PT95424B

PT95424B - Processo para a preparacao de polipeptideos uteis como bloqueadores de canais de calcio

Info

Publication number: PT95424B
Application number: PT95424A
Authority: PT
Inventors: Douglas Phillips; Nicholas Alex Saccomano; Robert Alfred Volkmann
Original assignee: Pfizer; Natural Product Sciences Inc
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-26
Publication date: 1998-06-30
Also published as: NO904251L; DE69007739D1; EP0425096B1; DK0425096T3; MY106832A; HUT55036A; NZ235496A; KR930007435B1; ZA907782B; IL95765A0; YU184490A; US5122596A; FI96865B; ES2053118T3; CA2026418A1; CN1033976C; JPH03120299A; JPH0692440B2; PL164541B1; KR910006326A

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE POLIPEPTiDEOS ÚTEIS COMO BLOQUEADORES DE CANAIS DE CÁLCIO”

M»RIâJ2ESCRITIVâ

Kesumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação ds um polipsptideo que se descobriu estar presente no veneno da aranha Aqelenopsis aperta s aos polipeptidsos que têm substancialmente a mesma sequência ds aminoácidos s substancialmente a mesma actividade do referido polipsptideo. Os polipeptí-deos do presente invento e os seus sais bloqueiam os canais ds cálcio nas células de vários organismos e são úteis no bloqueamento dos referidos canais de cálcio nas células, per sas no tratamento das doenças e estados mediados pelos canais de cálcioy e no controlo de pragas de invertebrados» 0 presente invento diz também respeito a composiçSes compreendendo os referidos polipeptídeos s os seus sais» O referido processo ds preparação consiste, por exempo, em ss proceder â eluição da totalidade do veneno da Aqelenopsis aperta a partir de uma coluna adequada, ss proceder á detecçâo do pico monocromático a 22©-23® nm, por a ss recolher a fracçao que é eluída a cerca de 4í,5 minutas e carregada numa coluna adequada, utilizando um sistema solvente isoerático e detecção de pico a 220-230 ns.» por se recolher & fracção que é eluida a cerca de 7_?5 minutos e, facultativamente₅liofilizads, ressuspensa an água s íiofiliçada.

presente invento diz respeito a um'pdlípeptidsa que se descobriu estar presente no veneno da aranha Aqelenopsis aperta e aos polipeptideos que apresentas substancialmente a íbSSbís sequência de aminoácidos e substancialmen te a mesma activi— dade que α referido polipeptideo. Os polipeptideos e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis bloqueiam os canais de cálcio em células tais como neurónios e células musculares de diversos organismos tais como vertebrados e invertebrados,, 0 presente invento dic também respeito à utilização dos referidos polipeptideos s dos seus sais no bloqueio dos canais tíe cálcio em células, nomeadsmente em células nervosas e células do sistema muscular, no tratamento de doenças e estados patológicos mediados pelos referidos canais de cálcio s® mamíferos e no controlo tíe pragas de invertebrados. 0 presente invento dis ainda respeito às composiçSés que contêm os referidos polipeptideos ou os seus ?Ξ- ή i *» κ

H „ Jackson e outros divulgaram em Soc= Neu. Sei. Abstr., Í2„ Í07S, 1987 que o veneno da aranha Agelenopsis aperta contêm pelo menos duas toxinas que afectam as correntes ds cálcio. Estes autores divulgam uma toxina, designada no referido texto por AB2, com uma massa molecular inferior a 1000 dalton. que parece suprimir as correntes tíe cálcio num grande número ds tecidos,: H= Jackson e outros referem ainda em Soc. Nsu. Sci„ Abstr„, 12, 730, 1986 uma outra toxina da Agelenopsís aperta que inclui um componente com massa molecular 600®,, Referem que a toxina efectua um bloqueamento pre-sináptico da transmissão s sugerem que a toxina bloqueia os canais de cálcio associados â libertação do neurotransmissor.

Determinados polipeptideos que se descobriu estarem presentes no veneno da aranha Aqelenopsis aperta são revelados no pedido de patente depositado nos E.U.A. em 2Q de Abril de 1989

sob ο n2 07/346 Í8Í = No referido pedido ds- pãtente afirma-se serem esses polipeptídeos bloqueadores dos canais de cálcio em células e descrevem-se como ss indica adiante, de acordo com ais fracções em que foram descobertos:

Fraeção G:

Uma sequência de aminoácidos com terminal amino constituída por? H^M-g 1 u-1 is~g 1 i~ 1 eu-pro-g 1 u-g 1 i-a 1 a-g 1 u-c is-asp-g 1 i~asn--g 1 u-ssr-asp-cis-l is~cis--ala~-y li-gln-trp-ile-lis-cis-arg-cis-pro-t rp-1 is-trp-his-ile—tre-gli-glu-gli-pro-cis-tre-cis-glu-arg-gli-leu-1is-1is-tre-cis-ils-ser-1is-1eu-ssr-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp— leu-ser~| massa molecular total do polipeptídeo de acordo coíií FAB MS (espectro de massa por bombardeamento com átomos rápidos): 7267

Fraeção

H.-^l-ala-cis-val-gli-glu-asn-gln-gln-cis-ala-asp-trp-ala-gli—

-pro-his-cis-cis-asp-gli-tir-tir-cis-trs-cis-arg-tir-fe-pro-lis-cis-ile-cis-arg-asn-asn-asn-COMH^g FAB MSs 4198=

Fraeção H~s

Uma sequência de aminoácidos com terminal amino constituída por? ala—1 is-ala-leu-pro-pro-gli—ser—val-cis·-asp-gli~a5n-glu-ser-asp-cis-l is—cis-tir-gli-1is-trp-his-lís-cis-arg-cis-pro-pro-lís-gli-his-fe—tre-gli-glu-^ massa molecular total do polipeptídeo de acordo com FAB MSs 5494=

Fracção Σ;

H^M-asp-c is-va1-g1i-g1u-ssr-g1n~g1n~c is-ala-asp-trp-a1a~g1i~ -pro-his-cis-cis-ssp-gli-tir-tir-cis-tre-cis-arg—fcir-fe-pro-lis-cis-ils-cis-val-asn-asn-asn-CONH^s FAB MS= 4158.

FracçSo Js uma sequência ds aminoácidos com terminal amino constituída pors H_oN-asp-glu-pro-cis-ile-pro-1su-g1i-1is-ser-cis-ser—fc rp-Iis™ ile-çli-tre-pro-tir-cis-cís-tre-his-pro-asp-ala-ala-; massa molecular total do polipeptídso de acordo com FAB MSs 5585.

Frscção Ks

H.-jN-g lu-asp-asn-cis-ile-ala-g lu-asp-tir-gl i-1 ís-cis-tre-trp™gli-g1i-tre-lis-cis-cis-arg-gli-arg-pro-cis-arg-cis-ser-meti1e-g1í-1rs-asn-cis-g1u-c is-tre-pro-arg-1eu-i1e-met-g1ugli-leu-ser-fe-ala-CONH^s FAB MSs 5274.

Fracção s

Uma sequência ds aminoácidos com terminal amino constituída pors H^IM-i le~val~gl i-g 1 i-1 is-tre-ala-iis—fe-g li-asp-tir-pro-trp-met·--va 1 --ssr-i 1 e-g 1 n-g 1 η-1 i s-asn-1 is-1 is-g 1 i-g 1 i-fe-asp™ 5 masa molecular total aproximada do polipeptídeos cerca de 2© ©Θ©=

Fracção L»-g

Um poiipeptídeo com as seguintes caracteristicas identificadoras 5

Ca) presente numa fracção de veneno em bruto da aranha Agelenopsis aperta obtida por eluição (caudais 15 ml/mín).

passadas cerca de 43 minutos, ds uma coluna da marca registada Vydac C-18 <22 mm x 25© mm, dimensão dos porosϊ 30©

Angsfcro®, dimensão das partículass 1® μ) com urs sistetna solvente com um gradiente linear programado do seguinte modos 5% -> 2©% B, 95% -> 8©% A Γ.® -> 3® mini, em seguida

2©% --> 7©% B, S©% -> 30% A E3® -> 55 mini, sm que A representa ácido TFA aquoso a ©,1% e B representa acetonitrilo ε <b) presente numa fracção da fracção descrita em Ca) obtida por eluição (caudais 3,5 ml/min). passados cerca de 22,5 minutos, de uma coluna da marca registada Vydac C-18 Cí® mm x 250 mm, dimensão dos poross 3©© Angstrom, dimensão das partículass 5 μ) com um sistema solvente com um gradiente linear programado do seguinte modos 25% -> 4©% B, 75% ·->

ώ®% Α Ε® -> 3® min3 = em que A representa ácido TFA aquoso a ©,í% e B representa acetonitrilo.

Fracção Ms

Uma sequência ds aminoácidos com terminal amino constituída pors H^N-glu-ala-tre-qlu-ala-ala-1is-val-leu-ser-asn-leu-asp-qlutrs-val-asp-pro~2 massa molecular total aproximada do polipeptídeo; cerca de 8© ©6®.

Os compostos que são antagonistas do cálcio têm diversas utilizações. Os antagonistas do cálcio têm utilidade clinica nc? tratamento de estados clínicos tais como angina de peito, hipertensão, cardiomiopatias. arritmias supravsntricularss, acalãsia aerofágica, trabalho de parto prematuro e doença de Raynaud, entre outros. Cf. W. G» Nsyler, Calcium Antagonista (Antagonistas do Cálcio), Academic Press, Hsrcourt Brace Jsvsnovicn Publishers. Nova Iorque, 1988, cujas conclusSes sSo incorporadas a titulo de referência na presente memória descritiva = Além disso.! estes coospostos são úteis no estudo ds fisiologia de células tais como neurónios e células musculares e no controlo de pragas ds invertebrados.

□ presente invento dis respeito a um polipeptídeo que se descobriu existir no veneno da aranha fiqelenoosis aperta, 0 polipeptídeo de acordo com o presente invento e a fracção em que se encontra presente de acordo co® c presente invento são os seguintes s

Fracção Q=

Ca) presente numa fracção obtida a partir de veneno ss bruto da aranha Agelenopsis aperta por eluição (caudais 15 snl/min), passados cerca de 41,5 minutos, de uma coluna da marca registada Vydac C--1S C22 mm χ 25® mm, dimensão dos porosa 3©ô Angstrom, dimensão das particulass 10 μ) com um sistema solvente ccm um gradiente linear programado do seguinte modos 5% -> 2©% B C© -·> 30 mini, em seguida 20% -> 70% B C30 -> 35 mini, em que A representa ácido trifluoroacético C7FA) s B representa acetanitrilo|

Cb) presente numa fracção da fracção descrita em Ca), obtida por eluição (caudal? 3,5 ml/min), passados 7,5 minutos, da uma coluna da marca registada Vydac C-18 Cl© mm x 250 mm, dimensão dos poross 3©® Angstrom, dimensão das particulass 5 μ) com o seguinte sistema solventes sistema isocrático constituído por 70% A, 30% B, em qus A representa ácido TF.A aquoso a ®,í% e B representa aoetonitrilo, e

Cc) uma sequência de aminoácidos com terminal -amino constituída pars H^N-1is~lis-lis-cis-ile-ala-lis-asp-tir-glí-arg-cic-1i s~ trρ-gIi-g1i-tre-pro-ci s-c is-arg~g1i-arg~g1i ~c i s-i1s~c is~ ser-i le-met-g I i-tre-asn-cis-g lu-cis~l is-pro-arg-leu-i le-~ mst-g lu......

polipeptidso ds acordo com o presente invente bloqueia es canais do cálcio nas células. Consequentemente_s o referido polipeptideo s util_s em si mssmog no bloqueio de canais ds cálcio ss células. 0 referido polipeptidso é igualmente útil no controlo de pragas de invertebrados e no tratamento de doenças e de estados clínicos am mamíferos mediados pelo funcionamento dos canais de cálcio nas células.

Igualmente abrangidos pelo âmbito do presente invento sstSío os polipeptideos que apresentam substancialmente a mesma sequência de aminoácidos s substancialmente a mesisis actividade bloqueadora dos canais de cálcio que o polipeptidso atrás descrito .

presente invento diz igualmente respeito às composições farmacêuticas que contêm os referidos polipeptideos e aos métodos para a administração dos referidos polipeptideos.

veneno é obtido da aranha Aqelenopsis aperta mediante o procssso de extracção por estimulação eléctrica ds acordo com os métodos padrão bem conhecidos dos especialistas da técnica. 0 método utilizado é de preferência um método que salvaguarde a totalidade do veneno da contaminação por regurgitação abdominal ou hemolinfa. Estes métodos sSo bem conhecidos pelos especialistas da técnica. A totalidade do veneno assim obtido é arnsazenada num estado congelado a cerca ds -78°C até ser purificada pelo processo descrito em seguida.

A purificação dos componentes da totalidade do veneno è efectuada mediante cromatografia líquida de elevado rendimento sm fase reversa CCLER) através de diversas colunas preparativas e semi-preparativas tais como as das marcas registadas Vydac C-4 e Vydac C-18 CRainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn, Massachusetts ôlSôl, E.LkA?. A detecção de picos é efectuada monocromaticamente para 220-23© nm. A análise ulterior das fracções pode ser realizada a partir de dados UV policromos obtidos cos um detsctor com um sistema de díodos Waters 99= (Millipors Corporation, Waters Chromathography Division, 34 Mapls Street, Milford, Massachussetts ©1757. E.U.A.). As fracções obtidas por eluição das colunas são obtidas por métodos conhecidos, tais como a utilização de um colector de fracções !?3CO/”FDXI e de um detsctor ds picos ISCO 2159 CISCO, 47®© Superior, Lincoln, Nebrasca 685©4, E.U.A.). As fracções são recolhidas em recipientes ds dimensões adequadas tais como recipientes de laboratório sfii polietileno estéril. A concentração das fracções é obtida mediante liofiiização a partir do eluente seguida de liofiiização a partir de água. A pureza das fracções componentes resultantes pode ser então determinada mediante análise cromatografica através de uma coluna analítica eluida com um sistema gradiente que é filais isocrático que o sistema utilizado na purificação final das fracções.

As estruturas compreendidas pelas respectivas fracções são determinadas de acordo com métodos analíticos conhecidos tais como espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear. A sequância ds aminoácidos do polipeptídeo da Fracção O é determinada de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, a 3-piridiletilação dos resíduos cisteina do polipeptídeo sob estudo pode ser efectuada em solução e seguida pela determinação da sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Um procedimento para efectuar a S-piridiletilação é o seguintes dissolvs-ss ou dilui-se uma quantidade de polipeptídeo compreendida entre 1 e 1© pg num máximo de 5® pml de um tampão obtido por misturação de uma parte de TrisHCl 1 M, pH 8,5, contendo ácido EDTA 4 mM e de 3 partes tíe guanidina-HCl 8 M. Em seguida, adíciona-ss 2,5 μΐ ds 2-mercaptoetanol aquoso a 1©% e incuba-se a mistura à temperatura ambiente, no escuro e sob uma atmosfera de árgon durante duas horas. Após incubação, adicionam-se 2 μΐ de 4~viniípiridina (reagente recentemente preparado sob uma atmosfera de árgon a -20^OCS s a mistura é incubada durante mais duas horas ã temperatura ambiente» no escuro, sob uma atmosfera de árgon. A mistura é então dessalinícada, de preferencia mediante cromatografia em coluna curta ds fase reversa. Determina-se então a sequência ds aniinoácidos do polipeptidso alquilado recuperado de acordo com métodos conhecidos»

Ao levar â prática o processo de acordo com o presente invento, seguindo o procedimento geral atrás delineado» descobriu-se que uma coluna adequada para o fraccionamsnto inicial do veneno é uma coluna da marca registada Vydao C-Í8 (22 mm x 25© mo» dimensão dos porosa 3@ô Angstrom, dimensão das partículas; 1© μ» A coluna é eluida com um sistema solvente (caudais 15 ml/min) com um gradiente linear programado do seguinte modos 95% -> 8®% A, 5% -> 2©% Β E© -> 3© mini, em seguida Q©% -> 3©% A» 2©% 7©% Β E30 -> 55 minj₅ em que A representa ácido trifluoroacètico (ácido TFA) aquoso a ©,15C e B representa acetonitrilo» As fracçSes sSo recolhidas do modo atrás descrito» Uma fracção obtida deste modo, designada por GT , foi escolhida para ser submetida a ulterior purificação» 0 tempo de eluição da FraccSo CT foi de cerca de 4i_?5 minutos»

A Fracção 3' foi submetida a purificação ulterior mediante cromatografia através de uma coluna da marca registada Vydsc C-ÍS (í© mm x 25© mm₅ dimensão dos poross 3©© Anostroo» dimensão das particulass 5,© μ) usando um sistema solvente isocrático constituído por 7©% ácido TFA aquoso a ®₅1% e 3ΘΧ acetonitrilo (caudais 3,5 ml/min)» As fracçSes foram recolhidas do modo atrás descrito» A Fracção GT foi obtida por eluição passados cerca ds 7,5 minutos» Foi também descoberto que uma fracção, obtida por eluição passados cerca ds Q,3 minutos, continha um polipeptídeo descrito no pedido de patente nos E»U»A„ nS Θ7/346 íQi sob a designação ds Fracção K»

A Fracção Q contém um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com terminal amino constituida pors ‘ 2-1is-1 is-1is-c i s~i1e~a1s~Iis-asp-1i r-g1i-arg-cis-1is-1 rp— g 1 ,í-g 1 i-tre-pro-cis-c is-arg-g 1 i-arg-g 1 i-cis-i le-c is-ser-ile-mst-gli-tre—asn-cis-glu-cis-ϊis-pro-arg-leu—ile-mst-glu-gli-leu™»

Na posse dos novos conhecimentos_f revelados na presente memória descritiva, respeitantes ao composto presente na Fracção (3 do veneno da aranha ftgelsnojisis aperta, torna-ss possivel obter o referido composto por outros métodos que não o isolamento/purificação da totalidade do veneno» 0 polipeptídeo de acordo com o presente invento pode ser preparado mediante técnicas que utilizam ADN recombinante sm que se preparam clones de uma sequência ds codificação do referido polipeptídeo ou ds porçSes deste» Por exemplo, podem utílizar-se, de acordo com métodos bem conhecidos pelos especialistas da técnica, sondas ds hibridização, tomando em conta a agora conhecida informação sobre a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo, para obter clones de uma sequência de codificação para a totalidade do polipeptídeo» Também ss pode utilicar uma combinação ds técnicas que utilizam

ADN recombinante com métodos de síntese ds proteínas in___vitro para preparar os polipeptídsos ds acordo com o presente invento» Os métodos de síntese ds proteínas in vitro referidos englobam, de modo não limitativo, a utilização de um sintetizador de peptídsos em fase sólida ABI 43®A (Applied Biosystsms, Inc», 830

Lincoln Center Drive, Fcster City, Califórnia 944@4, E.U.A.) que faz uso de métodos químicos em fase sólida tais como o de

Merrifield ou outros hem conhecidos pelos especialistas da técnica.

É bem conhecida dos especialistas tía técnica a possibilidade ds efectuar determinadas substituições de arainoácidos em polipeptídeos que nao afectam ou, pelo menos, não afecta® substancialments a funcional idade dos referidos polipeptídeos» As substituições exactas possíveis variam de polipeptídeo para polipeptídeo, A determinação das substituições permitidas é realizada de acordo com procedimentos bem conhecidos dos especialistas da técnica. Consequentemente₅ todos os polipeptídeos que apresentam substancialmente a mesma sequência de aminoácidos e substancialmente a mesma actividade bloqueadara dos canais de cálcio são abrangidos pelo âmbito do presente invento.

Os polipeptídeos da acordo com o presente invento bloqueiam irreversivelmente os canais de cálcio presentes em diversas células, tais como células do sistema nervoso e do sistema muscular de vertebrados e invertebrados.

A capacidade ds bloqueio dos canais de cálcio dos polipeptídeos de acordo com o presente invento é demonstrada pelo seguinte procedimentos Preparam-se células granulosas do cerebelo a partir do cerebelo de ratos com S dias CG, P. Wilkin e outros, Brain Res. ί15. 181-199, 1976)= Revestem-se quadrados Cl cm“) de Aclar CPropiastics Inc., 5033 Industrial Ave», Wall, New Jersey 07719, E.U.A.) com qoIí-L-lisina e colocam-se em recipientes com 12 concavidades que contêm í ml de Eagles Basal Médium» As células são dissociadas e a cada concavidade, contendo os quadrados de Aclar, são adicionadas partes alíquotas contendo

ώ.,25 χ 10 “ células. Adiciona-se citosina-p-D-arabinofuranosida (concentração final = i@ μΜ) 24 horas após colocação so placas. As células são submetidas a análise fura2 passados 6== 7 e 8 dias. As células (fixadas sobre os quadrados Aclar) são transferidas para recipientes com 12 concavidades contendo i ml de fura2/AM 2pli (Molecular Probss Inc=_? Eugsne₃ OR 97402₅ E.U.fi.) em tampão HEPES (contendo albumina de soro bovino a 0₅01%₅ dextrose s OjOIXj, pH 7₃4₃ isento ds magnésio). As células são incubadas durante 40 minutos a 37*Cs o tampão contendo Íura2/Aii é removido s substituido por í ml do mesmo tampão sem fura2/AM= Adicionam-se 2_S0 ml de tampão pré-aquscido C37°C) a uma cuvsta de quartzo. As células sobre o Aclar são colocadas na cuveta_s a cuvsta é inserida num suporte termostático (37*0 equipado com um agitador magnético e a fluorescSnciâ é medida com um espec trésse tres ds fluorescência (Biomsdical Instruments Sroup. Universidade da rensilvânia. E.U.A.). Deixa-se estabilizar durante dois minutos o sinal obtido no espscirómstro de fluorsscSncis= Em seguida, adicionam—ss è cuvsta 5 a 20 μΐ ds uma solução ^!Sstock” do composta a ser estudado sm solução salina tamponada com fosfato (PBS. ph 7 = 4). sm concentrações apropriadas. A calibração dos sinais © a eorrecção das psrdas de fura2/AM são realizadasuma vsz completado cada um dos testes₅ através dos procedimentos estabelecidos ds Nemsth s outros descritos sm <3. Biol. Chem.. 2fo2. 5188= 1987=! sendo o valor máximo da fluorsscência determinado mediante a adição ds ionomicins (35 μΜ) g g valor mínimo da fluorescência determinado mediante a adição posterior da ácido EGTA (12 μΜ) ds modo a quslatar o cálcio.

Utilizando o procedimento precedente, fica demonstrado que o bloqueamento dos canais ds cálcio ss verifica por diminuição na τiuorsscência subsequente à adição do composto sm estudo ==

Qs polipsptídeos ds acorde com o presenta invento são úteis em si mesmos como bloqueadores dos canais de cálcio nas células» Como tal, estes compostos são igualmente útsis no controlo de pragas de invertebrados e no tratamento de doenças e estados clínicos mediados peio funcionamento dos canais ds cálcio nas células ds mamíferos, tais como angina de peito, hipertensão» cardioffliopatias₉ arritmias supraventriculares, acalàsia esofágica, trabalho ds parto prematuro e doença ds Raynsud» Além disso, os compostos são úteis no estudo da fisiologia das células, incluindo ds um modo não limitativo as células do sistema nervoso e muscular»

Também abrangidos pelo Smbito do presente invento estão os sais dos polipsptídeos de acordo com o presente invento farmaceuticamente aceitáveis» Estes sais são preparados de acordo com métodos bem conhecidos dos especialistas da técnica» Por exemplo, podecn preparar-se sais base dos polipsptídeos de acordo com métodos convencionais»

Quando se pretende administrar um polipeptídeo ds acordo eom o presente invento a um mamífero, pode-se administra-lo isolsdsmenfce ou combinado com suportes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis numa composição farmacêutica de acordo com a prática farmacêutica padrão» Os polipeptídeos podem ssr administrados pelas vias oral ou parentérica, sendo de preferir a via parentérica» A administração por via parentérica abrange a administração pelas vias intravenosa, intramuscular, intraperitoneal e subcutânea e a administração tópica»

Guando se pretende administrar um polipeptídeo de acordo com o presente invento por via oral, pode—se administrar o composto por exemplo sob a forma de comprimidos ou cápsulas ou sob a forma de uma solução ol< suspensão aquosa» No caso dos comprimidos administráveis por via oral, utilizam-se normalmente ujss suportes a lactose e o amido de milho e adicionam-se normalmente lubrificantes tais como estearato de magnésio» Mo caso das cápsulas administráveis por via oral, são diluentes úteis a lactose e a amido de milho seco» No caso das suspensões aquosas administráveis por via oral, o ingrediente activo è combinados com emulsionantes e agentes de suspensão» Se desejado, podem adicionar-se determinados edulcorantes e/ou aromatizantes»

No caso da administração ss realizar pelas vias intramuscular, intraperitoneal» subcutânea ou intravenosa, preparam-se geralmente soluções estéreis do ingrediente activo, devendo o pH das soluções ser adequadamente ajustado e estas tamponadas» Mo caso da administração se realizar por via intravenosa, a concentração total dos solutos deverá ser controlada ds modo a que a preparação seja isotónica»

Quando ss administra s um sujeito humano um polipeptí™ deo ds acordo com o presente invento ou um seu sal, a dosagem diária será normslmente determinada médico assistente» A dosagem variará consoante a idade, o peso e a reacção de cada paciente bsm como da gravidade dos sintomas por este apresentados e da potSncía do composto particular que está a ser administrado»

Quando se utiliza um polipeptídeo de acordo com o presente invento ou um seu sal no controlo de pragas de invente— brados, a sua administração aos invertebrados será feita directamente, ou indirectamente por intermédio do meio ambiente dos referidos invertebrados» ror exemplo, potíe pulvsrissr-se um composto de acordo com o presente invento sob a forma de solução sobre esses invertebrados» A quantidade de composto necessária para o controlo da praga desses invertebrados variará de acorda com o tipo de invertebrado ε ss condições ambientais e será determinada pela pessoa que aplicar o composto.

Quando se utiliza um polipeptideo de acordo com o presente invento ou uss seu sal no estudo fisiológico de células,, o referido polipeptideos é administrado às células de acordo com métodos bem conhecidos dos especialistas ds técnica. Por exemplo, os referidos polipeptideos podem ser adfiiinistrados às células num tampão fisiológico apropriado,, uma concentração dos compostos de acorde? com o presente invento adequada para estes estudos s ΙΟ© μΜ,= Contudo, pode utilizar-se nestes estudos uma concentração do referido polipeptideo muito superior ou muito inferior a 1©© μΜ„ A quantidade do composto administrada será determinada pelo especialista da técnica ds acordo com métodos bem conhecidos,,

Qs Exemplos que se seguem destinam-se a ilustrar o presente invento e ds modo algum devem ser entendidos coí?ío limitativos do seu âmbito» i^: úcacc ionamento. inicial__ds__totalidade do veneno da aranha âas.LsõQJSS.^..^srta

Descongelou-se a totalidade do veneno da aranha

Aqe1.enops.is aperta adquirido a Natural Product Sciences Inc», Salt Lake City, Utah 84i©8, E„U„A„, que tinha sido armazenado, no estado congelado, a cerca de —78°C, diluíram—se quantidades de veneno compreendidas entre 1© μΐ e 6© μΐ até atingirem o volume 20© μΐ s carrsgou-ss com elas uma coluna da marca registada Vydac C-íS <22 mm x 25® mm, dimensão dos poros§ 3©© Angstrom, dimensão das partictÂiass ί© μ) que foi eluida com um sistema solvente

(caudais 15 ml/min) cora um gradiente linear programado do seguinte modos 5% -> Ξ0% B, 95% -> 8®% A E© -·> 3© min3_s em seguida 2©%

70% B. 80% -> 3ô% A Γ3© -> 55 min3_s em que A representa ácido TFA aquoso a ®_sl% e B representa aeetonitrilo. A detecçâo dos picos foi realizada iBonocromaticamerite para 220-23© nm₃ sendo as fracçSes recolhidas com um colector de fracçSes ISCO/^í!FDXYⁿ . usando uf« detector de picos ISCO 2159. Começaram a recolher-se fracçSes passados 2® minutos e continuaram a recolher-se até passares ó© minutos sobre o inicio. A Fracção G' foi recolhida passados cerca de 41,5 minutos.

SufeÍDãÇ£Í2QaffienÍQ dajLf^ç£Ío QJ s Jeteo»ins£Í2 dâS^^ a constituem

Carregou-se uma coluna da marca registada Vydac C-ÍB (10 mm x 25© mm. dimensão dos poros; 3©© Angstrom₃ dimensão das partículass 5 μ) com a Fracção 0'₃ obtida do modo descrito no Exemplo í e sluiu-ss usando ura sistema solvente isocrático (caudal 3_?5 ml/min) constituído por 7®% A s 3®% B_? em que A representa ácido TFA aquoso a ©₃1% e B representa aeetonitrilo. A detecçâo dos picos foi realizada com um detector com um sistema de diodos Waters 99© s a recolha das fracçSes foi efectuada conforme se descreveu no Exemplo 1= Obtiveram—se as seguintes duas fracçSes;

ErâÊlSlS ±siaPO_L_dg_ejxijxão

Q cerca de 7₃5 min

K cerca ds 8_S3 min

Com o objectivo de determinar as sequências de aminoácidos tíos polipeptídeosj as fracçSes β e K₅ que continham ·<

polipeptídeos, foram liofilisadas primeiramente a partir do eluente e sm seguida a partir ds água» ds acordo com métodos bem conhecidos.

A análise ds aminoácidos dos polipeptídeos alquilados das fracções Q s K foi realisada ds acordo com o método Pico-Tag CWstsrs) seguindo as instruções do fabricante» Os dados referentes às sequências foram obtidos com um sequenciador Proteina/reptídeo» modelo 470A (Applied Biosystems lno=, 850 Lincoln Conter Dríve, Foster City, Califórnia 94404, E.U.A.) com conversão ds ácido TFA aquoso» A análise dos resultantes feniltioidantoina aminoácidos foi efectuada ⁿon line^,! com um analisador PTH, modelo 120A (Applied Biosystemsí ou ”off lins” numa coluna PTH DuPont Zorbax íBiomedical Product Department, Chromatograpny Products, Ε» I» duPont de Nemours & Co», Inc», 1©07 rlarket Street, Wilmington, Delaware 19898, E.U.A.)

Determinou-ss, como resultada da análise de aminoácidos, a seguinte sequência de aminoácidos com terminal amino da parte do polipeptideo incluído na fraeção Qs

H^N-Iis-1 is-lis-cis-i le-ala-1 is-asp-tir—g 1 i—arg— cis~lis-t.ro-g1i-g1i-tre-pro-c is-cís-arg-g1i-arg-g1í-cís-i1e-cis-ser-i1e-met—g1i-tre-asn-c is-g1u-c is—1 is—pro-arg—1eu-i1e-rae t-gJ u-gli-leu·-»

Foi também determinado, conta resultada da análise de aminoácidos, que a fraeção K incluia o polipeptideo da fraeção K atrás descrito e revelado no pedido de patente nos E»U»A» r?3 ©7/346 ÍS1.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- Processo para a preparação ds us polipeptídeo subsLane is Imante puro possuindo as seguintes caracteristicas que o identificam?

Ca) estar presente numa fracção de veneno sa bruto da aranha. Agelanoosis aperta que έ eluida a partir de uma coluna » _ _ __ o

Vydac'¹ C-Í8, de 22 mm κ 2b® mm, de dimensão de poros de 3©© A e de dimensão de partículas de i©u_? usando um caudal de 15 ml/min e um sistema solvente usando um prograína de gradiente linear de 5% —> 207. S, 95 —> 807. A E0 —> 30 min3 e depois 207. —> 707. B_s 80 —> 3®% A E30 - 55 mini, em que A ê TFA aquoso s 0₅1X e B è acetonitrilo, a cerca ds 41.5 minutos:?

Cb) estar presente numa fracção da fracção descrita em R —

Ca), que έ eluida a partir de uma coluna Vydac ’ C-ltí, de 1© mm x _ o
2o0 mm_? de dimensão tíe poros tíe 3ôô A e ds dimensão tíe partículas de 5μ, usando um caudal de 3,5 ml/sin e uos sistema solvente isocrático de 7©% A, 3©7 B, bíe que A è TFA aquoso a Θ,17 s B é acetonitrilo, a cerca de 7,5 minutos? e uma sequãncia tíe aminoácidos amino-tarminal compreendendo s rUN-1i ε-1i s-1i s-ci 5-i1e-a1a-1is-ase~ t i r-g1i-a rgcis··· 1 is-trp-g 1 i---g 1 i-trs-pro-c is-cís-arg-g 1 i-argg 1 i -c i s-i le-c is-ser-i 1 e-mst ~g 1 i-tre-asn—c is-g 1 licís·-·· 1is-pro-arg-1eu-i1s-met-glu~g1i-1su~ s um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma sequãncia de aminoácidos e substancíalmente a mesma actividade de bloqueamento dos canais de cálcio do referido polipeptídeo s seus sais

2® farmaceuticamente aceiíáveis₃ caracterizado par s totalidade do veneno da Aqelenopsis aperta ssr eluida a partir d® uma coluna

P _ *

Vydac ' t;-lb₃ ds 22 mss x 250 mni₃ ds dimensão ds poros ds 300 A s ds dimensão ds partículas de 10μ ₅ usando um caudal ds 15 ml/min s um sistema solvsnts usando um programa ds gradiente linear de 5% —> 20% de aeetonitrilo» 95 —> 8©7 ds ácido trifluoroacêtico aquoso a 0=,1% EO —.> 3© min» 1 e dspois 20% —> 70% de acetona trilo» 807 —> 307 de ácido trifluoroacêtico aquoso a ©„1% E3® —>

55 mini s por se proceder à detecção do pico monocromático a

220-230 nm=_; por a fracção que é eluida a cerca ds 41 »5 minutos R ser recolhida s carregada numa coluna Vydac“ C-IS, ds 1© mm x 25© _ o ssq ds dimensão ds poros de 30® A e ds dimensão ds partículas ds 5μ₃ usando um caudal de 3_S5 ml/mín₃ um sistema solvente isocrático de 70% de ácido fluoroacétíco a 0=,1% s 3©% tíe aeetonitrilo e detecção do pico a 22O-230 nss_? por a fracção que é eluida a cerca de 7₃5 minutos ser recolhida e₃ facultativaments» liofilizada» rsssuspsnss em égua s liofilizadas qu, al ternativasnente,, por o referido polipeptídeo ser sintetizado por métodos conhecidos par se; s~ quando se pretendem polipsptídsos que tenham substancialmente a mesma sequência de aminoâcidos do referido polipeptídeo,, esse ou esses polipeptídeos serem sintetizados por métodos conhecidos per seg s,= facul taf ivamente,, por se converter os referidos polipeptídeos nos seus sais farmacsuticamsnte aceitáveis por métodos conhecidos per se»

Lisboa, 26 de tíetembro de 199©