JP3066398B2 - カルシウムチャンネル組成物および製造方法 - Google Patents

カルシウムチャンネル組成物および製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は分子生物学および薬理学に関する。
さらに詳しくは、本発明はカルシウム チャンネル組
成物およびその製造方法と利用方法に関する。
発明の背景 カルシウム チャンネルは細胞外流体中に細胞からCa
+2イオンを制御侵入させる膜スパンニングマルチサブユ
ニット蛋白質（memfrane−spanning,multsubunit prote
in）である。動物界のすべての細胞、少なくとも幾つか
の細菌細胞、真菌細胞および植物細胞は１種類以上のカ
ルシウム チャンネルを有する。
最も一般的な種類のカルシウム チャンネルは電圧依
存性である。電圧依存性チャンネルでは、Ca+2イオンの
細胞への流入を開始させる「開口」はチャンネル含有細
胞の内側と細胞を浸す細胞外媒質との間にあるレベルの
電位差が生ずるまでの脱分極を必要とし、Ca+2の細胞へ
の流入速度はこの電位差に依存する。例えば中枢神経系
のニューロンおよび、骨格筋、心臓筋、静脈平滑筋、動
脈平滑筋の細胞を含めた筋肉細胞のような、動物の「興
奮性（excitable）」細胞のすべては電圧依存性カルシ
ウム チャンネルを有する。
カルシウム チャンネルは細胞内Ca+2レベルの調節に
重要な役割を有し、これらのレベルは細胞の生育力と機
能にとって重要であるので、カルシウム チャンネルは
生理的に重要である。従って、細胞内Ca+2濃度は例えば
神経伝達物質放出、筋肉収縮、ペースメーカー作用なら
びにホルモンその他の物質の分泌のような動物体内の多
くの重要なプロセスに関係する。
ヒトを含めた動物における種々な疾患の治療に有用な
多くの化合物は、電圧依存性カルシウム チャンネルの
機能の調節によってそれらの有益な効果を及ぼすと考え
られる。これらの化合物の多くはカルシウム チャンネ
ルに結合し、Ca+2の細胞への流入速度を細胞内外の脱分
極に応じて遮断または減少させる。
カルシウム チャンネルと相互作用する化合物の薬理
学を理解し、カルシウム チャンネルと相互作用して目
的の治療効果を及ぼす化合物を合理的に設計すること
は、チャンネル サブユニットの構造とチャンネル サ
ブユニットをコードする遺伝子とについての理解が不充
分であるために今まで妨げられていた。従って、サブユ
ニットの性質、サブユニット相互の相互作用、サブユニ
ットと、チャンネルがそれを介してCa+2イオンを通過さ
せる細胞膜との相互作用、サブユニットとCa+2その他の
イオンとの相互作用、およびサブユニットと、チャンネ
ル機能に影響を与える低分子量化合物との相互作用を分
子レベルで理解するために必要な、多量の高純度チャン
ネル サブユニットを得ることは今まで不可能であっ
た。例えば、精製カルシウムチャンネル サブユニット
が多量に入手可能になることによって、機能的なチャン
ネルを製造して、チャンネル機能に対する化合物の影響
を調べるために用いることができ、それによってカルシ
ウム チャンネルに影響を与える治療剤の設計の基礎を
与えることができる、またはチャンネル サブユニット
の種々な組合せを結晶化させ、Ｘ線または中性子回析法
を用いてそれらの構造を高い分解度まで決定して、チャ
ンネル機能に影響を与える治療剤の合理的な設計の新た
な基礎をさらに与えることができる。
例えばランバート・イートン症候群（Lambert−Eaton
Syndrome）のような、ある一定の疾患はカルシウム
チャンネルとの自己免疫相互作用を有する。カルシウム
チャンネル サブユニットが容易に入手可能であるな
らば、このような疾患の診断のためのイムノアッセイと
分子レベルでのサブユニットの理解が可能になり、この
ような疾患の有効な治療方法が得られる。
カルシウム チャンネル サブユニットをコードする
遺伝子に関する情報の無いことが成熟カルシウム チャ
ンネル サブユニットとそれらの先駆体蛋白質（すなわ
ち末端アミノ基に付随したシグナル ペプチドを有する
成熟サブユニット）との分子性についての理解と、カル
シウム チャンネル サブユニットの発現の調節とを今
まで妨げていた。これらの性質と、カルシウム チャン
ネル サブユニット遺伝子の表現の調節方法とについて
の理解が、カルシウム チャンネルの機能または濃度に
影響を与えることによって有益な効果を有する治療剤を
設計する基礎を与えることになる。さらに、カルシウム
チャンネル サブユニットをコードする遺伝子の塩基
配列を利用できることが、このようなサブユニットをコ
ードする遺伝子の、多くの疾患の原因となる欠陥の診断
を可能にする。
動物の組織の細胞からのカルシウム チャンネルのサ
ブユニットをコード化する（encoding）cDNAの少なくと
も約12、好ましくは少なくとも約30のヌクレオチドから
成るセグメントの配列を有するDNAが利用可能になるな
らば、同じまたは異なる組織からおよび同じまたは異な
る種の動物からの異なるカルシウム チャンネルの対応
サブユニットをコードするcDNAおよび場合によってはゲ
ノムDNAの単離とクローニングが可能になると考えられ
る。多様な組織と動物種とからのカルシウム チャンネ
ルの対応サブユニットをコードする多くの全長cDNAの配
列の利用可能性は、サブユニット内の構造−機能関係の
解明に寄与し、この知識が次にカルシウム チャンネル
への結合を介して作用を発揮する治療剤の設計に役立つ
と考えられる。
電圧依存性カルシウム チャンネルは約130〜約200キ
ロダルトン（KD）の分子量を有する、２つの大きなサブ
ユニットとある数（一般には１または３個であると考え
られる）の異なる、約60KD未満の分子量を有する小さい
サブユニットとから成ると考えられる。大きいサブユニ
ットの少なくとも１個の場合によっては小さいサブユニ
ットの少なくとも幾つかはグリコシル化されている。サ
ブユニットの幾つかはホスホリル化されている。電圧依
存性カルシウム チャンネルの種々なサブユニットの命
名に関しては、この分野で混乱がある。
電圧依存性カルシウム チャンネルの２個の大きなサ
ブユニットはここでは、「（アルファ）１−サブユニッ
ト（α１−サブユニット）」および「（アルファ）２−
サブユニット（α２−サブユニット）」と名づける。
α１−サブユニットはジチオスレイトール（DTT）に
よってまたはグリコシル化蛋白質からのＮ結合糖基の除
去に触媒作用を及ぼす酵素によって処理する時に、検出
可能な分子量の変化を示さない。α１−サブユニットは
哺乳動物の筋肉組織から単離した後のドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAG
E）によって分析した場合に約150〜約170KDの分子量を
有し、種々の1,4−ジヒドロピリジン（DHPS）とフェニ
ルアルキルアミンに対する特異的結合部位を有する。
α２−サブユニットはα１−サブユニットほどには特
定されていない。α２−サブユットの分子量は、哺乳動
物の筋肉組織から単離した後のDTT存在下でのSDS−PADE
分析によって測定すると、少なくとも約130〜150KDであ
る。しかし、非還元性条件下（Ｎ−エチルマレイミドの
存在下）のSDS−PADEでは、α２−サブユニットは約160
−190KD帯を示して移動する。還元時に放出れさると考
えられる小フラグメント（約30KD）が130−150KDフラグ
メントをコード化する遺伝子とは異なる遺伝子の産物
（product）であるのか〔従って、これらの２サブユニ
ットはカルシウム チャンネルの異なるサブユニットで
ある）、または両フラグメントが同じ遺伝子の産物であ
るのか〔従って、α２−サブユニットは約160−190KDで
あり、還元時に（少なくとも）２フラグメントに分割す
る〕は、まだ技術上解明されていない。α２−サブユニ
ット（そのサイズ如何に拘らず〕と還元条件下で生ずる
対応フラグメント〔α２−サブユニットの一部であるか
否かに拘らず〕とが少なくともＮ−結合糖によってグリ
コシル化されており、α１−サブユニットに結合するこ
とが分っている1,4−ジヒドロピリジンとフェニルアル
キルアミンとに対する特異的結合部位を有さないという
証拠がある。
α１−サブユニットの前駆体なるここでの表現は、翻
訳時に最終的に、細胞膜中のカルシウム チャンネルの
一部として存在するα１−サブユニットを生ずる、全長
mRNAの配列に相当するアミノ酸配列を有する蛋白質を意
味する。前駆体蛋白質は種々な処理工程によってα１−
サブユニットに転化する。先駆体と成熟α１−サブユニ
ットとの間の処理の詳細は解明されていないが、この処
理はおそらくホスホリル化と、カルシウムチャンネルの
成熟α１−サブユニットを生ずるための一次翻訳産物の
分割（cleavage）とを含むと考えられる。
同様に、α２−サブユニットの前駆体なるここでの表
現は、翻訳時に最終的に細胞膜中のカルシウム チャン
ネルの一部として存在するα２−サブユニットを生ずる
全長mRNAの配列に相当するアミノ酸配列を有する蛋白質
を意味する。先駆体蛋白質は種々な処理工程によってα
２−サブユニトに転化する。α１−サブユニットの場合
と同様に、先駆体と成熟α２−サブユニットとの間の処
理の詳細は不明であるが、この処理は少なくともリーダ
ー配列（すなわちシグナル ペプチド）の除去、グリコ
シル化、およびおそらく、カルシウム チャンネルの他
のサブユニットと現在考えられるものを生ずるための分
割を含むと考えられる。
ウサギの背中骨格筋カルシウム チャンネルのα１−
サブユニット先駆体のcDNAと対応アミノ酸配列は報告さ
れている。タナベ（Tanaba）等のネイチャー（Nature）
328,313−318頁（1987）。
電圧固定法によって電気生理学的に測定した、カルシ
ウム チャンネル活性は、哺乳動物の脳と心臓筋肉から
単離された総mRNAをキセノプス レヴィス（Xenopus la
evis）の卵母細胞中に注入する場合に、この卵母細胞中
で誘発されている。すなわち、カルシウム チャンネル
含有製剤が、脂質二重層に再構成された場合に、電圧依
存性カルシウム チャンネル活性を二重層に与えること
が報告されている。
しかし、α１−サブユニット単独またはα２−サブユ
ニット単独が卵母細胞、脂質二重層または他の位置に機
能的カルシウムチャンネルを形成するという証拠は存在
しない。タナベ等が得たα１−サブユニットのcDNAを用
いて調製したmDNAがキセノプス レヴィス卵母細胞中で
カルシウム チャンネル活性を誘発できないことが最
近、ホフマン（Hofman）等トレンドスイン ファーマコ
ログ・サイ．（Trends in pfarmacolog.Sci.）８巻,393
−398頁（1987）によって報告されている。
発明の詳細な説明 簡単に述べると、我々は動物のカルシウム チャンネ
ルのα１−サブユニットをコードするcDNA（第１表参
照）と動物のカルシウム チャンネルのα２−サブユニ
ットをコードするcDNA（第２表と例４参照）とを発見し
た。
従って、本発明はその態様の１つにおいて、動物カル
シウムチャンネルのα２−サブユニットをコードするcD
NAを含むDNAと、本発明によるこのようなDNAの転写時に
製造される、このようなサブユニットをコードするRNA
とである。
本発明はその態様の他の１つにおいて、動物カルシウ
ム チャンネルの実質的に純粋なα２−サブユニットで
ある。
「実質的に純粋な」サブユニットまたは蛋白質とは、
SDS−PAGEによって物質と見なされるかまたは明白に配
列するほどに、他のポリペプチド汚染物を含まないサブ
ユニットまたは蛋白質を意味する。
本発明はその態様の他の１つにおいて、異種カルシウ
ム チャンネル（heterologous calcium channel）を含
む真核細胞であって、第１種の動物のカルシウム チャ
ンネルのα１−サブユニットの前駆体に前記細胞中で翻
訳される第1RNAから本質的に成る第１組成物と、第２種
の動物のカルシウム チャンネルのα２−サブユニット
の先駆体に前記細胞中で翻訳される第2RNAから本質的に
成る第２組成物とを前記細胞に投与することから成り、
前記第１種と第２種とが同じまたは異なるものである
が、前記α１−サブユニットの前記前駆体と前記α２−
サブユニットの前記前駆体と前記α２−サブユニットの
前記前駆体との少なくとも１つが前記細胞にとって異質
（foreign）である方法によって製造される真核細胞を
も包含する。このために好ましい細胞はキセノプス レ
ヴィス卵母細胞である。
本発明はその態様の他の１つにおいて、化合物をカル
シウムチャンネル アゴニスト またはアンタゴニスト
活性に関して分析する方法であって、直前のパラグラフ
で述べた細胞をこのような活性に関して試験すべき化合
物の溶液に暴露させた場合のこのような細胞のカルシウ
ム チャンネル活性を電気生理的に測定することから成
る方法を包含する。キセノプス レヴィス卵母細胞およ
びアセチルコリン レセプターを用いて適用される同様
な方法に関しては、例えばミシナ（Mishina）等、ネイ
チャー313,364頁（1985）参照；このような卵母細胞と
ナトリウム チャンネルとを用いた同様な方法に関して
は、ノダ（Node）等、ネイチャー322,826〜828（1986）
参照。
本発明はさらに他の態様において、カルシウム チャ
ンネルのα２−サブユニットを形成するように発現させ
うるcDNAから成るDNAを含む真核細胞である。本発明に
よるこのような細胞はカルシウム チャンネルのα１−
サブユニットを形成するように発現させうるcDNAから成
るDNAをも含む。このような細胞中のこのようなcDNAか
ら製造されたα２−サブユニットまたはα１−サブユニ
ットは細胞にとって異質である、すなわちこのようなcD
NAによってコード化されるα１−サブユニットまたはα
２−サブユニットを発現するDNAを含まない同じタイプ
の細胞中に生成するカルシウム チャンネルα１−サブ
ユニットまたはα２−サブユニットのアミノ酸配列とは
異なるアミノ酸配列を有することが好ましい。このよう
な細胞の中で、哺乳動物起源の細胞、例えばCOS細胞、N
IH3T3細胞、マウスＬ細胞等、または例えばS.セレヴィ
ジアエ（S.cerevisiae）またはP.パストリス（P.pastor
is）のような酵母菌が特に好ましい。適当な異種DNAを
エピソームとして細胞内に維持するかまたは（好ましく
は）細胞の染色体DNA中に組込むことによって細胞を形
質転換し、次に形質転換細胞を培養するかまたはこのよ
うな培養物または継代培養物から継代培養する（または
哺乳動物の場合には、継代する）ことによって、本発明
のこのような細胞を製造する方法は、通常の熟練度を有
する人々にとって周知である。
本発明のこのような細胞として、本発明は第１種の動
物のカルシウム チャンネルのα１−サブユニットの先
駆体をコードする第1cDNAと第２種の動物カルシウム
チャンネルのα２−サブユニットの前駆体をコードする
第2cDNAとの発現を構成し、前記第１種と第２種の動物
が同じまたは異なるものである方法によって製造した異
種カルシウム チャンネルを有する真核細胞をも含む。
前記α１−サブユニットの前記先駆体と前記α２−サブ
ユニットの前記先駆体との少なくとも１つは通常は前記
細胞にとって異質である。このような細胞の中では、哺
乳動物起源の細胞またはS.セレヴィジアエもしくはP.パ
ストリスのような酵母菌であることが好ましい。好まし
い実施態様では、このような細胞は細胞内で活性であ
り、その転写調節活性が機能的カルシウム チャンネル
から細胞内に入りうるイオンもしくは分子（例えばC
a ,Ba ,Ca イオフオァ）に反応し、イオンまたは分
子（例えばCa ,Ba ,Ca イオノフオァ）に反応する転
写調節要素であって、発現のために作用的に例えばクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフ
ェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼのようなインジケ
ータ蛋白質に関して構造遺伝子に結合した転写調節要素
を有する異種原子をも含む。
機能的な異質カルシウム チャンネル（すなわち、α
１−サブユニットとα２−サブユニットの少なくとも１
つが細胞にとって異質である機能的カルシウム チャン
ネル）を有する、本発明のこれらのサブユニットは、他
の目的の中でも特に、化合物をカルシウム チャンネル
アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して検定す
るために有用である。第一に、このような細胞をこのよ
うな化合物の機能的カルシウム チャンネルに対するア
フィニティの評価のために用いることができる。第二
に、このような細胞は被検化合物ならびに機能的チャン
ネルを通って細胞に入りうることがわかっている、例え
ばCa またはBa のような、イオンまたは分子の存在下
でのカルシウム チャンネル活性の電気生理的評価に用
いることができる。アセチルコリン レセプターを用い
て実施した同様な研究に関しては、クラウジオ（Claudi
o）等のサイエンス（Science）238,1688〜1694頁（198
7）参照。化合物をカルシウム チャンネル アゴニス
トまたはアンタゴニスト活性に関して検定する、これら
の方法も本発明の一部である。
本発明によるこのような細胞は、細胞内で活性であ
り、機能的カルシウム チャンネルから細胞に入りうる
イオンまたは分子と反応し、発現のために作用的にイン
ジケータ蛋白質に関して構造遺伝子に結合する転写調節
要素を含む異種遺伝子をも細胞が有する好ましい実施態
様では、化合物をカルシウム チャンネル アゴニスト
またはアンタゴニスト活性に関して検定する本発明によ
る他の方法に用いることもできる。この方法は、このよ
うな細胞の培養物をこのような活性に関して検定すべき
化合物の溶液に、機能的カルシウム チャンネルから細
胞に入って遺伝子の転写を調節する転写調節要素の活性
にインジケーター蛋白質に関して影響を与えるイオンま
たは分子と共に暴露させ、培養物の細胞中の遺伝子の表
現レベルをこのような細胞の他の対照培養物の細胞中の
このような表現レベルに、インジケーター蛋白質に関し
て比較することから成る。
「対照培養物」は、当業者によって明白に理解される
ように、被検化合物に暴露させない点以外は被検化合物
に暴露させる培養物と実質的に同じであり、実質的に同
様に処理される培養物である。インジケータ蛋白質に関
する遺伝子の発現レベルは、インジケータ蛋白質によっ
て触媒される反応で生成する検出可能な化合物の検定法
によるインジケータ蛋白質の濃度の測定を含む公知の方
法によって、当業者（the skilled）によって容易に確
認される。
上述したように、インジケータ蛋白質は本発明の細胞
中で活性であり、容易に検出可能な化合物の製造を触媒
する酵素である（例えば色原体、蛍光性化合物）。
本発明はさらに他の態様において、ヒトにおけるラン
バート・イートン症候群のイムノアッセイによる診断方
法であって、ヒトからの血清を第１動物種のα１−サブ
ユニットおよび第２動物種（第１種と同じまたは異な
る）のα２−サブユニットと結合させ、血清中の抗体が
対照血清（例えば、この症候群を有さないことがわかっ
ているヒトまたはヒトの群から）中の抗体よりも大きな
度合に、サブユニットの一方または両方と反応するか否
かを確認することから成る方法である。特定の抗原に対
する血清中の抗体を検出するための技術上公知のイムノ
アッセイ方法をこの方法に用いることができる。この方
法ではα−サブユニットの両方が哺乳動物、最も好まし
くはヒトのカルシウム チャンネルからのものであるこ
とが好ましい。
本発明はまた、下記第２表に示す塩基−238〜3495の
範囲からの少なくとも12（好ましくは少なくとも30）連
続塩基の配列を含む、配列長さが少なくとも12（好まし
くは少なくとも30）塩基である標識した（例えば32Pま
たはビオチニル化）RNAもしくは一重鎖DNA、またはヒト
のニューロンα２−サブユニットをコード化する、例４
に述べるcDNAから取った配列を有する、このような標識
RNAまたは一重鎖DNAをも含む。カルシウム チャンネル
α２−サブユニットをコードするcDANを確認し単離する
ため、またはα２−サブユニットmRNAを産生する組織を
確認するためのプローブとしてのこのようなDNAとRNAの
使用は当業者に明らかである。これに関しては、例えば
例４を参照。
ウサギ骨格筋からのDHP感受性カルシウム チャンネ
ルのα１およびα２−ポリペプチド サブユニットをコ
ードするcDNAをクローニングする第１方法は、ウサギ背
中骨格筋のラムダ（λ）−gtll cDNA表現ライブラリー
を各蛋白質に特異的な抗体プローブによって選別する
（screen）ことであった。一般的には、アウスベル（Au
subel）等、カレント プロトコールス インモレキュ
ラー バイオロジー（Current Protocols in Molecular
Biology）、ウィリー インター サイエンス（Wiley
−interscience）ニューヨーク（1987）；デヴィス（Da
vis）等「ベーシック メソッドス イン モレキュラ
ー バイオロジー（Basic Methods in Molecular Biolo
gy）」、エルセヴィール サイエンス パブリッシュ
イング社（Elsevier Science Publishing Co.）、ニュ
ーヨーク（1986）参照。ウサギ骨格筋三連構造からのMr
155K−170K DHPレセプターα１−蛋白質を免疫沈降さ
せうるモノクローナル抗体はすでにロイング（Leung）
等のジェイ．バイオル．ケム（J.Biol.Chem.）262,7943
−7946頁（1987）に述べられている。α２ポリペプチド
サブユニットに対して結果的なポリクローナル抗血清
はモルモットにおいてナカヤマ（Nakayama）等のジェ
イ．バイオル．ケム262,6572−6576頁（1987）に述べら
れているような、SDSポリアクリルアミドゲル精製α２
−蛋白質を用いて調製した。ロィング等（上記文献）に
よって11F7と名づけられたα１−特異的モノクローナル
抗体の１つとα２−特異的ポリクローナル抗血清とを用
いて、オリゴーdT開始（oligo−dT primed）λ gtll c
DNAライブラリーの1.0×106組換えファージをスクリー
ンした。タナベ等のα１−サブユニットcDNA配列〔ネイ
チャー328,313−318頁（1987）〕に基づくプローブも用
いて、α１−サブユニットcDNAフラグメントを有するク
ローンを確認することができた。
陽性クローン（positive clone）が抗体スクリーニン
グ方法を用いて検出されたならば、このクローンを用い
てさらに重複クローンをスクリーンした。このようにし
て、重複クローンの逐次系列が得られた。これらのクロ
ーンの配列を決定し、フラグメントをpIBI 24/25（IBI,
コネチカット州ニューヘブン）またはM13 mp 18/19にサ
ブクローン化した。α１−サブユニットのクローン化で
は、DNA配列をタナベ等が報告しているDHPレセプターα
１−サブユニットの一次配列（primarysequence）と比
較した。アミノ酸差を生じたヌクレオチド差は両方向に
おける配列決定（sequencing）によって確認した。
α１−サブユニットに付随するもの（pertains）とし
て、IIF7モノクローナル抗体と実際に反応した、２個の
cDNAクローンを単離し、交差ハイブリッド化によって相
関することが判明した。
これらのクローンの１つのDNA配列決定は453塩基対
（bp）のcDNAインサートの存在を明らかにした。このイ
ンサートはエレクトロホラス エレクトロプラックス
（Electrophorus electroplax）ナトリウム チャンネ
ル配列の領域に対して28％ホモロジーで151アミノ酸読
み取り枠を有意にコードした。このクローンに由来する
cDNAインサートを用いて、λ gtll cDNAライブラリーと
ウサギ背中骨格筋オカヤマ−ベルグ（Okayama−Berg）c
DNAライブラリー〔ラクレナン（Mac Lennan）等、ネイ
チャー316,696−700頁（1985）〕とを再スクリーンし
て、重複cDNAクローンを単離した。このcDNAクローンを
サンガー（Sanger）のジデオキシ チェイン ターミネ
ーター法を用いて分析し、カルシウム チャンネルのα
１−サブユニットの全コーディング配列（entire codin
g sequence）を決定し、DNA配列の比較とオリエンテー
ションのために制限マップを製造した。
オリゴ−dT開始表現cDNAライブラリーをグアニジンイ
ソチオシアネート中で単離した若い成熟ウサギ背中骨格
筋ポリ（A+）RNA〔シンシナチ大学ジェイ・ロビンス
（J.Robbins）の行為により提供〕を用いて、λ gtll中
に構成した〔グブラー（Gubler）等、ジーン（Gene）2
5、263−269頁（1983）；ラペイル（Lapeyre）等、ジー
ン37,215−220頁（1985）；フイン（Huynh）等、DNAク
ローニング：ア プラクティカル アプローチ（DNA Cl
oning:A Practical Approach）１巻,49−78頁（IRL,オ
ックスフォード,1985）参照〕。二重差DNAを合成し、Ec
oR Iアダプターを加えた。アダプターを加えた後に、二
重差cDNAをセハロース（Sepharose）CL−4Bまたはバイ
オ−ゲル（Bio−Gel）Ａ−50mカラム上でサイズ選択し
た。フラグメント＞1500bpはEcoR I消化脱ホスホリル化
λ gtllに結合した。ライブラリーをギガパック−プラ
ス（Gigapack−plus）〔ストラタジーン（Stratagen
e）、カリフォルニア州サンジェゴ〕によってインビト
ロ包装し、＞95％組換え体の効率をＸ−galとIPTGとの
存在下での平板培養によって決定した。全体で１×106
組換え体の２クローンをウサギ骨格筋カルシウム チャ
ンネルのMr170,000α１−サブユニットと反応するモノ
クローナルAbIIF7による表現ライブラリーのスクリーラ
ングによって確認した。陽性プラークをHRP−をヤギ抗
マウスIgGの結合および次の４−クロロ−１−ナフトー
ルによる発色によって可視化した。各クローンは−500b
pインサートを含み、交差ハイブリット化によって相関
した。１クローンは読み取り料（nts 2847−3300）を確
認するようにDNA配列し、ノザン分析法（Northern anal
ysis）による6.5 Kb転写の確認に用いた。上記453bpイ
ンサートを用いてλgtllライブラリーを再スクリーン
し、１×106クローンの中の８個が陽性（positive）で
あった。１クローン（1700bp）は最も離れた５′をnt 2
237まで伸長し、その522bp Pst Iフラグメントnts 229
4−2816を用いて、オカヤマとベルグの方法によって構
成されたウサギ背中骨格筋cDNAライブラリーの１×1016
形質転換体をスクリーンした。〔マクレナン等、ネイチ
ャー316,696−700頁（1985）〕３個の陽性クローン（po
sitive clone）を単離し、その中の最大クローン（5.0K
b）は５′をnt−750まで伸長した。オカヤマ−ベルグcD
NAライブラリーを５′250bp（Pst I）−EcoR Iフラグメ
ントによって再スクリーンした（Pst I部位はオカヤマ
−ベルグベクターによって与えられに）（nts〜750−10
06）。５陽性クローンの中単離された最長クローンは5.
3Kbであり、５′をnt−450に伸長した。α１の５′末端
をクローン化するために、ランダム開始（random prime
d）ウサギ背中骨格筋λgtll cDNAライブラリーを、上述
したように、但し次の修正を加えて合成した： （１）pd（Ｎ）６ヘキサマー〔ファーマシア社（Pharma
cia,Inc.）ニュージャーシー州ピスカタウェイ〕を、第
一鎖cDNA反応をランダムに開始するために用いた、 （２）Nco I,Kpn IおよびEcoR I部位を含むアダプタ
ー： を上述のように二重鎖cDNAに結合させた、および （３）二重鎖cDNAを1mlバイオーゲル（Bio−Gel）A50m
カラム上でサイズ選択した。＞600 bpフラグメントはλ
gtllに結合した。
このライブラリーの１×106組換え体をnt 1006−2653
に相当する1.648bpEcoR I/Xho Iフラグメントと開始メ
チオニン（initiating inethionine）をスパンする（sp
anning）オリゴヌクレオチド プローで： ５′−GGGAAGCCATGGAGCCATCCTCACCCCAGG−３′とを用い
て、二重にスクリーンした。40クローンが両プローブに
よって陽性であり、その１つ（1.55Kb）は開始コドンの
78nts 5′およびEcoR I部位の〜450bp3′を伸長した。
第１表（下記）とα１−サブユニットをコードするcD
NAの5.975ヌクレオチド配列を示す。1.873アミノ酸配列
をコードする5.619ヌクレオチド配列読み取り枠が存在
する（第１表）。指定開始コドンの配列状況はコザク
（Kozak）の「ヌクレイック アシドス レス．（Nucle
ic Acifs Res.）」15,8125−8132頁（1987）によって提
案されたコンセンサス配列（proposed consensus seque
nce）と一致する。cDNAの３′ノンコーディング配列（n
on−coding sequence）はポリ（dA）領域を除外して234
ヌクレオチド長さであり、ポリ（dA）領域から上流にコ
ンセンサス ポリアルデニル化シグナルATTAAA（ヌクレ
オチド5832−5837）17ヌクレオチドを含む。このcDNA配
列は−6,500ヌクレオチドDHPレセプターα1mRNAに一致
する。さらに、DNA配列はタナベ等（上記文献）が報告
したDHPレセプターをコードするcDNA配列と99.4％類似
する。ヌクレオチド差が33位置において確認され、その
中の３ヌクレオチド5423,5444および5504はアミノ酸変
化も生ずる。
α２−サブユニットの付随物（pertais）として、モ
ルモットα２特異的ポリクローナル抗血清による一次ス
クリーンでは、3cDNAクローンを単離し、交差ハイブリ
ッド化によってこれらが相関するが、α１−cDNA配列は
相関しないことが判明した。これらのcDNAクローンの２
つを用いてλgtll cDNAライブラリーを再スクリーン
し、重複cDNAクローンを単離した。cDNAクローンを分析
して、カルシウム チャンネルのα２−サブユニットの
コーディングDNA配列を確立し、制限マップを製造し
た。α2cDNAの約7.850ヌクレオチドをクローン化した、
これは−8,000ヌクレオチドα2mRNAに一致する。
α１サブユニットに関して述べたように若い成熟ウサ
ギ背中骨格筋ポリ（A+）RNAを用いて、オリゴdT開始発
現cDNAライブラリーをλgtll中に構成した。二重鎖cDNA
フラグメント＞1500bPをλgtllに結合させ、１×106組
換え体の一次平板培養（primary Plating）モルモット
抗160kdα２ポリクローナル抗血清によってスクリーン
した。３陽性プラークをHRP−プロティンＡの結合と次
の４−クロロ−１−ナフトールにある発色によって可視
化した。２クローン（2.5 Kdと3.6 Kd）は重複して、ノ
ザン（Northern）法によって確認される〜8Kb転写の4.7
5Kbをコードした。５′方向と３′方向とに伸長するα2
cDNAクローン（DNA配列決定と長い読み取り枠の確認と
によって方向決定）を、同じλgtll cDNAライブラリー
を１クローンの（EcoR I）−Hind IIIフラグメント（nt
s43−272,5′近位；アダプターからのEcoR I部位）また
は第２クローンのEcoR I−（EcoR I）フラグメント
（３′非翻訳領域における〜1.0 Kb）によって再スクリ
ーンすることによって単離した。各末端から７クローン
ずつの全体で14クローンを単離した。クローンの重複対
（〜2.750nts 3′まで伸長する１クローンと350 nts
5′まで伸長するもう１つのクローン）はα２−転写体
（transcript）の〜7850nst;5′非翻訳配列308nts、コ
ーティング配列3318ntsおよび３′非翻訳配列の〜4224n
tsをコードした。３′非翻訳配列の中の176ntsのみを両
方向で確認し、報告する。
第２表はα２サブユニットをコードするcDNA配列の3.
802ヌクレオチドと、５′非翻訳配列の308ヌクレオチ
ド、3.318ヌクレオチド読み取り枠および３′非翻訳配
列の176ヌクレオチドを含めたその前駆体とを示す。
第２表は最初の26個の負数アミノ酸として表されるα
２−サブユニットのシグナルペプチドを示す。矢印はシ
グナル ペプチドと成熟α２−サブユニットとの間の分
割部位を示す。今までに決定したＮ末端アミノ酸配列を
太い線の配列として示す（Thr（＋８）、Trp（＋12）、
Asp（＋14）は今までに決定されなかった）。示したヌ
クレオチド配列はα２−サブユニットのコーディング配
列は、重複してα２−サブユニットのコーディング配列
をスパンクする２クローンから決定した。個別クローン
には五個のヌクレオチド差異が四種類のアミノ酸変化を
生ずることが観察された。配列の169,347,348,984位置
の差異と、nt 1858〜1860の欠損とが生じた。アミノ酸
を次のように完全に決定した：残基31におけるAsn、残
基90におけるZys:および残基594におけるSerの欠損。枠
内上流終止コドン（in−frame upstream stop codon）
には上流の短い取り枠の開始コドンと終止コドンと同様
にアンダーラインを施した。３個の推定トランスメンブ
ラン領域を枠で囲む。可能なＮ−グリコシル化部位とホ
スホリル化部位を第１表で述べたように示す。
読み取り枠は1.106アミノ酸の配列をコードする（第
２表）。α２−蛋白質の以前に決定されたNH2末端アミ
ノ酸配列を同じ読み取り枠のヌクレオチド79〜129によ
ってコードする（アミノ酸残基１〜17,第２表）。指定
開始コドンに隣接するヌクレオチド配列は提案コンセン
サス配列と一致する。枠内終止コドンはヌクレオチド−
27から上流に存在する。さらに、枠外の可能な開始コド
ンはヌクレオチド−27から開始して存在し、この後にヌ
クレオチド−179〜181のナンセンスコドンが続く。
α2cDNAの５′非翻訳配列、このようにクローン化
し、配列決定した308ヌクレオチドは異常に長い。この
領域は特にＧ＋Ｃ富化であり（約80％Ｇ＋Ｃ）、このこ
とは今までに報告された他の比較的長い５′ノンコーデ
ィング配列と同じである。
第１表はウサギ骨格筋カルシウム チャンネルのα１
サブユニットのcDNAから導出される1.873アミノ酸配列
を示す。α１−特異的IIF7モノクローナル抗体を用いた
クローンの確認に基づいて、453 bp cDNAインサート
（アミノ酸残基950・・1,100）によってコードされる蛋
白質配列がこのモノクローナル抗体によって認識される
エピトープを含むことが判明した。完全な配列はα１−
蛋白質に対して算出Mr212,143を生じ、これは他の研究
者がSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて報告
している実測Mr155K−170Kとは対照的である。ここで決
定し、報告したアミノ酸配列はタベ等（上述文献）が最
近述べたアミノ酸配列に99.8％類似し、このことは残基
1,808（Thr対Met）、1,815（Ala対Val）および1,835（A
la対Glu）における３個のアミノ酸差異の存在を示す。
カルシウム チャンネルα１−サブユニット蛋白質はAs
n残基79,257,797,1,464および1,674における可能な5N−
グリコシル化部位と、Ser残基687,1,502,1,575,1,757,
1,772および1,854、およびThr1,552における可能な7CAM
P−依存性ホスホリル化部位を含む。ナトリウム チャ
ンネルのα−サブユニットと同様に、骨格筋カルシウム
チャンネルのα１−サブユニットは４個の内部反復配
列領域を含む。
α１−蛋白質配列のヒドロパシ−プロフィル（hydrop
athy profile）の分析は各反復領域が疎水性の５セグメ
ントと強陽電荷を有する１セグントとを含むことを明ら
かにする。α１−蛋白質配列はシグナル ペプチドに特
徴的を疎水性アミノ末端配列を有さないので、この４個
の内部反復配列領域のセグメントが24トランスメンブラ
ン セグメントを表し、アミノ末端とカルボキシ末端が
細胞内に伸長することが提案されている。このモデルは
細胞外に限局される可能なグリコシル化部位の２つ（As
n残基79と257）と細胞内に限局される可能なホスホリル
化部位のすべてと一致する。このことは一般的に今まで
の生化学的研究と一致し、α１−サブユニット（推定の
1,4−ジヒドロピリジン レセプターとして確認され
た）がグリコシル化されず、ホスホリル化されることを
示唆した。
第２表はウサギ骨格筋カルシウム チャンネルのα２
−サブユニットのcDNAから算出される1,106アミノ酸配
列を示す。この配列はこの蛋白質に対して125,018の算
出Mrを生じ、これはSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって以前に決定された実測Mr165K−175K（非還元
性条件下；還元性条件下ではMr135K−150Kとは対照的で
ある。ここでcDNAから算出したα２アミノ酸配列はおそ
らくα２−サブユニットのアミノ末端17アミノ酸の配列
として以前に報告された17アミノ酸配列を確認する。α
２−サブユニット前駆体は26アミノ酸（残基−１〜−2
6）シグナル ペプチドを有する。この提案シグナル
ペプチドは疎水性であり、シグナル配列に特徴的な適当
な長さであるが、ペプチドが１−位にGluを有し、12−
位のGluががなり短い中親水性領域を定義することは幾
らか異常である。α２蛋白質は可能な18N−グリコシル
化部位（Asn残基68,112,160,300,324,444,451,580,589,
652,671p758,801,865,872,962,975,および1,005）と、T
hr477およびSer822における可能な2cAMP依存性ホスホリ
ル部位とを含む。
限局性ヒドロパシーに関するα２蛋白質配列の分析に
よると、この蛋白質はα１蛋白質の同様な分析とは明白
に対照的に実質的に親水性であるが、多くの疎水性領域
を含む。さらに、極性指数と疎水性モーメント分析との
疎水性領域の特性化は３セグメントがα２−蛋白質のト
ランスメンブラン ドメインを表すことを実証する。し
かし、α２−蛋白質のトポグラフィーは導出された一次
アミノ酸配列から容易には予測されない。この問題は、
α２蛋白質がディホフ蛋白質配列データベース中の蛋白
質または他のイオン チャンネル蛋白質およびレセプタ
ー蛋白質との有意をホモロジーを有さないという決定に
よってさらに倍加する。提案α２−シグナル配列は実際
に位置−１のGlu残基と適切な位置のGlu残基との間で分
割する場合には、成熟蛋白質のアミノ末端は細胞外であ
る。さらに、３疎水性セグメントがトランスメンブラン
ドメインとして機能すると推定するならば、α２−蛋
白質のカルボキシ末端は細胞内である。このようなトラ
ンスメンブラン トポグラフィーは細胞外に限局された
可能な18N−グリコシル化部位と細胞内に限局された可
能な単一ホスホリル化部位との中の８部位と一致すと考
えられる。今までの生化学的研究は骨格筋カルシウム
チャンネルのα２−サブユニットがホスホリル化され
ず、広範囲にグリコシル化されることを実証する。
ウサギとヒトのゲノムDNAを種々な制限酵素によって
消化させ、これらのDNAのサザン ブロット（Southern
blot）をα１−サブユニットまたはα２−サブユニット
に特異的な放射能標識cDNAクローンとハイブリッド化し
た。非常に厳しい条件下で、α１−またはα２−特異的
プローブではウサギゲノムDNAハイブリッド化帯は殆ん
ど観察されなかった。この結果はウサギゲノム中のα１
−サブユニット遺伝子とα２−サブユニット遺伝子のそ
れぞれのコピー数が低く、おそらく単一コピーのみであ
ることと一致する。同じDNA調製物のサザン・ブロット
をあまり厳しくない（low stringency）条件下でも同じ
α１−またはα２−特異的プローブによって検査した。
あまり厳しくない条件下でもウサギゲノムDNAにおいて
α１およびα２−特異的プローブの両方との付加的なハ
イブリッド化帯が実測されたが、α１−特異的cDNAプロ
ーブでは実質的に大きいハイブリッド化が実測された。
これらの結果は骨格筋DHP感受性カルシウム チャンネ
ルのα１−およびα２−サブユニットが他の電圧依存性
DHP感受性カルシウム チャンネル、DHP感受性でない電
圧依存性カルシウム チャンネル（例えば、Ｔ型および
Ｎ型）および場合によってはリガンド−ゲーテッド（li
gand−gated）カルシウム チャンネル（例えば、グル
タメート レセプター）をコードする遺伝子との有意な
ホモロジーを有することを示唆する。興味深いことに
は、非常に厳しい条件下およびあまり厳しくない条件下
の両方において、α１−特異的cDNAプローブによってヒ
トゲノムDNA中にはハイブリッド化帯が実測されたが、
α２−特異的cDNAプローブの有意なハイブリッド化はあ
まり厳しくない条件下のみ実測された。従って、ウサギ
α１−およびα２−サブユニット遺伝子と同種のヒト遺
伝子が存在スルガ、α１−遺伝子に比べてα２−遺伝子
では大きな進化的配列の相違が生じたと考えられる。
本発明のさらに他の態様はランバート・イートン症候
群（LES）の診断法を提供する。LESは通常神経インパル
スに反応する振動神経末端からのアセチルコリンの放出
が不充分であることを特徴とする自己免疫疾患である。
最近の発表〔キム（Kim）とネヘル（Neher）、サイエン
ス239,405〜408頁（1988）〕は、LES患者からのIgGが個
々の電圧依存性カルシウム チャンネルをブロックし
て、機能を妨げることを実証している。従って、LES I
gGとカルシウム チャンネルα２−サブユニット単独ま
たはこのα２−サブユニットとα１−サブユニットとの
組合せとの免疫学的反応性に基づくLES診断法が提供さ
れる。例えは、このような検定法は本発明のカルシウム
チャンネル サブユニットによるLES IgGの免疫沈降
に基づくことができる。
例 １ cDNAライブラリー用のRNAの単離 RNA単離の前日に、次のように用意する。用心のため
に、ガラス器具はすべて焼成し、下記リスト中のストッ
ク溶液はすべてオートクレーブ処理によって滅菌すべき
である。
0.1 NaOAc,pH 5.2,1 mM EDTA 200 ml 0.2 M Na2 EDTA,pH 8.0. 50 ml 1 M Tris,pH 7.5 50 ml 3.2 Tris,pH 7.2 50 ml 0.01 M Tris（pH 8.0）,1 mM EDTA 50 ml PK緩衝液（0.1 M Tris,pH 7.2,50 mM NaCl 10 mM EDTA） 50 ml 10％SDS 50 ml 超純粋H2O 4 RNA単離の朝に、次の成分を一緒にする： H2O 100 ml グアニジンイソシアネート 100g 1M Tris,pH 7.5 10.6 ml 0.2M EDTA 10.6 ml 65℃より高温には加熱せずに、攪拌してグアニジンイ
ソシアネートを溶解する。
清潔なガラスプレート上で若い成熟ウサギの背中骨格
筋を切開し、例えば100mlウィートン ボトル（wheaton
bottl）内のグアニジンイソチオシアネート溶液50mlに
筋肉組織（〜4mmに小片切断）約10gを加える。
テクマン（Tekman）製「組織破砕器（Tissuemize
r）」（大ブレード）を用いて、10〜20秒間または小片
が見えなくなるまでホモジナイズする。
60℃水浴に入れ、８−OHキノリン（0.2％ β−ME）
中で0.1％にした再蒸留フェノール30mlを加える。溶液
はこの添加後に透明かつ均質でなければならない。
クロロホルム：酢酸塩緩衝液の1:1溶液30mlを加え
る。
60゜において10分間激しく振とうする；溶液は不透明
になる；ならない場合は、ミルク状になるまで充分なク
ロロホルム：酢酸塩を加える。
氷上で冷却し、回転して相を分離する（7000×ｇ、10
〜20分間）。
取出し、22ゲージニードルに強制的に通す。
酢酸塩緩衝液で飽和したフェノール：クロロホクム
（1:1）で処理する。３倍量のクロロホルムで水相を抽
出する。２倍量の−20゜EtOHを加え、１〜２時間（これ
以上長くしてはいけない）沈降させる。
沈澱を回収し、減圧下で短時間（＜５分間）乾燥す
る。SDSに関して0.2％にしたPK緩衝液7ml中に再懸濁す
る。沈降が開始したならば、溶液が透明になるまで65゜
で加熱する。プロティナーゼＫ 1.5mgを加える。37゜
において20分間インキュベートする（あまりに長く乾燥
した場合には、RNAを溶解することが非常に困難であ
り、インキュベーション中に激しくピペッティングする
ことが必要になる）。
1:1フェノール：クロロホルムによって反応を抽出す
る（８−OHキノリン、0.2％β−ME中で0.1％にし、100m
M Tris,pH 8.5またはPK緩衝液pH 7.7によって飽和させ
る）、クロロホルムで２回抽出し、1/10倍量の3.2M Tr
isと２倍量のEtOHとを加えて沈降させる。次に、ポリA+
RNAをマトリックス固定オリゴ（dT）を用いた周知のハ
イブリッド化方法によってRNA混合物から単離する。
例 ２ 1.第１鎖合成 a.次の試薬と組成物を一緒にし、氷上で５時間インキュ
ベートする： b.次に、次の３試薬を（ａ）に加え、混合物を37℃で60
分間インキュベートする： c.次の試薬を（ｂ）に加え、混合物を37℃で30分間イン
キュベートする： RNasin（24U/μ） １μ NMLV−逆転写酵素（BRL−200U/μ） ３μ d.分析用アリコート採取 ０時間目にTCAとして１μ 90分目にTCAとして１μ 90分目にTCAとして0.5μ e.反応を30分後に0.5M EDTA2μ加えることによって、
止め、フェノール／クロロホルム抽出を１回行い、次に
クロロホルム抽出を１回行った。次に10M NH4OAC10μ
プラス２倍量のエタノールを加え、第１鎖を沈澱させ
た。
f.合成を分析し、反応混合物（reaction）0.5μを1.5
％アガロースミニゲル上でランし、ゲルを写真撮影し、
乾燥させ、フィルム下に置いた。｛強化スクリーン（in
tensifying screen）による一晩暴露が適当である｝ g.バックグラウンドより大きい標識の含有率からcDNAの
質量を計算する。１μg SScDNA＝1.4％（含有） 2.第２鎖合成 a.cDNA−RNAをベンチトップミクロフュージ（benchtop
micro−fuge）上で遠心沈降させる。ペレットを95％エ
タノール中で洗浄し、乾燥させる。
b.次の混合物を形成し、12℃で60分間インキュベートす
る。
c.この混合物に次のものを加え、インキュベーションを
22℃において60分間続ける。
DNAポリメラーゼＩ（10U/μ） 1.5μ E.coli DNAリガーゼ（2U/μ） 1.5μ d.反応を60分後に0.M EDTA4μを加えることによって
止め、フェノール／クロロホルム抽出を１回行い、クロ
ロホルム抽出を１回行う。
e.水相を短パスツールピペット中のＧ−50カラム上でラ
ンし、100μ分画を回収する。cDNAを含む500μを回
収し、プールし、〜50μ量までブタノール抽出する。
10M NH4OAc 10μプラス２倍量のエタノールを加える
ことによって、cDNAを沈殿させる。
3.T4ポリメラーゼ反応 a.cDNAをマクロフュージ上で15分間遠心沈降させる。95
％エタノール洗浄を行い、cDNAペレットを乾燥させる。
乾燥ペレットをシンチレーションカウンターにおいて計
数する。第２鎖反応の100％効率を仮定し、第１鎖計算
から２重鎖cDNAの質量を計算する。
b.cDNAに次のものを加える、混合物を37℃において20分
間インキュベートする。
cDNA ＋ 10X T4緩衝液 50μ H2O 40.75μ 4mM dNTP 1.25μ 0.1mM DTT 2.5μ T4ポリメラーゼ（100U/μ） 0.5μ 50μ c.アリコートを採集する： ０時間目にゲルとして0.5μ 20分目にゲルとして0.5μ d.反応を20分後に0.M EDNA 2μ加えることによって
止め、フェノール／クロロホルム抽出とクロロホルム抽
出を１回行う。
e.水相を短パスツールピペット中のＧ−50カラム上でラ
ンし:100μ分画を回収する。cDNAを含有する500μ
sを回収し、プールし、〜50μ量までブタノール抽出
を行う。10M NH4OAc 10μプラス２倍量のエタノール
を加えることによってcDNAを沈殿させる。
f.0時間目と20分目に採取する0.5μサンプルを1.5％
アガロース ミニゲル上でランし、これを次に写真撮映
し、乾燥させ、フィルム下に置く。
4.EcoR Iアダプターの添加（λgtllへの挿入のため） a.次の配列を有するオリゴを合成する： b.20merを次の試薬と一緒にすることによってホスホリ
ル化し、37℃で15分間インキュベートする： 225 pmole20mer ＋ 水 6.8μ 10Xキナーゼ緩衝液 1.2μ 32P−ガンマATP（7000Ci/mmole） 1.0μ 0.1mM DTT 2.5μ キナーゼ（2U/μ） 1.0μ 10μ c.次の２試薬を上記混合物に加え、37℃で30分間インキ
ュベートする。
10mM ATP １μ キナーゼ（2U/μ） １μ 12μ（全体ｂ＋ｃ） d.次に酵素を10分間沸とうすることによって不活性化す
る e.24mer 225pmoleを加え（水を加え15μ量にする）65
℃で５分間インキュベートすることによって、フォスフ
ォリル化20mer〜24merをハイブリッド化する。次に反応
を室温まで除冷する。
今、アダプターを15pmole/μの濃度で存在し、cDNA
−ベクター結合が可能である。
f.次のものを結合する： cDNA ＋ ハイブリッド化アダプター（15pmole/μ）cDNAより
50倍モル過剰 水 16μ 10Xリガーゼ緩衝液 ２μ リガーゼ（10U/μ） ２μ 20μ 5.cDNAのホスホリル化 a.混合物を72℃まで15分間加熱することによって不活化
する b.次の試薬をcDNA結合反応に加え、37℃で30分間加熱す
る。
cDNA結合反応 20μ 水 24μ 10Xキナーゼ緩衝液 ３μ 10mM ATP １μ キナーゼ １μ 50μ c.反応を0.5M EDT 2μ加えることによって止め、フェ
ノール／クロロホルム抽出を１回、クロロホルム抽出を
１回行う。
6.cDNAの精製及びサイズ選択 a.TE緩衝液25mlで洗浄したバイオーゲルＡ−50カラム上
でcDNAをランさせる。カラムは、底部にイエローピペッ
ト先端中にグラスウールを有する0.2cm（内径）×30cm
シリンジ化ガラス管内に0.8μ床樹脂を有する。
b.cDNAを迅速減圧下で〜20μまで乾燥させる。ゲル負
荷染料2.5μを加え、cDNAをカラム上でランさせる。
カラムに緩衝液200−250μランさせた後、カウントが
出現し始める。５分分画（〜30μ）を回収し、シンチ
レーションカウンターでカウントする。cDNAが溶離を開
始し、350〜400μ溶出した後に、遊離アダプターが溶
出し始める。
c.回収した分画の幾つかの0.5μを1.5％アガロースミ
ニゲル上で泳動させ（fun）、ゲルを写真撮影し、乾燥
し、フィルム下に置く。
7.cDNAのλgtllベクターへの結合 a.cDNAλgtllベクターへの結合 a.cDNAを有する分画をプールし、20〜30μまでブタノ
ール抽出し、10M NH4OA ５μプラス２倍量のエタノ
ールを加え、cDNAを沈殿させる。これをミクロフュージ
上で15分間遠心分離沈降させ、次に95％エリノール洗浄
し、乾燥させる。
b.ペペレットのカウントを計数し、cDNA質量を第２鎖合
成後の質量に比べて算出する。
c.cDNAをTE中に再懸濁させる（〜0.10pmol/μ）． d.結合反応は下記のものを含む、これらを14〜16℃にお
いて一晩インキュベートする： 8.パッケージング ベクターをストレイトジーンから提供されたギガパッ
クインビトロ パッケージング キットを用いて、それ
に同封の指示に従ってパッケージする。
試薬 ５×RT緩衝液 試薬 ５×RT緩衝液 250mM Tris,pH 7.4 1M 250 μ 375mM KCl 1M 375 μ 15mM MgCl2 0.2M 75 μ H2O 300 μ 100μ ５×dNTPs 5mM dATP 14.1μ 3mM dCTP 9.1μ 5mM dGTP 13.6μ 5mM dTTP 13.3μ 50μ ５×第２鎖緩衝液 100mM Tris,pH 7.5 1M 100 μ 500mM KCl 1M 500 μ 50mM（NH4）2SO4 1M 50 μ 25mM MgCl2 0.2M 125 μ 250 μg/ml BSA 50 mg/ml 5 μ 水 220μ 1000μ 10×T4緩衝液 670mM Tris,pH 8.0 1M 670 μ 167mM（NH4）2SO4 1M 167 μ 67mM MgCl2 1M 67 μ H2O 96 μ 1000 μ 例 ３ 抗体によるcDNAライブラリーのスクリーニング λgtllライブラリーをLB寒天と50μg/mlアンピシリン
中のY1090上に置く。LB15ml、0.2％マルトースおよび50
μg/mlアンピシリン中で一晩増殖させる。細胞をペレッ
ト化し、10mM MgSO43ml中に再懸濁させる。フアージ25
μｇ（10,000/μｇ）と前記3ml細胞溶液300μとを用
いて４プレート（250,000プラーク／プレート）を、50
μg/mlアンピシリン含有軟質寒天10ml中に入れる。
42℃において2.5時間増殖させ、10mMIRTG〔ベリンジ
ャー マンハイム バイオケミカルス（Boehringer Man
nheim Biochemicals）インジアナ州インジアナポリス）
中に浸せきさせたIPTG処理フィルターが重ねる。やや湿
った程度までフィルターを乾燥させ、これらをプレート
中に入れ、37℃で一晩インキュベートする。
プレートを適切な方向に置き、精製DHTレセプター0.5
μｇを陽性対照として１プレート上にスポットする。フ
ィルターを室温において、TBS（50mMTRIS,150mM NaCl,p
H 8.0）中で10分間洗浄する。TBS,20％FCS（過）中で
フィルターを室温において30分間洗浄する。
フィルターをTBS,20％FCS,抗DHSレセプター抗体（モ
ノクローナルまたはポリクローナル）中で２時間インキ
ュベートする。TBS中で10分間洗浄する。フィルターを
新しいプレートに移し、TBS,0.1％NP40中で１分間洗浄
する。TBS中で10分間洗浄し、新しいプレートに移す。
適当な第２抗体（例えば、HRP−プロティンA;またはH
RP−ヤギ抗マウスIgG）を含むTBS,20％FCS中で少なくと
も１時間インキュベートする。
フィルターを第１抗体に関して上述したように洗浄す
る。
陽性クローンを４−クロロ−１−ナフトールに試薬約
40ml/プレートを用いて発色させる。この試薬は前記発
色剤60mgを氷冷MeOH20ml中に溶解し、４−クロロ−１−
ナフトール〔アルドリッヒ ケミカル カンパニー（Al
drich chemical Company）ミシシッピィ州 ミルウォー
キー〕を30％H2O260μ含有TBS100ml中に混合すること
によって製造する。
例４ ヒトのニューロン カルシウム チャンネルα２−サブ
ユニット・エンコーディングcDNA ヒトのカルシウム チャンネル α２−サブユニット
遺伝子がウサギ カルシウム チャンネル α２−サブ
ユニット遺伝子とは幾らか異なるという上記の指摘か
ら、ヒトのα２−サブユニットをコードするフラグメン
トを単離してヒト脳cDNAライブラリーを高度に厳しい条
件下でスクリーンするためのプローブとして用いた。
このようにして、EcoR I消化ヒト ゲノム サザン
ブロットをウサギα２−サブユニットをコードするcDNA
（第２表に示したヌクレオチド43〜272のフラグメン
ト）を用いて、あまり厳しくない条件と高度に厳しい条
件下の両方で検定した。あまり厳しくない条件下では、
２つのゲノムフラグメントは3.0kbpと3.5kbpのサイズで
あることが確認された。これらの２フラグメントをλgt
llにクローン化した。3.5kbpフラグメントは約300 kbp
フラグメントは約300bpの小Pst I−Xba Iフラグメント
を含み、これは第２表の配列のヌクレオチド102〜183と
96.4ホモロジーを有する82bpエクソン（exon）を含む。
技術上理解されるように、このエクソンの前にはジヌク
レオチドAG（スプライス ドナー）が存在し、後にはジ
ヌクレオチドGT（スプライス アクセプター）が存在す
る。3.0kbpフラグメントは約585bpのXba I−Bgl IIフラ
グメントを含み、これは104bpにおいて第２表のヌクレ
オチド184〜287に93.3％ホモロジーを有するエクソン
（その下流端部にBgl IIを含む）の104bpを含む。300b
p、Pst I−Xba Iフラグメントと585bp、Xba I−Bgl II
フラグメントの両方を用いて、λgtll中のヒト基礎ガン
グリア（basal ganglie）cDNAライブラリーの重複リフ
トを調べた〔このライブラリーはアメリカン タイプ
カルチャー コレクション（The American Type Cultur
e Collection）、米国メリーランド州ロックビルから得
られたものであり、平均インサート サイズ800〜1,000
bpの約106独立組換え体を含む〕。高度に厳しい条件下
で両プローブにハイブリッド化した３陽性クローン（１
つはインサートサイズ約1150bpを有し、他の１つはイン
サートサイズ約790bpを有し、第３クローンはインサー
トサイズ約670bpを有する）が確認された。１クローン
中の1150bpインサートはコーディング領域において約ヌ
クレオチド200からのコーディング領域に伸長し、第２
表の配列を示すcDNAの対応セグメントの配列に90％より
大きく類似する配列を有することが判明した。1150bpイ
ンサートを有するλゲノムをプローブとして用いて、ヒ
ト脳幹cDNAライブラリー〔これもアメリカタイプ カル
チャー コレクションから購入したものであり、平均イ
ンサートサイズ800〜1,000bpを有する約４×106独立組
換え体を有する〕を高度に厳しい条件化で調べた。この
検定では、インサート約950bp、1120bp、3000bpおよび2
500bpを有する４陽性クローンが確認された。1120bpイ
ンサートの大部分はプローブとして用いた1150bpインサ
ートに重複したが、1150bpインサートの上流端部より幾
らか上流まで伸長した。2500bpインサートは1120bpイン
サートの５′末端から約650bpの位置から下流に伸長し
た。2500bpインサートを有するDNAを用いて、脳幹ライ
ブラリーを再び検定し、2750bpインサートを有するクロ
ーンを発見した。2750bpインサートは制限分析と配列決
定とによって、上記1120bpインサート中に開始すること
が判明した読み取り枠の転写停止シグナルを超えて３′
方向に伸長することが判明した。2750bpインサートと11
20bpインサートは共通にPvu II部位を有し、Pvu II部位
を用いて結合させると、ヒトニューロンのカルシウム
チャンネルα２−サブユニットをコードするcDNAを形成
した。このcDNAの５′−1560bpの配列を決定したところ
に第３表に示すように、第２表に示した対応1575bpセグ
メントと91.2％類似するこことが判明した。
ヒトα２−サブユニットをコードするcDNAを、哺乳動
物組織培養細胞中に発現するために、技術上利用可能な
哺乳動物発現ベクターpSV2DHFRにサブクローン化され
る。
アメリカン タイプ カルチャー コレクションから
ヒト神経芽細胞腫細胞ラインITMR32（受入れ番号No.CCL
127）を入手した。この細胞ラインからのポリA+RNA上
で、全長ヒトα２−サブユニット コード化cDNAを用い
て１ザン ブロット分析を実施した。あまり厳しくない
洗浄下で、単一8.2kbフラグメンドが検出された。ウサ
ギ骨格筋α２−サブユニットコード化メッセンジャーRN
Aも8.2kbと同様なサイズを有した。
ここでは本発明を幾らか専門的に説明したが、当業者
はここに述べたことから、本発明の本質に含まれる多く
の変更と修正が可能であることを認識すると考えられ
る。このような変更と修正は請求の範囲に述べた本発明
の範囲に含まれるものである。
本発明の種々な特徴も下記の請求の範囲に述べる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ウィリアムズ，マーク・イー アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールスバッド，ペア・トゥリー・ドラ イブ 6919 (72)発明者 ハーポウルド，マイケル・ミラー アメリカ合衆国カリフォルニア州92102, サンディエゴ，トゥエンティナインス・ ストリート 1341 (72)発明者 シュヴァルツ，アーノルド アメリカ合衆国オハイオ州45244，シン シナチ，ロイアルグリーン・ドライブ 6914 (72)発明者 サルトアー，ジーン アメリカ合衆国カリフォルニア州92129, サンディエゴ，オヴィエド・ストリート 8939 (72)発明者 ブレンナー，ロバート アメリカ合衆国カリフォルニア州92155, サンディエゴ，ボニロ 4140，202 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 262 Ｎｏ．14（1987）ｐ．6572−6576 Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．328（1987) ｐ．313−318 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 ZNA C07K 14/47 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】動物カルシウムチャンネルのα２−サブユ
    ニット又は前記α２−サブユニットの前駆体をコードす
    るヌクレオチド配列を含有する単離されたDNAフラグメ
    ントであって、前記ヌクレオチド配列が、表２に示され
    ているヌクレオチド43〜272を含有するDNAと高緊縮条件
    下においてハイブリダイズすることを特徴とする、DNA
    フラグメント。
  2. 【請求項２】動物が哺乳動物である請求項１に記載のDN
    Aフラグメント。
  3. 【請求項３】哺乳動物の骨格筋、心臓又はニューロンの
    カルシウムチャンネルのα２−サブユニット又は前記α
    ２−サブユニットの前駆体をコードするヌクレオチド配
    列を含有する請求項１に記載のDNAフラグメント。
  4. 【請求項４】前記ヌクレオチド配列がウサギ骨格筋Ｔ管
    カルシウムチャンネルをコードする請求項１に記載のDN
    Aフラグメント。
  5. 【請求項５】前記α２−サブユニットが、表２に示され
    ているアミノ酸配列を含有するか、あるいは、表２に示
    されているDNAによってコードされているアミノ酸配列
    を含有することを特徴とする、請求項１から３のいずれ
    か一項に記載のDNAフラグメント。
  6. 【請求項６】α２−サブユニットが、表３に示されてい
    るDNAによってコードされているアミノ酸配列を含有す
    る請求項１から３のいずれか一項に記載のDNAフラグメ
    ント。
  7. 【請求項７】表２に示されているヌクレオチド43〜272
    を含有するDNAが表２に示されているヌクレオチド配列
    を含有する請求項１に記載のDNAフラグメント。
  8. 【請求項８】表２に示されているヌクレオチド配列のコ
    ーディング部分を含有する請求項１に記載のDNAフラグ
    メント。
  9. 【請求項９】表３に示されているヌクレオチド配列のコ
    ーディング部分を含有する請求項１に記載のDNAフラグ
    メント。
  10. 【請求項１０】請求項１から９のいずれか一項に記載の
    DNAフラグメントを含有する真核細胞。
  11. 【請求項１１】真核細胞中で第１種の哺乳動物のカルシ
    ウムチャンネルのα１−サブユニット前駆体に翻訳され
    得る第１のRNAから本質的になる第１の組成物と、該細
    胞中で第２種の哺乳動物のカルシウムチャンネルのα２
    −サブユニット前駆体に翻訳され得る第２のRNAから本
    質的になる第２の組成物とを該細胞に投与することを含
    んでなる方法（ここで、第１種と第２種は同一でも異な
    っていてもよく、α１−サブユニット前駆体とα２−サ
    ブユニット前駆体の少なくとも１つは該細胞にとって異
    質である）により製造される、異種カルシウムチャンネ
    ル含有両生類卵母細胞からなる真核細胞であって、α１
    −サブユニットが表１に示されているアミノ酸配列を含
    有し、およびα２−サブユニットが請求項１から９のい
    ずれか一項に記載のDNAフラグメントに相補的なRNAによ
    ってコードされているアミノ酸配列を含有することを特
    徴とする、真核細胞。
  12. 【請求項１２】異種カルシウムチャンネルを有する真核
    細胞であって、該カルシウムチャンネルが、第１種の哺
    乳動物のカルシウムチャンネルのα１−サブユニット前
    駆体をコードする第１のcDNAと、第１種と同じか又は異
    なる第２種の哺乳動物のカルシウムチャンネルのα２−
    サブユニット前駆体をコードする第２のcDNAとを、発現
    させることを含んでなる方法により製造され、α１サブ
    ユニットが表１に示されているアミノ酸配列を含有し、
    およびα２−サブユニットが請求項１から９のいずれか
    一項に記載のDNAフラグメントによってコードされてい
    るアミノ酸配列を含有することを特徴とする、真核細
    胞。
  13. 【請求項１３】哺乳動物細胞であることを特徴とする、
    請求項10又は12に記載の真核細胞。
  14. 【請求項１４】（α）２−サブユニットが、表２に示さ
    れているアミノ酸配列を有する請求項10、11又は12に記
    載の真核細胞。
  15. 【請求項１５】（α）２−サブユニットが、表３に示さ
    れているDNAによってコードされているアミノ酸配列を
    有する請求項10、11又は12に記載の真核細胞。
  16. 【請求項１６】当該細胞中で活性であり且つ指標（イン
    ジケータ）タンパク質をコードする遺伝子に機能的に結
    合している転写調節要素を更に含有し、前記転写調節要
    素の転写活性が、機能的カルシウムチャンネルを通して
    該細胞内に入ることが可能なイオン又は分子に応答する
    請求項13に記載の真核細胞。
  17. 【請求項１７】ある化合物の、カルシウムチャンネルア
    ゴニスト又はカルシウムチャンネルアンタゴニストとし
    ての活性をテストする方法であって、被検化合物を含有
    する溶液に請求項16に記載の細胞を懸濁し、機能的に結
    合した遺伝子の転写を測定又は検出することを含んでな
    る方法。
  18. 【請求項１８】ある化合物の、カルシウムチャンネルア
    ゴニスト又はカルシウムチャンネルアンタゴニストとし
    ての活性をテストする方法であって、被検化合物及び機
    能的カルシウムチャンネルを通して当該細胞内に入るこ
    とが可能なイオンを含有する溶液に請求項13に記載の細
    胞を懸濁し、当該イオンの濃度又はその流量を検出する
    ことを含んでなる方法。
  19. 【請求項１９】請求項１から３、５、６および９のいず
    れか一項に記載のDNAフラグメントによりコードされて
    いる、ヒトカルシウムチャンネルの実質的に純粋なα２
    −サブユニット。
  20. 【請求項２０】表２若しくは表３に示されているコーデ
    ィング配列から選択される少なくとも30の隣接塩基から
    なる配列を含有するか、又は、表２若しくは表３に示さ
    れているコーディング配列から選択される少なくとも30
    の隣接塩基からなる配列の相補配列を含有する、標識さ
    れたRNA又は標識された一本鎖DNA分子。
  21. 【請求項２１】表２若しくは表３に示されるコーディン
    グ配列から選択される少なくとも30の隣接塩基からなる
    配列を含有するか、又は、表２若しくは表３に示されて
    いるコーディング配列から選択される少なくとも30の隣
    接塩基からなる配列の相補配列を含有する、DNAフラグ
    メント。
  22. 【請求項２２】請求項１から９のいずれか一項に記載の
    DNAフラグメントより転写された単離されたRNA分子。
JP1505007A 1988-04-04 1989-04-04 カルシウムチャンネル組成物および製造方法 Expired - Lifetime JP3066398B2 (ja)

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