JPH04503152A

JPH04503152A - カルシウムチャンネル組成物および製造方法

Info

Publication number: JPH04503152A
Application number: JP1505007A
Authority: JP
Inventors: エリス，スティーヴン・ブラットリー; ウィリアムズ，マーク・イー; ハーポウルド，マイケル・ミラー; シュヴァルツ，アーノルド; サルトアー，ジーン; ブレンナー，ロバート
Original assignee: メルク　エンド　カンパニー　インコーポレーテッド
Priority date: 1988-04-04
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1992-06-11
Anticipated expiration: 2015-07-17
Also published as: CA1341170C; WO1989009834A1; EP0424397B1; DK240090D0; DE68926713D1; ATE139542T1; DK173404B1; EP0424397A1; US5618720A; EP0424397A4; US7063950B1; FI904827A0; AU3548089A; US6013474A; DE68926713T2; JP3066398B2; DK240090A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１７、キセ　ブス　レヴ　ス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ　）である請求項１６記載の細胞。

１８、前記α１−サブユニットが第１種の哺乳動物のα１−サブユニットであり、前記α２−サブユニットが第２種の哺乳動物のα、−サブユニットであり、前記第１種と第２種が同一または異なる種である請求項１７記戦の細胞。

１９、前記第１壇と第２種とが同一である請求項１８記載の細胞。

２０、前記α、−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウム　チャンネルのα、−サブユニットであり、前記α２−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウム　チャンネルのα２−サブユニットである請求項１日記載の細胞。

２１、前記α１−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウム　チャンネルのα１−サブユニットであり、前記α、−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウム　チャンネルのｃＸＸ−サブユニットである請求項１９記載の細胞。

２２、第１＠乳動物と第２＠乳動物のそれぞれをウサギおよびモルモットから成る群から選択する請求項２０記載の細胞。

２３、哺乳動物をウサギおよびモルモットから成る群から選択する請求項２１記載の細胞。

２４、α、−サブユニットとα２−サブユニットが骨格筋カルシウム　チャンネルのサブユニットである請求項２２記載の細胞。

２５、α１−サブユニットとα２−サブユニットが骨格筋カルシウム　チャンネルである請求項２３記載の細胞。

２６、＠乳動物がウサギである請求項２５記載の細胞。

２７、前記第１組成物の翻訳可能なＲＮＡがタナベ（Ｔｓｎａｂｅ）等のアミノ酸配列および第１表に示すアミノ酸配列から成る群から選択したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする配列を有し、前記第２組成物の翻訳可能なＲＮＡが第２表に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする配列を有する請求項２６記載の細胞。

２８、第１種動物のカルシウム　チャンネルのα１−サブユニットの前駆体をコードする第１ｃＤＮＡと、第２種動物のカルシウム　チャンネルのα２−サブユニットの前駆体をコードする第２ｃＤＮＡとを発現することを含む、前記第１種と第２種とが同一または異なる方法によって製造された異種カルシウムチャンネルを含む真核細胞。

２９、前記細胞を酵母細胞および哺乳動物細胞から成る群から選択する請求項２８記載の細胞。

３０、前記α１−サブユニッ１−が第１種の哺乳動物のものであり、前記α２− サブユニットが第２種の哺乳動物のものであり、第１種哺乳動物と第２種哺乳動物とが同一または異なる動物である請求項２９記載の細胞。

３１、前記第１種と第２種が同一である請求項３０記戦の細胞。

３２、前記α１−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウム　チャンネルのものであり、前記α２−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウム　チャンネルのものである請求項３０記載の細胞。

３３、前記α１−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウム　チャンネルのものであり、前記α２−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウム　チャンネルのものである請求項３１記載の細胞。

３４、第１種および第２種の哺乳動物をそれぞれ、ウサギおよびモルモットから成る群から選択する請求項３２記載の細胞。

３５、哺乳動物をウサギおよびモルモットから成る群から選択する請求項３３記載の細胞。

３６、α、−サブユニットとα２−サブユニットとの両方が骨格筋カルシウム　チャンネルのものである請求項３４記載の細胞。

３７、α１−サブユニットとα２−サブユニットとの両方が骨格筋カルシウム　チャンネルのものである請求項３５記載の細胞。

３８、哺乳動物がウサギである請求項３７記載の細胞。

３９、前記第１ｃＤＮＡがタナベ等のアミノ酸配列および第１表に示したアミノ酸配列から成る群から選択したアミノ酸配列を有する蛍白質をコードし、前記第２ｃＤＮＡが第２表に示したアミノ酸配列を特徴とする請求項３８記載の細胞。

４０、細胞内で活性であり、その転写活性が機能的カルシウムチャンネルから前記細胞内に入りうるイオンまたは分子に反応する転写調節要素を含み、インジケーター蛋白質の構造遺伝子に、発現のために操作可能に結合した異種遺伝子によって形質転換された請求項２８記載の細胞。

４１、細胞内で活性であり、その転写活性が機能的カルシウムチャンネルから前記細胞に入りうるイオンまたは分子に反応する転写活性要素を含み、インジケーター蛋白質の構造遺伝子に、発現のために操作可能に結合した異種遺伝子によって形質転換された請求項３９記載の細胞。

４２、前記インジケーター蛋白質をクコラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼから成る群から選択する請求項４０記載の細胞。

４３、前記インジケーター蛋白質をクロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼから成る請求項４１記載の細胞。

４４、化合物をカルシウム　チャンネル　アゴニストまたはカルシウム　チャンネル　アンタゴニストとしての活性に関して検定する方法であって、請求項４０記載の細胞を前記被検化合物と、機能的カルシウムチャンネルから前記細胞に入って前記細胞内の前記異種遺伝子の前記転写調節要素による転写レベルに影響しうるイオンまたは分子との溶液に懸濁させ、前記細胞中の前記インジケーター蛋白質の濃度の変化を測定することから成る方法。

４５、請求項４１記載の細胞を前記被検化合物と、機能的カルシウム　チャンネルから前記細胞に入って前記細胞内の前記異種遺伝子の前記転写調節要素による転写レベルに影響しうるイオンまたは分子との溶液に懸濁させ、前記細胞中の前記インジケーター蛋白質の濃度の変化を測定することから成る請求項４４記載の方法。

４６、請求項４２記戦の細胞を前記被検化合物と、機能的カルシラム　チャンネルから前記細胞に入って前記細胞内の前記異種遺伝子の前記転写調節要素による転写レベルに影響しうるイオン又は分子との溶液に懸濁させ、前記細胞中の前記クロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたはβ −ガラクトシダーゼの濃度の変化を測定することから成る請求項４４記載の方法。

４７、請求項４３記載の細胞を被検化合物と、機能的カルシウムチャンネルから前記細胞に入って前記細胞内で前記異種遺伝子の前記転写調節要素の転写レベルに影響しうるイオン又は分子との溶液に懸濁させ、前記細胞内の前記クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼの濃度の変化を測定することから成る請求項４４記載の方法。

４８、ヒトにおけるランバート・イートン症候群の診断方法において、哺乳動物カルシウム　チャンネルの実質的に純粋なα１−サブユニットとα２− サブユニットと前記ヒトからの血清サンプルとを一緒にして；前記血清サンプルの抗体と前記カルシウム　チャンネル　サブユニットの少なくとも１つとの間の反応を検出することから成る方法。

４９、第２表に示した塩基−２７〜３３１９間の少なくとも１２連続塩基の配列または第２表に示した塩基−２７〜３３１９間の少な（とも１２連続塩基の配列の補体から成る少なくとも１２連続塩基の長さの配列を有する標識または一重鎖ＤＮＡ。

５０、第２表に示した塩基−２７〜３３１９間の少なくとも３０連続塩基を含む配列または第２表に示した塩基−２７〜３３１９間の少なくとも３０連続塩基の配列の補体から成る配列を有する請求項４９記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。

５１、　”Ｐ　’？’標識した請求項４９記載（７）ＤＮＡまたはＲＮＡ。

５２、３！Ｐで標識した請求項５０記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。

５３、　前記ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの配列がヒトニューロン　カルシウムチャンネルの α２−サブユニットまたは前記α２−サブユニットの前駆体を特徴とする請求項３記載のＤＮＡ。

５４、前記ｃＤＮＡの配列が第３表に記載されたヒトのニューロンαよ一サブユニット　コード化ｃＤＮＡによってコード化されたアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡである請求項５３記載のＤＮＡ。

５５、ヒトのニューロン　カルシウム　チャンネルのサブユニットである請求項９記載の実質的に純粋なサブユニット。

５６、第３表に示したヒト　ニューロンα８−サブユニットコード化ｃＤＮＡによってコード化されたアミノ酸配列をコードする配列を含むｃＤＮＡを真核細胞中で発現することからなる方法によって製造される請求項５５記戦の実質的に純粋なサブユニット。

５７、製造法において、前記ｃＤＮＡを酵母細胞および哺乳動物細胞から成る群から選択された細胞中で発現する請求項５６記載の実質的に純粋なサブユニット。

５８、第３表に示したヒトのニューロンα２−サブユニットコード化ｃＤＮＡの蛋白質コード化セグメントの少なくとも１２連続塩基の配列を含む少なくとも１２塩蟇の長さの配列を有する標識されたＲＮＡまたは一本１１ｉＤＮＡ。

５９、第３表に示したヒトのニューロンα２−サブユニットコード化ｃＤＮＡの蛋白質コード化セグメントの少なくとも３０連続塩基を含む配列を有する請求項５８記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。

６０、　”Ｐで標識された請求項５９記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。

６１、　”Ｐで標識された請求項６０記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。

浄書（内容に変更なし）明　細　書カルシウム　チ　ン　ル　お　び　゛肢歪光！本発明は分子生物学および薬理学に関する。

さらに詳しくは、本発明はカルシウム　チャンネル組成物およびその製造方法と利用方法に関する。

光所坐皇量カルシウム　チャンネルは細胞外流体中に細胞からＣａ″２イオンを制御侵入させる膜スパンニングマルチサブユニット蛋白質（ｍｅｓ＋ｆｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ、　ｍｕｌｔｓｕｂｕｎｉｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）である、動物界のすべての細胞、少なくとも幾つかの細菌細胞、真菌細胞および植物細胞は１種類以上のカルシウム　チャンネルを有する。

最も一般的な種類のカルシウム　チャンネルは電圧依存性である。電圧依存性チャンネルでは、Ｃａ″：イオンの細胞への流入を開始させる「開口」はチャンネル含有細胞の内側と細胞を浸す細胞外媒質との間にあるレベルの電位差が生ずるまでの脱分極を必要とし、Ｃａ″意の細胞への流入速度はこの電位差に依存する。例えば中枢神経系のニューロンおよび、骨格筋、心臓筋、静臓平滑筋、動脈平滑筋の細胞を含めた筋肉細胞のような、動物の「興奮性（ｅｘｃｉｔａｂｌｅ）　Ｊ細胞のすべては電圧依存性カルシウム　チャンネルを有する。

カルシウム　チャンネルは細胞内Ｃａ″２レベルの調節に重要な役割を有し、これらのレベルは細胞の生育力と機能にとって重要であるので、カルシウム　チャンネルは生理的に重要である。

従って、細胞内Ｃａ−”ｉｌ１度は例えば神経伝達物質放出、筋肉収縮、ペースメーカー作用ならびにホルモンその他の物質の分泌のような動物体内の多くの重要なプロセスに関係する。

ヒトを含めた動物における種々な疾患の治療に有用な多くの化合物は、電圧依存性カルシウム　チャンネルの機能の調節によってそれらの有益な効果を及ぼすと考えられる。これらの化合物の多くはカルシウム　チャンネルに結合し、Ｃａ” の細胞への流入速度を細胞内外の脱分極に応じて遮断または減少させる。

カルシウム　チャンネルと相互作用する化合物の薬理学を理解し、カルシウム　チャンネルと相互作用して目的の治療効果を及ぼす化合物を合理的に設計することは、チャンネル　サブユニットの構造とチャンネル　サブユニットをコードする遺伝子とについての理解が不充分であるために今まで妨げられていた。従って、サブユニ７）の性質、サブユニット相互の相互作用、サブユニットと、チャンネルがそれを介してＣａ″！イオンを通過させる細胞膜との相互作用、サブユニットとＣａ”その他のイオンとの相互作用、およびサブユニットと、チャンネル機能に影響を与える低分子量化合物との相互作用を分子レヘルで理解するために必要な、多量の高純度チャンネル　サブユニットを得ることは今まで不可能であった０例えば、精製カルシウムチャンネル　サブユニットが多量に入手可能になることによって、機能的なチャンネルを製造して、チャンネル機能に対する化合物の影響を調べるために用いることができ、それによってカルシウム　チャンネルに影響を与える治療剤の設計の基礎を与えることができる、またはチャンネル　サブユニットの種々な組合せを結晶化させ、Ｘ線または中性子回折法を用いてそれらの構造を高い分解度まで決定して、チャンネル機能に影響を与える治療剤の合理的な設計の新たな基礎をさらに与えることができる。

例えばランハート・イートン症候群（Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような、ある一定の疾患はカルシウム　チャンネルとの自己免疫相互作用を有する。カルシウム　チャンネル　サブユニットが容易に入手可能であるならば、このような疾患の診断のためのイムノアッセイと分子レベルでのサブユニットの理解が可能になり、このような疾患の有効な治療方法が得られる。

カルシウム　チャンネル　サブユニットをコードする遺伝子に間する情報の無いことが成熟カルシウム　チャンネル　サブユニットとそれらの先駆体蛋白質（すなわち末端アミノ基に付随したシグナル　ペプチドを有する成熟サブユニット）との分子性についての理解と、カルシウム　チャンネル　サブユニットの発現の調節とを今まで妨げていた。これらの性質と、カルシウム　チャンネル　サブユニット遺伝子の表現の調節方法とについての理解が、カルシウム　チャンネルの機能または濃度に影響を与えることによって有益な効果を有する治療剤を設計する基礎を与えることになる。さらに、カルシウム　チャンネル　サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を利用できることが、このようなサブユニットをコードする遺伝子の、多くの疾患の原因となる欠陥の診断を可能にする。

動物の組織の細胞からのカルシウム　チャンネルのサブユニットをコード化する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約３０のヌクレオチドから成るセグメントの配列を有するＤＮＡが利用可能になるならば、同じまたは異なる組織からおよび同じまたは異なる種の動物からの異なるカルシウム　チャンネルの対応サブユニットをコードするｃ　ＤＮＡおよび場合によってはゲノムＤＮＡの単離とクローニングが可能になると考えられる。多様な組織と動物種とからのカルシウム　チャンネルの対応サブユニットをコードする多くの全長ＣＤＮＡの配列の利用可能性は、サブユニット内の構造− 機能関係の解明に寄与し、この知識が次にカルシウム　チャンネルへの結合を介して作用を発揮する治療剤の設計に役立つと考えられる。

電圧依存性カルシウム　チャンネルは約１３０〜約２００キロダルトン（ＫＤ）の分子量を有する、２つの大きなサブユニットとある数（一般には１または３個であると考えられる）の異なる、約６０ＫＤ未溝の分子量を有する小さいサブユニットとから成ると考えられる。大きいサブユニットの少なくとも１個と場合によっては小さいサブユニットの少なくとも幾つかはグリコジル化されている。サブユニットの幾つかはホスホリル化されている。電圧依存性カルシウム　チャンネルの種々なサブユニットの命名に関しては、この分野で混乱がある。

電圧依存性カルシウム　チャンネルの２個の大きなサブユニットはここでは、「（アルファ）、−サブユニット（α１−サブユニット」および「（アルファ）２ −サブユニット（α２−サブユニット）」と名づける。

α１−サブユニットはジチオスレイトール（ＤＴＴ）によってまたはグリコジル化蛋白質からのＮ結合糖基の除去に触媒作用を及ぼす酵素によって処理する時に、検出可能な分子量の変化を示さない。α１−サブユニットは哺乳動物の筋肉組織から単離した後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した場合に約１５０〜約１７０ＫＤの分子量を有し、種々の１，４−ジヒドロピリジン（ＤＨＰｓ）とフェニルアルキルアミンに対する特異的結合部位を有する。

α２−サブユニットはα１−サブユニットはどには特定されていない。α２−サブユツトの分子量は、哺乳動物の筋肉組織から単離した後のＤＴＴ存在下での５ＤＳ−ＰＡＤＥ分析によって測定すると、少なくとも約１３０〜１５０ＫＤである。しかし、非還元性条件下（Ｎ−エチルマレイミドの存在下）の５ＤＳ−ＰＡＤＥでは、α２−サブユニットは約１６０−１９０　Ｋ　Ｄ帯を示して移動する。還元時に放出れさると考えられる小フラグメント（約３０ＫＤ）が１３０−１５０　Ｋ　Ｄフラグメントをコード化する遺伝子とは異なる遺伝子の産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）であるのか〔従って、これらの２サブユニットはカルシウム　チャンネルの異なるサブユニットである）、または両フラグメントが同じ遺伝子の産物であるのか〔従って、α２−サブユニットは約１６０−１９０　Ｋ　Ｄであり、還元時に（少なくとも）２フラグメントに分割する〕は、まだ技術上解明されていない。α２−サブユニット（そのサイズ如何に拘らず〕と還元条件下で生ずる対応フラグメント〔α２−サブユニットの一部であるか否かに拘らず〕とが少なくともＮ−結合部によってグリコジル化されており、α１−サブユニットに結合することが分っている１、４−ジヒドロピリジンとフェニルアルキルアミンとに対する特異的結合部位を有さないという証拠がある。

α１−サブユニットの前駆体なるここでの表現は、翻訳時に最終的に、細胞膜中のカルシウム　チャンネルの一部として存在するα１−サブユニットを生ずる、全長ｍ　ＲＮ　Ａの配列に相当するアミノ酸配列を有する蛋白質を意味する。前駆体重白質は種々な処理工程によってα、−サブユニットに転化する。先駆体と成熟α１−サブユニットとの間の処理の詳細は解明されていないが、この処理はおそらくホスホリル化と、カルシウムチャンネルの成熟α１−サブユニットを生ずるための一次翻訳産物の分割（ｃｌｅａｖａｇｅ）とを含むと考えられる。

同様に、α２−サブユニットの前駆体なるここでの表現は、翻訳時に最終的に細胞膜中のカルシウム　チャンネルの一部として存在するα２−サプユニトを生ずる全長ｍＲＮＡの配列に相当するアミノ酸配列を有する蛋白質を意味する。先駆体蛋白質は種々な処理工程によってα２−サブユニトに転化する。α１−サブユニットの場合と同様に、先駆体と成熟α３−サブユニットとの間の処理の詳細は不明であるが、この処理は少なくともリーダー配列（すなわちシグナル　ペプチド）の除去、グリコジル化、およびおそらく、カルシウム　チャンネルの他のサブユニットと現在考えられるものを生ず、るための分割を含むと考えられる。

ウサギの背中骨格筋カルシウム　チャンネルのα１−サブユニット先駆体のｃＤＮＡと対応アミノ酸配列は報告されている。

タナベ（Ｔａｎａｂａ）等の　イ　−Ｎａｔｕｒｅ３２８．３１３−３１８頁（１９８７）。

電圧固定法によって電気生理学的に測定した、カルシウムチャンネル活性は、哺乳動物の脳と心臓筋肉から単離された総量ＲＮＡをキセノブス　レヴ　ス　χｅｎｏ　ｕｓ　１ａｅｖｉｓ　の卵母細胞中に注入する場合に、この卵母細胞中で誘発されている。すなわち、カルシウム　チャンネル含有製剤が、脂質二重層に再構成された場合に、電圧依存性カルシウム　チャンネル活性を二重層に与えることが報告されている。

しかし、α１−サブユニット単独またはαｔ−サブユニット単独が卵母細胞、脂質二重層または他の位置に機能的カルシウムチャンネルを形成するという証拠は存在しない、タナベ等が得たα、−サブユニットのｃＤＮＡを用いて調製したｍＤＮＡがキセノブス　レグイス卵母細胞中でカルシウム　チャンネル活性を誘発できないことが最近、ホフマン（Ｈｏｆｍａｎ）等上２ヱ上スーツ１−ン二−− −二２−１−二＝：二＝−≦ｙｏｌヨー＋、イー、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｆａｒｓａｃｏｌｏ　Ｓｃｉ　）８巻、　３９３−３９８頁（１９８７）によって報告されている。

主！夏１鉦鼠聚咀簡単に述べると、我々は動物のカルシウム　チャンネルのα１−サブユニットをコードするｃＤＮＡ（第１表参照）と動物のカルシウム　チャンネルのαよ一サブユニットをコードするｃＤＮＡ（第２表と例４参照）とを発見した。

従って、本発明はその態様の１つにおいて、動物カルシウムチャンネルのα意− サプユニットをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡと、本発明によるこのようなりＮＡの転写時に製造される、このようなサブユニットをコードするＲＮＡとである。

本発明はその態様の他の１つにおいて、動物カルシウム　チャンネルの実質的に純粋なα２−サブユニットである。

「実質的に純粋な」サブユニットまたは蛋白質とは、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって物質と見なされるかまたは明白に配列するほどに、他のポリペプチド汚染物を含まないサブユニットまたは蛋白質を意味する。

本発明はその態様の他の１つにおいて、異種カルシウム　チャンネル（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ）を含む真核細胞であって、第１種の動物のカルシウム　チャンネルのα１−サブユニットの前駆体に前記細胞中で翻訳される第１ＲＮＡから本質的に成る第１組成物と、第２種の動物のカルシウム　チャンネルのα２−サブユニットの先駆体に前記細胞中で翻訳される第２ＲＮＡから本質的に成る第２組成物とを前記細胞に投与することから成り、前記第１種と第２種とが同じまたは異なるものであるが、前記α１−サブユニットの前記前駆体と前記α２−サブユニットの前記前駆体と前記α２−サブユニットの前記前駆体との少なくとも１つが前記細胞にとって異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）である方法によって製造される真核細胞をも包含する。このために好ましい細胞はキセノプス　レヴ　ス卵母細胞である。

本発明はその態様の他の１つにおいて、化合物をカルシウムチャンネル　アゴニスト　またはアンタゴニスト活性に関して分析する方法であって、直前のパラグラフで述べた細胞をこのような活性に関して試験すべき化合物の溶液に暴露させた場合のこのような細胞のカルシウム　チャンネル活性を電気生理的に測定することから成る方法を包含する。キセノプス　レヴイス卵母細胞およびアセチルコリン　レセプターを用いて適用される同様な方法に関しては、例えばミシナ（Ｍｉｓｈｉｎａ）等、１±土二３１３．３６４頁（１９８５）参照；このような卵母細胞とナトリウム　チャンネルとを用いた同様な方法に関しては、ノダ（Ｎｏｄａ）等、主土±土二３２２．８２６〜８２８頁（１９８６）参照。

本発明はさらに他の態様において、カルシウム　チャンネルのα２−サブユニットを形成するように発現させうるｃＤＮＡから成るＤＮＡを含む真核細胞である０本発明によるこのような細胞はカルシウム　チャンネルのα１−サブユニットを形成するように発現させうるｃＤＮＡから成るＤＮＡをも含む、このような細胞中のこのようなｃＤＮＡから製造されたα２−サブユニットまたはα１−サブユニットは細胞にとって異質である、すなわちこのようなｃＤＮＡによってコード化されるα。

−サブユニットまたはα２−サブユニットを発現するＤＮＡを含まない同しタイプの細胞中に生成するカルシウム　チャンネルα１−サブユニットまたはα２− サブユニットのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有することが好ましい。

このような細胞の中で、哺乳動物起源の細胞、例えばＣＯ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウスＬ細胞等、または例えば区立２グ王乏ヱ盃Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰ　バス　１スＰ、ａｓｔＯｒｉＳのような酵母菌が特に好ましい、適当な異種ＤＮＡをエピソームとして細胞内に維持するかまたは（好ましくは）細胞の染色体ＤＮＡ中に組込むことによって細胞を形質転換し、次に形質転換細胞を培養するかまたはこのような培養物または継代培養物から継代培養する（または哺乳動物の場合には、継代する）ことによって、本発明のこのような細胞を製造する方法は、通常の熟練度を有する人々にとって周知である。

本発明のこのような細胞として、本発明は第１種の動物のカルシウム　チャンネルのＣ１−サブユニットの先駆体をコードする第１ｃＤＮＡと第２種の動物カルシウム　チャンネルのＣ２−サブユニットの前駆体をコードする第２ＣＤＮＡとの発現を構成し、前記第１種と第２種の動物が同じまたは異なるものである方法によって製造した異種カルシウム　チャンネルを有する真核細胞をも含む。前記 α１−サブユニットの前記先駆体と前記α２−サブユニットの前記先駆体との少なくとも１つは通常は前記細胞にとって異質である。このような細胞の中では、哺乳動物起源の細胞または旦−（＝Ｌｚグエ乏ヱエもしくはＰ　バ久上Ｕのような酵母菌であることが好ましい。好ましい実施ＪＩｌ様では、このような細胞は細胞内で活性であり、その転写調節活性が機能的カルシウム　チャンネルから細胞内に入りうるイオンもしくは分子（例えばＣａ　”　、　Ｂａ　”　、　Ｃａ ″′イオフォア）に反応し、イオンまたは分子（例えば、Ｃａ　”　、　Ｂａ　 ”　、　Ｃａ　”＋イオノフオア）に反応する転写調節要素であって、発現のために作用的に例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼのようなインジケータ蛍白質に関して構造遺伝子に結合した転写調節要素を有する異種原子をも含む。

機能的な異質カルシウム　チャンネル（すなわち、Ｃ１−サブユニットとＣ２− サブユニットの少なくとも１つが細胞にとって異質である機能的カルシウム　チャンネル）を有する、本発明のこれらのサブユニットは、他の目的の中でも特に、化合物をカルシウム　チャンネル　アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して検定するために有用である。第一に、このような細胞をこのような化合物の機能的カルシウム　チャンネルに対するアフィニティの評価のために用いることができる。第二に、このような細胞は被検化合物ならびに機能的チャンネルを通って細胞に入りうろことがわかっている、例えばＣａ″またはＢａ”＋のような、イオンまたは分子の存在下でのカルシウム　チャンネル活性の電気生理的評価に用いることができる。アセチルコリン　レセプターを用いて実施した同様な研究に関しては、クララジオ（Ｃ１ａｕｄｉｏ）等のサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３８．１６８８〜ｘ６９４ｉ　（１９８７）参照。化合物をカルシウム　チャンネル　アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して検定する、これらの方法も本発明の一部である。

本発明によるこのような細胞は、細胞内で活性であり、機能的カルシウム　チャンネルから細胞に入りうるイオンまたは分子と反応し、発現のために作用的にインジケータ蛋白質に関して構造遺伝子に結合する転写調節要素を含む異種遺伝子をも細胞が存する好ましい実施態様では、化合物をカルシウム　チャンネル　アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して検定する本発明による他の方法に用いることもできる。この方法は、このような細胞の培養物をこのような活性に関して検定すべき化合物の溶液に、機能的カルシウム　チャンネルから細胞に入って遺伝子の転写を調節する転写調節要素の活性にインジケーター蛋白質に関して影響を与えるイオンまたは分子と共に暴露させ、培養物の細胞中の遺伝子の表現レベルをこのような細胞の他の対照培養物の細胞中のこのような表現レベルに、インジケーター蛋白質に関して比較することから成る。

「対照培養物」は、当業者によって明白に理解されるように、被検化合物に暴露させない点以外は被検化合物に暴露させる培養物と実質的に同じであり、実質的に同様に処理される培養物である。インジケータ蛋白質に関する遺伝子の発現レベルは、インジケータ蛋白質によって触媒される反応で生成する検出可能な化合物の検定法によるインジケータ蛋白質の濃度の測定を含む公知の方法によって、当業者（ｔｈｅ　５ｋｉｌｌｅｄ）によって容易に確認される。

上述したように、インジケータ蛋白質は本発明の細胞中で活性であり、容易に検出可能な化合物の製造を触媒する酵素である（例えば色原体、蛍光性化合物）。

本発明はさらに他の１！樟において、ヒトにおけるランバート・イートン症候群のイムノアッセイによる診断方法であって、ヒトからの血清を第１動物種のＣ１ −サブユニットおよび第２動物種（第１種と同じまたは異なる）のＣ２−サブユニットと結合させ、血清中の抗体が対照血清（例えば、この症候群を有さないことがわかっているヒトまたはヒトの群から）中の抗体よりも大きな度合に、サブユニットの一方または両方と反応するか否かを確認することから成る方法である。特定の抗原に対する血清中の抗体を検出するための技術上公知のイムノアッセイ方法をこの方法に用いることができる。この方法ではα−サブユニットの両方が哺乳動物、最も好ましくはヒトのカルシウム　チャンネルからのものであることが好ましい。

本発明はまた、下記第２表に示す塩基−２３８〜３４９５の範囲からの少なくとも１２（好ましくは少なくとも３０）連続塩基の配列を含む、配列長さが少なくとも１２（好ましくは少なくとも３０）塩基である標識した（例えば３２ｐまたはビオチニル化）ＲＮＡもしくは一重鎖ＤＮＡ、またはヒトのニューロンα２− サブユニットをコード化する、例４に述べるｃＤＮＡから取った配列を有する、このような標識ＲＮＡまたは一重１（ＤＮＡをも含む。

カルシウム　チャンネルα２−サブユニットをコードするｃＤＡＮを確認し単離するため、またはＣ２−サブユニットｍＲＮＡを産生ずる組織を確認するためのプローブとしてのこのようなりＮＡとＲＮＡの使用は当業者に明らかである。これに関しては、例えば例４を参照。

ウサギ骨格筋からのＤＨＰ感受性カルシウム　チャンネルのＣ１およびＣ２−ポリペプチド　サブユニットをコードするｃＤＮＡをクローニングする第１方法は、ウサギ背中骨格筋のラムダ（λ）　−ｇｔｌｌ　ＣＤＮＡ表現ライブラリーを各蛋白質に特異的な抗体プローブによって選別する（ｓｃｒｅｅｎ）ことであった。一般的には、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、カレント　ブロトコールス　インモレキュラー　バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ウィリー　インター　サイエンス（Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）　＝　ニーヨーク（１９８７）　；デヴイス（Ｄａｖｉｓ）等「ベーシック　メソッドス　イン　モレキュラー　バイオロジー（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　Ｊ　、エルセヴイール　サイエンス　パブリッシュ　イング社（Ｅ］５ｅｖｉｅｒ　ＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）、　ニューヨーク（１９８６）参照。ウサギ骨格筋二連構造からのＭｒ　１５５Ｋ　−１７０Ｋ　Ｄ　ＨＰレセプターα１−蛋白質を免疫沈降させうるモノクローナル抗体はすでにロイング（Ｌｅｕｎｇ）等のジェイ、パイオル　ムＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、２６２＋７９４３−７９４６頁（１９８７）に述べられている。α２ポリペプチド　サブユニットに対して結果的なポリクローナル抗血清はモルモットにおいてナカヤマ（Ｎａｋａｙａｍａ）等のジエイ、パイオル、ケム２６２、６５７２−６５７６頁（１９８７）に述べられているような、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル精製α２−蛋白質を用いて調製した。ロイング等（上記文献）によって１１Ｆ７と名づけられたα１−特異的モノクローナル抗体の１つとα２−特異的ポリクローナル抗血清とを用いて、オリゴ−ｄＴ開始（ｏｌｉｇｏ−ｄ　Ｔ　ｐｒｉｍｅｄ）λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーの１．ＯＸ　１０’組換えファージをスクリーンした。タナベ等のα１−サブユニットｃＤＮＡ配列〔ネイチャー３２８．３１３−３１８頁（１９８７）　）に基づくプローブも用いて、α 、−サブユニットｃＤＮＡフラグメントを有するクローンを確認することができた。

陽性クローン（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅ）が抗体スクリーニング方法を用いて検出されたならば、このクローンを用いてさらに重複クローンをスクリーンした。このようにして、重複クローンの逐次系列が得られた。これらのクローンの配列を決定し、フラグメントをｐｌＢＩ　２４／２５（ＩＢＩ、コネチカット州ニューヘブン）またはＭ１３　Ｉｌｐ　１８／１９にサブクローン化した。α １−サブユニットのクローン化では、ＤＮＡ配列をタナベ等が報告しているＤＨＰレセプターα１−サブユニットの一次配列（ｐｒｉｍａｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ）と比較した。アミノ酸差を生じたヌクレオチド差は両方向における配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認した。

α１−サブユニットに付随するもの（ｐｅｒｔａｉｎｓ）として、ｌＩＦ７モノクローナル抗体と実際に反応した、２個のｃＤＮＡクローンを単離し、交差ハイブリッド化によって相関することが判明した。

これらのクローンの１つのＤＮＡ配列決定は４５３塩基対（ｂｐ）のｃＤＮＡインサートの存在を明らかにした。このインサートはエレクトロホラス　エレクトロブラックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｕｓｅｌｅｃｔｒｏｐｌａｘ）ナトリウム　チャンネル配列の領域に対して２８％ホモロジーで１５１アミノ酸読み取り枠を有意にコードした。このクローンに由来するｃＤＮＡインサートを用いて、 λｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーとウサギ背中骨格筋オカヤマーベルグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー〔ラクレナン（ＭａｃＬｅｎｎａｎ）等、ネイチ−１−−３１６，６９６−７００頁（１９８５）　）とを再スクリーンして、重複ｃＤＮＡクローンを単離した。このｃＤＮＡクローンをサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシ　チェイン　少−ミネーター法を用いて分析し、カルシウム　チャンネルのα１−サブユニットの全コーディング配列（ｅｎｔｉｒｅ　ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を決定し、ＤＮＡ配列の比較とオリエンテーションのために制限マツプを製造した。

オリゴ−ｄＴ開始表現ｃＤＮＡライブラリーをグアニジンイソチオシアネート中で単離した若い成熟ウサギ背中骨格筋ポリ（Ａ”　）ＲＮＡ　（シンシナチ大学ジェイ・ロビンス（Ｊ、　Ｒｏｂｂｉｎｓ　）の行為により提供〕を用いて、λ ｇｔｌｌ中に構成した〔グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２５．２６３−２６９頁（１９８３）　；ラベイル（Ｌａｐｅｙｒｅ）等、ジーン３７．２１５−２２０頁（１９８５）　；フィン（）ｌｕｙｎｈ）　等、ＤＮＡクローニングニア　プラクティカル　アプローチ（Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　１巻、　４９−７８頁（ＩＲＬ、オックスフォード、　１９８５）参照〕。二重差ＤＮＡを合成し、ＥｃｏＲＩアダプターを加えた。アダプターを加えた後に、二重差ｃＤＮＡをセハロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　−４Ｂまたはパイオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）　Ａ−５０ｍカラム上でサイズ選択した。フラグメント＞１５００ｂｐはＥｃｏＲＩ消化説ホスホリル化λｇｔｌｌに結合した。ライブラリーをギガパック −プラス（Ｇｉｇａｐａｃｋ−ｐｌｕｓ）　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州すンジエゴ〕によってインビトロ包装し、〉９５％組換え体の効率をＸ　−ｇａｌ　とＩＰＴＧとの存在下での平板培養によって決定した。全体で１×ｌＯｈ組換え体の２クローンをウサギ骨格筋カルシウム　チャンネルのＭｒ１７０，０００α１−サブユニットと反応するモノクローナルＡｂｌＩＦ７による表現ライブラリーのスクリーラングによって確認した。陽性プラークをＨＲＰ−をヤギ抗マウスＩｇＧの結合および次の４−クロロ−１−ナフトールによる発色によって可視化した。各クローンは一５００ｂｐインサートを含み、交差ハイブリット化によって相関した。１クローンは読み取り料（ｎｔｓ　２８４７−３３００）を確認するようにＤＮＡ配列し、ノザン分析法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ）による６、５Ｋｂ転写の確認に用いた。上記４５３ｂｐインサートを用いてλｇｔｌｌライブラリーを再スクリーンし、ｌ×１０ｈクローンの中の８個が陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であった、１クローン（１７００ｂ　ｐ　）は最も離れた５′をｎｔ　２２３７まで伸長し、その５２２ｂｐ　ＰｓｔＩフラグメントｎｔｓ　２２９４−２８１６を用いて、オカヤマとベルブの方法によって構成されたウサギ背中骨格筋ｃＤＮＡライブラリーのＩ　ＸＩＯ”形質転換体をスクリーンした。〔マクレナン等、ｌ±土二３１６、６９６ −７００頁（１９８５））　３個の陽性クローン（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅ）を単離し、その中の最大クローン（５，ＯＫ　ｂ　）は５′をｎ　ｔ　−７５０まで伸長した。オカヤマーベルグｃＤＮＡライブラリーを５’２５０ｂ　ｐ　（ＰｓｔＩ　）　ＥｃｏＲＩフラグメントによって再スクリーンした（ＰｓｔＩ部位はオカヤマーベルグベクターによって与えられに）　（ｎｔｓ〜７５０− １００６）。５陽性クローンの中単離された最長クローンは５．３Ｋｂであり、５′をｎｔ−４５０に伸長した。α１の５′末端をクローン化するために、ランダム開始（ｒａｎｄｏｓ＋　ｐｒｉｍｅｄ）ウサギ背中骨格筋λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーを、上述したように、但し次の修正を加えて合成した：（１）　ｐｄ　（Ｎ）＆　ヘキサマー〔ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｉｎｃ、）ニューシャーシー州ピスカタウェイ〕を、第−鎖ｃＤＮＡ反応をランダムに開始するために用いた、（２）Ｎｃｏｌ、ＫｐｎｌおよびＥｃｏＲ１部位を含むアダプター＝５’　−ＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＡＣＧ−３’３’ 　−ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡ＾−５′を上述のように二重ｌ［ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに結合させた、および（３）二重鎖ｃＤＮＡを１１１１バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）　Ａ３０ｍカラム上でサイズ選択した。　＞６００　ｂ　ｐフラグメントはλｇｔｌｌに結合した。

このライブラリーのｌＸｌ０”組換え体をｎｔ　１００６−２６５３に相当する１、６４８　ｂ　ｐ　ＥｃｏＲＩ　／　Ｘｈｏ　Ｉフラグメントと開始メチオニン（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　１ｎｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）をスパンする（ｓｐａｎｎｉｎｇ）オリゴヌクレオチド　ブローで：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＡＧＧ−３’ とを用いて、二重にスクリーンした。４０クローンが両プローブによって陽性であり、その１つ（１，５５Ｋ　ｂ　）は開始コドンの７８ｎｔｓ５’およびＥｃｏＲ１部位の〜４５０ｂｐ３’を伸長した。

第１表（下記）とα１−サブユニットをコードするｃＤＮＡの５．９７５ヌクレオチド配列を示す、　１．８７３アミノ酸配列をコードする５、６１９ヌクレオチド配列読み取り枠が存在する（第１表）。

指定開始コドンの配列状況はコザク（Ｋｏｚａｋ）のｒｌｕ−（−１シ′ス　レス、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｆｓ　Ｒｅｓ、　Ｊ　１５＋　８１２５−８１３２頁（１９８７）によって提案されたコンセンサス配列（ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　と一致する。ｃＤＮＡの３′ノンコーディング配列（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）はポリ（ｄＡ）Ｎ域を除外して２３４ヌクレオチド長さであり、ポリ（ｄＡ）８！域から上流にコンセンサス　ポリアルデニル化シグナルＡＴＴＡＡＡ　（ヌクレオチド５８３２−５８３７）　１７ヌクレオチドを含む。このｃＤＮＡ配列は−６，５００ヌクレオチドＤＨＰレセプターαＩｍ　ＲＮ　Ａに一致する。

さらに、ＤＮＡ配列はタナベ等（上記文献）が報告したＤＨＰレセプターをコードするｃＤＮＡ配列と９９．４％類似する。ヌクレオチド差が３３位置において確認され、その中の３ヌクレオチド５４２３．５４４４および５５０４はアミノ酸変化も生ずる。

α２−サブユニットの付随物（ｐｅｒｔａｉｓ）として、モルモットα、特異的ポリクローナル抗血清による一次スクリーンでは、３ｃＤＮＡクローンを単離し、交差ハイブリッド化によってこれらが相関するが、α＋ｃＤＮＡ配列は相関しないことが判明した。これらのｃＤＮＡクローンの２つを用いてλｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーを再スクリーンし、重複ｃＤＮＡクローンを単離した。ｃＤＮＡクローンを分析して、カルシウム　チャンネルのα２−サブユニットのコーディングＤＮＡ配列を確立し、制限マツプを製造した。αｚｃＤＮＡの約７．８５０ヌクレオチドをクローン化した、これは−ｓ、ｏｏｏヌクレオチドα２ｍＲＮＡに一致する。

α１サブユニツトに関して述べたように若い成熟ウサギ背中骨格筋ポリ（Ａａ　ＲＮＡを用いて、オリゴｄＴ開始発現ｃＤＮＡライブラリーをλｇｔｌｌ中に構成した。二重鎖ｃＤＮＡフラグメント＞１ｓｏｏｂｐをλｇｔｌｌに結合させ、ｌＸｌ０”組換え体の一次平板培養（ｐｒｉｓ＋ａｒｙ　Ｐｌａｔｉｎｇ）モルモット抗１６０ｋｄ　ａ、ポリクローナル抗血清によってスクリーンした。３陽性プラークをＨＲＰ−プロティンへの結合と次の４−クロロ−１−ナフトールにある発色によって可視化した。２クローン（２，５Ｋｄと３．６Ｋｄ）は重複して、ノザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）法によって確認される〜８Ｋｂ転写の４．７５Ｋｂをコードした。５′方向と３′方向とに伸長するαｚＣＤＮＡクローン（ＤＮＡ配列決定と長い読み取り枠の確認とによって方向決定）を、同じλｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーを１クローンの（ＥｃｏＲＩ）　Ｈ４ｎｄ　ＩＩＩフラグメント（ｎ　ｔ　ｓ　４３−２７２．　５’近位；アダプターからのＥｃ。

Ｒ１部位）または第２クローンのＥｃｏＲＩ　−（ＥｃｏＲＩ　）フラグメント（３′非翻訳領域における〜１．０Ｋｂ）によって再スクリーンすることによって単離した。各末端から７クローンずつの全体で１４クローンを単離した、クローンの重複対（〜２．７５０ｎｔｓ　３　’まで伸長する１クローンと３５０　ｎｔｓ　５　’まで伸長するもう１つのクローン）はα２−転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の〜７８５０ｎｔｓ　；　５　’非翻訳配列３０８ｎ　ｔｓ、コーティング配列３３１８ｎ　ｔｓおよび３′非翻訳配列の〜４２２４ｎ　ｔｓをコードした。３′非翻訳配列の中の１７６ｎｔｓのみを両方向で確認し、報告する。

第２表はαオサブユニットをコードするｃＤＮＡ配列の３．８０２ヌクレオチドと、５′非翻訳配列の３０８ヌクレオチド、３．３１８ヌクレオチド読み取り枠および３′非翻訳配列の１７６ヌクレオチドを含めたその前駆体とを示す。

二番球ξミ市酢ミ蔀記悶ホＥ！酸慶ミ臼嗣ｊす５目５睦Ｕ竺防髄ミ５舶お貼ミ５旧日３院３員ミ５連５咋５ミ５荘ミ５旧３５−≦噺占聞旨５連５酷旧Ｅｉ詰Ｕ＝跨ミ目５酊ぐミ貼藪ト２陣瞥さ茸５お臼旧酔跨５旧（庄調旧軍５目Ｉ酩詩艶５Ｇ嚢５番３３い配ム逝５瑚５止臼畦臼關目ξ３ミ軽竺膓慶跨ミ闘軽＝賠３配瑚コ・ピＡ昨貼陣ｉよトｉ？コ・ｉ！記旧蘇堅砧貼髄日ｊ酷旨５ｕ訂ｇｄδ止配配部δ髄民ｊ３ぶ箸さ耳５味厨グ５１３鳶占酔止トｚにｒ３訂院（ｈ　８＞　Ｈｊ跨ミ跨ミ悶；ヒ３第２表は最初の２６個の負数アミノ酸として表されるαｔ−サブユニットのシグナルペプチドを示す。矢印はシグナル　ペプチドと成熟α８−サブユニットとの間の分割部位を示す、今までに決定したＮ末端アミノ酸配列を太い線の配列として示す（Ｔｈ　ｒ　（＋８）　、Ｔｒ　ｐ　（＋１２）　、Ａｓ　ｐ　（＋１４）は今までに決定されなかった）。

示したヌクレオチド配列はα２−サブユニットのコーディング配列は、重複して α２−サブユニットのコーディング配列をスパフクする２クローンから決定した。

個別クローンには五個のヌクレオチド差異が四種類のアミノ酸変化を生ずることが観察された。配列の１６９．３４７．３４８．９８４位置の差異と、ｎｔ　１Ｂ５８〜１８６０の欠損とが生じた。アミノ酸を次のように完全に決定した：残基３１におけるＡｓｎ、残基９０におけるＺｙｓ：および残基５９４におけるＳｅｒの欠損、枠内上流終止コドン（ｉｎ−ｆｒａｍｅ　ｕｐｓｔｒｅａｓ＋　５ｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ）には上流の短い取り枠の開始コドンと終止コドンと同様にアンダーラインを施した。３個の推定トランスメンブラン領域を枠で囲む。可能なＮ−グリコジル化部位とホスホリル化部位を第１表で述べたように示す。

読み取り枠は１．１０６アミノ酸の配列をコードする（第２表）。

α２−蛋白質の以前に決定されたＮＨ２末端アミノ酸配列を同じ読み取り枠のヌクレオチド７９〜１２９によってコードする（アミノ酸残基ｌ〜１７．第２表）。指定開始コドンに隣接するヌクレオチド配列は提案コンセンサス配列と一致する。枠内終止コドンはヌクレオチド−２７から上流に存在する。さらに、枠外の可能な開始コドンはヌクレオチド−２７から開始して存在し、この後にヌクレオチド−１７９〜１８１のナンセンスコドンが続く。

αｔｃＤＮＡの５′非翻訳配列、このようにクローン化し、配列決定した３０８ヌクレオチドは異常に長い。この領域は特にＧ＋Ｃ冨化であり（約８０％Ｇ＋Ｃ）　、このことは今までに報告された他の比較的長い５′ノンコーディング配列と同じである。

第１表はウサギ骨格筋カルシウム　チャンネルのα１サブユニツトのｃＤＮＡから導出される１、８７３アミノ酸配列を示す。

α、−特異的１１Ｆ７モノクローナル抗体を用いたクローンの確認に基づいて、４５３　ｂｐ　ｃＤＮＡインサート（アミノ酸残基９５０　・・１，１００）によってコードされる蛋白質配列がこのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含むことが判明した。完全な配列はα１−蛋白質に対して算出Ｍ　ｒ　２１２．１４３を生じ、これは他の研究者がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて報告している実測Ｍ　ｒ　１５５に−１７０にとは対照的である。ここで決定し、報告したアミノ酸配列はタベ等（上述文献）が最近述べたアミノ酸配列に９９．８％類似し、このことは残基１　、８０Ｂ　（Ｔ　ｈｒ対Ｍｅｔ）　、１，８１５（Ａｊ！ａ対Ｖａｌ）および１　、８３５ＣＡｌａ対Ｇｌｕ）における３個のアミノ酸差異の存在を示す。

カルシウム　チャンネルαヨーサブユニット蛋白質はＡｓｎ残基７９、２５７．７９７．　Ｌ４６４および１　、６７４における可能な５Ｎ−グリコジル化部位と、Ｓｅｒ残基６８７．１，５０２．１，５７５．１，７５７．１．７７２および１，８５４　、およびＴｈｒｌ、５５２における可能な７ＣＡＭＰ−依存性ホスホリル化部位を含む。ナトリウム　チャンネルのα−サブユニットと同様に、骨格筋カルシウム　チャンネルのα、−サブユニットは４個の内部反復配列領域を含む。

α１−蛋白質配列のヒトロバジ−プロフィル（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙｐｒｏｆｉｌｅ）の分析は各反復領域が疎水性の５セグメントと強陽電荷を有する１セグントとを含むことを明らかにする。α１−査白質配列はシグナル　ペプチドに特徴的を疎水性アミノ末端配列を有さないので、この４個の内部反復配列領域のセグメントが２４トランスメンプラン　セグメントを表し、アミノ末端とカルボキシ末端が細胞内に伸長することが提案されている。このモデルは細胞外に限局される可能なグリコジル化部位の２つ（Ａｓｎ残基７９と２５７）と細胞内に限局される可能なホスホリル化部位のすべてと一致する。このことは一般的に今までの生化学的研究と一致し、α、−サブユニット（推定の１．４−ジヒドロピリジン　レセプターとして確認された）がグリコジル化されず、ホスホリル化されることを示唆した。

第２表はウサギ骨格筋カルシウム　チャンネルのα２−サブユニットのｃＤＮＡから算出される１、１０６アミノ酸配列を示す。

この配列はこの蛋白質に対して１２５．０１８の算出Ｍｒを生じ、これはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって以前に決定された実測Ｍ　ｒ　１６５Ｋ　−１７５Ｋ　（非還元性条件下；還元性条件下ではＭ　ｒ　１３５に一１５０Ｋ　）とは対照的である。ここでｃＤＮＡから算出したα２アミノ酸配列はおそらくα２−サブユニットのアミノ末端１７アミノ酸の配列として以前に報告された１７アミノ酸配列を確認する。α２−サブユニット前駆体は２６アミノ酸（残基−１〜−２６）シグナル　ペプチドを有する。この提案シグナル　ペプチドは疎水性であり、シグナル配列に特徴的な適当な長さであるが、ペプチドが１− 位にＧｌｕを有し、１２−位のＧｌｕががなり短い中親水性領域を定義することは幾らか異常である。α２蛋白質は可能な１８Ｎ−グリコジル化部位（Ａ　ｓ　ｎ残基６８．１１２．１６０．３００．３２４．４４４．４５１．５８０．５８９．６５２．６７１ｐ７５８、８０１．８６５．８７２．９６２．９７５．および１　、００５）と、Ｔ　ｈｒ４７７およびＳ　ｅｒ８２２における可能な２ｃＡＭＰ依存性ホスホリル部位とを含む。

限局性ヒトロバシーに関するＣ２蛋白質配列の分析によると、この蛋白質はα１蛋白質の同様な分析とは明白に対照的に実質的に親水性であるが、多くの疎水性領域を含む。さらに、極性指数と疎水性モーメント分析との疎水性領域の特性化は３セグメントがＣ２−蛋白質のトランスメンプラン　ドメインを表すことを実証する。しかし、Ｃ２−蛋白質のトポグラフィ−は導出された一次アミノ酸配列から容・易には予測されない。この問題は、α２蛋白質がディホフ蛍白質配列データヘース中の蛋白質または他のイオン　チャンネル蓋白質およびレセプター蛋白質との有意をホモロジーを有さないという決定によってさらに倍加する。提案 α２−シグナル配列は実際に位置−１のＧｊ２ｕ残基と適切な位置のＧｊ！ｕ残基との間で分割する場合には、成熟蛋白質のアミノ末端は細胞外である。さらに、３疎水性セグメントがトランスメンプラン　ドメインとして機能すると推定するならば、Ｃ２−蛋白質のカルボキシ末端は細胞内である。

このようなトランスメンプラン　トポグラフィ−は細胞外に限局された可能な１８Ｎ−グリコジル化部位と細胞内に限局された可能な単一ホスホリル化部位との中の８部位と一致すと考えられる。今までの生化学的研究は骨格筋カルシウム　チャンネルのＣ２−サブユニットがホスホリル化されず、広範囲にグリコジル化されることを実証する。

ウサギとヒトのゲノムＤＮＡを種々な制限酵素によって消化させ、これらのＤＮＡのサザン　プロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）をＣ１−サブユニットまたはＣ２−サブユニットに特異的な放射能標１ｃＤＮＡクローンとハイブリッド化した。非常に厳しい条件下で、Ｃ１−またはＣ２−特異的プローブではウサキゲノムＤＮＡハイブリッド化帯は殆んど観察されなかった。この結果はウサギゲノム中のＣ１−サブユニット遺伝子とＣ２−サブユニット遺伝子のそれぞれのコピー数が低く、おそらく単一コピーのみであることと一致する。同じＤＮＡ調製物のサザン・プロットをあまり厳しくない（ｌｏｓｖ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｒ、ｙ）条件下でも同じα。

−またはＣ２−特異的プローブによって検査した。あまり厳しくない条件下でもウサギゲノムＤＮＡにおいてＣ１およびＣ２−特異的プローブの両方との付加的なハイブリッド化帯が実測されたが、α、−特異的ｃＤＮＡプローブでは実質的に大きいハイブリッド化が実測された。これらの結果は骨格筋ＤＨＰ感受性カルシウム　チャンネルのＣ５−およびα□−サブユニットが他の電圧依存性ＤＨＰ感受性カルシウム　チャンネル、ＤＨＰｇ受性でない電圧依存性カルシウム　チャンネル（例えば、Ｔ型およびＮ型）および場合によってはりガント−ゲーテッド（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ　）カルシウム　チャンネル（例えば、グルタメート　レセプター）をコードする遺伝子との有意なホモロジーを有することを示唆する。興味深いことには、非常に厳しい条件下およびあまり厳しくない条件下の両方において、Ｃ１−特異的ｃＤＮＡプローブによってヒトゲノムＤＮＡ中にはハイブリッド化帯が実測されたが、Ｃ２−特異的ｃＤＮＡプローブの有意なハイブリッド化はあまり厳しくない条件下のみ実測された。従って、ウサギα１− およびＣ２−サブユニット遺伝子と同種のヒト遺伝子が存在スルガ、Ｃ１−遺伝子に比べてＣ２−遺伝子では大きな進化的配列の相違が生じたと考えられる。

本発明のさらに他の態様はランパート・イートン症候群（ＬＥＳ）の診断法を提供する。ＬＥＳは通常神経インパルスに反応する振動神経末端からのアセチルコリンの放出が不充分であることを特徴とする自己免疫疾患である。最近の発表〔キム（Ｋｉｓ）とネヘル（Ｎｅｈｅｒ）　、サイエンス２３９．４０５〜４０８頁（１９８８）　）は、ＬＥＳ患者からのＩｇＧが個々の電圧依存性カルシウムチャンネルをブロックして、機能を妨げることを実証している。

従って、ＬＥＳ　ＩｇＧとカルシウム　チャンネルα２−サブユニット単独またはこのＣ２−サブユニットとＣ１−サブユニットとの組合せとの免疫学的反応性に基づ（ＬＥＳ診断法が提供される。例えは、このような検定法は本発明のカルシウムチャンネル　サブユニットによるＬＥＳ　ＩｇＧの免疫沈降に基づくことができる。

劃−」− ｃＤＮＡ−イブ−Ｉ−のＲＮＡのＲＮＡ単離の前日に、次のように用意する。用心のために、ガラス器具はすべて焼成し、下記リスト中のストック溶液はすべてオートクレーブ処理によって滅菌すべきである。

０、Ｉ　Ｎａ０Ａｃ、ｐＨ５，２，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　２００　ｄＯ，２Ｍ　Ｎａｇ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０，５０ｄｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５５０ｔｄ３．２　Ｔｒｆｓ、ｐＨ７，２５０ｒｒｄｌＯ，０１Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　５０　ｔｄＰＫ緩衝液（０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，２，５０ｍＭ　ＮａＣ１５０ｄｌｏ　ｍＭ　ＥＤＴＡ）１０％ＳＤＳ　５０ｄ超純粋Ｈ２０４１ＲＮＡ単離の朝に、次の成分を一緒にする：Ｈ２０１００戚グアニジンイソシア＊−ト１００ｇＬＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，５１０，６ｄＯ，２Ｍ　ＥＤＴＡ　１０．６　ｄ６５°Ｃより高温には加熱せずに、攪拌してグアニジンイソシアネートを溶解する。

清潔なガラスプレート上で若い成熟ウサギの背中骨格筋を切開し、例えば１００ｄウイートン　ボトル（ｗｈｅａｔｏｎ　ｂｏｔｔｌ）内のグアニジンイソチオシアネート溶液５０ｄに筋肉組織（〜４ＩＩ１１に小片切断）約１０ｇを加える。

チクマン（Ｔｅｋｍａｎ）製［組織破砕器（ＴｉｓｓｕｅＩｌｉｚｅｒ）　Ｊ　（大ブレード）を用いて、１０〜２０秒間または小片が見えなくなるまでホモジナイズする。

６０°水浴に入れ、８−ＯＨキノリン（０，２％　β−ＭＥ）中で０．１％にした再蒸留フェノール３０ａｆを加える。溶液はこの添加後に透明かつ均質でなければならない。

クロロホルム：酢酸塩緩衝液のｌ：１溶液３０１ｄを加える。

６０°において１０分間激しく振とうする；溶液は不透明になる；ならない場合は、ミルク状になるまで充分なりロロホルム：酢酸塩を加える。

氷上で冷却し、回転して相を分離する（７０００Ｘ、　、　１０〜２０分間）。

取出し、２２ゲージニードルに強制的に通す。

酢酸塩緩衝液で飽和したフェノール：クロロホルム（１：１）で処理する。３倍量のクロロホルムで水相を抽出する。２倍量の一２０°ＥｔＯＨを加え、１〜２時間（これ以上長くしてはいけない）沈降させる。

沈澱を回収し、減圧下で短時間（〈５分間）乾燥する。ＳＤＳに関して０．２％にしたＰＫＩｌ衝液７１ｄ中に再懸濁する。沈降が開始したならば、溶液が透明になるまで６５°で加熱する。ブロティナーゼＫ　１．５■を加える。３７″において２０分間インキュベートする　（あまりに長く乾燥した場合には、ＲＮＡを溶解することが非常に困難であり、インキュベーション中に激しくピペッティングすることが必要になる）。

ｌ：ｌフェノール：クロロホルムによって反応を抽出する（８−ＯＨキノリン、０．２％β−ＭＥ中で０．１％にし、１００＊ＭＴｒｉｓ＋　ｐＨａ、　５またはＰＫｉｌ衝液ｐＨ７，７によって飽和させる）、クロロホルムで２回抽出し、１／Ｉ０倍量の３．２Ｍ　Ｔｒｉｓと２倍量のＥｔＯＨとを加えて沈降させる０次に、ポリＡ″ＲＮＡをマトリックス固定オリゴ（ｄＴ）を用いた周知のハイブリッド化方法によってＲＮＡ混合物から単離する。

［Ａ、腺３９次の試薬と組成物を一緒にし、氷上で５時間インキュベートする：試薬　量　最終濃度〜５ＲポリＡ＋ＲＮＡ、プラス水　１０５１１！まで５×逆転写酵素緩衝液　１０ｔｒｌ　ＩＸＯ，５Ｍ　ＤＤＴ　ｌａｆ　１０ｓ＋ＭＲＮａｓｉｎ　（２４Ｕ／ｐｆ）　２１１　〜ＩＵ／１１５　ＸｄＮＴＰ　Ｉｏｎ　ＩＸオリゴｄＴ　（２５０題／　Ｍｌ）　５ｕｌ　２５ａｌ　／　４５０次に、次の３試薬を（ａ）に加え、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする：アクチノマイシンｏ　（６００ｇ／ｄ）　４μ！　〜５０ｐｌ／ｄｉｓｚｐ−ガンマｄＣＴＰ（３２００Ｃｉ　／ｓ■ｏｌ）　２．５ｐｌ　−ＮＭＬＶ−逆転写酵素（ＢＲＬ−２００Ｕ／１１ｆ）　−」ｔ２００Ｕ／ｘＲＮＡ５０β！　（全体ａ＋ｂ）Ｃ０次の試薬を（ｂ）に加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベートする：ＲＮａｓｉｎ　（２４０／　ｐｌ）　１ｐ７ＮＭＬＶ−逆転写酵素（ＢＲＬ−２００Ｕ／ｌ１ｌ）　３ｒｄｄ１分析用アリコート採取０時間口にＴＣＡとして１　ｐｌ９０分目にＴＣＡとして１　ｐｌ９０分目にＴＣＡとして０．５１１＊０反応を３０分後に０．５Ｍ　ＥＤＴＡ２ｐ！加えることによって、止め、フェノール／クロロホルム抽出を１回行い、次にクロロホルム抽出を１回行った。

次にＩＯＭ　ＮＨ，ＯＡｃ　１０ｐｌプラス２倍量のエタノールを加え、第１鎖を沈澱させた。

ｆ２合成を分析し、反応混合物（ｒｅａｃｔｉｏｎ）０．５ｐ／を１．５χアガロースミニゲル上でランし、ゲルを写真撮影し、乾燥させ、フィルム下に置いた。（強化スクリーン（ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　５ｃｒｅｅｎ）による−晩暴露が適当である）ｇ、バックグラウンドより大きい標識の含有率からｃＤＮＡの質量を計算する。

１Ｍｇ　ＳＳｃ　ＤＮＡ＝１．４χ（含有）４金底ａ、ｃＤＮＡ−ＲＮＡをベンチトップミクロフェージ（ｂｅｎｃｈｔｏｐｍｉｃｒｏ−ｆｕｇｅ）上で遠心沈降させる。ペレットを９５％エタノール中で洗浄し、乾燥させる。

５１次の混合物を形成し、１２℃で６０分間インキュベートする。

量　最終濃度ｃＤＮＡ　ＲＮＡ、プラス水　６８．１５ｘ第２１１１衝液　２０ａｌ　ｌＸ１０ｍＭ　β−Ｎ＾Ｄ　１．５ａｌ　Ｏ，１５ｍＭ４−Ｍ　ｄＮＴＰ　５ａｌ　２００μＭ／＋ｄＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｌｏｌｌ／ｘ／）　２．５ｔｔｌ　２５０Ｕ／ｄＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　リガーゼＣ２Ｕ／ｐｌ）　２ａｌ　４０Ｕ＃ｄＲＮａｓｅ　Ｈ（２，３Ｕ／ｐｌ）　」ｄ２３Ｕ／Ｈ１００ａｆＣ９この混合物に次のものを加え、インキュベーションを２２℃において６０分間続ける。

ＤＮＡポリメラーゼＩ　（ＩＯＵ／ｐｆ）　１．５ｐｌＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　リガーゼ（２Ｕ／１１７）　１．５ｍｄ０反応を６０分後にＯ，Ｍ　ＥＤＴＡ４ｐｊを加えることによって止め、フェノール／クロロホルム抽出を１回行い、クロロボルム抽出を１回行う。

ｅ、水相を短パスツールピペット中のＧ−５０カラム上でランし、１００ａｆ分画を回収する。ｃＤＮＡを含む５００ｐ７を回収し、ブー７１／Ｌ、、〜５０ｔ！！量マチブタノール抽出すル、　ＩＯＭ　ＮＨ４ｏＡｃ　ｌＯ＃１プラス２倍量のエタノールを加えることによって、ｃＤＮＡを沈殿させる。

Ｔ４ポ１メー−ゼ　・ａ、ｃＤＮＡをマクロフユージ上で１５分間遠心沈降させる。９５％エタノール洗浄を行い、ｃＤＮＡペレットを乾燥させる。

乾燥ペレットをシンチレーションカウンターにおいて計数する。第２１［７反応の１００％効率を仮定し、第１ＩＩ計算がら２重１ｉｃＤＮＡの質量を計算する。

ｂ、ｃＤＮＡに次のものを加える、混合物を３７℃において２０分間インキュベートする。

ｃＤＮＡ　＋１０Ｘ　Ｔ４緩衝液　５０ＩｄＨｚ０　４０．７５＃ｆ４　ｍＰＩｄＮＴＰ　１．２５ｔｄ０．１ｓ＋Ｍ　ＤＴＴ　２．５μ！Ｔ４ポリメラーゼ（ＩＯＵ／ｐｉ）　」」Ｉ０ｐＩＣ，アリコートを採集する：０時間目にゲルとして０．５ｔｔ！２０分目にゲルとして０．５μ！ｄ０反応を２０分後に０．Ｍ　ＥＤＮＡ２ｐｌ加えることによって止め、フェノール／クロロホルム抽出とクロロホルム抽出ヲ１回行う。

ｅ、水相を短パスツールピペット中のＧ−５０カラム上でランし：１００μ１分画を回収する。ｃＤＮＡを含有する５００μ！Ｓを回収し、プールし、〜５０μ ！量までブタノール抽出を行う。ｌ０ＭＮＨ４０ＡＣ１０μ！プラス２倍量のエタノールを加えることによってｃＤＮＡを沈殿させる。

ｆ、Ｏ時間目と２０分目に採取する０　、　５　ｔｔｌサンプルを１．５％アガロース　ミニゲル上でランし、これを次に写真撮映し、乾燥させ、フィルム下に置く。

４、ＥｃｏＲＩア′ブ　−の５１．（λｇｔｌｌへの挿入のため）８９次の配列を有するオリゴを合成する：２０　ｌ１ｅｒ：　５’　−ＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＡＣＧ−３’２４　ｍｅｒ：　３’　−ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＡ−５’ｂ、　２０ｍｅｒを次の試薬と一緒にすることによってホスホリル化し、３７゛Ｃで１５分間インキュベートする：２２５　ｐｍｏｌｅ２０ｍａｒ　−１−水　６．８μ！１０Ｘキナーゼ緩衝液　１　、２　ｐ１３２ｐ−ガンマＡＴＰ（７０００Ｃｉ／ｌａｔｍｏｌｅ）　１．０ｔｉｌＯ，１ｍＭ　ＤＴＴ　２．５ｐｌキナーゼ（２Ｕ／μＺ）　」」ｄ０ａｌＣ９次の２試薬を上記混合物に加え、３７°Ｃで３０分間インキュベートする。

１０ｎ＋Ｍ　ＡＴＰ　１μ！キナーゼ（２Ｕ／μ／）　ｊ７１２μ！（全体ｂ＋ｃ）６０次に酵素を１０分間沸とうすることによって不活性化するｅ、　２４ｒｓｅｒ　２２５ｐｒｓｏ１ｅを加え（水を加え１５Ｊ１！量にする）６５℃で５分間インキュベートすることによって、フォスフォリル化２０ｍｅｒ〜２４ａ＋ｅｒをハイブリッド化する。次に反応を室温まで除冷する。

今、アダプターを１５ｐｍｏｌｅ／ａｆの濃度で存在し、ｃＤＮＡ−ベクター結合が可能である。

１９次のものを結合する：ｃＤＮ八　十ハイブリッド化アダプター（１５ｐｍｏｌｅ／ｐり　ｃＤＮＡより５０倍モル過剰水　１６μ！１０χリガーゼ緩衝液　２ａｌリガーゼ（ＩＯＵ／μＺ）　、２１２０μ！５、ｃＤＮＡのホスホフル化ａ、混合物を７２℃まで１５分間加熱することによって不活化するす０次の試薬をｃＤＮＡ結合反応に加え、３７°Ｃで３０分間加熱する。

ｃＤＮ＾　結合反応　２０μｌ水　２４μ！１０Ｘキナーゼ緩衝液　３ｐＨ０ｍＭ　ＡＴＰ　１μ！キナーゼ　」ｄ５０μｌＣ３反応を０．５Ｍ　ＥＤＴ　２μ！加えることによって止め、フェノール／クロロホルム抽出を１回、クロロホルム抽出を１回行う。

６、ｃＤＮＡの　１１　びサイズ゛ａ、ＴＥ１１衝液２５ｄで洗浄したバイオ−ゲル穴−５０カラム上でｃＤＮＡをランさせる。カラムは、底部にイエローピペット先端中にグラスウールを有する０、２ａｉ（内径）　Ｘ　３０ＣＩシリンジ化ガラス管内に０．８ｐｌ床樹脂を有する。

ｂ、ｃＤＮＡを迅速減圧下で〜２０μｌまで乾燥させる。ゲル負荷染料２．５μ ｌを加え、ｃＤＮＡをカラム上でランさせる。カラムに緩衝液２００−２５０μ ！ランさせた後、カウントが出現し始める。５分分画（〜３０μりを回収し、シンチレーションカウンターでカウントする。ｃＤＮＡが溶離を開始し、３５０〜４００μ！溶出した後に、遊離アダプターが溶出し始める。

Ｃ０回収した分画の幾つかの０．５μ！を１．５％アガロースミニゲル上で泳動させ（ｆｕｎ）　、ゲルを写真撮影し、乾燥し、フィルム下に置く。

ａ、ｃＤＮＡλｇｔｌｌベクターヘノ結合ａ、ｃＤＮＡを有する分画をプールし、２０〜３０μｌまでブタノール抽出し、ＩＯＭ　ＮＨ４０Ａ　５μ！プラス２倍量のエタノールを加え、ｃＤＡＮを沈殿させる。これをミクロフユージ上で１５分間遠心分離沈降させ、次に９５％エリノール洗浄し、乾燥させる。

ｂ、ベペレットのカウントを計数し、ｃＤＮＡｆ量を第２頷合成後の質量に比べて算出する。

ｃ、ｃＤＮＡをＴＥ中に再懸濁させる（〜０．１０ｐｍｏｌ／　ｐｌ　）　。

ｄ、結合反応は下記のものを含む、これらを１４〜１６°Ｃにおいて一晩インキュベートする：（λｇｔ１１ベクター１　ｐｇ　＝　０．０３５ｐｍｏ　！　ベクター使用）λ ｇｔｌｌ（１μＺ／１μＺ）　１μ！ｃＤＮＡインサート　（ベクターに比べて２〜４倍モル過剰なｃＤＮＡ）水　３　ｐｌまで５×リガーゼ緩衝液　１　ｔｔｌリガーゼ（Ｌｏｌｌ／ｐ／）　−上旦一５μ！８、バ上欠二乏ｌ久ベクターをストレイトジーンから提供されたギガパックインビトロ　パッケージング　キントを用いて、それに同封の指示に従ってパッケージする。

試薬５ＸＲＴ緩衝液試薬５ＸＲＴ緩衝液２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４１Ｍ　２５０　ｐ１３７５ｍＭＫＣＩ　ＩＭ　３７５　ｐＨ５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　Ｏ，２Ｍ　７５　Ｂｉ５　ＸｄＮＴＰｓ５ｍＭ　ｄＡＴＰ　１４．１ｐＺ３　ａ＋Ｍ　ｄＣＴＰ　９．　Ｌｔｔ１５　ｓ＋Ｍ　ｄＧＴＰ　１３．６ｐＺ５ｍＭ　ｄＴＴＰ　−ｕＪｔ− ０ｔｔ１５×第２鎖緩衝液１０抛Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，５１Ｍ　１００　ｐ１５００ｍＭ　ＫＣＩ　ＬＭ　５００μ１５０ａ＋Ｍ　（ＮＨ４）ｚｓ０４ＬＭ　５０　ｐ！２５＋ｓＭ　ＭｇＣ１ｚ　Ｏ，２Ｍ　１２５　ｐ１２５０　ｐｇ／ｄ　ＢＳＡ　５０■／ｗｉｔ　５μ！水　−一２鍛ｆ０００ｐｆ１０ＸＴ４緩衝液６７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０ＩＭ　６７０　ｔｄ１６７ｍＭ　（ＮＨａ）ｚｓＯａ　ＬＭ　１６７β！６７ｍＭ　ＭｇＣｈ　ＩＭ　６７　ｐＨ■−１拡止に１３匹ＤＮＡ−イブ−１−のスクｉ−ニングλｇｔｌｌライブラリーをＬＢ寒天と５０ｔｔｇ／ｄアンピシリン中のＹ１０９０上に置く。ＬＢ１５１ｄ、０．２％マルトースおよび５０＃ｇ／ｄアンピシリン中で一晩増殖させる。細胞をペレット化し、１０ｍＭＭｇ５Ｏ４３ｄ中に再懸濁させる。ファージ２５絽（１０，０００／　ｔｒｉ　）と前記３１ｄ細胞溶液３００ａｆとを用いて４プレート（２５０，０００プラーク／プレート）を、５０ｎ／ｄｉアンピシリン含有軟質寒天１０ｄ中に入れる。

４２℃において２．５時間増殖させ、１０ｍＭＩＲＴＧ（ベリンジャー　マンハイム　バイオケミカルス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）インジアナ州インジアナポリス）中に浸せきさせたＩ　ＰＴＯ処理フィルターが重ねる。やや湿った程度までフィルターを乾燥させ、これらをプレート中に入れ、３７℃で一晩インキュベートする。

プレートを適切な方向に置き、精製ＤＨＴレセプター０．５ｕｇを陽性対照として１プレート上にスポットする。フィルターを室温において、Ｔ　Ｂ　Ｓ　（５０ｓＭＴ　ＲＩ　Ｓ、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ８，０）中で１０分間洗浄する。ＴＢＳ、２０％ＦＣ３（ｒ遇）中でフィルターを室温において３０分間洗浄する。

フィルターをＴＢＳ、２０％ＦＣ５，抗ＤＨＳレセプター抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）中で２時間インキュベートする。ＴＢＳ中で１０分間洗浄する。フィルターを新しいプレートに移し、ＴＢＳ、０．１％ＮＰ４０中で１分間洗浄する。

ＴＢＳ中で１０分間洗浄し、新しいプレートに移す。

適当な第２抗体（例えば、ＨＲＰ−プロティンＡ；またはＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ）を含むＴＢＳ、２０％ＦＣ３中で少なくとも１時間インキュベートする。

フィルターを第１抗体に関して上述したように洗浄する。

陽性クローンを４−クロロ−１−ナフトールに試薬約４０ｄ／プレートを用いて発色させる。この試薬は前記発色剤６０■を水冷ＭｅＯＨ２Ｏａｄ中に溶解し、４−クロロ−１−ナフトール〔アルドリッヒ　ケミカル　カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）ミシシッピイ州　ミルウォーキー〕を３０％ＨｚＯｚ　６０ｇ！含有ＴＢＳ１００ｄ中に混合することによって製造する。

紅ヒ　のニューロン　カルシウム　チャン　ルα　−サ゛ユニ・　・エンコー−° 　ン　ｃＤＮＡヒトのカルシウム　チャンネル　α２−サブユニット遺伝子がウサギ　カルシウム　チャンネル　α２−サブユニット遺伝子とは幾らか異なるという上記の指摘から、ヒトのα２−サブユニットをコードするフラグメントを単離してヒト脳ｃ　ＤＮＡライブラリーを高度に厳しい条件下でスクリーンするためのプローブとして用いた。

このようにして、ＥｃｏＲＩ消化ヒト　ゲノム　サザン　プロットをウサギα２ −サブユニットをコードするｃＤＮＡ（第２表に示したヌクレオチド４３〜２７２のフラグメント）を用いて、あまり厳しくない条件と高度に厳しい条件下の両方で検定した。

あまり厳しくない条件下では、２つのゲノムフラグメントは３．０ｋｂｐと３．５ｋｂｐＯサイズであることが確認された。これらの２フラグメントをλｇｔｌｌにクローン化した。３．５ｋｂｐフラグメントは約３００　ｋｂｐフラグメントは約３ｏｏｂｐの小Ｐｓｔ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを含み、これは第２表の配列のヌクレオチド１０２〜１８３と９６．４ホモロジーを有する５２ｂｐエクソン（ｅｘｏｎ）を含む。技術上理解されるように、このエクソンの前にはジヌクレオチドＡＧ（スプライス　ドナー）が存在し、後にはジヌクレオチドＧＴ（スプライス　アクセプター）が存在する。　３．０ｋｂｐフラグメントは約５ｓｓｂｐのＸｂａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｉｆフラグメントを含み、これは１０４ｂｐにおいて第２表のヌクレオチド１８４〜２８７に９３．３％ホモロジーを有するエクソン（その下流端部にＢｇｌ　Ｕを含む）の１０４ｂｐを含む、　３００ｂｐ　、　Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントと５ａｓｂｐ　、χｂａｌ− Ｂｇｌ　Ｉｆフラグメントの両方を用いて、λｇｔｌ　１中のヒト基礎ガングリア　（ｂａｓａｌ　ｇａｎｇｌｉｅ）　ｃ　Ｄ　ＮＡライブラリーの重複リフトを調べた〔このライブラリーはアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、米国メリーランド州ロックビルから得られたものであり、平均インサート　サイズ８００〜１　、　ｏｏｏｂｐの約１０６独立組換え体を含む〕、高度に厳しい条件下で両プローブにハイブリッド化した３陽性クローン（１つはインサートサイズ約１１５０ｂｐを有し、他の１つはインサートサイズ約７９０ｂｐを有し、第３クローンはインサートサイズ約６７０ｂｐを有する）が確認された。

１クローン中の１１５０ｂｐインサートはコーディング領域において約ヌクレオチド２００からのコーディング領域に伸長し、第２表の配列を示すｃＤＮＡの対応セグメントの配列に９０％より大きく類似する配列を有することが判明した。

１１５０ｂｐインサートを有するλゲノムをプローブとして用いて、ヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリー〔これもアメリカンタイプ　カルチャー　コレクションから購入したものであり、平均インサートサイズ８００〜１　、０ＯＯｂｐを有する約４Ｘ１０’独立組換え０体を有する〕を高度に厳しい条件化で調べた。この検定では、インサート約９５０ｂｐ　、１１２０ｂｐ、３０００ｂｐおよび２５００ｂｐを有する４陽性クローンが確認された。１１２０ｂｐインサートの大部分はプローブとして用いた１１５０ｂｐインサートに重複したが、ｔｉｓｏｂｐインサートの上流端部より幾らか上流まで伸長した。　２５００ｂｐインサートは１１２０ｂｐインサートの５′末端から約６５０ｂｐの位置から下流に伸長した。２５００ｂｐインサートを有するＤＮＡを用いて、脳幹ライブラリーを再び検定し、２７５０ｂｐインサートを有するクローンを発見した。２７５０ｂｐインサートは制限分析と配列決定とによって、上記１１２０ｂｐインサート中に開始することが判明した読み取り枠の転写停止シグナルを超えて３′方向に伸長することが判明した。２７５０ｂｐインサートと１１２０ｂρインサートは共通にＰｖｕ　Ｉ［部位を有し、Ｐｖｕ　Ｉ［部位を用いて結合させると、ヒトニューロンのカルシウム　チャンネルα２−サブユニットをコードするｃＤＮＡを形成した。このｃＤＮＡの５　’　−１５６０ｂｐの配列を決定したところに第３表に示すように、第２表に示した対応１５７５ｂｐセグメントと９１．２％類似するこことが判明した。

ヒトα２−サブユニットをコードするｃＤＮＡを、哺乳動物組織培養細胞中に発現するために、技術上利用可能な哺乳動物発現ベクターｐｓＶ２ＤＨＰＲにサブクローン化される。

アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクションからヒト神経芽細胞腫細胞ラインＩＴＭＲ３２（受入れ番号Ｎｏ、ＣＣＬ１２７）を入手した。この細胞ラインからのポリＡ’　ＲＮＡ上で、全長ヒトα２−サブユニット　コード化ｃＤＮＡを用いて１ザン　プロット分析を実施した。あまり厳しくない洗浄下で、単一８．２ｋｂフラグメントが検出された。ウサギ骨格筋α２−サブユニットコード化メツセンジャーＲＮＡも８．２ｋｂと同様なサイズを有した。

■　ロ　■　■　■　■　■　■　ロ　■　■　■　■　■ａｎ　ｃｎ　ａ’＋　ζ力　ζ１　Ｃ口　ｃｎ　Ｏ’）　ａ’＋　（Ｊ）　ｃｒｔ　ｃｏ　Ｏ’１ここでは本発明を幾らか専門的に説明したが、当業者はここに述べたことから、本発明の本質に含まれる多くの変更と修正が可能であることを認識すると考えられる。このような変更と修正は請求の範囲に述べた本発明の範囲に含まれるものである。

本発明の種々な特徴も下記の請求の範囲に述べる。

手続補正書坊幻平成　４年工月ｌ／）日団同

Claims

【特許請求の範囲】

１．動物カルシウムチャンネルのα２−サブユニットまたは前記α２−サブユニットの前駆体をコードする配列を有するｃＤＮＡを含むＤＮＡ。
２．前記ｃＤＮＡの配列が哺乳動物カルシウムチャンネルのα２−サブユニットまたは前記α２−サブユニットの前駆体をコードする請求項１記載のＤＮＡ。
３．前記ｃＤＮＡの配列が骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのα２−サブユニットまたは前記α２−サブユニットの前駆体をコードする請求項２記載のＤＮＡ。
４．前記ｃＤＮＡの配列がウサギもしくはモルモットの骨格筋のカルシウムチャンネルのα２−サブユニットまたは前記α２−サブユニットの前駆体をコードする請求項３記載のＤＮＡ。
５．前記ｃＤＮＡの配列がウサギ骨格筋Ｔ管カルシウムチャンネルのα２−サブユニットまたは前記α２−サブユニットの前駆体をコードする請求項４記載のＤＮＡ。
６．前記ｃＤＮＡの配列が第２表に表したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列である請求項５記載のＤＮＡ。
７．動物カルシウムチャンネルの実質的に純粋なα２−サブユニット。
８．哺乳動物カルシウムチャンネルのサブユニットである請求項７記載の実質的に純粋なα２−サブユニット。
９．骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのサブユニットである請求項８記載の実質的に純粋なα２−サブユニット。
１０．ウサギまたはモルモットの骨格筋カルシウムチャンネルのサブユニットである請求項９記載の実質的に純粋なサブユニット。
１１．ウサギ骨格筋Ｔ管カルシウムチャンネルのサブユニットである請求項１０記載の実質的に純粋なサブユニット。
１２．真核細胞において第２表に表すアミノ酸配列をコードする配列によって、ｃＤＮＡを表現することを含む方法によって製造する請求項１１記載の実質的に純粋なサブユニット。
１３．製造方法において、前記ｃＤＮＡを酵母細胞または哺乳動物細胞からなる群から選択する細胞中に表現する請求項１２記載の実質的に純粋なサブユニット。
１４．第２表に表したアミノ酸１〜１００の配列を有する請求項１１記載の実質的に純粋なサブユニット。
１５．異種カルシウムチャンネルを含む真核細胞であって、第１種の動物のカルシウムチャンネルのα１−サブユニットの前駆体に前記細胞中で翻訳されうる第１ＲＮＡから本質的に成る第１組成物と、第２種の動物のカルシウムチャンネルのα２−サブユニットの前駆体に前記細胞中で翻訳されうる第２ＲＮＡから本質的に成る第２組成物とを前記細胞に投与することから成り、前記第１種と第２種が同一または異なる種であるが、前記α１ −サブユニットの前記前駆体および前記α２−サブユニットの前記前駆体の少なくとも１つが前記細胞にとって異質である方法によって製造される細胞。
１６．両生類卵母細胞であり、製造方法において前記第１組成物および第２組成物を微量注射によって投与する請求項１５記載の細胞。
１７．キセノプスレヴイス（ＸｅｎｏＰｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）である請求項１６記載の細胞。
１８．前記α１−サブユニットが第１種の哺乳動物のα１−サブユニットであり、前記α２−サブユニットが第２種の哺乳動物のα２−サブユニットであり、前記第１種と第２種が同一または異なる種である請求項１７記載の細胞。
１９．前記第１種と第２種とが同一である請求項１８記載の細胞。
２０．前記α１−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのα１−サブユニットであり、前記α２−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのα２−サブユニットである請求項１８記載の細胞。
２１．前記α１−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのα１−サブユニットであり、前記α２−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのα２−サブユニットである請求項１９記載の細胞。
２２．第１哺乳動物と第２哺乳動物のそれぞれをウサギおよびモルモットから成る群から選択する請求項２０記載の細胞。
２３．哺乳動物をウサギおよびモルモットから成る群から選択する請求項２１記載の細胞。
２４．α１−サブユニットとα２−サブユニットが骨格筋カルシウムチャンネルのサブユニットである請求項２２記載の細胞。
２５．α１−サブユニットとα２−サブユニットが骨格筋カルシウムチャンネルである請求項２３記載の細胞。
２６．哺乳動物がウサギである請求項２５記載の細胞。
２７．前記第１組成物の翻訳可能なＲＮＡがタナベ（Ｔｓｎａｂｅ）等のアミノ酸配列および第１表に示すアミノ酸配列から成る群から選択したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする配列を有し、前記第２組成物の翻訳可能なＲＮＡが第２表に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする配列を有する請求項２６記載の細胞。
２８．第１種動物のカルシウムチャンネルのα１−サブユニットの前駆体をコードする第１ｃＤＮＡと、第２種動物のカルシウムチャンネルのα２−サブユニットの前駆体をコードする第２ｃＤＮＡとを発現することを含む、前記第１種と第２種とが同一または異なる方法によって製造された異種カルシウムチャンネルを含む真核細胞。
２９．前記細胞を酵母細胞および哺乳動物細胞から成る群から選択する請求項２８記載の細胞。
３０．前記α１−サブユニットが第１種の哺乳動物のものであり、前記α２−サブユニットが第２種の哺乳動物のものであり、第１種哺乳動物と第２種哺乳動物とが同一または異なる動物である請求項２９記載の細胞。
３１．前記第１種と第２種が同一である請求項３０記載の細胞。
３２．前記α１−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチヤンネルのものであり、前記α２−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのものである請求項３０記載の細胞。
３３．前記α１−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのものであり、前記α２−サブユニットが骨格筋、心臓またはニューロンのカルシウムチャンネルのものである請求項３１記載の細胞。
３４．第１種および第２種の哺乳動物をそれぞれ、ウサギおよびモルモットから成る群から選択する請求項３２記載の細胞。
３５．哺乳動物をウサギおよびモルモットから成る群から選択する請求項３３記載の細胞。
３６．α１−サブユニットとα２−サブユニットとの両方が骨格筋カルシウムチャンネルのものである請求項３４記載の細胞。
３７．α１−サブユニットとα２−サブユニットとの両方が骨格筋カルシウムチャンネルのものである請求項３５記載の細胞。
３８．哺乳動物がウサギである請求項３７記載の細胞。
３９．前記第１ｃＤＮＡがタナベ等のアミノ酸配列および第１表に示したアミノ酸配列から成る群から選択したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードし、前記第２ｃＤＮＡが第２表に示したアミノ酸配列をコードする請求項３８記載の細胞。
４０．細胞内で活性であり、その転写活性が機能的カルシウムチャンネルから前記細胞内に入りうるイオンまたは分子に反応する転写調節要素を含み、インジケーター蛋白質の構造遺伝子に、発現のために操作可能に結合した異種遺伝子によって形質転換された請求項２８記載の細胞。
４１．細胞内で活性であり、その転写活性が機能的カルシウムチャンネルから前記細胞に入りうるイオンまたは分子に反応する転写活性要素を含み、インジケーター蛋白質の構造遺伝子に、発現のために操作可能に結合した異種遺伝子によって形質転換された請求項３９記載の細胞。
４２．前記インジケーター蛋白質をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼから成る群から選択する請求項４０記載の細胞。
４３．前記インジケーター蛋白質をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼから成る請求項４１記載の細胞。
４４．化合物をカルシウムチャンネルアゴニストまたはカルシウムチャンネルアンタゴニストとしての活性に関して検定する方法であって、請求項４０記載の細胞を前記被検化合物と、機能的カルシウムチャンネルから前記細胞に入って前記細胞内の前記異種遺伝子の前記転写調節要素による転写レベルに影響しうるイオンまたは分子との溶液に懸濁させ、前記細胞中の前記インジケーター蛋白質の濃度の変化を測定することから成る方法。
４５．請求項４１記載の細胞を前記被検化合物と、機能的カルシウムチャンネルから前記細胞に入って前記細胞内の前記異種遺伝子の前記転写調節要素による転写レベルに影響しうるイオンまたは分子との溶液に懸濁させ、前記細胞中の前記インジケーター蛋白質の濃度の変化を測定することから成る請求項４４記載の方法。
４６．請求項４２記載の細胞を前記被検化合物と、機能的カルシウムチャンネルから前記細胞に入って前記細胞内の前記異種遺伝子の前記転写調節要素による転写レベルに影響しうるイオン又は分子との溶液に懸濁させ、前記細胞中の前記クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼの濃度の変化を測定することから成る請求項４４記載の方法。
４７．請求項４３記載の細胞を被検化合物と、機能的カルシウムチャンネルから前記細胞に入って前記細胞内で前記異種遺伝子の前記転写調節要素の転写レベルに影響しうるイオン又は分子との溶液に懸濁させ、前記細胞内の前記クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼの濃度の変化を測定することから成る請求項４４記載の方法。
４８．ヒトにおけるランバート・イートン症候群の診断方法において、哺乳動物カルシウムチャンネルの実質的に純粋なα１−サブユニットとα２−サブユニットと前記ヒトからの血清サンプルとを一緒にして；前記血清サンプルの抗体と前記カルシウムチャンネルサブユニットの少なくとも１つとの間の反応を検出することから成る方法。
４９．第２表に示した塩基−２７〜３３１９間の少なくとも１２連続塩基の配列または第２表に示した塩基−２７〜３３１９間の少なくとも１２連続塩基の配列の補体から成る少なくとも１２連続塩基の長さの配列を有する標識または−重鎖ＤＮＡ。
５０．第２表に示した塩基−２７〜３３１９間の少なくとも３０連続塩基を含む配列または第２表に示した塩基−２７〜３３１９間の少なくとも３０連続塩基の配列の補体から成る配列を有する請求項４９記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。
５１．３２Ｐで標識した請求項４９記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。
５２．３２Ｐで標識した請求項５０記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。
５３．前記ｃＤＮＡの配列がヒトニューロンカルシウムチャンネルのα２−サブユニットまたは前記α２−サブユニットの前駆体をコードする請求項３記載のＤＮＡ。
５４．前記ｃＤＮＡの配列が第３表に記載されたヒトのニューロンα２−サブユニットコード化ｃＤＮＡによってコード化されたアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡである請求項５３記載のＤＮＡ。
５５．ヒトのニューロンカルシウムチャンネルのサブユニットである請求項９記載の実質的に純粋なサブユニット。
５６．第３表に示したヒトニューロンα２−サブユニットコード化ｃＤＮＡによってコード化されたアミノ酸配列をコードする配列を含むｃＤＮＡを真核細胞中で発現することからなる方法によって製造される請求項５５記載の実質的に純粋なサブユニット。
５７．製造法において、前記ｃＤＮＡを酵母細胞および哺乳動物細胞から成る群から選択された細胞中で発現する請求項５６記載の実質的に純粋なサブユニット。
５８．第３表に示したヒトのニューロンα２−サブユニットコード化ｃＤＮＡの蛋白質コード化セグメントの少なくとも１２連続塩基の配列を含む少なくとも１２塩基の長さの配列を有する標識されたＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ。
５９．第３表に示したヒトのニューロンα２−サブユニットコード化ｃＤＮＡの蛋白質コード化セグメントの少なくとも３０連続塩基を含む配列を有する請求項５８記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。
６０．３２Ｐで標識された請求項５９記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。
６１．３２Ｐで標識された請求項６０記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。