Hintergrund der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das sich im Gift der
Spinne Agelenopsis aperta findet, und ein Polypeptid mit im
wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im
wesentlichen der gleichen Aktivität, wie dieses Polypeptid. Die
Polypeptide und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon
blockieren Calciumkanäle in Zellen, einschließlich
Nerven- und Muskelzellen verschiedener Organismen, einschließlich
wirbellosen Tieren und Wirbeltieren. Die Erfindung betrifft
auch die Verwendung dieser Polypeptide und ihrer Salze zur
Blockierung von Calciumkanälen in Zellen, wie Zellen im
Nerven- und Muskelsystem eines Organismus an sich und die
Behandlung von durch Calciumkanäle vermittelten Krankheiten
und Zuständen bei einem Säugetier. Außerdem betrifft die
Erfindung Zusammensetzungen, die diese Polypeptide undsalze
davon umfassen.
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Verbindungen, die Calcium-Antagonisten sind, haben vielfachen
Nutzen. Calcium-Antagonisten finden klinische Anwendung bei
der Behandlung solcher Zustände wie unter anderem Angina,
Bluthochdruck, Kardiomyopathien, supraventrikulären
Arrythmien, Ösophagusachalasie, vorzeitigen Wehen und der Raynaud-
Krankheit. Siehe W.G. Nayler, Calcium Antagonists, Acacemic
Press, Harcourt Brace Jovanovich Publishers, New York, NY
1988, deren Lehren hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Außerdem sind solche Verbindungen nützlich für die
Untersuchung der Physiologie von Zellen, wie Nerven- und
Muskelzellen.
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Andere Polypeptide, die aus Agelenopsis aperta isoliert
wurden, sind in US-Patent Nr. 5,122,596 offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das im Gift der Spinne
Agelenopsis aperta gefunden wird. Das Polypeptid der
Erfindung und die erfindungsgemäße Fraktion, in der es vorhanden
ist, sind die folgenden.
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Agelenopsis-Peptid-J&sub2; hat die folgende Aminosäuresequenz, SEQ
ID Nr. 1:
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Das Polypeptid der Erfindung blokiert Calciumkanäle in
Zellen. Somit ist das Polypeptid nützlich zur Blockierung von
Calciumkanälen in Zellen an sich. Dieses Polypeptid ist auch
nützlich zur Bekämpfung bzw. Kontrolle von wirbellosen
Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen bei
einem Säugetier, die durch die Calciumkanal-Funktion in
Zellen vermittelt werden.
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Im Schutzbereich der Erfindung liegen auch Polypeptide mit im
wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz, wie oben
beschrieben, bei denen aber bestimmte Aminosäuren durch andere
Aminosäuren ersetzt sind, ohne die Calciumkanal blockierende
Aktivität des Polypeptids zu beeinflussen.
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Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische
Zusammensetzungen, die diese Polypeptide umfassen, und Methoden zur
Verabreichung der Polypeptide.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Das Gift wird aus der Spinne Agelenopsis aperta mit einem
Verfahren erhalten, bei dem durch elektrische Stimulation mit
dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Standardmethoden
gemolken wird. Es ist bevorzugt, daß das angewendete
Verfahren eines ist, das das gesamte Gift vor einer Kontamination
durch abdominalen Rückfluß oder Hämolymphe schützt. Solche
Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt. Das gesamte so
erhaltene Gift wird in gefrorenem Zustand bei etwa -78ºC
aufbewahrt, bis es zur Reinigung, wie unten beschrieben, verwendet
wird. Die Reinigung der Bestandteile aus dem gesamten Gift
wird erreicht mit Reverse
Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) auf einer Vielzahl präparativer und
semipräparativer Säulen, wie C-4- und C-18-Vydac -Säulen (Rainin
Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts 01801).
Der Nachweis der Peaks erfolgt monochromatisch bei 220 bis
230 nm. Eine weitere Analyse der Fraktionen kann z.B. mit
polychromen UV-Daten, die mit einem Waters 990 Diodenarray-
Detektor (Millipore Corporation, Waters Chromatography
Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757)
gesammelt wurden, durchgeführt werden. Die Fraktionen aus der
Säule werden mit bekannten Methoden gesammelt, z.B. unter
Verwendung eines ISCO/"FOXY"-Fraktionssammlers und eines ISCO
2159 Peakdetektors (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska
68504). Die Fraktionen werden in Gefäßen geeigneter Größe
gesammelt, z.B. steriler Polyethylen-Laborware. Das Einengen
der Fraktionen wird dann durch Lyophilisierung aus dem
Elutionsmittel nach einer Lyophilisierung aus Wasser erreicht.
Die Reinheit der entstehenden Fraktionen kann dann durch
chromatographische Analyse unter Verwendung einer
analytischen Säule mit einem Gradientensystem, das isokratischer
ist als das für die endgültige Reinigung der Fraktionen
verwendete System, bestimmt werden.
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Das erfindungsgemäße Polypeptid kann mit bekannten Methoden
sequenziert werden. Eine allgemeine Strategie zur Bestimmung
der Primärstruktur schließt z.B. die folgenden Stufen ein. 1)
Reduktion und S-Pyridylierung von durch Disulfidbindung
verbrückten Cysteinresten, um die Empfindlichkeit des Substrats
für einen enzymatischen Angriff zu erhöhen. 2) Kontrollierte
Spaltung des Peptids durch einstufigen oder mehrstufigen
enzymatischen Verdau. 3) Isolierung und Reinigung von
Peptidfragmenten über Reverse
Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC). 4) Kennzeichnung der Peptidfragmente durch
N-terminale Sequenzierung und
Ionenzerstäubungs-Massenspektrometrie.
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Die S-Pyridylethylierung von Cysteinresten der zu
untersuchenden Polypeptide kann z.B. in Lösung durchgeführt
werden, wobei sich eine Aminosäure-Sequenzierung der Polypeptide
anschließt. Ein solches Verfahren zur S-Pyridylethylierung
kann wie unten beschrieben durchgeführt werden.
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Etwa 1 bis 10 µg Polypeptid werden in bis zu 50 µl eines
Puffers gelöst oder verdünnt, der hergestellt wird, indem ein
Teil 1 M Tris-HCl, pH 8,5, der 4 mM EDTA enthält, und 3 Teile
8 M Guanidin HCl vermischt werden. 2,5 µl 10%iges wäßriges
2-Mercaptoethanol werden zugegeben und die Mischung wird bei
Raumtemperatur im Dunkeln unter Argon 2 Stunden lang
inkubiert. Nach der Inkubation werden 2 µl 4-Vinylpyridin
(frisches Reagenz, aufbewahrt unter Argon bei -20ºC)
zugegeben und die Mischung wird weitere 2 Stunden lang bei
Raumtemperatur in Dunkeln unter Argon inkubiert. Die Mischung wird
dann entsalzt, bevorzugt durch Chromatographie auf einer
kurzen Reverse Phase-Säule. Das gewonnene alkylierte Polypeptid
wird dann nach bekannten Methoden sequenziert.
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Mit dem Vorteil der hier im Hinblick auf das Peptid, das in
der Fraktion J&sub2; des Giftes von Agelenopsis aperta vorhanden
ist, gegebenen Offenbarung ist es nun möglich, das Peptid mit
anderen Methoden als durch Isolierung/Reinigung aus dem
gesamten Gift zu erhalten. Die Polypeptide der Erfindung können
hergestellt werden unter Verwendung von Gentechnik durch die
Klonierung einer kodierenden Sequenz für die Polypeptide oder
Teile davon. Zum Beispiel können Hybridisierungssonden, bei
denen die nun bekannte Information über die Aminosäuresequenz
des Polypeptids vorteilhaft eingesetzt werden kann,
angewendet werden in den dem Fachmann wohlbekannten Methoden, um
eine kodierende Sequenz für das gesamte Polypeptid zu
klonieren.
Eine Kombination aus rekombinanten DNA-Techniken und in
vitro Proteinsynthese kann auch angewendet werden, um die
erfindungsgemäßen Polypeptide herzustellen. Solche in vitro
Protein-Synthesemethoden schließen die Verwendung eines
ABI 430A-Festphasenpeptid-Syntheseautomaten (Applied
Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City,
Kalifornien 94404) unter Anwendung der Standard-Merrifield-Chemie
oder einer anderen, dem Fachmann wohlbekannten Festphasen-
Chemie ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
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Es ist im Stand der Technik wohlbekannt, daß bestimmte
Aminosäure-Substitutionen bei Polypeptiden gemacht werden können,
die die Funktion der Polypeptide nicht oder nicht wesentlich
beeinflussen. Die genauen Substitutionen, die möglich sind,
variieren von Polypeptid zu Polypeptid. Die Bestimmung
zulässiger Substitutionen wird mit dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannten Verfahren erreicht. Daher liegen alle Polypeptide
mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im
wesentlichen der gleichen Calciumkanal blockierenden
Aktivität im Schutzbereich der Erfindung.
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Die erfindungsgemäßen Polypeptide blockieren Calciumkanäle,
die in einer Vielzahl von Zellen vorhanden sind, z.B. Zellen
des Nerven- und Muskelsystems von wirbellosen Tieren und
Wirbeltieren.
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Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide,
Calciumkanäle zu blockieren, wird mit dem folgenden Verfahren
gezeigt. Kleinhirn-Zellgranula werden aus dem Kleinhirn von 8
Tage alten Ratten (Wilkin et al., Brain Res. 115, 181-199,
1976) präpariert. Quadrate (1 cm²) aus Aclar (Proplastics
Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, NJ 07719) werden mit
Poly-L-Lysin beschichtet und in Schälchen mit 12 Näpfen
gegeben, die 1 ml Eagles-Basalmedium enthalten. Die Zellen werden
getrennt und Aliquots, die 6,25 x 10&sup6; Zellen enthalten,
werden jedem Napf, der die Aclar-Quadrate enthält, zugegeben.
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Cytosin-beta-D-arabinofuranosid (Endkonzentration 10 µM) wird
24 Stunden nach dem Plattieren zugegeben. Die Zellen werden
für eine fura2-Analyse an den Tagen 6, 7 und 8 der Kultur
verwendet. Die Zellen (gebunden an die Aclar-Quadrate) werden
in Schälchen mit 12 Näpfen überführt, die 1 ml 2 µM fura2/AM
(Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402) in HEPES-Fuffer
(der 0,01 % Rinderserumalbumin, 0,01 % Dextrose, pH 7,4,
magnesiumfrei) enthält, überführt. Die Zellen werden 40
Minuten bei 37ºC inkubiert, der fura2/AM-haltige Puffer wird
entfernt und durch 1 ml des gleichen Puffers ohne fura2/AM
ersetzt. In eine Quarzküvette werden 2,0 ml vorgewärmter
(37ºC) Puffer gegeben. Die Zellen auf Aclar werden in die
Küvette gegeben und die Küvette wird in einen
thermostatisierten (37ºC) Halter eingesetzt, der mit einem Magnetrührer
ausgestattet ist, und die Fluoreszenz wird mit einem
Fluoreszenz-Spektrophotometer (Biomedical Instrument Group,
Universität von Pennsylvania) gemessen. Das Fluoreszenzsignal wird
etwa 2 Minuten lang sich stabilisieren gelassen. Dann werden
5 bis 20 µl einer Vorratslösung der zu untersuchenden
Verbindung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in
einer geeigneten Konzentration der Küvette zugegeben. Die
Kalibrierung der Fluoreszenzsignale und der
fura2/AM-Streukorrektur wird durchgeführt unter Verwendung der eingeführten
Verfahren von Nemeth et al., J. Biol. Chem., 262, 5188 (1987)
am Ende jedes Tests. Der maximale Fluoreszenzwert (Fmax) wird
bestimmt durch Zugabe von Ionomycin (35 µM) und der minimale
Fluoreszenzwert (Fmin) wird bestimmt durch anschließende
Zugabe von EGTA (12 mM) um Calcium zu komplexieren. Unter
Anwendung des vorhergehenden Verfahrens wird gezeigt, ob die
Calcium-Kanalblockierung bei einem entsprechenden Polypeptid
auftritt, wenn die Fluoreszenz bei Zugabe des jeweiligen
Polypeptids abnimmt. Das Polypeptid der Erfindung hat
niedrige IC&sub5;&sub0;-Werte, unter 200 nM, zur Blockierung der
Calciumkanäle, wenn dieser Test verwendet wird. Zum Vergleich haben
zwei bekannte im Handel erhältliche
Calciumkanal-Antagonisten, Nifedipin und Verapamil, IC&sub5;&sub0;-Werte von 33 nM bzw.
4800 nM.
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Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind nützlich als
Calciumkanal-Blockierer in Zellen an sich. Als solche sind diese
Polypeptide auch nützlich zur Kontrolle von wirbellosen
Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen
bei Säugetieren, die durch Calciumkanal-Funktionen in Zellen
vermittelt werden, z.B. Angina, Bluthochdruck,
Kardiomyopathien, supraventrikuläre Arrythmien, Ösophogusachalasie,
vorzeitige Wehen und Raynaud-Krankheit. Außerdem sind diese
Polypeptide nützlich zur Untersuchung der Physiologie von
Zellen, einschließlich von Zellen des Nerven- und
Muskelsystems, ohne darauf beschränkt zu sein.
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Im Schutzbereich der Erfindung liegen auch pharmazeutisch
annehmbare Salze der erfindungsgemäßen Polypeptide. Solche
Salze werden mit dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannten
Methoden gebildet. Zum Beispiel können basische Salze der
Polypeptide mit üblichen Methoden hergestellt werden.
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Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid an ein Säugetier
verabreicht werden soll, kann es allein oder in Kombination mit
pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln in
einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß pharmazeutischer
Standard-Praxis verabreicht werden. Die Polypeptide können
oral oder parenteral verabreicht werden, wobei der
parenterale Verabreichungsweg für Polypeptide bevorzugt ist. Die
parenterale Verabreichung schließt die intravenöse,
intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane und topische
Verabreichung ein.
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Für die orale Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids
kann die Verbindung z.B. in Form von Tabletten oder Kapseln
oder als wäßrige Lösung oder Suspension verabreicht werden.
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Im Fall von Tabletten für die orale Verwendung schließen
Träger, die üblicherweise verwendet werden, Lactose und
Maisstärke ein und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden
üblicherweise zugegeben. Für die orale Verabreichung in
Kapselforn sind nützliche Verdünnungsmittel Lactose und
getrocknete Maisstärke. Wenn wäßrige Suspensionen für die orale
Verwendung erforderlich sind, wird der aktive Inhaltsstoff mit
Emulsions- und Suspensionsmitteln vereinigt. Falls erwünscht,
können Süßstoffe und/oder Aromastoffe zugegeben werden.
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Für die intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane und
intravenöse Verwendung werden gewöhnlich sterile Lösungen des
aktiven Inhaltsstoffs hergestellt und der pH der Lösungen
sollte geeigneterweise eingestellt und gepuffert werden. Für
die intravenöse Verwendung sollte die Gesamt-Konzentration
der gelösten Stoffe kontrolliert werden, um das Präparat
isotonisch zu machen.
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Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon für
einen Menschen verwendet wird, wird die tägliche Dosierung
normalerweise durch den verschreibenden Arzt bestimmt.
Außerdem wird die Dosierung nach Alter, Gewicht und
Ansprechvermögen des einzelnen Patienten variieren, ebenso wie mit der
Schwere der Symptome des Patienten und der Wirksamkeit der
jeweilig verabreichten Verbindung.
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Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon zur
Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen verwendet wird, wird
das Polypeptid direkt an die wirbellosen Tiere verabreicht
oder der Umgebung der wirbellosen Tiere zugeführt. Zum
Beispiel kann eine Verbindung der Erfindung als Lösung auf die
wirbellosen Tiere aufgesprüht werden. Die zur Bekämpfung der
Wirbellosen notwendige Menge der Verbindung variiert abhängig
von dem wirbellosen Tier und den Umgebungsbedingungen und
wird von der die Verbindung anwendenden Person bestimmt.
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Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon zur
physiologischen Untersuchung von Zellen verwendet wird, wird
das Polypeptid den Zellen mit dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannten Methoden zugeführt. Zum Beispiel kann das
Polypeptid den Zellen in einem geeigneten physiologischen Puffer
zugeführt werden. Eine geeignete Konzentration eines
erfindungsgemäßen Polypeptids für die Verwendung in solchen
Untersuchungen ist 200 µM. Jedoch kann die Konzentration des
Polypeptids in solchen Untersuchungen größer oder viel
kleiner als 200 µM sein. Die Menge des zu verabreichenden
Polypeptids wird vom Fachmann mit wohlbekannten Methoden
bestimmt.
Beispiel 1
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a. Rohes Agelenopsis aperta-Gift ( 40 µl) wurde auf eine
Reverse Phase HPLC-Säule (VYDAC C-18, 300 Å, 22 x 250 mm)
aufgetragen, die unter Verwendung eines biphasischen linearen
Gradienten-Programms von 95 % A und 5 % B bis 80 % A und 20 %
B 30 Minuten lang, dann 30 % A und 70 % B 25 Minuten lang
betrieben wurde (A = 0,1 % Trifluoressigsäure und B = CH&sub3;CN),
wobei bei 220 nm detektiert wurde und bei einer Durchflußrate
von 15 ml pro Minute. Die gewünschte Fraktion wurde nach 38,3
bis 38,7 Minuten gesammelt. Gepoolte gleiche Fraktionen aus
einzelnen Durchläufen wurden durch Lyophilisierung eingeengt.
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B. Das Material aus der Fraktionierung von Stufe A, oben,
das aus 100 µl rohem Gift stammte, wurde auf eine Reverse
Phase-HPLC-Säule aufgetragen (Vydac , C-18, 300 Å,
22 x 250 mm), die unter Verwendung eines linearen Gradienten-
Programms von 77 % A und 23 % B bis 70 % A und 30 % B 25
Minuten lang betrieben wurde (A = 0,1 % Trifluoressigsäure
und B = CH&sub3;CN), wobei bei 220 nm detektiert wurde und bei
einer Druckflußrate von 12 ml pro Minute. Die gewünschte
Fraktion wurde nach 17,3 bis 17,7 Minuten gesammelt. Gepoolte
gleiche Fraktionen aus einzelnen Durchläufen wurden durch
Lyophilisierung eingeengt
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Die Struktur des Peptids J&sub2; wurde mit den folgenden Methoden
bestimmt und verifiziert. Eine PTC-Aminosäureanalyse wurde
3fach an 1 bis 10 nmol durchgeführt unter Verwendung des
Waters Pico-Tag-Systems. Die N-terminale Sequenzierung wurde
durchgeführt an einem Puls-Flüssigkeits-Sequenator (ABI),
sowohl an dem nativen als auch an dem
reduzierten/pyridylethylierten Peptid. Die Primärstruktur des Polypeptids wurde
erhalten unter Verwendung eines automatisierten gepulsten
Flüssigkeits-Sequenz-Automaten (Applied Biosystems, Modell
473A). Die Daten der Massen-Spektralanalyse wurden erhalten
an einem
BIO-ION-Plasma-Desorptions-Laufzeitmassenspektrometer.
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Ein pyridylethyliertes Derivat des Peptids J&sub2;, das für die
N-terminale Sequenzierung geeignet war, wurde auffolgende
Weise hergestellt. Peptid J&sub2; (50 mg) wurde in 10 µl Puffer
(Verhältnis 1:3 von 1 M Tris, pH 8,4, 4 µM EDTA-dibasisch und
8 M Guanidinhydrochlond) gelöst und mit 2 µl einer 0,454 M
(10 % V/V) Lösung von 2-Mercaptoethanol in Puffer versetzt
und drei Stunden in Dunkeln auf Raumtemperatur gehalten. Die
Reaktionsmischung wurde dann mit 2 µl einer 0,456 M Lösung
von 4-Vinylpyridin in Puffer versetzt und im Dunkeln 18
Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten. Die Reaktionsmischung
wurde mit 90 µl Wasser und 40 µl Acetonitril verdünnt und auf
eine HPLC-Säule (Baker WPC-18, 4,6 x 250 mm) aufgetragen, die
unter Verwendung eines biphasischen linearen
Gradienten-Programms von 80 % A und 20 % B 5 Minuten lang und anschließend
80 bis 50 % A und 29 bis 50 % B 30 Minuten lang betrieben
wurde (A = 0,1 % Trifluoressigsäure, B = CH&sub3;CN), wobei bei
220 nm detektiert wurde und bei einer Durchflußrate von
1,0 ml pro Minute. Die gewünschte Fraktion wurde nach 20,8
bis 21,3 Minuten gesammelt und durch Lyophilisierung
eingeengt.
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Die Daten bestätigen zusammen die Struktur des Peptids J&sub2;,
wie unten gezeigt.
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SEQ ID Nr. 1, 48 Reste, 10 Cysteine, 5 Disulfid-Bindungen.
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Berechnete Masse = 5474,4.
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Beobachtete Masse = 5474.
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Geschätzter pI = 7,98.