DK173404B1 - (alfa)2-underenhed af en pattedyr-calciumkanal, DNA kodende derfor, eukaryot celle indeholdende calciumkanalen, samt fremga - Google Patents

(alfa)2-underenhed af en pattedyr-calciumkanal, DNA kodende derfor, eukaryot celle indeholdende calciumkanalen, samt fremga Download PDF

Info

Publication number
DK173404B1
DK173404B1 DK199002400A DK240090A DK173404B1 DK 173404 B1 DK173404 B1 DK 173404B1 DK 199002400 A DK199002400 A DK 199002400A DK 240090 A DK240090 A DK 240090A DK 173404 B1 DK173404 B1 DK 173404B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
calcium channel
cdna
cell
subunit
sequence
Prior art date
Application number
DK199002400A
Other languages
English (en)
Other versions
DK240090D0 (da
DK240090A (da
Inventor
Steven Bradley Ellis
Robert Brenner
Mark E Williams
Michael Miller Harpold
Arnold Schwartz
Jean Sartor
Original Assignee
Merck & Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck & Co Inc filed Critical Merck & Co Inc
Publication of DK240090D0 publication Critical patent/DK240090D0/da
Publication of DK240090A publication Critical patent/DK240090A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173404B1 publication Critical patent/DK173404B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

DK 173404 B1 i ’ Den foreliggende opfindelse angår molekyler biologi og farma kologi.
Nermere betegnet angår opfindelsen calciumkanal-midler og 5 fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf.
Calciumkanaler er membran-overspmndende multisubenhed-protei-ner, der muliggør kontrolleret indgang af Ca+2-1oner i celler fra den ekstracellulare vaske. Alle celler overalt 1 dyreriget 10 og i det mindste nogle bakterielle celler, svampeceller og planteceller har en eller flere calciumkanaltyper.
Den mest almindelige type calciumkanal er spmndingsafhmngig. i en spmndingsafhmngig kanal kraver "åbningen" til muliggørelse 15 af en begyndende indstrømning af Ca+2-ioner i cellerne en de-polarisering til et vist niveau af potential forskel len mellem indersiden af cellen, der barer kanalen, og det ekstracellu-lare medium, som bader cellen, og Indstrømningshastigheden af Ca+2 i cellen afhanger af denne potentialforskel. Alle "exci-20 terbare" celler i dyr, såsom centralnervesystemets neuroner, perifere nerveceller og muskelceller indbefatttende sådanne 1 skeletmuskler, hjertemuskler og venøse og arterielle glatte muskler, har spandingsafhangige calciumkanaler.
25 Calciumkanaler er fysiologisk vigtige, fordi kanalerne spiller en central rolle i reguleringen af intracellulare Ca+2-niveau-er, og disse niveauer er^vigtige for cellelevedygtigheden og cellefunktionen. Intracellulare Ca+2-koncentrationer er således involveret 1 et antal vitale processer i dyr, såsom neuro-30 transmitterfrigørelse, muskelkontraktion, pacemaker-aktivitet samt sekretion af hormoner.„og andre stoffer.
Et antal forbindelser, der kan anvendes til behandling af forskellige sygdomme i dyr, inklusive mennesker, antages at udøve 35 deres gavnlige virkninger ved nodulering af funktioner af spandingsafhangige calciumkanaler. Mange af disse forbindelser binder til calciumkanaler og blokerer eller formindsker has- 2 DK 173404 B1 tigheden af Indstrømning af Ca + 2 1 celler som reaktion på depolarisering af cellernes Indre og ydre.
En forståelse af farmakologlen for forbindelser, der reagerer 5 med calciumkanaler, samt evnen til rationel opbygning af forbindelser, som vil. reagere med calciumkanaler til opnåelse af ønskede terapeutiske virkninger, er blevet vanskeliggjort af en mangel på forståelse af strukturen af kanal-underenheder og generne, som koder for dem. Det har således Ikke veret muligt 10 at opnå de store mængder af højrensede kanal-underenheder, som på det molekylere niveau krxves til forståelse af naturen af underenhederne og deres vekselvirkninger med hinanden, med cellemembranerne, gennem hvilke kanalerne tillader Ca42-1oner at passere, med Ca42 og andre Ioner samt med forbindelser med 15 lav molekylvagt, der påvirker kanalfunktionen. Med tilgangeligheden af store mangder rensede caldumkanal-underenheder kunne f.eks. funktionelle kanaler fremstilles og benyttes til screening af virkningerne af forbindelser på kanalfunktion og derved tilvejebringe et grundlag for opbygningen af terapeu-20 tiske midler, der påvirker calciumkanalen, eller forskellige kombinationer af kanal-underenheder kunne krystalliseres og få deres opbygninger bestemt med høj opløsning ved anvendelse af røntgen- eller neutrondiffraktionsteknik under opnåelse af endnu et grundlag for rationel udformning af terapeutiske 25 midler, der påvirker kanalfunktion.
Visse sygdomme, såsom Lambert-Eaton-syndromet, Indebærer autoimmunreaktloner med calciumkanaler. Den lette tilgængelighed af caldumkanal-underenheder ville muliggøre Immunoana-30 lyser til diagnosticering af sådanne sygdomme samt en forståelse af dem på det molekylære niveau, der kunne føre til effektive metoder til behandling af dem.
Manglen på information om gener, der koder for caldumkanal-35 underenheder, har hindret forståelsen af de molekylære egenskaber ved de fuldt udviklede caldumkanal-underenheder og deres forløberproteiner {dvs. de fuldt udviklede underenheder 3 DK 173404 B1 ' med signalpeptider knyttet til amino-terminalen) samt ekspres sionsreguleringen af calciumkanal-underenheder. En forståelse af disse egenskaber og af hvorledes ekspression af calcium-kanal-underenhedsgener reguleres kan tilvejebringe grundlag 5 for udformning af terapeutiske midler, som har gunstige virkninger via påvirkning af calciumkanalfunktion eller calcium-kanalkoncentration. Tilgængeligheden af sekvenser af gener, der koder for calciumkanal-underenheder, ville endvidere muliggøre diagnosticering af defekter, som kunne ligge bag et 10 antal sygdomme, 1 gener, der koder for sådanne underenheder.
Tilgængeligheden af et DMA med sekvensen af et segment på mindst ca. 12 og mere foretrukket mindst ca. 30 nukleotider i et cDNA, der koder for en underenhed af en calciumkanal fra 15 cellerne i et dyrs væv, ville muliggøre isolation og kloning af cDNA'er og eventuelt genomiske DNA'er, der koder for den tilsvarende underenhed af forskellige calciumkanaler fra det samme eller forskellige væv samt dyr af den samme eller forskellige arter. Tilgængeligheden af sekvenserne af talrige 20 cDNA'er af fuld længde, <j?r’ltoder for tilsvarende underenheder af calciumkanaler fra en række forskellige væv og dyrearter, ville bidrage til tydeliggørelse af struktur-funktion-relatio-ner 1 underenhederne, og denne viden ville på sin side kunne anvendes til udformning åf terapeutiske midler, hvis virknin-25 ger udøves via binding til calciumkanaler.
Spændingsafhængige calciumkanaler antages at bestå af to store underenheder på mellem ca, 130 og ca. 200 kilodalton ("k0") i molekylvægt samt et antal (antages generelt at være en eller 30 tre) forskel1ige nindre underenheder på mindre end ca. 60 kD i molekylvagt. Hindst en af de større underenheder og muligvis nogle af de større er glycosylerede. Nogle af underenhederne er i stand til at blive phosphorylerede. Der er uorden på området ned hensyn til navngivningen af de forskellige under-35 enheder af spsndingsafhangige calciumkanaler.
De to store underenheder af spændingsafhængige calciumkanaler angives heri som "(cO-j-underenheden" og "(a)2~underenheden".
4 DK 173404 B1 (o)j-underenheden andres ikke påviseligt i henseende til molekylvagt ved behandling ned dithlothreitol ("OTT") eller ned enzymer, der katalyserer fjernelse af N-bundne sukkergrupper fra glycosylerede proteiner, (a)^-underenheden har en nolekyl-5 vagt på fra ca. 150 til ca. 170 kO ved analysering ved hjalp af natriundodecylsulfat ("SDSn)-polyacrylanid-gelelektroforese ("PAGE") efter isolation fra pattedyr-muskelvav og har specifikke bindingssteder for forskellige 1,4-dlhydropyridlner ("DHP-er") og phenylalkylaminer.
10 (o)2~underenheden er noget mindre velkarakteriseret end (a)χ-underenheden. (a)2-underenhedens molekylvagt er mindst ca. 130-160 kD bestemt ved hjalp af SOS-PAGE-analyse i narve-relse af OTT efter Isolation fra pattedyr-muskelvav. Ved SDS-15 PAGE under ikke-reducerende betingelser (1 narverelse af N-et-hylaaleinid) vandrer (a)2~underenheden inidlertid med et bånd på ca. 160-190 kO. Det er ikke hidtil kendt, hvorvidt det mindre fragment (på ca. 30 kD), der viser sig at vare frigjort efter reduktion, er produktet af et gen, som er forskelligt 20 fra det gen, der koder for fragmentet på 130-160 kD (og de to fragnenter er følgelig forskellige underenheder af calcium-kanalen), eller hvorvidt begge fragmenter er produkter af det samme gen (og (alj-underenheden følgelig er ca. 160-190 kD bg spaltes 1 (nindst) to fragnenter efter reduktion). Der er vid-25 nesbyrd on, at (a)2~underenheden, uanset dens størrelse, og det tilsvarende fragment, der er produceret under reducerende betingelser, uanset om det er en del af (e)2-underenheden eller ikke, glycolyseres med 1 det nindste N-bundne sukkerarter og ikke har bestemte bindingssteder for 1,4-dihydropyridlner 30 og phenylalkylaminer, der vides at binde til (a)j-underenhe-den.
Henvisning heri til forløberen for en (aj^-underenhed betyder proteinet ned aninosyresekvensen svarende til sekvensen af den 35 fulde Inngde øRNA, som efter translation til slut resulterer 1 (o)j-underenhed placeret son del af en calciumkanal 1 en cellemembran. Forløberproteinet omdannes via forskellige bear- 5 DK 173404 B1 bejdningstrin til (a)j-underenheden. Detaljer ved bearbejdningen mellem forløberen og den fuldt udviklede (a)j-underenhed er ikke klarlagt, men bearbejdningen indebarer muligvis phos-phorylering og også spaltning af det primmre translationspro-5 dukt til opnåelse af denjfuldt udviklede (e)χ-underenhed af calciuakanalen.
På lignende måde betyder henvisning heri til forløberen for en (a)2~underenhed proteinet med aminosyresekvensen svarende til 10 sekvensen af den fulde langde mRNA, som efter translation til sidst resulterer i (a)2~underenhed placeret som del af en calciumkanal i en cellemembran. Forløberproteinet omdannes via forskellige bearbejdningstrin til (a)2~underenheden. Som i tilfalde af (a)j-underenheden er detaljer vedrørende bearbejd-15 ningen mellem forløberen og den fuldt udviklede (a)2~underen-hed ikke klarlagt, men bearbejdningen Indebarer formodentlig i det mindste fjernelse af en ledersekvens (dvs. et signalpeptid), glycosylering og eventuelt spaltning til opnåelse af, hvad der nu antages at vare andre underenheder af calciumkana-20 len.
cDNA'etog den tilsvarende aminosyresekvens af (a)j-underen-hedsforløberen for en kanin-rygskeletmuskel-calciuakanal har varet omtalt. Tanabe et al., Nature 328, 313-318 (1987).
25 ____________ ___________
Calciumkanal aktivitet, målt elektrofysiologisk ved hjalp af spanding-klemme-teknik, er blevet fremkaldt i oocyter af Xenopus laevis, når totalt mRNA, der er blevet isoleret fra pattedyrhjerne og hjertemuskel, injiceres 1 oocyteme. Det har 30 også varet omtalt, at calciumkanalhol dige praparater, når de blev rekonstitueret til JHpid-dobbeltlag, bibringer dobbeltlagene spandingsafhangig calciumkanalaktivitet.
Der foreligger imidlertid intet vidnesbyrd oa, at (a)j-under-35 enheden alene eller (a)2~underenheden alene tilvejebringer en funktionel calciumkanal i oocyter, Hpid-dobbeltlag eller i nogen anden situation. Det har for nylig varet omtalt af Hof- 6 DK 173404 B1 mann et al., Trends in Pharmacolog. Sci. 8, 393-398 (1987), at mRNA fremstillet ved anvendelse af cDNA fra (a)j-underenhed, opnået af Tanabe et al., var ude af stand til at fremkalde calciumkanalaktivitet i oocyter af Xeopus laevis.
5 Kort fortalt er der fundet frem til et cDNA, som koder for (a)1-underenheden af en pattedyr-calciumkanal (se tabel 1), og et cDNA, som koder for (a)2-underenheden af en pattedyr-calciumkanal (se tabel 2 og eksempel 4).
I et af sine aspekter angår opfindelsen således et DNA, som er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne.
10 I et andet af sine aspekter angår opfindelsen en hidtil ukendt, i det væsentlige ren (aV underenhed af en pattedyr-calciumkanal, som er ejendommelig ved det i krav 2's kendetegnende del angivne.
Ved en "i det vesentlige ren" underenhed eller protein menes en underenhed eller et protein, der er tilstrekkeli g fri for 15 andre polypeptidkontaminanter til at blive betragtet som homogent ved SDS-PAGE eller til at blive entydigt sekvensopdelt.
I et andet af sine aspekter angår opfindelsen en eukaryot celle, der er ejendommelig ved, at den omfatter en amfibie-oocyt med en heterolog calciumkanal, hvilken celle er fremstillet ved en proces, der omfatter administration til cellen af et første middel, som 20 i det væsentlige består af et første RNA, der i nævnte celle kan translateres fil forløberen for (a) runderenheden af en calciumkanal i et pattedyr af en første art, og et andet middel, som i det væsentlige består af et andet RNA, der i nævnte celle kan translateres til forløberen for (a^-underenheden af en calciumkanal i et pattedyr af en anden art, i 7 DK 173404 B1 hvilken første og anden art er ens eller forskellige, forudsat at i det mindste en af nævnte forløber for nævnte (a),-underenhed og nævnte forløber for nævnte (a^-underenhed er fremmed i forhold til nævnte celle, idet mindst ét blandt nævnte første RNA og nævnte andet RNA koder for en aminosyresekvens som angivet i tabel 2 eller som indkodet af 5 DNA-sekvensen vist i tabel 3 nedenfor, og idet cellen anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåden angivet i krav 6. Foretrukne celler til dette formål er oocyter af Xenopus laevis.
I et andet af sine aspekter angår opfindelsen en fremgangsmåde dl analysering af en forbindelse for calciumkanalagonistakrivitet eller caldumkanalantagomstakdvitet, hvilken 10 fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 6' s kendetegnende del angivne.
Vedrørende lignende metoder, der benyttes i forbindelse med oocyter af Xenopus leavis og acetylcholinreceptorer, henvises til f.eks. Mishina et al., Nature 313,364 (1985), og i forbindelse med sådanne oocyter og natriumkanaler henvises dl Noda et al., Nature 322, 826-828 (1986).
15 (a)2~underenheden eller (a)j-underenheden, der er fremstillet ud fra et s&dant cDNA 1 en sådan celle, vmre fremmed 1 forhold til cellen, dvs. vil have en aainosyresekvens, der adskiller sig fra aainosyresekvensen af en hvilken son helst calcium-kanal-(e)i-underenhed eller -(a)2*underenhed, son forekonner i 20 en celle af den samme type7 der ikke indeholder et DNA, hvorfra den ved hjalp af et sådant cDNA indkodede (e)j-underenhed eller (a)2~underenhed er udtrykt. Foretrukne blandt sådanne celler er celler af pattedyroprindelse, såsom COS-celler, NIH3T3-celler, mus L-celler eller lignende, eller gmrceller, __ ----- såsom S. cerevisiae eller P. pastoris. Fremgangsmåder til fremstilling af sådanne celler ifølge opfindelsen ved trans- 8 DK 173404 B1 formation af celler med egnede heterologe DNA’er til bibeholdelse i cellen som episomer eller (fortrinsvis) til integration i cellens kromosomale DNA samt derpå dyrkning af trans-formanter eller subdyrkning (eller gennemgang 1 tilfmlde af 5 pattedyrceller) fra en sådan kultur eller en subkultur deraf er velkendte for fagmanden på området.
Blandt sådanne celler ifølge opfindelsen er ifølge opfindelsen også omfattet en eukaryot celle med en heterolog calcmmkanal, hvilken celle er ejendommelig ved, at nævnte calciumkanal er fremstillet ved hjælp af en fremgangsmåde omfattende despression af 10 et første cDNA, som koder for forløberen for ^t)t-underenheden af en calchunkanal i et pattedyr af en første art, og et andet cDNA, som koder for forløberen for (aVunderenheden af en calchunkanal i et pattedyr af en anden art, idet nævnte første og anden art er ens eller forskellige, idet mindst ét blandt første cDNA og andet cDNA koder for en aminosyresekvens som vist i tabel 2, eller nævnte cDNA 15 har den i tabel 3 nedenfor viste sekvens, og idet cellen anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåden angivet i krav 6. Sædvanligvis er mindst en af de nævnte forløbere for nævnte (a),-underenhed og nævnte forløber for nævnte (a^-un-derenhed fremmed i forhold til nmvnte celle. Foretrukne blandt sådanne celler er atter sådanne af pettedyroprindelse eller 20 sådanne gmrceller som S. cerevisiae eller P. pastoris. X en foretrukken udførelsesforn vil en sådan celle også Indeholde et endet heterologt gen, son omfatter et transkriptionalt styreelenent (f.eks. en promotor/forsterker-kombination), son er aktivt i nmvnte celle, og hvis transkriptionale aktivitet 25 svarer til en ion eller et molekyle, som er i stand til at koerne Ind i nmvnte celle via en funktionel celciunkanal (f.eks. Ca++, Ba++, Ca++-ionoforer), og som er operativt tilknyttet til ekspression til et strukturelt gen for et indikatorprotein, såsom en chloramphenicol-acetyltransferase, 30 -lueiferase eller -Ø-galactosidase.
Disse celler ifølge opfindelsen, som har funktionelle, fremmede calciumkanaler (dvs. funktionelle calciumkanaler, hvori i 9 DK 173404 B1 mindst en af (a)j-underenheden og (a)2~underenheden er fremmed i forhold til cellen), vil blandt andre formål kunne anvendes til at analysere en forbindelse for calciumkanalagonistaktivi-, tet eller calciumkanalantagonistaktivitet. For det første kan 5 en sådan celle anvendes til måling af en sådan forbindelses affinitet til den funktionelle calciumkanal. For det andet kan en sådan celle benyttes til elektrofysiologisk måling af cal-ciumkanalaktiviteten i nærværelse af forbindelsen, der testes, både som en ion eller et molekyle, såsom Ca+* eller Bat+., der 10 vides at kunne komme ind i cellen gennem den funktionelle kanal. Vedrørende lignende undersøgelser, der er blevet udført med acetylcholinreceptoren, henvises til Claudio et al.. Science 238, 1688-1694 (1987). Disse metoder til analysering af en forbindelse for calciumkanalagonistaktivitet eller cal-15 ciumkanalantagonistaktivitet er også en del af den foreliggende opfindelse.
Sådanne celler ifølge opfindelsen kan i den foretrukne udførelsesfora, hvori cellen også indeholder et heterologt gen med et transkriptionalt styreelement, der er aktivt 1 cellen og 20 reagerer på en ion eller et molekyle, der kan komne ind i cellen gennem en funktionel kanal og er operativt tilknyttet til ekspression til et strukturelt gen for et Indikatorpro tein, også anvendes 1 en anden fremgangsmåde ifølge opfindelsen til analysering af en forbindelse for calciumkanalagonist-25 aktivitet eller calciumTcånalantagonistaktlvitet. Denne frem gangsmåde omfatter udsættelse af en kultur af sådanne celler for en opløsning af en forbindelse, der testes for sådan aktivitet, sammen med en ion eller et molekyle, der er i stand til at komme ind i cellerne gennem en funktionel calciumkanal og 30 påvirke aktiviteten af det transkriptionale styreelement, der styrer transkription af genet for indikatorproteinet, samt sammenligning af ekspressionsgraden 1 kulturens celler af 10 DK 173404 B1 genet for indikatorproteinet med graden af en sådan ekspression i cellerne i en anden kontrolkultur af sådanne celler.
En "kontrolkultur", son den tydeligt forstås af fagmanden, vil vare en kultur, son er og behandles 1 det vcsentllge på sanme 5 nåde son kulturen, der udsattes for forbindelsen, der analyseres, ned den undtagelse, at kontrolkulturen Ikke udsattes for forbindelsen, der analyseres. Ekspressionsniveauer af generne for Indikatorproteinerne konstateres let af fagmanden ved hjalp af kendte metoder, der Indebarer målinger af kon-10 centrationen af Indikatorprotein via analyser for påviselige forbindelser, der produceres ved reaktioner, som katalyseres af indikatorproteinet.
Som ovenfor anført er Indikatorproteiner enzymer, der er aktive 1 cellerne ifølge opfindelsen og katalyserer produktion 15 af let påviselige forbindelser (f.eks. chronogener og fluorescerende forbindelser).
Den primåre strategi for kloning af cDNA'er, der koder for (<Ol~ og (a)2-polypeptidunderenhederne af de DHP-følsomne cal-ciunkanaler fra kanln-skeletnuskel, var at screene kanln-ryg-20 $keletnuskel-A-gtll-c0NA-ekspress1onsbiblioteker ned antistof- DK 173404 B1 π sonder, der er specifikke for hvert af proteinerne. Se generelt Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology,
Mi ley-1nterscience. New York (1987); sent Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., 5 New York (1986). Monoklonale antistoffer, der er 1 stand at immunoudfelde Mr 155K-170K DHP-receptor (a)j-proteinet fra kanin-skeletmuskeltriader, har tidligere veret beskrevet af Leung et al., J. Biol. Chen. 262, 7943-7946 (1987). Polyklo-nale antisera, der er specifikke for (a)2-polypeptidunderen-10 heden, blev fremstillet 1 marsvin under anvendelse af aed SDS-polyacrylamidgel renset (a)2-protein son beskrevet af Nakay-ana et al., J. Biol. Chem. 262, 6572-6576 (1987). Et af de (a)}-specifikke monoklonale antistoffer, betegnet som 1IF7 af Leung et al. supra, og de (a)2~spec1f1kke polyklonale anti-15 sera blev benyttet til screening af Ι',Ο x 106 rekombinante fager fra et ol Igo-dT-priaerbehandlet λ-gtll-cDNA-bibliotek.
Sonder baseret på Tanabe et al. (a)^-underenheds-cDNA-sekven-sen (Nature 328, 313-318 (1987)) kunne også anvendes til identifikation af kloner med fragmenter af (e)j-underenheds-20 cDNA'et.
Når først en positiv klon var fundet under anvendelse af en antistof-screeningsmetode, blev klonen benyttet til yderligere screening for overlappende kloner. En sekvensraskke af overlap-25 pende kloner blev således dannet. Disse kloner blev sekvensopdelt, og fragmenter blev subklonet til enten pZBI 24/25 (IBI, New Haven, CT) eller M13 mpl8/19. Ved kloning af (a)j-underenheden blev DNA-sekvensen sammenlignet med den primåre sekvens af DHP-receptdr^·(a)χ-underenheden, der er omtalt af 30 Tanabe et al. Nukleotidfprskel le, der resulterer 1 aminosyre-forskelle, blev bekrmftet ved sekvensopdeling 1 begge retninger.
Med hensyn til (a)j-underenheden blev til at begynde ned to 35 cDNA-kloner, der reagerede positivt med det IIP7-monoklonale antistof, isoleret, og de viste sig at vcre beslegtede ved krydshybridisering.
12 DK 173404 B1 DNA-sekvensopdel1ng af en af disse kloner afslørede tilstedeværelsen af en cDNA-indsøtning på 453 basepar (bp). Vigtigt er det, at denne Indsatning kodede for en 151 aninosyrer åben laseramae øed 28% honologi til en region for "Eleetrophorus 5 electroplax"natriumkanalsekvensen. cDNA-indsøtningen afledt af denne klon blev benyttet til rescreening af λ-gtll-cDNA-bib-lioteket og et kanin-rygskeletmuskel Okayama-Berg-eDNA-bib1io-tek (MacLennan et al.. Nature 316, 696-700 (1985)) til Isolation af overlappende cDNA-kloner. cDNA-klonerne blev analy-10 seret ved anvendelse af dideoxy-kødeafslutningsøetoden ifølge Sanger til bestennelse af hele den kodende sekvens af (a)j-un-derenheden af calciumkanalen, og et restriktionskort blev fremstillet til sannenlIgning og orientering af DNA-sekvenser.
15 Et oligo-dT-priøerbehandlet ekspressions-cDNA-bibliotek blev opbygget i λ-gtll under anvendelse af ungt fuldt udviklet kanin-rygskeletmuskel-poly(A+)RNA (venligst stillet til rådighed af J. Robbins, University of Cincinnati), der var isoleret i guanidinisothiocyanat (se Gubier et al.. Gene 25, 20 263-269 (1983); Lapeyre et al., Gene 37, 215-220 (1985); og
Huynh et al., DNA Cloning; A Practical Approach, Vol. 1 49-78 (ZRL, Oxford, 1985)). Dobbeltstrenget cDNA blev syntetiseret, og EcoRI-adaptere blev tilsat. Efter tilsøtningen af adapterne blev det dobbeltstrengede cDNA størrelsesudvalgt på en Sepha-25 rose CL-4B- eller Bio-Gel A-50m-søjle. Fragmenter > 1500 bp blev ligeret til EcoRI-digestionsbehandlet og dephosphoryleret λ-gtll. Biblioteket blev in vitro pakket med "Gigapack-plus" (Stratagene, San Diego, CA), og en effektivitet på > 95% re-kombinanter blev bestemt ved pladedyrkning 1 nærværelse af X-30 gal og ZPTG. To kloner af 1 alt 1 x 10® rekombinanter blev identificeret ved screening af ekspressionsbiblioteket med monoklonalt Ab ZIF7, der reagerer aed Hr 170.000 (a)^-underen-heden af kaninskeletmuskel-calciumkanalen. Positive plaque blev gjort synlige ved binding af HRP-ged anti-mus IgG efter-35 fulgt af farvefreakaldelse med 4-chlor-l-naphthol. Hver klon indeholdt en - 500 bp indsmtning og var besløgtet via kryds-hybridisering. En klon blev DNA-sekvensopdelt til identifika- 13 DK 173404 B1 tion af en åben laseramme (nt'er 2847-3300) og blev benyttet til identifikation af en 6,5 Kb transcript ved hjalp af Norther n-analyse. Den ovenfor ontalte 453 bp indsatning blev benyttet til rescreening af λ-gtll-bibHoteket, og 8 ud af 1 x 5 10® kloner var positive. Tn klon (1700 bp) omfattede den fjer neste 5' til nt 2237. Dens 522 bp Pstl-fragaent, nt'er 2294-2816, blev benyttet til screening af 1 x 10® transformanter, et kanin-rygskeletauskel-cDNA-bibliotek, der var opbygget i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Okayama og Berg (se 10 MacLennan et al.. Nature 316, 696-700 (1985)}. Tre positive kloner blev isoleret, hvoraf den største (5,0 Kb) omfattende 5' til nt -750. Okayama-Berg-cONA-biblioteket blev rescreenet med et 5' 250 bp (Pstl)-EcoRI-fragment (Pstl-stedet tilvejebringes ved hjalp af Okayama-Berg-vektoren) (nt'er - 750-15 1006). Den langste isolerede klon pft 5 positive var 5,3 Kb, omfattende 5' til nt -450. Til kloning af 5'-enden af (β)χ blev et randomprimerbehandlet kanin-rygskeletmuskel-Agtll-cDNA-bibliotek syntetiseret som ovenfor beskrevet med de følgende modifikationer; (1) pd(N)6~hexamerer (Pharmacia, Jnc., 20 Piscataway, NJ) blev benyttet til random-prime af den første cDNA-strengs reaktion, (2) adaptere indeholdende Ncol-, Kpnl-og EcoRI-steder; 5'-CCATGGTACCTTCGTTGACG-3’ 25 3'-GGTACCATGGAAGCAACTGCTTAA-5' blev ligeret til det dobbeltstrengede cDNA som beskrevet ovenfor, og (3) dét dobbeltstrengede cDNA blev størrelsesudvalgt pft en 1 al "Bio-Gel" A50a-søjle. Fragmenter > 600 bp blev 30 ligeret til λ-gtll. 1 x 10® rekombinanter af dette bibliotek blev screenet dobbelt med 1648 bp EcoRI/Xhol-fragmentet svarende til nt 1005-2553ogen oligonukleotidsonde spandende over det initierende methionin: 5'-GGGAAGCCATGGAGCCATCCTCACCCCAGG-3'. Fyrre kloner var posi-35 tive med begge sonder, hvoraf den ene (1,55 Kb) omfattede 78 nt'er 5' fra startcodonen og -450 bp 3' fra EcoRI-stedet.
14 DK 173404 B1
Tabel 1 (nedenfor) viser den 5975 nukleotidsekvens af cDNA’et, som koder for (a)j-underenheden. Der er en 5619 nukleotidse-kvens-laseramme, som koder for en sekvens pi 1873 aminosyrer (tabel 1). Den angivne initieringscodons sekvensopbygning 5 stemmer overens med den foreslåede consensussekvens ifølge Kozak, Nucleic Acids Res. 15, 8125-8132 (1987). Den 3r ikke-kodende sekvens af cDNA'et er 234 nukleotider 1 lmngde, bortset fra poly(dA)-omridet, og indeholder et consensus-polyade-nyleringssignal ATTAAA (nukleotider 5832-5837) 17 nukleotider 10 pi opstrømssiden fra poly (dA)-området. Denne cDNA-sekvens stemmer overens aed en ~6500 nukleotid DHP-receptor (a)j-mRNA. DNA-sekvensen er endvidere 99,4% identisk med cDNA-sekvensen, som koder for DHP-receptoren, som er omtalt af Tanabe et al., supra. Nukleotidforskelle blev identificeret ved 33 positio-15 ner, hvoraf tre, nukleotiderne 5423, 5444 og 5504, også resulterer i aminosyrecndringer, 20 25 30 35 15 DK 173404 B1 ocooecsoop — 2 »* · — o *» — «· 5 id — — U O O 5 O e 3 OlU uld u C 0*< SID U-0<dOUOO— D DI U Ml ur·*- · m -- · Oiu X|C < · Ot< — ·*» O * · M —MM · O U - ©1 u —«
O U U U -J M — — i 13 O — <M — UO — OM — UV r«|U M
< ϋ D O© U 3 UC lu· UD 113 3 1} 3 K>- ίϋ · H U k U k — * M ·( 1 — — C. 1— · — · t— * «— — U U V U V U må MM |M — U < IU -U U U O > I^M — < o · uc »«3 udIuu es l— ψ uv uv u u < v < I— · < * m · — · »— — o — u— m — y < -i < < u u om i— V» u _j |< — u u uo u z O 2? O C u · *- C lu · U w O · U lu u u · » 3 v M — — — M · »v X «V u — u — |U · — x g <«J uo M — o< - v *- — U M U< j·- m — v u uo oa u · oa lu— u· o*. < v lu — 03 w U — — · — — « — I- U— |U £ U— *— · — ·
U UV U _J M — O u |U > W< JM. — UO !U> U mJ
50c u u uu ue iu w u a ιο· < · iu 3 uo U X U X U k U X M · I— X Μ v i— · U k
u UO M v M — UV j< — U< f— V M U IU U UV
o li! < < · 03 lu 3 U— lu 3 OC lu— U - IU Dl U3 u <v — · M — — · i— · M — *— O· iu * — · o < -J u U O o < a iu U U U jo > MM tu < u u 2 O · U · O· UO lu· U· IO V O k lu 3 o — o M v O v —X U - 1— X < — IU— O· t— · v · < < -j — u — v UV j— V U Z jo O MM IU J < a O OD U · u O 03 lu· U· 10 3 O— IUO U· o Du — £ U - — · 1— X v X I— · v · IU w U — o MM — V »UV U U — V *- V uu <3 |u V o< — 0 3 0 3 M U u Uu 03 lu· OO K D O·
lH O — · — · Μ V «V Μ V — · I— X U k IU k Μ V
ej g U mj Uu M u —— —— u_i - v uv ιμ M < fl O UV — · U O lu— 03 u · lu— U · iu 3 u · ¢3 K o— u— υ» <— » m — u x i— · u— i— · — x
o O O o < V - ju > O O —V jo > D< ju U *- V
U 03 OD <3 IU· 03 UV lu· Ok IU— U · O · — Uw · — IU— i— U — ·— — U Z i— · » — O OO U< OO |U< IU mJ UO |M — M — IU > M — •c — a po o— lo 3 o· lu T lu· uc l— o uv 2 li S Kr ni · < v < v, i- — <· 10 k u · £ o < UV O > jU u < U — — |M — IU m. — *n 5 OC O0 u · |U· 03 U · IU· Uk lu· uc i i. T· U k — — IU— M— U— I— X O· i— X <· O UO UV M— IU < OO t> < ·— V MM I— V M< 2 OO OD Uk 10— 03 u· iua OC lu· U 3 y UV M< MM je^> u mi Μ— ΙΟ M UO |OM U mi ir K 0 U· in* U V U· lo 3 U· IUO D — 5 ϋ Si Kr 10 v o— i-· - - 10 k —· o VM uv M- |— U OO <— IU mt <- mm O > O u· S2 y * iu C 03 O· lo- U - lu 3 o - O U · — · O V *m · — · MV I— · — m 1— B — · — VM U mJ v u MM U mi |< U jU> O > lu J O > u 5e K ~ K* u · u c [o- lu c u c lu· oc ir Kr Hi U — u— Μ· — · ·Μ· <· IU— M —
5 U ^ O > OM OM MM M3 MM II) < UO
O 03 03 O· - · 03 U· ΙΟ α U- ίθ· 03 O OO O O < U j— V U mi ΙΟ M jvv O > |M mi —ml o H Z K 0 Htt U· Ov U- luv O C. lu- V ν' o V· Uk Ok — — O · U — ΙΟ— M — 1- O·
M3 UV MM IM — vM ΙΟ M »O O UO »U> MM
16 DK 173404 B1 α ο ο ο ο ο ο ο ο ο »· « · ο Μ) η C Ο c Β Ο » Λ W Ν κ Β Ck 9 ···»» DUhOOSOOSOUbOOB ©to 31 0030030UBD<3 rw O — ·*«—*£»«—©— ZOO·. r* ·_ e a* — ©<— ©*9©* — >«υυ*·υυηϋυΜ»^η·>ι> ηιυ «j wwonooniM^otf O · — C U h ~ U H Uh lu 3 O* o 3 ti 3 O h ^ -i << < v> uo iu j <-* OO ** *- 1U · O 3 UH O· U S lu· Hi uc u “ os
— Λ < — O— — Z — · » — — U£ < — v* V B
— O. OO OO — ft. U-Jj<— < *“ O O O > U _/ U3 O —" O C ΟΓ O— lu 3 O · O C UB Oh — © > . <91 4 · V» ·— © ^ i ^ " < · O· u -i o> << « < o> u u “ *» oo o < <m 03 < h U · UB val— w <S O · O — <3 — ur — — «· <· u a «7 3^ »r · 5* os u · ο». u · <w o— H *“ !?3 u« Ri ju-j o< < — — ft. < — io > —— o o o > < — iu h, o — o·· u· oal—· Jrr i H ° ir3 H ®
~ IU — -· Oh < - Oh»— a »£· L, i Sm uJ
4J IOO o> — U U S — — |— b. J< ·* U ^ ti o o< u lu· U · UO Oh Uh. Ow Ju S 03 U H Uh 4J — — — Uh U £ O- K Η Γ * Γ · Ρ,Η ϋ · μ ja — < — o o. a — oo i— — !υ u J tso *- *«
‘S lu · UB UO U · 03 Ιυ· H · o C U H
fa — o «< u< a — oo|<— u> < -J uo oo ^ lu· <h Oh. u»· o— »o a H*· ta c Oh < h o iu < «V oo OO <3 i— — oo UO < — oo e )Uh Uh» Oh u· Uh IU O 10 3 U · U· 03 C Ia h, O — U · a — U £ iu h I— · — — — — < —
^ I — — oo vvi u S < — lua. ju u — u a — OO
lu· U · U>» uc υ· « Q »o— U - OB <3 ja - a - oo 5< < - - - >o> 1- vv oo lu· Uh Oh U 0 U · 03 It? 3 <h» Uh 03 ·— — < >* U £ Uh OH « — β O O· V*
f<— — — < — u*. — u OO IO u OO — mJ
iu- Uh OO OH oc UC £ OO O- Uh 0> V— oo U O < < < << — Ml lo — U· h OO Uh 3 h ιυ 3 Uh Uh 03 · Oh O— Uh < H O— i— · U· < h — · a v u o< uo. —— oo j u u —vi v— u mi IU· Uh U· OB O— u · !U · ts · UH o· #-λ u x oh Oh - · X— T" <7 g-
lu 3 O· U© uh Uh U · U· y · OO
i— · <h Uh o— u £ u — *r H 7 “ 2 Kr.
lUhJ <hi UO. OO <— U < l *“ t»< U < oo
IU- u· Oh UH U3 — O. |tf® ti" Z · 2 Z
3? 5Ξ ϋ5 S3 35 55 f- 55 35 bs 21 SS g? 2 X ΰ S IB 5 S3 - ? 55 IU-1 <3 UH U < <3 55 {-*" tso o < << 0 3 O· O· ua Uh “2 Jf3 I— · <H <h OH υ· — λ ΙΟ— O h ·— ·-* IU J <U <*J — U vV» o> lOOl U< .o o u u 17 DK 173404 B1 ouoeuooooo «βι^Β^ΟβΊΒ^Ο O O — Otu 910 O 9 ©IO 91010 DID O te om Mt o o · otu 9>o u · W — · tf · — ·ΙΟ — · Οι— tlOx o £ tf ·< MB O — O«— ·lO — £ tf o > tf tu wttf u mi **|o wi<riio · [*» < — w»t< w ·i o < ru^iB»i.
— o lo· o & lo— lo· o— lo w o· o c o C
Uw t— — O w t— · t— £ — · IU £ *- — < — tf · u*< »< — ►- — j< 3 — ft. <3 |< — <— jo o << oe to— oo lo a o o o· lu· o w to- oa tf · I— — · Itf — Ok O— I— — O · — · < · << jo > uw jo o o< o < j< — — *» lo o< oa lu 9 oo lu· lo c o w to · uo o w u · O·. »— · Ok. »— — ttf · O— I < W Ow o— — c.
— — ju o Ok jtf — t< < o u o u tf lu u — v.
O C loa OC jo te lo· Ow lu· U· IU 9 UC
uo j — — UO j< — i— w — tn j— 4. tf — ju o tf tf u o lu w υ c lu · lo · 09 lu 9 owtua uw
Ote KW tf · i— JZ i— — < — i— · O· »— · O· < tf |— — tf tf — W K — OO ju W — ** IU o tf ** oa to« O lo 9 Uw O— ID O UC lo· uo
Ote I— C. tf — »— · O· — to te tf· to- Ute _ — — j— fc. U 3 O O — V» o> |tf tf << jo< u<
ΰ U · IO — O · <W t»· 10 3 lu 5 U 9 ΙΟ · tf O
a tf — i— tf— o· — · l— · — · — · ·— £ Ote “j U X lj£ > ux — V» <3 jo w o w U w j- w O tf £ tfO tfO 09 09 U · lo 3 U3 O 9 lo · O — ,2 O» Ute tf— — · — £. »— · I— · — · I— — — m 3 u tf tf< O U U O — W ju w O W UO K — o > . o · Ow Ote 09 Ute lo 9 O o Ute lo· <9 1-1 — — o· O · F— · < W I — · O te o · — tf —
tf— — V» — vn U w — — to w o tf te · jtf — OO
Φ U · O· O tf lu- OC lo 9 U· O lo· Ote -2 — C tf te O— i— tf — Itf— — — O— t— — U £ g — W tf W Otf 0> UOjOO tf— O tf jtf — tf — oc u— o· tf h u o |o o o· o— lo· ua tf— — · i— — Ute Ute l— tf o— — tf i— £ <· UU U> ttf— otf Otf U U — U O > — k o < o· 09 lo te I— C 09 lo· oo 09 Ιθ9 09 — — — · IO· Itf· — · i— — Ote — · t— · tf —
tf— OO J— tf* jtf tf Ow [tf — Otf Uw ju w OO
U· oo |U 9 lu· UW low 09 UC O · o · — — tf · — · jo- O— ΙΟ— i— · tf · i— £ — £ tf— u< U W i O tf U JjJ jo O [— w tf tf j— te. — w.
tf· — · Ow O · lu 9 lu te IO— Uw lo 9 UB
tf w tf— V £ — — j— · lo· I— tf O· I— · «· tf -> US tf— tf— ju W jtf*» ju > tf*» uw u tf ue o· oc oa (ow lu ·· lu te u 9 lu 9 ow tftf -o tf tf Otf jo O j— U j— tn UW ju W — —
09 U · 09 tfC lo te lo— lu· Ote lo 9 OO
— -i tf—· Uw UO j— — |U > »tf— — *» Ow u tf uw 00 O · 09 lo— lo— U*W ow 09 ow
OO — — otf w w |< 3 ju > O O tf— Ow OO
09 OO O— ua O· lu· 09 O "o! 09 OW
* “ Ute ;— · < te tf W i— jc ·. t Ok. — · o —
OO otf 0> Uk tf w i— w Ow — — low O O
U· — · lo· Ote 09 lo·* OO Ute Ow lu ·{ · — — — £ J— — UC — · IO wJ Ote ttf w o· — £ — w Itf— tf— Uw *— U OW I— —I — M I— 18 DK 173404 B1 o s o te *» o » DU«· O I— wlOlU · «X ·- · W*< MtDIU ~ <p < a «>*— — i©ju < IS — lu · IU · — m i— — i— — | o > < - « -|
li w O · ili «I
U · O k. IU — ^ M — O iu < li C u - I (S 9 < · — »— · < < * u > IU mi o o. u "5 lu · υ w >— · i» jz k- *» u U | — ft.
o a — — iu — < · — · t— m U < IS > |U >
l* 9 U k. i— C
* — IS — l< · ^ u υ u o *< < ti *- >* o o tis 9 S IS — u w I— · ® o ο υ *. ju u ^ U b O h. IlS 9 o u Λ << k. i— ·
« — fk IUJ
w I
CS 9 Uh |U* — ft U · I— — M U .4 —' ·* |< — v o — od i- w <3 — « U w < k.
£ O > U l. — — IS C U k. u c ^ O “ < · U IS l> (S < < U · < k* U k.
*- C IS — o —i
k- ft. u is ts IS
U — U w u ·
— · < k UH
υ > c ·· — u U k. u · u — IS · u — - · < vi υ < u > u · O — — · k* — — · I— &, < — < a f— ft.
U 9 U · 1-9 . >- · — I— ·
U mJ < — lu «I
U m IS k* IU · u — IS — I— — IS < IS IS < — is c u c lu · « — « · *— — u u < < j< — UD u w. IU · u to * k* i— r U l — — I— I» DK 173404 B1 19 © £ O O O u U o o o
^ O C f* c w D c ^ B
O *· — n rv n <* ^ vt «% O O 300 — O U 3 O U O O O D O U * OtO BID U O Olu wlO O · O < — O — · *» — » * < * O U » C — r OIO toI Γχ < · «»u ri<0 < *.
βΰυΝϋ>Νυ^^ο<κυι>κ·-ι, ei· —to o < ex »io < 03 ►- ·- O· — UO U · Uw o 3 lu e u · « — U · < ». U — O*. i— £ U— < — »— £ « -.
O O ·“ ·" < u O < U < — a. < ·- oo j— u — u · u. U < to OO U to U « lu « lu · 0 3 U “ 5 *· U — U · U *. u · O— U — IU— — · o < < U O < *· *1 U L ►· M 0< O < IU < U mi
O· 03 ·· w ► C i O Uh UC u 1— · UB
< *· « — .. u Z U to Ok O· « *· u — «— — ^ £ < u OO < — o*. U < « vt « «, o < i« — «- A.
u · OS'Ufe Uto UO u m U — 03 1— o o· u ·· « “ or < ** Uh. u— — · — · *« rn u — o < OO « — — *- U fc. O < O > U u io< o< O» 03 ue UO Uto <3 U · O · I— · u>> 3 k f. “ U to U to O· < - — — U · I— £ o —
< w O O UB. UB. « «η O O « — O < i— 4. OO
< c O to U · U C O- O O U O i— · — T |“T| “ U — — — « · — · Uto Oto IU— < K X >«i UO « — « - 0< O > UB. U < O < — — i — to.
O« OK U *» O K < o U · U· — to <k lu w U- O- < to. Uto ·- — « — OK o- IU £.
Λ u< < u oo « w u 4. <— u : < k oo I « — +} Uto UC 0 3 O- UK UO - m Uto -3 l« w S u· « " m — to« — — u» o >* i o k — * |u r W »-κι 0< OO 0> «<— u i. — U i < m u «/ I « — O Γ, ? Γ° K ** U 3 «3 O - 03 lu 3 UK lo - ur u to o — « — ·— —· to»· i— · — to i— · M «to U B. oo OO OO U> U u U J « - |<3
, “2 to2 Ϊ * y£ r 0 * U - lo 3 OC IOK
M U«I U U <«/ « « U U O < O > |(J U UO j < Q) Uto to-K UO u — 03 OK — O lu· —c lu 3 •Q O· O— U to to· «to « to O to ·— to « · I to · g «·* OO UC. O > OO <to> U « j«- « « u" 03 O© OK U C U 6 03 U — |U· O© lu - OO «< < u « « 0< OO 0> I— 6. «< jo > U· U toto. OC — to 03 «κ O* lu 3 O— 1—· u - u O«., - - U· «to < to «toito· to · ito to o < — UO toV* OO «.«# «.«i |u U O > i« — 03 o— 03 «3 03 U 3 — C |θ3 U to 10 3
WO <3 U U O ϋ U O U ^ tf < I g ^ ^ ία JO O
!?to u2 o · ir o c u to u · 0 3 ίο υ— s·· ". £ «· «to ur I to to to — «to · o < «..J U U — C. O < uo « — I« to oo (O > O 2 US 0 3 U O lu c O« -to ® o·. «* «— «· a»· Uto i— r u — ur U m* < < < J o o__o < u U U k |— ·. o< « — «2 Se i?to 7 2 R w o a lu c o© u e ^ * W ^ tf ^ tf ^ U · tf V O# l< m U . \mm ^ u< l>< OO OO tf M W < u < I— £.
mm ml ,U, * U Z 0 ue UK |u to U · iu - u « <«j O < O > U ·. 0< — i. !« — «to jo > l°-l ° 7 Ϊ r U · 03 U· lu· UD I- to }— · O to to* « ^ — £ —· toto }_ £ u to iu ·
io >1 < < <3 * mJ ·“ A. Uu « — I— i, UB. I to VII
DK 173404 B1 20
O O O O O O O Q O O
O » te e * o «ø te b »O — -* « n © O O···" k r» m n n η η η η n
OtU 3IOIO C* O U » OIU «ΙΟ ©3DUOOO- O O 3 O O 3 DI» ©I
Οι» BIOIU fcin O te 4 » £119 — « CD U te O — · r· » *> 4 < — Cl·. £| oiu o>i© ©i© » u οι— via u.jbuv©c> o u .j D O U o·— ^1 i- *- 1<3 O C O C UB U B U C ” O 3 *" O — ""lu · u · ·» © - i© - < · 4 © κ m - « Z. m »~ — }- VI iu u u o lu o o < o < © < U Z o > |< -
IO — ll>— U — lo 3 — c o k UB OC < o UC
o> jo > O > IU J © < oo O < UO U « << u · t< O O — lu 3 u UB — · UB UC O — o< i«c © o > iu mi t- u o < — 4. ua. © < j« 3 lo— lo 3 U© Ote Ute. O© U · OB U C IU — ·— · »— · « - U £ υ· < K < - Ote < i·· · |U> |U U 3 © »- © vt V «I U S ·· — << l< 3 lo— lu© O© U te u© Ute U · < te Ute lu© <-· —- ©te w £ — -c < *» » r o- © >- »— r o > © — < «J © — te»·» ·» — te- 4» OO ·-»* I— V.
10 3 o© 03 U— U© o— UB 03 » — |u © I- © < >» » · ·— © — £ — © © © — — « i— £ Λ |U J <tei » -i |o> — i. o> o < oo o > i— v u i« 3 |< — Ote lo 3 O© tete. — c U© UO lu© » I— · — O— I— © < te < te < m — £ Ute IU — » IU _J lo > oo ju »J < j tete- << — *» UV. jo © M lu B O — I© · |u — U te U te U · U te U te I— · 0 »© © te« < te I» o— © te 4 — U £ O — i— — JW JO © o > <u jo > oo tete- U S ©te oo j© — 10 3 Ute U m lu · O© u te K · U te O— lu 3 iH ·— · U© U— I— — ©te ©te — — U© — · i— · |U «J tevi o< »©— ©«I te— K — te V) <a |U j « lu© U© ©O U "c io "©I Ute OB O- UB lu © Λ — — te— Ote © I— £ O— Ote — · © © — — g <— © — <© © < j— V oo tete o> o< © — UC Ute uC O te IU 3 OB OC Ote 03 W© 5© ur »<© o— i—· o*. ©— u £ ©— i— — < < © — (<< oo |U © < uo ©- OO J© — U© Ute lu© O© lo C u© UO U© 03 lu te »— r O© i— — — — 14— Ote Ote — £ ©— »<<*> J— V © VI 4 — ©— juo teU U< — *- OO I— — lu te Ute U© U te iu — 03 ue U 3 uclu© * © te u© u— U£ I— 4— U te te© 4» »— — I— — te-V! o© ©— |0> oo UV U U © © j© — UC 03 ©C* UO I- te 03 UO Ote Ute IU© 2 · Γ. Γ. *#5 o te io - ©- o*. u© u · i-- © © oo o© u< jo O OO U© — VI — ©i t © — UO U 3 03 U · U · <3 03 O- UB lu©
Ote — · I- B — — I— — © — — · — · ©« t— £
u< u u-j ©— J© — OO U ml <3 o© j— V
U© — te uo U « lu © < te 03 o- < · lu · ον. o— Ute u— i u te ur ©— te© —— i— r "* O OO UV O < j— U < » oo <3 © ~ I— te u© o— oo o— iu© o— o— u© u© lu© *-»· <3 u< 0> jo © <3 <3 o© O « —
Ute UtelUS u · lu « O© OC Ote oo lu© u · u© ·— · — £ i— £ ©te ©— U© Ote lu — — ©> — m U mJ — k |— te < _I uo » ·Λ ©< IO ©
Ute u · O- o- IO — Ute Ote 03 Ute lo — J2 · — - — · — · ue ur ».© <*»»—· oo I« — · O > d> l<3 »-M ©— Utel » — K 3< 21 DK 173404 B1 OOOOOb o o b d
^ ® « B O (0 π B
*',ηΠ^^(ήββΚ».
*”> n r»nnn ri »·> ri r> O U 5 O U » Ol- Bio U k OlU BIO U ODU k D O κ O κ — IO U · ' B < " O C ΚΝι- £|Ί < >>Βι> »IB < r D u · N υ · ^|ρ· BIO r £ O O U — κ O *-1— B. I — κ κ k*< — ϋ<Ν<ιηηυΐ} Nit! >m k a.
U O O lu kl UB lu b' < V. IU 3 ~ U B "lo o»" 15 k
UK 15 w K>J o- I— · O K CJ k U X
— u u < ·— —I us *a — ου |U U K U |u< a κ UC — 3 u k U C lu k UbIub UkIub uo a B κ B UB a — u X »· £ i- — U · *k £ u I.
<< U U M ^U U ja » K K ja — υ o I«- K κ κ ue <0 U k IO·* lu t — W lu— UK lu 3 U 3
a k U k UB — B t— £ < K *— B u— I— B — B
< u UK —Bl <3 I— K K — U > UU lu U U m*
Uk UD Uk UKIUB U K lu O — K lu BV U 3
ak Uk U X U » IU - t5 — Kb U— u b — B
— — o a a — uu jo a ua i l> a uu iu< u u U3 UB U — U 3 ll> — U D 1— B uslua Uw UU U< U> |U u |U> a < U u j— K a —
Uk UB o— lu » ·— C UB lu B UB |u B UO
_ ux < k — iukkb u - i— — uk i—x Uk £ a κ < U U > j- u ja a U< ♦ < — — u — K U< S U3 U3 U k IL) · lu 3 UB U k — k UB u —
!j a - KB < K I— — »— S < K ju B < K U — —B
μ UU U mJ kk I < — IU U < u la Π kk UB tS >
2 UK UB U O lu k UB IU B| lu K U3 Kk UK
Ci O — U — Uk IU X Kk I— X IU— K* IUB u — UU U< KK >< K < — j— K IUU U U »<V»I uu 1-1 UC Kk U — U C UB IU b lu B < k " k U 3 B K < W K B l< B Mm IU K |k ·> u K UB 4 k g UU KK U > j< a O a »u< la κ UU KBI uo 3 U 3 UC UC lu 3 <k (u 3 u - uk UB Li's ^ UU UU uu |U K*% *— ju > uu a — U a
UC Uk Uk IO — UB lu 3 |U B Uk UD UD
*» " k B < k ·— ® k - |k · IKK UB Uk Uk UO U> KK l< 3 a — lu u l< — a V) U < U < UB KB UC lu B UB lu B lu 3 Uk UB Kk
KX CK «Κ ·— — 4 - l< k ·κ b UB U— UB
Kfc KU UU |< — U 3 <«j JU kl k n U< a Bl
Uk UC Uk lu 3 UC U 3 lu B ua Uk IU 3 UX a — a K KB ^ · — B i — X U— UB I— · a κ uu kk u _j a a u u i— k u< a m u _j κΐ is® i® H · ° “ — · lu O U3 U 9 U 3 « > ua uk oa < 3 ja — ju < u uu u _j
IUB UC UC UB U 3 lu K lu B UB UO UB
k < - a * |k £ ^k )· · i_ £ k £ a < k a- u o a a j- κ uu <3 j- Z -ί u < κ· Ϊ S 2 · !° * w 3 0 3 !u - Kk a o ub |o> aa < ^ j<3 uu uo jo> a— u κ ja —
»KJ UB UDIU3 Uw U3I-C Ub Ub US
a Uk - t ub kb la * a· a · j-K a mi ub. ju -i -η iu .j ja a ua u a u ^
j U K Ub UB luk UC Uk [ub UB KK UD
iu — < k k ia k a k u x (u k k k k e u k jou ua a- -K uu a κ 2 i a K u > .< < |U K U 3 Uk la 3 ub u· tu o u 3 u e u κ io > uu kk iu u u: Ik k lub uu aa κ a 22 DK 173404 B1 e* O Q o * o (0 «· B B B o
« « Π T
OIU ·ΙΟ U · O u D < O
B»— — IO ·- — IMO— ▼Uw e*>« - 2<”'nu<riU·- ιυ · u c ua *— £ ·< — U«k < » j- t UO — U O < |U · U W o o o· l- i U £ O w U >> I*"" B < ·- « < — u lu 9 O h U · os
ju -> O O - B - «I
i o — ua u s u ·
»— · < · K · < X
j< 3 O < U U < U
lu— 0-050*.
iu > U > U -* O (9 lu· 09 09 U to ·** - — · — m * k J < — U«l U mJ — — +J lu 3 U · o— Uw nj »— · u · w u a «j iu -ί u< o> «μ M to 3 U · u U · o ·— · —— o — ok
Kl IU ^ « — o< — u lu· O· o C u · rH IU — « to — u — JO « < W uo o « o» lo — < κ oe os jQ »— · O— u- — · § *u^ o o u a u mi O- I— · U · 03 • K t— £ — i — · — ·» B — B u-j ue lo— Uw u · U to I— · u £ — — u a |< 3 ** * < — 03 lu C ue 03 — · n - < to « — U U JU O UO uo U m lu— u · <e U — t— · — £ · — o < i< a — a u o oc uk ue oa « — o— 1 m Ow UO OO H < — — u· u· ue o· — .£ »— — «C · · U — ·- k p < u<
Uto IU- uc 03 O· «— · «c· « · — ** jo > «<< oo
O· lu· UO OK
« κ IU— Uto O — < -j jo < u < o a u· iu w ue <w — — t<K<»U£ « — »— — «* < < — 23 DK 173404 B1 o o o o o o o o o o ® · O ® e* ® « o %C ro o — «« «μ n r* « m tn o
OIU wlOIU ·ΙΟ U O O « 3 O < O D O w O < 3 O < t> O O — O O C
OK kJ O·— —lO < * n » • •UteOUCC* — O O w r* «- · te < —
«i| — *- int« — K U^^U-i^Ok^ <i>vUOnJ<nt9>«)UO
lu k lu — Ca^Uk^i-e^U k *” < w""l3»”u»."*u o K k. j— m — m « — U k o— U C < κ U C o w |— *- iu > uj ur ·- u oo < — <j m — u < lu t L o o· O * u ft O* O ft O— O· — te jo < U 5 <«J tek 0< < «I tete O > < mi u · |o r o· u · o· ·- w u· o · oa o ·* υ » i- · m. — »- — < ». O* »* — i. > « · ·. · •^><|o> o: < — < u <* *» < — < — oo < a ο»|υ· o < t* ok oe o· o· o ft o· »i *“ i Ote Ote t> — Mm M te. « k Mm te £ *· k — k u k υ < OO MM < mi M mi O M te «.
o c ua Ok ok o· oa u a o · ·> e. o· < — · O— l> te te £ te · te · <k «C · « k MM u mi oo OO ·- k u U U mi < mi O Μ M mi
Ute u c o a o· u k uo u · u * < k oo u te K · te- · <k u — Ute U — te — O — U te Λ M ~ MM U mi < ml OO U k O < M — oo U « ti u k u » u · u · oa o — Ok u · Mm o· JO U— — — te — o— te · te u C te— te — te « OO « - < — O < U -» <3 <te < - « — te B.
S — · u · υ*. oa ·- e o c uo u uo o · O U te I- — om * — Ute « · Ute U— Ute * — 3 teU|<— teM oo U k MM Li M O < U te. u r - Ute lu a »ft «<e U e o— u— oo te o oa H U £. I— · Ute Ute Ute — · — Ute Ute « —
^ < " |U j te te U k U te <3 U > MM U k OO
$ Uteiu· u ft uo oc Uk oa oa u · u c •2 ·**!—« mm Mm J« — O— —· te· te — «te
g tete k U < O < U U O O u mi Li mi μ — U O
o a lu · u o te w o · Ote u · oa u — u· "· |U — Ute < k te — te· U— « te te· te — O O IU · U < tete «te O > U M OO o > · — ua u· «te oa oo oa — · oa oc ua ·»— rok uc «— Ote —· te z. « - «— ·.· U O ·— u < - OO U mi te k O O U O U mi
Uk ua oa · · m & uo ua uc ua u · O- »te* te · U — U te O te — «· «· te c OU O mi u mi O Μ Μ M O « U mi MM O « — te.
OO lu— U te O ft 03 O* Ote U 03 M w
Ute{-· «te Ute te* «te UC U— te· uc U k K 3 tete te — Li mi M mi M te o < U W <te U u te U ft U » oa te· U oc <3 U · u te *< k M m te — te j Ok u— ·— te* u — 0<l— te O M «— u mi te u O < UO Li mi O < u te lu B te· u m Li w U· te C 03 O· O te < k »— £ te c U— UC U— «·»«— « k « k tetep^ - k O < <te 0< << OO < mi tete u ft lu te UC O· Ote o— o· U · Ote u· « · IU · <· <k te· te· teC —C te· te£ 0<K«n << M. mi O > O > te k tek <3 te k
<telu· Uft U · Ote OO Ute UC U te -te O
u · i— — Mm te C te· Ote UC <· U O kl « k
te «fl o < tek O > U < ^ te mm Μ *Λ—* < U
oa lu· lOtei oa u α u· u— — k u>> Ok oo *— k k al oo o< us o> ou M te oo DK 173404 B1 24
O O O O O O D O o O
β ^ O e n e ^ O « n β β β o o* O " » n ooodu«ouoouoou »_ c> — ; o u » o ^ k o < k o u o •OUwOO — OU^r»Uw^U O U < n O — eOU-t*U-^Ui. *»U<<10<e<<CUk0»WB<< B < 3 ^UD^UUKUt c a u i. uo uo ua υ · " o c u· »· · o« “ · u c. u w Uh. 4 — u - «4 — U - U — u — U U «< ·- U < Ok uu o < u U o « u< u<
Ok ua U · <3 h 3 »o u C — « f · t- O
Vi ” ·*· *» £ *· · »- · Uh. < · o — o*» υ h u o u u — l. υ j u _j o< < < u < »- u u k *- υ e O · O h ua mm m U c oo UO k o U · < · *· « U · 4 — U· <· Ute Ute Ute « < 0 4 te.«* oo O < << Uk Uk U k « ε < >» o o y c 53 ua uw < w u· < < “ U >" U te 4 · 4 — — m O· u £ 4 k. <1 mm OO o u m, < 4 4 UU U mi <«V < te <_J u < u · < hte^ ua u h. o mø h· o te- ua u w uc " " U βν·4 - O £ te-# U te «ί— 4 - u · 4 —
^ Vite^ uu 4 » <3 Uk. u: UU 4 M UU
UE o· ua uo <3 uc uc o· u · uc ·* “ » 4 · Ute 4 - < te 4 »| o «» «4 — < m ^ uu 4 — uu 4 < uu 44 44 u< ur 44 y O “ Ow O- 4 3 4 · Uw Uw O 3 "te- o U· nj · u x «—· < te h- te. u x u· 4 — υ*- k- — M U> 4 te < 3 UU 4 - 4 te- 4 M UU Uk 4 —' fa H - H° « os os <0 uc < k 4 >>. uo o O X Ute u— — · 4 — Ute 4 · o— O— Ute *M * ~ U< 0 4 UU UU 4 4 4 4 uu UU Uk UO UO te · u · te- rn 4 « Uk 00 U 3 o — 1-1 * · Ote U — te c O — U — U·· Ute te# te# O < u < o < »- a. o < u < uu ok υ.» 4 a
φ O · U# ua Ute te# uo tete U· U m 4 K
x 2* te te 4 — u x te c: <· 4 w —c u— o — (3 < mi 4 te UU 4 te tek U 4 tete te te O 4 uu 61 O · ua u- uo uc 4 c u · ua uo uo 4 te 4 te te# 4 4 te 4 te u te 4 ·· U te U te < mi uu U > U 4 UU U.U U 4 UU 4 < Uk uo 7*0 Ute U te u 3 ·- O tete uo u » uc O te U te te# te« te# U te te· U te 4 te 4 —
Ok Uk <3 U > U mi Uk U> 4 4 ur UU
UOU« o · uc UO U m te c <3 Ute u — “ J O — U te 4 — U te «· £ < 4— U· te« O < u < U K UU Uk tek 4 < UU te«! U > J 7 O · < ® Uk 4 O UO U te# UK ua ^ h o te Uw Ute U te 4 4 Ute Uk 4 te te# ^ U< 4 4 UU 4 4 U 4 U 4 te u U3 Utel υ.«Ξ m 3 **5 5S « s -c u· uw uc
UU uu UU tek UU UU 3 < ur 4* UU
tew ua ua ea uc ua o · u- ua uk 2 2“ r* Π r · *“· < · te · u- te# te# u —
tete UO o ml- O mi 4 4 te U O < O > U mi UU
te ^ O 3 V?3 Uv O " U · UC Uw U · te C
2 _ 7- te 4 te O - U— te JZ 4 PI u# u— 4 " tete UO UU OU U< tek << 4 Vi U 4 << 52 5 - i?3 2 *· «· u— uc uw 4 k ua 7. " te te 4 > u*> te # te« 4* u · Ote te# OU 4— OU UO <3 U> << tevi uu Uu Έ Ξ H s os « « o* ►- o uw te# <0 <» uS ΟΛ 4 — uc — Uh. UX — JZ Uh 4 k
OU 4te OU 4T- U > Uk 4 te h-k ' U 4 4 U
25 DK 173404 B1
O o o O O O · »< « OK
•J V o W *f e « ·· O « · μ n w o m w · k b b · ·> m w «i o n m η n b ©o kou 000300--00 ce»o c u v υ < 00-βυ».0·-·η.».·««— u« — Cl O O « '•tfONUb.BK^B^asUOBUU < — 13 < m m * m m m o U U < • w UD U te O C U — UO — O « < u r υ*· u z. < — mm · ·» < · « « <» U< · κ u W O > O < U O · · < te· O < U 3 U O u O te. · U te te· 3 u U « · — rn LS w « · Ute. U · te-· u U U < U U · < U< p· U te- M U W te- te u <
O U te- V
u I-«te, u e U 3 UB 0 3 U u ·- U · · u aci Ute ·>· u — a - υ a o te u < te- M«/ U «, U mi t> < o o · b · u u < u u a < U te Ute u te. u a < o u te. o o · · u C. U X O — « · Ute O— ·> O « « < te < te uo O < u < OO O a te i te. U U <
OB Ute U te · — 03 03 U te. te- V
Ute U· O— te· a - te a U O te· «r • < · ** UO U> OO U mJ u — « · — o u < OB ok · O 03 < * U tete- < te. te. i
u te u — u te te · «ί te u «κι ti u a V
*77 · < UO U < U U « U m v»te* te te Cl < "ΰ U O < s O C 03 - u· 03 o te r» o O U O · w «te te — te· u — te· Cl · te. o te U « < f uo uo U> O · UteJ te m « U i- te U u Η te u « u
0 OKU tete. 05 OC <3 OB OB c· < U
u te u aci te· te - ·.· Ute Ute o o —
w O O te *»—' U rni UO U u · < a < · o O
, u · —
tel UB Ute te· Ute 03 UB UO UUU
Ute o · u— oa «·> Ute Ute u u — fH ci < a « u a «μ uu o < u c — o o ω “ »a o o J3 03 OB 03 · k < te Ute teO U — < IQ « — U .. «te U X U X O· Ute U U te ou a a ou «•» •te a « ok teuu
• O OB « C · a U · 03 te· UUU
Ute U · « — u “ U te te· tete Cl te te o ·. · · uo i> a___o · υ mj < — o o o a u < UD OC u · Ote a a Ute te 3 O O <
Ute «te te te te· Ute U · te« c « < UB. UO « — < 2 O · « V> u_i U U te te C UD 03 Ute Ute < te. Ute · « · • · Ute te· te· te· Ote UX < U u O · UK U mi o> o> OU · te U O · • o o
<te · 03 U· 03 OO <3 U<U
ux u— te· — z. « — Ute « — υ a a • te o· u u tea o o uk. oo teuu o u o
Ute <3 mm UK ·— Ute oc U··
O· «— U— o— te« te· «te UUU
• M UO 0< OU O > U > UO te o u te o ue •te te· <3 tete Ute < u u
Ute « » UX U — «te u· U · U Cl te < uk o < ·*- o« uo a n te m ·υυ< o · · < uc a c «·· <- ft 0 3 u« uk υ < u < a - «— u— < » a u·· Ote oou< u o u o o < o < o o o< ou o o o · O te te « OC 03 te O te· uo O — OC · u O · «— te· Uk U— Ute te« «te Ote·· UO Uu UK O < UK <3 UO UUU· o O te · U· te te te· ·· «3 UK U— OuO< UK U· U te U" «te o — te« <ou« teU mm u< o< OO UU u> < U — < 26 DK 173404 B1
Med hensyn til (a}2-underenheden blev i en første screening ed narsvin (a)2”Specifikke polyklonale antisera tre cDNA-klo-ner isoleret og viste sig at vare beslsgtede ned hinanden, men ikke med nogen (e)j-cDNA-sekvenser via krydshybridisering. To 5 af disse cDNA-kloner blev benyttet til rescreening af λ-gtll-cDNA-biblioteket til isolation af overlappende cDNA-kloner. cDNA-klonerne blev analyseret for at fastslå den kodende 0NA-sekvens af (<z) 2-underenheden af calciumkanalen, og et restriktionskort blev fremstillet. Ca. 7850 nukleotider fra (a)2~cDNA 10 blev klonet, hvilket stemmer overens med et -8000 nukleotid (a)2-mRNA.
Et oligo-dT-primerbehandlet ekspressions-cDNA-bibliotek blev opbygget i λ-gtll under anvendelse af ungt fuldt udviklet ka-15 nin-rygskeletmuskel poly(A+)-RNA som beskrevet for (a)^-under-enheden. Oobbeltstrengede cONA-fragmenter > 1500 bp blev ligeret til λ-gtll, og en primar pladedyrkning af 1 x 106 rekombi-nanter blev screenet med marsvin anti-160 Kd (a)2-polyklona1e antisera. Tre positive plaque blev visualiseret ved binding af 20 HRP-protein A efterfulgt af farvefremkaldelse med 4-chlor-l-naphthol. To kloner (2,5 Kb og 3,6 Kb) overlappede til indkodning af 4,75 Kb af en - 8 Kb transcript, der blev identificeret ved Northern-analyse. (a^-cDNA-kloner forløbende 1 5'- og 3'-retningen (orienteret via DNA-sekvensopdeling og identifl-25 kation af en lang, åben laseramme), blev isoleret ved rescreening af det samme λ-gtll-cONA-bibliotek med (EcoRI)-HindXXI-fragmentet af en klon (nt’er 43-272, narmest ved 5'; EcoRI-placering fra adapter) eller EcoRI - (EcoRI)-fragmentet af en anden klon (-1,0 Kb i den 3’-utranslaterede region). I alt 14 30 kloner blev Isoleret, 7 fra hver ende, hvoraf et overlappende par af kloner (den ene omfattende -2750 nt'er 3', og den anden omfattende 350 nt’er 5') kodede for -7850 nt’er af (e)2~tran-scripten; 308 nt'er af 5'-utranslateret sekvens, 3318 nt'er af kodende sekvens og -4224 nt'er af 3'-utranslateret sekvens.
35 Kun 176 nt'er af 3'-utranslateret sekvens blev bekraftet 1 begge retninger og er omtalt.
i DK 173404 B1 27
Tabel 2 viser de 3802 nukleotider -i cDNA-sekvensen, der koder for (a)2-underenheden og dens forløber, Indbefattende 308 nukleotider af 5'-utranslateret sekvens, en 3318 nukleotld Aben leseranne og 176 nukleotider af 3'-utranslateret sekvens.
5 10 15 20 25 30 35 DK 173404 B1 28
SSln n 2 ® ® O o β O B
£-2-5 £ S I g g 5 S 5 ; H Η ί η^ ίίηϊ;ί,η* ·κ»·®υ·-0 »r»4 - *·- 3 £ 2 δ Uw ϋ < 13 > u mi u > 03 — <«λ—uu — 3 —
3SSS 25 : = *? C 03 - · ua -CO -c W
5gS8 5- 55 ZZ S5 s: Zt 55 Si Sf 2888 HS 8? SS 5? Si ;« ; £. g? g* OOUU U "* *“*" WW U< W < o < 3 3 < 3 — m — U O U U & < k — C 3 « <· <3 s _ m J w uuuu u - u · < U- < 5— <" 5 1 Si· OOOO . ** *“ *“ w <K w < < «* o o 5j - a oo UUUU 041 O· U— — C »· b OO «<3 L) C rfa 4 O U — o- < k. Z m < m u« U Γ 5 2 2 £ 5 £ uuuu 0< a > << ** ** * < O O 3 3 049 U UIU O O c U · 4 k> »· c < o u a w D — « — k.
0-4 10 o 3 - - - O- 3 » o” Sr uZ u- 5 t u u*u o U w u ° << 4. 4 —— ua o < — — c o o «I oa »· k. — k -ce ue < e — a — a u· uuuo O W ua O· O I 4 ·Ι 5 - £2 <m 2 - O U - o < — < ** u 3 3 3 uo U < O 4 < - 2 2 2 Π *“ 2 u “ < <3 Ote o· te s ua ua oouo — · — m u— « - o· «— — · 7 7 r UOOO U u> w 3 O O <w U = U-I o < o < UUUO 4 te U 3 w O— U3 L) m — a te»· te·*.
ouoo ua o— ua 2 · — · rj " 5 . 5 i Π £ o<ou < *“ 0< "* *“ o > u-ι o < o < < — < —
o y U - 03 4 k. 4 · »-te — 3 < · ·— Q U« UO
is S2Hii Γ, * u · 3*· u a — · o — -4· * £ ti» — oou ° .*- ** 3-4 -4 - u-4 O 4 o< — a ua et yuuo Ote — o 4 · »-te o· < c o· —— u· ϋ 2 u 2 2 y e y te U— 3 a 3 a -4— 4 »» — m — — ro uuuu U ** ° < - - < -> uu <-I u> « - ^ OOLJU H a u · «2 W3 o 3 — - O· -O - · y y y o o» — a — · — · 4— — « u — υ-. -e — uuuu *“ “ *· U-4 -«i uu o > o< ua u = Π Η ϋ H u· oo -4te — a k- · 4 uc 3· u — 2 H S P. HZ y te ua 4 § —— 4 k. ^ · < k - · U4UU W< u *“ * — 4 - < 3< < ^ O > 2uuu 2 2 7 ir 3 U - 3 c U ft 03 —te U · — « u^uo u ^ u c> uu 0< 00 — — o < 2 2 u H y O U 3 U 3 — te 30 3· Ute OO 3· 5grs S £ 7 5 Ξ ZZ ti Si 85 ii Si S5 SSS8 s? ss ss 5: s; ss az s s si 3UUU W< * ** U< < -j 03 OU O > UU u =
OUULJ ti— Si 53 U3 4 03 k-- Ute O C
w U O u O— u · 3— 1_| _ — m — Æ t» m « —
3000 UU w U tt OO 03 — u U > 3« UO
m R tt · UO <C te. te te· — 33 ua — te tt teju u U— Ute 3— 3a te— U— 3— O— 3a < “ tt< ua UO —te. 3 — 03 uu uu — — £2u ui H- 25 *“ · 33 U3 -C <0 Ute ° < ϋϋ <a uo uw <(< ^ ^ uuuSiil 22 2* 5a tt— UO Ute <3 3- * K H - 7 7 i 5 5** 3 · — · o- o · 4— — · 'nUU3l<3 3— 3«J 03 0> U 3 3 tel OU U> 29 DK 173404 B1
_ o o o oooooo SSSW
O iD r* » ^ O
« «0 — — « et v mm. — — 403*Ute«*4 — 4 0 — 4 4 3 « — · — < — ο»<*. — — ·γ>— •«π*—— 2^ *Γ° ·«··«< k **OU'*»»r<U>n(}>NUON(l><
4 0 — - — O 153 U * — C U — mm m - · — C
uw <k. 4 · — s u * 4 · jc · ·- r — — < · U 4 C ·· O 4 U mJ — M << « > ·“ ». <— << — c uo ·- *. — · u — u k. "* · u ►. o · ui.
< m u k. < k. — - — · 13· 4 B 13— < te < k 4 4 U 4 — — 4 — U> 4 W < -> O O < mJ — — 4 · U · — 3 — 3 υ» O C t3· «9· — c 4 · <>. L> — — · — · U · <· < ·» < »» 4 · 4 — < u o < υ mJ u u — «λ 4 < 4 u <-j 44 <«j 4 · (93 —O (9— < b — · ·“ C (9· U · L> « <K — · 4 · - · ur — £ 4 · 4 *» O te. U — <J U mJ 0 4 <3 4 - — b < < 4 «I — U o < U · (J K k> · — B (9» < k li O te u C — · » £ (9— — — < u b υ · « ϊ < >* 5 — r
m k (9(9 < - U < U< — V> *4 — — 4 4 — B
— — — - (9· <· U · — · < ~ *“ O Cl· 4 · — · ur < k < x —— u— *- · 4 » u - — — — U > 4 - O < -J 4- «3 4 U > «4 (3 < <- s UB O - U C - 0 U 3 (9 — ►* C <W 4 0 («3
•g 0 4 (9< 4 4 υ V. U u O > < < + 4 4 UU
o — q — .. < o Ute 4 · o c f υ · o«. u c Ή 4 · (9· Ute U· 4 te 4 · u — — — U · * —
—' U 4 4 *n - u b —tn < ^ << 0 4 < — — in UO
CN 4 3 U te. U te < fl U 3 (9— < C «c te. < - u ; — · (3— ur U - — · — · «* — U — te- · u — *H — .J (9(9 4 — U< U ^ (9> U(9 (9(9 (3>.(9< ϋ U · te*· < O — < te —'· U— « — c < Ck io u— te-r (9 te u— ur —r — · <>* <**«Ute M O < f I. U< U < «t « te i. u> <_* ^ < < < — te (3 — Ute — *» (33 — O — 3 < · — w (53 U· — · O· (5— — · <· — · U— <*» < — < « <9 > 4 W U U U j (9< UteJ U < — — (3(9 <te (3 C — C < C < >» — O U· < te — c <3 ur m— «· <- u- <· ^- ur <> i- <— U(9 < < UU (3 13 (>< U S 4 » << (30 UB (9 C — B U · — — B (9 C U · — 3 < —
Ute O te 4 · — — (9· 4 4 — — — — · ' O —
— — — — (3 4 <— «CM (3 < UO 4 · U«# UO
UC 03 — — Ute — — 4te ·“ · — C 03 4 k 4 ·ι te * — · <>. — · u · — r «4 — · — · e —
4 4 — mJ O > — — O > te w — C. 4 4 U mJ O O
U3 03 OB OB Ute U3 U · — C O C UB
— · — · Ote O te O· — · u >> 4 · 4— 4 « U J UteJ — — — — 4 trt u tel — U < 4 UO 0< ^ 3 4 k < e 4(0 4 K Ute Ute O— 03 Ote • “ u· u«. υ» o— ur o· >· « 4 » ur U O — m UB UB 0 0 4— 4 in 0> 0(9 4 — UC — 0 — te 40 — te <3 4» 4· te · u · 4· u*. u· Uw u · 4— — · u— — r — r 4< UB — (A 44 4M oo u> U 4 — te — £ 43 UB » · 40 O— 03 — O — B — 03 — · 4· U— O·. — — · 4*i 4· U— — · -U 04 04 44 13 > - -J 04 04 04 -u O— 43 40 UO — B O— OC 4* — · O — O > OO UB u< o< 4a U O 4 U Z < £ DK 173404 B1 30 2 ° ® ® © D O O η n
© £ 2 * "» © « 5 g S
J2 ί ^ «η ·» * 5 ^ *· 9 -* O · < < V "»I— 31^ u C ^ ·»* — »** u w c* w U - r>,- ·,^ν 5Γ 0^5 >. o < *-ur ίΙΗϊ nuknu<tuo^juj-.< <^<^?ί<«<ίίϊίί<3 O- 5 - 5! bi ur - · ns g® S« J : oo oo o < jo o <£ <- u£ U i: 55 <w <o ►-· <3iU9 o · _ α ».α <· < e „ c * < « — "j Uw < w o< o< <— ui << VS u i_ tm b 2 <£.52 5* «2 g? o< ^ vi O > |U o << uo < — oo oo u <
Vt. S® °^!W3 < 3 09 <· <— O c *-· * *- u ·. < a iu j oo ►» _i o < o> uo < — 5 £ ·“ · © O l< · *“ · t-w ^ · w>hk ^ w 09 2 < i _ © *· jy τ *" Æ u · ^ x o - o · *» — <2 52 S? Irf 5 5C ° i 5 »· *- · < · o — ~ u z oo << JO < oo O > w £ < - 5 w o > « i- < S: g - t 2 gi: 5® VtuS SS 5* w ss Ηί {[·** * ^ 2 - s« < * «· w * ^ n « 5 * “ »o — · < »* - c < o oc ua >H o > 9m m O > JO > < — OO 2 < U W uo 0< •S S t π i* *T e f- C U C O — UO OC w w *- c p " rt u ° 0<|H<|<< < a u k. UO O* 5 < u · 5* <3Kw U · O — O · w. 3 fc-C t? 3 *“ £ 5 *>> *- · |U X — X — « u w w · rf · i " ^ ** J U«J ·* ►“ f- *k. O > *“ U U w << oo * * ; £ Uwioaiu— <k us *- c ue og V£ 25 <K|Ow.-· o- - · < · Uw P-· <·- << ·- ·- »- - io > oo U w << U II. Ρ» ^ if? 52 53 5c »«o »a <*. <© <0 03
00 oo u 5 !u £ u j <2 υϊΐ << S S
Si v^izs n? S? gr S° Π 5 Γ ? 5 C tw 03 ►- O <3 <· p-tt i3. 5 H “ ux <— U C P- · Ow — · <fc» <r u < O < <w U O < ·. UW U< »-«J <u o< g i 2: 55 o; <> oc <0 <3 <0 w3 ΓΓ ? 5 ί 5? <k»o— <— uw *-· ow ·*· U> <3 < < <W OO uo U ft. *-W << Uw 2 · H® ·“ · ·"· I« W uc <w O — 03 u · *“*· o < |< »- << + — 0> *^w O· oc <0 5 · U · o· 03 -w *.e iw α 3; 15 ϊί 5i|3= 5; 5; i i 55 55
=2 22 Ϊί!ϋ5 <S S? 52 =2 SS
31 DK 173404 B1 o e o o lo W4 m m w pp ^ ^ « O ^ O w * O 9 P-U^tttt· — * —
IM <n< MCUD
tt 9 "Ί^"" h. 3 · < lk < - O O »· n u o *- ft k- ft < · « · < ·> — OK o < < - K C ' K w < · f, - o Λ < κ
u β < *· < «J
^ w UK O
O · u - u — p- m u o o < < · u e < · K k <·<*.
< J * < mi ~ *“ “ tt - < · £ u > u > « -
j5 tt 9 t- o ·- K
r *- · u ·. < k C O mi U K P· P-
·· K K- W U K
w U C. U £ < K
CN < "* < *" ** * <f tt tt ft *- · Φ O *- O - - £
£ < < ^ ·“ p- K
S O · O w » ^ ·- C O C tt ·
» b 4 ·· 4 M
K w U w u w O £ K k < k < ^ ^ P P· ^ ' k · ""«“i."” ύ * < K o Λ u £ ' ' < mJ < » < P- <9 C tt < ft v - υ k u k O tt < < U b K K u C <9 tt — *·!·-· O tt < < k j p- w « K < — tt ft W - P- · < « tt U tt > <9 < os « — < K P- » tt tt < J p- «i < k o ft U m tt — < · u ·· tt tt tt < O < ^ ft *- · tt g < · *- — ·- · tt < « — p. w U · ·- w P- w ► “ < K tt ·
< *" Ρ» P» ' « M
DK 173404 B1 32 £ ® © o o o o o o o 4UK4—w4· w 4 < C *r .- BvCsvt.fvi.iVbK,« g. fU>-*Ufir.U te. » 4 · · 4 ΑΠ<.Αυ-κυ·»< « _ , . ~ νυ004»-».-οβυ0·04·0υ·04·04·υ4 β U a u · < m u · · « ur uw ur < a — _ Π_ *- » « < ·- "» O > 4 · U a 4 - < u < - u u 53 5 £. 5 ® *“2 ° ” o c u · uw 4 · · tf O ^ < U L U«d tf > < < k « VI < j l>< <3 ·“ O U C <3 · — <s — — < · 9 _ · y tf tf< < < uo o > oo o > u> <— £ υ ► · < >- UC ►· c te · oc Uw U * 4 k u ft
• r u· < * < · — r * - 4 κ Z · 6 _ □ Z
·· k *· «I < < 4 < · a UO *·*· .< 3 oo U L
• c · o <o < w oo or uc · · · — *- c.
4 u w υ^ ur o·. o·. 4 » — — · · « · 44 U a o i. < · u< ^ »· < < < > o > o<
•"C 4 · · w *»# < · te C te Q (J te te-· OO
4 · 4 κ ur — r u — <· <· o— — · ο te „ O < < W < · · i. o< << o< oo o> << ti oo * 3 4 · U te 4 m < s te- C 4 ·. < · (_> · » Ute te · < K O— 4 K « - 4 · U · U » *- · *3 UA. U W < W OO < -J OO 4 4 · #1 0< 4 — s < ua < o < · o— < v, · a oa —o <».
5 4 · « » U te U te te o te < · « te U te LJ · ^ < mJ 0 4 4 4 0 4 O > OO O 4 oo u a te- ·* 03 te te · a te- O 4 K — · 03 >>te 4 · »-te
^ U W < *A o < 0 4 OO O 4 Uw - - 5 J Ϊ W
S f. S *2 * *"· «3 O · 0 3 U W U 4 te-3 < m ™ <· · u < — Uw 4 w oo * *Λ o 4 uw <w <3 Ute te-· 03 U · 4 · OO Ote · 3 Ute f. <»» •r te · ·» < te Ote o— te · ur OO te te te- te, te j 4 » <W 4 < UO UW 4 te « te —a oa u — · c u© < m ·© < · u · U · 4· W· ·« Ute 4 te Ute 4 te -- £.
te··» O < OO 0> 4 4 U te 4 W Ute <W te- 4.
·· w 40 te· C 40 O te k te b 4 te 4’te ·Ε < »» Ote 4 m O te 4*- 4 te. 4 k O · O·· 4 ·»· te » 44 4 4 44 < w te-· te · OO OO 44 40 <0 U · · C oc ·· U · ·«. 4 c 03 ο». υ· •r 4 · 4 C — « - e. o« 4· 4·
44 Ua te 4. 44 UO O > te k 4*» UO OO
U· 44 •C ·· O· 40 Ute 4· U · 4· U — U— 44 ·· 4 K Ote O· 4*» ·— ·· 04 04 4 < 4» 4 mi 44 4*1 4w 4 — 4 —
OC 43 43 03 ·— te Ute UD U Γ — w OD
4- - · — · ·· o· ur 4· 4 ·»· 4 >. u -.
UO Uw · W •w 4V> 4· 04 44 ·· ·· Γ. * *- a ua oa ·· <3 ·· 4· · ur · r · · < m Ote · — 4 · ·. z · · u© 4· — fc. Uw 04 · · 4· OO •a 4- · vi 4· 4 te ·· 4 i- U·. OK aw U >. 43 ·Π ►- — ur •r ur 4a o — 4 κ 4 κ <· 4· 4» 4 — ·· fc, 4· te-· OO »· ► te *· OO 44 <te Ute 43 ·3 ·ΰ · a 4 w UO 4— 4 — ur 4 a 4· 4·» 4· O - ur Ute te.« · · 4· te te OO 4< 44 OO 4· ua 0> 0> 33 DK 173404 B1 o o o o o o o o o o
B ^ O Ιβ B * O o N
B k K C C tt O O v f* n w η λ n »* η η n tf U k tf o 5 <r » l f u bwi- ·»· tf e · o 3 tf u k tf o — tf — »_ n y - r> < — ►»u *0*0 » — IO — »n O — < — — o — a — · — u r OUUOOUO — Μ B U tf OtfO <(» (M Øl U U ODU»OD<I- *- w < k tf * O I— · 0 3 ►· b b < · < c (i— O — < K « — )U — « — U C. Ok —' — < —
15 U UO < må U S i O tf OO tf — n-o tf — UO
ua »- t u c o w I- t *- 3 o · oa o· oa tf · — r tf »I O— |U Z. — m — — tf* — £ < —
Otf » b << OO ttf — O ml tf— Otf — a oo — a u · — · tf* o· ua u * tfa tf· tf* tf· — £ - £ O— U » — · 15 K ^ · — — u —
Otf fc *· k Otf Otf U W »-O — må tf— Otf tfa tfo o« tf κ oa. oo u l. tf. <3 < c — · O*. O— O— lOw O k o· — m — · — — U -J tftf Otf OO — - U tf tf·» 0> - må uo — · < k — w o c 10 o. <0 oc o k. — c <· — — O— tf*» tf— lu k Ok tf— O— tf· — — tf— OO — — OO f— — U k UO OO tftf tf — _ o— — · o· < k — · o· — w Ok ua T7 — · — — — tf k o— — r < k o· or — ·
O > tf— O > tfo U O — k. < rnå tfM tf— U mJ
S — · oc tf k tfe — · — k tf k o· oc oa g — O OO — ·» U k. tf— tf— — «5» — fc. tf< u -0 . — a — c <· o· oc oa o— Ok o— 00 <· <· — — O— tf— — · — · O· — · Ok N Otf tftf tf— otf uo — må < a ·· m tfa utf o— Ok — c — · oa — k Uk tf· o a tfw J!j tfa tf— tftf otf u j tf·» — ·» tf ^ u m* << — S « — — k o- — k Itf · oa u Ok o· ua — · tf >* — · o— »— — — · o— o· <*» tf· o > — — O > O U jtf — — mJ Otf tfV* tf „J Otf — a — a oa — o lu a 03 — k 00 tfa — · tf· X·· — · Ok jtf· — · ur tf· tf— o k utf Otf o mi ua lu tf u må tf— otf 00 — u *“ v — a u · <3 »tf· — · u· — c tf— uo o *ki tf· ·— < — 1 u — — r —r tf·*— u w tf •»w' otf u · ou J O tf — a — a tftf u > ua uc — · < o — · »tf · oc υ d — a — · — · tf· tf— Ow Ok»— — tf— tfa» tf· tf— Ok tftf ur tftf — u jtf — 00 otf otf uz —o * 0 y c o— o — tf k oc uo o· — · tf w u tf tftf tfa o > — · juo otf — a — a < — tf· u · oa Ok tf o — a — a ο· o · o k <k U— — · O· Uk — « tf· k £ —— o — < rnå Otf — må — *Λ ua U må utf — a tf— ou U · O— Ok OC O— — · 03 — w tfO o·
Uk — · O · - tf — — · i— — a — tfk Ok tfk — u tfa tf·» 00 o > j<- ou - - tftf uo oa tf o —· —k —w o— oc ow Uk < · — · Uk tfkftfk u e — · tf— o· o·
Utf — u ua — — —— — vi <a UO — v» <*» — » — a — a — a — oa — a Uk — · oa
Ok — · tf· tf· u — o k tf· ur Ok « — — U Uu Otf otf utf —— Otf tf— — u ou ·" “ — · — · — k Ok O· — · tfC — C tf — — · —r —— tfk u· u— u— tf— < ·· — · o > — a <— —— 1— v» otf otf 00 tftf u> DK 173404 B1 34 o O o « ^ o — r* o n m n «* ·- O W < s ** IU k.
Λ « M «ft *- · **ll> — o o < o — ojo o - < 0 - < * L * U t. O O i— tn O x ·» w I— — C* — U · I- · O O . ► « |U > <9 U — IU 3 ·( b b · «— · < «I O > |U «i
«CO O >* lo A
o b o — iu ·.
o < υ o j— *-
^ h b K Ib S
< K O «· t·» ·
k- k O O lu -J
’ « O U lo 3
Ok υ k i— « ^ < *- U )U mi rr o o o o U — u k < · ·— · g o «. o < jo > tj < C »- w ·- · y ·< — u £ »- £ O u o **->-·» - ». .. Li.
«Ν ^ h · IU ΰ k — k O · Λ o > o « i« — H o « u s lm> < a o u jo u »O 0 3 lu 9 < · k · “ — O < U U f« — *- · U — IU · υ k ». · i— — *- u o > k — ·- 0 *- C IU kio
U k « M lu «1C
U ·» < < j— **10
»- O o C II) D
«4 ** « m IU k U < M < |— k- < 0 U tt lo 3 U k «Μ*—· U 4. O < IU «4 4 k ·> · |U k O ·* k £ ιυ · O O k 4» )— *Λ — a u · i— o « o k IU k O < — u lu μ.
·- k U — k C
U · k · < *»» ““ *« U > 4 4 35 DK 173404 B1
Tabel 2 viser også (a)2~underenhedens signalpeptid, der er vist son de første 26 negativt nunnererede aminosyrer. En pil identificerer spaltningsstedet eellen signalpeptidet og den fuldt udviklede (a)2-underenhed. Den tidligere bestemte N-5 terminale aninosyresekvens er vist som tydelig sekvens (Thr(+8), Trp(+12) og Asp (+14) var ikke tidligere bestemt).
Den viste nukleotidsekvens blev bestemt fra to kloner, som overlappede til at spmnde over (a)2-underenhedens kodende sekvens. Fem..nukleotidforskel le blandt individuelle kloner iagt-10 toges at resultere i fire aminosyreendringer. Forskelle forekom 1 sekvensen ved positionerne 169, 347, 348 og 964 tilligemed en fjernelse af nt'er 1858-1860, Aminosyrerne blev til slut bestemt til at vmre som følger; Asn ved rest 31, Lys ved rest 90 og udeladelse af Ser ved rest 594. En "in-frame"-stop-15 codon på opstrønssiden er understreget tilligemed start- og stopcodonen af en kort, åben Isseramme på opstrømssiden. Tre formodede transmembran-regi oner er indrammet i kasser. Potentielle N-glycosylerings- og phosphoryleringssteder er angivet soa beskrevet for tabel 1. _ 20
Den åbne Isseramme koder for en sekvens af 1106 aminosyrer (tabel 2). Den tidligere bestemte NH2-tera1nale aminosyrese-kvens af (a)2~prote1net indkodes ved hjslp af nukleotider 79-129 1 den samme åbne .Isseramme (amlnosyrerester 1-17, tabel 25 2). Nukleotidsekvensen, der støder op til den angivne initie- ringscodon, stemmer overens med den foreslåede consensusse-kvens. En "in-frame"-afslutninqscodon er til stede på opstrømssiden begyndende ved nukleotid -27. En potentiel "out-of-frame"-initieringscodon er endvidere placeret begyndende 30 ved nukleotid -229 og efterfølges af en "nonsense"-codon ved nukleotider -179 til -181. Den 5'-utranslaterede sekvens af (a)2-cDNA'et, 308 nukleotider klonet og hidtil sekvensopdelt, er usedvanlig lang. Denne region er yderst G+C-rig, ca. 80¾ G+C, hvilket svarer til andre relativt lange 5’-ikke-kodende 35 sekvenser, der har veret omtalt.
Tabel 1 viser sekvensen på 1873 aminosyrer hidrørende fra cDNA'et 1 (a)i-underenheden af kaninskeletmuskel-calciumkana- DK 173404 B1 36 len. Baseret på Identifikationen af en klon under anvendelse af det (a)^-specifikke IIF7-monoklonale antistof er det fastslået, at proteinsekvensen, der indkodes af den 453 bp cDNA-indsmtning (aminosyrerester 950-1100) indeholder epitopen, der 5 genkendes af dette nonoklonale antistof. Den komplette sekvens resulterer i en beregnet Mr pi 212.143 for (a)j-proteinet i modsstning til den iagttagne Mr 155K-170K, der tidligere om-taltes af andre, son anvender SDS-polyacrylamid-gelelektrofo-rese. Den her bestemte og omtalte aminosyresekvens er 99,Bi 10 identisk med den for nylig af Tanabe et al., supra, beskrevne, der viser tre aninosyreforskelle ved resterne 1808 (Thr til Met), 1815 (Ala til Val) og 1835 (Ala til Glu). Calciumkanal-(a)i-underenhedsproteinet indeholder fen potentielle M-glyco-syleringssteder ved Asn-resterne 79, 257, 797, 1464 og 1674 15 samt syv potentielle cAMP-afhengige phosphoryleringssteder ved Ser-resterne 687, 1502, 1575, 1757, 1772 og 1854 samt Thr 1552. Analogt med calciumkanalens (a)-underenhed indeholder skeletmuskel-calciumkanalens (ajj-underenhed fire indre gentagne sekvensregioner. En analyse af (e)j-proteinsekvensens 20 hydropatiprofi 1 viser, at hver gentagelse indeholder fem hydrofobe segmenter og et segment med stark positiv ladning. Eftersom (a)j-proteinsekvensen mangler en hydrofob aminotermi-nalsekvens, der er karakteristisk for et signalpeptid, har det veret foreslået, segmenterne af de fire indre gentagne reglo-25 ner representerer 24 transmembransegmenter, og at amino- og carboxylterainalerne forløber intracel1ulart. Denne model stemmer overens aed to af de potentielle glycosyleringssteder (Asn-rester 79 og 257), der er lokaliseret ekstracellulart, og alle de potentielle phosphoryleringssteder, der er lokaliseret 30 intracellulart. Dette er generelt i overensstemmelse med hidtidige biokemiske undersøgelser, der antyder, at (e)χ-underen-heden (som er blevet identificeret som den formodede 1,4-dlhy-dropyridinreceptor) ikke er glycosyleret, men er phosphoryle-ret.
Tabel 2 viser sekvensen pd 1106 aminosyrer hidrørende fra cDNA’et 1 (a)2~underenheden af kaninskeletmuskel-calciumkana- i 35 37 DK 173404 B1 len. Sekvensen resulterer i en beregnet Mr på 125.018 for dette protein 1 «odsætning til den iagttagne Mr 165K-175K (under ikke-reducerende betingelser; ΜΓ 135K-150K under reducerende betingelser), so« hidtil er besteat ved hjælp af SOS-poly-5 acrylanidgelelektroforese. (e)2_aminosyresekvensen, som her hidrerer fra cONA'et, bekræfter sekvensen på 17 aainosyrer, der tidligere omtaltes som formentlig værende sekvensen af (a)2~underenhedens 17 aminoterminåle aminosyrer. (o)2~under-enhedsforløberen har et signalpeptid på 26 aminosyrer (rester 10 fra -l til -26). Selvom dette foreslåede signalpeptid er hydrofobt og har en passende og for signalsekvenser karakteristisk længde, er det noget usædvanligt i den henseende, at pep-tidet har Glu i position -1 og Gin f position -12, der afgrænser en temmelig kort central hydrofob region. (a)2_proteinet 15 Indeholder 18 potentielle Nglycosyleringssteder (Asn-rester 68, 112, 160, 300, 324, 444, 451, 580, 589, 652, 671, 758, 801, 865, 872, 962, 975 og 1005) og to potentielle cAMP-afhæn-gige phosphoryleringssteder ved Thr 477 og Ser 822 (tabel 2).
20 En analyse af (e)2-proteinsekvensen for regional hydropatl viser, i direkte modsætning til lignende analyse af (a)j-pro-teinet, at dette protein er i det væsentlige hydrofilt, selv om det Indeholder et antal hydrofobe regioner. Yderligere karakterisering af de hydrofobe regioner for polaritetsindeks 25 samt hydrofobe aomentanalyser viser, at tre segmenter kan repræsentere transmembrandomæner af (a)2~proteinet. Topografien af (e)2"proteinet er imidlertid ikke let at forudsige fra den udledte primære aminosyresekvens. Dette problem forøges yderligere af konstateringen af, at (e)2*proteinet mangler 30 signifikant homolog! med noget protein i Dayhoff-proteinse-kvensdatabasen eller med andre kendte ionkanal- og receptor-proteiner. Hvis den foreslåede (e)2-signalsekvens i virkeligheden spaltes mellem Glu-resten 1 stillingen -1 og Glu-resten 1 stilling, da ville det fuldt udviklede proteins aæinoter-35 mlnal være ekstracellulær. Under antagelse af, at de tre hydrofobe segmenter fungerer som transmembrandomæner, og at der kun findes tre sådanne domæner, ville endvidere (a)2~pro- DK 173404 B1 38 teinets carboxylterminal være intracellular. En sådan trans-membrans topografi ville stemme overens med 8 ud af de 18 potentielle N-glycosyleringssteder, der er lokaliseret ekstra-cellulært, og det ene potentielle phosphoryleringssted, der er 5 lokaliseret intracellulært. Tidligere biokemiske undersøgelser viser, at (a}2-underenheden af skeletmuskel-calciuakanalen ikke er phosphoryleret, een vidtgående glycosyleret.
Kanin og humant genoaisk DNA blev digestionsbehandlet med for-10 skellige restriktionsenzymer, og Southern-aftryk af disse DNA'er blev hybridiseret oed radiomærkede cDNA-kloner, der er specifikke for (a)j-underenheden eller (a)2-underenheden.
Under meget strenge betingelser iagttoges meget få hybridi-seringsbånd i kanin-genomisk DNA oed enten de (a)}- eller 15 (a)2~5pecifikke sonder. Dette resultat stemmer overens med et lavt kopital, måske kun en enkelt kopi for hver af (a)|- og (a)2-underenhedsgenerne i kaningenomet. Southern-aftryk af de samme DNA-præparater blev også undersøgt under lave streng-hedsbetingelser med de samme (α}χ- og (o)2-specifikke sonder.
20 Hedens yderligere hybridiseringsbånd iagttoges i kaningenomisk DNA under lave strenghedsbetingelser med både de (a)j- og (a)2~specifikke sonder, iagttoges betydelig større hybridi-' sering med de (e)j-specifikke cDNA-sonder. Disse resultater antyder, at (a)j- og (a)2-underenhederne af den DHP-følsomme 25 skeletmuskel-calciumkanal kan dele signifikant homologi med gener, der koder for andre spændingsafhengige DHP-følsomme calciumkanaler, spændingsafhangige calciumkanaler, som ikke er DHP-følsomme (f.eks. T- og N-typer) og eventuelt ligand-”ga-ted" calciumkanaler (f.eks. glutamatreceptor). Interessant nok 30 iagttoges hybridiseringsbånd i humant genomisk DNA med de (a)^-specifikke cDNA-sonder under både høje og lave strenghedsbetingelser, medens signifikant hybridisering af (a)2-spe-cifikke cDNA-sonder kun iagttoges under lave strenghedsbetingelser. Selvom der findes humane gener, der er homologe i for-35 hold til kanin(o)j- og (a)2-underenhedsgenerne, kan større udviklingsmæssig sekvensdivergens således være forekommet i (a)2~genet i forhold til (a)i-genet.
39 DK 173404 B1
Ifølge et yderligere aspekt angår opfindelsen en diagnostisk analyse for Lambert Eaton-syndromet (LES). LES er en autolm-munsygdom, der er karakteriseret ved en utllstrakkel1g frigørelse af acetylcholln fra motoriske nerveterminaler, som 5 normalt er ansvarlige for nerveimpulser. En nylig publikation (Kim og Neher, Science 239, 405-408 (1988)) viser, at IgG fra LES-patlenter blokerer Individuelle spend1ngsafhang1ge calciumkanaler og således hindrer funktion. En diagnostisk analyse for LES baseret på LES-IgG's Immunologiske reaktivitet 10 med caldumkanal (et)2-underenhed alene eller 1 kombination med (a)i-underenhed opnås således. En sådan analyse kan f.eks. baseres på Immunoudfaldnlng af LES-IgG ved hjalp af calclui-kanal-underenhederne Ifølge opfindelsen.
15 EKSEMPEL 1
Isolation af RNA til cDNA-blbl1otek
Dagen før RNA Isoleres fremstilles følgende. Som en forholdsregel bør alle glasgenstande vare varmebehandlede, og alle 20 stamopløsnlnger 1 den umiddelbart nedenfor anførte liste bør vare steriliserede ved hjalp af autoklavering.
200 ml 0,1 M NaOAc, pH 5,2, 1 mM EDTA 50 al 0,2 M Na2 EDTA, pH 8,0.
25 50 al 1 M Tris, pH 7,5 50 al 3,2 M Tris, pH 7,2
50 ml 0,01 M Tris (pH 8,0), 1 aM EDTA
50 al PK-puffer (0,1 M Tris, pH 7,2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) 30 50 al 10% SDS, 4 1 ultrarent Η20 0a morgenen for RNA-Isolationen kombineres: 35 100 ml H20 100 g guan1d1n1soth1ocyanat (ΪΒΙ) 10.6 al 1 M Tris, pH 7,5
10.6 ml 0,2 M EDTA
DK 173404 B1 40
Der omrøres, men opvarmes ikke til over 65*C til opløsning af guanidinisothiocyanat.
Ungt fuldt udviklet kaninryg-skeletauskel dissekeres pi en ren 5 glasplade, og ca. 10 g muskelvæv (skåret i -4 mm stykker) sættes til 50 ml af guanidinisothiocyanatopløsningen, f.eks. i en 100 ml Wheaton-flaske.
Der homogeniseres under anvendelse af en "tissuemizer" fra 10 Teknan (stor vinge) i 10-20 sekunder eller indtil små stykker ikke længere er synlige.
Homogenisatet anbringes i et 60*C varmt H20-bad, og der tilsættes 30 ml redestilleret phenol, der er blevet gjort 0,1% 1 15 8-OH quinolin, 0,2% ø-He. Opløsningen bør være klar og homogen efter denne tilsætning.
30 al af en 1:1 opløsning af chloroform:acetatpuffer tilsæt tes.
20
Der rystes kraftigt ved 60*C i 10 minutter. Opløsningerne skulle forekomme uigennemsigtige. Hvis ikke dette er tilfaldet, tilsættes tilstrækkeligt chloroform:acetat, indtil opløsningen bliver mælkeagtig.
25
Der køles på is og centrifugeres indtil opnåelse af separate faser (7000 x g, 10-20 minutter).
Der fjernes og lades passere energisk gennem en nr. 22 nål.
30
Der behandles ned phenol:chlorofora (1:1), soa er mættet med acetatpuffer. Der ekstraheres vandigt med 3 x chloroforn-volumenet. Der tilsættes to volumener -20*C varm EtOH samt ppt 1 1-2 timer, men ikke længere.
Pracipitatet opsamles og tørres kortvarigt (<5 minutter) under vakuum. Det resuspenderes i 7 ml PK-puffer, der er gjort 0,2% 35 41 DK 173404 B1 med hensyn til SDS. Hvis pracipitat udvikles, opvarmes til 65*C, indtil opløsningen bliver klarere. 1,5 ng proteinase K tilsattes.
5 Der inkuberes i 20 minutter ved 37*C (hvis man har tørret i for lang tid, vil RNA blive meget vanskeligt at få til at gå 1 opløsning, og kraftig pipettering vil vmre nødvendig under hele inkubationen).
10 Reaktionsblandingen ekstraheres med 1:1 phenol:chloroform (der er gjort 0,1% i 8-0H quinolin, 0,2% Ø-Me, mattes med 100 mM Tris, pH 8,5 eller PK-puffer pH 7,7), 2 x aed chloroform, ppt ved tilsatning 1/10 volumen 3,2 H Tris, pH 7,5, samt 2 volumen EtOH. Poly A+ RNA kan derpå isoleres fra RNA-blandingen ved 15 hjmlp af velkendte hybridiseringsmetoder under anvendelse matriks-lRRobiliseret oli go (dT).
EKSEMPEL 2 cDNA-kloningsprocedure 20 ________ 1. Syntese af første streng a. De følgende reagenser og midler kombineres og inkuberes på is i 5 minutter: 25
Slut koncen-
Reagens : Volumen tration 30 -5 pg poly A+ RNA, plus vand til 10,5 μΐ
5X omvendt transkriptasepuffer 10 μΐ IX
0,5M DTT 1 ^1 1° "M
RNasin (24 U/μΙ) 2 μΐ -Ιϋ/μΐ
5X dNTPs 10 Ml IX
35 oligo dT (250 pg/ml) 5 μΐ 25 pg/ml b. Derpå tilsættes de følgende tre reagenser til (a), og blandingen inkuberes ved 37VC 1 60 minutter: DK 173404 B1 42 actinomycin D (600 pg/ml) 4 μΐ ~50 pg/ml 32P-gammadCTP (3200 Ci/mmol) 2,5 μΐ
MMLV-omvendt transkriptase 5 μΐ 200 U/pg RNA
(BRL-200 U/μΙ) _ 5 50 μΐ (total a+b) c. De følgende reagenser sættes til (b), og blandingen inkuberes ved 37aC i 30 Minutter: 10 RNasin (24 U/μΙ) 1 μΐ MMLV-omvendt transkriptase 3 μΐ (BRL-200 U/μΙ) d. Udtag aliquot mængder til analyse: 15 1 μΐ på tidspunktet 0 til TCA 1 μΐ efter 90 minutter til TCA 0,5 μΐ efter 90 minutter til gel 20 e. Reaktionen standses efter 30 minutter ved tilsætning af 2 μΐ 0,5M EDTA, og der gennemføres en phenol/chloroform-ekstrak-tion efterfulgt af en chloroformekstraktion. Derpå tilsættes ΙΟ μΐ 10 N NH4OAC plus to volumener ethanol til udfældning af den første streng.
25 f. Til analyse af syntesen påføres 0,5 μΐ af reaktionsblandingen på en 1,5% agarose-minigel, gelen fotograferes, tørres og anbringes under film (en eksponering natten over ned en intensiverende gennemlysning er generelt tilstrækkelig).
30 g. Beregn massen af cDNA ud fra den procentiske inkorporering af mærke ud over baggrund. 1 μς ss cDNA«l,4% inkorporering.
2. Syntese af anden streng 35 a. cDNA-RNA nedcentri fugeres ved centrifugering i en "bench-top" mikrocentrifuge i 15 minutter. Småkuglen vaskes i 95% ethanol og tørres.
43 DK 173404 B1 b. Den følgende blanding samles og Inkuberes ved 12*C 1 60 minutter.
Slut 5 --------- koncen-
Reagens Volumen tration cDNA RNA, plus vand til 68 μΐ
5X 2. streng-puffer 20 μΐ IX
10 10 ·Μ Ø-NAD 1,5 μΐ 0,15 mM
4 mM dNTPs 5 μΐ 200 μΜ/al DNA-polymerase I (10 U/μΙ) 2,5 μΐ 250 U/æl E. coll DNA-1igase (2 U/μΙ) 2 μΐ 40 U/ml RNase H (2,3 ϋ/μΐ) _______ 1 ul 23 U/ml 15 100 μΐ c. Til denne blanding sættes følgende, og Inkubationen fortsætter ved 22*C 1 60 mlnutteri 20 DNA-polymerase I (10 υ/μ1_)_ 1,5 μΐ E. col1 DNA-1Igase (2 U/μΙ) 1,5 μΐ d. Reaktionen standses efter 60 minutter efter tilsætning af 4 μΐ 0,5M EDTA, og der gennemføres en phenol/chloroform-ekstrak- 25 t1on og en chloroforaekstraktIon.
e. Den vandige fase påføres på en G-50-søjle 1 en kort Pas-teur-p1pette, og 100 μΐ fraktioner opsamles. De 500 μΐ Indeholdende cDNA’et opsamles og kombineres og ekstraheres med 30 butanol til opnåelse af et volumen på -50 μΐ. cDNA udfældes ved tilsætning af 10 μΐ 10 M NH4OAC plus to volumener ethanol.
3. T4-polymerasereaktIon 35 a. cDNA'et centrifugeres 1 en mlkrofuge 1 15 minutter. En vask med 95% ethanol gennemføres, og cDNA-småkuglen tørres. Den tørre småkugle tælles 1 en scinti1latlonstæller. Han antager DK 173404 B1 44 100% effektivitet af den anden strengreaktion, og massen af dobbeltstrenget cDNA beregnes ud fra den første strengberegning.
5 b. Til cDNA sættes følgende, og blandingen inkuberes ved 37*C 1 20 minutter: cDNA + 10X T4-puffer δ μΐ 10 H20 40,75 μΐ 4 mM dNTPs 1,25 μΐ 0,1 mMOTT 2,5 μ! T4-polymerase (10 U/μ1) 0.5 ul 50 μΐ 15 c. Aliquot mængder udtages: 0,5 μΐ til gel på tidspunktet 0 0,5 μΐ til gel efter 20 minutter 20 d. Reaktionen standses efter 20 minutter ved tilsmtning af 2 μΐ 0,5 H EDTA efterfulgt af en phenol/chloroform-ekstraktlon og en chloroformekstraktion.
25 e. Den vandige fase påføres på en G-50-søjle i en kort Pas-teur-pipette, og 100 μΐ fraktioner opsamles. De 500 μΐ indeholdende cDNA opsamles og kombineres, og de ekstraheres med butanol til opnåelse af et volumen på «50 μΐ. cDNA udfældes ved tilsætning af 10 μΐ 10 H NH4OAC plus to volumener ethanol.
30 f. De 0,5 μΐ prøver, der udtages på tidspunkterne 0 og 20 minutter, påføres på en 1,5% agarose-minigel, der derefter fotograferes, tørres og anbringes under film.
35 4. EcoRI-adaptere tilsættes (til indsætning i λ-gtll) a. Oligo'er syntetiseres med følgende sekvenser: DK 173404 B1 45 20-mer: 5’-CCATGGTACCTTCGTTQACG-3' 24-mer: 3'-GGTACCATGGAAGCAACTGCTTAA-51 5 b. 20-meren phosphoryleresved kombination af de følgende reagenser og inkuberes ved 3?*C i 15 minutter* 225 pmol 20-mer + vand 6,8 μΐ 10 10X kinasepuffer 1,2 μΐ 32P-gammaATP (7000 Ci/mmol) 1,0 μΐ kinase (2 U/μΙ) 1.0 ul 10 μΐ 15 c. De følgende to reagenser sattes til ovennavnte blanding, og denne inkuberes ved 37aC 1 30 minutter; 10 mH ATP 1 μΐ kinase (2 U/ml) 1 ul 20 12 μΐ (total b+c) d. Enzymet inaktiveres derpå ved kogning i 10 minutter.
e. 24-meren hybridiseres til den phosphorylerede 20-mer ved 25 tilsatning af 225 pmol af 24-meren (plus vand til et bringe volumenet op på 15 μΐ), og der inkuberes ved 65*0 i 5 minutter. Han lader derpå reaktionsblandingen afkøle langsomt til stuetemperatur.
30 Adapterne er nu til sted_e__i en koncentration på 15 pmol/μΐ og er parate til cDNA-vektorUgering.
f. Følgende kombineres: 35 DK 173404 B1 46
cDNA
hybridiserede adaptere (15 ρηοΐ/μΐ) 50 gange nolart overskud
i forhold til cDNA
vand 16 μΐ 5 10X llgasepuffer 2 μΐ ligase (10 U/nl) 2 ul 20 μΐ
5. Phosphorylering af cDNA
10 a. Ligasen inaktiveres ved opvarmning af blandingen til 72*C i 15 minutter.
b. De følgende reagenser sattes til cDNA-ligeringsreaktions-15 blandingen, og denne opvarnes til 37*C i 30 ainutter: cDNA-ligeringsreaktionsblanding 20 μΐ vand 24 μΐ 10X kinasepuffer 3 μΐ 20 10 aM ATP 1 μΐ kinase (2 ϋ/μΐ) 2 ul 50 μΐ c. Reaktionen standses ved tilsatning af 2 μΐ 0,5 M EDTA, 25 hvorpft der ekstraheres en gang ned phenol/chlorofora og en gang aed chloroforn.
6. Rensning og størrelsesudvelgelse af cDNA
30 a. cDNA-mengden påføres på en "BIO-GEL A-50"-søjle, son er blevet vasket ned > 5 al TE-puffer. Søjlen har et 0,8 al lag harpiks i et 0,2 cn (indre diaaeter) x 30 ca sil iconiseret glasrør ned en glasuldsprop i en gul pipettespids ved bunden.
35 b. cDNA-mangden tørres i en "speed vac" til -20 μΐ. 2,5 μΐ gel Indeholdende farvestof tilsattes, og cDNA-aangden fyldes på søjlen. Tællingerne begynder at koane, efter at 200-250 μΐ TE- i DK 173404 B1 47 puffer er løbet gennem søjlen. 5 minutters fraktioner (-«30 μΐ) opsamles og tmlles 1 en scintillationstaller. Frie adaptere kan begynde at eluere 350-400 μΐ efter at cDNA-mengden begynder at eluere.
5 c. o,5 μΐ af flere af de opsaalede fraktioner påføres på en 1,5* agarose-mini gel, Gelen fotograferes, tørres og placeres under film.
10 7. Ligering af cDNA til λ-gtll-vektor a. Fraktionerne indeholdende cDNA kombineres, ekstraheres med butanol til 20-30 μΐ, og 5 μΐ 10 M NH4OAC plus to volumener ethanol tilscttes til udfsldning af cDNA. Det centrifugeres i 15 en mikrocentrifuge i 15 minutter og underkastes derpå en vask ned 95* ethanol og tørres.
b. Småkuglen tmlles, og massen af cDNA beregnes i forhold til massen efter syntesen af den anden streng.
20 c. cDNA-mnngden resuspenderes i TE (-0,10 pmol/μΐ).
d. Ligeringsreaktionsblandingen indeholder følgende, som inkuberes ved 14-16*C natten over* 25 (1 Ug af λ-gtll-vektor anvendes * 0,035 pnol vektor) λ-gtll (1 ug/μΐ) 1 μΐ cDNA-indsmtning (2-4 gange molart overskud af cDNA i forhold til vektor) 30 vand indtil 3 μΐ 5X ligasepuffer 1 μΐ ligase (lo U/μΙ) l ul 5 μΐ 35 DK 173404 B1 48 8. Emballering
Vektoren emballeres under anvendelse af "Gigapack" in vitro emballeringssaettet, der leveres af Strategene, og ved at følge 5 de deri Indeholdte instruktioner.
REAGENSER XX RT-puffer
10 250 mN Tris, pH 7,4 250 μΐ af IH
375 rH KC1 375 μΐ åf 1M
15 nN MgCl2 75 μΐ af 0,2H
H2O 300 ul_ 1000 μΐ 15 5X dNTPs 5 mH dATP 14,1 μΐ 3 ·Μ dCTP 9,1 μΐ 20 5 mH dGTP 13,9 μΐ 5 øM dTTP 13.3 ul 50 μΐ 5X 2. streng-puffer 25
100 mM Tris, pH 7,5 100 μΐ af IH
500 rH KC1 500 μΐ af IH
50 mH (NH4}2SO4 50 μΐ af IH
25 rH HgCl2 125 μΐ af 0.2H
30 250 pg/øl BSA 5 μΐ af 50 mg/ml vand 220 ul_ 1000 μΐ 35 49 DK 173404 B1 10X T4-puffer
670 nM Tris, pH 8,0 670 μΐ af 1M
167 nM (NH4)2SO4 167 μΐ af IH
5 67 bM HgCl2 67 μΐ af 1M
H20 96 ul 1000 μΐ EKSEMPEL 3 10 Screening af cDNA-bibliotek ned antistof λ-gtll-bibliotek pladedyrkes pi Y1090 i LB-agar og 50 pg/al anpicillin. Der dyrkes natten over i 15 ni LB, 0,2¾ naltose og 50 pg/nl ampicillin. Cellerne pelleteres og resuspenderes i 3 15 ni 10 aM MgS04. Fire plader ned 250.000 plaque/plade pladedyrkes under anvendelse af 25 μΐ fag (10.000/μ1) og 300 μΐ af navnte 3 ni opløsning af celler i 10 ni blød agar indeholdende 50 pg/nl anpicillin.
20 Der dyrkes ved 32*C 1 1\ tine og IPTQ-behandlede filtre, som var gennemblødt 1 10 aM IPTG (Boehringer Mannhein Biocheni-cals, Indianapolis, IN) blev lagt over. Filtre tørredes, indtil de kun lige var fugtige, de blev indlagt i pladerne, og der blev inkuberet natten over ved 37*C.
25
Pladerne orienteredes, og 0,5 μΐ renset DHP-receptor påførtes son plet på den ene plade son en positiv kontrol. Filtrene vaskedes 1 10 n i nutter yed__st_uetemperatur ned TBS (50 nM Tris, 150 nM NaCl, pH 8,0). Filtre vaskes i TBS, 20¾ FCS (filtreret) 30 1 30 minutter ved stuetemperatur.
Filtrene inkuberes i 2 tiner i TBS, 20¾ FCS, anti-DHS-recep-tor/intistof (nonoklonalt eller polyklonalt). Der vaskes i 10 ninutter 1 TBS. Filtre overføres til nye plader, og der vaskes 35 1 1 minut 1 TBS, 0,1¾ NP40. Der vaskes 1 10 ninutter i TBS og overføres til nye plader.
50 DK 173404 B1
Der inkuberes i nindst 1 time med TBS, 20% FCS indeholdende et passende andet antistof (f.eks. HRP-protein A; eller HRP-ged anti-mus IgG).
5 Filtre vaskes som ovenfor beskrevet for det første antistof.
De positive kloner fremkaldes ved anvendelse af ca. 40 ml/plade af 4-chlor-l-naphthol som reagens, der fremstilles ved opløsning af 60 mg af ncvnte fremkalder i 20 ml iskold 10 MeOH og iblandes 4-chlor-l-naphthol (Aldrich Chemical Company, MilMauke, WI) i 100 ml TBS indeholdende 60 μΐ 30% H2O2.
EKSEMPEL 4
En human neuronal cDNA, der koder for (a)2-underenhed af cal-15 ciunkanal.
På grund af de ovenfor nevnte angivelser, at humane calciumkanal- (a)2-underenhedsgener havde afveget noget fra kanin-cal-ciumkanal-(e)2-underenhedsgener, blev fragmenter, der koder 20 for human (a)2-underenhed, isoleret til anvendelse som sonder til screening af menneskehjerne cONA-biblioteker under høje strenghedsbetingelser.
Et EcoRX-digestionsbehandlet humant genomisk Southern-aftryk . 25 blev undersøgt under både høje og lave strenghedsbetingelser med et fragment af cDNA, der koder for kanin-(a)2-underenhed (fragmentet fra nukleotid 43 til nukleotid 272 som vist i tabel 2). Under lave strenghedsbetingelser identificeredes to genomiske fragmenter på 3,0 kbp og 3,5 kbp i størrelse. Under 30 høje strenghedsbetingelser bevarede kun det 3,5 kbp fragment en stabil hybrid. Disse to fragmenter blev klonet til λ-gtll.
Det 3,5 kbp fragment indbefatter et lille Pstl-Xbal-fragment på ca. 300 bp, der indbefatter en 82 bp exon med 96,4% homo-logi til nukleotider 102 til 183 i sekvensen i tabel 2. Forud 35 for denne exon går dinukleotidet AG (splice donor), og exonen efterfølges af dinukleotidet GT (splice acceptor), som kendes på området. Det 3,0 kbp fragment indbefatter et Xbal-BgIII- 51 DK 173404 B1 fragment på ca. 585 bp, der Indbefatter 104 bp af en exon (der Indbefatter Bglll-stedet ved sin nedstrømsende), som i de 104 bp har 93,3% homologi til nukleotider 184 til 287 i sekvensen i tabel 2. Både det 300 bp Pstl-Xbal-fragment og det 585 bp 5 Xbal-BglIl-fragment blev benyttet til undersøgelse af dobbelte stigninger af et humant, basalt gang!ia-cDNA-bibliotek 1 λ-gtll (idet biblioteket var opnået fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, og Indeholdt ca. 10& uafhengige", rekombinanter med en gennemsnitlig indsattelses-10 størrelse på 800 - 1000 bp). Tre positive kloner blev identificeret, hvilke kloner hybridiserede til begge sonder under høje strenghedsbetingelser, en med en indsettelsesstørrelse på ca. 1150 bp, en anden med en Indsattelsesstørrelse på ca..790 bp og den tredje med en indssttelsesstørrelse på ca. 670 bp.
15 oen 1150 bp indsatning i den ene klon strakte sig ind 1 den kodende region fra ca. nukleotid 200 1 den kodende region og viste sig at have en sekvens, der var mere end 90% homolog 1 forhold til sekvensen af det tilsvarende segment af det cONA, hvis sekvens er vist i_tabel 2. Under anvendelse af λ-genomet 20 ned den 1150 bp indsatning som sonde blev et humant hjernesti lk-cONA-bibliotek (også købt fra the American Type Culture Collection og med ca. 4 x 106 uafhangige rekombinanter med en gennemsnitlig Indsattelsesstørrelse på 800 - 1000 bp) undersøgt under høje strenghedsbetingelser. Ved denne undersøgelse 25 identificeredes fire positive kloner med indsatninger på ca.
950 bp, 1120 bp, 3000 bp og 2500 bp. Det meste af den 1120 bp indsatning overlappede den 1150 bp indsatning af det som sonde benyttede DNA, men strakte sig noget opstrøms fra opstrømsenden af den 1150 bp indsatning. Den 2500 bp Indsatning strakte 30 sig nødstrøms fra ca. 650 bp fra 5*-enden af den 1120 bp indsatning. DNA'et aed den 2500 bp Indsatning blev atter benyttet til undersøgelse af hjernestilksbiblioteket, og en klon aed en 2750 bp indsatning blev fundet. Den 2750 bp indsatning viste sig ved restriktionsanalyse og sekvensopdeling at strakke sig 35 i 3'-retningen ud over translationsstopsignalet 1 en laseram-me, der viste sig at begynde 1 den ovenfor beskrevne 1120 bp indsatning. Den 2750 bp Indsatning og den 1120 bp Indsatning DK 173404 B1 52 har et PvuII-sted til fælles og er blevet Ugeret under anvendelse af PvuII-stedet til opnåelse af et cDNA, son Indkoder en hunan, neuronal caldunkanal (a)2-underenhed. De 5'-1560 bp af dette cDNA er blevet sekvensopdelt og viste sig son lllustre-5 ret 1 tabel 3 at være 91,2% honologe ned det tilsvarende 1 tabel 2 viste 1575 bp segnent.
Det hunane (a>2-underenheds1ndkodende cDNA vil blive subklonet til pattedyr-ekspressionsvektoren pSV2DHFR, son står t11 rå-10 dighed, ned henblik på ekspression 1 pattedyr-vnvskulturcel -ler.
Den hunane neuroblastonacelleiInle IMR32 opnåedes fra the Anerlcan Type Culture Collection (accesslonsnr. CCL127). En 15 northern-aftryksanalyse blev udført på poly A+ RNAS fra denne cellelinie under anvendelse af den fulde længde hunant (a)2-underenheds indkodende cDNA. Under vask ned lav strenghed fandtes et enkelt 8,2 kb fragnent. Det kan1nskeletnuskel-(a)2-1nd-kodende nessenger-RNA havde også en størrelse svarende til 8,2 20 kb.
25 30 35 DK 173404 B1 53 TABEL 3 5 .....ΪΤΓΪ’ “"ΙΤί ieV... .....gggcgggggagggggattgatcttc as
KanlMkeletamakd (*), I I I I I I I I I I I I I | CCCGGGGCCCGCTGGGGGGCGGTCGGGGCGTGTGaGGCGCTTGCTCCCAG 299 10 GATCGCAAGATGGCTGCTGGCTGCCTGCTGGCCTTGACTCTGACACTTTT 75 mi mi in mi in mi in i in minim CTCGCGAAGATGGCTGCGGGCCGCCCGCTGGCCTGCACGCTGaCaCTTTG 349 CCAATCTT......TGCTCATCGGCCCCTCGTCGGAGGAGCCGTTCCCTT 119
II I I I II I I I I I 11 11 I I I I 1II I I I I I III III III
Gcaggcgtggctgatcctgatcgggccctcgtcggaggagccgttccctt 399 15 9 9 a * CGGCCGTCACTATCAAATCATGGGTGGATAAGATGCAAGAAGACCTTGTC 169 i nun min n mnnnnnnnnnmmii in cagcegtcactatcaagtcatgggtggataagatgcaagaagacctggtc 449 a a » a a ACACTGGCAAAAACAGCAAGTGGAGTCAATCAGCTTGTTGATATTTATGA 219 ni 111111111111 ni 11 mi ninnniiiinnniiiiiii 20 acactggcaaaaacagcaagtggagtcaatcagcttgttgatatttatga 499 • * i « · GAAATATCAAGATTTGTATACTGTGGAACCAAATAATGCACGCCAGCTGG 269 i tt 1111111111111111111111111 n 111111111111 nnni gaaatatcaagatttgtatactgtggaaccaaataatgcacgtcagctgg 549 • 6 a a · a TAGAAATTGCAGCCAGGGATATTGaCAAACTTCTGAGCAACAGATCTAAA 319 25 I 11111111111111 II 11111111 11111 111111111II1111 tggaaattgcagccagagacattgagaagcttctcagcaACAGATCTAAA 599 GCCCTGGTGAGCCTGGCATTGGAAGCGGAGAAAGTTCAAGCAGCTCACCA 369 niiinn niiin iiiimi nnmmimm mil gccctggtgcgcctggctttggaagcagagaaagttcaagcagcccacca 64 9 30 35 TABEL 3 (fortsat) 54 DK 173404 B1 5 GTGGAGAGAAGATTTTGCAAGCAATGAAGTTGTCTACTACAATCCAAAGG 419
Mill I I I I I I Ilt I I I I I I I I I I I I I I I I I I 11 I I I II il liil ATGGAGGGAAGATTTTGCAAGCAATGAAGTTGTCTACTA7AACGCGAAGG 699 « « « · t ATGATCTCGATCCTGAGAAAAATGACAGTGAGCCAGGCAGCCAGAGGATA 469 mim iiiiiiii ηιιιιιιιιιιιι ι ιι 1111111 n u 111 10 ATGATCTTGåTCCTGAAAAAAATGACAGTGAACCAGGCAGCCAGaGGATC 749 • · · * AAACCTGTTTTCATTGAAGATGCTAATTTTGGACGACAAATATCTTATCA 519 I i I I I I I I I I I III l I l IIIIIIII III II I I I I I nil III I I AAACCTGTTTTCaTTGACGATGCTAACTTTAGAAGACAAGTaTCCTaTCa 799 GCaCGCAGCAGTCCATATTCCTACTGaCATCTATGAGGGCTCAACAATTG 569
15 111 111 111 IIIIIIII II III I I 1 11111111 II II I I 11 I I
GCACGCAGCTGTCCATATCCCCACTGACaTCTATGAAGGATCGACAATCC 849 · 4 « « TGTTAAATGAACTCAACTGGACAAGTGCCTTAGATGAAGTTTTCAAAAAG 619 111 11 I I I I 1 I I I I I I I I II I I 1 11 I I I I I 11 I I 11 lllllllllll TGTTAAACGAACTCAACTGGACAAGTGCCTTAGATGACGTTTTCAAAAAA 899 * t 1 · 20 AATCGCGAGGAAGACCCTTCATTATTGTGGCAGGTTTTTGGCAGTGCCAC 669 mil mmmιιmi i mmminmmmmi AATCGAGAGGAAGACCCTTCACTGTTGTGGCAGGTGTTTGGCAGTGCCAC 949 • 19 1» TGGCCTAGCTCGATATTATCCAGCTTCACCATCGGTTGATAATGGTAGAA 719 mm ιι ιι mii iiiiiiii immimmi i m TGGCCTGGCCCGGTATTACCCAGCTTCTCCATGGGTTGATAATAGCCGAA 999 25 « · « * · CTCCAAATaTGATTGACCTTTATCATGTACGCAGAAGaCCATGGTACaTC 769 i mii i mm iiiiiiiiiiiimiiiiiimimmii CCCCAAACAAGATTGATCTTTATGATGTACGCAGAAGACCATGGTACATC 1049 CAAGGAGCTGCATCTCCTAAAGACATGCTTaTTCTGGTGGATGTCAGTGG 819 mii iiiiiiii iiiiiiii miimmmmmimii 30 CAAGGTGCTGCATCCCCTAAAGATATGCTTATTCTGGTGGATGTGAGTCG 1099 35 TABEL 3 (fortsat) DK 173404 B1 55 5 AAGTGTTaGTGGaTTGACACTTAAACTGATCCGAACATCTCTCTCCCAAA 669
III 11 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I I I I I I I I I II I
AAGCGTTAGTCGACTGACACTCAAACTCaTCCGGACaTCCGTCTCCGAAA 1149 • III» TGTTAGAAACCCTCTCAGATGATGATTTCGTGAATGTAGCTTCATTTAAC 919 II11 lllillllllimillllllll lllll II 1111111111 11 io tgttggaaaccctctcagatgatgattttgtgaacgtggcttcatttaac 1199 AGCAATGCTCAGGaTGTAAGCTGTTTTCAGCACCTTGTCCAAGCAAATGT 969 I I I i 1 I 11 I i I I I I 11 I I!I I II I I I I I I 11 111 i I I I I I I il I I I i I I AGCAATGCTCAGGATGTAAGCTGCTTTCAGCaCCTTGTCCAAGCAAATGT 1249 • « « · · AAGAAATAAAAAAGTGTTGAAAGACGCGGTGAATAATATCACAGCCAAAG 1019 15 I I i I 11 11 I I 111 (IIII II ΠΙ II I I 1111 II1111 11111 11 11 AAGAAATAAGAAAGTGTTGAAAGaTGCAGTGAATAATATCaCAGCAAAAG 1299 • * · · · GAATTACAGATTATAAGAAGGGCTTTAGTTTTGCTTTTGAACAGCTGCTT 1069 INI 11111111111 1111II11 1111111111111111 111111111 GAATCACAGATTATAAGAAGGGCTTTAGTTTTCCTTTTGAGCAGCTCCTT 1349
I f * t I
20 aattataatgtttccagagcaaactgcaataagattattatgctattcac 1119 I 11 I I I 11 111 I I 11 I Hl 111 111 11 I 111 11 111 Ilt I lllll AATTATAATGTaTCCAGAGCCAACTGCAATAAGATTaTCATGTTGTTCaC 1399 GGA...TGGAGAAGAGAGAGCCCAGGAGA7ATTTAACAAATACAATAAAG 1166 III I I I I I i I 11 I I I I I I I I I I I I I I 11 I I I I I I I I I 11 I 11 I I GGACGGAGGAGAAGAGAGAGCCCAGGAGATATTTGCCAAATACAATAAAG 1449 25 ATAAAAAACTACCTGTATTCaCCTTCTCAGTTGGTCAACACAATTaTGAC 1216
I II III III 11111IIII 111IIIII111 lllll lllll III
acaagaaagtacgtgtattcacattctcagttggccaacataattacgaC 1499 30 35 5 TABEL 3 (fortsat) DK 173404 B1 56 ^ # · · « · AGAGGaCCTaTTCAGTGGATGGCCTGTGAAAACAAAGGTTATTATTATGA 1266 Ilt 1 I I I I I I ! I I I I t i I 11 I I I II I I I I I I I 1 I 11 I I i I I I I I I I I AGAGGACCTATTCAGTGGATGGCTTGCGAAAATAAAGGTTATTATTATCA 1549 • ' I t f AATTCCTTCCATTGGTGCAATAAGAATCAATACTCAGGAATaTTTGGaTG 1316 llllll llllllll II lllltlil 11(11(11111111 I INI 10 AATTCCATCCATTGGÅGCCATAAGAATTAATACTCAGGAATACCTAGaTG 1599 • V · I 9 TTTTGGGAAGACCAATGGTTTTAGCaGGaGACAAAGCTAAGCAAGTCCAA 1366 II 11 I I I 11 I I I I 11 I 11 I I I I 11 I 11 I I 111 1111111111 ! 11111 TTCTGGGAAGACCGATGGTTTTAGCAGGAGACAAAGCTAAGCAAGTCCAA 1649 • ·ι·ι TGGaCAAATGTGTaCCTGGATGCATTGGAACTGGGACTTGTCaTTACTGG 1416 15 111111111II111111111 I 11 I I I Mil I Mill llllllll lim TGGACAAATGTGTACCTGGATGCACTGGAACTGGGACTTGTCATTACTGG 1699 • i · 9 · AACTCTTCCGGTCTTCAACATAACCGGCCAATTTGAAAATAAGACAAACT 1466 I I I 11 11 111 I I 11 111 111 I I I i I I I In11 111 I 111 11 I I M II I I AACTCTTCCGGTCTTCAACATAACTGGCCAATTTGAAAATAAGACAAACT 1749 20 TAAAGAACCAGCTGATTCTTGGTGTGATGGGAeTAGATGTGTCTTTGGAA 1516 I 11 11 11 111 I I 11 I 11 111 I I I I II 11 11 111 1111111111111 11 TAAAGAACCAGCTGATTCTTGGAGTGATGGGAGTTGATGTGTCTTTGGAA 1799 • I » I · GATATTAAAAGACTGACACCACGTTTTACACTGTGCCCCAATGG...... 1560 I I I I 111 11 I 11 I I Μ 1111 II I I I I II I 11 I lllllllllll GATATTAAAAGACTGACACCACGTTTTACACTCTGCCCCAATGGCTACTA 1649 25 30 35 DK 173404 B1 57
Selvom opfindelsen her er blevet beskrevet med nogen specificitet, vil fagmanden på området erkende talrige varianter og modifikationer i det beskrevne, som ligger inden for opfindelsens ånd. Sådanne varianter og modifikationer ligger inden 5 for rammerne af opfindelsen, der er beskrevet i kravene.
Forskellige trek ved opfindelsen er også beskrevet i de følgende krav.
10 15 20 25 30 35

Claims (6)

1. DNA, kendetegnet ved, at det omfatter et cDNA med en sekvens, som koder for (a)2-underenheden af en pattedyr-calriumkanal valgt blandt en skeletmuskel- 5 calcium kanal, en hjerte-caldumkanal eller en neuronal calciumkanal, eller forløberen for nævnte (a)2-underenhed, idet sekvensen af nævnte cDNA er en cDNA-sekvens, som koder for den i tabel 2 viste aminosyresekvens, eller nævnte cDNA har don i tabel 3 viste sekvens.-
2. I det væsentlige ren (a^-underenhed af en pattedyr-calciumkanal, kendeteg-10 net ved, at den er fremstillet ved en fremgangsmåde, der omfatter ekspression i en eukaryot celle af et cDNA med en sekvens ifølge krav 1, idet pattedyr-calciumkanalen har en aminosyresekvens som vist i tabel 2 eller indkodes af sekvensen vist i tabel 3.
3. Eukaryot celle, k e n d e t e g n e t ved, at den omfatter en amfibie-oocyt med en heterolog calciumkanal, hvilken celle er fremstillet ved en fremgangsmåde omfattende 15 administration til nævnte celle af et første middel, som i det væsentlige består af et første RNA, som i nævnte celle kan translateres til forløberen for (a)runderenheden af en calciumkanal i et pattedyr af en første art, og af et andet middel, som i det væsentlige består af et andet RNA, der i nævnte celle kan translateres til forløberen for (a^-under-enheden af en calciumkanal i et pattedyr af en anden an, hvorhos nævnte første og anden 20 art er ens eller forskellige, forudsat at i det mindste den ene af nævnte forløber for nævnte (a)runderenhed og nævnte forløber for nævnte (a^-underenhed er fremmed i forhold til cellen, idet mindst ét blandt nævnte første RNA og nævnte andet RNA koder for en aminosyresekvens som angivet i tabel 2 eller som indkodet af DNA-sékvensen i tabel 3, og idet cellen anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge krav 25 6.
4. Eukaryot celle med en heterolog calciumkanal, kendetegnet ved, at calciumkanalen er fremstillet ved en fremgangsmåde omfattende ekspression af et første 59 DK 173404 B1 cDNA, som koder for forløberen for (a)runderenheden af en calciumkanal i et pattedyr af en første art, og et andet cDNA, som koder for forløberen for (a)2-underenheden af en calciumkanal i et pattedyr af en anden art, hvorhos nævnte første og anden art er ens eller forskellige, idet mindst ét blandt første cDNA og andet cDNA koder for en amino-5 syresekvens som vist i tabel 2, eller nævnte cDNA har den i tabel 3 viste sekvens, og idet cellen anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge krav 6.
5. Celle ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den er transformeret med et heterologt gen, som omfatter et transskriptionsstyreelement, der er aktivt i nævnte celle, og hvis transskriptionsaktivitet reagerer på en ion eller et molekyle, der kan komme ind 10. nævnte celle gennem en funktionel calciumkanal, operativt tilknyttet til ekspression til et strukturelt gen for et indikatorprotein.
6. Fremgangsmåde til at teste en forbindelse for aktivitet som calchimkanalagonist eller caldumkanalantagonist, kendetegnet ved, at en celle ifølge krav 5 suspenderes i en opløsning af nævnte forbindelse, der testes, og af en ion eller et molekyle, der er 15. stand til at komme ind i nævnte celle gennem en funktionel calciumkanal og er i stand til at påvirke niveauet af transskription fra nævnte transskriptionsstyreelement af nævnte heterologe gen i cellen, og at ændringen i koncentration af nævnte indikatoiprotein i cellen måles. 20
DK199002400A 1988-04-04 1990-10-04 (alfa)2-underenhed af en pattedyr-calciumkanal, DNA kodende derfor, eukaryot celle indeholdende calciumkanalen, samt fremga DK173404B1 (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17689988A 1988-04-04 1988-04-04
US17689988 1988-04-04
US8901408 1989-04-04
PCT/US1989/001408 WO1989009834A1 (en) 1988-04-04 1989-04-04 Calcium channel compositions and methods

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK240090D0 DK240090D0 (da) 1990-10-04
DK240090A DK240090A (da) 1990-10-04
DK173404B1 true DK173404B1 (da) 2000-09-25

Family

ID=22646350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK199002400A DK173404B1 (da) 1988-04-04 1990-10-04 (alfa)2-underenhed af en pattedyr-calciumkanal, DNA kodende derfor, eukaryot celle indeholdende calciumkanalen, samt fremga

Country Status (10)

Country Link
US (3) US5618720A (da)
EP (1) EP0424397B1 (da)
JP (1) JP3066398B2 (da)
AT (1) ATE139542T1 (da)
AU (1) AU3548089A (da)
CA (1) CA1341170C (da)
DE (1) DE68926713T2 (da)
DK (1) DK173404B1 (da)
FI (1) FI904827A0 (da)
WO (1) WO1989009834A1 (da)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5846757A (en) * 1988-04-04 1998-12-08 Sibia Neurosciences, Inc. Human calcium channel α1, α2, and β subunits and assays using them
US5386025A (en) * 1990-02-20 1995-01-31 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Calcium channel compositions and methods
US5429921A (en) * 1988-04-04 1995-07-04 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Assoc. Inc. Assays for agonists and antagonists of recombinant human calcium channels
US6653097B1 (en) 1991-08-15 2003-11-25 Merck & Co., Inc. Human calcium channel compositions and methods
US5851824A (en) * 1988-04-04 1998-12-22 Sibia Neurosciences, Inc. Human calcium channel α-1C/α-1D, α-2, β-1, and γsubunits and cells expressing the DNA
JP3066398B2 (ja) * 1988-04-04 2000-07-17 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド カルシウムチャンネル組成物および製造方法
US6387696B1 (en) 1988-04-04 2002-05-14 Merck & Co., Inc. Human calcium channel compositions and methods
US5874236A (en) * 1988-04-04 1999-02-23 Sibia Neurosciences. Inc. DNA encoding human calcium channel α-1A, β1, β-2, and β-4 subunits, and assays using cells that express the subunits
US5876958A (en) * 1988-04-04 1999-03-02 Sibia Neurosciences, Inc. Assays of cells expressing human calcium channels containing α1 β subunits
US6096514A (en) * 1988-04-04 2000-08-01 Sibia Neurosciences, Inc. Human calcium channel compositions and methods
US20040018510A1 (en) 1990-11-08 2004-01-29 Merck & Co., Inc. Human calcium channel compositions and methods
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US5401629A (en) * 1990-08-07 1995-03-28 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal
CA2092717C (en) * 1990-09-13 2001-06-12 Klim King Expression of g protein coupled receptors in yeast
DE4110785A1 (de) * 1991-04-04 1992-10-08 Bayer Ag Gewebe-spezifische humane neuronale calcium-kanal-subtypen und deren verwendung
US6229000B1 (en) 1991-04-04 2001-05-08 Bayer Aktiengesellschaft Tissue-specific human neuronal calcium channel subtypes and their use
ATE286976T1 (de) * 1991-08-15 2005-01-15 Merck & Co Inc Menschliche calcium-kanale und verwendungen davon
US6031003A (en) * 1991-08-23 2000-02-29 Nps Pharmaceuticals, Inc. Calcium receptor-active molecules
US5688938A (en) * 1991-08-23 1997-11-18 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Calcium receptor-active molecules
ATE312347T1 (de) * 1991-08-23 2005-12-15 Nps Pharma Inc Screening-verfahren für kalzium-rezeptor aktive verbindungen
US5763569A (en) * 1991-08-23 1998-06-09 The Brigham And Women's Hospital, Inc Calcium receptor-active molecules
US5858684A (en) * 1991-08-23 1999-01-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Method of screening calcium receptor-active molecules
US6001884A (en) * 1991-08-23 1999-12-14 Nps Pharmaceuticals, Inc. Calcium receptor-active molecules
US6313146B1 (en) 1991-08-23 2001-11-06 Nps Pharmaceuticals, Inc. Calcium receptor-active molecules
US6011068A (en) * 1991-08-23 2000-01-04 Nps Pharmaceuticals, Inc. Calcium receptor-active molecules
US5670113A (en) * 1991-12-20 1997-09-23 Sibia Neurosciences, Inc. Automated analysis equipment and assay method for detecting cell surface protein and/or cytoplasmic receptor function using same
WO1993014098A1 (en) * 1992-01-10 1993-07-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antigen recognized by patients with antibody associated lambert-eaton myasthenic syndrome (lems), dna encoding same and uses thereof
US5962314A (en) * 1993-02-23 1999-10-05 Nps Pharmaceuticals, Inc. Calcium receptor-active molecules
GB2286397C (en) * 1993-03-08 1997-09-10 Sibia Neurosciences Inc Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods of applying same
US7235648B1 (en) 1993-03-31 2007-06-26 Cadus Technologies, Inc. Yeast cells engineered to produce pheromone system protein surrogates, and uses therefor
US6255059B1 (en) 1993-03-31 2001-07-03 Cadus Pharmaceutical Corporation Methods for identifying G protein coupled receptor effectors
US6100042A (en) 1993-03-31 2000-08-08 Cadus Pharmaceutical Corporation Yeast cells engineered to produce pheromone system protein surrogates, and uses therefor
US5912122A (en) * 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US6090623A (en) * 1993-08-11 2000-07-18 Merck & Co., Inc. Recombinant human calcium channel β4 subunits
GB2287941B (en) * 1993-11-08 1998-01-28 Salk Inst Biotech Ind Human alpha2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
US6800452B1 (en) * 1994-08-08 2004-10-05 Science Applications International Corporation Automated methods for simultaneously performing a plurality of signal-based assays
PL183499B1 (pl) 1994-10-21 2002-06-28 Nps Pharma Inc Związki do modulowania receptorów wapniowych i kompozycje farmaceutyczne
US5623051A (en) * 1994-11-10 1997-04-22 University Of Washington Methods and compositions for screening for presynaptic calcium channel blockers
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
DK0907631T3 (da) 1996-05-01 2003-09-22 Nps Pharma Inc Uorganiske ionreceptoraktive forbindelser
US6362009B1 (en) 1997-11-21 2002-03-26 Merck & Co., Inc. Solid phase synthesis of heterocycles
US6528630B1 (en) * 1997-12-03 2003-03-04 Merck & Co., Inc. Calcium channel compositions and methods
AU4125699A (en) 1998-06-02 1999-12-20 University Technologies International Inc. Retinal calcium channel (alpha)1f-subunit gene
US6441156B1 (en) * 1998-12-30 2002-08-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Calcium channel compositions and methods of use thereof
US7524643B2 (en) 2001-04-11 2009-04-28 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. CDNA encoding the human alpha2 delta4 calcium channel subunit
US7049084B2 (en) 2001-05-30 2006-05-23 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroblastoma cell lines expressing the α2δ subunit of calcium channels and methods therefore
WO2003059251A2 (en) 2001-10-22 2003-07-24 The Scripps Research Institute Antibody targeting compounds
US20040009537A1 (en) * 2002-01-11 2004-01-15 Jack Roos Methods of modulating and of identifying agents that modulate intracellular calcium
ES2641271T3 (es) 2006-10-30 2017-11-08 Le Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Ensayo de gen indicador, kit y células con sensibilidad y/o especificidad mejoradas para determinar el nivel del TNF-alfa
AU2008244576A1 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Merck Sharp & Dohme Corp. 2-substituted indole derivatives as calcium channel blockers
US20100204247A1 (en) * 2007-10-04 2010-08-12 Duffy Joseph L N-substituted oxindoline derivatives as calcium channel blockers
US8304434B2 (en) * 2007-10-04 2012-11-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted aryl sulfone derivatives as calcium channel blockers
WO2009045386A1 (en) * 2007-10-04 2009-04-09 Merck & Co., Inc. N-substituted oxindoline derivatives as calcium channel blockers
CN101970427A (zh) 2008-02-29 2011-02-09 Vm生物医药公司 治疗疼痛症状及其它失调的方法
ES2543381T3 (es) 2008-03-04 2015-08-18 Centre National De La Recherche Scientifique Ensayo con gen indicador, las células y el kit para realizar dicho ensayo
WO2009132452A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Neuromed Pharmaceuticals Ltd. Diaryl-cyclylalkyl derivatives as calcium channel blockers
WO2009132454A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Neuromed Pharmaceuticals Ltd. Di-t-butylphenyl piperazines as calcium channel blockers
US20090270394A1 (en) * 2008-04-28 2009-10-29 Galemmo Jr Robert Cyclylamine derivatives as calcium channel blockers
JP2012504127A (ja) * 2008-09-29 2012-02-16 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション カルシウムチャネル遮断薬としての置換アリールスルホン誘導体
EP2493297B1 (en) 2009-10-30 2016-08-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Heterocycle amide t-type calcium channel antagonists
EP2831071B1 (en) 2012-03-29 2018-11-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Imidazolyl methyl piperidine t-type calcium channel antagonists

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0046790A4 (en) * 1980-02-25 1983-01-31 Richard Axel USE OF EUKARYOTIC PROMOTOR SEQUENCES IN THE PRODUCTION OF PROTEIN MATERIAL.
US4788135A (en) * 1983-03-07 1988-11-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Jr. University System for efficient isolation of genes using probes
US4912202A (en) * 1987-01-08 1990-03-27 Miles Inc. Dihydropyridine receptor and antibodies thereto
US4906564A (en) * 1987-03-13 1990-03-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Antigenic determinants recognized by antibodies obtained using a pathogenic agent or a derivative thereof that presents a restricted set of antigens
US5024939A (en) 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
US4954436A (en) * 1987-08-06 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Dihydropyridine-sensitive calcium channel as a tumor associated marker
US4950739A (en) 1988-02-10 1990-08-21 New York University Membrane calcium channels and factors and methods for blocking, isolating and purifying calcium channels
US5429921A (en) * 1988-04-04 1995-07-04 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Assoc. Inc. Assays for agonists and antagonists of recombinant human calcium channels
JP3066398B2 (ja) * 1988-04-04 2000-07-17 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド カルシウムチャンネル組成物および製造方法
US5876958A (en) * 1988-04-04 1999-03-02 Sibia Neurosciences, Inc. Assays of cells expressing human calcium channels containing α1 β subunits
US5407820A (en) * 1988-04-04 1995-04-18 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Calcium channel α-2 subunit DNAs and cells expressing them
US5851824A (en) * 1988-04-04 1998-12-22 Sibia Neurosciences, Inc. Human calcium channel α-1C/α-1D, α-2, β-1, and γsubunits and cells expressing the DNA
US5874236A (en) * 1988-04-04 1999-02-23 Sibia Neurosciences. Inc. DNA encoding human calcium channel α-1A, β1, β-2, and β-4 subunits, and assays using cells that express the subunits
US5386025A (en) * 1990-02-20 1995-01-31 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Calcium channel compositions and methods
US5846757A (en) * 1988-04-04 1998-12-08 Sibia Neurosciences, Inc. Human calcium channel α1, α2, and β subunits and assays using them
US5189020A (en) * 1989-11-22 1993-02-23 Neurex Corporation Method of reducing neuronal damage using omega conotoxin peptides
US5051403A (en) * 1989-11-22 1991-09-24 Neurex Corporation Method of treating ischemia-related neuronal damage
US5264371A (en) * 1989-11-22 1993-11-23 Neurex Corporation Screening method for neuroprotective compounds
US5401629A (en) * 1990-08-07 1995-03-28 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal
AU1258292A (en) * 1991-01-18 1992-08-27 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating expression of hematopoietic growth factor genes
DE4110785A1 (de) * 1991-04-04 1992-10-08 Bayer Ag Gewebe-spezifische humane neuronale calcium-kanal-subtypen und deren verwendung
WO1993008469A1 (en) * 1991-10-23 1993-04-29 Trustees Of Dartmouth College Recombinant calcium channel polypeptides
WO1993014098A1 (en) * 1992-01-10 1993-07-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antigen recognized by patients with antibody associated lambert-eaton myasthenic syndrome (lems), dna encoding same and uses thereof
DE4222126A1 (de) 1992-02-17 1993-08-19 Bayer Ag Humane neuronale beta-untereinheiten spannungsabhaengiger calciumkanaele und deren verwendung
RU2104286C1 (ru) * 1992-07-27 1998-02-10 Пфайзер Инк. Полипептид или его фармацевтически приемлемые соли
ATE196651T1 (de) 1993-07-30 2000-10-15 Elan Pharm Inc Für die alpha-1e untereinheit des menschlichen kalziumkanals kodierende dna
US5712158A (en) * 1995-06-06 1998-01-27 Warner-Lambert Company Cell line for the rapid expression of functional calcium channels

Also Published As

Publication number Publication date
US7063950B1 (en) 2006-06-20
DE68926713T2 (de) 1996-11-14
CA1341170C (en) 2001-01-16
ATE139542T1 (de) 1996-07-15
AU3548089A (en) 1989-11-03
DK240090D0 (da) 1990-10-04
JP3066398B2 (ja) 2000-07-17
FI904827A0 (fi) 1990-10-01
EP0424397B1 (en) 1996-06-19
EP0424397A1 (en) 1991-05-02
DE68926713D1 (de) 1996-07-25
EP0424397A4 (en) 1992-08-12
US5618720A (en) 1997-04-08
US6013474A (en) 2000-01-11
DK240090A (da) 1990-10-04
JPH04503152A (ja) 1992-06-11
WO1989009834A1 (en) 1989-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK173404B1 (da) (alfa)2-underenhed af en pattedyr-calciumkanal, DNA kodende derfor, eukaryot celle indeholdende calciumkanalen, samt fremga
US5407820A (en) Calcium channel α-2 subunit DNAs and cells expressing them
US5981193A (en) Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
US5595880A (en) DNA encoding an α2B adrenergic receptor and uses thereof
DE69831222T2 (de) Verbindungen zur immundiagnose von prostatakrebs und deren verwendung
KR101446626B1 (ko) 신장암 진단, 신장암 환자 예후 예측을 위한 조성물 및 방법
US5726035A (en) Recombinant production of mammalian calcium channel gamma subunits
EP1270724A2 (en) Guanosine triphosphate-binding protein coupled receptors
CA2554380C (en) Mecp2e1 gene
US20070009916A1 (en) Guanosine triphosphate-binding protein coupled receptors
WO1994004571A1 (en) A substrate for the epidermal growth factor receptor kinase
US5744594A (en) DNA encoding ATP-sensitive potassium channel genes
JP2003159059A (ja) 痛みに関連する分子の同定及び使用
US7001985B2 (en) Human cyclin I and genes encoding same
WO2012134039A1 (ko) 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질
CN101300348A (zh) 肾癌诊断、肾癌患者预后预测用的组合物及方法
KR102099392B1 (ko) 개체의 제엽염 진단용 조성물 및 키트, 개체가 제엽염에 걸렸는지를 진단하는 방법 및 제엽염 치료제를 탐색하는 방법
Weinshank et al. DNA encoding an alpha2B adrenergic receptor and uses thereof
Nash Overview of receptor cloning
Weinshank et al. DNA encoding an α 2B-adrenergic receptor
JPH09221499A (ja) 神経細胞で発現する新規タンパク質
WO2004055186A1 (ja) グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型の受容体
JP2002330770A (ja) 乾癬で発現変動する遺伝子およびこれに着目した検査方法
JP2003284560A (ja) Ａｂｃトランスポーター関連遺伝子ａｂｃｃ１３
JPH09301998A (ja) 神経細胞の細胞骨格の動的制御因子蛋白質、そのポリヌクレオチドおよびその抗体

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired