HU213353B - Method for preparation of calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta and pharmaceutical compositions containing it as active ingredient - Google Patents

Method for preparation of calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta and pharmaceutical compositions containing it as active ingredient Download PDF

Info

Publication number
HU213353B
HU213353B HU9302158A HU9302158A HU213353B HU 213353 B HU213353 B HU 213353B HU 9302158 A HU9302158 A HU 9302158A HU 9302158 A HU9302158 A HU 9302158A HU 213353 B HU213353 B HU 213353B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cys
polypeptide
lys
asp
arg
Prior art date
Application number
HU9302158A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT67467A (en
HU9302158D0 (en
Inventor
Mary E Kelly
Douglas Phillips
Nicholas A Saccomano
Robert A Volkmann
Original Assignee
Nps Pharma Inc
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nps Pharma Inc, Pfizer filed Critical Nps Pharma Inc
Publication of HU9302158D0 publication Critical patent/HU9302158D0/hu
Publication of HUT67467A publication Critical patent/HUT67467A/hu
Publication of HU213353B publication Critical patent/HU213353B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

A találmány az Agelenopsis aperta pók mérgéből származó polipeptid és lényegében ezen polipeptiddel azonos aminosav-szekvenciát és azonos aktivitást mutató polipeptid és ilyen polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására vonatkozik. Ezen polipeptidek, valamint gyógyászatilag elfogadható sói kalciumcsatorna-blokkoló hatásúak különböző organizmusok, így például gerincesek különböző sejtjeiben, így például idegés izomsejtjeiben. A találmány szerinti eljárással nyert polipeptidek és sóik, valamint az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények alkalmasak kalciumcsatomablokkolásra sejtekben, így például valamely organizmus ideg- és izomsejtjeiben, valamint alkalmazhatók a kalciumcsatoma által közvetített különböző betegségek és állapotok kezelésére emlősöknél.
A kalcium agonista hatású vegyületek különböző területen alkalmazhatók. A kalcium agonisták például felhasználhatók a következő állapotok kezelésére: angina, hipertenzió cardiomyopátiák, supraventrikuláris arrithmiák, aesophogeális achalasia, koraszülés, valamint Raynaud-féle betegségek (W.G. Nayler, Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Brace Jovanovich Publishers, New York, NY 1988). Ezen vegyületek továbbá alkalmasak a sejtek, így például az ideg- és izomsejtek fiziológiájának tanulmányozásához.
Az Agelenopsis aperta-ból izolált, a jelen találmány szerint nyert polipeptidtől eltérő aminosav-szekvenciájú polipeptidet ismertetnek az 5 122 596 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, és említik, hogy a polipeptid kalciumcsatoma-blokkoló aktivitású.
A találmány tehát az Agelenopsis aperta pók mérgében található polipeptid és gyógyászatilag elfogadható sói előállítására vonatkozik. A találmány szerinti polipeptidet és a frakciót, amelyben jelen van Agelenopsis J2-nek neveztük el, ennek aminosav-szekvenciája a SEQ ID NO. 1 szekvencia, amely a következő:
HíN-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-Ile-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys- Asp-Arg-Leu-Lys-Pro-OH.
A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy (i) Agelenopsis aperta pók teljes mérgét fordított fázisú C-18 típusú, 300 A pórusméretü, 22x250 mm nagyságú HPLC oszlopon 15 ml/perc átfolyási sebesség mellett 200 nm-en végzett csúcsdetektálást alkalmazva kétfázisú lineáris gradiens program szerint kromatografáljuk, ahol eluensként 30 percen át 5% -» 20% acetonitrilt és 95% -> 80% 0,1 %-os vizes trifluor-ecetsavat, majd ezt követően 25 percen át 70% acetonitrilt és 30% 0,1%-os vizes trifluor-ecetsavat alkalmazunk, a
38,3 és 38,7 perc között nyert frakciókat összegyűjtjük, és (ii) az (i) lépésben összegyűjtött frakciókat egy fordított fázisú C-l 8 típusú, 300 Á pórusméretű, 22x250 mm nagyságú HPLC oszlopon 12 ml/perc átfolyási sebesség mellett 220 nm-en végzett csúcsdetektálást alkalmazva kétfázisú lineáris program szerint kromatografáljuk, ahol eluensként 25 percen át 23% -> 30% acetonitrilt és 77% -> 70% 0,1%-os trifluor-ecetsavat alkalmazunk, a
17,3 és 17,7 perc között eluálódó frakciókat összegyűjtjük, és kívánt esetben lioflizáljuk, vízben újra szuszpendáljuk és liofílizáljuk, és kívánt esetben a kapott polipeptidet gyógyszerészetileg elfogadható sóvá alakítjuk.
A találmány szerinti polipeptid a sejtekben blokkolja a kalciumcsatomákat. Ennek megfelelően a találmány szerinti polipeptid per se alkalmas sejtekben kalciumcsatornák blokkolására és emlősöknél a kalciumcsatoma funkciókkal kapcsolatos betegségek és állapotok kezelésére.
A találmány oltalmi körébe tartoznak továbbá azok a polipeptidek, amelyek lényegében azonos aminosav szekvenciával és lényegében azonos kalciumcsatomablokkoló hatással rendelkeznek, mint a fentiekben leírt polipeptid.
A találmány vonatkozik továbbá az említett polipeptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítási eljárásra.
Az Agelenopsis aperta pókból a mérget szakember számára ismert módon, elektromos stimulálással végzett fejéssel nyerjük. Előnyös, ha olyan módszert alkalmazunk, amely biztosítja, hogy a teljes méreg abdominális folyadékokkal vagy hemolymph-fel ne szennyeződjön. Az ilyen módszerek a szakember számára ismertek. Az ily módon nyert teljes mérget fagyasztott állapotban -78 °C hőmérsékleten tároljuk, az alábbiakban ismertetésre kerülő tisztításig. Az összetevők tisztítását fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) végezzük különböző preparatív és szemipreparatívoszlopok, így például C-4 és C-18 VydacR oszlopok (Ranin Instrument Co., Inc., Mack Road, Wobum Massachusetts 01801) alkalmazásával. A csúcs detektálást monokromatikusán 220-230 nm-nél végezzük. A frakciók további analízisét például polikróm UV adatkollektorral Waters 990 diódadetektor segítségével [Millipore Corporation, Water Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757] végezzük. Az oszlopról lejövő frakciókat ismert módon gyűjtjük össze, így például az ISCO/„FOXY” frakció kollektorral, valamint az ISCO 2159 csúcsdetektorral (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). A frakciókat megfelelő méretű edényekben, így például steril polietilén laboratóriumi edényekben gyűjtjük össze. A frakciók betöményítését ezután az eluátumból való liofilizálással, majd vízből való liofilizálással végezzük. A kapott frakciók tisztaságát ezután kromatográfiás analízissel határozzuk meg, amelyhez analitikai oszlopot és gradiens rendszert alkalmazunk, amely izokratikusabb, mint az a rendszer, amelyet a frakciók végső tisztításához alkalmaztunk.
A találmány szerint nyert polipeptidet ismert módon szekvenálhatjuk. A primer szerkezet meghatározásánál általános módszer szerint például a következőképpen járunk el: 1) redukáljuk és S-piridilezzük a diszulfid-hidakkal kapcsolt cisztein- csoportokat annak érdekében, hogy a szubsztrátum érzékenységét az enzimatikus behatásra fokozzuk; 2) szabályozott módon hasítjuk a peptidet egy vagy többlépéses enzimatikus emésztéssel; 3) izoláljuk és tisztítjuk a peptid fragmenseket fordított
HU 213 353 Β fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC); 4) jellemezzük a peptid fragmenseket N-terminális szekvenálással és ion-permetezéssel tömegspektrometriával.
A találmány szerinti polipeptidek cisztein-csoportjainak S-pirídil-etilezését például oldatban végezzük, majd ezután a polipeptidek aminosav-szekvenálása következik. Egy ilyen S-piridilezési eljárást például a következők szerint végezhetünk.
Körülbelül 1-10 pg polipeptidet feloldunk vagy hígítunk 50 pl térfogatú pufferoldatban, amely a következőket tartalmazza: 1 rész 1 mólos trisz-HCl, pH 8,5, 4 mmólos EDTA és 3 rész 8 mólos guanidin HC1. Az így kapott keverékhez 2,5 pl 10%-os vizes 2-merkaptoetanolt adagolunk, és a kapott anyagot szobahőmérsékleten sötétben argonatmoszférában 2 órán át inkubáljuk. Ezután 2 pl 4-vinil-piridint (friss reagens argonatmoszférában -20 °C hőmérsékleten tárolva) adagolunk, és a kapott keveréket további 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk sötétben argonatmoszférában. A keveréket ezután sótalanítjuk, előnyösen rövid vagy fordított fázisú kromatográfiás oszlopon, majd a kinyert alkilezett polipeptidet ismert módon szekvenáljuk.
A találmány szerinti, az Agelenopsis aperta mérgének J2 frakciójában jelenlévő peptid ismeretében már lehetséges, hogy ezt a polipeptidet a teljes méregből más eljárással is, mint az izolálási/tisztítási eljárás, előállítsuk. A találmány szerinti polipeptidet előállíthatjuk rekombináns DNS-eljárással úgy, hogy az említett polipeptideket vagy azok egy részét kódoló szekvenciát klónozzuk. így például a teljes polipeptidet kódoló szekvencia klónozására ismert módon és ismert módszerek alkalmazásával felhasználhatjuk a hibridizációs mintát, amely az említett polipeptid most már ismert aminosavszekvenciájának információjával rendelkezik. Rekombináns DNS-eljárások és in vitro protein szintézisek kombinációja szintén alkalmazható a találmány szerinti polipeptidek előállítására. Az ilyen in vitro protein szintézisek közé tartozik például a korlátozás szándéka nélkül az ABI 430A szilárdfázisú peptid szintetizátor [Applied Biosytems, Inc. 850 Lincoln Center Drive, Foster City, Califomia 94404] alkalmazása standard Merrifield-eljárás felhasználásával vagy más, a szakterületen ismert szilárdfázisú eljárások.
Jól ismert a szakterületen, hogy bizonyos aminosavak helyettesítése elvégezhető a polipeptidekben anélkül, hogy azok befolyásolnák vagy lényegesen befolyásolnák a polipeptid tulajdonságát. Az adott helyettesítések, amelyek elvégezhetők, polipeptidenként változnak. A megengedhető helyettesítések meghatározását a szakterületen ismert módszerek szerint lehet elvégezni. Ennek megfelelően minden olyan polipeptid, amely lényegében azonos aminosav-szekvenciával és lényegében azonos kalciumcsatoma-blokkoló hatással rendelkezik, mint az említett polipeptid, szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.
A találmány szerinti polipeptidek blokkolj ák a különböző sejtekben, így például gerincesek és gerinctelenek ideg- és izomrendszerében jelenlévő sejtek kalciumcsatomáit.
A találmány szerinti polipeptidek kalciumcsatomablokkoló képességét a következő módon bizonyítottuk. Cerebelláris sejtgranulátumot készítettünk 8 napos patkányok kisagyának felhasználásával [Wilkin és munkatársai, Brain Rés. 115, 181-199(1976)]. 1 négyzetcentiméteres méretű Aclar-t [Proplastics Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, NJ 07119] poli-L-lizinnel bevontuk, és 12lyukú lemezbe helyeztünk, amely 1 ml Eagles-féle alaptápközeget tartalmazott. A sejteket eloszlattuk, és 6,25* 106 sejtet tartalmazó alikvot részt adagoltunk minden, Aclar-darabot tartalmazó lyukba. 10 pmól végső koncentrációban citozin-béta-D-arabino-furanozidot adagoltunk 24 órával a lemeztenyésztés után. A tenyésztés 6., 7. és 8. napján a sejteken fura2 analízist végeztünk. A sejteket, amelyek az Aclar-darabokhoz kötődtek, 12lyukú lemezre vittük át, amely 1 ml 2 pmól mennyiségű fura2/AM anyagot [Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402] tartalmazott HEPES pufferben (0,01% szarvasmarha szérum albumin, 0,01% dextróz, pH = 7,4, magnézium-mentes). A sejteket 40 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk, majd a fura2/AM-tartalmú puffért eltávolítottuk, és 1 ml azonos pufferral helyettesítettük, amely nem tartalmazott fura2/AM anyagot. Kvarc küvettába 2 ml 37 °C-ra előmelegített puffért adagoltunk. Az Aclar-lemezhez tapadt sejteket a küvettába helyeztük, és a küvettát 37 °C hőmérsékleten termosztáltuk mágneses keverővei végzett keverés közben, és mértük a fluoreszcenciát fluoreszcens spektrofotométerrel (Biomedical Instrument Grop, University of Pennsylvania). A fluoreszcens jelet hagytuk stabilizálódni körülbelül 2 percen át. Ezután 5-20 pl vizsgálandó vegyület törzsoldatot adagoltunk foszfát-pufferben (PBS, pH = 7,4) megfelelő koncentrációban. A fluoreszcens jelet, és a fura2/AM veszteség korrekciójátNémeth és munkatársai módszere szerint [J. Bioi. Chem. 262, 5188 (1987)] elvégeztük minden vizsgálatnál. A maximális fluoreszcens értéket (Fmax) ionomicin (35 pmól) adagolásával, a minimális fluoreszcens értéket (Fmin) EGTA (12 mmól) azt követő adagolásával végeztük, amely a kalciumot kelát formájában megköti. A fentiek szerinti módszer alkalmazásával az adott polipeptid kalcium-csatoma-blokkoló hatását a fluoreszcencia csökkenése mutatja, amely a polipeptid adagolása révén következik be. A találmány szerinti polipeptid IC5o értéke ennél a vizsgálatnál a kalciumcsatoma blokkolására alacsony, 200 nm alatti érték. Összehasonlításképpen két ismert kereskedelmi forgalomban lévő kalciumcsatoma antagonista a Nifedipin és a Verapamil esetén az IC50 érték 33 nm, illetve 4800 nm.
A találmány szerinti polipeptidek előnyösen alkalmazhatók sejtekben kalciumcsatoma-blokkolóként per se. Ez alapj án a találmány szerinti polipeptidek alkalmazhatók emlősöknél a sejtekben lévő kalciumcsatomák által közvetített alábbi betegségek és állapotok kezelésére például: angina, hipertenzió, cardiomyopátiák, szupraventrikuláris arrithmiák, aesophogeális achalasia, koraszülés és Raynaud-féle betegség. A találmány szerinti polipeptidek továbbá alkalmazhatók a sejtek, így például az ideg- és izomrendszerben lévő sejtek fiziológiájának tanulmányozására is.
HU 213 353 Β
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá a találmány szerinti polipeptidek gyógyászatilag elfogadható sói előállítása is. Ezek a sók a szakterületen ismert módszerekkel képződnek. így például a polipeptidek bázikus sóit ismert eljárásokkal állíthatjuk elő.
A találmány szerinti polipeptideket emlősöknek adagolhatjuk önmagukban vagy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokkal vagy hígítóanyagokkal együtt, gyógyászati készítmények formájában, amelyeket ismert módon állítunk elő. A találmány szerinti polipeptideket adagolhatjuk orálisan vagy parenterálisan, a parenterális adagolási mód előnyös. A parenterális adagolás lehet intravénás, intramuszkuláris, intraperitoneális, szubkután vagy topikális.
Orális adagolás esetén a találmány szerinti vegyületeket például tabletták vagy kapszulák vagy vizes oldatok vagy szuszpenziók formájában adagoljuk. Tabletták esetében hordozóanyagként például laktózt vagy kukoricakeményítőt, továbbá csúsztatóanyagokat, így például magnézium-sztearátot adagolunk. Kapszulakészítmények esetén a hígítóanyag előnyösen laktóz vagy szárított kukoricakeményítő. Vizes szuszpenziók esetében a hatóanyagot emulgeálószerrel és szuszpendálószerrel keverjük el, és kívánt esetben bizonyos édesítő és/vagy ízanyagokat is adagolhatunk.
Intramuszkuláris, intraperitoneális, szubkután és intravénás adagolás esetén általában a hatóanyaghoz steril oldatokat állítunk elő, és a kapott oldatok pH-ját megfelelően beállítjuk és pufferoljuk. Intravénás adagoláshoz az oldat teljes koncentrációját úgy szabályozzuk, hogy a készítmény izotóniás legyen.
Amennyiben a találmány szerinti polipeptideket vagy azok sóit a humán gyógyászatban alkalmazzuk, a napi dózist általában a gyógyszert felíró orvos határozza meg. A napi dózis továbbá függ a beteg korától, tömegétől, a beteg reagálásától, valamint a szimptómák komolyságától és az adott, adagolásra kerülő vegyület hatásosságától.
1. Példa
A. Körülbelül 40 μΐ nyers Agelenopris aperta mérget fordított fázisú HPLC oszlopra viszünk (VYDACR C-18, 300 λ, 22x250 mm), amely kétfázisú lineáris gradiensű programmal működik (95% A és 5% B -> 80% A és 20% B, 30 percen át, majd -> 30% A és 70% B 25 percen át, ahol A = 0,1% trifluor-ecetsav és B = CH3CN), detektálás 220 nm-nél és átfolyási sebesség 15 ml/perc. A kívánt frakciókat 38,3 és 38,7 perc közötti értéknél gyűjtjük. Az összesített frakciókat az egyes kísérletekből liofilizálással betöményítjük.
B. Az előző A. lépés frakcionálási lépésénél nyert, 100 μΐ nyers méregből nyert anyagot fordított fázisú HPLC oszlopra visszük (VydacR, C-18, 300 Á, 22x250 mm), amely lineáris gradiens programmal működik (77% A és 23% B - 70% A és 30% B 25 percen át, ahol A = 0,1% trifluor-ecetsav és B = CH3CN), detektálás 220 nm-nél és átfolyási sebesség 12 ml/perc. A kívánt frakciókat 17,3 és 17,7 perc között gyűjtjük. Az egyesített frakciókat az egyes kísérletekből liofilizálással betöményítjük.
A J2 peptid szerkezetét a következő eljárással határoztuk meg és igazoltuk. PTC aminosav-analízist végeztünk 1-10 nmól mennyiségeken három párhuzamossal a Waters Pico-Tag rendszer alkalmazásával. N-terminális szekvenálást végeztünk pulzálófolyadék szekvenátor (ABI) alkalmazásával mind a natív, mind a redukált/piridil-etilezett peptiden. A polipeptid primer szerkezetét egy automatizált pulzáló folyékony szekvenáló alkalmazásával nyertük (Applied Biosystems, model 473A). A tömegspektrum adatokat BIO-ION plasma deszorpciós tömegspektrométer alkalmazásával határoztuk meg.
A J2 peptid piridil-etilezett származékát, amely az N-terminális szekvenáláshoz szükséges, a következőképpen állítottuk elő. 50 mg J2 pepiidet feloldunk 10 μΐ pufferben (1:3 arányú 1 mólos trisz, pH 8,4,4 pmólos EDTA-kétbázisú és 9 mólos guanidin-hidroklorid) és 2 μΐ, 0,454 mólos (10 tf%) 2-merkapto-etanol pufferolt oldatával kezeljük, majd 3 órán át sötétben szobahőmérsékleten tároljuk. A reakciókeveréket ezután 2 μΐ, 0,456 mólos 4-vinil-piridin pufferolt oldatával kezeljük, majd szobahőmérsékleten sötétben 18 órán át tároljuk. A keveréket ezután 90 μΐ vízzel és 40 μΐ acetonitrillel hígítjuk, és HPLC oszlopra adagoljuk (Baker WPC-18, 4,6x250 mm), amely kétfázisú lineáris gradiens programmal működik (80% A és 20% B 5 percen át, majd 80 -► 50% A és 29 -> 50% B 30 percen át, ahol A = 0,1% trifluor-ecetsav, B = CH3CN), detektálás 220 nm, átfolyási sebesség 1 ml/perc. A kívánt frakciót 20,8-21,3 perc értéknél gyűjtjük, és liofilizálással betöményítjük.
Az adatok együttesen a következő J2 peptid szerkezetet igazolnak:
SEQID NO: 1,48 csoport, 10 cisztein, 5 diszulfid-kötés. Számított molekulatömeg = 5474,4
Mért molekulatömeg: 5474.
Becsült pl = 7,98.
Szekvencia felsorolás (1) Általános információ:
(i) Bejelentő:
(A) Név: Pfizer Inc (B) Utca: 235 East 42nd Street (C) Város: New York (D) Állam: New York (E) Ország: USA (F) Postai irányítószám: 10017 (G) Telefon: (203) 441-4905 (H) Telefax: (203) 441-5221 (A) Név: NPS Pharmaceuticals, Inc.
(B) Utca: 420 Chipeta Way (C) Város: Salt Laké City (D) Állam: Utah (E) Ország: USA (F) Postai irányítószám: 84108 (G) Telefon: (801)583-4939 (H) Telefax: (801) 583-4961 (ii) A találmány címe: Agelenopsis aperta-ból származó kalciumcsatoma-blokkoló polipeptid
HU213 353 Β (ifi): Szekvenciák száma: 1 (iv): Komputer adatok:
(A) Közeg típusa: floppy disk (B) Komputer: IBM PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patent In Release #1,0,
Version #1,25 (EPO) (vi) Elsőbbségi bejelentés adatai:
(A) Bejelentési szám: US 07/919538 (B) Benyújtás napja: 1992. 07. 27.
(2) Információk a SEQID NO: 1-hez:
(i) Szekvencia jellemzők:
(A) Hossz: 48 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száljellegzetesség: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (vi) Eredeti forrás :
(A) Organizmus: Agelenopsis aperta (F) Szövet típusa: méreg (xi) Szekvencia leírása: SEQ ID NO: 1:
Ghi Alá Cys Alá Gly Alá Tyr Lys Ser Cys Asp Lys Val Lys Cys Cys 1 5 10 15
His Asp AigAig Cys Arg Cys Asnlle AlaMet Asp AsnCys Val Cys
25 30
Lys Leu Phe Tyr Cys Ghi Leu Phe Gly Thr Cys Asp Atg Leu Lys Pro
40 45

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás
    H2N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys30
    -Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-Ile-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-Asp-Arg-Leu-Lys-Pro-OH aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid és gyógyszerészetileg elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) Agelenopsis aperta pók teljes mérgét fordított fázisú C—18 típusú, 300 A pórusméretű, 22*250 mm nagyságú HPLC oszlopon 15 ml/perc átfolyási sebesség mellett 200 nm-en végzett csúcsdetektálást alkalmazva kétfázisú lineáris gradiens program szerint kromatografáljuk, ahol eluensként 30 percen át 5% -> 20% acetonitrilt és 95% -> 80% 0,1%-os vizes trifluor-ecetsavat, majd ezt követően 25 percen át 70% acetonitrilt és 30% 0,1 %-os vizes trifluor-ecetsavat alkalmazunk, a
    38.3 és 38,7 perc között nyert frakciókat összegyűjtjük, és (ii) az (i) lépésben összegyűjtött frakciókat egy fordított fázisú C-l 8 típusú, 300 A pórusméretű, 22*250 mm nagyságú HPLC oszlopon 12 ml/perc átfolyási sebesség mellett 220 nm-en végzett csúcsdetektálást alkalmazva kétfázisú lineáris program szerint kromatografáljuk, ahol eluensként 25 percen át 23% -> 30% acetonitrilt és 77% -> 70% 0,1 %-os trifluor-ecetsavat alkalmazunk, a
    17.3 és 17,7 perc között eluálódó frakciókat összegyűjtjük, és kívánt esetben liofílizáljuk, vízben újra szuszpendáljuk és liofílizáljuk, és kívánt esetben a kapott polipeptidet gyógyszerészetileg elfogadható sóvá alakítjuk.
  2. 2. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított polipeptidet vagy sóját gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal és/vagy adalékanyaggal elkeverjük és adagolásra alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
HU9302158A 1992-07-27 1993-07-26 Method for preparation of calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta and pharmaceutical compositions containing it as active ingredient HU213353B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91953892A 1992-07-27 1992-07-27

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9302158D0 HU9302158D0 (en) 1993-11-29
HUT67467A HUT67467A (en) 1995-04-28
HU213353B true HU213353B (en) 1997-05-28

Family

ID=25442279

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9302158A HU213353B (en) 1992-07-27 1993-07-26 Method for preparation of calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta and pharmaceutical compositions containing it as active ingredient

Country Status (28)

Country Link
US (1) US5599559A (hu)
EP (1) EP0656905B1 (hu)
JP (1) JP2571197B2 (hu)
KR (1) KR950702577A (hu)
CN (1) CN1086824A (hu)
AT (1) ATE157672T1 (hu)
AU (1) AU662066B2 (hu)
BR (1) BR9306796A (hu)
CA (1) CA2139947C (hu)
CZ (1) CZ281539B6 (hu)
DE (1) DE69313650T2 (hu)
DK (1) DK0656905T3 (hu)
ES (1) ES2105284T3 (hu)
FI (1) FI933349A (hu)
GR (1) GR3024637T3 (hu)
HR (1) HRP931050B1 (hu)
HU (1) HU213353B (hu)
IL (1) IL106424A0 (hu)
MX (1) MX9304497A (hu)
MY (1) MY131356A (hu)
NZ (1) NZ253611A (hu)
PL (1) PL307258A1 (hu)
RU (1) RU2104286C1 (hu)
SK (1) SK10395A3 (hu)
TW (1) TW271442B (hu)
WO (1) WO1994002511A1 (hu)
YU (1) YU51593A (hu)
ZA (1) ZA935370B (hu)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040018510A1 (en) 1990-11-08 2004-01-29 Merck & Co., Inc. Human calcium channel compositions and methods
US5846757A (en) * 1988-04-04 1998-12-08 Sibia Neurosciences, Inc. Human calcium channel α1, α2, and β subunits and assays using them
JP3066398B2 (ja) * 1988-04-04 2000-07-17 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド カルシウムチャンネル組成物および製造方法
US5876958A (en) * 1988-04-04 1999-03-02 Sibia Neurosciences, Inc. Assays of cells expressing human calcium channels containing α1 β subunits
US6653097B1 (en) 1991-08-15 2003-11-25 Merck & Co., Inc. Human calcium channel compositions and methods
US5407820A (en) * 1988-04-04 1995-04-18 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Calcium channel α-2 subunit DNAs and cells expressing them
US6387696B1 (en) 1988-04-04 2002-05-14 Merck & Co., Inc. Human calcium channel compositions and methods
US6096514A (en) * 1988-04-04 2000-08-01 Sibia Neurosciences, Inc. Human calcium channel compositions and methods
US5874236A (en) * 1988-04-04 1999-02-23 Sibia Neurosciences. Inc. DNA encoding human calcium channel α-1A, β1, β-2, and β-4 subunits, and assays using cells that express the subunits
US6090623A (en) * 1993-08-11 2000-07-18 Merck & Co., Inc. Recombinant human calcium channel β4 subunits
ES2075796B1 (es) * 1993-08-17 1996-03-01 Pfizer Polipeptido de la agelenopsis aperta bloqueante de los canales de ca lcio
DE69634412T3 (de) 1995-09-29 2013-07-04 Vegenics Pty Ltd Regulierte gene und ihre verwendungen
EP0956339B1 (en) 1996-08-23 2005-10-12 Ludwig Institute For Cancer Research Recombinant vascular endothelial cell growth factor d (vegf-d)
US6528630B1 (en) 1997-12-03 2003-03-04 Merck & Co., Inc. Calcium channel compositions and methods
ATE371448T1 (de) * 1998-07-10 2007-09-15 Novartis Pharma Gmbh Bluthochdruckgegenmittelkombination des valsartan und kalziumkanal blocker
US8299211B2 (en) * 2005-09-30 2012-10-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Peptides and regulation of calcium channels
CN103768469A (zh) * 2012-10-23 2014-05-07 葛继云 一种治疗妇科炎症的中药组合物及其制备方法和用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5064657A (en) * 1986-10-20 1991-11-12 University Of Utah Spider toxins and methods for their use as blockers of amino acid receptor function
US4925664A (en) * 1986-10-20 1990-05-15 University Of Utah Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function
US5196204A (en) * 1986-10-20 1993-03-23 University Of Utah Research Foundation Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function
US5122596A (en) * 1989-09-29 1992-06-16 Pfizer Inc. Polypeptides useful as blockers of calcium channels

Also Published As

Publication number Publication date
GR3024637T3 (en) 1997-12-31
RU95105340A (ru) 1996-10-27
SK10395A3 (en) 1995-06-07
DE69313650T2 (de) 1998-01-08
HRP931050A2 (en) 1996-12-31
JP2571197B2 (ja) 1997-01-16
HRP931050B1 (en) 1999-04-30
CA2139947A1 (en) 1994-02-03
MX9304497A (es) 1994-04-29
EP0656905B1 (en) 1997-09-03
WO1994002511A1 (en) 1994-02-03
AU4407893A (en) 1994-02-14
PL307258A1 (en) 1995-05-15
CZ281539B6 (cs) 1996-10-16
FI933349A (fi) 1994-01-28
US5599559A (en) 1997-02-04
BR9306796A (pt) 1998-12-08
ES2105284T3 (es) 1997-10-16
DK0656905T3 (da) 1997-10-20
NZ253611A (en) 1996-09-25
ZA935370B (en) 1995-01-26
JPH07504685A (ja) 1995-05-25
HUT67467A (en) 1995-04-28
YU51593A (sh) 1997-01-08
FI933349A0 (fi) 1993-07-26
HU9302158D0 (en) 1993-11-29
CN1086824A (zh) 1994-05-18
MY131356A (en) 2007-08-30
KR950702577A (ko) 1995-07-29
CZ9500200A3 (en) 1995-10-18
RU2104286C1 (ru) 1998-02-10
DE69313650D1 (en) 1997-10-09
EP0656905A1 (en) 1995-06-14
AU662066B2 (en) 1995-08-17
CA2139947C (en) 1998-06-30
IL106424A0 (en) 1993-11-15
TW271442B (hu) 1996-03-01
ATE157672T1 (de) 1997-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU662066B2 (en) Calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta
JPH09118690A (ja) 興奮性アミノ酸神経伝達物質の拮抗物質として、および／またはカルシウムチャンネルの遮断剤として有用なポリペプチド
EP0425096B1 (en) Polypeptides useful as blockers of calcium channels
EP0672056B1 (en) Calcium channel blocking polypeptides from filistata hibernalis
US5627154A (en) Calcium channel blocking polypeptides from Heteropoda venatoria
EP0668872B1 (en) Calcium channel blocking polypeptides from theraphosidae aphonopelma

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee