JP2571197B2 - アゲレノプシス・アペルタ由来のカルシウムチャンネル阻害ポリペプチド - Google Patents
アゲレノプシス・アペルタ由来のカルシウムチャンネル阻害ポリペプチドInfo
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Description
psis aperta)毒中に見出されたポリペプチドに関す
る。このポリペプチド及び薬剤学的に許容されるその塩
は、無脊椎動物及び脊椎動物をはじめとするさまざまな
生物の神経及び筋肉の細胞をはじめとする細胞内のカル
シウムチャンネルを阻害する。本発明は、生物それ自体
の細胞、例えば、神経及び筋肉系の細胞内のカルシウム
チャンネルを阻害すること、並びにカルシウムチャンネ
ルが媒介する哺乳動物の疾病及び症状の治療すること
に、前記ポリペプチド及びその塩を使用することにも関
する。更に、本発明は、前記ポリペプチド及びその塩を
含む組成物に関する。
な実用性を有する。カルシウムアンタゴニストは、アン
ギナ、高血圧症、心筋症、上室性不整脈、食道弛緩不能
症、早産、及びレイノー病も含め、このような症状の治
療において臨床上の適用を見いだすことができる。W.G.
Nayler,Calcium Antagonists,Academic Press,Harcourt
Brace Jovanovich Publishers,New York,NY 1988を参
照されたい。この文献の教示は、参考として本明細書に
含まれる。更に、前記の化合物は、神経及び筋肉細胞の
ような細胞の生理学の研究に有用である。
プチドは、米国特許第5,122,596号明細書に開示されて
いる。
に見出されたポリペプチドに関する。本発明のポリペプ
チド及びそれが存在する本発明による分画を以下に示
す。
る次のアミノ酸配列を有する。
ネルを阻害する。従って、このポリペプチドは、細胞そ
れ自体の内のカルシウムチャンネルを阻害するのに有用
である。また、このポリペプチドは、有害な無脊椎動物
の抑制並びに細胞内のカルシウムチャンネルの機能によ
って媒介される哺乳動物の疾病及び症状の治療にも有用
である。
記ポリペプチドを投与する方法にも関する。
の標準的方法に従って、電気的刺激による乳化工程を経
て、毒が得られる。使用する方法は、腹部反芻物又は血
リンパによる全毒の汚染から守るものであることが好ま
しい。このような方法は、当業者に周知である。このよ
うにして得られた全毒は、以下に述べる精製に用いるま
で、約−78℃で冷凍状態で保存する。全毒からの成分の
精製は、さまざまな調製又は部分調製されたカラム、例
えば、C−4及びC−18のVydac(登録商標)カラム(R
ainin Instrument Co.Inc.,Mack Road,Woburn,Massachu
setts 01801)を用いた逆相高性能液体クロマトグラフ
ィ(HPLC)により達成される。ピークの検出は、220〜2
30nmで単色光的に(monochromatically)行なう。更
に、分画の分析は、例えば、Waters 990ダイオードアレ
イ検出器(Millipore Corporation,Waters Chromatogra
phy Division,34 Maple Street,Milford,Massachusetts
01757)で収集したポリクロームUVデータにより達成す
ることができる。カラム分画は、公知の方法、例えば、
ISCO/“FOXY"フラクションコレクタ及びISCO2159ピーク
検出器(ISCO,4700 Superior,Lincoln,Nebraska 6850
4)を使用する方法により集める。分画は、適当な大き
さの容器、例えば、滅菌したポリエチレン実験容器に集
める。その後、分画の濃縮は、溶出液からの凍結乾燥
と、これに続く水からの凍結乾燥により達成される。得
られた成分分画の純度は、その後、分画の最終精製に用
いたシステムよりも、よりイソクラティクな(isocrati
c)濃度勾配システムを利用する分析用カラムを用いた
クロマトグラフィ分析により測定することができる。
決定することができる。一次構造を決定するための一般
的方針は、例えば、次の工程を含む。1)酵素作用に対
する基質の感受性を高めるための、ジスルフィド結合の
システイン残基の還元及びS−ピリジル化。2)1又は
多段階の酵素消化によるペプチドの制御下切断。3)逆
相高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)によるペプチド
断片の単離及び精製。4)N末端の配列決定及びイオン
−スプレー質量分析法によるペプチド断片の特性決定。
ピリジルエチル化は、例えば、溶液中で達成することが
でき、続けてポリペプチドのアミノ酸配列決定が可能で
ある。このようなS−ピリジルエチル化の工程の1つ
は、以下の記載のようにして達成することができる。
リスHCl(pH8.5)1部と8MグアニジンHCl3部とを混合し
て調製した緩衝液50μl以下に溶解又は希釈する。10%
2−メルカプトエタノール水溶液2.5μlを加え、混合
液をアルゴン下、暗所にて室温で2時間保温する。保温
後、4−ビニルピリジン(アルゴン下、−20℃で保管し
た新品の試薬)2μlを加え、この混合液をアルゴン
下、暗所にて室温で更に2時間保温する。その後、この
混合液を、好ましくは短い逆相カラムを用いるクロマト
グラフィにより、脱塩する。回収したアルキル化ポリペ
プチドについて、その後、公知の方法に従って配列決定
を行なう。
るペプチドに関する本明細書の上記の開示により、全毒
から単離/精製工程を経る方法とは別の方法により前記
ペプチドを得ることが今や可能である。本発明のポリペ
プチドは、前記ポリペプチド又はその一部分をコードす
る配列のクローニングにより、組換えDNA技術を用いて
生成することができる。例えば、前記ポリペプチドにつ
いて今や判明したアミノ酸配列の情報を利用するハイブ
リダイゼーションプローブを、当業者に周知の方法に従
って、用いて、ポリペプチド全長をコードする配列をク
ローニングすることができる。組換えDNA技術とイン・
ビトロのタンパク質合成法とを組合せて用いても、本発
明のポリペプチドを生成することができる。このような
イン・ビトロのタンパク質合成法には、限定するもので
はないが、当業者に周知の標準メリフィールド化学又は
その他の固相化学を利用したABI 430A固相ペプチド合成
機(Applied Biosystems,Inc.,850 Lincoln Center Dri
ve,Foster City,California 94404)の使用が包含され
る。
無脊椎動物及び脊椎動物の神経及び筋肉系の細胞に存在
するカルシウムチャンネルを阻害する。
ドの能力は、以下の操作によって示される。小脳の顆粒
細胞を、生後8日目のラットの小脳から調製する(Wilk
inら,Brain Res,115,181−199,1976)。正方形状(1c
m2)のアキュラ(Aclar:Proplastics Inc.,5033 Indust
rial Ave.,Wall,NJ 07719)をポリ−L−リジンでコー
トし、イーグル基本培地1mlを含む12穴プレートに設置
する。細胞をばらばらにし、6.25×106個の細胞を含む
アリコートを、正方形状のアキュラを含むそれぞれの穴
に加える。この後、24時間後にシトシン−β−D−アラ
ビノフラノシド(最終濃度10μM)を加える。この細胞
を、6日間、7日間及び8日間の培養後のfura2分析の
ために用いる。(正方形状のアキュラに接着した)細胞
を、2μM−fura2/AM(Molecular Probes Inc.,Eugen
e,OR 97402)を含有するHEPES緩衝液(0.01%ウシ血清
アルブミン及び0.01%デキストロース含有;pH7.4;マグ
ネシウム不含)1mlを含む12穴プレートに移す。細胞を3
7℃で40分間保温し、fura2/AMを含有する緩衝液を除去
し、fura2/AMを含有しない同じ緩衝液1mlで置換する。
石英キュベットに、予め温めておいた(37℃)緩衝液2.
0mlを加える。アキュラ上の細胞をキュベットに移し、
マグネチックスターラを備えた温度自動調節(37℃)の
ホルダーにキュベットを挿入し、蛍光分光光度計(Biom
edical Instrument Group,ペンシルベニア大学)により
蛍光を測定する。蛍光シグナルが安定化するまで放置す
る(約2分間)。その後、適当な濃度でリン酸緩衝生理
食塩水(PBS,pH7.4)に溶解した研究対象化合物の貯蔵
溶液5〜20μlをキュベットに加える。蛍光シグナルの
検量線作成及びfura2/AM漏れの補正は、各テストの完了
時にNemethらの常法[J.Biol.Chem.,262,5188(198
7)]を用いて行なう。最大蛍光値(Fmax)は、イオノ
マイシン(35μM)の添加により測定し、最小蛍光値
(Fmin)は、これに続いて、EGTA(12mM)を添加してカ
ルシウムをキレートすることにより測定する。前述の操
作を用いると、研究対象のポリペプチドの添加による蛍
光の減少によって、研究対象のポリペプチドによるカル
シウムチャンネルの阻害が起こっていることが示され
る。本発明のポリペプチドは、このアッセイを用いたカ
ルシウムチャンネルに関し、200nm未満の低いIC50値を
示す。比較用としての2種の公知の市販のカルシウムチ
ャンネルアンタゴニストであるニフェジピン(Nifedipi
ne)及びベラパミル(verapamil)は、それぞれ、33nm
及び4800nmのIC50値をもつ。
チャンネル阻害剤として有用である。従って、これらの
ポリペプチドは、有害な無脊椎動物の抑制、並びに哺乳
動物の細胞内のカルシウムチャンネルの機能によって媒
介される疾病及び症状、例えば、アンギナ、高血圧症、
心筋症、上室性不整脈、食道弛緩不能症、早産、及びレ
イノー病の治療にも有用である。更には、これらのポリ
ペプチドは、限定するものではないが、神経系及び筋肉
系の細胞をはじめとする細胞の生理学の研究に有用であ
る。
塩も、本発明の範囲内である。これらの塩は、当業者に
周知の方法により形成される。例えば、ポリペプチドの
塩基性塩は、常法に従って調製することができる。
場合、標準的な薬剤学的方法に従って、単独で、又は医
薬組成物中の薬剤学的に許容される担体若しくは希釈剤
と組合せて投与することができる。前記のポリペプチド
は、経口的に又は非経口的に投与することができるが、
非経口的経路による投与がポリペプチドにとって好まし
い。非経口的投与には、静脈、筋肉内、腹腔内、皮下及
び局所投与が包含される。
を、例えば、錠剤若しくはカプセル形状で、又は水性の
溶液若しくは懸濁液として、投与することができる。経
口使用のための錠剤の場合、一般的に用いられる担体に
は、ラクトース及びコーンスターチが含まれ、滑剤、例
えば、ステアリン酸マグネシウムを一般的に加える。カ
プセル形状での経口投与用として、有効な希釈剤は、ラ
クトース及び乾燥コーンスターチである。経口使用のた
めに水性懸濁液が必要とされる場合は、活性成分と乳化
剤及び懸濁剤とを組合せる。所望により、或る種の甘味
剤及び/又は香料を加えることができる。
常、活性成分の滅菌溶液を調製し、溶液のpHを適正に調
製及び緩衝することが好ましい。静脈使用のためには、
溶液の全濃度を制御して、調製試料を等張にするのが好
ましい。
場合には、一日の投与量は、処方する医者によって一般
的に決定される。更に、投与量は、個々の患者の年令、
体重及び応答、更には患者の症状の重篤性及び投与され
る個々の化合物の効力に従って変化する。
の抑制に用いる場合には、前記のポリペプチドを、前記
の無脊椎動物に直接投与するか、又は前記の無脊椎動物
の環境に与える。例えば、本発明の化合物を、前記の無
脊椎動物の上に、溶液としてスプレーすることができ
る。前記の無脊椎動物の抑制に必要な化合物の量は、無
脊椎動物及び環境の条件に従って変化し、化合物を適用
する人によって決定される。
究に用いる場合には、前記ポリペプチドを、当業者に周
知の方法に従って細胞に投与する。例えば、前記ポリペ
プチドを、適当な生理学的緩衝液中の細胞に投与するこ
とができる。このような研究に用いる本発明のポリペプ
チドの適当な濃度は、200μMである。しかしながら、
このような研究での前記ポリペプチドの濃度は、200μ
Mより大きいか、又はかなり少なくてもよい。投与され
るポリペプチドの量は、周知の方法に従って当業者によ
って決定される。
逆相HPLCカラム(VYDAC(登録商標)C−18,300Å,22×
250mm)に注入した。このカラムを二相直線勾配プログ
ラム、すなわち、95%A及び5%Bから、30分間かけて
80%A及び20%Bにし、続いて25分間かけて30%A及び
70%Bにするプログラム(A=0.1%トリフルオロ酢酸
及びB=アセトニトリル)を用いて操作し、220nmで検
出し、流速は15ml/分であった。所望の分画を、38.3分
から38.7分まで集めた。個々の実験からのプール様分画
を、凍結乾燥により濃縮した。
来の材料を、逆相HPLCカラム(VYDAC(登録商標)C−1
8,300Å,22×250mm)に注入した。このカラムを直線勾
配プログラム、すなわち、77%A及び23%Bから、25分
間かけて70%A及び30%Bにするプログラム(A=0.1
%トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル)を用いて
操作し、220nmで検出し、流速は12ml/分であった。所望
の分画を、17.3分から17.7分まで集めた。個々の実験か
らのプール様分画を、凍結操作により濃縮した。
て確認した。PTCアミノ酸分析は、ウォーターズ・ピコ
ータグ・システムを使用して、1〜10ナノモルに関し
て、3回実施した。N末端の配列決定は、天然型及び還
元/ピリジルエチル化ペプチドの両方を用いて、パルス
−液体シークエンサ(ABI)により実施した。ポリペプ
チドの一次構造は、自動化パルス−液体シークエンサ
(Applied Biosystems,model 473A)の使用により得
た。質量分光分析のデータは、フライト質量スペクトル
メータのBIO−IONプラズマ放出時間から得た。
ル化誘導体を、以下の方法で調製した。ペプチドJ2(50
mg)を、緩衝液(1:3比率の1Mトリス,pH8.4μM−EDTA
−二塩基性及び8Mグアニジン塩酸)10μlに溶解し、緩
衝液中の0.454M(10%v/v)2−メルカプトエタノール
溶液2μlで処理し、暗所で3時間室温で保持した。反
応混合物を、その後、緩衝液中の0.456M4−ビニルピリ
ジン溶液2μlで処理し、暗所で18時間室温で保持し
た。反応混合物を、水90μl及びアセトニトリル40μl
で希釈し、HPLCカラム(ベーカーWPC−18,4.6×250mm)
に注入した。このカラムを二相直線勾配プログラム、す
なわち、5分間の80%A及び20%Bの後、30分間かけて
80から50%A及び29から50%Bにするプログラム(A=
0.1%トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル)を用
いて操作し、220nmで検出し、流速は1.0ml/分であっ
た。所望の分画を、20.8分から21.3分まで集め、凍結乾
燥により濃縮した。
チドJ2の構造が確認される。
数5。
・インク (B)通り:420 シペタ・ウエイ (C)市:ソレトレークシティ (D)州:ユタ (E)国:米国 (F)郵便番号(ZIP):84108 (G)電話:(801)583−4939 (H)ファクシミリ:(801)583−4961 (ii)発明の名称:アゲレノプシス・アペルタ由来のカ
ルシウムチャンネル阻害ポリペプチド (iii)配列の数:1 (iv)コンピュータ読込可能な形式: (A)媒体の種類:フロッピーディスク (B)コンピュータ:IBM PC互換機 (C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウエア:パテントイン・リリース♯1.0、
バージョン♯1.25(EPO) (vi)先の出願データ (A)出願番号:US 07/919538 (B)出願日:1992年7月27日 (2)配列番号1の情報 (i)配列の特徴 (A)配列の長さ:48アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子の型:タンパク質 (vi)起源: (A)生物名:アゲレノプシス・アペルタ (B)組織の種類:毒 (xi)配列:配列番号:1
Claims (1)
- 【請求項1】配列番号1のアミノ酸配列を含む実質的に
純粋なポリペプチド、又は薬剤学的に許容されるそれら
の塩。
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