JPH03120299A - カルシウムチャンネル遮断薬として有用なポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｎ鉦肛釦）クモの毒液中に存在することが見い出された
ポリペプチドおよび前記ポリペプチドと本質的に同じア
ミノ酸配列および本質的に同じ活性を持つポリペプチド
に関する。このポリペプチドおよびその医薬として適当
な塩は無脊椎動物およびを椎動物を含む種々の生物体の
神経および筋肉細胞を含む細胞中のカルシウム　チャン
ネルを遮断する０本発明はまた前記ポリペプチドおよび
その塩、それ自身の、生物体の神経および筋肉系中の細
胞のごとき細胞中のカルシウム　チャンネルの遮断；哺
乳類のカルシウム　チャンネルが介在する疾患および健
康状態の処置；および無脊椎動物害虫の制御における使
用にも関する。さらに、本発明は前記ポリペプチドおよ
びその塩からなる組成物に関する。

鉦肛圓）の毒液はカルシウム流動に影響を及ぼず少くと
も２つの毒素を含んでいることが報告されている。Ｊａ
ｃｋｓｏｒ＋、Ｈ，、らＳｏｃ、Ｎｅｕ、Ｓｃｉ、Ａｂ
ｓｔｒ、　１２　：１０７８　（１９８７）　、これら
の著者は１　、０００ダルトン未満の分子量を持ち、組
織の広い範囲においてのカルシウム流動を抑制する毒素
（そこではＡＣ３と称されている）について記載してい
る。さらに、Ｊａｃｋｓｏｎ、　Ｈ，らはＳｏｃ、Ｎｅ
ｕ、Ｓｃｉ、Ａｂｓｔｒ、１２　：　７３０（１９８６
）において約６　、０００の分子量の成分からなるヱｙ
とノブシス　ヱづル久　ｎ討圏並Ｌｎ　且肛田）からの
他の毒素を報告している。その毒素は伝達の前シナグシ
ス封鎖に影響を与え、神経伝達物質の放出と関連がある
カルシウム　チャンネルをその毒素が遮断することが示
唆されてきた。

ｌ力〕乙とプクノヨ　ヱペ止叉す且１刑］臣臘　並−肛
田）クモの毒液中に存在することが発見されたある種の
ポリペプチドが１９８９年４月２８日に出願された米国
特許出願第０７／３４６．１８１号に記載されている。

これらのポリペプチドはそこで細胞のカルシウムチャン
ネルの遮断薬として記載されており、それらが見い出さ
れる分画に従って下記のごとく記載されている： 分画Ｇニ アミノ末端アミノ酸配列中が、 ＨｚＮ−ｇ　Ｉｕ−１ｙｓ　−ｇ　Ｉｙ−１ｅｕ−ｐｒ
ｏ−ｇｌｕ−ｇ　１ｙ−ａ　Ｉａ−ｇ　Ｉｕ−ｃｙｓ−
ａｓｐｇｌｙ−ａｓｎ−ｇ　Ｉｕ−ｓｅｒ−ａｓｐ−ｃ
ｙｓ−１ｙｓ−ｃｙｓ−ａ　ｌａ−ｇ　ｌｙ−ｇ　Ｉｎ
−ｔｒｐｉ　Ｉｅ−１ｙｓ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｃｙｓ−
ｐｒｏ−ｔｒｐ−１ｙｓ　−ｔｒｐ−ｈ　ｉｓ−ｉｌ　
ｅ−ｔｈｒｇ　１　ｙ−ｇ　ｌｕ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｃ
ｙｓ−ｔｈｒ−ｃｙｓ−ｇｌ　ｕ−ａｒｇ−ｇｌ　ｙ−
１ｅｕ−１ｙｓｌｙｓ　−ｔｈｒ−ｃｙｓ−ｉ　１ｅ−
５ｅｒ−１ｙｓ　−１ｅｕ−ｓｅｒ−ａｓｐ−ｐｒｏ−
ａｓｎ−ａｒｇａｓｎ−ｇｌｕ−ｔｒｐ−！ｅｕ−ｓｅ
ｒからなり、　ＦＡＲＭＳによる全ポリペプチドの分子
量ニア２６７゜ 分画Ｈ１： ＩＩＪ−ａｌａ−ｃｙｓ−ｖａｌ−ｇｌｙ−ｇｌｕ−ａ
ｓｎ−ｇｉｎ−ｇｌｎｃｙｓ−ａｌａ−ａｓｐ−ｔｒｐ
−ａｌａ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｈｉｓ−ｃｙｓ−ａｙｓａ
ｓｐ−ｇｌｙ−Ｌｙｒ−ｔｙｒ−ｃｙｓ−ｔｈｒ−ｃｙ
ｓ−ａｒｇ−ｔｙｒｐｈｅ−ｐｒｏ−１ｙｓ−ｃｙｓ−
ｉｌｅ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ａｓｎ−ａｓｎ−ａｓｎに０
ＮＩＩｚ；　　ＦＡＲＭＳ：　　４１９８゜分画Ｈ茸　
ニ アミノ末端アミノ酸配列が： ＨＪ−ａｌａ−１ｙｓ−ａｌａ−１ｅｕ−ｐｒｏ−ｐｒ
ｏ−ｇｌｙ−ｓｅｒｖａｌ−ｃｙｓ−ａｓｐ−ｇｌｙ−
ａｓｎ−ｇｌｕ−ｓｅｒ−ａｓｐ−ｃｙｓ−１ｙｓ−ｃ
ｙｓ−ｔｙｒ−ｇｌｙ−１ｙｓ−ｔｒｐ−ｈｉｓ−１ｙ
ｓ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｃｙｓ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−１ｙｓ
−ｇｌｙ−ｈｉｓ−ｐｈｅ−Ｌｈｒ−ｇｌｙ−ｇｌｕ からなり、ＦＡＢＭＳによる全ポリペプチドの分子量：
５４９４゜ 分画Ｉ： ＨＪ−ａｓｐ−ｃｙｓ−ｖａｌ−ｇｌｙ−ｇｌｕ−ｓｅ
ｒ−ｇｌｎ−ｇｌｎｃｙｓ−ａｌａ−ａｓｐ−ｔｒｐ−
ａｌａ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｈｉｓ−ｃｙｓ−ｃｙｓａｓ
ｐ−ｇｌｙ−ｔｙｒ−Ｌｙｒ−ｃｙｓ−ｔｈｒ−ｃｙｓ
−ａｒｇ−ｔｙｒｐｈｅ−ｐｒｏ−１ｙｓ−ｃｙｓ−１
１ｅ−ｃｙｓ−ｖａ　Ｉ−ａｓｎ−ａｓｎ−ａｓｎ−Ｃ
ＯＮＩＩ　ｚ　；ＦＡＢ門Ｓ：　４１５８゜ 分画Ｊニ アミノ末端アミノ酸配列が： ＨｔＮ−ａｓｐ−ｇｌｕ−ｐｒｏ−ｃｙｓ−ｉｌｅ−ｐ
ｒｏ−１ｅｕ−ｇｌｙ−１ｙｓ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｓｅ
ｒ−ｔｒｐ−１ｙｓ−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ｔｈｒ−ｐｒｏ
−ｔｙｒｃｙｓ−ｃｙｓ−ｔｈｒ−ｈｉｓ−ｐｒｏ−ａ
ｓｐ−ａｓｐ−ａｌａ−からなり；　ＦＡＢ　ＭＳによ
る全ポリペプチドの分子量：５５０５゜ 分画に： ）１ｔＮ−ｇｌｕ−ａｓｐ−ａｓｎ−ｃｙｓ−ｉｌｅ−
ａｌａ−ｇｌｕ−ａｓｐｔｙｒ−ｇＩｙ−１ｙｓ−ｃｙ
ｓ−ｔｈｒ−ｔｒｐ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｔｈｒ−１ｙｓ
−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｐｒｏ−
ｃｙｓ−ａｒｇ−ｃｙｓ−ｓｅｒｓｅｔ−ｉｌｅ−ｇｌ
ｙ−ｔｈｒ−ａｓｎ−ｃｙｓ−ｇｌｕ−ｃｙｓ−ｔｈｒ
−ｐｒ。

ａｒｇ−１ｅｕ−４１ｅ−ｓｅｔ−ｇｌｕ４１ｙ−１ｅ
ｕ−ｓｅｒ−ｐｈｅ−ａｌａＣＯＮＨｚ；　ＦＡＢ　Ｍ
Ｓ：５２７４分画Ｌ１　： アミン末端アミノ酸配列が： ＨＪ−４１ｅ−ｖａｌ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−１ｙｓ−ｔｈ
ｒ−ａｌａ−１ｙｓ−ｐｈｅｇｌｙ−ａｓｐ−ｔｙｒ−
ｐｒｏ−ｔｒｐ−ａ＋ｅｔ−ｖａｌ−ｓｅｒ−４１ｅｇ
ｌｎ−ｇｌｎ−１ｙｓ−ａｓｎ−１ｙｓ−１ｙｓ−ｇｌ
ｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ａｓｐからなり；全ポリペプチド
のおよその分子量は約２０、０００゜ 分画し２　： 下記の同定特性を持つポリペプチド： （ａ）　　ヱｆ！１ブ之入　　ベル　（ＡｅｌｅｎＯ５
ｉＳ鉦肛田Ｌクモの粗毒液からの分画に存在し、Ｃ−１
８バイダツク（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＠）　　（登録商標
）２２ａｕ＋＋Ｘ２５０ＩＩ１ｍ、３００人の細孔径、
ｌＯμの粒子径のカラムにおいて、１５ｄ／分の流速お
よび５％→２０％Ｂ１９５％→８０％Ａ（０→３０分〕
続いて２０％→７０％Ｂ、８０％→３０％Ａ〔３０→５
５分〕　（ここでＡは０．１％ＴＦＡ水溶液であり、Ｂ
はアセトニトリルである）の直線勾配プログラムを使用
する溶媒系を用いて約４３分に？容出され；および （ｂ）　　前記（ａ）項に記載されている分画の分画中
に存在し、Ｃ−１８バイダツク（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＠
）　　（登録商標）　１０ｍｍＸ２５０ｍｍ、３００人
の細孔径、５μの粒子径のカラムにおいて３．５ｄ／分
の流速および２５％→４０％Ｂ、７５％→６０％Ａ（０
→３０分）　（ここでＡは０．１χＴＦ＾水溶液であり
、Ｂはアセトニトリルである）の直線勾配プログラムを
使用する溶媒系を用いて約２２．５分に溶出される。

分画Ｍニ アミノ末端アミノ酸配列が： ＨＪ−ｇｌｕ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｇｌｕ−ａｌａ−ａｌ
ａ−１ｙｓ−ｖａｌ−１ｅｕ−ｓｅｒ−ａｓｎ−１ｅｕ
−ａｓｐ−ｇｌｕ−ｔｈｒ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐｒ。

からなり；全ポリペプチドのおよその分子Ｗカ’Ｊ−ｔ
８０．０００゜ 占 カルシウム拮抗薬である化合物は種々の有用性を持って
いる。カルシウム拮抗薬はアンシーナ、高血圧、心筋症
、上心室性不整脈、食道アヵラシア、早産およびレイノ
ー病などのごとき状態の処置における臨床応用に見るこ
とができる。Ｍ、Ｇ。

１１ａｙｌｅｒ＋−友夾之立人拮筑ｌ、アカデミツクプ
レス、ハルコートブレイス　ヤバノヴイッチ　パプリン
シャーズ、ニューヨーク、ＭＹ　１９ＢＢ　、を参照さ
れたい、その教えはここに引例として含まれている。

さらに、そのような化合物は神経および筋肉細胞のごと
き細胞の生理学の研究および無脊椎動物の害虫の制御に
有用である。

競ｎ　肛肛釦）クモの毒液中に存在することが見い出さ
れたポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドおよ
びそれが存在する本発明による分画は以下のごとくであ
る； 分画Ｑ： （ａ）　　ヱＹ２ム１之囚ヱさ火久圏討旦肘旺ｎ７クモ
の粗毒液からの分画に存在し、ｃ−１８バイダツク（Ｃ
−１８ＶｙｄａｃＯ）　　（登録商標）２２ｓｘ２５０
ＩＩＩＩ１１．３００人の細孔径、５μの粒子径のカラ
ムにおいて１５ｄ／分の流速および５％→２ｏ％Ｂ、９
５％→８０％Ａ（０−３０分〕続イテ２０％−７０％Ｂ
、８０％−ｈ３０％Ａ　（３０−５５分〕　〔ここでＡ
は０．１＄）リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液であり、
Ｂはアセトニトリルである〕の直線勾配プログラムを使
用する溶媒系を用いて約４１．５分に溶出され； （ｂ）　　前記（ａ）項に記載されている分画の分画中
に存在し、Ｃ−１８バイダツク（Ｃ−１８ＶｙｄａｃＯ
）　　（登録商り　１０５ｗ＜Ｘ２５０ｍｍ、３００人
の細孔径、５μの粒子径のカラムにおいて３．５ｍｌ！
／分の流速および７ｏ％Ａ、３０％Ｂ　（コ、：テＡハ
０．１Ｘ　ＴＦＡ水溶液であり、Ｂはアセトニトリルで
ある）の無勾配系を使用する溶媒系を用いて約７．５分
に溶出され；および（Ｃ）　　アミノ末端アミノ酸配列
が：Ｈ、Ｎ−１ｙｓ−１ｙｓ　−１ｙｓ−ｃｙｓ−ｉ　
Ｉｅ−ａ　ｌａ−１ｙｓ−ａｓｐ−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ａ
ｒｇｃｙｓ　−１ｙｓ−ｔｒｐ−ｇ　Ｉ　ｙ−ｇ　Ｉｙ
−ｔｈｒ−ｐｒｏ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｇａｙ−
ａｒｇｇ　１ｙ−ｃｙｓ−ｉ　Ｉｅ−ｃｙｓ−ｓｅｒ−
ｉ　Ｉｅ−ａ＋ｅｔ−ｇ　Ｉｙ−ｔｈｒ−ａｓｎ−ｃｙ
ｓ−ｇ　Ｉｕｃｙｓ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ａｒｇ−１ｅｕ
−ｉｌｅ−ｓｅｔ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−１ｅｕ−からなる
。

本発明のポリペプチドは細胞中のカルシウムチャンネル
を遮断する。それ故、前記ポリペプチドはそれ自身で細
胞のカルシウム　チャンネルの遮断に有用である。前記
ポリペプチドはまた無脊椎動物の害虫の制御および細胞
のカルシウム　チャンネル機能が介在する補乳頻の疾病
および健康状態の処置に有用である。

前記のポリペプチドと本質的に同じアミノ酸配列および
本質的に同じカルシウム　チャンネル遮断活性を持つポ
リペプチドも本発明の範囲に含まれる。

本発明はまた前記ポリペプチドからなる医薬組成物およ
び前記ポリペプチドの投与方法にも関している。

毒液は１乃夕にノニ乙ンノ、ヱユ火Ｌ（釦蛙、ヤ、ｉｓ
　　ｕ肛圏）クモから当業者にはよく知られている常法
に従い、電気刺激による乳液しばり出し過程ニヨり得う
れる。腹部逆流物または血リンパによる全毒液への混入
に対して防護できる方法を用いるのが好適である。その
ような方法は当業者にはよく知られている。そのように
して得られた全毒液は以下に記載する精製に使用される
までは＝７８°Ｃにて凍結状態で貯蔵された。

全毒液からの成分の？＃製ば、Ｃ−４およびＣ−１８ハ
イダツク（Ｃ−１８ＶｙｄａｃＯ）　　（登録商標）カ
ラム（レイニン　インスッルメント　Ｃｏ、　Ｉｎｃ、
　、マンクロード、ウォバーン、マサチューセッツ０１
８０１）のごとき種々の分取用および半分衣用カラムに
ょる透相高速液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬｃ）に
より達成された。ピークの検出は２２０−２３０ｒ＋ｍ
の単色光で実施された。分画のさらなる分析は例えばウ
ォーターズ９９０ダイオードアレー検出器（ミリボアコ
ーポレーション、ウォーターズ　クロマトグラフイー　
デイビジョン、３４メープルストリート、ミルホード　
マサチューセッツ０１７５７）で集められた多色光Ｕｖ
データにより達成された。カラムからの分画はｌ５ＣＯ
／“ｐｏｘｖ”フラクシシンコレクターおよびｌ５Ｃ０
２１５９ピーク検出器（ＩＳＣｏ、４７００スーベリオ
ール、リンカーン、ネプラスカ６８５０４）を使用する
ごとき既知の方法により集められた０分画は無菌ポリエ
チレン実験器具のごとき適当な大きさの容器に集められ
る０分画の濃縮は溶出液からの凍結乾燥続いての水から
の凍結乾燥により達成される。得られる成分分画の純度
は分画の最終精製に使用された系よりも少ない勾配の勾
配系を用いる分析カラムを使用するクロマトグラフィー
分析により決定できる。

各々の分画に含まれるものの構造はマススペクトル法お
よび核磁気共鳴法のごとき既知の分析法により決定され
た０分画Ｑのポリペプチドは既知の方法に従って配列決
定された０例えば、試験するポリペプチドのシスチン残
基のＳ−ピリジルエチル化は溶液中で実施でき、続いて
ポリペプチドのアミノ酸配列決定がなされる。Ｓ−ピリ
ジルエチル化のためのそのような方法の１つは以下のご
とくである。１部の４ｓＨのＥＯＴＡを含むＩＭＦリス
ＭＣＩ、　ＰＨ８，５および３部の８Ｍグアニジン・１
ｌｔＪを混合することにより調製された緩衝液に約１か
ら１０４のポリペプチドを溶解または希釈して５０ｐｌ
とする０次に２．５ｐｌの１０％２−メルカプトエタノ
ール水溶液を添加して混合物を暗所、アルゴン下室温に
て２時間インキュベートする。インキュベーション後、
２ｐｌの４−ビニルピリジン（アルゴン下−２０℃で貯
蔵されている新しい試薬）を添加し、混合物は暗所にて
アルゴン下室温でさらに２時間インキュベートする。混
合物は次に好適には短い逆相カラム上のクロマトグラフ
ィーにより脱塩される６回収されたアルキル化ポリペプ
チドは続いて既知の方法に従って配列決定される。

本発明の実施には先に概説した一般式な方法が用いられ
、毒液の最初の分画化に適したカラムはＣ−１８バイダ
ツク（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＠）　　（登録商標）２２閤
×２５０閣、３００人の細孔径、１０μの粒子径のカラ
ムであることが見い出された。このカラムは１５Ｉ１１
／分の流速テ９５％−ＢＯ％Ａ、５％−２０％Ｂ（０−
３０分〕続イテ８０％→３０％　Ａ　、　２０％→７０
％Ｂ（３０−５５分〕　〔ここでＡは０．１χトリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液であり、Ｂはアセトニトリル
である〕の直線勾配プログラムを用いて溶出される１分
画は前記のごとく集められる。そのようにして得られた
Ｑ′と名付けられた分画がさらなる精製のために選択さ
れた。分画Ｑ′の溶出時間は約４１６５分であった。

分画Ｑ′はＣ−１８バイダツク（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＠
）（登録商標）１０ｍｘ２５０ｍ、３００人の細孔径、
５．０μの粒子径のカラムを用い、３．５ｍ／分の流速
で７０％０．１％ＴＦＡ水溶液、３０％アセトニトリル
の無勾配系を用いてさらに精製された０分画は前記のご
とくして集められた１分画Ｑはカラムがら約７６５分で
溶出された。また、約８．３分に溶出される分画は米国
特許出願第０７７３４６．１８１号において、分画にと
記載されているポリペプチドを含んでいた事が観察され
た。

分画Ｑは： ）ＩＪ−１ｙｓ−］　ｙｓ−１ｙｓ−ｃｙｓ　−ｉ　１
ｅ−ａｌａ−］　ｙｓ−ａｓｐ−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ａｒ
ｇｃｙｓ　−１ｙｓ　−ｔｒｐ−ｇｌｙ−ｇｌ　ｙ−ｔ
ｈｒ−ｐｒｏ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｒ
ｇｇｌｙ−ｃｙｓ−ｉ　１ｅ−ｃｙｓ−，５ｅｔ−ｉｌ
ｅ−ｓｅｔ−ｇｌｙ−ｔｈｒ−ａｓｎ−ｃｙｓ−ｇｌＬ
ｌｃｙｓ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ａｒｇ−１ｅｕ−ｉ　Ｉｅ
−ｍｅｔ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−１ｅｕからなるアミノ末端
アミノ酸配列を持つポリペプチドが含まれていた。

７カ〕６ムズ之ノー　ヱゴ〃１−（４）邑国収旺艮　奸
〜肛紐）からの毒液の分画Ｑに存在する化合物に関して
本開示内容に利点を与えるよう現在全毒液からの単離／
精製以外の方法により前記化合物を得ることが可能であ
る０本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドまたは
その一部をコードしている配列のクローニングによる組
換え体ＤＮＡを用いて製造できる０例えば、全ポリペプ
チドをコードしている配列のクローン化のため、前記ポ
リペプチドの現在知られているアミノ酸配列情報を利用
するバイブリダイゼーションプローブが当業者にはよく
知られた方法に従って用いることができる。組換え体Ｄ
ＮＡ技術および試験管内でのタンバク質合成の組合せも
また本発明のポリペプチドの製造に用いることができる
。そのような試験管内タンパク質合成法としては、当業
者にはよく知られている標準メリーフィールド化学また
は他の固相化学を用いるＡＢＩ　４３０Ａ固相ペプチド
合成機（アプライド　バイオシステムス、　Ｉｎｃ、、
８５０リンカーンセンター　ドライブ、フォスター市　
カリホルニア９４４０４）の使用が挙げられるがそれに
制限されるわけではない。

本分野においては前記ポリペプチドの機能に影響しない
、または本質的に影響しないある種のアミノ酸の置換を
ポリペプチド中にすることができることがよく知られて
いる。可能である的確な置換はポリペプチド間で変化す
る。許容される置換の決定は当業者によく知られた方法
に従って達成される。それ故、本質的に同じアミノ酸配
列および本質的に同じカルシウム　チャンネル遮断活性
を持つすべてのポリペプチドは本発明の範囲内である。

本発明のポリペプチドは無脊椎動物およびを椎動物の神
経および筋肉系の細胞のごとき種々の細胞に存在するカ
ルシウム　チャンネルを不可逆的に遮断する。

カルシウム　チャンネルを遮断する本発明のポリペプチ
ドの能力は以下の方法により示される。

小脳顆粒細胞を生後８日のラットの小脳から調製する（
Ｗｔｌｋｉｎ、Ｇ、Ｐ、　　ら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ：
１１５：１８１−１９９１９７６）　、　Ａｃ１ａｒ（
プロプラスチックＩｎｃ、、　５０３３インダストリア
ルアベニユ、ウオール、　Ｎ、Ｊ、０７７１９）の四角
片（１，：ｄ）をポリーＬ−リジンで被覆し、１１ｄの
イーグルの基礎培地を含む１２−ウェルの皿に入れる。

細胞を解離させ、６．２５　ｘ　１０’細胞を含む液を
Ａｃ１ａｒの四角片を含む各々のウェルに添加する。細
胞播種２４時間後にシトシン−ベーターＤ−アラピノ　
フラノシドを添加する（最終濃度１０μＨ）、培養６．
７および８日日に細胞をｆｕｒａ２分析に使用する。細
胞（Ａｃｌａｒ四角片に付着している）をＨＥＰＥＳ緩
衝液（０，０１％ウシ血清アルブミン、　０．０１％デ
キストロースを含み、ｐ）１７．４　、マグネシウム除
去）に溶解した２μＭｆｕｒａ２／ＡＭ　（モレキラー
プローブＩｎｃ、　＋　コージーン、　０１１．９７４
０２）の１−を含む１２−ウェル皿へ移す、細胞を３７
℃にて４０分間インキュベートし；　ｆｕｒａ２／ＡＭ
含有緩衝液を除き・ｆｕｒａ２／＾ｈ除いた１１１１の
同じ緩衝液に置き換える。

石英のキュベツトに２．０ｍｌ！の前もって温めである
（３７°Ｃ）ＩＩ衝液を加える。Ａｃ１ａｒ上の細胞を
キュベツト中に置き、キュベツトを磁気攪拌器を備えた
恒温に保たれている（３７℃）ホールグー中へ挿入し、
蛍光分光光度計（バイオメディカル　インスツルメント
　グループ、ペンシルバニア大学）で蛍光を測定する。

蛍光信号は約２分間まって安定化させる０次にリン酸緩
衝化塩溶液（ＰＢＳｌｐＨ７，４）に適当な濃度で溶解
させた５　−２０ｐｌの試験する化合物の貯蔵溶液をキ
ュベツトに添加する。蛍光信号の校正およびｆｕｒａ２
／ＡＭ漏出補正はＮｅｍｅｔｈらの確立された方法（Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　」録：　５１８８（１９Ｂ？
）　）を用いて実施され、各々の試験完了時、最大蛍光
値（Ｆｌａｘ）はイオノマイシン（３５μＭ）の添加に
より決定され、最小蛍光値（Ｆｍｉｎ）は続いてのキレ
ートカルシウムへのＥＧＴＡ　（１２＋ｉＭ）の添加に
より決定された６以上の方法を用い、被験化合物による
カルシウム　チャンネルの遮断が起こることは被験化合
物の添加により蛍光が減少することにより示される。

本発明のポリペプチドはそれ自身、カルシウムチャンネ
ル遮断薬として有用である。それだけでなく、これらの
化合物はまか無脊椎動物の害虫の制御およびアンジーナ
、高血圧、心筋症、上心室性不整脈、食道アカラシア、
早産およびレイノー病のごとき哺乳類の細胞のカルシウ
ム　チャンネル機能が介在する疾患および健康状態の処
置にも有用である。さらに、これらの化合物は神経およ
び筋肉系の細胞を含む（しかしそれらに制限されるわけ
ではない）細胞の生理学の研究に有用である。

本発明のポリペプチドの医薬として適当な塩もまた本発
明の範囲内である。そのような塩は当業者にはよく知ら
れた方法により形成される。例えば、ポリペプチドの塩
基塩が常法に従って調製できる。

本発明のポリペプチドが哺乳類に投与される場合、単独
でまたは標準的な医薬処方に従って医薬組成物中の医薬
として適当な担体または希釈剤と組合わせて投与できる
０本発明のポリペプチドは経口または非経口で投与でき
るが、ポリペプチドには非経口投与法が好適であろう、
非経口投与には静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下および局
所投与が含まれる。

本発明のポリペプチドの経口使用のためには、本化合物
は例えば錠剤またはカプセルまたは水性溶液または懸濁
液の形で投与できる。経口使用のための錠剤の場合にお
いては、通常使用される担体として乳糖およびコーンス
ターチが挙げられ、ステアリン酸マグネシウムのごとき
潤滑剤が普通添加される。カプセルの形での経口投与の
ための有用な希釈剤は乳糖および乾燥コーンスターチで
ある。経口使用のために水性懸濁液が必要とされる場合
、活性成分は乳化および沈殿防止剤と混合される。必要
に応じ、ある種の甘味および／または芳香剤が添加でき
る。

筋肉内、腹腔内、皮下および静脈内使用のためには、活
性成分の無菌溶液が通常調製され、溶液のｐＨは適切に
調節および緩衝化されなければならない。静脈内使用の
ためには、調製液を等張にするために、溶質の全濃度が
制御されなければならない。

本発明のポリペプチドまたはその塩がヒトの患者に使用
される場合、日用量は通常処方する医者により決定され
るであろう。さらに、用量は患者の徴候の激烈さおよび
投与される特定の化合物の強力さ同様に個々の患者の年
令、体重および応答性に従って変化するであろう。

本発明のポリペプチドまたはその塩が無を推動物害虫の
制御に使用される場合、前記ポリペプチドは前記無を推
動物へ直接投与されるかまたは前記無を推動物の環境へ
供給される０例えば、本発明の化合物は溶液として前記
無を推動物上に噴霧できる。前記無を推動物の制御に必
要な化合物の量は、無を推動物および環境状態に従って
変化するであろうし、化合物を使用する人により決定さ
れるであろう。

本発明のポリペプチドまたはその塩が細胞の生理学的研
究に使用される場合、前記ポリペプチドは細胞に当業者
にはよく知られている方法に従っテ投与される０例えば
、前記ポリペプチドは適当な生理学的緩衝液に溶解して
細胞に投与できる。

そのような研究に使用するための本発明の化合物の適当
な濃度は１１００ｐである。しかしながら、そのような
研究における前記ポリペプチドの濃度は１００μＭより
高くても低くてもよい、投与される化合物の量は既知の
方法に従い当業者により決定されるであろう。

以下の実施例は例示のためであり、本発明の範囲を制限
すると解釈してはならない。

ヱさ四ｊ　］。」お、ｎ　肛肛釦）の全毒液を融解し、
そのｌＯから６０．１に希釈し、ｃ−１８バイダツク（
Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＠　）　　（登録商標）　　（２２
ｍＸ２５０ｍｍ。

３００人の細孔径、１０μの粒子径）のカラムに負荷Ｌ
１５ｍ／分の流速および５％−２０％Ｂ、９５％→１１
１０％Ａ（０−３０分〕続イテ２０％−７０％Ｂ、８０
％→３゜％Ａ　（３０−５５分）　　（，１ｍ、：テＡ
は０．１％ＴＦＡ水溶液であり、Ｂはアセトニトリルで
ある〕の直線勾配プログラムを使用する溶媒系を用いて
溶出する。ピーク検出は２２０−２３０ｎｍの単色光で
実施し、分画はＩ　ＳＣＯ／“ＦＯＸＹ”　フラクショ
ンコレクターおよびｌ５ＣＯ２１５９ビーク検出器を用
いて集めた０分画は２０分から６０分まで集めた。分画
Ｑ′は約４１．５分に集められた。

ナチュラル　プロダクト　サイエンス　Ｉｎｃ。

（ソルトレーク市、ユタ８４１０８）から得られ約−７
８℃で凍結状態で貯蔵されていたヱゲ之込ブ之ス実施例
１に記載されたごとくして得られた分画Ｑ′をＣ−１８
バイダツク（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ”）　　（登録商標）
　　（１０ｍａＸ２５０ｍｍ、　３００人の細孔径、５
μの粒子径）のカラムに負荷し、３．５ｍ／分の流速お
よび７０％Ａ、３０％Ｂ（ここでＡは０．１χＴＦ＾水
溶液であり・Ｂはアセトニトリルである）の無勾配溶媒
系ヲ用いてカラムから溶出した。ピーク検出はウォータ
ーズ９９０ダイオード　アレー検出器を用０行い、分画
収集は実施例１に記載したごとく行った・下記の２つの
分画が得られた： ＬＪＩＬｌｌＬ！！Ｍ Ｑ　　　　　　　約７．５分 Ｋ　　　　　　　約８．３分 ポリペプチドを含む分画ＱおよびＫは次に既知の方法に
従って溶出液を凍結乾燥し続いて水から凍結乾燥するこ
とにより配列決定のために調製された。

分画ＱおよびＫのアルキル化ポリペプチドのアミノ酸分
析はウォーターズ　ピコ／タグ法を用い、製造元の使用
法に従って得られた。配列データは水性ＴＰＡ転換して
アプライド　バイオシステムス４７０Ａ型タンパク質／
ペプチドシークエンサー（アプライド　バイオシステム
ス、　Ｉｎｃ、８５０　リンカーン　センター　ドライ
ブ、フォスター市、カリホルニア９４４０４）で集めら
れた。得られたフェニルヒダントインアミノ酸の分析は
オンラインでアプライド　バイオシステムス１２０Ａ型
ＰＴＨ分析機でまたはオフ　ラインでデュポン　ツルペ
ックスＰＴＨカラム（バイオメディカル　プロダクト　
デパートメント、クロマトグラフィープロダクツ、Ｅ、
　１．デュポンド　ヌムール　アンドＣｏ、　、　Ｉｎ
ｃ、　、　１００７マーケツト　ストリート、ウィルミ
ントン、プラウエア１９８９８）により達成された。

アミノ酸分析の結果、分画Ｑのポリペプチドの一部のア
ミノ末端アミノ酸配列は下記のごとく決定された： ＨｚＮ−１ｙｓ−１ｙｓ−１ｙｓ−ｃｙｓ−ｉ　Ｉｅ−
ａ　Ｉａ−１ｙｓ−ａｓｐ−ｔｙｒ−ｇ　ｌｙ−ａｒｇ
ｃｙ３−１ｙｓ−ｔｒｐ−ｇｌｙ−ｇ　ＩＶ−ｔｈｒ−
ｐｒｏ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｒｇｇｌ
ｙ−ｃｙｓ−ｉ　１ｅ−ｃｙｓ−ｓｅｒ−ｉ　ｌｅ−ｓ
ｅｔ−ｇｌｙ−ｔｈｒ−ａｓｎ−ｃｙｓ−ＢＩｕ−ｃｙ
ｓ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ａｒｇ−１ｅｕ−ｉ　Ｉｅ−＋ｓ
ｅｔ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−１ｅｕアミノ酸分析の結果、分
＠には前記および米国特許出願第０７／３４６．１８１
号に記載されている分画にのポリペプチドからなること
も決定された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記（ａ）−（ｃ）の同定特性を持つ本質的に純粋
   なポリペプチド： （ａ）￥アゲレノプシス￥￥アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏ
   ｐｓｉｓａｐｅｒｔａ）￥クモの粗毒液からの分画に存
   在し、Ｃ−１８バイダック（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＾■）
   （登録商標）２２ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Åの細孔径
   、１０μの粒子径のカラムにおいて１５ｍｌ／分の流速
   および５％→２０％Ｂ、９５％→８０％Ａ〔０→３０分
   〕続いて２０％→７０％Ｂ、８０％→３０％Ａ〔３０→
   ５５分〕〔ここでＡは０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢
   酸）水溶液でありＢはアセトニトリルである）の直線勾
   配プログラムを使用する溶媒系を用いて約４１．５分に
   溶出され； （ｂ）前記（ａ）項に記載されている分画の分画中に存
   在し、Ｃ−１８バイダック（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＾■）
   （登録商標）１０ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Åの細孔径
   、５μの粒子径のカラムにおいて３．５ｍｌ／分の流速
   および７０％Ａ、３０％Ｂ（ここでＡは０．１％ＴＦＡ
   水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである）の無勾配溶
   媒系を用いて約７．５分に溶出され；および （ｃ）アミノ末端アミノ酸配列が 【アミノ酸配列があります】 からなる； または、前記ポリペプチドと本質的に同じアミノ酸配列
   および本質的に同じカルシウムチャンネル遮断活性を持
   つポリペプチドおよびその医薬として適当な塩。 ２、下記（ａ）−（ｃ）の特性を持つ特許請求の範囲第
   １項記載のポリペプチド： （ａ）￥アゲレノプシス￥￥アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏ
   ｐｓｉｓａｐｅｒｔａ）￥クモの粗毒液からの分画に存
   在し、Ｃ−１８バイダック（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＾■）
   （登録商標）２２ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Åの細孔径
   、１０μの粒子径のカラムにおいて１５ｍｌ／分の流速
   および５％→２０％Ｂ、９５％→８０％Ａ〔０→３０分
   〕続いて２０％→７０％Ｂ、８０％→３０％Ａ〔３０→
   ５５分〕（ここでＡは０．１％ＴＦＡ水溶液であり、Ｂ
   はアセトニトリルである）の直線勾配プログラムを使用
   する溶媒系を用いて約４１．５分に溶出され； （ｂ）前記（ａ）項に記載されている分画の分画中に存
   在し、Ｃ−１８バイダック（Ｃ−１８Ｖｙｄａｃ＾■）
   （登録商標）１０ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Åの細孔径
   、５μの粒子径のカラムにおいて、３．５ｍｌ／分の流
   速および７０％Ａ、３０％Ｂ（ここでＡは０．１％ＴＦ
   Ａ水溶液であり、Ｂはアセトニトリルである）の無勾配
   溶媒系を用いて約７．５分に溶出され；および （ｃ）アミノ末端アミノ酸配列が 【アミノ酸配列があります】 からなる； または、その医薬として適当な塩。 ３、カルシウムチャンネル遮断量の特許請求の範囲第１
   項記載のポリペプチドまたはその医薬として適当な塩お
   よび医薬として適当な希釈剤または担体からなる哺乳類
   の細胞中のカルシウムチャンネルを遮断するための医薬
   組成物。 ４、カルシウムチャンネル遮断量の特許請求の範囲第２
   項記載のポリペプチドまたはその医薬として適当な塩お
   よび医薬として適当な希釈剤または担体からなる哺乳類
   の細胞中のカルシウムチャンネルを遮断するための医薬
   組成物。 ５、医薬としての使用のための特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載のポリペプチドまたはその医薬として適
   当な塩。 ６、哺乳類の神経系の細胞中のカルシウムチャンネル遮
   断用医薬の製造のための特許請求の範囲第１または第２
   項記載のポリペプチドまたはその医薬として適当な塩の
   使用。 ７、哺乳類の筋肉系の細胞中のカルシウムチャンネル遮
   断用医薬の製造のための特許請求の範囲第１または第２
   項記載のポリペプチドまたはその医薬として適当な塩の
   使用。 ８、無脊椎動物害虫の抑制に使用するための特許請求の
   範囲第１または第２項記載のポリペプチドまたはその医
   薬として適当な塩。