.
5. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 que comprende o bien cuatro residuos de
cisteína enlazados en pares para formar dos enlaces disulfuro o seis
residuos de cisteína enlazados en pares para formar tres enlaces
disulfuro.
6. Un péptido de acuerdo a la reivindicación 5
que tiene tres enlaces disulfuro en la forma de un nudo de
cisteína.
7. Un péptido de acuerdo a la reivindicación 6
que es un péptido ciclizado de omega conotoxina.
8. Un péptido de acuerdo a la reivindicación 5
que tiene dos enlaces disulfuro.
9. Un péptido de acuerdo a la reivindicación 8
que es un péptido ciclizado de alfa conotoxina.
10. Un péptido de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 que comprende un péptido lineal de conotoxina
y un enlazador peptídico, en donde los terminales N y C del péptido
lineal están enlazados a través del enlazador peptídico para formar
una columna vertebral peptídica ciclizada de amida.
11. Un péptido cíclico de acuerdo a la
reivindicación 10 en donde la fracción del péptido lineal de
conotoxina se deriva de un péptido de conotoxina de ocurrencia
natural y retiene la conectividad del enlace disulfuro del péptido
de conotoxina de ocurrencia natural.
12. Un péptido de acuerdo a la reivindicación 10
u 11 en donde, el enlazador peptídico es de 2 a 15 aminoácidos de
longitud.
13. Un péptido de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12 en donde el enlazador peptídico se
selecciona del grupo que consiste de:
14. Un péptido seleccionado del grupo que
consiste de:
\vskip1.000000\baselineskip
y
15. Un proceso para preparar un péptido de
acuerdo a la reivindicación 1 que comprende:
- (i)
- sintetizar un péptido lineal extendido de conotoxina sobre un soporte en fase sólida, dicho péptido lineal extendido de conotoxina comprende un péptido lineal de conotoxina que tiene una fracción enlazadora unida al menos a un extremo del mismo,
- (ii)
- escindir dicho péptido lineal extendido del soporte,
- (iii)
- ciclizar dicho péptido lineal extendido de conotoxina, y
- (iv)
- oxidar dicho péptido ciclizado para formar enlaces disulfuro.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un proceso para preparar un péptido de
acuerdo a la reivindicación 1 que comprende:
- (i)
- sintetizar un péptido lineal extendido de conotoxina sobre un soporte en fase sólida, comprendiendo dicho péptido lineal extendido de conotoxina un péptido lineal de conotoxina que tiene una fracción enlazadora unida al menos a un extremo del mismo,
- (ii)
- escindir dicho péptido lineal extendido del soporte sólido,
- (iii)
- someter dicho péptido extendido a condiciones tales que el péptido se pliegue y forme los enlaces disulfuro requeridos, y
- (iv)
- ciclizar el péptido plegado.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un proceso para preparar un péptido de
acuerdo a la reivindicación 1 que comprende:
- (i)
- hacer reaccionar un péptido de conotoxina con una fracción enlazadora para formar un péptido lineal extendido de conotoxina que tiene dicha fracción enlazadora unida a un extremo del mismo, y
- (ii)
- ciclizar dicho péptido lineal extendido y oxidarlo para formar enlaces disulfuro, si se requiere.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Un método in vitro que comprende el
uso de un péptido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1
a 14 que tiene actividad en los receptores del canal de iones como
una sonda neurofarmacológica.
19. Un péptido de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 para uso como un medicamento.
20. El uso de un péptido de acuerdo a cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14 en la elaboración de un medicamento
para el tratamiento o profilaxis de trastornos neurológicos tales
como tales como dolor agudo y crónico, ataque fulminante, lesión
cerebral traumática, migraña, epilepsia, enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, o depresión, en donde
dicho péptido es una omega-conotoxina que bloquea
los canales de calcio de tipo N.
21. El uso de un péptido de acuerdo a cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14 en la elaboración de un medicamento
para el tratamiento o profilaxis de trastornos neurosiquiátricos
incluidos esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de
Parkinson o síndrome de Tourette, en donde dicho péptido es una
\alpha-conotoxina que se enlaza a receptores
nicotínicos de acetilcolina (nAChRs).
22. El uso de un péptido de acuerdo a cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14 en la elaboración de un medicamento
para el tratamiento de dolor crónico o neuropático, en donde dicho
péptido es una \mu-conotoxina que dirige los
canales de sodio.
23. Una composición que comprende un péptido de
acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un excipiente
o diluyente farmacéuticamente aceptable.
24. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 23 que es una composición farmacéutica.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPP5895 | 1998-09-14 | ||
| AUPP5895A AUPP589598A0 (en) | 1998-09-14 | 1998-09-14 | Novel peptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2308847T3 true ES2308847T3 (es) | 2008-12-01 |
Family
ID=3810116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99947111T Expired - Lifetime ES2308847T3 (es) | 1998-09-14 | 1999-09-14 | Peptidos de conotoxinas ciclizadas. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7001883B1 (es) |
| EP (1) | EP1129106B1 (es) |
| AT (1) | ATE398630T1 (es) |
| AU (1) | AUPP589598A0 (es) |
| CA (1) | CA2385049C (es) |
| DE (1) | DE69938935D1 (es) |
| ES (1) | ES2308847T3 (es) |
| WO (1) | WO2000015654A1 (es) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPP589598A0 (en) * | 1998-09-14 | 1998-10-08 | University Of Queensland, The | Novel peptides |
| US6855805B2 (en) | 1999-01-22 | 2005-02-15 | University Of Utah Research Foundation | α-conotoxin peptides |
| AU778353B2 (en) | 1999-01-22 | 2004-12-02 | Cognetix, Inc. | Alpha-conotoxin peptides |
| WO2004050688A1 (en) | 2002-12-02 | 2004-06-17 | Xenome Ltd | NOVEL χ-CONOTOXIN PEPTIDES (-II) |
| AU2003902131A0 (en) * | 2003-05-05 | 2003-05-22 | The University Of Queensland | Novel mu conotoxin peptides |
| US7745573B2 (en) * | 2006-02-17 | 2010-06-29 | Polychip Pharmaceuticals Pty Ltd. | Conotoxin analogues and methods for synthesis of intramolecular dicarba bridge-containing peptides |
| US9102708B2 (en) * | 2006-02-17 | 2015-08-11 | Syngene Limited | Methods for the synthesis of dicarba bridges in organic compounds |
| US7538190B2 (en) * | 2006-02-17 | 2009-05-26 | Polychip Pharmaceuticals Pty Ltd | Methods for the synthesis of two or more dicarba bridges in organic compounds |
| AU2006236006B2 (en) | 2006-04-13 | 2012-09-06 | The University Of Queensland | Cyclised a-conotoxin peptides |
| US8188048B2 (en) | 2006-06-23 | 2012-05-29 | Xenome Limited | Combination therapy |
| AU2007353396C1 (en) * | 2006-11-02 | 2013-06-27 | Biomolecular Holdings Llc | Hybrid immunoglobulins with moving parts |
| US7847019B2 (en) * | 2007-10-15 | 2010-12-07 | California Institute Of Technology | Functionalized polymers using protected thiols |
| US8765677B2 (en) | 2009-09-21 | 2014-07-01 | The University Of Queensland | Omega conotoxin peptides |
| JP2014509859A (ja) | 2011-03-16 | 2014-04-24 | アムジエン・インコーポレーテツド | １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤 |
| US9636418B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-05-02 | Amgen Inc. | Potent and selective inhibitors of NAV1.7 |
| US10344060B2 (en) | 2013-03-12 | 2019-07-09 | Amgen Inc. | Potent and selective inhibitors of Nav1.7 |
| CA2913993A1 (en) | 2013-05-31 | 2014-12-04 | University Of Utah Research Foundation | Conotoxin peptides, pharmaceutical compositions and uses thereof |
| RU2731217C2 (ru) * | 2016-11-28 | 2020-08-31 | Общество с ограниченной ответственностью "Синейро" | Аналог альфа-конотоксина RgIA для лечения боли |
| CN111936508A (zh) | 2018-03-29 | 2020-11-13 | 横向知识产权私人有限公司 | 环肽及其用途 |
| CN113063950B (zh) * | 2021-03-25 | 2021-11-19 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一对用于检测芋螺毒素的抗体及其应用 |
| CN113943361B (zh) * | 2021-12-20 | 2022-03-29 | 浙江湃肽生物有限公司深圳分公司 | 一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽、制备方法与用途 |
| CN117586355B (zh) * | 2024-01-15 | 2024-05-28 | 杭州湃肽生化科技有限公司 | 一种四元环多肽及应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4447356A (en) * | 1981-04-17 | 1984-05-08 | Olivera Baldomero M | Conotoxins |
| US5589356A (en) | 1993-06-21 | 1996-12-31 | Vanderbilt University | Litigation of sidechain unprotected peptides via a masked glycoaldehyde ester and O,N-acyl rearrangement |
| AU700592B2 (en) | 1995-04-17 | 1999-01-07 | University Of Utah Research Foundation | Conotoxin peptides |
| SI0832096T1 (en) | 1995-05-04 | 2001-12-31 | Scripps Research Inst | Synthesis of proteins by native chemical ligation |
| JP2001507924A (ja) * | 1996-07-22 | 2001-06-19 | ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション | コナントキン類 |
| US6441132B1 (en) * | 1996-11-08 | 2002-08-27 | University Of Utah Research Foundation | Contryphan peptides |
| WO1998028434A1 (en) | 1996-12-24 | 1998-07-02 | The Scripps Research Institute | General chemical ligation |
| DE69837170T2 (de) | 1997-06-13 | 2007-11-22 | Amylin Pharmaceuticals, Inc., San Diego | Festphasige native chemische Ligation von ungeschützten oder n-cystein-geschützten Peptiden in wässrigen Lösungen |
| AUPP589598A0 (en) * | 1998-09-14 | 1998-10-08 | University Of Queensland, The | Novel peptides |
-
1998
- 1998-09-14 AU AUPP5895A patent/AUPP589598A0/en not_active Abandoned
-
1999
- 1999-09-14 DE DE69938935T patent/DE69938935D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-14 CA CA2385049A patent/CA2385049C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-14 AT AT99947111T patent/ATE398630T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-14 US US09/787,082 patent/US7001883B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-14 EP EP99947111A patent/EP1129106B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-14 ES ES99947111T patent/ES2308847T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-14 WO PCT/AU1999/000769 patent/WO2000015654A1/en active IP Right Grant
-
2005
- 2005-02-07 US US11/052,168 patent/US7312195B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE398630T1 (de) | 2008-07-15 |
| US7001883B1 (en) | 2006-02-21 |
| EP1129106B1 (en) | 2008-06-18 |
| CA2385049A1 (en) | 2000-03-23 |
| US7312195B2 (en) | 2007-12-25 |
| EP1129106A1 (en) | 2001-09-05 |
| AUPP589598A0 (en) | 1998-10-08 |
| DE69938935D1 (de) | 2008-07-31 |
| WO2000015654A1 (en) | 2000-03-23 |
| EP1129106A4 (en) | 2002-07-03 |
| US20050256301A1 (en) | 2005-11-17 |
| CA2385049C (en) | 2010-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2308847T3 (es) | Peptidos de conotoxinas ciclizadas. | |
| ES2855169T3 (es) | Conjugados de polipéptido-anticuerpo derivados de aprotinina | |
| Li et al. | Medicinal chemistry, pharmacology, and therapeutic potential of α-conotoxins antagonizing the α9α10 nicotinic acetylcholine receptor | |
| US20220048961A1 (en) | Transferrin receptor targeting peptides | |
| US20080081901A1 (en) | Alpha-conotoxin peptides | |
| CA2693047A1 (en) | The use of type-b lantibiotic-based compounds having antimicrobial activity | |
| US20180362599A1 (en) | Modifications and uses of conotoxin peptides | |
| JP5345929B2 (ja) | 環状アルファ−コノトキシンペプチド | |
| EA006423B1 (ru) | Олигопептид, обладающий биологической активностью модулятора рецептора тромбопоэтина, и способы его применения | |
| JP2791957B2 (ja) | ホロレナ・クルタくも毒液から単離されたポリペプチド類 | |
| Kem et al. | Sea anemone toxins as templates for the design of immunosuppressant drugs | |
| JPH03120299A (ja) | カルシウムチャンネル遮断薬として有用なポリペプチド | |
| ES2377635T3 (es) | Compuestos análogos de péptidos analgésicos derivados del veneno de serpientes Crotalus durissus terrificus, sus usos, composiciones, procedimientos de preparación y purificación | |
| WO2002064740A9 (en) | Cone snail peptides | |
| WO2021200259A1 (ja) | Ｖｉｐｒ２アンタゴニストペプチド | |
| ES2268885T3 (es) | Peptidos de chi-conotoxina como inhibidores de transportadores neuronales de anima. | |
| US5866682A (en) | Conopeptides AuIA, AuIB and AuIC | |
| EP3169344B1 (en) | Epha4 cyclic peptide antagonists for neuroprotection and neural repair | |
| EP4028392A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of respiratory syncytial virus | |
| ES2719137T3 (es) | Análogos de apelina cíclica | |
| KR102097040B1 (ko) | 폐렴구균의 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항생 펩타이드 및 이의 용도 | |
| Jones et al. | Composition and therapeutic utility of conotoxins from genus Conus. Patent status 1996-2000 | |
| US5182262A (en) | Calmodulin binding peptide derivatives of non-erythroid alpha spectrin | |
| JP2017526644A5 (es) | ||
| Saccomano et al. | Ca2+ channel toxins: tools to study channel structure and function |