ES2641271T3 - Ensayo de gen indicador, kit y células con sensibilidad y/o especificidad mejoradas para determinar el nivel del TNF-alfa - Google Patents

Abstract

Una línea celular transformada establemente con una construcción de gen indicador que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico indicador unida operativamente a un elemento de control de la transcripción que se activa como parte de la ruta de transducción de la señal NF-κ B iniciada por un receptor del TNF-α en respuesta al TNF-α como señal extracelular, en la que: a) dicho elemento de control de la transcripción es un promotor sintético que comprende un promotor mínimo SV40 y SEQ ID NO: 2, que es específico para NF-κ B, mientras que carece de sitios de unión para otros factores de transcripción; y b) las células de dicha línea celular carecen de una o más moléculas de superficie celular, distintas del receptor de TNF-α, que se sabe que son activadoras principales de la ruta de transducción de la señal NF-κ B que causarían de otra manera una interferencia con la señal extracelular del TNF-α cuando se utiliza la línea celular para determinar el nivel de TNF-α en un ensayo de gen indicador, en donde dicha una o más moléculas de superficie celular comprenden los receptores para IFNγ e IL2.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Ensayo de gen indicador, kit y celulas con sensibilidad y/o especificidad mejoradas para determinar el nivel del TNF- alfa

Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un ensayo de gen indicador y a un kit para determinar la presencia y/o el nivel, en una muestra, de una senal extracelular que activa la actividad de transduccion de la senal de una molecula o complejo de superficie celular. La presente invencion se refiere adicionalmente a una llnea celular que ese puede utilizar en dicho ensayo.

Descripcion de la tecnica relacionada

Las protelnas de la superficie celular permiten la transduccion intracelular de senales extracelulares. Las protelnas de la superficie celular proporcionan a las celulas eucariotas, as! como procariotas, un medio para detectar senales extracelulares y transducen dichas senales intracelularmente de manera que en ultimo termino dan como resultado una respuesta celular o una respuesta tisular u organica concertada. Las protelnas de la superficie celular, al transmitir intracelularmente la informacion con respecto al ambiente extracelular mediante rutas intracelulares especlficas, inducen una respuesta apropiada a un estlmulo particular. La respuesta puede ser inmediata y transitoria, lenta y sostenida, o cualquier mezcla de las mismas. Mediante una matriz de protelnas de superficie de membrana variadas, las celulas eucariotas son exquisitamente sensibles a su medio ambiente.

Manna (J Immunol 2000; 165:4927-4934) desvela celulas Jurkat humanas transfectadas transitoriamente con una construccion de un gen indicador que responde al TNF-alfa que comprende una fosfatasa alcalina secretora estable al calor (SEAP) unida a un ADN promotor de NF-kB.

Las moleculas de senal extracelulares, tales como citocinas, factores de crecimiento, hormonas, vasodilatadores, y neurotransmisores, ejercen sus efectos, al menos en parte, mediante la interaccion con protelnas de la superficie celular. Por ejemplo, algunas moleculas de senal extracelular producen cambios en la transcripcion de genes diana mediante cambios en los niveles de mensajeros secundarios, tales como el cAMP. Otras senales alternan la expresion genetica indirectamente activando la expresion de genes, tales como los genes inmediato-tempranos que codifican protelna reguladoras, que a su vez activan la expresion de otros genes que codifican protelnas reguladoras de la transcripcion. Otras moleculas de senal extracelular producen la activacion de transductores de senal citoplasmatica y protelnas activadoras de la transcripcion (STAT) que aumentan la transcripcion de grupos especlficos de genes.

Los receptores de superficie celular y los canales de iones estan entre las protelnas de superficie celular que responden a senales extracelulares e inician los eventos que dan lugar a esta expresion genetica y respuestas variadas. Los canales de iones y los receptores localizados en la superficie celular son ubicuos y protelnas de la membrana de la superficie celular fisiologicamente importantes.

Receptores de superficie celular

Los receptores localizados en la superficie celular son protelnas que abarcan la membrana que se unen a moleculas de senalizacion extracelular o cambios en el medio ambiente extracelular y transmiten la senal mediante las rutas de transduccion de la senal para efectuar una respuesta celular. Los receptores de la superficie celular se unen a moleculas de senal circulantes, tales como las citocinas, factores de crecimiento y hormonas, etc., como la etapa inicial en la induccion de numerosas rutas intracelulares. Los receptores se clasifican basandose en el Tipo particular de ruta que se induce. Entre estas clases de receptores hay clases de receptores de citocinas que incluyen las que se unen a factores de crecimiento y que tienen una actividad tirosina cinasa intrlnseca, tales como los receptores del factor de crecimiento que se unen a la heparina (HBGF), la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas, la superfamilia de receptores de citocinas/hematopoyetina, la superfamilia de receptores del factor de crecimiento de nervios, otros receptores de tirosina o serina cinasas, y los que se acoplan a protelna efectoras mediante protelnas reguladoras de la union del nucleotido guanina, a los que se hacer referencia como receptores acoplados a protelna G y protelnas G, respectivamente.

Las citocinas son mensajeros intercelulares que coordinan la comunicacion entre las celulas de un tejido particular, por ejemplo, interacciones entre anticuerpos y celulas T del sistema inmunitario, y sirven para modular o modificar la repuesta biologica. Son pleiotropicas y tienen un amplio espectro de efectos biologicos sobre mas de un Tipo de celulas o tejidos. Los receptores para las citocinas se agrupan ampliamente en dos clases, en que los receptores de citocinas de Clase I incluyen receptores que se unen a distintas interleucinas (IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15), eritropoyetina (EPO), hormona de crecimiento (GH), factor estimulante de colonias de granulocitos (G- CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos macrofagos (GM-CSF), factor inhibidor de leucemia (LIF), y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

factor neurotrofico ciliar (CNTF), y los receptores de citocina de Clase II incluye receptores que se unen al interferon (IFN) a/p, IFFy, e IL-10.

Receptores de interferon

Los interferones humanos (IFN) son una familia de citocinas helicoidales homologas compuestas por tres clases distintas: Tipo I, Tipo II, y Tipo III que se basan en la homologla de secuencias de nucleotidos y aminoacidos. Los IFN Tipo I humanos consisten en IFN-a, IFN-p, IFN-£, IFN-k, e IFN-w. El IFN-a humano incluye un grupo de protelnas relacionadas estrechamente codificadas por al menos 12 genes de IFN-a funcionales. Los IFN-p, IFN-£, IFN-k e IFN-w se codifican por genes relacionados unicos relacionados mas distantes. El IFN Tipo II, o IFN-y, esta codificado por un gen no relacionado y se une a distintos receptores de superficie celular (De Maeyer et al., 1988; Pestka et al., 1987 y Diaz et al., 1993). Recientemente, se ha descrito un nuevo grupo de interferones designados IFN-X o IFN de Tipo III. El grupo tiene tres miembros IFN-X1, IFN-X2, e IFN-X3 tambien llamado interleucina-29 (IL- 29) (X1), e IL-28A/B (X2/3). (Sheppard et al., 2003; y Ank et al., 2006).

Los IFN Tipo I se unen a un receptor comun, como se muestra por su capacidad para competir de manera cruzada por la union al receptor (Pestka et al., 1987; Branca et al., 1981; y Merlin et al., 1985). El receptor de interferon Tipo I tiene el numero mas grande de ligandos naturales, algunos hasta 14 en total, de todos los receptores de citocinas conocidos. La union de los interferones a su receptor de superficie celular representa la etapa inicial y probablemente mas especlfica de la ruta de senalizacion de IFN.

El receptor del IFN Tipo I esta compuesto por dos glucoprotelnas transmembrana, INFAR1 y INFAR2 (Uze et al., 1990; Novick et al., 1994; Lutfalla et al., 1995; Domanski et al., 1995), que se tirosina-fosforilan rapidamente despues de la union con el IFN (Platanias et al., 1994; Constantinescu et al., 1994; y Abramovich et al., 1994). Ambas subunidades pertenecen a la superfamilia de receptores de citocinas de clase II (Bazan et al., 1990 y Thoreau et al., 1990) y son necesarios para la union de ligando de alta afinidad y el establecimiento de la actividad biologica (Langer et al., 1996 y Domanski et al., 1996). Los receptores de citocinas de Clase II se distinguen de los receptores de Clase I basandose en el patron de las parejas conservadas de restos de cistelna que se cree que forman enlaces disulfuro.

El receptor del IFN Tipo II (IFNy) esta compuesto por dos glucoprotelnas transmembrana, IFNGR1 e IFNGR2 que se pre-ensamblan en la superficie celular. La union del IFNy a su receptor activa las tirosina cinasas Jak1 y Jak2 dando como resultado la tirosina-fosforilacion y la formacion de un homodlmero Stat1. El homodlmero Stat1 activado se translocaliza entonces en el nucleo donde se une a la GAS (Secuencia activada gamma) dando como resultado la activacion transcripcional de los genes activados de IFNy.

Los interferones de Tipo III se une a un receptor unico que comprende la IL-28Ra, que es especlfica de una cadena de los IFN-X, y la cadena IL-10Rp que tambien es parte de los receptores para la IL-10, IL-22, e IL-26 (Ank et al, 2006).

Al contrario que con otros receptores de citocinas, particularmente el receptor de IFNy, ni el IFNAR1 ni el IFNAR2 solos se unen a IFNa ni a IFNp con una afinidad comparable al heterodlmero. A pesar del hecho de que el IFNAR2 tiene un papel importante en la union al ligando, el IFNAR1 contribuye a la union con el IFN aumentando la afinidad del complejo de receptores (4-10 veces) respecto al del IFNAR2 solo. El IFNAR1 tambien modula la especifidad de la union al ligando respecto a la observada en el IFNAR2 solo (Cohen et al., 1995; Russell-Harde et al., 1995; Cutrone et al., 1997; y Cook et al., 1996). El IFNAR1 tiene un dominio extracelular mas grande que la mayorla de los demas receptores de citocinas de Clase II, compuesto por 4 subdominios Tipo inmunoglobulinas separados por motivos di o tri-prolinas que se pueden dividir en dos repeticiones en tandem (Novick et al., 1994; Lutfalla et al., 1992; y Uze et al., 1995).

El IFNAR1 humano, murino y bovino se han clonado y expresado en celulas humanas y murinas. Los estudios que se han llevado a cabo con celulas transfectadas muestran que el IFNAR1 tiene un papel central en la union al ligando, las respuestas celulares a los IFN y en la induccion de actividades biologicas de los interferones Tipo I (Novick et al., 1994; Abramovich et al., 1994; Uze et al., 1992; Mouchel-Vielh et al., 1992; Lim et al., 1993; Cleary et al., 1994; Constantinescu et al., 1995; Hwang et al., 1995; Vandenbroek et al., 1995; y Colamonici et al., 1994). El receptor del IFN tambien determina el alto grado de especificidad de especie caracterlstico de los IFN. Por lo tanto, la transfeccion de celulas de raton con IFNAR1 e IFNAR2 hace que las celulas de raton sean sensibles a los IFN Tipo I humanos ya que tanto las celulas humanas como las de raton comparten una ruta de senalizacion comun y elementos de respuesta a IFN comunes en las regiones de los genes regulados por IFN. Ademas, se ha demostrado que el dominio intracelular del IFNAR1 tiene un papel clave en la transduccion de la senal iniciada en la superficie celular uniendo los interferones de Tipo I al nucleo (Basu et al., 1998). La destruccion dirigida del gen de IFNAR1 da como resultado la perdida de la respuesta antivlrica de los IFN Tipo I demostrando que este receptor polipeptldico es un componente esencial del complejo de receptores y que se necesitan tanto la subunidad IFNAR1 como IFNAR2 para la senalizacion de IFNa e IFNp (Vandenbroek et al., 1995; Muller et al., 1994; Fiette et al., 1995; Steinhoff et al., 1995; y van den Broek et al., 1995).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La union del interferon Tipo I al complejo de receptores activa dos Janus cinasas, Tyk2 y JAK1, que median en la tirosina fosforilacion y en la activacion de dos factores de transcripcion citoplasmaticos latentes STAT1 y STAT2 que forman un complejo (ISGF3) con una protelna de union a ADN p48, protelna de respuesta al interferon 9 (IRF 9), que se translocaliza en el nucleo para promover la transcripcion genetica especlfica (Fu et al., 1992; Schindler et al., 1992; Darnell et al., 1994; Ihle et al, 1995; y Taniguchi, 1995). Tanto Tyk2 como STAT2 estan asociadas constitutivamente con la region proximas de membrana de la cadena de IFNAR1, mientras que JAK1 y STAT1 estan asociadas flsicamente con IFNAR2 y los cuatro factores se activan rapidamente durante la estimulacion con IFNa (Lutfalla et al., 1995; Bazan, 1990; Basu et al., 1998; Barbieri et al., 1994; Velazquez et al., 1995; Uddin et al., 1995; Yan et al., 1996(a) y 1996(b).

La union de los IFN Tipo III a su receptor de superficie celular tambien activa el complejo ISGF3 lo que sugiere que los IFN Tipo III tambien activan varios genes en comun con los IFN Tipo I (Ank et al., 2006).

Las poblaciones clave de celulas incluyen las CD distribuidas a lo largo de los tejidos perifericos actuan como centinelas capaces de reconocer agentes infecciosos por medio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Estos incluyen la familia de receptores Tipo Toll (TLR) de la superficie celular y los receptores de membrana endosomicos (Uematsu y Akira, 2007) y los receptores proteicos citosolicos Tipo gen I inducible por el acido retinoico (RIG-I), RIG-i, MDA5 y LGP2 (Yoneyama y Fujita, 2007). Se han identificado trece miembros de la familia de TLR en mamlferos (Uematsu y Akira, 2007). Cada TLR media en una respuesta distinta en asociacion con diferentes combinaciones de cuatro protelnas adaptadoras que contienen el domino del receptor de IL-1/Toll (TIR) (MyD88, TRIF, TRAP/MAL, y TRAM). Todos los TLR excepto el TLR3 interactuan con MyD88. El TLR3 que reconoce el ARN vlrico de cadena sencilla o cadena doble, se localiza en los endosomas de las CD mieloides y necesita la acidificacion de veslculas para la activacion. El TLR3 senaliza mediante TRIF y activa el TBK1/I KKe que fosforila el factor 3 regulador de interferon 3 (I RF3) y NFkB, que da como resultado la produccion de IFNp (Hemmi et al, 2004, Perry et al., 2004). Los receptores proteicos Tipo RIG-I son DExD/H box aRn helicasas, dos de las cuales, RIG-I y MDA5, albergan motivos Tipo activacion de caspasa y del dominio de reclutamiento (CARD) en el extremo N (Yoneyama y Fujita, 2007). El dominio CARD interactua con I PS-1 dando como resultado la activacion de IRF3 y NFkB, y la produccion de IFNp. Por lo tanto, la activacion de los PRR da lugar a la produccion de citocinas pro- inflamatorias que incluyen los IFN Tipo I y la activacion de la respuesta inmunitaria innata. Las celulas dendrlticas senalizan principalmente mediante los TLR mientras que los receptores Tipo RIG-I predominan en otros Tipos celulares. Se pueden distinguir dos sub-grupos principales de CD en el ser humano, CD mieloides derivadas de monocitos, CD11c(+), presentes en la mayorla de los tejidos, y CD plasmacitoides (pCD), CD11c(-), presentes principalmente en los ganglios linfaticos. Las CD plasmacitoides son las productoras principales de IFN Tipo I en respuesta a virus (Steinmann y Hemmi, 2006). Las CD plasmacitoides expresan altos niveles de TLR 7/8 y TLR9 que reconocen ARN de cadena sencilla (ssARN) y ADN CpG, respectivamente (Diebold et al., 2004, Heli et al., (2004). Hemmi et al., 2000) La activacion tanto de TLR 7/8 y TLR9 da lugar a la formacion de un complejo con MyD88 y la fosforilacion de IRF7 y la produccion de altos niveles de IFN de Tipo I (Uematsu y Akira, 2007).

Receptores de TNF

El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) en una citocina multifuncional que ejerce efectos pleiotropicos en diferentes Tipos celulares. El TNF-a se sintetiza como pro-TNF, una protelna unida a la membrana de 26 kDa, que se libera al escindir su dominio pro por la enzima convertidora de TNF (TACE) para dar lugar a una protelna de 17 kDa que consiste en 157 aminoacidos que se encuentra como un homotrlmero en solucion. El TNF-a se une a dos receptores distintos el TNFR-1 (p55) y el TNFR-2 (p75). El TNFR-1 contiene un dominio de muerte (ausente en el TNFR2) que esta implicado en la induccion de apoptosis. La union del homotrlmero de TNF-a al TNFR-1 da como resultado la trimerizacion del TNFR-1 y se libera el silenciador del dominio de muerte (SODD). El dominio de muerte asociado al TNFR (TRADD) se une al dominio de muerte del TNFR-1 y recluta protelnas adaptadoras, protelna que interactua con el receptor (RIP), factor 2 asociado al TNFR (TRAF-2), y el dominio de muerte asociado a Fas (FADD). El TNFR-1 senaliza la apoptosis, uniendose el FADD a la pro-caspasa-8, cuya activacion da lugar a la induccion de una cascada de proteasas que da como resultado a la apoptosis. El TNFR-1 senaliza la supervivencia por reclutamiento de TRAF-2 que inhibe la apoptosis mediante la protelna citoplasmatica inhibidora de apoptosis (cIAP). Una de las rutas de senalizaciones principales desencadenadas por el reclutamiento de TRAF-2 y RIP por el complejo del receptor TNFR-1 es la ruta NF-kB que transduce una senal en el nucleo culminando en la activacion transcripcional de varios genes diana de TNF (Schwamborn et al., 2003). El NF-kB es un factor de transcripcion ubicuo inducido por varias citocinas (que incluyen IFNy, IL2, IL5 e IFNa2). El NF-kB esta implicado en la regulation de numerosos genes implicados en procesos que incluyen, la respuesta inflamatoria, apoptosis, cancer, supervivencia neuronal, e inmunidad innata. La activacion del NF-kB se controla principalmente a nivel post- transcripcional por degradation de la subunidad inhibidora IkB del complejo p55/p65/kB presente en el citoplasma. Los estlmulos activadores tales como el TNF-a activan un complejo cinasa compuesto por dos cinasas especlficas de kB (IKKa e IKKp) y una subunidad moduladora (NEMO o IKKy). Esto da lugar a la fosforilacion de la subunidad inhibidora, que se ubiquitinila entonces y se degrada mediante el proteosoma. Esto desencadena la translocalizacion del NF-kB en el nucleo, donde inicia la transcripcion uniendose a secuencias reguladoras (secuencias de union/reconocimiento de NF-kB) presentes en la region promotora de los genes diana de NF-kB.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Receptores acoplados a G

Las rutas de senalizacion transmembrana de protelna G consisten en tres protelnas: los receptores, las protelnas G y los efectores. Las protelnas G, que son intermediarias en las rutas de senalizacion transmembrana, son heterodlmeros y consisten en subunidades a, p y y. Entre los miembros de una familia de protelnas G las subunidades a son diferentes. Las funciones de protelnas G se regulan por la asociacion clclica de GTP con la subunidad a seguido por la hidrolisis de GTP a GDP y disociacion del GDP.

Los receptores acoplados a protelna G son una clase de receptores diversa que median la transduccion de senales uniendose a las protelnas G. La transduccion de senal se inicia mediante la union al ligando con el receptor de la membrana celular, que estimula la union del receptor a la protelna G. La interaccion de receptor con protelna G libera GDP, que se une especlficamente a la protelna G y permite la union de GTP, que activa la protelna G. La protelna G activada se disocia del receptor y activa la protelna efectora, que regula los niveles intracelulares de mensajeros secundarios especlficos. Ejemplos de dichas protelnas efectoras incluyen la adenil ciclasa, fosfolipasa C, y otras.

Factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento

Los factores de crecimiento polipeptldicos son moduladores de la proliferacion y diferenciacion celular cuyas funciones biologicas estan mediadas por la interaccion del factor de crecimiento con los receptores de la superficie celular y las posteriores alteraciones de la expresion genetica. Los factores de crecimiento se unen a receptores especlficos y parece que inducen la tirosina fosforilacion y la slntesis de ARNm c-fos. Ademas, al menos algunos factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (Yeh et al., 1987) y factor 2 de crecimiento de union a heparina o factor de crecimiento de fibroblastos (Bouche et al., 1987), se translocalizan en el nucleo.

La activacion de los receptores de factores de crecimiento por la interaccion con los factores de crecimiento especlficos o con agentes tales como el acetato forbol mlstrico (PMA) activa la protelna cinasa C, que es una familia de protelna cinasas activadas por calcio y fosfollpidos. Esta activacion da como resultado la transcripcion de una matriz de genes que codifican factores de transcripcion de proto-oncogenes, incluyendo c-fos, c-myc, y c-jun, proteasas, inhibidores de proteasas, incluyendo la colagenasa Tipo I y el inhibidor del activador de plasminogeno, y moleculas de adhesion, que incluyen la molecula de adhesion intercelular I. La activacion de protelna cinasa C antagoniza con la actividad del factor de crecimiento por la rapida fosforilacion de receptores de factores de crecimiento, que de esta manera disminuye la actividad de la tirosina cinasa. Se cree que los factores de crecimiento y otros mitogenos que inducen la proliferacion celular y el crecimiento celular tienen un papel en el crecimiento tumoral que a menudo albergan receptores de superficie celular identificables para los factores de crecimiento y otras senales extracelulares.

La interaccion del factor de crecimiento de nervios (NGF) con su receptor es tlpica de la matriz de respuestas que induce dicha senal extracelular. El NGF es una hormona polipeptldica de crecimiento que es necesaria para la diferenciacion y crecimiento de la neurona sensitiva derivada de la cresta neural. El NGF se une a su receptor de la superficie celular especlfico y se transporta retrogradamente al cuerpo celular (Changelian et al., 1989). Esto inicia una cascada de eventos intracelulares, que culminan en un fenotipo diferenciado. Las celulas PC12, que son una llnea celular de feocromocitoma de rata, se utilizan como modelo para el estudio de la diferenciacion mediada por NGF. Cuando las celulas se PC12 se tratan con NGF, cambian de celulas Tipo cromafines adrenales replicantes a celulas Tipo neuronas simpaticas excitables electricamente no replicantes.

Junto con los cambios fenotlpicos, existe la induccion y expresion de genes especlficos. La union del NGF a las celulas PC12 induce la expresion inmediata y rapida de ciertos genes, incluyendo los genes de c-fos, NGF1-A, y NGF1-B, a los que se hace referencia como genes tempranos. Se cree que dichos genes tempranos codifican reguladores de la transcripcion. El producto del gen NGF1-A contiene dominios en “dedos de zinc” repetidos en tandem que son caracterlsticos de las protelnas de union a ADN, y el NGF1-B proteico es homologo a los miembros de la familia de receptores de glucocorticoides y, por lo tanto, pueden funcionar como modulador de la transcripcion dependiente de ligando. El producto del gen c-fos, FOS parece funcionar como una moleculas reguladora de la transcripcion.

El gen c-fos y genes relacionados

Como se ha expuesto anteriormente, la induccion de la expresion del gen c-fos es un evento que es comun a varias rutas de respuesta que se inician por la actividad de varias protelnas de la superficie celular.

El producto del gen c-fos, FOS, se asocia con el activador de la transcripcion JUN, que es el producto del gen c-jun, para formar un complejo que forma un complejo de activacion de la transcripcion, AP-1. La transcripcion de ambos c-fos y c-jun se induce rapidamente y transitoriamente despues de la estimulacion. Los ARNm inducidos se acumulan durante 1-2 horas en el citoplasma en el que las protelnas FOS y JUN, que tienen una vida corta, se traducen y despues se translocalizan en el nucleo para formar un complejo proteico heterodimerico que se une al

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

elemento regulador de ADN, el sitio de union de AP-1.

Los genes c-fos y c-jun son miembros de familias geneticas que codifican protelnas que participan en la formacion de complejos heterodimericos que interaction con los sitios de union AP-1. El factor de transcripcion AP-1 esta compuesto de varios complejos proteicos cuyas concentraciones cambian con la estimulacion celular. Estos complejos interaction especlficamente con un motivo de secuencias de nucleotidos con un nucleo de siete bases, del que se sabe que es un constituyente relativamente comun de elementos reguladores de la transcripcion tanto positivos como negativos y que son necesarios tanto para los niveles de la expresion genetica basales como inducidos.

Los productos genicos, FOS y JUN cooperan en la regulacion de genes diana que soportan muchas respuestas celulares y adaptativas al medio ambiente. Estan implicados en varios procesos neurofisiologicos.

Por lo tanto, la induccion de c-fos implica rutas de mensajeros secundarios distintos que action mediante elementos reguladores separados y que modifican diferencialmente, el producto genico resultante, FOS, que a su vez interactua con diferentes rutas con protelna JUN modificada diferencialmente. Por lo tanto, una multitud de eventos extracelulares induce la expresion de un pequeno numero de protelnas inducibles que forman una matriz de complejos proteicos que pueden unirse diferencialmente a elementos reguladores de aDn que contienen sitios de union AP-1. Por lo tanto, muchas protelnas de la superficie celular pueden actuar mediante rutas de transduccion solapadas y transducen senales extracelulares que en ultimo termino inducen varias respuestas.

Hay muchos ensayos que se pueden basar en la actividad in vivo en una llnea celular viva. Un ejemplo es una llnea celular que tiene un Elemento de Respuesta Estimulante de Interferon (ISRE) conectado a un gen de luciferasa, u otro gen indicador, de manera que cuando la llnea celular se somete a la presencia del interferon como senal extracelular, la actividad de transduccion de la senal de los receptores de la superficie celular del interferon endogeno produce una senal que activa el ISRE, que produce entonces la transcripcion del gen de luciferasa. Por lo tanto, la actividad de luciferasa de creacion de luz se puede medir y se relaciona con la cantidad de interferon que esta presente en la muestra, y que es proporcional a la cantidad de interferon a lo largo de un intervalo particular (Lallemand et al., 1996).

Lleonart et al. (1990) describieron un ensayo de gen indicador para el interferon Tipo I basado en celulas Vero de mono transfectadas con el promotor Mx de raton inducible por el interferon Tipo I unido al gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) como gen indicador. Este ensayo de interferon Tipo I se desarrollo adicionalmente transfectando las celulas Vero de mono con un plasmido que alberga el gen indicador de luciferasa bajo el control del promotor Mx1 de raton inducible por interferon Tipo I (Canosi et al., 1996).

Un Tipo adicional de ensayo de gen indicador de interferon se desarrollo por Hammerling et al. (1998) que utilizo una llnea celular de glioblastoma humano transfectada con una construccion de gen indicador del promotor proteico acido fibrilar (GFAP) y un gen indicador de p-galactosidasa (IacZ) de E. coli.. En este ensayo en particular, lo que se mide es la reduccion/inhibicion de la expresion de p-galactosidasa por el interferon humano Tipo I o Tipo II de una manera selectiva y dependiente de la dosis.

La cita de cualquier documento en el presente documento no se considera como una admision de que dicho documento es una tecnica anterior pertinente, o material considerado como patentable de cualquiera de las reivindicaciones de la presente solicitud. Cualquier declaracion como del contenido o de una fecha de cualquier documento se basa en la informacion disponible para el solicitante en el momento de la presentacion y no constituye una admision de la correccion de dicha declaracion.

Sumario de la invencion

Es un objetivo de la presente invencion desarrollar un gen indicador contenido en una llnea celular con una especificidad y/o sensibilidad por una senal extracelular particular de interes (es decir, un ligando) de manera que se pueda utilizar en un ensayo de gen indicador para determinar con precision la presencia y/o el nivel de la senal extracelular de interes en presencia de otras senales extracelulares que son capaces de activar la misma ruta de transduccion de la senal iniciada por una primera molecula o complejo de la superficie celular como la senal extracelular de interes o que son capaces de activar otra ruta de transduccion de la senal capaz de modular la transcripcion del gen indicador.

Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona una llnea celular transformada con una construccion de gen indicador que incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico indicador unido operativamente a un elemento de control de la transcripcion que se activa como parte de la ruta de transduccion de la senal iniciada por una primera molecula o complejo de la superficie celular en respuesta a una primera senal extracelular (la senal extracelular de interes). La ruta de transduccion de la senal incluye un factor de transcripcion que se une al elemento de control de la transcripcion de manera que activa el elemento de control de la transcripcion y de esta manera regula la transcripcion del gen indicador. La sensibilidad y/o especificidad de la respuesta de esta llnea celular por la senal extracelular de interes esta mejorada debido a:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

a) el elemento de control de la transcripcion es una modificacion de un elemento de control de la transcripcion de origen natural o de un elemento de control de la transcripcion sintetico que contiene una o mas secuencias de reconocimiento especlficas del factor de transcripcion, que se activa como parte de la ruta de transduccion de la senal iniciada por la primera senal extracelular, y por tanto de la sensibilidad y/o especificidad del elemento de control de la transcripcion aumentando el numero de secuencias de reconocimiento especlficas de los factores de transcripcion de interes y/o excluyendo secuencias de reconocimiento para factores que son susceptibles de reducir la sensibilidad o especificidad por la senal extracelular de interes; y/o

b) las celulas de la llnea celular carecen de una segunda molecula de superficie que responda a, o sea parte de un complejo que responda a, una segunda senal extracelular, cuya segunda senal extracelular, si la segunda molecula de superficie celular estuviera presente, producirla el inicio de una segunda ruta de transduccion que modula la transcripcion de dicho gen indicador que disminuya la sensibilidad o especificidad de la respuesta de la primera senal extracelular.

La presente divulgacion tambien proporciona un kit de ensayo basado en celulas para la determination con una sensibilidad y/o especificidad mejorada, la presencia y/o nivel de una senal extracelular de interes que activa la actividad de transduccion de senal de una molecula o complejo de la superficie celular.

Se proporciona adicionalmente por la presente divulgacion un ensayo de gen indicador para determinar la presencia y/o nivel de una senal extracelular de interes (es decir, un ligando) en una muestra.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es una ilustracion esquematica de una construction de gen indicador inicial con los -500 a +1 nucleotidos de la region promotora del gen del factor de respuesta al interferon (IRF-1) clonada corriente arriba del gen indicador de luciferasa de luciernaga para regular la transcripcion de luciferasa de luciernaga.

La Figura 2 es una grafico que muestra las unidades de luciferasa relativas (RLU) de la construccion de gen indicador de la Figura 1 en respuesta a IFNy, TNF-a, e IFNy + TNF-a.

La Figura 3 es un grafico que muestra las x veces de induction de la actividad de luciferasa de luciernaga convertida a parti r de los datos que se muestran en la Figura 2.

La Figura 4 es una ilustracion esquematica de una construccion de gen indicador en la que una repetition de 5 tandems del NF-kB canonico (SEQ ID NO: 2) se posiciona corriente arriba del promotor mlnimo SV40 para regular la transcripcion de la luciferasa de luciernaga.

La Figura 5 es un grafico que muestra las unidades de luciferasa relativas en un ensayo de gen indicador utilizando la construccion de gen indicador de la Figura 4 en presencia de distintas cantidades de TNF-a, IFNy, IL-2, IL-5 e IFNa2.

Descripcion detallada de la invencion

Los presentes inventores han desarrollado y establecido un ensayo de gen indicador que utiliza una llnea celular transfectada con una construccion de gen indicador de manera que el ensamblaje es capaz de detectar y responder a bajos niveles de una senal extracelular (es decir, un ligando) de una manera altamente especlfica, permitiendo as! la cuantificacion de la senal extracelular. En una realization preferida, esto se obtuvo utilizando un promotor quimerico sintetico, que contenla un numero optimo de elementos de respuesta para los factores de transcripcion inducidos por la senal extracelular de interes y que carece de elementos de respuesta para factores de transcripcion activados por senales extracelulares no relacionadas (es decir, ligandos), para dirigir un promotor mlnimo y regular la expresion de un gen indicador. Se obtiene un nivel adicional transfectando celulas que albergan un receptor especlfico para la senal extracelular de interes pero que carecen de receptores para otras senales extracelulares capaces de activar la misma ruta de transduccion de la senal que la senal extracelular de interes o que son capaces de activar otra ruta de transduccion de senal, capaces de modular la transcripcion del gen indicador mediante la interaction con elementos de respuesta especlficos de la senal extracelular regulados por el promotor sintetico. Dicho ensamblaje mejora tambien preferentemente el nivel de sensibilidad en la detection de la senal extracelular de interes.

El termino “especificidad” como se utiliza en el presente documento es la capacidad de un ensayo de gen indicador para reconocer una senal extracelular particular de interes sin interferencia de otras senale extracelulares. El termino “sensibilidad” como se utiliza en el presente documento es la capacidad de un ensayo de gen indicador para detectar cantidades bajas de una senal extracelular de interes que de otra manera serla indetectable en un ensayo que sea menos “sensible” a la senal extracelular.

Mas preferentemente, la llnea celular de acuerdo con la presente divulgacion es en la que la llnea celular esta a) transformada con una construccion de gen indicador en la que se mejora la sensibilidad y/o especificidad de un elemento de control transcripcional unido operativamente al gen indicador por la modificacion de un elemento de control transcripcional de origen natural o un promotor sintetico que contiene un numero optimo de elementos de control especlfico para los factores de transcripcion inducidos por la senal extracelular de interes, y b) carente de una segunda molecula o complejo de superficie celular funcional que responda a otras senales extracelulares que interferirlan de otra manera con una primera senal de interes produciendo el inicio de una ruta de transduccion de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

senal que module la transcripcion del gen indicador con el fin de mejorar la sensibilidad y/o especificidad de la ilnea celular a la senal extracelular de interes. Se contempla que la llnea celular pueda carecer de mas de una molecula o complejo de superficie celular funcional dependiendo de la cantidad de otras moleculas o complejos de la superficie celular sea necesario que esten ausentes/inactivas en la llnea celular para evitar la interferencia de otras senales extracelulares en un ensayo de gen indicador con la senal extracelular de interes. La falta de una o mas moleculas o complejos de superficie celular funcionales (es decir, receptores y complejos de receptores) en la llnea celular puede ser de origen natural o se puede obtener por tecnicas tales como “desactivacion” inactivando el gen que codifica la molecula de superficie celular o silenciando (“supresion”) el gen que codifica la molecula de la superficie celular utilizando un ARN de interferencia (ARNi).

La molecula de superficie celular de cuya actividad de transduccion de la senal, en respuesta a una senal extracelular, regula la expresion de un producto genico indicador puede ser cualquier protelna de la superficie celular que sea conocida por los expertos en la tecnica o que pueda ser identificada por los expertos en la tecnica. Las protelnas de superficie celular a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular y canales ionicos. Ejemplos no limitantes de receptores de superficie celular incluyen receptores de citocinas (por ejemplo, receptores para el interferon Tipo I, interferon Tipo II, factor de necrosis tumoral (TNF), interleucinas, hormona de crecimiento, eritropoyetina (EPO), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos macrofagos (GM-CSF), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor neurotrofico ciliar (CNTF), etc.), receptores de factores de crecimiento, receptores de hormonas, receptores de celulas T, receptores de antlgenos, receptores de complemento , receptores de muerte, y neurorreceptores. El texto de referencia, J. M. Cruse y Robert E. Lewis, Atlas of Immunology, CRC Press, Washington, DC, 1999, que desvela muchos receptores implicados en la respuesta inmunitaria y las interacciones del sistema inmunitario se toma como referencia. Los receptores de superficie celular tambien incluyen, pero no se limitan a, receptores del TNF (por ejemplo, TNF-a), receptores muscarlnicos (por ejemplo, el M2 humano (acceso de GenBank n° M16404); M3 de rata (acceso de GenBank n° M16407), M4 humano (acceso de GenBank n° M16405); M5 humano (Bonner et al., 1988); y similares); receptores de acetilcolina nicotlnicos neuronales (por ejemplo, los subtipos a2, a3 y p2); la subunidad a2 de rata (Wada et al., 1988); la subunidad a3 de rata (Boulter et al., 1986); la subunidad a4 de rata (Goldman et al., 1987); la subunidad a5 de rata (Boulter et al., 1986); la subunidad p2 de rata (Deneris et al., 1988); la subunidad p3 de rata (Deneris et al., 1988); la subunidad p4 de rata (Duvoisin et al., 1989); combinaciones de las subunidades a, subunidades p y subunidades a y p de rata; receptores GABA (por ejemplo, las subunidades a1 y p1 bovinas (Schofield et al., 1987); las subunidades a2 y a3 bovinas (Levitan et al., 1988); la subunidad y (Pritchett et al., 1989); las subunidades p2 y p3 (Ymer et al., 1989); la subunidad 5 (Shivers, B.D., 1989); y similares); receptores de glutamato (por ejemplo, el receptor aislado del cerebro de rata (Hollmann et al., 1989); y similares); receptores adrenergicos (por ejemplo, el p1 humano (Frielle et al., 1987); a2 humano (Kobilka et al., 1987); p2 de hamster (Dixon et al., 1986); y similares); receptores de dopamina (por ejemplo, D2 humano (Stormann et al., 1990); de rata (Bunzow et al., 1988); y similares); receptores NGF (por ejemplo, receptores NGF humano (Johnson et al., 1986); y similares); receptores de serotonina (por ejemplo el 5HT1a humano (Kobilka et al., 1987); 5HT2 de rata (Julius et al., 1990); 5HTlc de rata (Julius et al., 1988); y similares).

Tambien se incluyen como receptores de superficie celular nominalmente los receptores Tipo Toll intracelulares y/o extracelulares y receptores intracelulares tales como RIG-1 y MDA5, debido a que dichos receptores detectan senales extracelulares, tales como partlculas vlricas o bacterianas o componentes que en el caso de los receptores Tipo Toll intracelulares, interaction con estos receptores Tipo Toll tras la endocitosis desde la superficie celular. Dichos receptores de superficie celular Tipo Toll (TLR) o de membrana endosomicos (Uematsu y Akira, 2007), o los receptores proteicos RIG-I, MDA5 y LGP citosolicos Tipo gen 1 inducible por el acido retinoico (GIG-I) (Yoneyama y Fujita, 2007) son ejemplos no limitantes de receptores de reconocimiento de un patron.

Los canales de iones incluyen, pero no se limitan a, canales de ion calcio (por ejemplo, la subunidad a2 neuronal humana (vease el documento WO89/09834); subunidad a1 de musculo esqueletico de conejo (Tanabe et al. 1987); subunidad a2 de musculo esqueletico de conejo (Ellis et al., 1988); subunidad p de musculo esqueletico de conejo (Ruth et al., 1989); subunidad y de musculo esqueletico de conejo (Jay et al., 1990); y similares); canales de potasio (por ejemplo, de cerebro de rata (BK2) (McKinnon, D., 1989); cerebro de raton (BK1) (Tempel et al., 1988); y similares); canales de ion de sodio (por ejemplo, cerebro de rata I y II (Noda et al., 1986); cerebro de rata III (Kayano et al., 1988); y otros).

Los expertos en la tecnica apreciaran que la protelna de superficie celular expuesta anteriormente es preferentemente endogena a la llnea celular de la presente divulgacion. Sin embargo, tambien se apreciara que la protelna de superficie celular de la superficie de la celula, o la protelna de superficie celular se puede expresar de un ADN clonado pero sera una protelna de superficie celular que es heterologa a la celula huesped.

Para la transduccion de la senal, la senal intracelular que se transduce se inicia por la interaction especlfica de una senal extracelular, es decir una molecula o un cambio en el medio ambiente extracelular (tal como la luz, la radiation UV, o la radiacion y), con una molecula o complejo de superficie celular, receptor o canal ionico presentes en la superficie celular. Esta interaccion pone en movimiento una cascada de eventos intracelulares, cuya ultima consecuencia es un cambio rapido y detectable en la expresion de un producto genico, que en la celula de la presente divulgacion es un producto genico indicador. La senal extracelular o molecula efectora es cualquier

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

compuesto o sustancia que de alguna manera altera especlficamente la actividad de una molecula de superficie celular o un complejo de moleculas de superficie celular (es decir, complejos de receptores). Ejemplos de dichas senales incluyen, pero no se limitan a, moleculas tales como citocinas (es decir, interferones), factores de crecimiento, hormonas, endorfinas, neurotransmisores, acetilcolina, y sustancias mitogenicas, tales como el acetato mlstrico forbol (PMA), que se unen a los receptores de superficie celular y canales ionicos y modulan la actividad de dichos receptores y canales. Por ejemplo, los antagonistas son senales extracelulares que bloquean o disminuyen la actividad de una protelna de superficie celular y los agonistas son ejemplos de senales extracelulares que potencian, inducen o aumentan de otra manera la actividad de las protelnas de superficie celular.

La construccion de gen indicador albergada en la llnea celular de la presente divulgacion es una molecula de ADN que incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico indicador unida operativamente a elementos/secuencias de control de la transcripcion. La transcripcion del gen indicador se controla por estas secuencias. La actividad de al menos uno o mas de estas secuencias de control esta regulada directa o indirectamente por la molecula o complejo de superficie celular. Las secuencias de control de la transcripcion incluyen pero no se limitan a promotores y otras regiones reguladoras, tales como secuencias amplificadoras y sitios de union represores y activadores, por ejemplo, para la union con un factor de transcripcion tal como NF-kB, que modula la actividad del promotor, o secuencias de control que modulan la actividad o eficacia de la ARN polimerasa que reconoce el promotor, o secuencias de control que son reconocidas por las moleculas efectoras, incluyendo las que son inducidas especlficamente por la interaccion de una senal extracelular con una protelna de superficie celular. Por ejemplo, la modulacion de la actividad del promotor se puede efectuar alterando la union de la ARN polimerasa a la region del promotor, o, de manera alternativa, interfiriendo el inicio de la transcripcion o la elongacion del ARNm. Se hace referencia a dichas secuencias colectivamente en el presente documento como elementos de control de la transcripcion. Ademas, la construccion puede incluir secuencias de nucleotidos que alteren la traduccion del ARNm resultante, alterando de esta manera la cantidad del producto genico indicador expresado.

Un promotor que se regula o modula por la actividad de una molecula o complejo de superficie celular es un promotor cuya actividad cambia cuando una celula se expone a una senal extracelular particular mediante la presencia de moleculas o complejos de superficie celular cuyas actividades estan afectadas por la senal extracelular. Por ejemplo, el promotor c-fos se activa especlficamente con la interaccion especlfica de ciertas senales extracelulares, tal como las hormonas de crecimiento, con una molecula de superficie celular, tal como un receptor de la hormona de crecimiento. En particular, la regulacion de dichos promotores por la molecula o complejo de superficie celular, aunque indirecta, se produce en unos minutos de la interaccion de la molecula o complejo de superficie celular con la senal extracelular. Como se utiliza en el presente documento, union operativa se refiere a la union de un elemento de control de la transcripcion, es decir, el promotor y/o el sitio de union al factor de transcripcion, con un nucleotido que codifica una secuencia de manera que el elemento de control de la transcripcion se posiciona apropiadamente para su actividad de union a la ARN polimerasa y el inicio de la transcripcion de la secuencia de nucleotidos codificante. Por lo tanto, una secuencia de nucleotidos codificante en union operativa con un promotor, esta corriente abajo con respecto a la direccion de la transcripcion a partir del promotor, esta en el marco de lectura correcto con respecto al sitio de inicio de transcripcion y esta insertado de manera que dicha elongacion de la transcripcion progresa a lo largo de la secuencia de nucleotidos codificante.

Los elementos de control de la transcripcion adecuados se pueden obtener o derivar de las regiones reguladoras de la transcripcion de genes cuya expresion se induce rapidamente, generalmente en minutos, del contacto entre la protelna de superficie celular y la protelna efectora que modula la actividad de la protelna de superficie celular. Ejemplos de dichos genes incluyen, pero no se limitan a, los genes inmediatos tempranos (Sheng et al., 1990), tales como c-fos. Los genes inmediatos tempranos son genes que se inducen rapidamente con la union de un ligando a una protelna de superficie celular. Los elementos de control de la transcripcion que se prefieren para su uso en las construcciones geneticas indicadoras incluyen elementos del control de la transcripcion de genes inmediatos tempranos, elementos derivados de otros genes que presentan alguna o todas las caracterlsticas de genes inmediatos tempranos, o elementos sinteticos que se construyen de manera que los genes unidos operativamente entre ellos presenten dichas caracterlsticas. Las caracterlsticas de los genes preferidos a partir de los cuales se derivan los elementos de control de la transcripcion incluyen, pero no se limitan a, la expresion baja o indetectable en celulas quiescentes, induccion rapida a nivel transcripcional en minutos de la estimulacion extracelular, induction que es transitoria e independiente de la slntesis de nuevas protelnas, la posterior interruption de la transcripcion necesita la slntesis de nuevas protelnas, y los ARNm de estos genes tienen una semivida corta. No es necesario que todas estas protelnas esten presentes.

Los promotores y elementos de control de la transcripcion adecuados incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de IFN gamma activada (GAS) del gen del factor regulador de interferon 1 (lRF-1), SV40 u otros promotores mlnimos en combination con elementos de control de la transcripcion tal como secuencias de union al factor activador o de transcripcion (tales como para NF-kB), el promotor del gen del peptido vasoactivo intestinal (que responde a cAMP; Fink et al., 1988); el promotor del gen de la somatostatina (que responde a cAMP; Montminy et al., 1986); el promotor proencefalina (que responde a cAMP, agonistas nicotlnicos, y esteres de forbol; Comb et al. 1986); el promotor del gen de fosfoenolpiruvato carboxi-cinasa (que responde a cAMP; Short et al., 1986); el promotor del gen de NGFI-A (que responde a NGF, cAMP, y suero; Changelian et al., 1989); los elementos de control de la transcripcion obtenidos o derivados del gen c-fos; y otros que pueden ser conocidos o preparados por los expertos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

en la tecnica.

El proto-oncogen c-fos es el homologo celular del gen transformante del virus del osteosarcoma FBJ. Este codifica una proteina nuclear lo mas probable es que este implicada en el crecimiento y diferenciacion celular. La transcripcion de c-fos se activa transitoria y rapidamente por factores de crecimiento y por inductores de otras proteinas de superficie celular, incluyendo hormonas, agentes especificos de la diferenciacion, estres, mitogenos y otros inductores conocidos de proteinas de superficie celular. La activacion es independiente de la sintesis de proteinas. Los elementos reguladores c-fos incluyen un TATA box que es necesaria para el inicio de la transcripcion, dos elementos corriente arriba para la transcripcion basal, y un amplificador, que incluye un elemento con simetria en diada y que es necesario para la induction por TPA, suero, EGF, y PMA. El elemento amplificador de la transcripcion de 20 pb localizado entre 317 y 298 pb corriente arriba del sitio de la protection c-fos de ARNm, es esencial para la induccion serica en las celulas NIH 3T3 privadas de suero. Uno de los dos elementos corriente arriba se localiza de 63 a 57 y se parece a la secuencia de consenso para la regulacion por cAMP.

Preferentemente, el elemento de control de la transcripcion es un promotor quimerico sintetico que contiene un promotor mmimo, que es mas preferentemente el promotor minirno SV40, y un numero optimo de elementos de respuesta especificos de los factores de transcripcion inducidos por la senal extracelular de interes, pero que carece de elementos para los factores activados para senales extracelulares no relacionadas.

En una realization preferida de la presente divulgation, la linea celular contiene una construction de gen indicador que tiene tanto especificidad como sensibilidad por el IFNy como la senal extracelular. Los bioensayos actuales para el IFNy se basan en su mayor parte en la capacidad del IFNy para inhibir la replication virica (Ank et al., 2006) o inhibir la proliferation celular (Sato et al., 2006). Dichos metodos carecen de especificidad ya que los INF Tipo I (IFN-a, IFN-p, IFN-£, IFN-k, e IFN-w) tambien inhiben la replicacion virica y la proliferacion celular. La actividad del IFNy tambien se puede evaluar por su capacidad para inducir NO en celulas de exudado peritoneal recien aislado (Malu et al, 2003), kinurenina en celulas WISH (Boyanova et al, 2002), o antigenos del MHC clase II en celulas susceptibles (King, D.P., Jones, P.P., J. 1983). Dichos bioensayos tambien carecen de especificidad y se basan en sistemas de cultivo celular que son variables inherentemente y dan resultados que varian de un ensayo a otro (Meager, 2006). Aunque se ha desarrollado un ensayo de gen indicador para IFNy basado en la induccion de la actividad de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) el ensayo carece de especificidad ya que tambien es sensible a los IFN Tipo I (Lewis, 1995). Por lo tanto, es altamente deseable un ensayo de gen indicador que sea especifico y sensible a bajos niveles de IFNy (interferon Tipo II) en presencia de interferones de Tipo I (IFN-a e IFN-p) en la tecnica. Sin embargo, debido a la degeneration entre las secuencias de GAS e ISRE y debido a la inter-relation entre el heterodimero STAT1-STAT2 (de la ruta de transduction de la senal en el receptor de interferon Tipo I IFNAR1/IFNAR2) y el homodimero STAT1-STAT2 (de la ruta de transduccion de la senal iniciada en el receptor de interferon Tipo II GAR1/GAR2), la presencia de interferones de Tipo I interfiere fuertemente los ensayos de gen indicador para determinar el nivel de IFNy en una muestra. Por lo tanto, una linea celular que contuviera una construccion de gen indicador con una especificidad y sensibilidad mejorada por el IFNy permitiria rapidamente los niveles de IFNy en una muestra. Esta capacidad de detectar la presencia y/o determinar el nivel de IFNy, incluso en presencia de un interferon de Tipo I, tendria aplicaciones clinicas inmediatas. Por ejemplo, la presencia de IFNy en el liquido cefalorraquideo es indicativa de la progresion de la enfermedad en la recaida de esclerosis multiple en remision u otras enfermedades neurodegenerativas. Se piensa tambien que la reduction de la production de IFNy esta implicada en la fisiopatologia de enfermedades fibroticas tales como la fibrosis pulmonar idiopatica, esclerosis sistemica, o escleroderma. La cuantificacion de la produccion de IFNy humano se puede utilizar tambien como un marcador in vitro de la maduracion/proliferacion de celulas T, la respuesta de CTL CD8+, y la activacion de celulas NK. La cuantificacion de IFNy tambien proporciona la base de un ensayo para la infection por TB midiendo la proliferacion de celulas T in vitro en respuesta a antigenos de TB. La presencia de IFNy en el derrame pleural es diagnostico de tuberculosis extrapulmonar. Por lo tanto, con dicha linea celular en un ensayo de gen indicador para IFNy, se cubre la necesidad de un ensayo diagnostico no invasivo.

El elemento de control de la transcripcion, particularmente como se refiere a una realizacion preferida de la presente divulgacion en la que el interferon Tipo II (IFNy) es la senal extracelular, es la secuencia gamma activada (GAS). Con respecto a gAs, a la que se une el homodimero STAT1 en los genes que responden al interferon Tipo II, se identifico la secuencia de consenso, nnnsanttccgGGAAntgnsn (SEQ ID NO: 3; con la secuencia central en mayusculas; y la alta conservation subrayada), en muchas secuencias de union seleccionadas.

En la realizacion de la presente divulgacion en la que el interferon Tipo II es la senal extracelular de interes (la primera senal extracelular) y un interferon de Tipo I (IFN-a e IFN-p) es una senal extracelular de interferencia (la segunda senal extracelular), un elemento de control de la transcripcion preferido en la construccion de gen indicador es un promotor quimerico que responde al interferon Tipo II en el que la GAS controla un promotor minimo SV40 unido operativamente a una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico indicador. Ademas, en esta realizacion de una linea celular para su uso en un ensayo de gen indicador para IFNy, la linea celular se ha seleccionado de manera que carezca de un receptor de IFN de Tipo I, o celulas que se han modificado geneticamente para desactivar el receptor de interferon Tipo I (IFNAR1/IFNAR2), al que se hace referencia en general en la section “Sumario de la invention” anterior como segunda molecula de superficie celular. En ausencia de un receptor de interferon Tipo I funcional, no hay inter-relacion STAT1-STAT2 para que interfiera la activacion de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

la transcripcion de GAS en respuesta al homodlmero STAT1. Por lo tanto, la especificidad y sensibilidad de la respuesta a una senal extracelular con IFNy esta considerablemente mejorada. Ahora se pueden detectar bajos niveles de IFNy utilizando la llnea celular con IFNAR1/IFNAR2 “desactivado” que se ha descrito anteriormente.

El termino “desactivado” como se utiliza en el presente documento se refiere a una llnea celular en la que se han inactivado genes especlficos, tal como por un metodo de direccionamiento genico. Este es el contrario a “activado” que como se utiliza en el presente documento se refiere a una llnea celular de acuerdo con la presente divulgacion en la que un gen de un receptor o complejo o una parte de los mismos (es decir, al menos la parte extracelular y los elementos necesarios para la activacion de la ruta de transduccion de la senal) de la superficie celular de una primera especie animal se ha introducido (“activado”) en la llnea celular de una segunda especie animal. Dicho receptor o complejo de la superficie celular “activado” se puede utilizar en la llnea celular en un ensayo de gen indicador cuando hay una especificidad estricta de especie entre el receptor o complejo de superficie celular y su ligando, es decir, el receptor o complejo de superficie celular que es endogeno de la llnea celular y que es ortologo con el receptor de superficie celular “activado” no inicia (o de manera insignificante) una senal junto con su ruta de transduccion de senal en respuesta a un ligando del receptor de superficie celular “activado” de otra especie animal.

El producto del gen indicador en la llnea celular de la presente divulgacion, cuyo nivel es una medida de la presencia y/o el nivel de una senal extracelular que activa al actividad de transduccion de la senal de una molecula de la superficie celular, puede ser un ARN o una protelna, siempre que sea detectable facilmente. Por ejemplo, la luciferasa de luciernaga, luciferasa Renilla, la protelna verde fluorescente aumentada (EGFP) de luciferasa secretada por Metridios y aequorina de medusas son las realizaciones mas preferidas de productos genicos indicadores que se utilizan de acuerdo con la presente divulgacion. En el caso de la enzima luciferasa de luciernaga (deWet et al., 1987) y aequorina de medusa (Rider et al., 2003), se detecta el resultado de su actividad enzimatica, la luz, y se mide utilizando un luminometro, mientras que en el caso de EGFP, se puede utilizar un clasificador celular o analizador de fluorescencia activada (FACS) a una longitud de onda apropiada para detectar y cuantificar la cantidad de EGFP expresada en una celula. La curva de distribucion de la cantidad de luciferasa, aequorina o EGFP que se expresa en una muestra de celulas se determinara por la cantidad de ligando (en un intervalo determinado) a la que se expone la celulas. Ejemplos no limitantes de otros productos genicos indicadores adecuados incluyen dsRED, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (Alton et al., 1979), otros sistemas de deteccion enzimaticos, tales como p-galactosidasa, luciferasa bacteriana (Engebrecht et al., 1984 y Baldwin et al. 1984), fosfatasa alcalina (Toh et al. 1989 y Hall et al. 1983), y p-lactamasa bacteriana o humanizada (Zlokarnik et al., 1998).

El desarrollo de un ensayo de gen indicador especlfico para una citocina pleiotropica se hace diflcil cuando la transduccion de la senal esta mediada por un factor de transcripcion ubicuo inducido por varias citocinas no relacionadas y/o cuando los genes diana activados por la citocina estan sometidos a un patron complejo de regulacion. Estas dificultades se pueden obviar por el uso de una construccion de gen indicador de promotor quimerico sintetico que carezca de los sitios de reconocimiento para factores de transcripcion activados por las citocinas no relacionadas para transfectar una llnea celular que contenga un receptor especlfico de ligando pero que carezca de receptores para otros ligandos que compartan una ruta de transduccion de la senal comun con el ligando de interes. Esta estrategia se ilustra en referencia a la citocina pleiotropica TNFa que utiliza la ruta NF-kB para activar los genes diana. En una realizacion preferida de la presente invencion la llnea celular que contiene la construccion de gen indicador tiene sensibilidad y especificidad para TNF-a.

El TNF-a es una citocina pro-inflamatoria multifuncional que tiene un papel clave en la regulacion de la apoptosis y la supervivencia celular y esta implicado en procesos biologicos importantes como la inflamacion, transformacion neoplasica y respuesta inmunitaria. Por lo tanto, puede detectarse TNF-a en el plasma de pacientes con enfermedad de Crohn (Balog et al., 2004), en el plasma y llquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Marotte et al., 2005), y en el fluido de heridas de las heridas cronicas no cicatrizadas (Cowin et al., 2006). Es por lo tanto importante ser capaces de evaluar la relacion entre la presencia de TNF-a en una muestra cllnica particular y la progresion de la enfermedad, o determinar la capacidad de las terapias anti-TNF-a incluyendo los anticuerpos anti- TNF-a (Remicade, Adlimumab) o un receptor de TNF-a soluble (Enbrel) para bloquear la actividad de TNF-a. Los bioensayos convencionales para el TNF-a se basan en la capacidad del TNF-a para destruir llneas celulares susceptibles (celulas L929 de raton, celulas WEHI 164, o celulas HeLa humanas habitualmente en presencia de un inhibidor de la transcripcion tal como actinomicina D o un inhibidor de la traduccion tal como cicloheximida. De manera alternativa, tambien se puede utilizar la capacidad del TNF-a para regular positivamente las moleculas de adhesion celular tal como la ICAM-1 (moleculas de adhesion celular -1) como base para un bioensayo del TNF-a. Una desventaja obvia de dichos metodos es su falta de especificidad. TNF-P, TRAIL, y TWEAK (ligando Apo-3) interfieren con el ensayo de citotoxicidad de TNF-a y TNF-P, IL-1 a, IL-1p, e IFNy inducen la expresion de ICAM-1 (Meager, 2006). Ademas, dichos bioensayos se basan en sistemas de cultivo celular que son inherentemente variables y dan resultados que varlan de un ensayo a otro (Meager, 2006). Aunque se ha desarrollado un ensayo de gen indicador para TNF-a, que se basa en la activacion de una construccion de gen indicador de luciferasa regulada por NF-kB, el ensayo carece de especificidad ya que tambien es sensible a otros agentes que activan la NF-kB (McFarlane et al., 2002).

La union del homotrlmero TNF-a al TNFR-1 da como resultado la trimerizacion del TNFR-1, el reclutamiento de TRAF-2 y RIP en el complejo receptor TNFR-1, y la activacion de la ruta del NF-kB culminando en la activacion de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

transcripcion de varios genes diana del TNF (Schwamborn et al., 2003). El NF-kB es un factor de transcripcion ubicuo inducido por varias citocinas (incluyendo IFNy, IL2, IL5, e IFNa2). El NF-kB esta implicado en la regulacion de numerosos genes implicados en procesos que incluyen, la respuesta inflamatoria, apoptosis, cancer, supervivencia neuronal, e inmunidad innata. La activacion del NF-kB se controla principalmente a nivel post-transcripcional por degradation de la subunidad inhibidora IkB del complejo p55/p65/IKB presente en el citoplasma. Los estlmulos activadores tales como el TNF-a activan un complejo cinasa compuesto por dos cinasas especlficas de kB (IKKa e IKKp) y una subunidad moduladora (NEMO o IKKy). Esto da lugar a la fosforilacion de la subunidad inhibidora, que se ubiquitinila entonces y se degrada mediante el proteosoma. Esto desencadena la translocalizacion del NF-kB en el nucleo, donde inicia la transcripcion uniendose a secuencias reguladoras (secuencias de reconocimiento/union a NF-kB) presentes en la region promotora de los genes diana de NF-kB.

Los genes diana del TNF-a se somete a un patron complejo de regulacion ya que NF-kB es un factor de transcripcion ubicuo inducido por varias citocinas. Ademas, el TNF-a induce la expresion de varios genes dianas de NF-kB que en si mismos son factores de transcripcion incluyendo JunD y factor regulador del interferon-1 (IRF-1). Por lo tanto, el aumento de transcripcion de IRF-1, por ejemplo, es responsable del acoplamiento cruzado de una respuesta de interferon con la respuesta mediada por el receptor del TNF. Con el fin de construir un ensayo de gen indicador especlfico para la detection de TNF-a de manera que otras citocinas distintas al TNF-a (por ejemplo, IFNy, IL-2, IL-5, IL-6) que activan el NF-kB no interfieran con el ensayo, se transfecto una llnea celular que es negativa en receptores (es decir, de origen natural, “desactivada” o “inactivada”) para los receptores de los activadores extracelulares principales de la ruta de serialization del NF-kB, distintos del TNF-a, con una construction de gen indicador regulada por NF-kB sintetica que carezca de sitios de reconocimiento para los factores de transcripcion inducida por citocinas no relacionadas.

Por lo tanto, los presentes inventores han desarrollado un metodo altamente sensible y reproducible para cuantificar la actividad del TNF-a como otra realization preferida de la presente invention. Una realization preferida se basa en la llnea de celulas T humanas, Jurkat, transfectada con un gen indicador de luciferasa controlada por un promotor quimerico que responde al TNF-a, que permite determinar la actividad del TNF-a con un alto grado de precision en pocas horas. El promotor que responde al TNF-a que se utiliza para transfectar las celulas Jurkat es un promotor sintetico basado en repeticiones en tandem de 5 secuencias canonicas de reconocimiento del NF-kB, el elemento de respuesta principal para el factor de transcripcion principal inducido por el TNF-a (Imanishi et al., 2000). Como se descubrio sorprendentemente que las repeticiones en tandem de la secuencia canonica de reconocimiento/union de NF-kB eran altamente eficaces (105 veces mas) para aumentar la transcripcion a partir del promotor mlnimo SV40, se diseno una repetition en tandem de 6 secuencias canonicas de reconocimiento de NF-kB para conferir la maxima actividad transcripcional al promotor sintetico en respuesta al tratamiento con TNF-a (Figura 4). Se selecciono entonces un clon estable, JUT-4, de celulas Jurkat transfectadas basandose en el aumento maximo en unidades relativas de luciferasa (RLU) en respuesta al tratamiento con TNF-a con respecto a las celulas de control sin tratar. Se apreciara que aunque los presentes inventores han descubierto que las repeticiones en tandem de cinco secuencias canonicas de reconocimiento/union a NF-kB se prefieren, tambien se contemplan repeticiones en tandem de mas o menos de cinco canonicas de reconocimiento/union a NF-kB.

La Figura 5 demuestra que esta realizacion de llnea celular preferida, que es negativa a receptores de IFNy e IL2 y que alberga una construccion de gen indicador de repeticiones en tandem de cinco secuencias canonicas de reconocimiento de NF-kB que controla un promotor mlnimo SV40 unido operativamente a una secuencia codificante de luciferasa, es altamente sensible y especlfico de TNF-a. La mejora de la sensibilidad y especificidad por el TNF-a se puede ver facilmente con respecto a una llnea celular U937 (que tiene receptores funcionales para IFNy e IL2) que alberga una construccion de gen indicador en la que la region promotora (-500 a +1) del gen IRF-1 esta unida operativamente a la secuencia codificante de luciferasa (Figura 1). Esta region promotora contiene secuencias de reconocimiento de NF-kB y una secuencia GAS que responde a IFNy. La Figura 2 muestra que la llnea celular U937 transfectada con la construccion de gen indicador responde tanto a IFNy como a TNF-a. Cuando esta presentes el IFNy y TNF-a, la sensibilidad del gen indicador se reduce ya que la actividad de luciferasa en RLU es menor que la suma de las unidades relativas de luciferasa (RLU) para IFNy y TNF-a ensayados por separado.

Otros ejemplos no limitantes de llneas celulares de acuerdo con la presente divulgation incluye las llneas celulares que contienen, por ejemplo, la construccion de gen indicador de la Figura 4, pero que carece de receptores de superficie celular al menos para TNF-a e IFNy (cuando se desea un ensayo de gen indicador para IL2) y para al menos TNF-a, IFNy e IL2 (cuando se desea un ensayo de gen indicador para IL5).

Otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a un kit de ensayo para determinar la presencia y/o el nivel, en una muestra, de una molecula que activa la actividad de transduction de la senal de una molecula o complejo de superficie celular. Este kit de ensayo incluye una pluralidad de celulas de la llnea celular de la presente divulgacion (como reactivo) y un dispositivo de ensayo que tiene una pluralidad de pocillos. Preferentemente, el dispositivo de ensayo es una placa de titulacion multipocillo, pero tambien puede ser cualquier Tipo de receptaculo, tal como placas o platos de Petri, con una pluralidad de pocillos en los que se pueda llevar a cabo el ensayo para determinar el nivel de una molecula en una muestra. Se prefiere que las celulas como componente o reactivo del kit de ensayo se dispongan en los pocillos del dispositivo de ensayo, aunque se apreciara que en vez de eso dichas celulas pueden dispensarse en los pocillos del dispositivo de ensayo por el usuario final justo antes de llevar a cabo el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ensayo. El kit puede incluir adicionalmente un grupo de instrucciones para utilizar el kit para llevar a cabo el ensayo que se pretende para la determinacion de la presencia y/o nivel de una molecula que active la actividad de transduccion de la senal en una muestra.

Cuando las celulas de la llnea celular de acuerdo con la presente invention se utilizan como un reactivo en un kit, las celulas se tratan preferentemente con un agente anti-mitotico y pro-apoptotico y se almacenan congeladas para su uso futuro en un ensayo de gen indicador como parte de un kit. La preparation de celulas de esta manera se desvela en el documento US2004-0235157.

La presente invencion proporciona ademas un metodo de ensayo para determinar la presencia y/o el nivel, en una muestra, en referencia a una referencia incluida en el ensayo, de una senal extracelular que activa la actividad de transduccion de la senal de una molecula o complejo de superficie celular, preferentemente un receptor o complejo de superficie celar. Este metodo de ensayo utiliza celulas de la llnea celular de la presente invencion. Tras la incubation con una muestra en la que se desea determinar la presencia y/o nivel de una senal extracelular que activa la actividad de transduccion de la senal de una molecula o complejo de superficie celular, se determina el nivel de expresion de in producto genico indicador, codificado en la construction de gen indicador albergada en las celulas de la llnea celular de la presente invencion en la muestra. Este nivel de expresion segun se determina por el metodo de acuerdo con la presente invencion se utiliza para despues determinar cualitativamente la presencia y/o determinar cuantitativamente el nivel, en una muestra, de la senal extracelular que activa la actividad de transduccion de senal de una molecula o complejo de superficie celular.

Los expertos en la tecnica apreciaran que el kit y el metodo de ensayo de acuerdo con la presente se pueden utilizar tanto para cuantificar un agonista o ensayar indirectamente el nivel de una molecula que se une a la molecula de senal extracelular como un antagonista o que se une el antagonista de la molecula de senal extracelular. Un ejemplo preferido de dicho ensayo indirecto es cuando la molecula de senal extracelular es TNF-a y la molecula que se ensaya indirectamente mediante la determinacion del nivel de TNF-a es o un antagonista de TNF-a o un anticuerpo neutralizante contra el antagonista de TNF-a. Esta realization se describe adicionalmente al final de esta section.

Los ensayos de gen indicador para el interferon Tipo II y para el TNF-a son las realizaciones mas preferidas de la presente divulgation. El producto del gen indicador preferentemente es luciferasa de luciernaga, aequorina de medusa, o protelna verde fluorescente aumentada (EGFP) y esta preferentemente bajo el control de un promotor quimerico sensible al interferon Tipo II que contiene GAS de IRF-1 y un promotor mlnimo SV40. Ejemplos de dichas construcciones geneticas indicadoras en los ensayos de gen indicador para IFNy y TNF-a se presentan, respectivamente , en SEQ ID NO: 4 y en la Figura 4 (SEQ ID NO: 5). El SEQ ID NO: 4 es la secuencia completa de una construccion de gen indicador de luciferasa, en la que la GAS del IRF-1 (nucleotidos 41-83 de SEQ ID NO: 4) se clona en el sitio XhoI/BgI 11 del ADN plasmldico de promotor pGL2 (n° de catalogo E1631, Promega, Madison, WI) inmediatamente corriente arriba del promotor mlnimo SV40 unido operativamente a la secuencia del gen indicador de luciferasa de luciernaga. La Figura 4 es una representation esquematica de una construccion de gen indicador en la que una repetition en tandem de 5x del sitio de reconocimiento/union del NF-kB (nucleotidos 41-111 de SEQ ID NO: 5) se posiciona inmediatamente corriente arriba del promotor mlnimo SV40 unido operativamente a la secuencia del gen indicador codificante de la luciferasa de luciernaga (es decir, en el sitio de donation XhoI/BgIII del ADN plasmldico del promotor pGL2). El SEQ ID NO: 5 es la secuencia completa del plasmido resultante.

Como la llnea celular de la presente divulgacion que se utiliza en el ensayo de gen indicador, la llnea celular es preferentemente una llnea celular de mamlfero o aviar, mas preferentemente una llnea celular humana, y mas preferentemente una celula pro-monocltica humana o celula T (es decir, Jurkat). Otras llneas celulares preferidas incluyen, pero no se limitan a, llneas celulares mieloides humanas (es decir, U266R) y adenocarcinoma de mama humano (es decir, MCF7) y llneas celulares de linfoma de raton y leucemia eritroide de raton.

Una aplicacion adicional del ensayo de gen indicador de la presente invencion es para utilizar el nivel de senal extracelular de interes para determinar indirectamente el nivel de un antagonista contra la senal extracelular de interes o el nivel de un anticuerpo (es decir, un anticuerpo neutralizante) contra el antagonista.

Los antagonistas del TNF-a se utilizan ampliamente para el tratamiento de varios trastornos inflamatorios que incluyen la enfermedad de Crohn y artritis reumatoide (AR) (Targan et al., 1997; y Lipsky et al., 2000). El tratamiento repetido con antagonistas del TNF-a da lugar a la production de anticuerpos contra el antagonista (anticuerpo o protelna de fusion recombinante) en un numero de pacientes (Baert et al., 2003).La aparicion de anticuerpos contra los antagonistas del TNF-a se asocia con una farmacodinamia reducida y una respuesta cllnica deficiente (Baert et al., 2003). Por lo tanto, en un estudio, el 45 % de los pacientes con enfermedad de Crohn tratados con Infliximab, un anticuerpo IgG1 monoclonal quimerico contra TNF-a, desarrollaba anticuerpos contra el infliximab tras la primera infusion y del 61 % tras la quinta infusion. La aparicion de anticuerpo contra infliximab se asocio con un aumento del riesgo de reacciones en la infusion y con una duration mas corta de la respuesta cllnica (Baert et al., 2003). Actualmente el TNF-a o los anticuerpos contra el TNF-a se cuantifican utilizando ensayos basados en anticuerpos tales como ELISA (Ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas) Dichos ensayos no pueden distinguir entre anticuerpos de union (BAbs) y anticuerpos neutralizantes (NAbs). Aunque ambos Tipos de anticuerpos pueden impactar negativamente la farmacodinamia del farmaco, solamente los NAbs pueden neutralizar la actividad

5

10

15

20

25

30

35

40

45

biologica de los antagonistas del TNF-a dando como resultado una respuesta cllnica reducida y la progresion de la enfermedad. El tratamiento de celulas JUT-4, una llnea celular de acuerdo con la presente invencion desarrollada para el uso en un ensayo de gen indicador para TNF-a con un farmaco anti-mitotico permite que las celulas se almacenen congeladas durante varios meses sin perdida de sensibilidad al TNF-a o necesidad del cultivo celular (vease el documento US2004-0235157 para la preparacion de celulas con un farmaco anti-mitotico para su almacenamiento como celulas congeladas). Este ensayo forma la base de un metodo para la cuantificacion selectiva de los anticuerpos neutralizantes contra los antagonistas de TNF-a incluyendo el infliximab (IgG1 quimerico), Adlimumab (IgG1 humana), y Etanercept (protelna de fusion TFNRp75-Fc de IgG1 humana). En resumen, se pre- incuba una cantidad de antagonista de TNF-a suficiente para neutralizar 10 ng/ml de TNF-a con 10 ng/ml de TNF-a y entones se incuban con diluciones en serie de suero humano que contiene los anticuerpos contra el antagonista de TNF-a. El tltulo neutralizante del anti-suero anti-antagonista de TNF-a se estima entonces a partir de la dilucion del suero reclproca que da como resultado la deteccion de 1,0 ng/ml de TNF-a utilizando el ensayo de gen indicador con JUT-4, despues de la incubacion del suero con 10 ng de unidades neutralizantes del antagonista de TNF-a y 10 ng/ml de TNF-a.

Ejemplo 1

Ensayo de interferon gamma humano

Se co-transfecto la llnea celular U266R pro-monocltica humana, que carece de un receptor funcional de IFN Tipo I (Abramovich et al., 1994) y se derivo de la llnea celular linfoblastoide humana U266 (ATCC N° TIB-196), con el plasmido GAS-Luc (luciferasa) y la construccion del gen neo PSV2, y se seleccionaron los clones resistentes a G418 utilizando tecnicas convencionales. El plasmido GAS-Luc que contenla la secuencia GAS (secuencia de IFN gamma activado) del gen del IRF-1 (Factor Regulador del Interferon 1) (numero de acceso de GenBank L05078.1 GI: 186551; Harada et al., 1989) y un promotor mlnimo SV40 que regula la transcripcion del gen indicador de luciferasa de luciernaga se construyo clonando el oligonucleotido de doble cadena sintetica tctacaacagcctgatttccccgaaatgacgg cacgcagccg (SEQ ID NO:1), que se corresponde con la secuencia GAS del gen IRF1, en el sitio XhoI/BgI 11 del vector de promotor pGL2 (Promega). Se selecciono entonces un clon estable, el Clon 2, basandose en el maximo aumento de unidades relativas de luciferasa (RLU) en respuesta al tratamiento con IFNy humano con respecto a las celulas de control sin tratar. Este clon estable de celulas U266R transfectadas con GAS-Luc, denominado UIG2, se aislo y se cultivo en medio RPMI 1640 con un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y gentamicina. Las celulas se sembraron a una densidad de 2 x 105 celulas/ml en medio RPMI 1640 con un 10 % de FBS y se dividieron 1:4 cinco dlas mas tarde cuando se alcanzaba una concentracion de 0,8 x 106 celulas/ml.

Los resultados de un ensayo con interferon gamma (IFNy) humano en la llnea celular U937 humana, que tiene receptores funcionales para IFN Tipo I y Tipo II y que se habla co-transfectado con el plasmido GAS-Luc y la construccion genetica neo PSV2, se muestran en la Tabla 1, a continuation.

Tabla 1

IFNy (UI/ml)

10,0

1000

IFNa (UI/ml)

1,0

100,0

RLU (Unidades relativas de luciferasa): Veces de aumento

1,25

1,50

1,5

3,0

El aumento de RLU en respuesta al IFNy humano era mlnimo con respecto a las celulas de control sin tratar, y se puede ver que la especificidad por IFNy era pobre ya que el tratamiento de celulas con IFNa humano presentaba un relativamente gran aumento en RLU.

Por el contrario, los resultados del ensayo con IFNy humano en la llnea celular U266R humana Clon 2 estable, que carece de un receptor de IFN Tipo I funcional, y que se transfecto con la misma construccion de gen indicador que se utilizo para transfectar celulas u937, se muestra en la Tabla 2, a continuacion.

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 2

IFNy (Ul/ml) RLU (Unidades relativas de luciferasa):

Veces de aumento

1.0 1,5

1000 9

IFNo (Ul/ml)

100.0 < 0,15

Estos resultados muestran que el incremento de RLU en respuesta al IFNy humano era grande con respecto a las celulas de control sin tratar, y se puede ver que la especificidad por el IFNy era bueno ya que el tratamiento de celulas con el IFNa humano no daba lugar a un aumento significativo en ULR.

Ejemplo 2

Ensayo de TNF-a humano

Se establecio aqul un ensayo de gen indicador para la cuantificacion de TNF-a utilizando una llnea celular transfectada con una construction de gen indicador de manera que el ensamblaje sea capaz de detectar y responder a bajos niveles de TNF-a de una manera altamente especlfica.

En una serie inicial de experimentos, la region promotora (nucleotido -500 a +1) del gen IRF-1 (numero de acceso de GenBank L05078.1 Gl: 186551; Harada et al., 1989) se clono corriente arriba de un promotor mlnimo SV40 en el sitio Xhol/Bglll del vector ADN promotor-pGL2 (Promega) con el fin de regular la transcription del gen indicador con luciferasa de luciernaga (Figura 1). Se co-transfectaron celulas U927 pro-monoclticas humanas con el plasmido IRF- Luc y una construccion genetica neo PSV2 y se seleccionaron los clones resistentes a G418 utilizando tecnicas convencionales. Se selecciono entonces un clon estable, el Clon 2, basandose en el aumento maximo en unidades relativas de luciferasa (RLU) en respuesta al tratamiento con TNF-a humano con respecto a las celulas de control sin tratar.

La llnea de celulas T humana Jurkat, que es refractaria a lL-2 y responde pobremente a IFNy, se co-transfecto con el plasmido 5xNFkB-Luc y una construccion genetica neo PSV2, y se seleccionaron los clones resistentes a G418 utilizando tecnicas convencionales. Se construyo el plasmido 5xNFkB-Luc que contenla una repetition en tandem de 5 veces de la secuencia canonica de reconocimiento del NF-kB y un promotor mlnimo SV40 que regula la transcripcion del gen indicador de luciferasa de luciernaga clonando el oligonucleotido de doble cadena sintetico (Figura 4), que se corresponde con la repeticion en tandem 5 veces de la secuencia canonica de reconocimiento del NF-KB en el sitio Xhol/Bglll del vector de promotor pGL2 (Promega). Se selecciono entonces un clon estable, el Clon 4, basandose en el incremento maximo en unidades relativas de luciferasa (RLU) en respuesta al tratamiento con TNF- a humano con respecto a las celulas de control sin tratar.

Se aislo un clon estable, el Clon 4, de celulas Jurkat transfectadas con 5xNFkB-Luc, denominado JUT-4, y se cultivo en medio RPMl 1640 con un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y gentamicina. Las celulas se sembraron a una densidad de 1 x 105 celulas/ml en medio RPMl 1640 con un 10 % de FBS y entonces se dividieron 1:10 cinco dlas mas tarde cuando la concentration celular alcanzaba 1,0 x 106 celulas/ml.

Tabla 3

Celulas MCF7 humanas transfectadas con el promotor lRF-1, Clon n° 1

TNFa (ng/ml)

0,1

100,0

lL2 (ng/ml)

1,0

RLU (Unidades relativas de luciferasa): Veces de aumento

0*

0*

< 0,1

100,0 < 0,1

* Ausencia completa de una respuesta en RLU debido a la induction de apoptosis masiva en las celulas de ensayo______________________________________________________________

5

10

15

20

25

30

35

Las celulas MCF-7 transfectadas con el promotor IRF-1 son altamente sensibles al TNF-a pero son inadecuadas como base para un ensayo de gen indicador para TNF-a debido a la induccion de apoptosis masiva en las celulas de ensayo y la rapida muerte celular.

Celulas U937, Clon 2

El tratamiento de celulas IRF-Luc transfectadas con el plasmido IRF-Luc con TNF-a (10 ng daban como resultado un aumento modesto de 1,58 veces en RLU, mientras que el tratamiento de celulas IRF-Luc2 con IFNy o TNF-a + IFNy daba un aumento de 1,1 y 1,85 veces en RLU respectivamente (Figura 3).

Celulas Jurkat, Clon n° 4

Tabla 4

TNF-a (ng/ml)

RLU (Unidades relativas de luciferasa): Veces de aumento

0,1

2,0

100,0

10,0

IFNy (IU/ml)

100,0

< 0,10

IL-2 (ng/ml)

1,0

< 0,10

100

< 0,15

Las celulas Jurkat, JUT-4, transfectadas con el promotor 5xNFkB eran altamente sensibles al TNF-a y no respondlan completamente al IFNy o IL-2 y por lo tanto proporcionan una base ideal para un ensayo de gen indicador capaz de detectar y cuantificar bajos niveles de TNF-a de una manera altamente especlfica.

Referencias

Abramovich et al. (1994) Differential tyrosine phosphorylation of the IFNAR chain of the type I interferon receptor and of an associated surface protein in response to IFN-alpha and IFN-beta. Embo J. 13:5871.

Ank et al JICR 2006, 26:373-379

Alton et al. (1979) Nucleotide sequence analysis of the chloramphenicol resistance transposon Tn9. Nature 282:864-869

Baert et al., N Engl J Med 2003, 348:601-08

Baldwin et al. (1984) Cloning of the luciferase structural genes from Vibrio harveyi and expression of bioluminescence in Escherichia coli. Biochemistry 23:3663-3667

Balog et al., Pathobiology 2004; 71(5):274-280

Barbieri et al. (1994) Activation of the protein tyrosine kinase tyk2 by interferon alpha/beta. Eur J Biochem. 223:427.

Basu et al. (1998) The antiviral action of interferon is potentiated by removal of the conserved IRTAM domain of the IFNAR1 chain of the interferon alpha/beta receptor: effects on JAK-STAT activation and receptor down- regulation. Virology. 242:14.

Bazan, (1990). Structural design and molecular evolution of a cytokine receptor superfamily. Proc Nat1 Acad Sci U S A. 87:6934.

5

10

15

20

25

30

35

Bouche et al. (1987) Basic fibroblast growth factor enters the nucleolus and stimulates the transcription of ribosomal genes in ABAE cells undergoing GO-—G1 transition. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 84:6770-6774

Boulter et al. (1986) Isolation of a cDNA clone coding for a possible neural nicotinic acetylcholine receptor alpha- subunit. Nature 319:368-374

Boulter et al. (1990) Alpha 3, alpha 5, and beta 4: three members of the rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor-related gene family form a gene cluster. J. Biol. Chem. 265:4472-4482

Boyanova et al, Analytical Biochemistry, 2002; 308:178-181

Branca et al. (1981) Evidence that types I and II interferons have different receptors. Nature. 294:768.

Bunzow et al. (1988) Cloning and expression of a rat D2 dopamine receptor cDNA. Nature 336:783-787

Canosi et al. (1996) A highly precise reporter gene bioassay for type I interferon. Journal of Immunological Methods 199:69-76

Changelian et al. (1989) Structure of the NGFI-A gene and detection of upstream sequences responsible for its transcriptional induction by nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:377-381

Changelian et al. (1989) Structure of the NGFI-A gene and detection of upstream sequences responsible for its transcriptional induction by nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:377-381

Cleary et al. (1994) Knockout and reconstitution of a functional human type I interferon receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 269:18747.

Cohen et al. (1995) Ligand-induced association of the type I interferon receptor components. Mol Cell Biol. 15:4208.

Colamonici et al. (1994) Direct binding to and tyrosine phosphorylation of the alpha subunit of the type I interferon receptor by p135tyk2 tyrosine kinase. Mol. Cell. Biol. 14:8133.

Comb et al. (1986) Nature 323:353-356

Constantinescu et al. (1994) Role of interferon alpha/beta receptor chain 1 in the structure and transmembrane signaling of the interferon alpha/beta receptor complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 91:9602.

Constantinescu et al. (1995) Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc Natl Acad Sci USA. 92:10487.

Cook et al. (1996) Differential responsiveness of a splice variant of the human type I interferon receptor to interferons. J Biol Chem. 271:13448.

Cowin et al., Wound Repair Regen. 2006; 14(4):421-426

Cutrone et al. (1997) Contributions of cloned type I interferon receptor subunits to differential ligand binding. FEBS Lett. 404:197.

Darnell et al. (1994) Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science. 264:1415.

De Maeyer et al. (1988) Interferons and other regulatory cytokines. John Wiley, New york: 69.

Deneris et al. (1988) Primary structure and expression of beta 2: a novel subunit of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Neuron 1:45-54

Deneris et al. (1989) Beta 3: a new member of nicotinic acetylcholine receptor gene family is expressed in brain.J. Biol. Chem. 264: 6268-6272

deWet et al. (1987) Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Mol. Cell Biol. 7:725-737

5

10

15

20

25

30

35

40

Diaz et al. (1993) Nomenclature of the human interferon genes. J Interferon Res. 13:443.

Diebold SS, Kaisho T, Hemmi H, Akira S, Reis, E., y Sousa C. (2003). Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science. 303, 1529-1531.

Dixon et al. (1986) Cloning of the gene and cDNA for mammalian beta-adrenergic receptor and homology with rhodopsin. Nature 321:75-79

Domanski et al. (1995) Cloning and expression of a long form of the beta subunit of the interferon alpha beta receptor that is required for signaling. J Biol Chem. 270:21606.

Domanski et al. (1996) The type-I interferon receptor. The long and short of it. Cytokine Growth Factor Rev. 7:143.

Duvoisin et al. (1989) The functional diversity of the neuronal nicotinic acetylcholine receptors is increased by a novel subunit: beta 4. Neuron 3:487-496

Ellis et al. (1988) Sequence and expression of mRNAs encoding the alpha 1 and alpha 2 subunits of a DHP- sensitive calcium channel. Science 241:1661-1664

Engebrecht et al. (1984) Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence. PNAS 1:4154-4158

Fiette et al. (1995) Theiler's virus infection of 129Sv mice that lack the interferon alpha/beta or interferon gamma receptors. Journal of Experimental Medicine. 181:2069.

Fink et al. (1988), The CGTCA sequence motif is essential for biological activity of the vasoactive intestinal peptide gene cAMP-regulated enhancer. Proc. Natl. Acad. Sci. 85:6662-6666

Frielle et al. (1987) Cloning of the cDNA for the human beta 1-adrenergic receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7920-7924

Fu, (1992) A transcription factor with SH2 and SH3 domains is directly activated by an interferon alpha-induced cytoplasmic protein tyrosine kinase(s). Cell. 70:323.

Goldman et al. (1987) Members of a nicotinic acetylcholine receptor gene family are expressed in different regions of the mammalian central nervous system. Cell 48:965-973

Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2:101

Hammerling et al. (1998) The (3-gal interferon assay: a new, precise, and sensitive method. Journal of Interferon and Cytokine Research 18:451-460

Harada et al, Cell, 1989, 58:729-739

Heil F, Hemmi H, Hochrein H, Ampenberger F, Kirschning C, Akira S, Lipford G, Wagner H, y Bauer S. (2003). Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science, 303, 1526-1529.

Hemmi, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yamamoto, M., Kaisho, T., Santon H., Kawai, T., Hoshino, K., Takeda, K, y Akira, S. (2004). The roles of two ikappaB kinases in lipopolysaccharide and double stranded RNA signaling and viral infection. J. Exp. Med. 199, 1641-1650.

Hemmi, H., Takeuchi, O., Kawai, T., Kaisho, T., Sato, S., Sanjo, H., Matsumoto, M., Hoshino, K., Wagner, H., Takeda, K., y Akira, S. (2000). A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature, 408, 740-745.

Hollmann et al. (1989) Cloning by functional expression of a member of the glutamate receptor family. Nature 342:643-648

Horvath et al. (1995) A STAT protein domain that determines DNA sequence recognition suggests a novel DNA- binding domain Genes Dev. 9:984-994

5

10

15

20

25

30

35

Hwang et al. (1995) A null mutation in the gene encoding a type I interferon receptor component eliminates antiproliferative and antiviral responses to interferons alpha and beta and alters macrophage responses. Proc Natl Acad Sci USA. 92:11284.

Ihle, (1995) Cytokine receptor signalling. Nature. 377:591.

Imanishi et al., J. Immunol, 2000, 165:3907-16

Jay et al. (1990) Primary structure of the gamma subunit of the DHP-sensitive calcium channel from skeletal muscle. Science 248:490-492

Johnson et al. (1986) Cell 47:545-554

Julius et al. (1988) Molecular characterization of a functional cDNA encoding the serotonin 1c receptor. Science 241:558-564

Julius et al. (1990) The 5HT2 receptor defines a family of structurally distinct but functionally conserved serotonin receptors. PNAS 87:928-932

Kayano et al, (1988) Primary structure of rat brain sodium channel III deduced from the cDNA sequence. FEBS Lett. 228:187-194

King, D.P., Jones, P.P., J. Immunol. Methods, 1983, 131:315-320

Kobilka et al. (1987) An intronless gene encoding a potential member of the family of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins. Nature 329:75-79

Kobilka et al. (1987) Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2- adrenergic receptor. Science 238:650-656

Lallemand et al. (1996) Constitutive expression of specific interferon isotypes in peripheral blood leukocytes from normal individuals and in promonocytic U937 cells. J Leukoc Biol. 60:137-46

Langer et al. (1996) Interferon receptors. Biotherapy. 8:163

Levitan et al. (1988) Structural and functional basis for GABAA receptor heterogeneity. Nature 335:76-79

Levy et al. (1988) Interferon-induced nuclear factors that bind a shared promoter element correlate with positive and negative control Genes Dev. 2:383-393

Lewis, (1995) A sensitive biological assay for interferons. Journal of Immunological Methods 185:9-17

Lim et al. (1993) Cloning and characterization of a bovine alpha interferon receptor. Biochim Biophys Acta. 1173:314.

Lipsky et al., N Engl J Med 2000, 343:1594-602

Lleonart et al., (1990) A novel, quantitative bioassay for type I interferon using a recombinant indicator cell line. Biotechnology 8:1263-1267

Lutfalla et al. (1992) The structure of the human interferon alpha/beta receptor gene. J Biol Chem. 267:2802.

Lutfalla et al. (1995) Mutant U5A cells are complemented by an interferon-alpha beta receptor subunit generated by alternative processing of a new member of a cytokine receptor gene cluster. Embo J. 14:5100.

Malu et al, J. Immunol Methods, 2003; 272:55-65

Marotte et al, Arthritis Res. Ther. 2005; 7(1):R149-155

McFarlane et al, FEBS Letters, 2002, 515:119-126

5

10

15

20

25

30

35

McKinnon, D. (1989) Isolation of a cDNA clone coding for a putative second potassium channel indicates the existence of a gene family. J. Biol. Chem. 264:8230-8236

Meager, A. Methods; 2006, 38:237-252

Merlin et al. (1985) 1251-labelled human interferons alpha, beta and gamma: comparative receptor-binding data. J Gen Virol. 66:1149.

Montminy et al. (1986), Identification of a cyclic-AMP-responsive element within the rat somatostatin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. 83:6682-6686

Mouchel-Vielh et al. (1992). Specific antiviral activities of the human alpha interferons are determined at the level of receptor (IFNAR) structure. FEBS Lett. 313:255.

Muller et al. (1994) Functional role of type I and type II interferons in antiviral defense. Science. 264:1918.

Noda et al. (1986) Nature 320:188-192

Novick et al. (1994) The human interferon alpha/beta receptor: characterization and molecular cloning. Cell. 77:391.

Perry et al., (1999) Cloning of interferon-stimulated gene 17: The promoter and nuclear proteins that regulate transcription. Molecular Endocrinology, 13:1197-1206

Perry, A. K., Chow, E. K., Goodnougy, J. B., Yeh, W. C., y Cheng, G. (2004). Differential requirement for TANKbinding kinase-1 in type I interferon responses

Pestka et al. (1987) Interferons and their actions. A. Rev. Biochem. 56:727.

Platanias et al. (1994) Tyrosine phosphorylation of the alpha and beta subunits of the type I interferon receptor. Interferon-beta selectively induces tyrosine phosphorylation of an alpha subunit-associated protein. J. Biol. Chem. 269:17761.

Pritchett et al. (1989) Importance of a novel GABAA receptor subunit for benzodiazepine pharmacology. Nature 338:582-585

Rider et al. (2003) A B cell-based sensor for rapid identification of pathogens. Science 301:213-215

Russell-Harde et al. (1995) Reconstitution of a high affinity binding site for type I interferons. J Biol Chem. 270:26033.

Ruth et al. (1989) Primary structure of the beta subunit of the DHP-sensitive calcium channel from skeletal muscle. Science 245:1115-1118

Sato et al., (2006) J Immunol 176(12):7686-94

Schindler et al. (1992) Interferon-dependent tyrosine phosphorylation of a latent cytoplasmic transcription factor [veanse los comentarios]. Science. 257:809.

Schofield et al. (1987) Sequence and functional expression of the GABA A receptor shows a ligand-gated receptor super-family. Nature 328:221-227

Schumacher et al. (1994) The chicken Mx promoter contains an ISRE motif and confers interferon inducibility to a reporter gene in chick and monkey cells. Virology 15:203(1):144-8

Schwamborn et al., BMC Genomics 2003, 4:46-58

Sheppard et al Nat Immunol. 2003; 4:63-68

Sheng et al. (1990) The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system. Neuron 4:477-485

5

10

15

20

25

30

35

Shivers, B.D. (1989) Neuron 3:327-337 Short et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9721-9726

Steinhoff et al. (1995) Antiviral protection by vesicular stomatitis virus-specific antibodies in alpha/beta interferon receptor-deficient mice. Journal of Virology. 69:2153.

Steinman, R.M., y Hemmi, H. (2006). Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 311, 17-58.

Stormann et al. (1990) Molecular cloning and expression of a dopamine D2 receptor from human retina. Molec. Pharm. 37:1-6

Tanabe et al. (1987) Primary structure of the receptor for calcium channel blockers from skeletal muscle. Nature 328:313-E318

Taniguchi, (1995) Cytokine signaling through nonreceptor protein tyrosine kinases. Science. 268:251.

Targan et al., N Engl J Med 1997, 337:1029-35

Tempel et al. (1988) Cloning of a probable potassium channel gene from mouse brain. Nature 332:837-839

Thoreau et al. (1991) Structural symmetry of the extracellular domain of the cytokine/growth hormone/prolactin receptor family and interferon receptors revealed by hydrophobic cluster analysis. FEBS Lett. 282:26.

Toh et al. (1989) Isolation and characterization of a rat liver alkaline phosphatase gene. A single gene with two promoters. Eur. J. Biochem. 182:231-238

Uddin et al. (1995) Interaction of the transcriptional activator Stat-2 with the type I interferon receptor. J Biol Chem. 270:24627.

Uematsu, S., y Akira, S. (2007). Toll-like receptors and type I interferons. J. Biol. Chem. 282, 15319-15323.

Uze et al. (1990) Genetic transfer of a functional human interferon alpha receptor into mouse cells: cloning and expression of its cDNA. Cell. 60:225.

Uze et al. (1992) Behavior of a cloned murine interferon alpha/beta receptor expressed in homospecific or heterospecific background. Proc Natl Acad Sci U S A. 89:4774.

Uze et al. (1995) Alpha and beta interferons and their receptor and their friends and relations. Journal of Interferon & Cytokine Research. 15:3.

van den Broek et al. (1995) Antiviral defense in mice lacking both alpha/beta and gamma interferon receptors. Journal of Virology. 69:4792.

Vandenbroek et al. (1995) Immune defence in mice lacking type I and/or type II interferon receptors. Immunol Rev. 148:5.

Velazquez et al. (1995) Distinct domains of the protein tyrosine kinase tyk2 required for binding of interferon-al- pha/beta and for signal transduction. J Biol Chem. 270:3327.

Wada et al. (1988) Functional expression of a new pharmacological subtype of brain nicotinic acetylcholine receptor. Science 240:330-334

Yan et al. (1996) Molecular characterization of an alpha interferon receptor 1 subunit (IFNaR1) domain required for TYK2 binding and signal transduction. Mol Cell Biol. 16:2074.

Yan et al. (1996) Phosphorylated interferon-alpha receptor 1 subunit (IFNaR1) acts as a docking site for the latent form of the 113 kDa STAT2 protein. EMBO J. 15:1064.

Yeh et al. (1987) Ultrastructural localization of a platelet-derived growth factor/v-sis-related protein(s) in cytoplasm

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

and nucleus of simian sarcoma virus-transformed cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:2317-2321

Ymer et al. (1989) GABAA receptor beta subunit heterogeneity: functional expression of cloned cDNAs. EMBO J. 8:1665-1670

Yoneyama, M., Fujita, T. (2007). Function of RIG-I-like receptors in antiviral innate immunity. J. Biol. Chem. 282, 15315-15318.

Zlokarnik et al. (1998) Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with p-lactamase as reporter. Science 279:84-88.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> TOVEY, Michael LALLEMAND, Christophe

<120> ENSAYO DE GEN INDICADOR, KIT Y CELULAS CON SENSIBILIDAD Y/O ESPECIFICIDAD MEJORADAS PARA DETERMINAR EL NIVEL DE UNA SENAL EXTRACELULAR

<130> TOVEYBA PCT

<150> US 60/863.479 <151 >

<160> 5

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> sintetico <400> 1

tctacaacag cctgatttcc ccgaaatgac ggcacgcagc cg 42

<210>2 <211> 70 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> sintetico <400> 2

tggggacttt ccgctgggga ctttccgctg gggactttcc gctggggact ttccgctggg 60 gactttccgc 70

<210>3 <211>21 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> sintetico <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(3)

<223> n es a, c, g o t

5

10

15

20

25

30

<220>

<221> misc_feature <222> (6)..(6)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature <222> (16)..(16)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature <222> (19)..(19)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature <222> (21)..(21)

<223> n es a, c, g o t

<400>3

nnnsanttcc gggaantgns n 21

<210>4 <211 > 5834 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> sintetico <400> 4

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Una ilnea celular transformada establemente con una construccion de gen indicador que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico indicador unida operativamente a un eiemento de control de la transcripcion que se activa como parte de la ruta de transduccion de la senal NF-kB iniciada por un receptor del TNF-a en respuesta al TNF-a como senal extracelular, en la que:

   a) dicho elemento de control de la transcripcion es un promotor sintetico que comprende un promotor mlnimo SV40 y SEQ ID NO: 2, que es especlfico para NF-kB, mientras que carece de sitios de union para otros factores de transcripcion; y

   b) las celulas de dicha llnea celular carecen de una o mas moleculas de superficie celular, distintas del receptor de TNF-a, que se sabe que son activadoras principales de la ruta de transduccion de la senal NF-kB que causarlan de otra manera una interferencia con la senal extracelular del TNF-a cuando se utiliza la llnea celular para determinar el nivel de TNF-a en un ensayo de gen indicador, en donde dicha una o mas moleculas de superficie celular comprenden los receptores para IFNy e IL2.
2. 2. La llnea celular de la reivindicacion 1, en la que las celulas de dicha llnea celular son tratadas con un agente anti- mitotico y pro-apoptotico y preferentemente estan almacenadas congeladas para su uso futuro en un ensayo de gen indicador.
3. 3. La llnea celular de la reivindicacion 1, en la que las senales principales que se sabe que activan la ruta de transduccion de la senal NF-kB se seleccionan de entre el grupo que consiste en TNF-a, IFNy, IL-2, IL-5 e IL-6.
4. 4. La llnea celular de la reivindicacion 1, en la que las celulas de dicha llnea celular existen de modo natural sin dicha segunda molecula de superficie celular.
5. 5. La llnea celular de la reivindicacion 1, en la que las celulas de dicha llnea celular han sido modificadas geneticamente para desactivar dicha segunda molecula de superficie celular.
6. 6. La llnea celular de la reivindicacion 1, en la que al menos la parte extracelular de dicha primera molecula o complejo de superficie celular es de una primera especie animal y las celulas de dicha llnea celular son celulas de una segunda especie animal que han sido modificadas geneticamente para introducir dicha primera molecula o complejo de superficie celular.
7. 7. La llnea celular de la reivindicacion 1 en estado congelado, en donde dicha llnea celular tiene la propiedad de que mantendra la actividad de transduccion de la senal de dicha ruta de transduccion de la senal iniciada por dicha primera molecula o complejo de superficie celular durante al menos una hora despues de haber sido descongelada pero que perdera dicha actividad de transduccion de la senal y sufrira la muerte celular en no mas de aproximadamente 30 dlas a una temperatura superior a la de congelacion tras ser descongelada.
8. 8. Un kit para determinar la presencia y/o el nivel, en una muestra, de TNF-a como senal extracelular que activa la ruta de transduccion de la senal de un receptor de TNF-a como molecula o complejo de superficie celular, que comprende:

   un dispositivo de ensayo que tiene una pluralidad de pocillos; y

   un reactivo que contiene una pluralidad de celulas de la llnea celular de la reivindicacion 1.
9. 9. El kit de la reivindicacion 8, en el que dicho dispositivo de ensayo es una placa de microtitulacion.
10. 10. El kit de la reivindicacion 8, en el que dicho reactivo esta dispuesto en los pocillos de dicho dispositivo de ensayo.
11. 11. Un metodo para determinar el nivel, en una muestra, de TNF-a como senal extracelular que activa la ruta de transduccion de la senal de un receptor de TNF-a como molecula o complejo de superficie celular, que comprende:

    incubar las celulas de la llnea celular de la reivindicacion 1 con una muestra en la que se desea determinar el nivel de TNF-a que activa la actividad de transduccion de la senal del receptor TNF-a; y

    determinar el nivel de expresion del producto genico indicador en las celulas midiendo la actividad del producto genico indicador con respecto a una referencia entre la actividad del producto genico indicador y el TNF-a para determinar de esta manera el nivel, en la muestra, del TNF-a que activa la actividad de transduccion de la senal del receptor de TNF-a.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que la determinacion del nivel, en una muestra, de TNF-a indirectamente determina el nivel de un anticuerpo contra un antagonista del TNF-a estimando el tltulo de neutralizacion del anticuerpo a partir del reclproco de la dilucion de la muestra que da como resultado la deteccion de 1,0 ng/ml de TNF-a tras la incubacion de la muestra con 10 ng/ml de TNF-a y una cantidad de antagonista de TNF-a suficiente

    para neutralizar 10 ng/ml de TNF-a (unidades neutralizantes de 10 ng).

    -500

    +1

    imagen1

    imagen2

    Luciferasa

    imagen3

    TNF a TFNy

    Fig. 1

    SV40 Poli A

    Control

    IFN Gamma TNF Alfa a 10 100 Ul/ml ng

    Fig. 2

    IFN + TN =

    Veces de induccion

    imagen4

    Fig. 3

    imagen5

    Fig. 4

    imagen6

    Fig. 5